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Mathematische Modelle fur

FRAP-Mikroskopie in

unterschiedlichen Anwendungen

Bachelorarbeitzur Erlangung des akademischen Grades

Bachelor of Science

Westfalische Wilhelms-Universitat Munster

Fachbereich Mathematik und Informatik

Institut fur Numerische und Angewandte Mathematik

Betreuung:

Prof. Dr. Martin Burger

Dr. Christoph Brune

Eingereicht von:

Miriam Riedel

Munster, April 2013

i

Zusammenfassung

In dieser Arbeit werden drei verschiedene Anwendungen des Fluorescence Recovery

after Photobleaching vorgestellt, die die Vielfalt der Einsatzmoglichkeiten dieser Me-

thode aufzeigen sollen.

Zunachst werden eine Einfuhrung in die Funktionsweise des Fluorescence Recovery

after Photobleaching gegeben sowie der fur die Modelle notwendige mathematische

Hintergrund vorgestellt. Es folgen die Herleitung und Auswertung der Modellierung

der drei Anwendungen. Abschließend wird auf die Sensibilitat der Methode und das

daraus resultierende hohe Fehlerpotential eingegangen.

ii

Eidesstattliche Erklarung

Hiermit versichere ich, Miriam Riedel, dass ich die vorliegende Arbeit selbststandig

verfasst und keine anderen als die angegebenen Quellen und Hilfsmittel verwendet

habe. Gedanklich, inhaltlich oder wortlich Ubernommenes habe ich durch Angabe von

Herkunft und Text oder Anmerkung belegt bzw. kenntlich gemacht. Dies gilt in gleicher

Weise fur Bilder, Tabellen, Zeichnungen und Skizzen, die nicht von mir selbst erstellt

wurden.

Munster, 25. April 2013

Miriam Riedel

iii

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung 1

2. Funktionsweise von Fluorescence Recovery after Photobleaching 3

3. Mathematische Grundlagen 7

3.1. Fokker-Planck-Gleichung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

3.2. Fourier-Transformation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

4. Anwendung I: Diffusion und Fluss von Lipiden innerhalb der Zellmembran 10

4.1. Anfangs- und Randbedingungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

4.2. Vorwartsrechnung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

4.3. Ruckwartsrechnung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

5. Anwendung II: Langenberechnung von Aktinfilamenten 19

5.1. Vorwartsrechnung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

5.2. Ruckwartsrechnung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

6. Anwendung III: Diffusion von Molekulen innerhalb des Zellkerns 26

6.1. Vorwarts- und Ruckwartsrechnung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

6.2. Einfluss der Berucksichtigung der Kernmembran auf die Berechnung des

Diffusionskoeffizienten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

7. Allgemeine Probleme des Fluorescence Recovery after Photobleaching 34

8. Zusammenfassung und Ausblick 37

A. Anhang 38

A.1. Bestimmung von ω im Gaußschen Intensitatsprofil . . . . . . . . . . . . 38

A.2. Rechnung zu Abschnitt 3.2, um Gleichung (3.5) zu erhalten . . . . . . . 39

A.3. Rechnung zum Fehlerpotential des Radius ω . . . . . . . . . . . . . . . 40

Abbildungsverzeichnis 41

Inhaltsverzeichnis iv

Literaturverzeichnis 42

1

1. Einleitung

Fluorescence Recovery after Photobleaching (FRAP) ist eine Methode, die in der Zell-

biologie eine vielfaltige Anwendung findet. So eignet sich FRAP beispielsweise dafur,

die Diffusion von Lipiden oder anderen Molekulen in einem Bereich einer Zelle oder

gar der ganzen Zelle zu untersuchen.

Im Allgemeinen spielen Transport- und Diffusionsprozesse innerhalb einer Zelle ei-

ne wichtige Rolle, wenn man ihren physiologischen Zustand beziehungsweise die Ver-

anderungen des Zustandes beschreiben mochte. (vgl. [AK76], [HN10], [KW10], [RG10])

Mogliche Fragestellungen, die zugrunde liegen, wenn Fluorescence Recovery after Pho-

tobleaching angewendet wird, sind: Wie bewegen sich bestimmte Molekule? Sind sie in

ihrer Bewegung beschrankt? Treten sie in Wechselwirkung mit anderen Bereichen der

Zelle? Lassen sich Strukturveranderungen nachweisen? (vgl. [KW10])

Eine Veranderung der Zelle beziehungsweise der Zellstruktur ist in Krankheitsbildern

keine Seltenheit. Daher wird FRAP auch benutzt, um Strukturveranderungen inner-

halb von Zellen festzustellen. Auf diese Weise kann man Ruckschlusse auf die jeweilige

Krankheit ziehen.

Beispielsweise wird FRAP in der Neurologie verwendet, unter anderem in der Alzheimer-

Forschung. Ist ein Mensch an Alzheimer erkrankt, lasst sich in bestimmten Bereichen

seines Gehirns vermehrt das Eiweiß Beta-Amyloid in den Zellen nachweisen. Daher ver-

muten Forscher, dass diese Anhaufung eine Ursache der Alzheimer-Krankheit ist. Wel-

che Vorgange oder Gegebenheiten die Ablagerung von Beta-Amyloid begunstigen oder

bremsen konnten, wurde von einigen Wissenschaftlern unter Verwendung von FRAP

erforscht. Zum Beispiel wurde von ihnen untersucht, welchen Einfluss der pH-Wert auf

das Eiweiß Beta-Amyloid hat. Weiterfuhrende Informationen zu diesem Thema sind in

[EH10] zu finden. (vgl. [Ap13], [EH10], [RG10])

Die vorliegende Arbeit gliedert sich wie folgt: In Kapitel 2 wird der Aufbau und der Ab-

lauf eines FRAP-Experimentes beschrieben. Außerdem wird skizziert, wie das weitere

Vorgehen aussieht, um die jeweils spezifischen Parameter zu bestimmen.

1 Einleitung 2

Die zur Losung der Differentialgleichung, welche den Transport in der Zelle beschreibt,

benotigten mathematischen Grundlagen werden in Kapitel 3 behandelt. Dazu wird die

Fokker-Planck-Gleichung definiert und diese mittels der Fourier-Transformation gelost.

Eine erste Anwendung der Methode wird in Kapitel 4 prasentiert. Das Ziel in diesem

Kapitel ist die Bestimmung der Diffusions- und Flusskonstanten von Lipiden innerhalb

der Zellmembran.

In Kapitel 5 wird FRAP verwendet, um die Lange der Aktinfilamente in einer Zel-

le zu bestimmen. Dazu wird eine Modellierung hergeleitet und eine Methode zur

Langenberechnung angegeben.

Anschließend wird in Kapitel 6 eine dritte Anwendung vorgestellt. FRAP wird verwen-

det, um die Diffusion von Molekulen innerhalb des Zellkerns genauer zu charakterisie-

ren. Außerdem wird dieses Modell mit dem aus Kapitel 4 hinsichtlich eines wichtigen

Aspekts verglichen.

In den Kapiteln 4, 5 und 6 wird jeweils eine kurze themenspezifische biologische Ein-

fuhrung gegeben.

Allgemeine Probleme in der Anwendung des FRAP werden in Kapitel 7 diskutiert.

Die Arbeit endet mit einer kurzen Zusammenfassung und einem Ausblick auf weitere

Forschungsmoglichkeiten.

3

2. Funktionsweise von Fluorescence

Recovery after Photobleaching

Wir wollen uns in diesem Kapitel mit der folgenden Frage beschaftigen: Wie wird in

einem FRAP-Experiment vorgegangen?

Bei Fluorescence Recovery after Photobleaching werden einer Zelle beziehungsweise

einem Bereich einer Zelle fluoreszierende Proteine injiziert. Ob die ganze Zelle oder

nur ein kleiner Bereich der Zelle betrachtet wird, hangt von der zu untersuchenden

Fragestellung des einzelnen Experimentes ab. Die injizierten Fluorophore koppeln sich

an die Molekule in der Zelle und konnen sich somit gemeinsam mit ihnen bewegen.

Sie sollten zusatzlich die Eigenschaft haben, dass sie die Molekule, an die sie gekoppelt

sind, nicht behindern. Dadurch ist sichergestellt, dass die Vorgange in der Zelle nicht

beeinflusst, sondern lediglich sichtbar gemacht werden.

Das weitere Vorgehen der Methode unterteilen wir nun in drei Phasen. Die erste Phase

ist die Phase vor dem Bleichvorgang, welche Prebleaching genannt wird. Es schließt

sich die zweite Phase an, das Photobleaching. In dieser Phase findet der eigentliche

Bleichvorgang statt. Die dritte Phase umfasst den Zeitraum nach dem Bleichen und

wird daher mit Postbleaching bezeichnet. (vgl. [AK76], [KW10])

Abbildung 2.1.: Fluoreszierende Zelle mit markiertem Bleichbereich Ω [KW10]

2 Funktionsweise von Fluorescence Recovery after Photobleaching 4

Zuerst wollen wir die Phase vor dem Bleichen, das Prebleaching, genauer betrachten.

Nachdem der Zelle Fluorophore injiziert wurden, mochte man diese nun sichtbar ma-

chen. Dazu wird das Gebiet mit einem Laser beleuchtet, der mit geringer Intensitat

strahlt. Auf diese Weise ist sichergestellt, dass vor dem eigentlichen Bleichen kein irre-

versibler Bleichungsprozess durch das emittierte Licht des Lasers einsetzt. Zudem wird

die Anfangsintensitat der Fluoreszenz ermittelt, also in welchem Maße die Zelle nach

der Injektion der Fluorophore leuchtet. (vgl. [KW10])

In Abbildung 2.1 sehen wir eine fluoreszierende Zelle mit dem markierten, zukunftigen

Bleichbereich Ω, hier als weißer Kasten dargestellt.

Abbildung 2.2.: Fluoreszierende Zelle mit gebleichtem Bereich Ω [KW10]

Beim Photobleaching gibt derselbe Laser einen Lichtimpuls mit sehr hoher Intensitat

ab, um die Fluorophore im Bereich Ω irreversibel zu bleichen. Wie wir in Abbildung

2.2 sehen, ist dieser Bereich nun schwarz und leuchtet nicht mehr. (vgl. [KW10])

Abbildung 2.3.: Fluoreszierende Zelle wahrend des Wiederherstellungsprozesses[KW10]


Nach dem Bleichen, in der Postbleaching Phase, wird fur die Beobachtung erneut die

Einstellung des Lasers mit geringer Intensitat verwendet. Es wird nun die Umverteilung

der Fluoreszenz im Bleichbereich Ω analysiert, welche auf Diffusions- oder Transport-

prozesse zuruckzufuhren ist. Hierbei spielt aber auch der Anteil der Molekule, die fest

in der Zelle verankert sind und sich nicht bewegen konnen, eine große Rolle. Dieser

Aspekt wird in Kapitel 7 erneut aufgegriffen und diskutiert. (vgl. [KW10])

Die Abbildung 2.3 zeigt links den Zustand direkt nach dem Bleichen. Im mittleren

Bild ist zu sehen, dass sich die Molekule bewegen und eine Umverteilung stattfindet.

Im dritten Bild ist diese dann vollzogen.

Tragen wir die Intensitat der Fluoreszenz F (t) gegen die Zeit t auf, erhalten wir einen

Kurvenverlauf der Umverteilung. Dieser Kurvenverlauf ergibt sich dadurch, dass im

Wesentlichen uber die Konzentration der ungebleichten Fluorophore im Bleichbereich

Ω integriert wird:

F (t) =

∫Ω

C(r, t) dr

Mit C(r, t) = Konzentration ungebleichter Fluorophore in Ω.

Abbildung 2.4.: Wiederherstellungskurve der Fluoreszenz im Bleichbereich Ω [KW10]

Abbildung 2.4 zeigt die Wiederherstellungskurve der Fluoreszenz im Bleichbereich Ω.

Wir sehen zu Beginn der Kurve die Intensitat der Fluoreszenz vor dem Bleichen Fi. Fi

ist eine etwas dichtere Punktwolke, da die ganze Zelle noch Licht emittiert und sich in

dieser Zeit keine großartige Veranderung der Intensitat feststellen lasst.


Zum Zeitpunkt t0 erfolgt das Bleichen. Die Intensitat der Fluoreszenz sinkt abrupt ab.

Wie man in der Abbildung sieht, wurden jedoch nicht alle Fluorophore ausgebleicht.

Das ist daran erkennbar, dass die Intensitat nicht bei Null liegt. Die Hohe der zu

diesem Zeitpunkt vorhandenen Intensitat hangt unter anderem davon ab, welcher Laser

verwendet wird.

Durch die Umverteilung der Molekule erhoht sich die Intensitat im Bleichbereich Ω

wieder und nahert sich dem Wert F∞ an. F∞ ist die Fluoreszenzintensitat, die sich nach

der Umverteilung einpendelt. Diese ist in der Regel geringer als die Anfangsintensitat.

Grunde dafur sind zum Beispiel die falsche Einstellung des Lasers oder die Anteile der

Molekule, die sich in der Zelle nicht bewegen konnen. (vgl. [KW10], [AK76])

Das erste Ziel ist die Herleitung einer Funktion, die den Wiederherstellungsprozess

modelliert. Anschließend wird die Kurve durch mathematische Verfahren an die ex-

perimentellen Daten angepasst, um abschließend die Parameter zu bestimmen, welche

uns Aufschluss uber die Prozesse und Gegebenheiten in dem beobachteten Bereich Ω

geben.

Es ist offensichtlich, dass Fluorescence Recovery after Photobleaching ein Verfahren

ist, welches nicht pauschal angewendet werden kann, sondern nur in Verbindung mit

einem sorgfaltig gewahlten Modell zu sinnvollen Ergebnissen fuhrt.

7

3. Mathematische Grundlagen

Es werden nun die mathematischen Grundlagen prasentiert, die fur das Verstandnis der

spater folgenden Modellierungen notwendig sind. Zunachst steht die Fokker-Planck-

Gleichung im Mittelpunkt. Im weiteren Verlauf wird die Fourier-Transformation be-

trachtet.

3.1. Fokker-Planck-Gleichung

Fur die Modellierungen ist es sinnvoll die Vereinfachung anzunehmen, dass Diffusion

und Fluss in einem nicht begrenzten Raum stattfinden. Dies bedeutet, dass eine un-

endliche Ebene betrachtet wird, statt eines endlichen Bereichs einer Zelle.

Aufgrund dieser Annahme (r ∈ Rn, statt r ∈ Ω) konnen wir die Fokker-Planck-

Gleichung verwenden, um das System unter Einwirkung von Diffusion und Fluss zu

beschreiben. (vgl. [AK76], [HN10], [Ri84])

Definition 3.1.1 (Fokker-Planck-Gleichung). Die Fokker-Planck-Gleichung ist gege-

ben durch folgende partielle Differentialgleichung:

∂

∂tC(r, t) = ∆ [C(r, t)D(r, t)]−∇ [C(r, t)V (r, t)] (3.1)

Wobei D(r, t) die Diffusion und V (r, t) den Fluss beschreibt und r = (x, y) die Ortsva-

riable in den Richtungen x und y ist.

Um die Fokker-Planck-Gleichung fur unsere spezielle Verwendung in den Modellen wei-

ter umzuformen und zu vereinfachen, nehmen wir Folgendes an:

D(r, t) sei gleichgerichtet, also D(r, t) ≡ D. Zudem nehmen wir an, dass V (r, t) un-

abhangig von Zeit und Ort ist und konstant entlang der x-Richtung verlauft, also setze

V (r, t) = (V0, 0). (vgl. [AK76], [HN10])

3 Mathematische Grundlagen 8

Somit erhalten wir:

Definition 3.1.2 (Vereinfachte Fokker-Planck-Gleichung). Die vereinfachte Fokker-

Planck-Gleichung ist gegeben durch:

∂

∂tC(r, t) = D∆C(r, t)− V0

[∂

∂xC(r, t)

](3.2)

3.2. Fourier-Transformation

Um die partielle Differentialgleichung (3.2) losen zu konnen, fuhren wir in diesem Ab-

schnitt die Fourier-Transformation ein. (vgl. [Ev98])

Definition 3.2.1 (Fourier-Transformation fur Dimension 2). Sei u ∈ L1(R2) eine

integrierbare Funktion und µ ∈ R2. Die Fourier-Transformierte u ist gegeben durch:

u(µ) :=1

2π

∫R2

eir·µu(r) dr (3.3)

Entsprechend gilt fur die Fourier-Rucktransformation:

u(r) :=1

2π

∫R2

e−ir·µu(µ) dµ (3.4)

Durch Anwenden der Fourier-Transformation auf die vereinfachte Fokker-Planck-Glei-

chung (3.2) erhalten wir eine gewohnliche Differentialgleichung folgender Form:

∂

∂tC(µ, t) = −

[µ2D − iµxV0

]C(µ, t) (3.5)

Mit µ2 = µ2x + µ2

y.

Fur weitere Zwischenschritte siehe Anhang A.2. (vgl. [AK76])

Eine Losung der gewohnlichen Differentialgleichung (3.5) sieht wie folgt aus:

C(µ, t) = C(µ, 0)e−(µ2D−iV0µx)t (3.6)

3 Mathematische Grundlagen 9

Wobei

C(µ, 0) =1

2π

∫R2

eir·µC(r, 0) dr (3.7)

die transformierte Anfangsverteilung ist.

Fuhren wir nun die Fourier-Rucktransformation durch und setzen die transformierte

Anfangsverteilung (3.7) ein, erhalten wir eine Losung der Fokker-Planck-Gleichung, die

im Wesentlichen nur noch von der Anfangsintensitat der Fluoreszenz C(r′, 0) abhangt:

C(r, t) =1

2π

∫R2

e−iµr1

2π

∫R2

eiµr′C(r′, 0) dr′e−(Dµ2−V0iµx)t dµ (3.8)

(vgl. [AK76])

Nach der Darstellung der mathematischen Grundlagen kann mit der Prasentation der

verschiedenen Anwendungen fortgefahren werden.

10

4. Anwendung I: Diffusion und Fluss

von Lipiden innerhalb der

Zellmembran

In diesem Kapitel wird eine erste Anwendung von Fluorescence Recovery after Photo-

bleaching prasentiert. Wir wollen mit FRAP Diffusion und Fluss von Lipiden innerhalb

der Zellmembran charakterisieren.

Grundlage fur die in Kapitel 4 dargestellten Aussagen ist die Publikation von D. Axel-

rod, D.E. Koppel, J. Schlessinger, E. Elson und W.W. Webb [AK76].

Abbildung 4.1.: Schematische Darstellung der Zellmembran [Bi13]

Abbildung 4.1 zeigt eine schematische Darstellung der Zellmembran. Bei dem folgenden

ersten Experiment befinden wir uns in der Lipiddoppelschicht einer Zellmembran, hier

in hellem Gelb eingefarbt.

Wie sieht das eigentliche Vorgehen bei dieser Anwendung mit FRAP nun aus?

Wir haben ein mit fluoreszierenden Proteinen markiertes Praparat sowie einen geeig-

neten Laser gegeben.

4 Anwendung I: Diffusion und Fluss von Lipiden innerhalb der Zellmembran 11

Dieser kann sowohl einen Lichtimpuls mit geringer Intensitat abgeben, durch den die

Fluorophore nicht zerstort werden, als auch einen mit sehr hoher Intensitat, welcher

dann irreversibel bleichen soll.

Es folgen die drei Phasen: Prebleaching, Bleaching und Postbleaching. In der letz-

ten Phase wird die Umverteilung der Fluoreszenz beobachtet und erfasst. (vgl. auch

[KW10])

Wir gehen davon aus, dass unser Bleichbereich Ω eine Teilmenge des R2 ist (Ω ⊂R2) und dass wir eine zweidimensionale Diffusion betrachten. Außerdem nehmen wir

an, dass der Fluss, sollte es einen geben, nur in x-Richtung verlauft. Dazu legen wir

die Achsen des Koordinatensystems so, dass der Fluss genau diese Bedingung erfullt.

Zusatzlich sei das verwendete Bleichmuster kreisformig, d.h. ein Kreis mit Radius ω.

Weiter setzen wir fur die folgenden Berechnungen den Mittelpunkt des Bleichmusters

als Nullpunkt.

Das weitere Vorgehen sieht nun wie folgt aus:

Zunachst werden wir die Anfangswerte der Fluoreszenz bestimmen. Anschließend stel-

len wir in einer Vorwartsrechnung die theoretische Fluoreszenzumverteilungskurve auf

und im letzten Schritt, einer Ruckwartsrechnung, wird die theoretische Fluoreszenz-

umverteilungskurve an die experimentell erfassten Daten angepasst, um Diffusion und

Fluss genauer zu charakterisieren.

4.1. Anfangs- und Randbedingungen

In diesem Abschnitt wollen wir das Fluoreszenzkonzentrationsprofil direkt nach dem

Bleichen bestimmen, welches uns als Anfangswert fur die noch ausstehende Rechnung

dienen wird. Außerdem gilt es die Randbedingung anzugeben.

Zuerst beschaftigen wir uns mit der Anfangsbedingung:

Der Zelle beziehungsweise einem Teil einer Zelle werden fluoreszierende Proteine inji-

ziert und die Intensitat der Fluoreszenz vor dem Bleichen C0 wird ermittelt. Dann

erfolgt das irreversible Bleichen durch den Laser und wir gehen davon aus, dass dies

mit konstanter Rate αI(r) geschieht.

Die Anderung der Fluoreszenzintensitat wahrend des Bleichvorgangs kann dann durch

folgende Gleichung beschrieben werden:

∂

∂tC(r, t) = −αI(r)C(r, t) (4.1)


Dabei beschreibt C(r, t) die Fluoreszenzintensitat, also die Intensitat der noch fluores-

zierenden Proteine an der Position r zum Zeitpunkt t. Die Bleichrate geht mit einem

negativen Vorzeichen in die Formel ein, denn je hoher die Bleichrate ist, desto mehr

Fluorophore werden gebleicht und die Fluoreszenzintensitat verringert sich. I(r) gibt

das Intensitatsprofil des Lasers an. Ein Beispiel fur ein Laserintensitatsprofil wird im

nachsten Abschnitt gegeben. (vgl. auch [So83])

Da wir im Folgenden die Umverteilung der Fluoreszenz betrachten wollen und die

Zeitrechnung des Bleichens nicht mit eingehen soll, fuhren wir eine neue Zeitvariable t

ein und ersetzen t durch t. t = 0 beschreibt den Zeitpunkt direkt nach dem Bleichen.

Eine Losung der Anderung des Fluoreszenzintensitatsprofils direkt nach dem Bleichen

(Gleichung (4.1)) sieht dann wie folgt aus:

C(r, 0) = C0e−αTI(r) (4.2)

Wobei T die Lange des Zeitintervalls des Bleichens angibt.

Hier muss beachtet werden, dass wir in der Bleichphase davon ausgehen, dass es zu kei-

nem nennenswerten Transport kommt. Wir konnen diese Annahme machen, da wir im

Vergleich zur Wiederherstellungsphase nur einen sehr kurzen Zeitraum T betrachten,

in dem gebleicht wird. (vgl. auch [So83])

Fur die weiteren Berechnungen fuhren wir einen Parameter K ein:

K ≡ αTI(0) (4.3)

K liefert die Rate des Bleichens in einem Referenzpunkt. In diesem Fall ist das der

Mittelpunkt des Bleichkreises, also unser gewahlter Nullpunkt.

Wir stellen durch Einsetzen des Referenzpunktes in das Fluoreszenzkonzentrationsprofil

nach dem Bleichen fest, dass der Parameter K nun in der Formel wiederzufinden ist:

C(0, 0) = C0e−αTI(0) (4.4)

Das Fluoreszenzkonzentrationsprofil direkt nach dem Bleichen (4.2) hangt also von K

ab. Diese Abhangigkeit wird durch einen Index verdeutlicht. Wir schreiben CK(r, 0).

(vgl. auch [So83])

Die gesuchte Anfangsbedingung ist somit durch die Gleichung (4.2) angegeben.


Die Randbedingung ist durch folgende Gleichung gegeben:

lim|r|→∞

C(r, t) = C0 (4.5)

Diese Darstellung ergibt sich dadurch, dass angenommen wird, dass die Umverteilung

der Fluoreszenz auf die Rander keinen Einfluss hat, sondern dass dort immer die In-

tensitat vor dem Bleichen C0 zu finden ist.

Nun haben wir das Fluoreszenzkonzentrationsprofil direkt nach dem Bleichen, also die

benotigten Anfangswerte, sowie die Randbedingung bestimmt und wir konnen zum

nachsten Abschnitt, der Vorwartsrechnung, ubergehen.

4.2. Vorwartsrechnung

In diesem Abschnitt fuhren wir eine Vorwartsrechnung durch, um die Umverteilungs-

kurve der Fluoreszenz zu bestimmen. Wir wollen also eine Modellierung finden, welche

die Transporte in der Lipidschicht beschreibt.

Wie in den mathematischen Grundlagen in Kapitel 3 erlautert wird, kann die Fokker-

Planck-Gleichung verwendet werden, um Diffusion und Fluss in einem System zu be-

schreiben. Wir ubernehmen die dort gemachten Annahmen und konnen somit unser

System durch die vereinfachte Fokker-Planck-Gleichung (Definition 3.1.2) darstellen:

∂

∂tC(r, t) = D∆C(r, t)− V0

[∂

∂xC(r, t)

](4.6)

Wir benotigen an dieser Stelle die im vorherigen Abschnitt 4.1 bestimmten Anfangs-

und Randbedingungen. Setzen wir diese Bedingungen in die Rechnungen ein, welche in

den mathematischen Grundlagen bereits vorgestellt wurden, erhalten wir eine Losung

der Differentialgleichung (4.6):

CK(r, t) =1

2π

∫R2

e−iµr1

2π

∫R2

eiµr′C0e

−αTI(r′) dr′e−(Dµ2−V0iµx)t dµ (4.7)

Die zum Zeitpunkt t ≥ 0 beobachtete Fluoreszenz ist dann durch folgende Formel

gegeben:

FK(t) ≡ c

∫R2

I(r)CK(r, t) dr (4.8)


Dabei wird, wie in Kapitel 2 schon erlautert wurde, im Wesentlichen uber die Konzen-

tration ungebleichter Fluorophore CK(r, t) integriert. An dieser Stelle geht zusatzlich

das Laserintensitatsprofil I(r) mit ein, welches angibt, wie stark in Abhangigkeit des

Vektors r gebleicht wurde. Die Konstante c gibt den Fehler an, der durch Laser- und

Lichteinflusse verursacht wird.

Setzt man die Losung der Differentialgleichung CK(r, t) in Gleichung (4.8) ein, so erhalt

man durch eine kleine Umformung fur die beobachtete Fluoreszenz folgende Darstel-

lung:

FK(t) =c C0

4π2

∫R2

Φ(µ)e−(µ2D−iV0µx)t dµ (4.9)

mit Φ(µ) ≡∫R2

I(r)e−iµ·r dr

∫R2

eiµ·r′−αI(r′)T dr′ (4.10)

Die Gleichungen (4.9) und (4.10) hangen nur noch vom Intensitatsprofil des Lasers

I(r), D und V0 ab.

Ist vom System jetzt schon bekannt, dass zum Beispiel kein Fluss vorhanden ist, kann

V0 hier schon Null gesetzt werden. Analog fur die Diffusion.

Abbildung 4.2.: Fluoreszenzumverteilung fur unterschiedliche Werte von K, falls keinFluss vorhanden ist [AK76]


Abbildung 4.2 zeigt die Kurven der beobachteten Fluoreszenz FK(t) fur unterschied-

liche Raten des Bleichens K, falls kein Fluss vorhanden ist. (Andere Falle gehen ana-

log.)

Wird mit einer hohen Rate K gebleicht, wie dies bei K = 100 der Fall ist, so kann man

erkennen, dass fast alle Fluorophore ausgeloscht wurden. Ist das K jedoch klein, zum

Beispiel K = 1, so liegt der y-Achsenabschnitt lediglich bei ungefahr 0,63.

Um die einzelnen FRAP-Kurven und somit in diesem Fall die Diffusion fur unterschied-

liche Werte von K besser vergleichen zu konnen, ist es von Noten eine weitere Funktion

fK(t) einzufuhren:

fK(t) ≡ FK(t)− FK(0)

FK(∞)− FK(0)(4.11)

Durch diese Darstellung der beobachteten Fluoreszenz beginnen alle FRAP-Kurven im

Ursprung und die erwunschte bessere Vergleichbarkeit ist gegeben. Dies sehen wir in

Abbildung 4.3.

Abbildung 4.3.: Verschobene Fluoreszenzumverteilung fur unterschiedliche Werte vonK, falls kein Fluss vorhanden ist [AK76]

Um zu erreichen, dass die allgemeinen Gleichungen der beobachteten Fluoreszenz FK(t)

beziehungsweise fK(t) nur noch von den zu bestimmenden Parametern D und V0

abhangen, muss das jeweilige Laserintensitasprofil eingesetzt werden. Es gibt viele un-

terschiedliche Profile der Laserintensitat. Wir wollen uns nun mit dem Gaußschen La-

serprofil beschaftigen. Fur weiterfuhrende Informationen zu anderen Laserprofilen siehe

[AK76] und [KW10].


Die Intensitat eines Lasers mit Gaußschem Profil ist in der Mitte des Bleichmusters am

hochsten und nimmt zum Rand hin ab. Das Intensitatsprofil ist somit gegeben durch:

I(r) =2P0

πω2e−2|r|2

ω2 (4.12)

Hierbei gibt P0 ein Maß fur die Laserkraft an und ω beschreibt die halbe Breite des

Profils bei einer Intensitat von 1e2

. Siehe dazu Anhang A.1.

Durch Einsetzen des Laserprofils in die Gleichungen (4.9) und (4.10) fur die beobachtete

Fluoreszenz FK(t) und mithilfe der Reihendarstellung von exp(−αr′T ) erhalten wir eine

Gleichung fur die beobachtete Fluoreszenz mit Gaußschem Intensitatsprofil:

FK(t) = cP0C0

∞∑n=0

(−K)ne−2(t/τF )2n/[1+n(1+2t/τD)]

n![1 + n(1 + 2t/τD)](4.13)

Dabei bezeichnet τD = ω2

4Ddie charakteristische Zeit fur die Diffusion und τF = ω

V0die

charakteristische Zeit fur den Fluss.

Wir haben nun eine Moglichkeit der Modellierung fur die Fluoreszenzumverteilung

gefunden.

4.3. Ruckwartsrechnung

Der Abschnitt Ruckwartsrechnung befasst sich mit der Analyse der experimentell er-

fassten Daten. Es wird die in Abschnitt 4.2 hergeleitete theoretische Kurve an die

experimentell erfassten Daten angepasst, um die erwunschten Parameter in unserem

System bestimmen zu konnen.

Dafur seien FK(t) und fK(t) die experimentell erfassten Daten. Um eine moglichst

gute Anpassung der theoretischen an die experimentellen Daten zu erreichen, sollte

man zunachst feststellen, um welche Art von Transport es sich hauptsachlich handelt.

Es sollte geklart werden, ob ein System vorliegt, in dem die Diffusion oder doch der

Fluss im Vordergrund stehen. Ist uns dies bekannt, konnen wir ein besseres Ergebnis

durch die noch ausstehenden Anpassungsmethoden erzielen.

Es werden nun zwei Moglichkeiten prasentiert, die Ruckwartsrechnung durchzufuhren.

Die eine bezieht sich auf das Dreischritt-Verfahren, die andere auf die Log-Log-Methode.


Betrachten wir im Folgenden zunachst das Dreischritt-Verfahren. Wie der Name schon

sagt, geht man hier im Wesentlichen in drei Schritten vor.

Im ersten Schritt berechnet man die Halbwertszeit der Wiederherstellung τ1/2 durch

Umstellen von:

fK(τ1/2) =1

2(4.14)

Dann bestimmen wir den Parameter K. Dazu muss das Laserprofil bekannt sein. Wir

verwenden hier wieder das Gaußsche Laserprofil. Wir erhalten K durch Umstellen der

Anfangsfluoreszenz:

FK(0) =cP0C0

K(1− e−K) (4.15)

Mit K bestimmen wir nun γD ≡τ1/2τD

und γF ≡τ1/2τF

durch Ablesen an Grafik 4.4. Diese

Grafik ist nur fur das Gaußsche Laserprofil verwendbar.

Abbildung 4.4.: γ vs. K fur das Gaußsche Laserprofil [AK76]

In diesen drei Schritten haben wir τ1/2, K, γD und γF bestimmt. Durch Umformen

der charakteristischen Zeiten fur Diffusion und Fluss erhalt man dann die gewunschten

Diffusions- und Flusskoeffizienten D und V0:

D =

(ω2

4τ1/2

)γD (4.16)

V0 =

(ω

τ1/2

)γF (4.17)

Das Dreischritt-Verfahren ist nur anwendbar, wenn bekannt ist, dass im Wesentlichen

eine der beiden Transportformen vorliegt. Kann dies nicht explizit bestimmt werden,

ist die Log-Log-Methode eine Alternative.


Die Log-Log-Methode nutzt aus, dass sich die theoretische und die experimentelle Kur-

ve um zwei multiplikative Faktoren in beide Richtungen des Plots unterscheiden.

Wendet man nun den Logarithmus auf beide Skalen an, so werden die multiplikativen

Faktoren zu einer einfachen Verschiebung, zum einen in horizontaler und zum anderen

in vertikaler Richtung, wie man in Abbildung 4.5 erkennen kann.

Abbildung 4.5.: Log-Log-Methode [AK76]

Setzen wir die horizontalen und vertikalen Verschiebungen in die Gleichung der Fluo-

reszenzumverteilung FK(t) ein und verrechnen diese mit den Parametern τD und τF ,

erhalten wir modifizierte Werte fur γD und γF . Diese setzt man dann in die Gleichungen

fur die Diffusion (4.16) und den Fluss (4.17) ein.

Somit sind die gewunschten Transportparameter bestimmt und wir konnen die Bege-

benheiten in der Zelle genauer charakterisieren.

19

5. Anwendung II: Langenberechnung

von Aktinfilamenten

Wir wollen uns in diesem Kapitel mit einer weiteren Anwendung von FRAP beschaftigen,

namlich der Langenberechnung von Aktinfilamenten.

Kapitel 5 orientiert sich an der Publikation von A.A. Halavatyi, P.V. Nazarov, Z. Al

Tanoury, V.V. Apanasovich, M. Yatskou und E. Friederich [HN10].

Aktinfilamente sind Bestandteile des Cytoskeletts einer Zelle und befinden sich im Cy-

toplasma direkt angrenzend an die Lipiddoppelschicht. In Abbildung 4.1 sind diese

Strange in einem dunklen Gelbton markiert worden.

Aktinfilamente spielen eine wichtige Rolle bei der Formgebung und der Beweglichkeit

einer Zelle. Auch an der Wundheilung und dem Wachstum des Gewebes sind sie maß-

geblich beteiligt. Besonders in Krankheitsfallen, wenn die Zellfunktionen gestort oder

eingeschrankt sind, kann man hier Veranderungen der Struktur erkennen. (vgl. auch

[PB03])

Aktin ist ein asymmetrisches Protein, welches dazu fahig ist, sich mit anderen Akti-

nen zu einem Filament zusammenzufugen. Ein Aktinfilament hat zwei unterschiedliche

Enden, welche ihm somit eine molekulare Polaritat verleihen. Zum einen besitzt es ein

gezacktes Ende, das sogenannte Barbed End (BE). Zum anderen hat es ein spitzes

Ende, auch Pointed End (PE) genannt. In Abbildung 5.1 sehen wir die schematische

Darstellung eines Aktinfilamentes mit den beiden unterschiedlichen Enden. (vgl. auch

[PB03])

Abbildung 5.1.: Schematische Darstellung eines Aktinfilamentes

Wie lasst sich nun FRAP vor dem Hintergrund dieser Informationen realisieren?

Betrachten wir zunachst einmal den Versuchsaufbau.

5 Anwendung II: Langenberechnung von Aktinfilamenten 20

Abbildung 5.2.: Schematischer Aufbau des FRAP-Experimentes (angelehnt an [HN10])

Abbildung 5.2 zeigt, dass das verwendete Bleichmuster kreisformig ist. Außerdem sei

das Intensitatsprofil des Lasers auf dieser Kreisflache konstant.

Die einzelnen Aktinfilamente sind durch ein Netzwerk von Proteinkomplexen mit der

Zellmembran verbunden und konnen sich somit nicht von der Stelle bewegen. Daher

kann der Austausch von gebleichten und noch fluoreszierenden Anteilen nur durch die

Abspaltung beziehungsweise die Anbindung an den Enden jedes einzelnen Filamentes

stattfinden.

Die Lange eines Aktinfilamentes ist ein wichtiger physiologischer Parameter einer Zelle

in Bezug auf die Bewegungen im Cytoskelett. Daher nehmen wir die Anbindungs- und

Trennungsraten, die Filamentlange sowie die Konzentrationen der freien als auch der

gebundenen Aktine als Grundlagen fur die folgenden Berechnungen. Aus diesem Grund

definieren wir:

L := Filamentlange

k+/−b := Anbindungsrate/Trennungsrate am BE

k+/−p := Anbindungsrate/Trennungsrate am PE

cm/f := Konzentration der freien/gebundenen Aktine

Weiter sei vb/p der daraus resultierende Ausdehnungs- beziehungsweise Db/p der Diffu-

sionskoeffizient, jeweils bezuglich des BE und des PE.

Wir werden im Verlauf des Kapitels sehen, dass diese Großen von den Bewegungsraten

an den zwei Enden k+/−b/p abhangen.

M beschreibt die Anzahl der Aktine innerhalb eines Filaments.


Abbildung 5.3.: Teilweise gebleichtes Filament (angelehnt an [HN10])

In Abbildung 5.3 ist ein einzelnes Aktinfilament dargestellt. Nachdem der Bleichvor-

gang abgeschlossen wurde, besteht das Filament aus einzelnen gebleichten und unge-

bleichten Aktinen.

Fur die nachfolgende Modellierung nehmen wir an, dass die Fluorophore in einem Ak-

tin entweder allesamt ausgebleicht wurden oder noch vollstandig Licht emittieren.

Weiter gehen wir davon aus, dass einmal abgespaltene Aktine sofort und irreversibel

den gesamten Bereich, welchen wir betrachten, verlassen. Diese Annahme ist gerecht-

fertigt, falls der Radius des gebleichten Bereichs relativ klein ist und der Transport

im Cytoplasma im Vergleich zur Anbindung und Trennung an BE und PE schneller

vonstattengeht.

Im folgenden Abschnitt fuhren wir eine Vorwartsrechnung durch, um die Fluoreszenz-

umverteilungskurve aufzustellen. Darauf folgt eine Ruckwartsrechnung, in der die Fluo-

reszenzumverteilungskurve an die experimentell erfassten Daten angepasst wird, damit

abschließend die Filamentlange L bestimmt werden kann.

5.1. Vorwartsrechnung

Wir wollen nun in diesem Abschnitt eine Funktion angeben, welche die Fluoreszenzum-

verteilung im speziellen Fall von Anwendung II beschreibt.

Dazu werden wir zu Beginn gewisse Annahmen an unser System festlegen:

Es wird im Folgenden nur ein Filament aus dem Komplex betrachtet und der Bleich-

bereich Ω sei eine Teilmenge der reellen Zahlen (Ω ⊂ R). Die Reaktionen an BE und

PE seien unabhangig voneinander. Außerdem sollen einmal abgeloste Aktine fur den

Anbindungsprozess nicht mehr zur Verfugung stehen.


Zunachst werden wir nur Reaktionen betrachten, die am PE stattfinden. Diese Re-

aktionen wollen wir mithilfe von Ubergangswahrscheinlichkeiten, also als stochasti-

sches Ereignis, beschreiben. Wir befinden uns an der i-ten Stelle im Filament. (Um die

Zahlweise genauer verstehen zu konnen, siehe Abbildung 5.3.)

Es sei pi(t) die Wahrscheinlichkeitsfunktion, die angibt, ob an Position i ein gebleichtes

Aktin vorhanden ist. Dann genugt pi folgender Differentialgleichung:

d

dtpi(t) =

J∑j=1

(−Wijpi(t) +Wjipj(t)) (5.1)

Hierbei bezeichnet J alle moglichen Zustande und mit Wij sind die Ubergangswahr-

scheinlichkeiten von Zustand i zu Zustand j gemeint.

Es wird weiter angenommen, dass Anbindung und Trennung an den Enden nur einzeln

moglich sind und sich keine ganzen Ketten ablosen oder anbinden konnen. In unserem

Fall kann das i-te Aktin also auf die Position i + 1 oder auf die Position i − 1 durch

Anbindungen und Trennungen am PE verschoben werden. Es gilt fur die jeweiligen

Ubergangswahrscheinlichkeiten:

Wi(i+1) = W(i−1)i = k+p cm

Wi(i−1) = W(i+1)i = k−p

Eingesetzt in Gleichung (5.1) erhalten wir:

d

dtpi(t) = −(k+

p cm + k−p )pi(t) + k+p cmpi−1(t) + k−p pi+1(t) (5.2)

Mit i = 1, 2, ...,M , wobei M die maximale Anzahl der Aktine angibt. p0 setzen wir

hier Null (p0 = 0).

Im nachsten Schritt gehen wir davon aus, dass das Filament lang genug ist (≥ 1µm,

M ≥ 400). Somit konnen wir von den diskreten Wahrscheinlichkeiten pi(t) zu einer

Wahrscheinlichkeitsdichte ρ(x, t) ubergehen. Um dies zu erreichen, wird eine Taylor-

Entwicklung bezuglich der Variable x durchgefuhrt und der Grenzwert M → ∞ wird

betrachtet. Es folgt fur die kontinuierliche Wahrscheinlichkeitsverteilung ρ(x, t):

∂

∂tρ(x, t) ≈

k−p + k+p cm

2δ2 ∂

2

∂x2ρ(x, t)− (k+

p cm − k−p )δ∂

∂xρ(x, t) (5.3)

Wobei ρ(0, t) = 0 gilt und δ den Abstand der Aktine im Filament beschreibt.


Wir setzen:

vp := (k+p cm − k−p )δ (5.4)

Dp :=k−p + k+

p cm

2δ2 (5.5)

Einsetzen in Gleichung (5.3):

∂

∂tρ(x, t) = Dp

∂2

∂x2ρ(x, t)− vp

∂

∂xρ(x, t) (5.6)

Gleichung (5.6) hat nun wieder die Form einer Fokker-Planck-Gleichung. Dabei in-

terpretieren wir den hinteren Summanden als die durchschnittliche Verlangerung am

Pointed End. Ein positives vp wird als Verlangerung der Filamentkette gedeutet. Der

vordere Term beschreibt in unserem Kontext eine Schwankung der Filamentlange. Die-

se Schwankung kann als eindimensionale Diffusion aufgefasst werden.

Mit der Annahme, dass einmal abgeloste Aktine irreversibel den gesamten Bereich

augenblicklich verlassen und somit fur einen Wiederanbau nicht mehr zur Verfugung

stehen, erhalten wir eine Losung der Gleichung (5.6) in folgender Form:

ρx0(x, t) =1

2√πDpt

(e− (x−x0−vpt)

2

4Dpt − e−(x+x0−vpt)

2

4Dpt− vpx0

Dp

)(5.7)

ρx0(x, t) beschreibt die Aufenthaltswahrscheinlichkeit eines gebleichten Aktins in x zum

Zeitpunkt t, welches sich zur Zeit t = 0 in x0 befand.

Die Variable x enthalt insbesondere auch die moglichen Positionen, welche außerhalb

des Filaments liegen konnen.

Integration uber den gesamten Raum liefert eine Wahrscheinlichkeit Pp(x0, t), die an-

gibt, ob das gebleichte Aktin aus x0 noch im Filament enthalten ist:

Pp(x0, t) =

∞∫0

ρx0(x, t) dx = Φ

(x0 + vpt√

2Dpt

)− e−

vpx0Dp Φ

(vpt− x0√

2Dpt

)(5.8)

mit Φ(u) =1√2π

u∫−∞

e−t22 dt (5.9)


Wir haben bisher nur Reaktionen am Pointed End betrachtet, konnen aber analog die

Gleichung fur Reaktionen am Barbed End aufstellen und erhalten:

Pb(y0, t) =

∞∫0

ρy0(x, t) dx = Φ

(y0 + vbt√

2Dbt

)− e−

vby0Db Φ

(vbt− y0√

2Dbt

)(5.10)

Wir nutzen nun aus, dass y0 = L−x0 gilt und dass die Reaktionen am BE und am PE

unabhangig voneinander stattfinden.

Es ergibt sich eine Wahrscheinlichkeit P (x0, t) bezuglich beider Filamentenden, welche

angibt, ob das gebleichte Aktin aus x0 noch im Filament enthalten ist:

P (x0, t) = Pp(x0, t)Pb(L− x0, t) (5.11)

Integrieren wir uber alle moglichen Startzustande x0, erhalten wir die Gesamtwahr-

scheinlichkeit P (t), welche beschreibt, ob gebleichte Aktine im Filament zu finden sind:

P (t) =

L∫0

P (x0, t)φ(x0) dx0 (5.12)

Wobei φ die Verteilungsfunktion der gebleichten Zustande im Filament darstellt (mitL∫0

φ(ξ) dξ = 1). Dieser Verteilungsfunktion liegt das verwendete spezifische Laserinten-

sitatsprofil zugrunde.

Mit den im Vorfeld eingefuhrten Variablen cf und cm ergibt sich fur die Wiederherstel-

lungskurve der Fluoreszenz:

FRAP (t) = 1− cfcm + cf

P (t) (5.13)

Eine Gleichung fur die Fluoreszenzumverteilung ist angegeben und es kann mit der

Ruckwartsrechnung fortgefahren werden.


5.2. Ruckwartsrechnung

Wir wollen in diesem Abschnitt die aufgestellte Kurve fur die Fluoreszenzumverteilung

an die experimentell erfassten Daten anpassen.

Die experimentell erfassten Daten werden im Folgenden mit F (t) bezeichnet. Diese

Daten und auch die Anbindungs- und Trennungsraten k+/−p/q fur BE und PE sind uns

durch die Messungen des Experimentes bekannt.

Es wird angenommen, dass vor dem Bleichen und wahrend des Bleichvorgangs ein

Gleichgewichtszustand zwischen Anbindung und Trennung auf beiden Seiten gegeben

ist (k+b cm + k+

p cm = k−b + k−p ). Daraus folgt durch Umformung:

cm =k−b + k−pk+b + k+

p

Durch Einsetzen von cm in Gleichungen (5.4) und (5.5) erhalten wir (analog fur BE):

vb = −vp =k+b k−p − k+

p k−b

k+b + k+

p

δ

Db =2k+

b k−b + k+

b k−p + k+

p k−b

2(k+b + k+

p )δ2

Dp =2k+

p k−p + k+

b k−p + k+

p k−b

2(k+b + k+

p )δ2

Es sind nun alle Parameter bis auf L und cf bestimmt. L und cf erhalten wir durch

geeignete Optimierungsverfahren.

Zum Beispiel konnen wir die Methode der kleinsten Quadrate anwenden, um eine

bestmogliche Approximation zu erhalten. Dazu berechne:

mincf ,L

∑i

[FRAP (ti, cf , L)− F (ti)]2 (5.14)

(vgl. [DH08])

Somit ist die Lange L des Aktinfilaments angegeben.

26

6. Anwendung III: Diffusion von

Molekulen innerhalb des Zellkerns

In Kapitel 6 wird eine weitere Anwendung von Fluorescence Recovery after Photo-

bleaching beschrieben. Es werden die Bewegungen von Molekulen innerhalb des Zell-

kerns betrachtet, wobei der Diffusionskoeffizient im Mittelpunkt steht.

In diesem Kapitel folgen wir der Darstellung von G. Carrero, D. McDonald, E. Craw-

ford, G. de Vries, M.J. Hendzel [CM03].

Der Zellkern, auch Nucleus genannt, ist das Steuerungselement einer jeden Zelle. In

ihm befindet sich die Erbinformation (DNA). Sie enthalt unter anderem die Informa-

tionen fur den Bau der Proteine.

Ist die DNA beschadigt oder mutiert, so veranlasst sie die Bildung von veranderten

Proteinen. Dieser Prozess ist Ursache fur viele Krankheiten.

Auch die Huntington-Krankheit basiert auf einem Gendefekt.”Auf der DNA, dem

Trager der Erbinformation, sind gewisse Abschnitte als mehrfache Kopie aneinander-

gereiht.“ ([Dz13]) Somit wird das Protein Huntingtin nicht exakt produziert.”Fur den

Organismus ist das Huntingtin lebensnotwendig. Es ist ein Multitalent, das fur viele

Vorgange von Bedeutung ist. Ist das Protein fehlerhaft, so fuhrt das zum Absterben

von Gehirnzellen.“ ([Dz13]) Einige Forscher haben FRAP verwendet, um die markier-

ten fehlerhaften Proteine zu lokalisieren. (vgl. [Dz13])

Die Bewegungen der Proteine innerhalb des Nucleus sind bisher nur in Ansatzen er-

forscht. Die Forscher erhoffen sich unter anderem durch FRAP weitere Aufschlusse

uber die Vorgange im Zellkern zu erhalten.

Im folgenden Abschnitt wird die Funktion der Fluoreszenzumverteilung hergeleitet,

die berucksichtigt, dass der Zellkern durch eine Membran vom Zellplasma abgegrenzt

ist. Anschließend wird deutlich gemacht, in welcher Weise die Berucksichtigung der

Membran die Berechnung des Diffusionskoeffizienten beeinflusst.

6 Anwendung III: Diffusion von Molekulen innerhalb des Zellkerns 27

6.1. Vorwarts- und Ruckwartsrechnung

In diesem Abschnitt wollen wir eine Kurve fur die Fluoreszenzumverteilung im Zellkern

herleiten und angeben, wie der Diffusionskoeffizient bestimmt werden kann.

Im Allgemeinen werden die Bewegungen innerhalb eines Nucleus durch Diffusion cha-

rakterisiert.

Die Modellierung, die in Kapitel 4 hergeleitet wurde, kann beispielsweise auch fur

die Betrachtung der Vorgange im Zellkern verwendet werden. Daher konnen wir die

Konzentration der Fluorophore nach dem Bleichvorgang u(r, t) durch eine partielle

Differentialgleichung beschreiben:

∂

∂tu(r, t) = D∆u(r, t), t > 0,

u(r, 0) = f(r)(6.1)

Wobei r = (x, y) die Ortsvariable in den Richtungen x und y ist, D fur den Diffusi-

onskoeffizienten steht und f(r) die Fluoreszenzkonzentration direkt nach dem Bleichen

angibt.

Wir nehmen an, dass die Intensitat des verwendeten Lasers durch das Gaußsche Profil

beschrieben werden kann. Die Fluoreszenzumverteilungskurve F (t) hat somit folgende

Gestalt (vgl. auch [AK76]):

F (t) = cP0C0

∞∑n=0

(−K)n

n![1 + n(1 + 2t/τD)](6.2)

(Die Bedeutung der einzelnen Variablen ist in Kapitel 4 gegeben.)

Um diese Modellierung zu erhalten, wurde im Vorhinein angenommen, dass die Diffu-

sion in einem unendlichen Raum stattfindet (r ∈ Rn).

Diese Annahme widerspricht jedoch den physiologischen Begebenheiten, denn eine Zel-

le beziehungsweise ein Zellkern ist durch eine Membran begrenzt. Diese Membran ist

fur viele Molekule undurchlassig und dient somit als Barriere. Wollen wir die Bewe-

gungsablaufe im Zellkern genauer verstehen, ist es wichtig, dass dieser Aspekt in unser

Modell mit einbezogen wird. Aus diesem Grund betrachten wir im Folgenden einen

endlichen Bereich Λ, welcher den Zellkern darstellen soll.

Zudem nehmen wir an, dass es keinen Fluss in den Zellkern hinein oder aus ihm heraus

gibt.


Indem wir diese Annahmen berucksichtigen, erhalten wir eine erweiterte Darstellung

der Gleichungen (6.1) mit Neumann-Randbedingung:

∂

∂tu(r, t) = D∆u(r, t), r ∈ Λ, t > 0,

∂

∂ηu(r, t) = 0, r ∈ ∂Λ, t > 0,

u(r, 0) = f(r), r ∈ Λ

(6.3)

∂Λ ist der Rand des Gebietes Λ und η bezeichnet die außere Normale an ∂Λ.

Im nachsten Schritt wird die Flache des Zellkerns Λ approximiert. Wir gehen davon

aus, dass der Nucleus die Form eines Rechtecks mit Lange l besitzt.

Das verwendete Laserprofil soll einem schmalen Streifen der Breite 2h gleichen. Die

Mitte des Bleichmusters befindet sich an der Stelle c auf der x-Achse. Dieser Laser-

typ wird haufig fur Experimente verwendet, die die Membran in der Modellierung

berucksichtigen.

Abbildung 6.1.: Approximation des Nucleus (angelehnt an [CM03])

In Abbildung 6.1 ist die Approximation des Zellkerns visualisiert.


Durch diese getroffenen Bedingungen kann das System der Gleichungen (6.3) zu einem

eindimensionalen Problem vereinfacht werden:

∂

∂tu(x, t) = D

∂2

∂x2u(x, t), x ∈ (0, l), t > 0,

∂

∂xu(x, t) = 0, x = 0, l, t > 0,

u(x, 0) = f(x), x ∈ (0, l)

(6.4)

Mit der Anfangsbedingung f(x) gegeben durch:

f(x) =

0, |x− c| ≤ h,

u0, |x− c| > h(6.5)

u0 gibt die Intensitat der Fluoreszenz vor dem Bleichen an.

f(x) ist von der angegebenen Form, wenn der Laser mit einer auf der Breite von 2h

gleichbleibenden Intensitat bleicht.

Integrieren wir die Losung der Gleichungen (6.4) uber die Breite des Bleichmusters 2h

und teilen das Ergebnis durch die Gesamtheit der fluoreszierenden Molekule im ge-

bleichten Bereich 2hu0, so erhalten wir folgende Fluoreszenzumverteilungskurve FB(t):

FB(t) =(l − 2h)

l− l

hπ2

∞∑n=1

1

n2e−(nπl )

2Dt ×

[sin

(nπ(c− h)

l

)− sin

(nπ(c+ h)

l

)]2

(6.6)

Die Lange l des Zellkerns kann durch die Fluoreszenzintensitat vor dem Bleichen F0

und direkt nach dem Bleichvorgang Fa ausgedruckt werden:

l = 2hF0

(F0 − Fa)(6.7)

Die Ruckwartsrechnung, um den Diffusionskoeffizienten D zu bestimmen, kann bei-

spielsweise analog zu Abschnitt 5.2 durchgefuhrt werden. Dort wurde zur Approxima-

tion die Methode der kleinsten Quadrate verwendet.


6.2. Einfluss der Berucksichtigung der Kernmembran

auf die Berechnung des Diffusionskoeffizienten

In diesem Abschnitt wird beschrieben, inwieweit die Berucksichtigung der Kernmem-

bran die Berechnung des Diffusionskoeffizienten beeinflusst. Dazu wird zuerst disku-

tiert, ob es einen Unterschied macht, an welcher Position sich der gebleichte Bereich im

Zellkern befindet. Anschließend wird die Fluoreszenzumverteilung in einem begrenz-

ten Bereich FB(t) mit der in einem unbegrenzten Bereich FU(t) verglichen und die

Auswirkungen auf die Berechnung des Diffusionskoeffizienten D werden dargelegt.

Nehmen wir an, dass in einem unbegrenzten Gebiet gebleicht wird, so hat die Positi-

on des Bleichbereichs keinen Einfluss auf den Diffusionskoeffizienten. Das liegt daran,

dass die Diffusion in diesem Gebiet durch nichts behindert wird, was eine Abweichung

verursachen konnte.

Betrachten wir im Folgenden ein begrenztes Gebiet. Wird in der Mitte des Nucleus

gebleicht, so kann die Umverteilung zugig vonstattengehen.

Bleichen wir jedoch in der Nahe der Membran, wird die Diffusion durch diese Barriere

beeinflusst. Die noch fluoreszierenden Proteine sind nicht an allen Seiten des gebleichten

Bereichs in gleichem Maße vorhanden. Dadurch wird die Umverteilung verlangsamt.

Abbildung 6.2.: Auswirkung der Bleichposition auf die Fluoreszenzumverteilung in ei-nem begrenzten Bereich


In Abbildung 6.2 sehen wir die Umverteilung der Fluoreszenz in einem Zellkern der

Lange l = 20µm mit einem Diffusionskoeffizienten von D = 10µm2

s. Der Bleichbereich

ist 5µm breit. Im Fall F1 befindet sich die Mitte des Bleichbereichs auf der x-Achse

an der Stelle c = l2

und im Fall F2 bei c = l4. Wir sehen deutlich den verursachten

Unterschied in der Umverteilung der Fluoreszenz.

Um die Fluoreszenzumverteilung in einem begrenzten Gebiet FB(t) mit der in einem

unbegrenzten Bereich vergleichen zu konnen, fuhren wir eine neue Funktion FU(t) ein.

FU(t) erhalten wir, indem wir Gleichungen (6.4) ohne die Neumann-Randbedingung

losen:

FU(t) =1

4h

h∫−h

[erfc

(h+ x√

4Dt

)+ erfc

(h− x√

4Dt

)]dx (6.8)

Wobei erfc(x) = 1− 2√π

x∫0

e−ν2

dν die komplementare Fehlerfunktion ist.

Zuerst wollen wir die beiden Kurven FU(t) und FB(t) hinsichtlich ihres asymptotischen

Verhaltens untersuchen. Wir bilden dazu jeweils den Grenzwert:

limt→∞

FB(t) =l − 2h

l< 1

limt→∞

FU(t) = 1(6.9)

Es zeigt sich, dass ein bestimmter Anteil der Fluoreszenz in dem begrenzten Bereich

durch das Bleichen verloren geht und die Intensitat vor dem Bleichvorgang nicht erneut

erreicht werden kann. Betrachten wir ein unbegrenztes Gebiet, so konnen wir davon

ausgehen, dass die Fluoreszenzintensitat vor dem Bleichen nach einer gewissen Zeit der

Umverteilung wieder vorhanden ist.

Mit den oben genannten Werten der Lange des Zellkerns sowie der Breite des Bleich-

bereichs erhalten wir fur den ersten Grenzwert einen Wert von 34. In diesem Fall sehen

wir, dass ein viertel der Fluoreszenzintensitat irreversibel ausgebleicht wurde.

Wir wollen uns abschließend mit den Auswirkungen der beiden Kurven auf die Berech-

nung des Diffusionskoeffizienten D beschaftigen.

Dazu fuhren wir zunachst eine Normierung der experimentellen Daten durch. Seien

F ∗(t) die normierten experimentell erfassten Daten bezuglich der Intensitat vor dem

Bleichen und F (t) normiert bezuglich der Fluoreszenzintensiat nach der Umverteilung.

Wir betrachten einen Nucleus mit geschatzter Lange l = 20µm und einen 5µm breiten

Bleichbereich, welcher in der Zellkernmitte positioniert ist.


Zuerst wird die theoretische Kurve FB(t) mittels der Methode der kleinsten Quadrate

an die experimentellen Daten F ∗(t) angepasst. Es ergibt sich ein Diffusionskoeffizient

von D = 10µm2

s. Der Kurvenverlauf ist in Abbildung 6.3 dargestellt. Zudem sehen

wir die Kurve der Fluoreszenzumverteilung in einem nicht begrenzten Bereich FU(t),

ebenfalls mit einem Diffusionskoeffizient von D = 10µm2

s.

Abbildung 6.3.: Vergleich von FU(t) und FB(t) bezuglich der Daten F ∗(t)

Wir stellen fest, dass die Kurve der Funktion FU(t) oberhalb der Kurve der Funktion

FB(t) liegt und somit auch oberhalb der experimentellen Daten F ∗(t) verlauft.

Hatte man die Funktion FU(t) an die Daten F ∗(t) angepasst, so wurde der zugehorige

Graph niedriger verlaufen als der in Abbildung 6.3 dargestellte. Der daraus resultie-

rende Diffusionskoeffizient ware kleiner und wurde somit den wahren Wert D = 10µm2

s

unterschatzen.

Zur besseren Vergleichbarkeit normalisieren wir im nachsten Schritt die Umverteilungs-

kurve der Fluoreszenz in einem begrenzten Bereich FB(t):

FB(t) =l

l − 2hFB(t) (6.10)

Um Abbildung 6.4 zu erhalten, wird die Funktion FB(t) an die experimentellen Daten

F (t) angepasst. Es ergibt sich analog ein Diffusionskoeffizient von D = 10µm2

s. Wir

erkennen, dass die Kurve zu FU(t) unterhalb der Kurve zu FB(t), also auch unterhalb

der experimentellen Daten F (t), verlauft.


Abbildung 6.4.: Vergleich von FU(t) und FB(t) bezuglich der Daten F (t)

Daher wurden wir bei Anpassung der theoretischen Kurve FU(t) an die Daten F (t)

den vorliegenden Diffusionskoeffizienten uberschatzen. Es ist demnach fur die korrekte

Bestimmung des Diffusionskoeffizienten von Bedeutung, welches der beiden Modelle

wir verwenden.

In Abbildung 6.3 ist zu sehen, dass zu Beginn der Umverteilung die Kurven beider

Funktionen, FU(t) und FB(t), ubereinstimmen.

Das bedeutet, dass es fur die anfangliche Umverteilung keinen Unterschied macht, ob

von einer Modellierung mit oder ohne Membran ausgegangen wird.

Die oben beschriebene Unterschatzung des Diffusionskoeffizienten konnte demnach ver-

mieden werden, wenn wir nur die ersten experimentell erfassten Daten betrachten

wurden.

34

7. Allgemeine Probleme des

Fluorescence Recovery after

Photobleaching

In diesem Kapitel wird auf das hohe Fehlerpotential des Fluorescence Recovery after

Photobleaching und die damit verbundenen Probleme aufmerksam gemacht.

Vor der eigentlichen Durchfuhrung eines FRAP-Experimentes, sollte das Laserprofil

des eingesetzten Lasers genau bestimmt werden. Das Laserprofil ist, wie schon gezeigt

wurde, fur die Modellierung von großer Bedeutung. (vgl. [KW10])

Abbildung 7.1.: Wirkung des Observational Photobleaching und der Mobile Fractionauf die Fluoreszenzumverteilung (angelehnt an [KW10])

7 Allgemeine Probleme des Fluorescence Recovery after Photobleaching 35

Außerdem darf die Grundbelichtung des Lasers, um die Fluoreszenz sichtbar zu ma-

chen, nicht zu hoch sein, da sonst in den Phasen Prebleaching und Postbleaching Fluo-

rophore ungewollt gebleicht werden. Dieses Phanomen nennt man auch Observational

Photobleaching.

In Abbildung 7.1 sehen wir im Fall M=1 die Auswirkungen von Observational Photo-

bleaching. Die durchgezogene schwarze Linie stellt die Fluoreszenzumverteilung ohne

Observational Photobleaching dar. Bei den beiden gestrichelten Graphen ist die Inten-

sitat des Lasers fur die Beobachtung zu hoch. Wie man sieht, findet nicht nur aus-

schließlich eine Umverteilung der Fluoreszenz statt, denn zu einem spateren Zeitpunkt

sind weniger Fluorophore vorhanden, als zu einem fruheren Zeitpunkt. (vgl. [KW10])

Die sogenannte Mobile Fraction M ist ein weiterer Aspekt, der bei der Modellierung

eines FRAP-Experimentes beachtet werden sollte. Sie beschreibt den Anteil der Mo-

lekule, die sich in der Zelle frei bewegen konnen. Das Gegenteil, die Immobile Fraction

(1-M), gibt den Prozentsatz der unbeweglichen Molekule an. Liegt der Prozentsatz der

Mobile Fraction beispielsweise bei M=0.5, so kann die Anfangsintensitat der Fluores-

zenz durch die Umverteilung nicht mehr erreicht werden, wie ebenfalls in Abbildung

7.1 zu erkennen ist.

Die Werte der Mobile Fraction und der Immobile Fraction sind interessant, wenn man

sich fur den Aufbau einer bestimmten Zelle und fur die Ablaufe im Inneren interessiert.

Sind die vorhandenen Molekule in der zu betrachtenden Zelle auf eine gewisse Weise

angeordnet und beispielsweise durch ein Bindungsprotein mit der Membran verbunden,

konnen sie sich nicht bewegen und es findet kein Austausch in der Zelle statt.

Bei erhohter Immobile Fraction kann die Diffusion in der Zelle außerdem durch eine

Bindung der freien an die unbeweglichen Molekule beeinflusst und gestort werden. (vgl.

[KW10])

Weiter ist es notwendig, dass die Fluorophore, die zur Markierung verwendet werden,

fur diesen Prozess geeignet sind. Dabei ist darauf zu achten, welche Zelltypen man

betrachtet, also welche Molekule in der Zelle vorhanden sind, um zu vermeiden, dass die

Fluoreszenz chemisch rekonstruiert werden kann. Ebenfalls sollten sie sich irreversibel

bleichen lassen. (vgl. [AK76])

Man muss zudem darauf achten, dass Bleichmuster und Radius passend gewahlt sind.

Einerseits muss der Radius groß genug sein, damit man vernunftige Ergebnisse erhalt,

andererseits sollte er im Vergleich zum Gesamtsystem aber klein genug sein, um sicher-

zustellen, dass noch genugend Fluorophore vorhanden sind, die durch die Umverteilung

erfasst werden konnen. (vgl. [KW10])

7 Allgemeine Probleme des Fluorescence Recovery after Photobleaching 36

Ein weiteres Problem ist die Belichtungszeit wahrend des Bleichens. Durch eine zu

lange Bleichphase kann es passieren, dass die Fluorophore in dem gebleichten Gebiet

mit der Umgebung in der Zelle in Wechselwirkung treten.

Dies hat zur Folge, dass bereits bestrahlte Fluorophore aus dem Fokus des Lasers aus-

treten und durch fluoreszierende ersetzt werden, die daraufhin falschlicherweise eben-

falls gebleicht werden. (vgl. [KW10])

Durch die Ungenauigkeiten an den Randern des Bleichgebietes variiert der Radius. Hier

ist zu beachten, dass der Radius in quadrierter Form in die Berechnung der Diffusion

eingeht (siehe dazu Kapitel 4). Daher birgt der Radius ein sehr hohes Fehlerpotenzial.

Zur Verdeutlichung ist eine Rechnung im Anhang A.3 angegeben. (vgl. [RG10])

37

8. Zusammenfassung und Ausblick

In dieser Arbeit haben wir gesehen, auf welche Weise Fluorescence Recovery after

Photobleaching funktioniert und angewendet werden kann. Es wurden nach einer kur-

zen Vorbereitung drei unterschiedliche Anwendungen der Methode explizit angegeben.

Zum Schluss haben wir mogliche Probleme, die bei einem FRAP-Experiment auftreten

konnen, diskutiert.

FRAP entwickelt sich seit den Anfangen in den siebziger Jahren immer weiter. Auch

heute spielt die Methode in der Cytologie noch eine wichtige Rolle. Besonders die klei-

nen Organellen innerhalb einer Zelle, wie zum Beispiel der Zellkern, sind bisher noch

nicht hinreichend erforscht worden.

Da durch diese Methode Transport jeglicher Art in vivo und in vitro untersucht werden

kann, wird sie auch in der Pharmazie haufig verwendet. Die Pharmazeuten benutzen

FRAP unter anderem, um den Weg der Arzneimittel zu den Zellen zu visualisieren.

Ebenso wird dann untersucht wie die Makro- bzw. Mikromolekule der Arzneimittel

durch die Zellmembran in die Zelle eindringen konnen. Dies ist theoretisch nur schwer

zu erfassen, daher werden oftmals Experimente durchgefuhrt. Die Medikamente konnen

aufgrund der gewonnenen Erkenntnisse weiter verbessert werden, sodass eine kontrol-

lierte Zufuhrung der Wirkstoffe sichergestellt werden kann.

Eine weitere Anwendung liegt darin, dass die Bewegung der krebsbekampfenden Mit-

tel und ihre Anbindung am Tumorgewebe mittels FRAP analysiert wird. Gerade die

Krebsforschung benotigt noch weitere Aufklarung, denn eine Heilung ist in den meisten

Fallen noch nicht moglich.

Die Weiterentwicklung der Methode geht einher mit den technischen Fortschritten in

den Bereichen der Mikroskopie und der Bildverarbeitung. Denn je hochauflosender die

Bilder der Mikroskope werden, desto tiefere Einblicke bekommt man in die jeweiligen

biologischen Prozesse. (vgl. [MD99])

Mittels FRAP konnen so in Zukunft viele Fragen, unter anderem aus den Bereichen

der Pharmazie und der Cytologie, beantwortet werden.

38

A. Anhang

A.1. Bestimmung von ω im Gaußschen Intensitatsprofil

Abbildung A.1.: Gaußsches Intensitatsprofil (angelehnt an [Gl13])

Die gestrichelte Linie gibt in dieser Darstellung die doppelte Lange von ω an.

A Anhang 39

A.2. Rechnung zu Abschnitt 3.2, um Gleichung (3.5)

zu erhalten

Gegeben ist die vereinfachte Fokker-Planck-Gleichung aus Definition 3.1.2:

∂

∂tC(r, t) = D∆C(r, t)− V0

[∂

∂xC(r, t)

]Außerdem gilt fur die Fourier-Transformation unabhangig von der Zeit:

ˆ(∂

∂tC(r, t)

)=

∂

∂tC(µ, t), µ ∈ R2

Einsetzen ergibt somit:

∂

∂tC(µ, t) = D

(ˆ(

∂2

∂x2C(r, t)

)+

ˆ(∂2

∂y2C(r, t)

))− V0

ˆ(∂

∂xC(r, t)

)

Mit der Definition der Fourier-Transformation 3.2.1 erhalten wir nun Gleichung (3.5):

∂

∂tC(µ, t) = D

(−µ2

xC(µ, t)− µ2yC(µ, t)

)− V0

(−iµxC(µ, t)

)= −D

(µ2C(µ, t)

)+ V0iµxC(µ, t)

= −(Dµ2 − V0iµx

)C(µ, t)

(vgl. [AK76])

A Anhang 40

A.3. Rechnung zum Fehlerpotential des Radius ω

An dieser Stelle wird eine Rechnung angegeben, um zu verdeutlichen, was eine Mess-

ungenauigkeit beim Radius des Bleichmusters bewirkt.

Angenommen wir verwenden ein Gaußsches Laserprofil und der wesentliche Transport

ist die Diffusion mit:

τ1/2 = 2s

K = 1Gaußprofil======⇒ γD ≈ 1, 1

ω = 5µm

Setzen wir diese Werte in die Formel fur die Diffusion ein, ergibt sich:

Dω=5µm =ω2

4τD=ω2

4

γDτ1/2

=(5µm)2

4

1, 1

2s≈ 3, 44

µm2

s

Verandern wir den Radius jetzt um 1µm, so ergibt sich fur den Diffusionskoeffizienten:

Dω=6µm =ω2

4τD=ω2

4

γDτ1/2

=(6µm)2

4

1, 1

2s≈ 4, 95

µm2

s

Man sieht, kleine Messungenauigkeiten beim Radius bewirken relativ große Fehler bei

der Berechnung des Diffusionskoeffizienten.

41

Abbildungsverzeichnis

2.1. Fluoreszierende Zelle mit markiertem Bleichbereich Ω [KW10] . . . . . 3

2.2. Fluoreszierende Zelle mit gebleichtem Bereich Ω [KW10] . . . . . . . . 4

2.3. Fluoreszierende Zelle wahrend des Wiederherstellungsprozesses [KW10] 4

2.4. Wiederherstellungskurve der Fluoreszenz im Bleichbereich Ω [KW10] . 5

4.1. Schematische Darstellung der Zellmembran [Bi13] . . . . . . . . . . . . 10

4.2. Fluoreszenzumverteilung fur unterschiedliche Werte von K, falls kein

Fluss vorhanden ist [AK76] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

4.3. Verschobene Fluoreszenzumverteilung fur unterschiedliche Werte von K,

falls kein Fluss vorhanden ist [AK76] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

4.4. γ vs. K fur das Gaußsche Laserprofil [AK76] . . . . . . . . . . . . . . . 17

4.5. Log-Log-Methode [AK76] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

5.1. Schematische Darstellung eines Aktinfilamentes . . . . . . . . . . . . . 19

5.2. Schematischer Aufbau des FRAP-Experimentes (angelehnt an [HN10]) 20

5.3. Teilweise gebleichtes Filament (angelehnt an [HN10]) . . . . . . . . . . 21

6.1. Approximation des Nucleus (angelehnt an [CM03]) . . . . . . . . . . . 28

6.2. Auswirkung der Bleichposition auf die Fluoreszenzumverteilung in einem

begrenzten Bereich . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

6.3. Vergleich von FU(t) und FB(t) bezuglich der Daten F ∗(t) . . . . . . . 32

6.4. Vergleich von FU(t) und FB(t) bezuglich der Daten F (t) . . . . . . . . 33

7.1. Wirkung des Observational Photobleaching und der Mobile Fraction auf

die Fluoreszenzumverteilung (angelehnt an [KW10]) . . . . . . . . . . . 34

A.1. Gaußsches Intensitatsprofil (angelehnt an [Gl13]) . . . . . . . . . . . . . 38

42

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