Messen -und Regeln in der Biotechnologie ... | Mess- und Regeltechnik 2016 : 8 Frank Eiden Mess- und...

Frank Eiden Mess- und Regeltechnik

: 12016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik

MessenMessen-- und Regeln in der Biotechnologieund Regeln in der BiotechnologieBioProzessTechnikBioProzessTechnik (Basics)(Basics)

002_001002_001

Westfälische Hochschule- Standort Recklinghausen-

Sommersemester 2016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik : 12016





Biologie Chemie

BiotechnologieDefinition: moderne BiotechnologieDefinition: moderne Biotechnologie



Biologie Chemie

BiotechnologieBiotechnologieDefinition: moderne BiotechnologieDefinition: moderne Biotechnologie



Biologie Chemie

• Biochemie

• Molekularbiologie (Gentechnik)

Biotechnologie

Interdisziplinarität

BiotechnologieDefinition: moderne BiotechnologieDefinition: moderne Biotechnologie



Ing.wiss.

Biologie Chemie

• Biochemie

• Molekularbiologie

• Chemische Technik

• Reaktionstechnik• Bioverfahrenstechnik (Fermentation)

Biotechnologie




Biologie

Medizin

Chemie

Ing.wiss.

• Pharmazie

• Toxikologie

• Galenik

• Drug Targeting

• Medizintechnik

(Implantologie, Prothektik)

• Bioverfahrenstechnik

Biotechnologie

• Biochemie

• Molekularbiologie




Biologie

Medizin

Chemie

Ing.wiss.

Biotechnologie

• Weiße Biotechnologie:Ersetzen chemischer Prozesse durch biotechnologische Verfahren (Ascorbinsäuresynthese, ...)

• Graue Biotechnologie:"Umweltbiotechnologie": Stabilisierung von Enzymen in Waschprozessen, Klärung von Abwässern, ...

• Grüne BiotechnologiePflanzen- und Nahrungsmittelbereich, Futtermittel, Biofarming (Grüne und Rote BT), Ertragssteigerung, ...

• Rote BiotechnologiePharmazeutische Anwendung, Neue Therapeutika und Diagnostika (Rekombinante Proteine, Tissue Engineering, Drug Targeting, ...), Implantologie, ...

• Blaue BiotechnologieMeeresbiotechnologie, Nutzung mariner Stoffe (Klebetechniken, "Muscheln-Lotus-Effekt", ...)


BioProzessTechnik



Mathematik

Biotech. Math.

• Bioinformatik

High Throughput Systems / Genom-, Proteomentschlüss elung / ...

Biologie

Medizin

Chemie

Ing.wiss.




Biotechnologie ist die Lehre von der auf

Basis von quantifizierenden Methoden

reproduzierbar gemachten Durchführung

von Bioprozessen in industriellen

Produktionsverfahren technischen

Maßstabes.

EinfEinf üührung in die Biotechnologiehrung in die Biotechnologie



In einer modernen Definition erklärte die OECD

(Organization for Economic Cooperation and

Development) Biotechnologie als die Anwendung

von Naturwissenschaft und Technologie an

lebenden Organismen, deren Teilen sowie

Produkten und Modellen von ihnen.

In einer modernen Definition erklärte die OECD

(Organization for Economic Cooperation and

Development) Biotechnologie als die Anwendung

von Naturwissenschaft und Technologie an

lebenden Organismen, deren Teilen sowie

Produkten und Modellen von ihnen.

Biotechnologie Biotechnologie -- BegriffsbestimmungBegriffsbestimmung



einfachere, umweltfreundlichere und sauberere Produktionsverfahren zu etablieren,

die Abhängigkeit von fossilen Rohstoffen zu reduzier en,

die Investitionskosten zu verringern,

die Energie-und Entsorgungskosten zu reduzieren,

neue Produkte und Systemlösungen mit hohem Wertschöpfungspotenzial zu entwickeln,

die Wettbewerbsfähigkeit zahlreicher Industriezweige zu verbessern.

Beitrag der WeiBeitrag der Wei ßßen Biotechnologieen Biotechnologie



Molekulare BiotechnologieEngineering von

Biosystemen

Zell-EngineeringStoffwechsel-Engineering

Protein-Engineering

BioprozesstechnikEngineering von

Produktionsverfahren

ProzessentwicklungReaktionstechnik

Aufarbeitungstechnik

BIOTECHNOLOGIE

integrierte Vernetzung



� Biotechnologische Prozesse– Substrate und deren Aufbereitung– Bioreaktoren

Aufbau, Design und BetriebKinetik

– Aufarbeitung

� Prozessbeispiele� Enzymtechnologie

– Produktion– Enzymatische Prozesse

EinfEinf üührung in die Biotechnologiehrung in die Biotechnologie



� Gärungen (Bier und Wein; Sauermilchprodukte und Käse; Wurstherstellung; Essig; fermentierte asiatische Produkte; Kaffee, Tee und Kakao)

� Enzyme (überlegen Sie welche)

Stärke und Milch

� Traditionelle Mikroorganismen in der Biotechnologie (überlegen Sie welche das sind und deren Klassifikation)

HefenSchimmelpilze (Pinsel- und Gießkannenschimmel)

Bakterien (Milchsäure, Buttersäure, Propionsäure, Aceton-Butanol, ...)

� Forscher (A. van Leeuwenhoek 1632-1723; L. Pasteur 1822-1895; E.

Buchner 1860-1917)

Renneberg, R. 2006. Biotechnologie für Einsteiger, Elsevier

Biotechnologie (traditionell)Biotechnologie (traditionell)



Medizin

MarineOrganismen

Pflanzen

Industrielle Biotechno-logie

IBB

Grund- und Feinchemikalien, Wirkstoffe, Polymere, .. .

Biotechnologie heuteBiotechnologie heute



Mikrotechnologien mithohem Durchsatz.Chemie/Biologie im Vordergrund (z.B. Enzym-entwicklung) Prozesse im Labor-

maßstab.Wechselwirkung von bio-chemischen Komponentenund Prozesstechnik (z.B. Enzym im Rührreaktor)

Prozess im Pilot oder Industriemaßstab.Prozesstechnik im Vordergrund (z.B. Dimensio-nierung des Enzymreaktors)

IBB

Industrielle Biotechnologie (IBB)Industrielle Biotechnologie (IBB)



Abbildung: Schematische Darstellung der Arbeitsschritte in der Bioprozessentwicklung, vom Gen zum Produkt

„„ fromfrom genegene to to productproduct ““



� Stufen der Prozessentwicklung� Identifizierung eines neuen Produktkandidaten

� Entscheidung die Prozessentwicklung zu beginnen

� Parallele Entwicklung - Anlagentechnik und Maßstabsvergrösserungsowie physiologische Tests, klinische Studien, Toxizitätsüberprüfung, usw.

� In Phase III von klinischen Tests wird bereits Material aus der Produktionsanlage verwendet (Center for Biological Evaluation and Research, FDA).

� Vorteile einer effizienten Prozessentwicklung� In allen Einzelheiten reproduzierbare Herstellung eines biologischen

Produktes von invarianter Qualität und Charakteristik

� Reduktion der Anlagenkosten (durch z.B. Minimierung der Grösse des Bioreaktors) als wesentlichem Teil der gesamten Prozesskosten

� Reduktion der Zeitspanne zwischen Beginn der Prozessentwicklung und Markteinführung des Produktes.

BioProzessEntwicklungBioProzessEntwicklung



Abbildung: Parallele Prozessentwicklung ist ein entscheidendes Kriterium für die Implementierung von biotechnologischen Verfahren in der Industrie. Dies gilt vor allem für neue Produkte mit medizinischer Anwendung, bei denen die Markteinführung mehrere Jahre benötigt. Die prinzipielle Brauchbarkeit des Verfahrens muss in den ersten 6 bis 12 Monaten bewiesen werden.

BioProzessEntwicklungBioProzessEntwicklung



Grobes Ablaufschema eines biotechnologischen Prozesses.

Die völlig biospezifische Komponente ist die Bioreaktion(“Fermentation”).

Substrataufbereitung, Sterilisation, und Aufarbeitung erfordern teilweise spezielle Techniken, die für Biosysteme entwickelt und optimiert wurden.

Aufschluss von mikrobiellenZellen zur Enzymgewinnung ist ein Beispiel.

BioTechBioTech --ProzessProzess



Abbildung: Optimierung eines industriellen Prozesses anhand identifizierter kostenbestimmender Faktoren

BioTechBioTech --ProzessProzess -- OptimierungOptimierung



� Reduktion der Substratkosten– Reinchemikalien für Massenprodukte zu teuer– ausgehend von erneuerbaren Rohstoffen– Kohlenhydrate (Zellulose, Stärke, Saccharose)– Proteine (aus Fisch, Sojabohnen)

� Eliminierung von Inhibitoren– Schwermetalle (Mn2+; Zitronensäure)– Azetat (Hefefermentation)

� Anforderungen für klinische Produkte– Viren– Proteine

Substrataufbereitung Substrataufbereitung -- UpstreamUpstream processingprocessing



Viele “klassische” Produkte der Biotechnologie werden im Multihunderttonnen Maßstab jährlich hergestellt, haben aber einen Preis von unter 1 Euro pro Kilogramm.

Der Optimierung jedes einzelnen Prozess-schritteskommt daher Bedeutung zu.

Die Substratwahl ist davon eine wesentliche Komponente.

BioTechnologieBioTechnologie (Felder)(Felder)



Stärke• Lineares und verzweigtes Homopolysaccharid, aufgebaut aus einer Hauptkette mit α1,4-glykosidisch verknüpften Glukoseeinheiten • Verzweigungen in α1,6-Positionen• Polymerisationsgrad und Verzweigungsgrad abhängig vom Rohstoff• Depolymerisation (Hydrolyse) für mikrobielle Verwertung nötig• Säurehydrolyse führt zu Nebenprodukten

•Lignocellulose•Saccharose

Prozessbeispiel (StProzessbeispiel (St äärke)rke)



Der Abbau von Stärke ist das Beispiel für den Einsatz von Enzymen im großtechnischen Maßstab und wird unter anderem für das Upstream Processingeines natürlichen Rohstoffs verwendet.• Die Verflüssigung von Stärke findet mit extrem thermostabilen Enzymen (α−Amylasen) bei etwa 80°C statt. Die Hauptkette wird gespalten und kürzere, besser lösliche Einheiten enstehen.• DE entspricht der Anzahl an reduzierenden Enden, gewichtet an 100% Glukose.• Weitere Enzyme spalten mit unterschiedlichen Spezifitäten (α1,6; α1,4 - Maltose oder Glukose-spaltend; Glukoseisomerisierung; Dextrinsyn-these).




Abbildung : Einige Enzyme, die zur vollständigen Hydrolyse von Stärke (Amylopektin) benötigt werden. Die Quelle für diese und andere Amylasen sind Bakterien und Pilze.




� Selektivität (Chemo, Regio, Stereo)

� günstiger pH (2 - 12) und T-Bereich (10 - 110 °C)

� keine oder wenig Nebenprodukte

� nicht toxisch und leicht abbaubar

� durch Immobilisierung wiederverwendbar

� Herstellung in unlimitierenden Mengen durch mikrobielleProduktion möglich

� Feinabstimmung der Eigenschaften möglich

� geringe(re) Stabilität und Bedarf an Kofaktoren (Metalle)

� manchmal teuer (vor allem wegen Aufarbeitung)

Beispiel : Isomerisierung der D-Glukose in D-Fruktose

VorVor -- und Nachteile des Enzymeinsatzesund Nachteile des Enzymeinsatzes



� Kostenreduktion� Erhöhung der Ausbeute und verbesserte

Rohstoffnutzung� Verminderung der Kosten für die Aufarbeitung (z.B.

Filtration in der Herstellung von Fruchtsäften)

� Qualitätsverbesserung� Veränderte technische Eigenschaften von Proteinen und

Fetten; verbesserter Geschmack von Käse

� Verminderte Umweltbelastung� Lösungsmittelbedarf in der Penicillinherstellung� Molkeverwertung (Laktoseabbau)

Wirtschaftliche Gesichtspunkte des EnzymeinsatzesWirtschaftliche Gesichtspunkte des Enzymeinsatzes



Abbildung : Enzymatischer Prozess zur Herstellung von Fruktose-reichem Sirup (42 % D-Fruktose), welcher hauptsächlich zur Süßung von Getränken eingesetzt wird.

Im Gegensatz zur

Stärkeverzuckerung, die in

Rührtankreaktoren mit löslichen

Enzymen durchgeführt wird, erfolgt die Glukoseisomerisierung in

Reaktoren mit gebundenem

(immobilisiertem) Enzym

(Festbettreaktoren ).Die Bindung der Glukose-

Isomerase, als freies Enzym oder

innerhalb mikrobieller Zellen, erfolgt über adsorptive Kräfte an

Ionentauscher oder Silika mit oder

ohne Quervernetzung.

ImmobilisierteImmobilisierte EnzymeEnzyme



� Rührkesselreaktor (10 mL bis 100 m3 Arbeitsvolumen)� Reaktorgeometrie (H/D ≈ 1 - 3)� andere Designs: Säulenreaktoren ohne mechanisches

Rührwerk (H/D > 3)� Rührergeometrie (d/D ≈ 0.3 bis 0.5)

� Rührerbauweise und Leistungseintrag des Rühres (Pg ≈ d5) hängen stark voneinander ab.

� Turbulenz (Reynolds Zahl; Re = Nid2ρ/µ, laminar für Rei < 10; turbulent für Re > 104) hängt vom Leistungseintrag ab. Erhöhte Turbulenz verbessert das Mischverhalten im Bioreaktor.Rührerdrehzahl Ni [1/s]; Rührerdurchmesser d [m]; Fluiddichte ρ [kg/m3]; Fluidviskosität µ [kg/(m s)]

BioreaktorBioreaktor



ReaktorfahrweisenDas diskontinuierliche Verfahren (Batch-oderChargenverfahren), bei dem der Reaktionsraum zu Beginn mit dem gesamten Ausgangsmaterial und den Mikroorganismen gefüllt wird. Der Tank wird nach Beendigung der Reaktion geleert und das Produkt gereinigt.

Das kontinuierliche Verfahren , bei dem dem Reaktor ständig die Ausgangsstoffe zugeführt und ein Reaktionsgemisch entnommen werden. Ein Fließgleichgewicht zwischen Durchflussrate und Wachstumsgeschwindigkeit der Mikroorganismen muss sich dabei einstellen.

Es gibt auch die semi-kontinuierliche Produktion , bei der in bestimmten Intervallen Fermentationsbrühe aus dem Reaktionsraum abgezogen und durch neues Medium ersetzt wird oder lediglich neues Medium zugegeben wird.

Bioreaktoren und ProzessBioreaktoren und Prozess --DesignDesign



Schematischer Aufbau eines Rührkesselbioreaktors

• Tank aus rostfreiem Stahl• 1 oder mehrere Rührer montiert am Rührerschaft• Montage des Rührers erfolgt von unten oder oben (Dichtung und Sterilität !!)• Leistungseintrag direkt von der Anzahl der Rührer abhängig.• Sterile Belüftungsvorrichtung (Zu- und Abluft)• Temperaturkontrolle und Kühlungsvorrichtung (Leistungseintrag; mikrobielles Wachstum)• Sterile Inokulierung sowie Probenahme• Mess- und Regeltechnik

Der BioreaktorDer Bioreaktor



The power input (Pg) in an aerated stirred vessel influences:

• the oxygen transfer rate by affecting the transfer coefficient kLa, and

• the quality of mixing, avoiding dead zones (where mixing is poor) and local

concentration gradients.

It is dependent on:

• stirrer speed Ni (to the power of 3)

• stirrer diameter d (to the power of 5)

• the fluid density ρ, and

• the power number of the stirrer (which in turn depends on fluid turbu-lence

given by the Reynold’s number).

The value of kLa is influenced further by the (superficial; volumetric) gas flow rate

(Fg) and the medium viscosity (τ).

Der Bioreaktor Der Bioreaktor –– StoffStoff üübergang*bergang*

*Chemical, Engineering, DynamicsHeinzle, Prenosil



Abbildung : Schematischer Darstellung einiger Rührertypen. Die Auswahl stellt immer einen Kompromiss zwischen Leistungseintrag (hoch), Aufbringen von Scherkräften (niedrig) sowie Kompatibilität mit viskosen Medien dar. Der Blattrührer(Rushton impeller) ist am breitesten einsetzbar. Biotechnologische Medien sind teilweise hoch viskos, einerseits auf Grund der gebildeten Biomasse oder wegen polymerer extrazellulärer Produkte.

RRüührerhrer



RRüührerhrer

Abbildung: Darstellung der Bauweise (a) und des Strömungsverhaltens (b) in Reaktoren mit axialem (links) und radialem (rechts) Rührer.

Abbildung: Strombrecher im Reaktor sorgen für erhöhte Turbulenz und damit verbesserte Mischung des Reaktorvolumens.



Abbildung . Zusammenstellung weiterer gebräuchlicher Rührertypen, klassifiziert nach „axial“ und „radial“ sowie dem Einsatzbereich in Bezug auf die Zähigkeit der zu mischenden Flüssigkeit. η, Viskosität in Pa s.

Weitere Weitere RRüührertypenhrertypen



� Scherrate im gerührten Tank (“Integrated Shear Factor” ISF)� ISF = 2 π N d / (D - d) wobei N die Drehzahl des Rührers ist, d ist der Rührerdurchmesser

und D ist der Durchmesser des Reaktors

� Labordaten zeigen, dass z.B. tierische Zellen bei ISF Werten über 20 s-1

kaum mehr wachsen. � Hohe Scherraten können für die Grenzflächen Flüssig-Fest erwartet werden.

Es ist daher manchmal nötig, dass zwischen mittlerer Scherrate und maximaler Scherrate unterschieden wird.

� In Blasensäulen wird die Scherrate durch die Geschwindigkeit (ms-1) der Gasblasen determiniert. Weiter Schereffekte werden durch Koaleszenzerzeugt.

� Inaktivierung von Zellen und pilzlichen Mycelen (siehe Abb.) durch Scherkräfte fließt in das Design des Bioreaktors mit ein.

Abbildung : Das Wachstum von filamentösen Organis-men unterscheidet sich stark vom Wachstum von Bakterien oder Hefen. Sie zeigen apikale Verlängerung und Verzweigung der Hyphen, gefolgt von Pelletbildung. Prozessfaktoren beeinflussen dieses Wachstum und auch die Produktbildung.

ScherkrScherkr ääftefte



Abbildung: Schematische Darstellungen eines Blasensäulereaktors (linkes Bild) und der Durchmischung in diesem Reaktor unter heterogenen Flussbedingungen (siehe nächste Seite).

BlasensäuleZylindrischer Aufbau, Verhältnis von Höhe zu Breite etwa 3 bis 6

Es gibt keine mechanische Durchmischung - die Mischung erfolgt über die mit den Gasblasen aufsteigende FlüssigkeitBegasung über Vorrichtung am Boden (Sinterplatte, Düse, o.ä.)Vorteile sind die relativ geringen Anlagenkosten, das Fehlen beweglicher Teile, und die geringe Schaumbildung

Weitere ReaktortypenWeitere Reaktortypen



Weitere Reaktortypen (Weitere Reaktortypen ( AirliftAirlift ))

Abbildung: Typische Konfigurationen von Airliftreaktoren . Die Separation in Steig-und Fallrohr verbessert die Mischeigenschaften im Vergleich zur Blasensäule.



� Mischungseffizienz und Massentransport sind in allen drei Typen (STR, Blasensäule, Airlift) im Industriemaßstab ähnlich. Der maximale Massentransport ist im STR am höchsten, weil der Leistungseintrag über den Rührer am stärksten ist.

� Im Falle der BS und des AL bricht der Massentransport bei Viskositäten über 0.1 N s m-2 zusammen.

� Mechanischer Probleme können im STR im Zusammenhang mit dem Rührermotor auftreten.

� Daher gilt als Faustregel:� BS und AL sind für Bioreaktionen mit myzelbildenden Pilzen und in der Herstellung

von mikrobiellen Polysacchariden ungeeignet.� Flexibilität hinsichtlich Viskosität und Massentransport wird vor allem durch den STR

geliefert.� Bioreaktionen in viskose Medien werden nicht im Maßstab > 500 m3 betrieben.� Die BS ist der billigste Reaktor und wird für Reaktionen im Bereich niedriger

Viskositäten und in Volumina von 50 bis 500 m3 verwendet. Für Volumina von 200 bis 10 000 m3 wird der AL eingesetzt, vor allem weil die Möglichkeit lokaler Zugabe von Substrat besteht. Der STR ist in diesem Maßstab ungeeignet, da die Rührerleistung bis zu 1 MeW ansteigen kann.

Vergleiche Vergleiche -- ReaktortypenReaktortypen



� Dichtungen für den Rührerschaft(mit Sattdampf sterilisierbare Gleitringdichtungen)

� Filtration (adsorptive Tiefenfilter; Absolutfilter mit molekulare Ausschlussgröße; 0.1 µm)

� Sterile Zudosierung und Probennahme

� Sterilisation des Bioreaktors� Sattdampf statt trockener Hitze� Abtötungseffekt als Funktion der

Inkubationszeit und der Temperatur

Steriltechnik und SterilisationSteriltechnik und Sterilisation



� Aufheizen des flüssigen Mediums auf Sterilisationstemperatur (etwa 120°C)

� Direkte Injektion von Sattdampf ins Medium� Verdünnung (10-20%)� Qualität des Dampfes (Kontamination durch Metallionen oder

organische Substanzen)

� Indirekter Wärmetransfer über Kühlsystem des Reaktors

� Sterilisation erfolgt in drei Phasen, die in einem Temperatur-Zeit-Profil dargestellt werden: Aufheizen, Haltezeit (thd) bei 120 °C, Abkühlen.

� Die Sterilisationführt zur Reduktion der Anzahl der lebenden Zellen vor der Inaktivierung (N0).

� Unter der Annahme, dass die Zellen nur während thd inaktiviert werden, ergibt sich die Frage, wie lange thd sein soll.

Sterilisation mit SattdampfSterilisation mit Sattdampf



Abbildung : Verschiedene konstruktionstechnische Lösungen, um Wärmetransfer in Bioreaktoren effektiv zu bewerkstelligen. Links: Ummantelung; Mitte: Kühlschlangen; Rechts: Kühlschlangen, die auch als Prellwände fungieren.

BeheizungBeheizung



Abbildung : Zeit-Temperatur-Profil für eine typische Dampfsterilisation (a) und Abtötung der lebenden Zellen im Bioreaktor als Funktion der Zeit (b).

Die Inaktivierung der Zellen kann häufig als Reaktion 1.Ordnung beschrieben werden. Das heißt, die Abnahme von N über die Zeit erfolgt exponenziell.In der thd gilt:• ln (N1/N2) = kd thd

kd ist eine Inaktivierungskonstante (h-1), die Organismen spezifisch ist und von der Temperatur abhängt.•kd = A exp (-Ed/RT)wobei A ein Arrhenius Faktor, Ed die Aktivierungsenergie für den Zelltod, R die Gaskonstante und T die Temperatur in K ist.• thd = ln (N1/N2) / kd N1 ≥ 103; N2 ≤ 10-3

Sterilisation (Profile/Kinetik)Sterilisation (Profile/Kinetik)



� Vermeidung von Nebenreaktion (z.B. “Bräunung”) (Abb. 5.8)

� Kenntnis der Kinetik der Inaktivierung von hitzeresistenten Organismen bzw. Sporen (z.B. Bacillus sp.).

� In Suspensionen, wenn z.B. das Substrat unlöslich ist, hängt Wärmetransfer stark von der Partikelgröße ab.

� N ist direkt vom Maßstab abhängig. Sterilisation von größeren Reaktoren schwieriger (thd länger; Energiekosten bedeutend).

Sterilisation (Kinetik)Sterilisation (Kinetik)



Abbildung : Charakterisierung des mikrobiellenWachstums anhand einer Darstellung des Zeitverlaufs (oben) sowie der spezifischen Wachstumsraten in den einzelnen Phasen (unten).

Wie lässt sich das mikrobielle Wachstum und damit verbunden, Substratverbrauch und Produktbildung formalkinetisch beschreiben?

Was sind typische Werte für die maximale Wachstumsrate von Hefen und Bakterien?

BioprozesskinetikBioprozesskinetik



Biomasse YXS = g Zellen produziert / g Substrat verbraucht

Produkt YPS = g Produkt hergestellt / g Substrat verbraucht

Elektronenbilanzen dienen zur Berechnung der theoretischen Ausbeuten wie• Sauerstoffbedarf oder• maximale BiomasseausbeuteAusgegangen wird von den vorhandenen Elektronen (4 in C, 1 in H, −2 in O etc.) sowie dem Reduktionsgrad der beteiligten Reaktanden (Summe aller Elektronen / Anzahl der C Atome).Thermodynamisch maximale YXS Werte:n-Hexan (2,6); Glucose (0,8); Essigsäure (0,8); Oxalsäure (0,1)

ErtragskoeffizientenErtragskoeffizienten



Voraussetzungen für experimentelle Studien zur Kine tik als physiologischer Eigenschaft von Mikroorganismen• Identifizierung relevanter Zustandsvariablen aus den Kulturparametern

• Vereinfachung

• Eliminierung von physikalischen Effekten (Massentransport)

Abbildung : Wechselwirkungen und mögliche Beeinflussungen zwischen dem biotechnologischen Produktionsystem(Zellpopulation) und der prozesstechnischen Umgebung (Medium, Bioreaktor). Eine typische Frage betrifft die Konzentration des limitierenden Substrates (C-Quelle, O2, etc.)

Physiologische Eigenschaften (MO)Physiologische Eigenschaften (MO)Physiologische Eigenschaften (MO)Physiologische Eigenschaften (MO)



Abbildung : Darstellung von drei Rührtankbioreaktoren zur Erklärung der Begriffe „Transportlimitierung“ und „Pseudohomogenität“.

a) Fall einer homogenen Lösung ohne Grenzflächen (z.B. flüssig/fest oder gasförmig/flüssig); Stofftransport (rTR) erfolgt in der Regel durch molekulare Diffusion und ist

zumeist viel schneller als chemische Reaktionen (rRk). Zur Ermittlung kinetischer Gesetzmäßigkeiten muss gelten, dass rRk ≤ 0,1 rTR. Ein mögliches Beispiel wären

Transformationen mit löslichen Enzymen. b) Pseudohomogener Fall, in dem zwar reale Grenzflächen

vorliegen (OTR, Sauerstofftransport von der Gas- in die

Flüssigphase; Versorgung von suspendierten mikrobiellenFlocken mit Substrat), jedoch das Kriterium rRk ≤ 0,1 rTR

nach wie vor erfüllt wird.

c) Fall eines heterogenen Systems, wobei rRk ≥ 0,1 rTR.

Eliminierung von MassentransporteffektenEliminierung von Massentransporteffekten



Mischen von RMischen von R üührkesselnhrkesseln

Abbildung: Eliminierung von Massentransporteffekten (2) - Misch zeitkonzept für Rührkesselrektoren.Experiment zur Charakterisierung des Mischverhaltens in einem Bioreaktor. Ein Marker (Salzlösung, Farbstoff, ...) wird in den Reaktor injiziert und die Misschung über Leitfähigkeit oder spektrophotometrische Detektion on-line mit einer Elektrode gemessen. Das Bild zeigt einen typischen Verlauf, aus dem die Zirkulationszeit (tc) und die Mischzeit (tm) ermittelt werden. tm wird durch die definierte Mischgüte (z.B. 90% wie im Bild) festgelegt. tcist eine Funktion des Macromixing und wird durch stärkeres Rühren erniedrigt. Beachten Sie: tm ≤ 0,1 tRk. Ein idealer Rührkessel ist vollständig (Mischgüte: 100%) und un endlich schnell vermischt.



Biologisches Wachstum in einer autokatalytischen Reaktion

rX = dx/dt = µ x

mit x der Konzentration an Zellen (g/L), X der Masse an Zellen (g), rX der Wachstumsgeschwindigkeit (g/(L h)) sowie einem Proportionalitätsfaktor µ (1/h), der als spezifische Wachstumsrate bezeichnet wird.

µ = rX/x

Für die Situation von nur einem limitierenden Substrat formulierte Monod:

µ = µmax s/(Ks + s)

mit µmax der maximalen spezifische Wachstumsrate (1/h), s der Substratkonzen-tration (g/L) sowie Ks der Sättigungskonstante für s.

Den Ertragskoeffizienten YXS kann man formulieren als:

YXS = rX/rS (oder vereinfacht: = ∆x/∆s)

Typische Werte für µmax sind mit Glucose als C-Quelle (Saccharomyces: 0.47 1/h; E. coli: 2 1/h); für Ks von Glucose (Saccharomyces: 25 mg/L; E. coli: 4 mg/L; Aspergillus: 5 mg/L) und O2 (etwa 0,05 mg/L)

Grundbegriffe der Grundbegriffe der MonodMonod KinetikKinetik



Abbildung : Vergleich von zwei Monod-Kinetiken mit unterschiedlichem Ks Wert (relativ niedrig: oben; relativ hoch: unten).

Bezüglich der Substratkonzentration s wird unter sättigenden Bedingungen (s ≈ 10 Ks) eine Reaktion nullter Ordnung erreicht.

rx = dx/dt = (µ maxx) s0 wobei: s0 = 1

Liegt s deutlich unter Ks, werden Bedingungen einer Reaktion erster Ordnung erreicht.

rx = dx/dt = (µ maxx/Ks) s1 wobei: s1 = s

Überlegungen zum Satzverfahren (Batch)• Reaktor wird befüllt und inokuliert. Danach ändern sich mit fortschreitendem Wachstum die Konzentrationen (Ci) aller Nährstoffe, der Zellen und der Produkte mit der Zeit.• Aus der Massenilanz: ∆(VCi)/∆t ≈ d(VCi)/dt = V ri

BatchBatch --VerfahrenVerfahren



Überlegungen zum Satzverfahren (Batch) (2)

• Aus der Konzentrationsbilanz: ∆Ci/∆t ≈ dCi/dt = ri

• Unter Verwendung der Monod-Kinetik:

Biomasse : rX = dx/dt = µ x = µ max x s/(Ks + s)

Substrat : rs = ds/dt = q s x = − (µ/YXS) x = - x [µ max s/(Ks + s)]/YXS

• Oft gilt, da Ks einen kleinen Wert hat, dass s/(Ks + s) ≈ 1.

• Das heißt in weiterer Folge: rX = dx/dt ≈ µmax x.

• Nach Variablenseparation und Integration erhält man:

ln(x) - ln(x0) = ln (x/x0) = µmax (t - t0), oder

x = x0 e µmax (t - t0)

mit t der Zeit und dem Index 0 für t = 0.

• Wachstum (und Substratverbrauch) erfolgen exponenziell. Wenn s ≈ Ks stimmt die Näherung von s/(Ks + s) ≈ 1 nicht mehr. Es folgt ein Übergang von exponenziellerPhase in eine Verzögerungsphase.

• Minimale Verdopplungszeit td: 2 x0 = x0 e µmax (td - 0) woraus folgt: td = ln(2)/µmax

• Minimale Dauer des Batches tB = [ln(x0 + ∆x) - ln(x0)]/µmax




Überlegungen zum Satzverfahren (Batch) (3)

• Minimale Dauer des Batches tB = [ln(x0 + ∆x) - ln(x0)]/µmax

• Mit der Annahme, dass x0 sehr viel kleiner als x ist, und mit ∆x = s0YXS erhält man:

tB = [ln(s0YXS) - ln(x0)]/µmax

• Sauerstoff kann als limitierendes Substrat auftrete n

Sauerstoff ist in wässrigen Medien nur

schlecht löslich. Wie kann der

Mikroorganismus totzdem ausreichend

mit Sauerstoff versorgt werden, um das

Wachstum optimal zu unterstützen?

Begasung mit Luft oder reinem

Sauerstoff ist nötig.

YXO2 = rX / rO2




� Sauerstofftransportrate OTR = kLa (O2* - O2) kL ist der Massentransportkoeffizient der Flüssigphase (ms-1); a ist die Gas-Flüssig

Austauschfläche pro Volumseinheit (m2 m-3); O2* ist die

Gleichgewichtskonzentration von Sauerstoff, und O2 ist die aktuelle Konzentration.

� OTR kann verbessert werden durch:

� Erhöhung von O2* (Reinsauerstoff statt Luft; Druckerhöhung)

� Erhöhung des kLa Wertes (Bioreaktortechnologie; 0.02 - 0.2 s-1)

� Größe und Verweilzeit der Gasblasen (Art der Begasungseinheit; Rührer

und Rührspitzengeschwindigkeit)

� Leistungseintrag (Art und Geometrie des Rührers; Rührerdrehzahl bzw.

Rührspitzengeschwindigkeit)

� Turbulenz (Rührer; Strombrecher)

� Begasungsrate

StoffStoff üübergangbergang



Wechselwirkung zwischen biologischen und prozesstec hnischen Wechselwirkung zwischen biologischen und prozesstec hnischen Faktoren Faktoren

Einflussfaktoren• des Mediums

pH, T, mehr als 1 limitierendes Substrat, chemische Reaktionen, rheologische Eigen-schaften, Grenzflächen, Inhomogenitäten)

• der ZellenOperative Rahmenbe-dingungen für den Betrieb eines Bioreak-tors

ProzessfensterProzessfenster



Abbildung: Messparameter in Bioreaktoren. Kontrolliert werden zumeist physikalische und chemische Parameter. Biologische Parameter wie die Biomassekonzentration lassen sich im Regelfall nur indirekt kontrollieren, wofür eine quantitative Korrelation zwischen physikalischen / chemischen Parametern und der biologischen Größe hergestellt werden muss. Es kann sich dabei um ein mathematisches Modell handeln (z.B. Monod Kinetik) oder empirische Korrelationen.

MessMess -- und Regeltechnik in Bioreaktorenund Regeltechnik in Bioreaktoren



� Sedimentation, Flockulierung, Flotation oder Zentrifugation von Zellen (Abb. A1)

� Filtration von Zellen oder Enzymen (Abb. A2)

� Mechanischer Zellaufschluss (Abb. A3)

� Weitere Reinigungsverfahren (bis zu 90% der Produktionskosten)� hochentwickelte Methoden auf Basis von biologischer

Affinität verfügbar� Kosten meist prohibitiv (klassische Chromatographie)

� Kontinuierliche Aufarbeitung im Prozessmaßstab

AufarbeitungAufarbeitung



Abbildung : Darstellung von 3 technologisch genutzten Typen von Zentrifugen. Ein künstlich verstärktes Schwerefeld (≥ 5000 x g) ist bei vielen Zellen nötig, um brauchbare Absetzgeschwindigkeiten (im Vergleich zur Sedimentation) zu erzielen. Im Idealfall wird ein pastöses Produkt erzeugt. Wesentlich ist neben der Dichte der Zellen, deren Radius (bei Annahme von Kugelform).

Zentrifugenbauarten• Röhren (links)• Teller (mitte)• Mehrkammer (rechts)

ZentrifugenZentrifugen



� Flockulation� Bildung von Zellaggregaten durch Zusatz von

Flockulationsmitteln (geladene Polymere wie Polyethylenimin oder Acrylamid / Acrylat, mehrwertige Kationen, quarternäre Ammoniumverbindungen, ...)

� Neutralisation der negativ geladenen Gruppen an der Zelloberfläche von Mikroorganismen

� Gute Sedimentation der Flocken ist wichtig

� Flotation� Anhaftung der Zellen an Gasblasen� Zugabe von Oberflächen aktiven Substanzen

(“Schäumer”) wie kurzkettige Polyethylenglykole oder langkettige Alkohole

FlockulationFlockulation / / FlotationFlotation



� Abtrennung von festen Teilchen mit einem Filterhilfsmittel� Kuchen- oder Oberflächenfiltration� Sieb- oder Membranfiltration (Größenausschluss)� Tiefen- oder Bettfiltration (adsorptive Wechselwirkungen)

Oberflächenfiltration• Träger, der von Filtertuch bedeckt ist• Während der Filtration bildet sich der Filterkuchen allmählich, und der Flusswiderstand steigt damit stetig.• Bleibt der angelegte Druck konstant, sinkt die Durchflussrate.• Zellen stellen einen kompressiblen Filterkuchen dar, und es muss ein Kompromiss zwischen Durchlässigkeit (geringer Druck) und Kuchenentwässerung gefunden werden (hoher Druck).

FiltrationFiltration



� Chemische Methoden (Alkalibehandlung; Detergenzien wie SDS oder Cetyl (C16) Trimethylammoniumbromid; Enzyme wie Lysozym; Lyse durch Phagen oder Antibiotika wie Penicillin oder CephalosporinC)

� Osmotischer Schock (Einfrieren, Auftauen) und Trocknung (Gefrier-, Sprüh-, Lösungsmittel)

� Mechanische Verfahren� Scherkräfte in Lösung (Ultraschall, Rotor-Stator-Mischer -

mechanische Rührung; Hochdruckhomogenisator - Druck; 1000 - 2000 bar)

� Scherkräfte in Festsubstanz (Kugelmühle - Vermahlen; Mörser und Pistill - Vermahlen; X-Press - Druck)

� Für größeren Maßstab sind der Hochdruckhomogenisatorund die Kugelmühle gut geeignet.

� Kombinationen der Aufschlussmethoden sind möglich und sinnvoll.

ZellausschlussZellausschluss



Eine technische Version des Hochdruckhomogenisators ist der Manton-Gaulin Homogenisator . Die Menge an freigesetztem intrazellulären Produkt ist proportional• dem angelegten Druck• der Anzahl der Passagen durch den Homogenisator• und ist temperaturabhängig.

Kugelmühlen unterscheiden sich in den Geometrien der Rührscheiben und vor allem in den verwendeten Mahlkugeln (meist aus Glas):• für Hefe (0,75 - 1,0 mm) • für Bacillus sp. (0,50 - 0,75 mm)• für Brevibact. sp. (0,25 - 0,50 mm)

ZellausschlussZellausschluss



Abbildung: Die Prokaryonten (Eubakterien, Archebakterien) unterscheiden sich hinsichtlich des Aufbaus und der Stabilität ihrer Zellwände. a) Archaea; b) Gram-positive und c) Gram-negative Eubakterien.

Zellausschluss (Membranen)Zellausschluss (Membranen)



Weitere Aufarbeitungsschritte für technische Enzyme beinhalten vor allem: • Fällung und Membranfiltration• Einfache chromatographische Verfahren• Extraktion und eventuell Trocknung

Kontinuierliche AufarbeitungKontinuierliche Aufarbeitung



CAPTUREprecipitationextractionionexchange, HIC

INTERMEDIATEvarious chromato-praphic proc.

POLISHINGAffinity methodsHigh-resolutionchromatography

Resolution increases

Capacity increases

Technische Enzyme und Proteine

Therapeutische Enzyme und Proteine

Allg. Schema fAllg. Schema f üür die Proteinaufreinigungr die Proteinaufreinigung



� Einsatzbereiche in der Technologie

� Hauptsächlich Hydrolasen(Enzymklasse 3)� Spaltung von Kohlenhydraten,

Proteinen, Fetten

� einfache und technisch wichtige Reaktionen

� keine Kofaktoren

� stabil

� “Other”: Analytik und Sensoren, Medizin, Biokatalyse und Feinchemikalien

� Keine “Reinproteine”

Technische EnzymeTechnische Enzyme



� Resolution von Aminosäureracematen (Gemisch der D,L-Form nach chemischer Synthese) durch Acylierung (der Aminogruppe) und anschließende selektive enzymatische Deacylierung mit dem Enzym L-Aminosäureacylase

� Anwendungen für Lebens- und Futtermittel bzw. für medizinische und kosmetische Zwecke.

Abbildung : Konzept der enzymatischen Resolution.

Industrielles Beispiel (1/4)Industrielles Beispiel (1/4)



Abbildung : Prozesstechnische Realisierung der Resolution von racemischen Acylaminosäuren. Kernelement ist der immobilisierteEnzymreaktor, im Design eines Festbettes.




Abbildung : Darstellung verschiedener Methoden der Enzymimmobilisierung(Rückhaltung). Transport zum und vom Enzym kann durch Diffusion (Konzentrationsgradient) oder Konvektion (Druckdifferenz) erfolgen.




Abbildung : Reaktorkonfigurationen für enzymkatalysierte Prozesse. Die gezeichneten Membranen in Bild (b), (e) und (f) besitzen Poren, die für Proteine impermeabel sind (Ultrafiltrationsmembranen). Bilder (c) und (d) zeigen Festbett- und Wirbelschichtreaktoren.

Bioreaktoren und ProzessBioreaktoren und Prozess --DesignDesign

Industrielles Industrielles BeispielBeispiel(4/4)(4/4)



FermenterFermenter --LaborLabor



„Phantasie ist wichtiger als Wissen, denn Wissen ist begrenzt.“Albert Einstein

Messen -und Regeln in der Biotechnologie ... | Mess- und Regeltechnik 2016 : 8 Frank Eiden Mess- und...

Documents

Transcript of Messen -und Regeln in der Biotechnologie ... | Mess- und Regeltechnik 2016 : 8 Frank Eiden Mess- und...