A contribution to design

foam fractionation processes

Zur Erlangung des akademischen Grades eines

Dr.-Ing.

von der Fakultt Bio- und Chemieingenieurwesen

der Technischen Universitt Dortmund

genehmigte Dissertation

vorgelegt von

Dipl.-Ing. Juliane Merz

aus

Linz am Rhein

Tag der mndlichen Prfung: 28.06.2012

1. Gutachter: Prof. Dr.-Ing. Gerhard Schembecker

2. Gutachter: Prof. Dr.-Ing. Andrzej Gorak

Dortmund 2012

Ein Gelehrter in seinem Laboratorium ist nicht nur ein Techniker;

er steht auch vor den Naturgesetzen wie ein Kind vor der Mrchenwelt.

Marie Curie

Abstract

In biochemical industry foams are generally undesired because foaming is mostly accompa-

nied by product loss and thus, effort is put into the prevention of foam formation especially

during downstream processing. However, the foaming tendency caused by amphiphilic or

surface-active substances in bioprocesses does not necessarily need to be disadvantageous.

A downstream separation technique, where foam is actually desired and used as the se-

paration medium, is foam fractionation. The principle of separation is the preferential

adsorption of surface-active substances at a gas-liquid interface. In this thesis, a fungal

hydrolytically active enzyme, biochemically characterized as a cutinase, is separated out

of the crude culture supernatant using foam fractionation. For batch and continuous

foam fractionation various process parameters, like pH value or temperature, and column

design parameters, such as length or diameter of the foaming column are systematically

investigated in regard to separation efficiency and foam stability. Impact parameters and

parameter interactions were identified using Design of Experiment and it was possible

to tailor the foam fractionation process to desired yields or enrichments. For continuous

foam fractionation enriching and stripping mode were examined, whereas stripping mode

is found to be more efficient for highly diluted or weak systems. Experiments with dyes

and surface tension measurements further increased the knowledge about the process.

It could be shown, that cutinase can be recovered and simultaneously concentrated and

purified. A recovery of 94 % and a 47-fold concentration and 19-fold purification of

cutinase in the foam phase could be achieved in a single process step. This, and the lack

of additives and the simple experimental procedure make foam fractionation a technique

for process intensification. However, before foam fractionation can be used in industry a

scale-up is necessary. Two traditional scale-up approaches were tested to enlarge the foam

fractionation system. However, the investigated and enlarged foam fractionation columns

were still lab-scale equipment. During the scale-up experiments, activity profiles of the

columns were analyzed. Relationships between gas superficial velocity and column length

ii

were found, which offer opportunities to configure a foam fractionation column to special

requirements.

Parallel to the cutinase system the industrial enzyme PLA2 was separated and purified

from complete culture broth of the recombinant Aspergillus niger via foam fractionation.

Batch foam fractionation and continuous foam fractionation in stripping and enriching

mode were investigated. Similar results as for the cutinase system were obtained.

As a consequence of the research presented a guideline was developed to adjust foam frac-

tionation fast and efficiently to general enzyme systems. Additionally, a pure component

system and non-foamable enzymes were investigated to validate the guideline.

Zusammenfassung

In biotechnologischen Prozessen ist die Bildung von Schumen grundstzlich unerwnscht,

da diese meist mit Limitierungen und Produkteinbuen einhergeht. Allerdings muss die

Tendenz zur Schaumbildung, meist ausgelst durch amphiphile beziehungsweise ober-

flchenaktive Substanzen nicht zwangslufig negativ sein. Ein Aufreinigungsprozess der

gerade diesen physikalischen Unterschied der Substanzgruppen zur Trennung ausnutzt ist

die Zerschumung. Das Trennprinzip beruht dabei darauf, dass sich die oberflchenak-

tiven Substanzen an eine Gas-Flssigkeits-Grenzflche anlagern beziehungsweise adsor-

bieren und mit dem Schaum ausgetragen werden. In dieser Arbeit wird ein hydrolytisch

aktives Pilzenzym, biochemisch identifiziert als eine Kutinase, mit Hilfe der Zerschumung

aus unbehandeltem Kulturberstand getrennt. Verschiedene Prozessgren, wie pH-Wert

oder Temperatur und Kolonnengren, wie der Durchmesser oder die Lngen der Sule

wurden variiert und im Hinblick auf Trenneffizienz und Schaumstabilitt systematisch

untersucht. Dabei wurde statistische Versuchsplanung als systematischer Ansatz gewhlt

um absatzweise und kontinuierliche Zerschumung zu untersuchen. Fr die kontinuierliche

Zerschumung wurden die Betriebsweisen enriching mode und stripping mode nher

untersucht. Fr hochverdnnte oder schwach oberflchenaktive Substanzen fhrte die

stripping Fahrweise zu einem stabileren und effizienteren Prozess. Mit Hilfe der statis-

tischen Versuchsplanung konnten Einflussgren und deren Wechselwirkungen identifiziert

werden und die Zerschumung so angepasst werden, dass die gewnschte Ausbeute oder

Anreicherung erlangt werden konnte. Zum weiteren Verstndnis der Vorgnge whrend

der Zerschumung wurden Farbstoffexperimente durchgefhrt und die Oberflchenspan-

nung unter verschiedenen Bedingungen vermessen. Es konnte gezeigt werden, dass das

Enzym Kutinase aus dem Kulturberstand getrennt und gleichzeitig konzentriert und

gereinigt werden konnte. In nur einem Schritt konnte eine Ausbeute von 94 % mit einer

47-fachen Aufkonzentrierung und 19-fachen Reinigung der Kutinase in der Schaumphase

erreicht werden. Des Weiteren kann die Zerschumung aufgrund der einfachen Durch-

iv

fhrung und der Abwesenheit von Hilf- oder Zusatzstoffen als eine Technik zur Prozess-

intensivierung betrachtet werden. Um die Zerschumung jedoch industriell einsetzen zu

knnen, ist eine Mastabsvergrerung notwendig. In dieser Arbeit wurden zwei tra-

ditionelle Anstze zur Mastabsvergrerung der Zerschumung betrachtet, wobei der

Labormastab nicht berschritten wurde. Zum einen wurde der Ansatz eines konstan-

ten Verhltnisses von Lnge zu Breite und zum anderen der Ansatz konstanter Lnger

aber variierender Breite untersucht. Das Scale-up Verfahren bei konstantem Lngen-

und Breitenverhltnis fhrte zu einer verbesserten Trennleistung bei gleichbleibenden

Schaumeigenschaften. Die Mastabsvergrerung mit dem Ansatz konstante Lnge und

variierender Durchmesser der Sule hingegen verschlechterte die Trenneffizienz und die

Schaumstruktur vernderte sich. Whrend dieser Versuche wurden zustzlich Profile der

enzymatischen Aktivitt ber die Lnge der Sulen vermessen. Es konnten Zusammen-

hnge zwischen der Gasleerrohrgeschwindigkeit und der Kolonnenlnge ermittelt werden,

die fr die sptere Sulenkonfiguration von Bedeutung sind.

Parallel zu dem untersuchten Kutinase System wurde das im industriellen Mastab herge-

stellte Enzym PLA2 aus der Kulturbrhe des rekombinanten Pilzes Aspergillus niger mit-

tels Zerschumung getrennt und gereinigt. Auch hier wurde das System absatzweise und

kontinuierlich in stripping und enriching Fahrweise untersucht. Die Ergebnisse sind

denen des Kutinase Systems sehr hnlich.

Als Folge der prsentierten Untersuchungen wurde ein Leitfaden zur schnellen und ef-

fizienten bertragung herkmmlicher Enzymsysteme zur Zerschumung entwickelt. Um

die Qualitt des Leitfadens zu prfen, wurden weiterhin ein Reinstoffsystem und nicht

zerschumbare Enzyme untersucht.

List of Publications

Journal Papers

Merz, J., Schembecker, G., Riemer, S., Nimtz, M., Zorn, H.: Purification and identification

of a novel cutinase from Coprinopsis cinerea by adsorptive bubble separation. Separation

and Purification Technology, 69 (1), 2009, 57-62.

Merz, J., Zorn, H., Burghoff, B., Schembecker, G.: Purification of a fungal cutinase by

adsorptive bubble separation: A statistical approach, Colloids and Surfaces A: Physico-

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as a function of operating variables, Separation and Purification Technology, 82, 2011,

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Merz, J., Schembecker, G.: Foam fractionation: A technique for process intensification.

Submitted to Chemical Engineering and Processing: Process Intensification.

Oral Presentations

Merz, J., Van de Sandt, E., Meesters, G., Schaap, A., Schembecker, G.: Intensified

downstream processing of PLA2 using foam fractionation. 16th International Conference

on Biopartitioning and Purification (BPP), Puerto Vallarta, Mexico (2011)

Merz, J., Burghoff, B., Schembecker, G.: Continuous foam fractionation: Performance as

a function of operating variables. GVC/Vortrags- und Diskussionstagung: Bioverfahrens-

technik an Grenzflchen, Potsdam (2011)

Merz, J., Burghoff, B., Schembecker, G.: Purification of a fungal cutinase by adsorptive

bubble separation: A statistical approach. 8th Conference on Foams and foam-related sys-

vi

tems (fluid interfaces, thin films, surfactants, concentrated emulsions) Eufoam, Borovets,

Bulgaria (2010)

Merz, J., Sc