Metabolic Engineering von - Rostocker...

Metabolic Engineering von

Clostridium acetobutylicum zur Produktion von

1,4-Butandiol

Dissertation

zur

Erlangung des akademischen Grades

doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.)

der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät

der Universität Rostock

vorgelegt von

Markus Klipp

Rostock, 23.03.2016

zef007

Schreibmaschinentext

urn:nbn:de:gbv:28-diss2016-0087-1

zef007

Schreibmaschinentext

Gutachter: Prof. Dr. Hubert Bahl

Universität Rostock,

Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät,

Institut für Biowissenschaften, Abteilung Mikrobiologie

Prof. Dr. Bernd Kreikemeyer

Universitätsmedizin Rostock,

Medizinische Fakultät,

Institut für Medizinische Mikrobiologie, Virologie und Hygiene

Datum der Einreichung: 23. März 2016

Datum der Verteidigung: 24. Juni 2016

Inhaltsverzeichnis I

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis ....................................................................................................................... I

Abkürzungsverzeichnis .............................................................................................................. V

Abbildungsverzeichnis ............................................................................................................... X

Tabellenverzeichnis ................................................................................................................ XIII

1. Einleitung ............................................................................................................................ 1

1.1 Zielstellung ................................................................................................................... 1

1.2 1,4-Butandiol ............................................................................................................... 2

1.3 Clostridium acetobutylicum ......................................................................................... 4

1.4 4-Hydroxybutyryl-CoA-Dehydratase/Vinylacetyl-CoA-∆-Isomerase ........................... 6

2. Material und Methoden ................................................................................................... 10

2.1 Organismen und Plasmide ......................................................................................... 10

2.2 Oligonukleotide ......................................................................................................... 15

2.3 Nährmedien ............................................................................................................... 16

2.3.1 Nährmedium für E. coli ................................................................................... 16

2.3.2 Medien für C. acetobutylicum ........................................................................ 16

2.3.3 Medienzusätze ................................................................................................ 19

2.4 Stammhaltung ........................................................................................................... 20

2.5 Zellanzucht ................................................................................................................. 20

2.5.1 Zellanzucht von E. coli ..................................................................................... 20

2.5.2 Zellanzucht von C. acetobutylicum ................................................................. 20

2.5.2.1 Zellanzucht von C. acetobutylicum auf Festmedium ........................ 21

2.5.2.2 Zellanzucht von C. acetobutylicum in statischer Kultur .................... 21

2.5.2.3 pH-kontrollierte Batch-Fermentation ............................................... 21

2.6 Bestimmung physiologischer Parameter ................................................................... 22

2.6.1 Optische Dichte ................................................................................................ 22

2.6.2 Bestimmung der Wachstumsrate und Verdopplungszeit ............................... 22

2.6.3 Bestimmung des externen pH-Wertes ............................................................ 23

2.6.4 Optisch-enzymatische Glukosebestimmung ................................................... 23

2.6.5 Optisch-enzymatische Laktatbestimmung ...................................................... 24

2.6.6 Gaschromatografie .......................................................................................... 25

Inhaltsverzeichnis II

2.6.6.1 Gaschromatografische Analyse der Gärungsprodukte von

C. acetobutylicum .............................................................................. 25

2.6.6.2 Gaschromatografische Analyse von 1,4-Butandiol und

γ-Hydroxybutyrat .............................................................................. 26

2.7 Visualisierung von 1,4-Butandiol ............................................................................... 27

2.8 Arbeiten mit Nukleinsäuren ...................................................................................... 28

2.8.1 Isolierung von Nukleinsäuren ......................................................................... 28

2.8.1.1 Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli.............................................. 28

2.8.1.2 Isolierung chromosomaler DNA aus Clostridien ................................ 29

2.8.2 PCR-Techniken ................................................................................................ 31

2.8.2.1 Oligonukleotid-Design....................................................................... 31

2.8.2.2 Standard-PCR .................................................................................... 32

2.8.2.3 „Colony“-PCR .................................................................................... 32

2.8.3 Enzymatische Modifikation von DNA ............................................................. 32

2.8.3.1 Restriktion von DNA .......................................................................... 32

2.8.3.2 Dephosphorylierung von DNA-Fragmenten ..................................... 33

2.8.3.3 Ligation von DNA-Fragmenten.......................................................... 33

2.8.3.4 in vivo Methylierung von Plasmid-DNA ............................................ 34

2.8.4 Agarosegelelektrophorese .............................................................................. 34

2.8.5 Reinigung von Nukleinsäuren ......................................................................... 35

2.8.5.1 Extraktion von DNA aus Agarosegelen ............................................. 35

2.8.5.2 Kit-basierte DNA-Aufreinigung ......................................................... 35

2.9 Erzeugung rekombinanter Organismen .................................................................... 35

2.9.1 DNA-Transfer in E. coli .................................................................................... 35

2.9.1.1 CaCl2-vermittelte Transformation in E. coli ...................................... 35

2.9.1.2 Transformation von E. coli durch Elektroporation ........................... 36

2.9.2 DNA-Transfer in C. acetobutylicum ................................................................. 36

2.9.2.1 Transformation von C. acetobutylicum durch Elektroporation ........ 36

2.10 Arbeiten mit Proteinen ............................................................................................. 37

2.10.1 Zellaufschluss von C. acetobutylicum mittels Ultraschall ............................. 37

2.10.2 Proteinaufreinigung mittels Affinitätschromatografie ................................. 38

2.10.3 Konzentrationsbestimmung von Proteinen (Bradford, 1976) ...................... 39

Inhaltsverzeichnis III

2.10.4 Eindimensionale SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)........... 39

2.10.5 Kolloidale Coomassie-Färbung ...................................................................... 41

2.10.6 Transfer von Proteinen auf Membranen (Western Blot) .............................. 41

2.10.7 Detektion von Strep-tag II Fusionsproteinen................................................. 42

2.11 Bezugsquellen ........................................................................................................... 43

3. Ergebnisse ......................................................................................................................... 46

3.1 1,4-Butandioltoleranz von C. acetobutylicum ATCC 824 ........................................... 46

3.2 Nachweismethoden für 1,4-Butandiol ...................................................................... 49

3.2.1 Dünnschichtchromatografie-basierte Nachweismethode ............................. 49

3.2.2 GC/MS-basierte Nachweismethode ............................................................... 50

3.3 Generierung von rekombinanten C. acetobutylicum-Stämmen zur Produktion von

1,4-Butandiol ............................................................................................................. 52

3.4 Wachstumsphysiologische Charakterisierung von generierten 1,4-BDO-Produktions-

stämmen .................................................................................................................... 56

3.4.1 Wachstumsverlauf und Gärungsprodukte ...................................................... 57

3.4.2 1,4-Butandiolproduktion ................................................................................ 61

3.4.3 Zeitlicher Verlauf der 1,4-BDO-Produktion..................................................... 63

3.5 Optimierungsstrategien ............................................................................................. 65

3.5.1 pH-regulierte Batch-Fermentation von C. acetobutylicum

pTc::P(thlA)cbei_2100 ...................................................................................... 65

3.5.2 Verwendung verschiedener Kohlenhydratquellen .......................................... 67

3.5.3 Modifikation der 4HBD-Expression durch Verwendung unterschiedlicher

Promotoren ..................................................................................................... 70

3.5.3.1 Vektorgenerierung .............................................................................. 71

3.5.3.2 1,4-BDO-Produktion rekombinanter C. acetobutylicum-Stämme ...... 73

3.5.4 Stoffwechseldefektmutanten von C. acetobutylicum ATCC 824 .................... 75

3.5.4.1 C. acetobutylicum-Mutanten mit Defekten in der Säurebildung ...... 75

3.5.4.2. C. acetobutylicum-Mutanten mit Defekten in der

Lösungsmittelbildung ......................................................................... 77

4. Diskussion ......................................................................................................................... 80

4.1 1,4-Butandioltoleranz ................................................................................................ 81

4.2 1,4-Butandiolproduktion ........................................................................................... 82

Inhaltsverzeichnis IV

4.2.1 Limitierung durch die 4HBD ............................................................................ 83

4.2.2 Limitierung durch die Aldehyd-/Alkoholdehydrogenase (AdhE) .................... 84

4.2.3 Codon Usage ................................................................................................... 85

4.3 GHB-Produktion ......................................................................................................... 86

4.4 1,4-BDO-Produktion unter Verwendung verschiedener Kohlenhydratquellen ........ 88

4.4.1 Pentosen ......................................................................................................... 88

4.4.1.1 Xylose .................................................................................................. 88

4.4.1.2 Arabinose ............................................................................................ 90

4.4.2 Hexosen ........................................................................................................... 91

4.4.2.1 Galaktose ............................................................................................ 91

4.4.2.2 Mannose ............................................................................................. 91

4.4.3 Kohlenhydratgemisch ...................................................................................... 92

4.5 C. acetobutylicum pT::P(ptb)ckl_3020 ....................................................................... 94

4.6 Stoffwechseldefektmutanten .................................................................................... 95

4.6.1 Defekte in der Lösungsmittelproduktion ......................................................... 95

4.6.2 Defekte in der Säureproduktion ...................................................................... 97

4.7 Fazit ............................................................................................................................ 98

5. Zusammenfassung .......................................................................................................... 100

6. Literaturverzeichnis ........................................................................................................ 101

7. Anhang ............................................................................................................................ 113

Danksagung ............................................................................................................................ 126

Selbstständigkeitserklärung .................................................................................................. 128

Abkürzungsverzeichnis V

Abkürzungsverzeichnis

α alpha

A Adenin, Ampere

A. Aqua

ABC “ATP binding cassette”

AbfD 4HBD aus Clostridium aminobutyricum

abfD 4hbd-Gen aus Clostridium aminobutyricum

ad auffüllen auf

adc Acetoacetadecarboxylase-Gen

adhE Aldehyd-Alkoholdehydrogenase-Gen

Amp Ampicillin

AP alkalische Phosphatase

AS Aminosäure

ATCC „American Type Culture Collection”

ATP Adenosintriphosphat

β beta

BCIP 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphat

BDH Butanol-Dehydrogenase

BDO Butandiol

Bp Basenpaar

BSA Rinderserumalbumin

Buk Butyratkinase

BYDH Butyraldehyd-Dehydrogenase

γ gamma

c Konzentration, centi (10-2)

C Kohlenstoff, Cytosin

C- Carboxy-

C. Clostridium

°C Grad Celsius

ca. zirka

Abkürzungsverzeichnis VI

Cbei_2100 4HBD aus Clostridium beijerinckii

cbei_2100 4hbd-Gen aus Clostridium beijerinckii

CCR „carbon catabolite repression”

CGM „Clostridial Growth Medium”

Ckl_3020 4HBD aus Clostridium kluyveri

ckl_3020 4hbd-Gen aus Clostridium kluyveri

Cm Chloramphenicol

CoA Coenzym A

ctfA Acetoacetyl-CoA:Acyl-CoA-Transferase-Gen

d desoxy

D „dextro“ (rechts)

Da Dalton

DC Dünnschichtchromatografie

dest. destiliert

DNA Desoxyribonukleinsäure

dNTP Desoxyribonukleosid-5-triphosphat

E Extinktion

E. Escherichia

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

Ery Erythromycin

et al. „et alteri“ (lat., und andere)

FAD Flavinadenindinukleotid

FID Flammenionisationsdetektor

Form. Formel

fw forward

g Gramm, Erdbeschleunigung

G Guanin

GC Gaschromatograph(ie)

GHB γ-Hydroxbutyrat

h Stunde

HBD 4-Hydroxybutyryl-CoA-Dehydratase/Vinylacetyl-CoA-∆-Isomerase

Abkürzungsverzeichnis VII

hbd 4-Hydroxybutyryl-CoA-Dehydratase/Vinylacetyl-CoA-∆-Isomerase-Gen

IS interner Standard

k kilo (103)

K Kontrolle

konz. konzentriert

l Liter, Länge

L „levo“ (links)

LB Luria-Bertani

ldh Laktatdehydrogenase-Gen

LDH Laktatdehydrogenase

ln natürlicher Logarithmus

log dekadischer Logarithmus

Lsg. Lösung

LW Leloir-Weg

µ Mikro (10-6)

m Meter, milli (10-3), „messenger“

M Molar, Marker

MBDSTFA N-Methyl-N-tert-butyldimethylsilyl-tifluoracetamid

MES 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure

min Minute

MMfvK Minimalmedium für Vorkulturen

mod. modifiziert

MS „medium-synthetique“

MW Molekulargewicht

n Nano (10-9), Anzahl der Versuche

N Stickstoff, Normal

N- Amino-

NAD(P)+ Nicotinamidadenindinucleotid-(phosphat), oxidiert

NAD(P)H Nicotinamidadenindinucleotid-(phosphat), reduziert

NaOH Natriumhydroxid

NBT Nitroblautetrazoliumchlorid

Abkürzungsverzeichnis VIII

NCBI „National Center for Biotechnology Information”

NCIMB „National Collection of Industrial, Marine and Food Bacteria”

NEB „New England Biolabs“

Nr. Nummer

nt Nukleotid(e)

NTA Nitrilotriessigsäure

OD optische Dichte

ORF offener Leserahmen

P Promotor, Phosphat

PABA Para-aminobenzoesäure

PAGE Polyacrylamidgelelektrophorese

PCR Polymerase-Kettenreaktion

PDO Propandiol

pH negativer Logarithmus der Protonenkonzentration

pI isoelektrischer Punkt

PKW Phosphoketolaseweg

PPW Pentosephosphatweg

pta Phosphotransacetylase-Gen

ptb Phosphotransbutyrylase-Gen

PTS Phosphoenolpyruvat-Transferasesystem

R Resistenz

RCA „Reinforced Clostridial Agar”

rev reverse

RNA Ribonukleinsäure

RNase Ribonuklease

RT Raumtemperatur

s Sekunde

SDS Natriumdodecylsulfat

SIM „Selected Ion Mode“

t Zeit

T Thymin

Abkürzungsverzeichnis IX

T6PW Tagatose-6-Phosphatweg

Tab. Tabelle

TAE Tris-Acetat-EDTA

Tc Tetracyclin

thlA Thiolase A-Gen

Tm Thiamphenicol

Tm Schmelztemperatur

U Units

UE Untereinheit

ü. N. über Nacht

Upm Umdrehungen pro Minute

UV Ultraviolett

V Volt

VF Verdünnungsfaktor

Vol. Volumen

v/v Volumen pro Volumen

W Watt

WT Wildtyp

w/v Masse pro Volumen

Abbildungsverzeichnis X

Abbildungsverzeichnis

Abb. 1.1: Strukturformel von 1,4-Butandiol. ............................................................................. 2

Abb. 1.2: Produktderivatkette von 1,4-Butandiol ..................................................................... 3

Abb. 1.3: Biphasischer Gärungsstoffwechsel von C. acetobutylicum. ....................................... 5

Abb. 1.4: Reaktionen der 4HBD ................................................................................................. 6

Abb. 1.5: Vorausgesagter Reaktionsmechanismus der 4HBD ................................................... 7

Abb. 1.6: Strukturelle Darstellung der 4HBD aus C. aminobutyricum. ...................................... 9

Abb. 3.1: Wachstum von C. acetobutylicum ATCC 824 in Anwesenheit von unterschiedlichen

1,4-BDO-Konzentrationen. ....................................................................................... 47

Abb. 3.2: Phasenkontrastmikroskopische Aufnahmen von C. acetobutylicum bei

verschiedenen 1,4-BDO-Konzentrationen. .............................................................. 48

Abb. 3.3: Dünnschichtchromatogramm von 1,4-BDO. ............................................................ 49

Abb. 3.4: Schematische Darstellung von 1,4-BDO und GHB nach Silylierungsreaktion mit

MBDSTFA. ................................................................................................................. 51

Abb. 3.5: SIM-Chromatogramm von 1,4-BDO und GHB. ......................................................... 51

Abb. 3.6: Erzeugung der 4HBD-kodierenden Gene cbei_2100, ckl_3020 und abfD. .............. 52

Abb. 3.7: Vektorkarten. ............................................................................................................ 53

Abb. 3.8: Kontrollrestriktion der Plasmide pTc::P(thlA)cbei_2100, pTc::P(thlA)ckl_3020 und

pTc::P(thlA)abfD. ....................................................................................................... 55

Abb. 3.9: Verifizierung von rekombinanten C. aetobutylicum-Klonen. ................................... 56

Abb. 3.10: Kultivierungsexperimente von C. acetobutylicum pTc::P(thlA)cbei_2100,

C. acetobutylicum pTc::P(thlA)ckl_3020 und C. acetobutylicum pTc::P(thlA)abfD

vergleichend zum C. acetobutylicum ATCC 824 Typstamm und C. acetobutylicum

Kontrollvektorstamm ............................................................................................. 57

Abbildungsverzeichnis XI

Abb. 3.11: Gärungsprodukte der Kultivierungsexperimente C. acetobutylicum

pTc::P(thlA)cbei_2100, C. acetobutylicum pTc::P(thlA)ckl_3020 und

C. acetobutylicum pTc::P(thlA)abfD vergleichend zum C. acetobutylicum ATCC

824 Wildtypstamm und C. acetobutylicum pTc-Kontrollvektorstamm ................. 59

Abb. 3.12: 1,4-BDO- und GHB-Produktion der Expressionsstämme nach 120 h Kultivierung in

200 ml MS-MES. ...................................................................................................... 62

Abb. 3.13: Zeitlicher Verlauf der 1,4-BDO- und GHB-Produktion. .......................................... 64

Abb. 3.14: Kultivierungsexperiment von C. acetobutylicum pTc::P(thlA)cbei_2100 in 1,5 l

Kulturvolumen......................................................................................................... 66

Abb. 3.15: 1,4-BDO- und GHB-Produktion von C. acetobutylicum pTc::P(thlA)cbei_2100 in

1,5 l Kulturvolumen in Abhängigkeit verschiedener Medien. ................................ 67

Abb. 3.16: Kultivierungsexperimente von C. acetobutylicum pTc::P(thlA)cbei_2100 auf

verschiedenen C-Quellen. ....................................................................................... 68

Abb. 3.17: 1,4-BDO- und GHB-Produktion von C. acetobutylicum pTc::P(thlA)cbei_2100 auf

verschiedenen C-Quellen. ....................................................................................... 69

Abb. 3.18: Zeitlicher Verlauf der 1,4-BDO- und GHB-Produktion von C. acetobutylicum

pTc::P(thlA)cbei_2100. ............................................................................................ 70

Abb. 3.19: Schematische Darstellung der Vektorherstellung mit unterschiedlichen

Promotoren. ............................................................................................................ 72

Abb. 3.21: Gärungsstoffwechsel von C. acetobutylicum. ........................................................ 76

Abb. 3.22: 1,4-BDO- und GHB-Produktion rekombinanter C. acetobutylicum-Mutanten. ..... 77

Abb. 3.23: Gärungsstoffwechsel von C. acetobutylicum. ........................................................ 78

Abb. 3.24: 1,4-BDO- und GHB-Produktion rekombinanter C. acetobutylicum-Mutanten. ..... 79

Abb. 4.1: Schematische Darstellung der potentiellen Bildungswege von 4-Hydroxbutyrat

(GHB). ........................................................................................................................ 87

Abb. 4.2: Schematische Darstellung der Kohlenhydratverwertung in C. acetobutylicum ...... 89

Abbildungsverzeichnis XII

Abb. 4.3: Schematische Darstellung der Lignocellulose-Zusammensetzung .......................... 93

Abb. A1: Dünnschichtchromatogramm von 1,4-BDO ............................................................ 113

Abb. A2: Dünnschichtchromatogramm von 1,4-BDO mit C. acetobutylicum Kulturüberstand

................................................................................................................................................ 113

Abb. A3: Analysenfunktion für die Kalibrierung der 1,4-BDO-Messung ............................... 114

Abb. A4: Analysenfunktion für die Kalibrierung der GHB-Messung ...................................... 114

Abb. A5: Aminosäure-Alignment der 4HBDs ......................................................................... 115

Abb. A6: Vektorkarte vom pT-Vektor .................................................................................... 116

Abb. A7: Nukleotidsequenz von cbei_2100 nach Sequenzierung positiver Plasmide ........... 116

Abb. A8: Nukleotidsequenz von ckl_3020 nach Sequenzierung positiver Plasmide ............. 117

Abb. A9: Nukleotidsequenz von abfD nach Sequenzierung positiver Plasmide ................... 117

Abb. A10: Zeitlicher Verlauf der 1,4-BDO- und GHB-Produktion von C. acetobutylicum

pTc::P(thlA)cbei_2100 auf verschiedenen Kohlenstoffquellen ............................ 118

Abb. A11: Vektorkarten der generierten Vektoren zur Variation der Promotoren .............. 120

Abb. A12: Vektorkarten pT::P(ptb)pp2, pT::P(adc)pp2 und pT::P(fac)pp2 ............................ 121

Abb. A13: Colony-PCR auf die 4HBD-kodierenden Gene ...................................................... 122

Abb. A14: SDS-PAGE aufgereinigter 4HBDs ........................................................................... 122

Abb. A15: Western Blot der aufgetrennten Proteinproben .................................................. 123

Abb. A16: Zeitlicher Verlauf der 1,4-BDO- und GHB-Produktion von C. acetobutylicum

pT::P(ptb)ckl_3020. ............................................................................................... 125

Tabellenverzeichnis XIII

Tabellenverzeichnis

Tab. 1.1: Bifunktionelle 4-Hydroxybutyryl-CoA Dehydratasen/Vinylacetyl-CoA-∆-Isomerasen

(4HBDs) aus verschiedenen Clostridien-Spezies.......................................................... 8

Tab. 2.1: Organismen ............................................................................................................... 10

Tab. 2.2: Vektoren .................................................................................................................... 13

Tab. 2.3: rekombinante Plasmide ............................................................................................ 14

Tab. 2.4: Oligonukleotide ......................................................................................................... 15

Tab. 2.5: Medienzusätze .......................................................................................................... 19

Tab. 2.6: Restriktionsendonukleasen ....................................................................................... 33

Tab. 2.7: SDS-PAGE-Gellösungen ............................................................................................. 40

Tab. 2.8: Bezugsquellen für Chemikalien ................................................................................. 43

Tab. 2.9: Bezugsquellen für Geräte und Materialien ............................................................... 44

Tab. 3.1: Wachstumsraten (µ) und Verdopplungszeiten (td) von C. acetobutylicum bei

unterschiedlichen 1,4-BDO-Konzentrationen............................................................ 47

Tab. 3.2: 1,4-BDO-Produktivitäten der Expressionsstämme. .................................................. 63

Tab. A1: Kalibrierung der 1,4-BDO- und GHB-Nachweismethode ......................................... 114

Tab. A2: Wachstumsparameter und Gärungsprodukte der 200-ml Kultivierungsexperimente

................................................................................................................................................ 118

Tab. A3: Wachstumsparameter und Gärungsprodukte von rekombinanten C. acetobutylicum

Stämmen .................................................................................................................. 123

Tab. A4: Vergleich der Häufigkeiten der verwendeten Codons in C. acetobutylicum,

Cbei_2100, Ckl_3020 und AbfD ............................................................................... 124

Tab. A5: Gärungsprodukte transformierter C. acetobutylicum-Mutantenstämmen in 200 ml

MS-MES nach 120 h ................................................................................................. 125

Einleitung 1

1. Einleitung

1.1 Zielstellung

Die Möglichkeit der Nutzung von fossilen Ressourcen, wie z. B. Erdöl, Kohle und Gas führten

zur Entwicklung der heutigen Gesellschaft und ihres Wohlstands. Aus diesem Grund lag bis

ins 20. Jahrhundert hinein der Schwerpunkt vieler Forschungen auf der Entwicklung der

erdölbasierten Produktion von Chemikalien und anderen Gütern (Demirbas, 2006; Chandra

et al., 2012). Dies resultierte jedoch in einer Abhängigkeit der heutigen Weltwirtschaft von

diesen nicht-erneuerbaren Energieträgern, sodass ca. 90 % der genutzten Energiequellen

fossilen Ursprungs sind (Chandra et al., 2012). Aufgrund exzessiven Gebrauchs jener Quellen

kommt es durch Emission von Kohlenstoffdioxid neben Luftverschmutzungen in urbanen

Ballungsgebieten vor allem zu einem Anstieg der Treibhausgase in der Erdatmosphäre

(Sarkar et al., 2012), welche maßgeblich mit der Erderwärmung assoziiert sind (Chandra et

al., 2012). Durch die zunehmende Weltbevölkerung und dem damit einhergehenden

steigenden Energiebedarf wird die Situation in Hinblick auf Nachhaltigkeit und Klimawandel

erheblich verschlechtert. Aus diesem Grund ist die Entwicklung von alternativen Strategien

zur Nutzung und Optimierung von erneuerbaren Energiequellen unabdingbar. Ein

entsprechender Ansatz beinhaltet die Erzeugung von bisher auf Erdölbasis hergestellten

Grundchemikalien für die chemische Industrie aus nachwachsenden Rohstoffen. Hierzu zählt

unter anderem die biotechnologische Produktion von Diolen, die als Plattformchemikalien

für viele verschiedene industrielle Anwendungen eingesetzt werden (Zeng und Sabra, 2011).

Zu den wichtigsten industriell genutzten Diolen gehören 1,3-Propandiol (1,3-PDO),

2,3-Butandiol (2,3-BDO) und 1,4-Butandiol (1,4-BDO). Dabei werden 1,3-PDO und 2,3-BDO

bereits im industriellen Großmaßstab biotechnologisch produziert (Zeng und Sabra, 2011).

Im Gegensatz zu diesen Diolen kommt 1,4-BDO in der Natur nicht vor, sondern wird

ausschließlich über chemische Synthesen auf Erdölbasis erzeugt (Yim et al., 2011). Daher ist

es von Interesse auch diese Verbindung unabhängig von fossilen Energiequellen aus

erneuerbaren Rohstoffen zu gewinnen. Vor wenigen Jahren gelang es Yim et al. (2011) einen

1,4-BDO-Biosyntheseweg in Escherichia coli zu etablieren. Hierfür waren jedoch komplexe

und umfangreiche genetische Veränderungen des Wirtsorganismus notwendig. Im

Gegensatz dazu beinhaltete die in dieser Arbeit verfolgte Strategie die Generierung eines

Einleitung 2

1,4-BDO-Biosyntheseweges durch eine einzige genetische Veränderung des Wirtsorganismus

Clostridium acetobutylicum. Durch das Zusammenspiel einer heterolog exprimierten 4HBD

(1.4) und einem nativen Enzym (AdhE) sollte der Stoffwechsel des Wirtsorganismus

erweitert und so die 1,4-BDO-Bildung ermöglicht werden. Demnach bestand das vorrangige

Ziel dieser Arbeit darin, C. acetobutylicum durch Bereitstellung der genetischen

Voraussetzungen zu einem 1,4-BDO-Produzenten zu entwickeln. Bei erfolgreicher 1,4-BDO-

Produktion sollte weiterhin durch erste Optimierungsversuche die Produktbildung

verbessert und der Einfluss verschiedener Kohlenhydratquellen auf die Biosynthese

untersucht werden.

1.2 1,4-Butandiol

1,4-Butandiol ist ebenso wie 2,3-Butandiol ein Isomer des Butandiols und wird aufgrund der

beiden Hydroxylgruppen (OH-) der Gruppe der Diole zugeordnet (Zeng und Sabra, 2011). Die

OH-Gruppen sind dabei an den Kohlenstoffatomen 1 und 4 gebunden (Abb. 1.1). 1,4-BDO ist

eine farb- und geruchslose Flüssigkeit und leicht biologisch abbaubar (OECD 301C: 100 %

nach 14 Tagen).

Abb. 1.1: Strukturformel von 1,4-Butandiol.

Von den vier Kohlenstoff-basierten Diolen in der Industrie wird 1,4-BDO am häufigsten im

Großmaßstab verwendet (Haas et al., 2005). Die jährliche chemische Produktion beträgt ca.

1,3 Mio. Tonnen pro Jahr (Yim et al., 2011; Zeng und Sabra, 2011) mit einem Marktpreis von

ca. 1850 €/t (van Haveren et al., 2008). Analysen bescheinigen dem globalen 1,4-BDO-Markt

eine jährliche Wachstumsrate von 4,8 % bis 2020 (in: 1,4-Butanediol market analysis and

segment forecasts to 2020; www.hexareports.com/report/1-4-butanediol-market-analysis-

and-segment-forecasts-to-2020/details, Stand: 25.02.2016). Die Produktderivatkette des

1,4-BDO umfasst vier Hauptzweige: Tetrahydrofurane (THF), γ-Butyrolactone (GBL),

Polybutylenterephthalate (PTB) und Polyurethane (PUR) (Abb. 1.2). Daraus gehen wiederum

jährlich 2,5 Mio. Tonnen Plastik, Polyester und Elastanfasern hervor (Yim et al., 2011), die

Einleitung 3

unter anderem Anwendung in der Automobil-, Textil- und Kosmetikindustrie finden (Haas et

al., 2005). In Form von Funktionsbekleidung, Schuhsohlen, Schutzgehäusen für

Haushaltskleingeräte und technisches Plastik für Armaturenbretter sind diese Erzeugnisse

aus dem heutigen Alltag nicht mehr wegzudenken. Aufgrund dieser zahlreichen

verschiedenen Anwendungsmöglichkeiten wird 1,4-BDO infolgedessen auch als eine „Top-

Mehrwert“-Chemikalie bezeichnet (Yim et al., 2011).

Abb. 1.2: Produktderivatkette von 1,4-Butandiol (1,4-BDO). THF, Tetrahydrofuran; GBL, γ-Butyrolacton; PTB,

Polybutylenterephthalat; PUR, Polyurethan.

Die Produktion von 1,4-BDO erfolgt bisher rein synthetisch aus erdölbasierten Rohstoffen,

wie Acetylen, Butan, Propylen oder Butadien (Haas et al., 2005). Damit unterliegt die

Produktion der wichtigen Plattformchemikalie den allgemeinen wirtschaftlichen Problemen,

wie Schwankungen in den Erdölpreisen und verknappenden Erdölreserven. Um eine vom

Erdöl unabhängige Produktion von 1,4-BDO zu gewährleisten, wurde für die

biotechnologische Erzeugung dieser Chemikalie der Modellorganismus C. acetobutylicum als

Wirtsstamm eingesetzt.

1,4-BDO

OH

HO

THF GBL PTB PUR

Lösungsmittel

Thermoplastik

Highperformance-

Polyester

Lösungsmittel

(Co-)Polymer

Kosmetik

Thermoplastik

Plastikgehäuse

Kleinelektronik

Automobilindustrie

Verpackungsmaterial

Bauschaum

Elastanfasern

Einleitung 4

1.3 Clostridium acetobutylicum

Nach Isolierung und Erstbeschreibung durch Chaim Weizmann zwischen 1912 und 1914

wurde C. acetobutylicum vorwiegend für die Aceton-Butanol-Ethanol-(ABE) Fermentation

eingesetzt (Jones und Woods, 1986). Vor allem während des 1. Weltkrieges erlangte die

ABE-Fermentation eine enorme Bedeutung, insbesondere in Großbritannien, da Aceton für

die Herstellung von Kordit, einem rauchfreien Schießpulver, benötigt wurde (Dürre, 2008).

Mit der raschen Ausbreitung der Automobilindustrie in den USA nach dem Krieg wurde das

als Nebenprodukt angesehene Butanol immer wichtiger. Ab den 1950er Jahren kam es

jedoch aufgrund gesunkener Rohölpreise und der Entwicklung von wirtschaftlicheren und

effizienteren petrochemischen Verfahren zu einem rapiden Rückgang der industriellen ABE-

Fermentation (Dürre, 2008). Gestiegene Erdölpreise in den 70er Jahren und ein

zunehmendes Interesse an der Erzeugung von Biokraftstoffen führten dann zu einem

erneuten Aufschwung der ABE-Fermentation (Dürre, 2008). Besonders in China wurden

seitdem alte ABE-Fermentationsanlagen wieder in Stand gesetzt und neue eingerichtet,

wodurch bis heute mehrere 100.000 t Butanol pro Jahr erzeugt werden (Chiao und Sun,

2007). Somit rückte C. acetobutylicum in den Fokus aktueller Forschungen (Lütke-Eversloh

und Bahl, 2011) und entwickelte sich so zu einem Modellorganismus apathogener

Clostridien (Bahl und Dürre, 1993).

Bei C. acetobutylicum handelt es sich um ein Gram-positives, sporenbildendes und strikt

anaerobes Bakterium (Madigan et al., 2013), welches in der Lage ist, eine Vielzahl an

verschiedenen Kohlenhydraten, wie z. B. Arabinose, Galaktose, Glukose, Mannose und

Xylose, zu verwerten (Qureshi et al., 2006; Ezeji und Blaschek, 2008; Servinsky et al., 2010).

Mit Blick auf die Verwendung als biotechnologische Produktionsplattform ist dies ein

wichtiger ökonomischer Vorteil für die Umwandlung von preisgünstigen Substraten. Denn

diese Zucker sind die Hauptkomponenten von Hemicellulose, einem wesentlichen

Bestandteil der Lignocellulose (Mussatto und Teixeira, 2010), einem günstigen und

nachwachsenden Rohstoff, der aktuell in Form von Weizenstroh, Getreidestroh, Reisstroh

und Bagasse (Sarkar et al., 2012) jedes Jahr in sehr großen Mengen verfügbar ist

(10-50 x 109 Tonnen; Kuhad und Singh, 1993). Lignocellulose-Hydrolysate würden somit ein

optimales Substrat für die biotechnologische Fermentation darstellen, so auch für die in

dieser Arbeit angestrebte 1,4-BDO-Synthese. Die Metabolisierung der Kohlenhydratquellen

Einleitung 5

erfolgt in einem biphasischen Gärungsstoffwechsel (Abb. 1.3), welcher für C. acetobutylicum

charakteristisch ist und in eine säure- (acidogene) und lösungsmittelbildende (solventogene)

Phase gegliedert wird. Während des exponentiellen Wachstums werden die

aufgenommenen Kohlenhydrate über die Glykolyse zu den Säuren Acetat und Butyrat

umgesetzt, welche in das umgebende Medium abgegeben werden. Dies führt zu einem

Absinken des externen pH-Wertes (Hartmanis und Gatenbeck, 1984). Durch die zunehmende

Akkumulation der Säuren kommt es beim Übergang von der exponentiellen in die stationäre

Wachstumsphase zu einer Veränderung im Genexpressionsprofil von C. acetobutylicum

(Alsaker und Papoutsakis, 2005) und zur Einleitung des „Lösungsmittelshifts“. Infolgedessen

werden Acetat und Butyrat assimiliert und in die pH-neutralen Lösungsmittel Aceton,

Butanol und Ethanol im Verhältnis von 3:6:1 umgewandelt (Mitchell, 1998).

Abb. 1.3: Biphasischer Gärungsstoffwechsel von C. acetobutylicum. Der Abzweig des 1,4-BDO-

Biosynthesewegs sowie die veranwortliche rekombinante 4HBD sind in blau, native Enzyme in rot dargestellt.

Gestrichelte Linien weisen auf die Reassimilation der Säuren während der Solventogenese hin. Abkürzungen:

Ldh, Lactat-Dehydrogenase; Pfor, Pyruvat-Ferredoxin-Oxidoreduktase; Hyd, Hydrogenase; Fnor, Ferredoxin-

NAD(P)+-Oxidoreduktase; Pta, Phosphotransacetylase, Ack, Acetatkinase; AdhE, Aldehyd/ Alkohol-

Dehydrogenase; CtfAB, Acetoacetyl-CoA:Acyl-CoA-Transferase; Adc, Acetoacetat-Decarboxylase; Thl, Thiolase;

Hbd, 3-Hydroxybutyryl-CoA-Dehydrogenase; Crt, Crotonase; 4HBD, 4-Hydroxybuytryl-CoA-Dehydratase; Bcd,

Butyryl-CoA-Dehydrogenase-Komplex; Ptb, Phosphotransbutyrylase; Buk, Butyratkinase; Acetyl-P,

Acetylphosphat; Ac-CoA, Acetyl-CoA; AcAld, Acetaldehyd; AcAc-CoA, Acetoacetyl-CoA; AcAc, Acetoacetat; 3HB-

CoA, 3-Hydroxybutyryl-CoA; 4HB-CoA, 4-Hydroxybutyryl-CoA; Butyryl-P, Butyrylphosphat; BuAld, Butyraldehyd.

Einleitung 6

Der C4-Stoffwechsel von C. acetobutylicum bietet die besondere Möglichkeit durch die

Einbringung einer 4HBD-Aktivität einen Weg zur 1,4-BDO-Bildung zu eröffnen (Abb. 1.3).

1.4 4-Hydroxybutyryl-CoA-Dehydratase/Vinylacetyl-CoA-∆-

Isomerase

Eine weitverbreitete Reaktion in biochemischen Stoffwechselwegen ist die Dehydratation

(Martins et al., 2004). Derzeit sind mehr als 100 Dehydratasen (Hydrolyasen [EC 4.2.1.-])

bekannt (Martins et al., 2007). Die meisten dieser Enzyme katalysieren dabei die

Eliminierung von Wasser unter Ausbildung einer Doppelbindung, wobei das α-Wasserstoff

an Position C2 durch die Elektronen-ziehende Wirkung der benachbarten funktionellen

Gruppe (z. B. CoA-Thioestergruppe) aktiviert und dann als Proton entfernt werden kann.

Daraufhin wird die Hydroxylgruppe in β-Position (C3) freigegeben (Martins et al., 2007). In

anaeroben Mikroorganismen gibt es jedoch die Möglichkeit durch Radikal-vermittelte

Reaktionen ein Wasserstoffatom von einem nicht-aktivierten β-Kohlenstoff (C3) zu

entfernen (Martins et al., 2004). Die 4-Hydroxybutyryl-CoA-Dehydratase/Vinylacetyl-CoA-∆-

Isomerase (4HBD; EC 4.2.1.120/ EC 5.3.3.3) ist solch eine atypische Dehydratase und

katalysiert sowohl die reversible, sauerstoffempfindliche Dehydrierung von

4-Hydroxybutyryl-CoA (4HB-CoA) zu Crotonyl-CoA als auch die irreversible, Sauerstoff-

unempfindliche Isomerisierung von Vinylacetyl-CoA zu Crotonyl-CoA (Scherf und Buckel,

1993) (Abb. 1.4). Die Gesamtreaktion verläuft dabei trotz eines nicht-kovalent gebundenen

FADs ohne Netto-Redoxveränderungen ab (Müh et al., 1996), was zu der Annahme eines

Radikal-basierten Reaktionsmechanismus führte (Martins et al., 2004) (Abb. 1.5).

Abb. 1.4: Reaktionen der 4HBD (Martins et al., 2007; mod.).

4-Hydroxybutyryl-CoA Vinylacetyl-CoA Crotonyl-CoA

Einleitung 7

Durch Bindung von 4HB-CoA durch die 4HBD zwischen den beiden prosthetischen Gruppen

(FAD und [4Fe-4S]2+-Cluster) wird das C2-Proton von 4HB-CoA abgespalten (Abb. 1.5) und ein

Elektron von [4Fe-4S]2+ auf FAD übertragen. Das entstandene Flavin-Semiquinon-Anion

(FAD- ·) oxidiert anschließend das Enolat zum Enoxylradikal, welches infolgedessen das C3-

Proton ansäuert (pKa = 14). Das Flavin-Semiquinon-Anion agiert daraufhin als Base und

entfernt das Proton von der β-Position. Es entstehen das neutrale Semiquinon (FADH) und

ein Ketyl-Radikal-Anion. Es folgt durch Abspaltung der Hydroxylgruppe die Bildung eines

Dienoxyl-Radikals und dessen Reduktion zum Dienolat unter Regenerierung des FADs.

Abschließend wird durch Protonierung das Dienolat zu Crotonyl-CoA umgewandelt.

Abb. 1.5: Vorausgesagter Reaktionsmechanismus der 4HBD (Näser et al., 2005; mod.).

4HB-CoA

Enolat

Enoxyl-Radikal

Crotonyl-CoA

Dienolat

Dienoxy-Radikal

Ketyl-Radikal-Anion Ketyl-Radikal-Anion

FAD

FAD·

FADH

Einleitung 8

Die Dehydratation von 4-Hydroxyacyl-CoA-Derivaten zu Crotonyl-CoA ist zwar von

anaeroben Bakterien, vorzugsweise bei Vertretern der Fusobacteriales und Clostridiales

bekannt (Buckel et al., 2005), C. acetobutylicum verfügt jedoch über keine 4HBD. Allerdings

kommen 4HBD homologe Enzyme aus relativ nah verwandten Arten, wie beispielsweise

C. aminobutyricum (AbfD), C. beijerinckii (Cbei_2100) und C. kluyveri (Ckl_3020) (Tab. 1.1), in

denen sie eine wesentliche Rolle bei der Aminobutyrat- bzw. Succinat-Fermentation

einnehmen, vor (Scherf und Buckel, 1993; Scherf et al., 1994; Buckel, 2001). Aufgrund der

Verwandtschaftsbeziehung der Donorstämme zum Wirtsorganismus galten diese Enzyme als

erste Kandidaten, um eine 1,4-BDO-Synthese in C. acetobutylicum zu ermöglichen. Denn

durch die 4HBD sollte es möglich sein, das im Stoffwechsel von C. acetobutylicum gebildete

Crotonyl-CoA zu 4HB-CoA umzuwandeln, welches dann weiter zu 1,4-BDO umgesetzt wird

(Abb. 1.3).

Tab. 1.1: Bifunktionelle 4-Hydroxybutyryl-CoA Dehydratasen/Vinylacetyl-CoA-∆-Isomerasen (4HBDs) aus

verschiedenen Clostridien-Spezies.

Organismus ORF annotierte Funktion

Gen [Bp]

Protein [AS]

MW [kDa]1

pI [pH]

C. beijerinckii cbei_2100 Vinylacetyl-CoA-∆-Isomerase

EC [5.3.3.3]

1455 484 53,6 6,61

C. kluyveri a) ckl_3020 4-Hydroxybutyryl-CoA Dehydratase

EC [4.2.1.120]

1455 484 53,7 5,84

C. aminobutyricum b) abfD 4-Hydroxybutyryl-CoA Dehydratase

EC [4.2.1.120]

1473 490 54,4 5,78

1 Theoretisch ermitteltes Molekulargewicht über die AS-Sequenz (http://web.expasy.org/compute_pi/).

Legende: ORF, offener Leserahmen; Bp, Anzahl der Basenpaare; AS, Anzahl der Aminosäuren; MW,

Molekulargewicht der Proteine; kDa, Kilodalton; pI, isoelektrischer Punkt. a) Scherf et al., 1994, b) Scherf und

Buckel, 1993.

Die katalytisch aktive Form der 4HBD ist eine homotetramere Struktur mit einem

Gesamtmolekulargewicht von 232 kDa, welche sich aus vier identischen Untereinheiten

(MW ca. 54 kDa) zusammensetzt (Scherf und Buckel, 1993) (Abb. 1.6, A). Dabei sind beide

Einleitung 9

Dimere mit zwei aktiven Zentren pro Dimer katalytisch funktionsfähig (Martins et al., 2007).

Die Monomere sind jeweils aus drei Domänen aufgebaut (Abb. 1.6, B). Die N- und C-

terminalen α-Helices werden durch eine β-Faltblattstruktur miteinander verbunden (Zhang,

2010). Darüber hinaus sind je Untereinheit ein [4Fe-4S]2+-Cluster und ein FAD in oxidierter

Form gebunden (Scherf und Buckel, 1993; Müh et al., 1996). Beide prosthetischen Gruppen

sind für den bereits beschriebenen Reaktionsmechanismus essentiell.

A) B)

Abb. 1.6: Strukturelle Darstellung der 4HBD aus C. aminobutyricum. A) Homotetramere Struktur der 4HBD.

Die vier Monomere sind individuell angefärbt (blau, rot, grün und gelb). B) Sekundärstruktur eines Monomers.

Die N- und C-terminalen α-Helices (rot bzw. blau) sowie die β-Faltblattstruktur (grün) sind farblich

hervorgehoben (Martins et al., 2007).

Material und Methoden 10

2. Material und Methoden

2.1 Organismen und Plasmide

Die in dieser Arbeit verwendeten Organismen (Tab. 2.1), Vektoren (Tab. 2.2) und

rekombinanten Plasmide (Tab. 2.3) sind nachfolgend aufgeführt.

Tab. 2.1: Organismen

Organismen Genotyp Herkunft/ Referenz

C. acetobutylicum ATCC 824

Typstamm ATCC, Laborsammlung Nr. 258

C. acetobutylicum pTc

C. acetobutylicum ATCC 824 pTc-Vektor ohne Insert, AmpR, CmR/TmR

Schulz, 2013, Laborsammlung Nr. 356

C. acetobutylicum pTc::P(thlA)cbei_2100

C. acetobutylicum ATCC 824 pTc::P(thlA)cbei_2100; C-terminaler Strep-tag II, CmR/TmR, AmpR

diese Arbeit, Laborsammlung Nr. 648

C. acetobutylicum pT::P(ptb)cbei_2100

C. acetobutylicum ATCC 824 pT::P(ptb)cbei_2100; C-terminaler Strep-tag II, EryR, AmpR


C. acetobutylicum pT::P(adc)cbei_2100

C. acetobutylicum ATCC 824 pT::P(adc)cbei_2100; C-terminaler Strep-tag II, EryR, AmpR


C. acetobutylicum pT::P(fac)cbei_2100

C. acetobutylicum ATCC 824 pT::P(fac)cbei_2100; C-terminaler Strep-tag II, EryR, AmpR


C. acetobutylicum pTc::P(thlA)ckl_3020

C. acetobutylicum ATCC 824 pTc::P(thlA)ckl_3020; C-terminaler Strep-tag II, CmR/TmR, AmpR


C. acetobutylicum pT::P(ptb)ckl_3020

C. acetobutylicum ATCC 824 pT::P(ptb)ckl_3020; C-terminaler Strep-tag II, EryR, AmpR


C. acetobutylicum pT::P(adc)ckl_3020

C. acetobutylicum ATCC 824 pT::P(adc)ckl_3020; C-terminaler Strep-tag II, EryR, AmpR


C. acetobutylicum pT::P(fac)ckl_3020

C. acetobutylicum ATCC 824 pT::P(fac)ckl_3020; C-terminaler Strep-tag II, EryR, AmpR


C. acetobutylicum pTc::P(thlA)abfD

C. acetobutylicum ATCC 824 pTc::P(thlA)abfD; C-terminaler Strep-tag II, CmR/TmR, AmpR



Tab. 2.1: Organismen (Fortsetzung)


C. acetobutylicum pT::P(ptb)abfD

C. acetobutylicum ATCC 824 pT::P(ptb)abfD; C-terminaler Strep-tag II, EryR, AmpR


C. acetobutylicum pT::P(adc)abfD

C. acetobutylicum ATCC 824 pT::P(adc)abfD; C-terminaler Strep-tag II, EryR, AmpR


C. acetobutylicum pT::P(fac)abfD

C. acetobutylicum ATCC 824 pT::P(fac)abfD; C-terminaler Strep-tag II, EryR, AmpR


C. acetobutylicum pta::int(80)

Gruppe II Intron integrierte zw. 80./81. Bp von pta, EryR

Lehmann, 2012a; Laborsammlung Nr. 328

C. acetobutylicum pta::int(80) pTc::P(thlA)cbei_2100

Gruppe II Intron integrierte zw. 80./81. Bp von pta, EryR; pTc::P(thlA)cbei_2100; C-terminaler Strep-tag II, CmR/TmR, AmpR


C. acetobutylicum ptb::int(87)

Gruppe II Intron integrierte zw. 87./88. Bp von ptb, EryR


C. acetobutylicum ptb::int(87) pTc::P(thlA)cbei_2100

Gruppe II Intron integrierte zw. 87./88. Bp von ptb, EryR; pTc::P(thlA)cbei_2100; C-terminaler Strep-tag II, CmR/TmR, AmpR


C. acetobutylicum ldh1::int(93)

Gruppe II Intron integrierte zw. 93./94. Bp von ldh1, EryR


C. acetobutylicum ldh1::int(93) pTc::P(thlA)cbei_2100

Gruppe II Intron integrierte zw. 93./94. Bp von ldh1, EryR; pTc::P(thlA)cbei_2100; C-terminaler Strep-tag II, CmR/TmR, AmpR


C. acetobutylicum ldh2::int(231)

Gruppe II Intron integrierte zw. 231./232. Bp von ldh2, EryR


C. acetobutylicum ldh2::int(231) pTc::P(thlA)cbei_2100

Gruppe II Intron integrierte zw. 231./232. Bp von ldh2, EryR; pTc::P(thlA)cbei_2100; C-terminaler Strep-tag II, CmR/TmR, AmpR


C. acetobutylicum adhE1::int(158)

Gruppe II Intron integrierte zw. 158./159. Bp von adhE1, EryR


C. acetobutylicum adhE1::int(158) pTc::P(thlA)cbei_2100

Gruppe II Intron integrierte zw. 158./159. Bp von adhE1, EryR; pTc::P(thlA)cbei_2100; C-terminaler Strep-tag II, CmR/TmR, AmpR


C. acetobutylicum adhE2::int(114)

Gruppe II Intron integrierte zw. 114./115. Bp von adhE2, EryR





C. acetobutylicum adhE2::int(114) pTc::P(thlA)cbei_2100

Gruppe II Intron integrierte zw. 114./115. Bp von adhE2, EryR; pTc::P(thlA)cbei_2100; C-terminaler Strep-tag II, CmR/TmR, AmpR


C. acetobutylicum adc::int(180)

Gruppe II Intron integrierte zw. 180./181. Bp von adc, EryR


C. acetobutylicum adc::int(180) pTc::P(thlA)cbei_2100

Gruppe II Intron integrierte zw. 180./181. Bp von adc, EryR;pTc::P(thlA)cbei_2100; C-terminaler Strep-tag II, CmR/TmR, AmpR


C. acetobutylicum ctfA::int(352)

Gruppe II Intron integrierte zw. 352./353. Bp von ctfA, EryR


C. acetobutylicum ctfA::int(352) pTc::P(thlA)cbei_2100

Gruppe II Intron integrierte zw. 352./353. Bp von ctfA, EryR;pTc::P(thlA)cbei_2100; C-terminaler Strep-tag II, CmR/TmR, AmpR


C. beijerinckii NCIMB 8052

Typstamm NCIMB, Laborsammlung Nr. 107

C. kluyveri Typstamm Laborsammlung

E. coli DH5α supE44, ∆lacU169, hsdR17, (φ80lacZ∆M15), recA1, endA1, gyrA96, thi-1, relA1

Grant et al., 1990; Laborsammlung Nr. 272

E. coli DH5α pTc::P(thlA)cbei_2100

pTc::P(thlA)cbei_2100, C-terminaler Strep-tag II, AmpR, CmR/TmR


E. coli DH5α pT::P(ptb)cbei_2100

pT::P(ptb)cbei_2100, C-terminaler Strep-tag II, AmpR, EryR


E. coli DH5α pT::P(adc)cbei_2100

pT::P(adc)cbei_2100, C-terminaler Strep-tag II, AmpR, EryR


E. coli DH5α pT::P(fac)cbei_2100

pT::P(fac)cbei_2100, C-terminaler Strep-tag II, AmpR, EryR


E. coli DH5α pTc::P(thlA)ckl_3020

pTc::P(thlA)ckl_3020, C-terminaler Strep-tag II, AmpR, CmR/TmR


E. coli DH5α pT::P(ptb)ckl_3020

pT::P(ptb)ckl_3020, C-terminaler Strep-tag II, AmpR, EryR


E. coli DH5α pT::P(adc)ckl_3020

pT::P(adc)ckl_3020, C-terminaler Strep-tag II, AmpR, EryR





E. coli DH5α pT::P(fac)ckl_3020

pT::P(fac)ckl_3020, C-terminaler Strep-tag II, AmpR, EryR


E. coli DH5α pTc::P(thlA)abfD

pTc::P(thlA)abfD, C-terminaler Strep-tag II, AmpR, CmR/TmR


E. coli DH5α pT::P(ptb)abfD

pT::P(ptb)abfD, C-terminaler Strep-tag II, AmpR, EryR


E. coli DH5α pT::P(adc)abfD

pT::P(adc)abfD, C-terminaler Strep-tag II, AmpR, EryR


E. coli DH5α pT::P(fac)abfD

pT::P(fac)abfD, C-terminaler Strep-tag II, AmpR, EryR


E. coli DH5α pT::P(ptb)pp2

pT::P(ptb)pp2, C-terminaler Strep-tag II, AmpR, EryR

Schulz, 2013; Laborsammlung Nr. 233

E. coli DH5α pT::P(adc)pp2

pT::P(adc)pp2, C-terminaler Strep-tag II, AmpR, EryR


E. coli DH5α pT::P(fac)pp2

pT::P(fac)pp2, C-terminaler Strep-tag II, AmpR, EryR


E. coli DH5α pASK-IBA3+::abfD

pASK-IBA3+::abfD, C-terminaler Strep-tag II, AmpR


E. coli ER2275 trp-31, his-1, tonA2, rpsL104, supE44, xyl-7,

mtl-2, metB1, el4-, ∆(lac)U169, endA1, recA1,

R(zbg10::Tn10) Tcs, ∆(mcr-hsd-mrr)114::1510,

[F´, proAB, laqlqZ∆2.15zzf::mini-Tn10 (Km

r)]

NEB, Laborsammlung Nr. 271

Tab. 2.2: Vektoren

Vektor Relevantes Merkmal Herkunft/ Referenz

pANII TcR , Φ3tI; p15A oriR Heap et al., 2007; Laborsammlung Nr. 271

pTc::hydA thlA Promotor, hydA, Strep-tag II, AmpR, CmR/TmR, repL, ColE1 ori, cytoplasmatische Expression in E. coli


pASK-IBA3+::abfD ColE1 origin, F1 origin, MCS, AmpR, tet-Repressor, cytoplasm. Express. in E. coli

Gerhardt et al., 2000


Tab. 2.2: Vektoren (Fortsetzung)

Vektor Relevantes Merkmal Herkunft/ Referenz

pT::P(ptb)pp2 ptb Promotor, pp2, AmpR, CmR/TmR, repL, ColE1 ori, cytoplasmatische Expression in E. coli

Schulz, 2013 Laborsammlung Nr. 233

pT::P(adc)pp2 adc Promotor, pp2, AmpR, CmR/TmR, repL, ColE1 ori, cytoplasmatische Expression in E. coli


pT::P(fac)pp2 fac Promotor, pp2, AmpR, CmR/TmR, repL, ColE1 ori, cytoplasmatische Expression in E. coli


Tab. 2.3: rekombinante Plasmide

Plasmid Relevantes Merkmal Insert Herkunft

pTc::P(thlA)cbei_2100 thlA-Promotor, 5´BamHI, 3Ćfr9I, cbei_2100, Strep-tag II, AmpR, CmR/TmR, repL, ColE1 ori, cytoplasmatische Exp.

1455 Bp diese Arbeit

pT::P(ptb)cbei_2100 ptb-Promotor, 5´BamHI, 3Ćfr9I, cbei_2100, Strep-tag II, AmpR, EryR, repL, ColE1 ori, cytoplasmatische Expression


pT::P(adc)cbei_2100 adc-Promotor, 5´BamHI, 3Ćfr9I, cbei_2100, Strep-tag II, AmpR, EryR, repL, ColE1 ori, cytoplasmatische Expression


pT::P(fac)cbei_2100 fac-Promotor, 5´BamHI, 3Ćfr9I, cbei_2100, Strep-tag II, AmpR, EryR, repL, ColE1 ori, cytoplasmatische Expression


pTc::P(thlA)ckl_3020 thlA-Promotor, 5ŃheI, 3Ćfr9I, ckl_3020, Strep-tag II, AmpR, CmR/TmR, repL, ColE1 ori, cytoplasmatische Expression


pT::P(ptb)ckl_3020 ptb-Promotor, 5ŃheI, 3Ćfr9I, ckl_3020, Strep-tag II, AmpR, EryR, repL, ColE1 ori, cytoplasmatische Expression


pT::P(adc)ckl_3020 adc-Promotor, 5ŃheI, 3Ćfr9I, ckl_3020, Strep-tag II, AmpR, EryR, repL, ColE1 ori, cytoplasmatische Expression


pT::P(fac)ckl_3020 fac-Promotor, 5ŃheI, 3Ćfr9I, ckl_3020, Strep-tag II, AmpR, EryR, repL, ColE1 ori, cytoplasmatische Expression


pTc::P(thlA)abfD thlA-Promotor, 5ŃheI, 3Ćfr9I, abfD, Strep-tag II, AmpR, CmR/TmR, repL, ColE1 ori, cytoplasmatische Expression



Tab. 2.3: rekombinante Plasmide (Fortsetzung)

Plasmid Relevantes Merkmal Insert Herkunft

pT::P(ptb)abfD ptb-Promotor, 5ŃheI, 3Ćfr9I, abfD, Strep-tag II, AmpR, EryR, repL, ColE1 ori, cytoplasmatische Exp.


pT::P(adc)abfD adc-Promotor, 5ŃheI, 3Ćfr9I, abfD, Strep-tag II, AmpR, EryR, repL, ColE1 ori, cytoplasmatische Exp.


pT::P(fac)abfD fac-Promotor, 5ŃheI, 3Ćfr9I, abfD, Strep-tag II, AmpR, EryR, repL, ColE1 ori, cytoplasmatische Exp.


2.2 Oligonukleotide

Die in dieser Arbeit verwendeten Oligonukleotide sind in der Tabelle 2.4 aufgelistet.

Tab. 2.4: Oligonukleotide

Bezeichnung Sequenz (5´ 3´)* Verwendung

cbei_2100_fw_BamHI CCCCGGATCCATGCCATTAAAAACAAAGGAAC Klonierung

cbei_2100_rev_Cfr9I GGGGCCCGGGTTCTTTAATTCTAGCTATTTTCTTAGC cbei_2100

ckl_3020_fw_NheI_BamHI GGGGGGATCCGCTAGCATGTCTTTAATGACTGGGGA Klonierung

ckl_3020_rev_Cfr9I GGGGCCCGGGATCTTCTATTCTAGCTATCTTCTTTG ckl_3020

abfD_fw_NheI CCCCGCTAGCATGTTAATGACAGCAGAACAG Klonierung

abfD_rev_Cfr9I GGGGCCCGGGTTTAATTCCAGCGATTGCC abfD

pT_fw_SacI CCCCGAGCTCTGATAAATATGAACATGA Schnittstellen-

pT_rev_NheI_Cfr9I GGGGCCCGGGGCTAGCTCTAACTAACCTCCTTGATCC anpassung

Strep-tag_rev_KasI TTTTGGCGCCTTATTTTTCAAATTGAGGATGTGAC Klonierung Strep-tagII

Padc_fw_SacI GGGGGAGCTCTATTTATTTTTTGTATTGGAATTGTTTATAGT Klonierung

Padc_rev_NheI_BamHI TTTTGGATCCGCTAGCTTCATCCTTTAACATAAAAGTCAC adc-Promotor

Pptb_fw_SacI GGGGGAGCTCTATGAAGGATACAGTAAGCAGT Klonierung

Pptb_rev_NheI_BamHI AAAAGGATCCGCTAGCAATCACTGGTCGTACACT ptb-Promotor

Pfac_fw_SacI GGGGGAGCTCTCTTTAAATATAGATAAAGTTATAGAAGCAA Klonierung

Pfac_rev_NheI_BamHI TTTTGGATCCGCTAGCCATATGAAATACACCTCCTTAAAATT fac-Promotor

pT_seq_fw GGGATAAACTATGGAACTTATGAAA Sequenzierung

pT_seq_rev TGCAAGAATGTGAGAGCTAGAAA der 4hbd

pT_seq_fw_P GAGCCGATTTCAAAGATATTATCATG Sequenzierung

pT_seq_rev_P TGCAAGAATGTGAGAGCTAGAAA Promotoren * unterstrichene Basen symbolisieren entsprechende Restriktionsschnittstellen.


2.3 Nährmedien

Hitzestabile Nährlösungen und Medien wurden im Anschluss an die Herstellung für 20 min

bei 121 °C autoklaviert. Hitzelabile Lösungen wurden mittels Einwegfiltern (Porengröße

0,2 µm; Sarstedt) sterilfiltriert.

2.3.1 Nährmedium für E. coli

Zellen von E. coli wurden entweder in LB-Flüssigmedium oder auf LB-Agarplatten bei 37 °C

kultiviert. Medienzusätze wurden bei Bedarf zugegeben (2.3.3).

LB-Medium (Luria Bertani) (Sambrook und Russel, 2001)

Hefeextrakt 5,0 g

Trypton 10,0 g

NaCl 10,0 g

A. dest. ad 1000 ml

Zur Herstellung von LB-Festmedien wurden dem Medium vor dem Autoklavieren 1,5 % (w/v)

Agar-Agar zugegeben.

2.3.2 Medien für C. acetobutylicum

Anaerobe Nährmedien für die Anzucht von C. acetobutylicum wurden nach Vorschrift von

Breznak und Costilow (1994) hergestellt. Die Medien wurden in einer Mikrowelle zur

Entfernung des Luftsauerstoffs aufgekocht und unter kontinuierlicher Stickstoffbegasung

abgekühlt. Die Anaerobität der Medien konnte optisch anhand des Redoxindikators

Resazurin (0,0001 % [w/v]) überprüft werden. Die Kulturgefäße wurden im Anschluss

luftdicht verschlossen und autoklaviert. Etwaiger Restsauerstoff wurde durch die Zugabe von

Titan-(III)-Nitrilotriessigsäure (NTA) (2.3.3) vor Verwendung der Nährmedien reduziert.


CGM (clostridial growth medium) (Wiesenborn et al., 1988; mod.)

Glukose x H2O (50 %, [w/v])* 50,0 ml

Hefeextrakt 5,0 g

Asparagin 2,0 g

(NH4)2SO4 2,0 g

NaCl 1,0 g

KH2PO4 0,75 g

K2HPO4 0,75 g

MgSO4 x 7 H2O 0,71 g

MnSO4 x H2O 10,0 mg

FeSO4 x 7 H2O 10,0 mg

Resazurin (0,1 % [w/v]) 1,0 ml

A. dest. ad 1000 ml

* Nach dem Autoklavieren und vor dem Beimpfen wurde die Glukose aus einer sauerstofffreien, sterilen

Stammlösung (50 %, [w/v]) zugegeben.

MS-MES Medium (medium synthetique) (Monot et al., 1982; mod.)

Glukose x H2O 60,0 g

KH2PO4 0,55 g

K2HPO4 0,55 g

MgSO4 x 7 H2O 0,22 g

FeSO4 x 7 H2O 11,0 mg

Eisessig 2,3 ml

MES* 21,3 g

PABA (0,8 mg/l)** 10,0 ml

Biotin (0,08 mg/l)** 1,0 ml

Resazurin (0,1 % [w/v]) 1,0 ml

A. dest. ad 1000 ml

* Vor der Zugabe von MES wurde der pH-Wert mit NH4OH auf 6,6 eingestellt.

** Vor dem Autoklavieren wurde PABA aus einer 100-fachen und Biotin aus einer 1000-fachen sterilen

Stammlösung hinzugegeben.


Bei Verwendung verschiedener Kohlenstoffquellen (C-Quellen) wurde anstelle der Glukose

die entsprechende C-Quelle aus einer anaeroben, sterilfiltrierten Stammlösung (Mannose

50 % [w/v], Galaktose 50 % [w/v], Arabinose 50 % [w/v], Xylose 50 % [w/v]) zugegeben.

MMfvK (Minimalmedium für Vorkulturen) (Fischer et al., 2006)

Glukose (50 % [w/v])* 40,0 ml

CaCO3 1,0 g

K2HPO4 x 3 H2O 1,0 g

KH2PO4 1,0 g

MgSO4 x 7 H2O 0,1 g

(NH4)2SO4 2,0 g

NaCl** 10,0 mg

Na2MoO4 x 2 H2O** 10,0 mg

CaCl2 x 2 H2O* * 10,0 mg

MnSO4 x H2O* * 15,0 mg

FeSO4 x 7 H2O** 15,0 mg

PABA** 2,0 mg

Thiamin-HCl** 2,0 mg

Biotin** 0,1 mg

Resazurinlösung (0,1 % [w/v]) 1,0 ml

Na2S2O4 35,0 mg

A. dest. ad 1000 ml

* Nach dem Autoklavieren wurde die Glukose direkt vor dem Beimpfen des Mediums aus einer sauerstofffreien,

sterilen Stammlösung (50 % [w/v]) zugesetzt.

** Diese Komponenten wurden zusammen als 100-fache Stammlösung angesetzt, aliquotiert und bei -20 °C

gelagert.


RCA (reinforced clostridial agar)*

Glukose x H2O 5,0 g

Hefeextrakt 3,0 g

Trypton 10,0 g

NaCl 5,0 g

Fleischextrakt 10,0 g

Na-Acetat 3,0 g

Cystein-HCl 0,5 g

Stärke 1,0 g

Agar-Agar 15,0 g

A. dest. ad 1000 ml

* RCA wurde als kommerzielles Komplettmedium von der Firma Oxoid (Wesel) erworben. Der pH-Wert

entsprach ohne Einstellung 6,8.

2.3.3 Medienzusätze

Den Nährmedien wurden im Bedarfsfall nach dem Autoklavieren und Abkühlen auf etwa

50 °C bzw. direkt vor dem Animpfen nachstehende Medienzusätze (Tab. 2.5) beigefügt.

Tab. 2.5: Medienzusätze

Mediumzusatz Stammkonzentration Arbeitskonzentration

Ampicillin (Amp) 50 mg/ml in A. dest. (sterilfiltriert)* 100 µg/ml

Chloramphenicol (Cm) 34 mg/ml in Ethanol (96 % [v/v])** 25 µg/ml

Tetracyclin (Tc) 10 mg/ml in Ethanol (96 % [v/v])** 10 µg/ml

Erythromycin (Ery) 50 mg/ml in Ethanol (96 % [v/v])** 20 µg/ml

Thiamphenicol (Tm) 15 mg/ml in Ethanol (96 % [v/v])** 15 µg/ml

* Porengröße 0,2 µm (Sterilfilter, Schleicher & Schuell)

** in Ethanol gelöste Substanzen bedürfen keiner Sterilfiltration


Titan-(III)-NTA-Lösung

Die Herstellung der Titan-(III)-Nitrilotriessigsäure erfolgte wie bei Lehmann (2012 a)

beschrieben.

2.4 Stammhaltung

E. coli Zellen wurden vorübergehend auf LB-Agarplatten bis zu vier Wochen bei 4 °C gelagert.

Für eine dauerhafte Konservierung wurden 1 ml einer exponentiell wachsenden E. coli-

Kultur zu 0,5 ml LB-Glycerin-Lösung (Glycerin 60 % [v/v], LB-Medium 40 % [v/v]) gegeben,

gründlich durchmischt und anschließend bei -70 °C gelagert.

Zur Stammhaltung von C. acetobutylicum wurden zu 1-ml exponentiell wachsenden Zellen in

CGM (2.3.2) 0,5 ml CGM-Glycerin-Lösung (Glycerin 60 % [v/v], CGM 40 % [v/v]) zugegeben

und anschließend nach einer halbstündigen Inkubationszeit (37 °C, Anaerobenbox) bei -70 °C

konserviert.

Vitalitäts- und Reinheitskontrollen wurden durch erneutes Ausstreichen auf Antibiotika-

haltigen Agarplatten und mittels Mikroskopie durchgeführt.

2.5 Zellanzucht

2.5.1 Zellanzucht von E. coli

Die Anzucht der E. coli-Stämme (Tab. 2.1) erfolgte unter aeroben Bedingungen in LB-

Flüssigkulturen unter Schütteln (180 Upm) bzw. auf LB-Festmedien (2.3.1) im Brutschrank

bei 37 °C unter Verwendung entsprechender Medienzusätze (2.3.3).

2.5.2 Zellanzucht von C. acetobutylicum

C. acetobutylicum Stämme wurden zum einen auf RCA-Festmedien und zum anderen in

Flüssigmedien (CGM und MS-MES) (2.3.2) kultiviert.


2.5.2.1 Zellanzucht von C. acetobutylicum auf Festmedium

Für die Anzucht auf Festmedien wurden die aerob angefertigten Platten zur Minimierung

des Sauerstoffgehaltes mindestens 24 h vor Verwendung in eine Anaeroben-Werkbank

(MACS-MG-1000-anaerobic work station, Meintrup DWS, Lähden-Holte) eingeschleust. Die

anschließende Kultivierung von C. acetobutylicum erfolgte ebenda bei 37 °C unter

Stickstoffatmosphäre. Zur Reduktion von eingetragenem Sauerstoff wurden maximal 5 %

[v/v] Wasserstoff zugegeben.

2.5.2.2 Zellanzucht von C. acetobutylicum in statischer Kultur

Die Kultivierung von C. acetobutylicum in statischer Kultur (Batch-Kultur) erfolgte anaerob

unter einer abgeschlossenen N2-Atmosphäre bei 37 °C in Hungate-Röhrchen (Ochs GmbH)

oder in Müller&Krempel-Serumflaschen (Müller & Krempel AG). Batch-Kulturen (10 ml)

wurden mit 0,1 Vol. einer MS-MES Sporensuspension bzw. mit 1 ml einer CGM-Glycerin-

Stammkultur (2.4) inokuliert. Im Falle einer Sporensuspension wurde die Sporenkeimung

durch Pasteurisierung (80 °C, 10 min) induziert. Anschließend erfolgte die Inkubation bei

37 °C. Vorkulturen dienten in der Regel der Anzucht von Batch-Hauptkulturen in

Müller&Krempel-Serumflaschen mit unterschiedlichen Volumina (50 - 500 ml), die aufgrund

der Gasentwicklung und des damit einhergehenden Druckanstieges nur bis maximal 60 %

des Fassungsvermögens befüllt wurden. Die Anzucht von Vorkulturen erfolgte in

Komplexmedium (CGM; 2.3.2). Wachstumsversuche wurden stets in 200-ml MS-MES

durchgeführt. Im Falle eines Medienwechsels war eine weitere Vorkultur in MS-MES

Medium notwendig. Hierfür wurden 0,1 Vol. der CGM-Vorkultur in 10-ml-MS-MES-

Vorkulturen überimpft, die bei Bedarf mit verschiedenen C-Quellen (Mannose, Galaktose,

Arabinose und Xylose) versetzt wurden. Hauptkulturen wurden in der Regel mit einer

optischen Dichte (OD600) von 0,1 inokuliert.

2.5.2.3 pH-kontrollierte Batch-Fermentation

Für höhere Kulturvolumina wurde ein pH-regulierter „BIOSTAT B“ Chemostat (BBI,

Melsungen) mit einem Arbeitsvolumen von 1,5 l eingesetzt. Die Steuereinheit ermöglichte

eine konstante Temperatur von 37 °C und eine Regulation des pH-Wertes durch die Zufuhr


von 2 M KOH. Das Kulturgefäß wurde mit 1,3 l MS-MES bzw. MMfvK (2.3.2) gefüllt,

autoklaviert und während des Abkühlens mit N2 durchgast. Vor dem Beimpfen der

Hauptkultur wurde zur Reduzierung des Restsauerstoffs 0,5 ml Titan-(III)-NTA-Lösung (2.3.3)

zugegeben. CGM-Vorkulturen (2.5.2.2) dienten der Inokulation von 10 ml-Vorkulturen (MS-

MES bzw. MMfvK), die nach einer Inkubation von 12 h bei 37 °C für die Inokulation von

200 ml Kulturmedium eingesetzt wurden. Die Hauptkultur wurde über einen sterilen

Beimpfungsschlauch mit einer gut gasenden, exponentiell wachsenden 200-ml-Vorkultur

inokuliert. Die Anwachsphase der Kultur erfolgte bei einer pH-Wertkontrolle von 5,2 und

einer Durchmischung bei 50 Upm. Nach Erreichen einer OD600 von ca. 1,0 wurde die

Durchgasung mit N2 eingestellt und die Rührgeschwindigkeit erhöht (200 Upm). Bei einer

OD600 von ca. 2,0 wurde die pH-Wertkontrolle auf 4,7 gesetzt, um die Lösungsmittelphase

einzuleiten (Fontaine et al., 2002).

2.6 Bestimmung physiologischer Parameter

2.6.1. Optische Dichte

Das Wachstum der Batchkulturen wurde photometrisch bei einer Wellenlänge von 600 nm

in einem Spektralphotometer (Photometer WPA Biowave II, Biochrom, Cambridge) gegen

A.dest. in einer Plastikküvette mit 1 cm Schichtdicke ermittelt. Bei einer Extinktion über 0,3

erfolgte die Verdünnung der Zellsuspension mit A. dest.

2.6.2 Bestimmung der Wachstumsrate und Verdopplungszeit

Die Wachstumsrate µ gibt die masseabhängige Verdopplung pro Stunde an und lässt sich mit

folgender Formel berechnen (Formel 2.1). Über die Wachstumsrate kann weiterhin die

Verdopplungszeit td bestimmen werden (Formel 2.2), welche das Zeitintervall der

Zellmasseverdopplung pro Stunde angibt (Madigan et al., 2013).

µ =𝑙𝑛𝑥2−𝑙𝑛𝑥1

(𝑡2−𝑡1)

Formel 2.1: Berechnung der spezifischen Wachstumsrate (µ). x1/x2, Messwerte der optischen

Dichte während des exponentiellen Wachstums zu den Zeitpunkten t1 und t2.


𝑡𝑑 =𝑙𝑛2

µ

Formel 2.2: Berechnung der Verdopplungszeit (td). µ, spezifische Wachstumsrate

2.6.3 Bestimmung des externen pH-Wertes

Die Veränderung des externen pH-Wertes in Batch-Kulturen wurde in zellfreien Überständen

nach Sedimentation (13000 Upm, 4 °C, 5 min) mit Hilfe eines pH-Meters (pH-Meter

SevenEasy) verfolgt.

2.6.4 Optisch-enzymatische Glukosebestimmung

Zur Bestimmung des Glukoseverbrauchs während des Wachstums von C. acetobutylicum

diente ein optisch-enzymatischer Test (Bergmeyer, 1983, mod.). Dabei wird D-Glukose in

einer ersten Reaktion durch die Hexokinase [EC 2.7.1.1] unter ATP-Verbrauch zu Glukose-6-

Phosphat und ADP umgewandelt. Anschließend erfolgt die Umwandlung von Glukose-6-

Phosphat unter NADP+-Verbrauch durch die Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase

[EC 1.1.1.49] zu 6-Phospho-D-Glukonat und NADPH+H+. Die gebildete NADPH-Menge ist

dabei direkt proportional zur Glukosemenge und kann photometrisch durch Bestimmung der

Extinktionsänderung bei einer Wellenlänge von 340 nm (WPA Biowave II) gemessen werden.

Die Berechnung der Glukosekonzentration erfolgte anschließend mit der Formel 2.3.

cGlukose = ∆E ∗ V ∗ MWGlukose

ɛ ∗ 𝑑 ∗ 𝜈∗ VF [

g

l]

Formel 2.3: Berechnung der Glukosekonzentration. c, Konzentration; ∆E, Extinktionsänderung; V,

Gesamtvolumen des Ansatzes (ml); MW, Molekulargewicht (180,16 g/mol); ɛ, Extinktionskoeffizient

von NADPH bei 340 nm (6,3 l * mmol-1 * cm-1); d, Schichtdicke der Küvette (1 cm); v, Probenvolumen.

Für die Bestimmung der Glukosekonzentration wurde folgender Reaktionsansatz in einer

Halbmikroliterplastikküvette durchgeführt:

0,2 M Tris-HCl + 0,002 M MgSO4 (pH 7,6) 900 µl

NADP+ (44 mg/ml) 10 µl

ATP (96 mg/ml) 10 µl

Probe (zellfreier Überstand) 10 µl


Nach dem Mischen des Ansatzes wurde die Extinktion des Leerwertes (E1) bei 340 nm

gemessen. Durch Zugabe von 10 µl des Hexokinase/Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase

Enzymgemisches (3 mg/ml, Roche) wurde die zuvor beschriebene Reaktion eingeleitet. Der

Reaktionsansatz wurde erneut gemischt und für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Es

folgte die erneute Messung der Extinktion der Probe (E2) bei 340 nm.

2.6.5 Optisch-enzymatische Laktatbestimmung

Die Bestimmung des während des Wachstums produzierten Laktats wurde in einem optisch-

enzymatischen Test mit Hilfe des „D-/L-Laktat“-Kits von Megazyme (Megazyme

International, Irland) durchgeführt. Die Quantifizierung des Laktats erforderte zwei

Enzymreaktionen. Während der ersten Reaktion wird das D- bzw. L-Laktat in Anwesenheit

von NAD+ zu Pyruvat über die D-Laktatdehydrogenase (D-LDH) [EC 1.1.1.27] bzw. L-

Laktatdehydrogenase (L-LDH) [EC 1.1.1.27] oxidiert. In einer zweiten Reaktion, die der

Rückreaktion zum D-/L-Laktat entgegenwirkt, wird das gebildete Pyruvat über die D-

Glutamat-Pyruvat-Transaminase (D-GPT) [EC 2.6.1.2] zu D-Alanin und 2-Oxoglutarat

umgewandelt. Dabei ist die Menge des gebildeten NADH aus der ersten Reaktion

stöchiometrisch zu der Laktatmenge. Die Bestimmung der Laktatkonzentration erfolgte

photometrisch in einer Halbmikroliter-Plastikküvette bei einer Wellenlänge von 340 nm. Für

die Berechnung der Konzentration wurde die Formel 2.4 verwendet.

cLaktat = V ∗ MWLaktat

ɛ ∗ 𝑑 ∗ 𝜈∗ ∆E [

g

l]

Formel 2.4: Berechnung der Gesamtlaktatkonzentration. c, Konzentration; V, Gesamtvolumen des

Ansatzes (ml); MW, Molekulargewicht von Laktat (90,1 g/mol); ɛ, Extinktionskoeffizient von NADH

bei 340 nm (6,3 l * mmol-1 * cm-1); d, Schichtdicke der Küvette (1 cm); v, Probenvolumen (ml); ∆E,

Extinktionsänderung.

Der Reaktionsansatz umfasste 750 µl A. dest., 250 µl Glycylglycin-Puffer, 50 µl NAD+-Lösung

und 10 µl D-GPT. Anschließend wurden 50 µl der zu untersuchenden Probe, nach zu voriger

Sedimentation (13000 Upm, 4 °C, 10 min), dem Ansatz zugeführt, gründlich durchmischt und

die Extinktion des Blindwertes gegen A. dest. und der Leerwerte bei 340 nm gemessen. Die

zuvor beschriebenen Reaktionen wurden durch Zugabe von jeweils 10 µl D-LDH und L-LDH


gestartet. Nach 10 minütiger Inkubation der Reaktionsansätze bei RT wurde erneut die

Extinktion gemessen.

2.6.6 Gaschromatografie

2.6.6.1 Gaschromatografische Analyse der Gärungsprodukte von C. acetobutylicum

Die Analyse und Quantifizierung der Gärungsprodukte Acetat, Butyrat, Aceton, Butanol und

Ethanol erfolgte mit einem Agilent 7890A Gaschromatographen (Agilent Technologies,

Böblingen) unter Verwendung eines Flammenionisationsdetektors (FID). Als Trägergas

wurde über Feuchtigkeits- und Sauerstofffilter gereinigtes N2 eingesetzt, welches der

Zurückhaltung von Wasser, Sauerstoff und schwefeligen und chlorierten Substanzen diente.

Die FID-Brenngase, synthetische Luft und Wasserstoff, wurden zur Entfernung von

organischen Substanzen über einen Aktivkohlefilter geführt. Für die Analyse von Alkoholen

und Carbonsäuren wurde eine mit Porapak P (80-100 mesh) gepackte Säule eingesetzt.

Nach Sedimentation der zu analysierenden Zellsuspension bei 13000 Upm und 4 °C für

10 min wurde der zellfreie Überstand in ein steriles 1,5-ml Eppendorfreaktionsgefäß

überführt und bis zur Verwendung bei -20 °C eingefroren. Für die Bestimmung des

Produktspektrums wurden 100 µl des zellfreien Überstandes zu 900 µl destilliertem Wasser

und 100 µl internem Standard (IS; 55 mM Isobutanol in 2 M HCl und 0,5 M Acetoin) in ein

Rollrandgefäß gegeben. Anschließend wurden die Rollrandgefäße mittels Bördelkappen

gasdicht verschlossen. Über einen automatisierten Probengeber wurden 0,5 µl der Probe zur

Analyse in das System injiziert.

Die Quantifizierung der Gärungsprodukte erfolgte über eine Eichlösung bestehend aus 5 mM

der zu analysierenden Produkte einschließlich des internen Standards, woraus ein

Eichchromatogramm erstellt werden konnte. Über das Programm EZChrom Elite (Agilent

Tehnologies, Böblingen) erfolgte sowohl die Steuerung des Gaschromatographen und des

Probengebers als auch die Auswertung der Signale.

Die Analysebedingungen für die Detektion der Substanzen Acetat, Butyrat, Aceton, Butanol

und Ethanol sind nachfolgend dargestellt.


Chromatografiesäule: INNOSteel-GC-Säule (2 m x 1/8“AD x 2 mm, Porapak P

80/100 mesh)

Säulentemperatur: 155-197 °C; 9 °C/min

Trägergas: N2 (30 ml/min)

Injektortemperatur: 195 °C

Detektor: FID; 230 °C

2.6.6.2 Gaschromatografische Analyse von 1,4-Butandiol und γ-Hydroxybutyrat

Die Analyse und Quantifizierung von 1,4-BDO und GHB erfolgte mit einem

Gaschromatographen mit massenselektivem Detektor (GC/MS) bestehend aus einem Agilent

GC 6890 Gaschromatographen (Agilent Technologies, Böblingen) und einem

massenselektiven Detektor (MSD 593). Als Trägergas diente Helium.

Die zu analysierenden Zellsuspensionen wurden bei 13000 Upm und 4 °C für 10 min

sedimentiert und der zellfreie Überstand in ein steriles 1,5-ml Eppendorfreaktionsgefäß

überführt. Bis zur Weiterverwendung wurden die Proben bei -20 °C gelagert. Für die Analyse

der 1,4-BDO- und GHB-Konzentration wurden 50 µl des Silylierungsreagenz N-Methyl-N-tert-

butyldimethylsilyl-tifluoracetamid (MBDSTFA, Macherey und Nagel, Düren) in ein

Rollrandgefäß mit Insert vorgelegt. Anschließend wurden je 1 µl der internen Standards (8-

fach deuteriertes 1,4-BDO [100 µg/ml] und 6-fach deuteriertes GHB [100 µg/ml]) und 1 µl

der Probe zugegeben, gut vermischt und das Probengefäß luftdicht verschlossen. Zur

Beschleunigung der Silylierung der Proben und der internen Standards mit MBDSTFA folgte

eine Inkubation des Reaktionsansatzes bei 80 °C für 20 min. Im Anschluss daran wurde 1 µl

des Reaktionsansatzes über einen automatisierten Probengeber (Autosampler 7683) in das

System injiziert.

Für die Quantifizierung von 1,4-BDO und GHB wurde eine isotopenverdünnte

Nachweismethode mit dem „Selected Ion Mode“ (SIM) angewandt. Die SIM-Ionen für 1,4-

BDO/ 1,4-BDO-d8 und GHB/ GHB-d6 sind 219/221 bzw. 317/323. Die Analysebedingungen

von 1,4-BDO und GHB sind nachfolgend dargestellt.


Chromatografiesäule: VF-5ms (25 m x 0,2 mm; 0,33 µm)

Säulentemperatur: Initial 80 °C (3 min halten), + 20 °C/min bis 150 °C,

+ 10 °C/min bis 300 °C (8,5 min halten)

Trägergas: Helium (0,9 ml/min)

Injektionsmodus: splitless

Injektortemperatur: 290 °C

Detektor: MSD

2.7 Visualisierung von 1,4-Butandiol

Für einen schnellen, präzisen und kostengünstigen Nachweis von 1,4-Butandiolproduzenten

wurde eine auf Dünnschichtchromatografie-basierte Methode evaluiert. Als stationäre

Phase diente eine ALUGRAM SIL G DC-Fertigfolie (Macherey-Nagel, Düren) mit Kieselgel

(Schichtdicke 0,2 mm) als Sorptionsmittel. Diese wurde zur Aktivierung bei 90 °C für 30 min

erhitzt und nach dem Abkühlen mit den Proben beladen. Hierfür wurde der zellfreie

Überstand von C. acetobutylicum bzw. 1,4-BDO (Sigma Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen)

ca. 1 cm vom unteren Rand tropfenweise aufgetragen. Nach Lufttrocknung der Proben

wurde die beladene Kieselgelplatte aufrecht in eine mit Fließmittel enthaltene Trennkammer

überführt. Dabei galt es zu beachten, dass die Probenfront oberhalb des Fließmittels lag. Als

mobile Phase wurde ein Gemisch aus Chloroform und Methanol im Verhältnis 80:20

gewählt. Damit eine mit dem Fließmittel gesättigte Atmosphäre entstand, wurde die

Trennkammer geschlossen. Durch Kapillarkräfte stieg das Fließmittel vom unteren zum

oberen DC-Plattenrand und transportierte so die aufgetragenen Proben mit. Sobald die

Lauffront annähernd den oberen Rand der Platte erreichte, wurde die Platte aus der

Trennkammer entnommen und an der Luft getrocknet. Es folgte das Besprühen der DC-

Platte mit einer Vanillin-Färbelösung. Hierfür wurde in 98 ml Ethanol (96 %, reinst) 2 ml

konzentrierte Schwefelsäure gelöst und mit 1 g Vanillin versetzt. Die Entwicklung der Spots

erfolgte bei 100 °C bis eine Farbreaktion zu beobachten war. Anschließend konnten die

Platte der Kammer entnommen und fotodokumentiert werden.


2.8 Arbeiten mit Nukleinsäuren

Zur Vermeidung von Verunreinigungen bei Arbeiten mit Nukleinsäuren wurden alle

hitzestabilen Lösungen und Materialien bei 121 °C für 20 min autoklaviert. Hitzelabile

Lösungen hingegen wurden sterilfiltriert (Porengröße 0,2 µm, Sarstedt).

2.8.1 Isolierung von Nukleinsäuren

2.8.1.1 Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli

Die Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli erfolgte nach den Prinzipien der alkalischen Lyse

von Birnboim und Doly (1979). In der Regel wurden 5 ml einer Übernachtkultur (2.5.1) für

die Plasmid-Isolierung eingesetzt und nach folgender Prozedur behandelt.

1. Sedimentation der Zellen durch Zentrifugation (13000 Upm, 4 °C, 2 min)

2. Suspendieren des Zellpellets mit 300 µl Puffer P1

3. Zugabe von 300 µl Puffer P2, vorsichtiges Schwenken und Inkubation für 5 min bei RT

4. Zugabe von 300 µl Puffer P3, vorsichtiges Schwenken und Inkubation für 5 min bei RT

5. Zentrifugation für 20 min bei 13000 Upm und 4 °C

6. Überführung des Überstandes in ein neues 1,5-ml Eppendorfreaktionsgefäß


8. Überführung des Überstandes in ein neues 1,5-ml Reaktionsgefäß unter Zugabe von 0,8 Vol. Isopropanol


10 . Überstand verwerfen und Waschen des Pellets mit 500 µl eiskaltem Ethanol (70 % [v/v], reinst]


12. Dekantieren des Überstandes, Trocknung des Pellets und Aufnahme in 15 µl A. dest.

Die Qualität der isolierten Plasmid-DNA wurde in einem 0,8 %igen Agarosegel (2.8.4)

überprüft.

Puffer P1

50 mM Tris-HCl (pH 8,0) 10 ml (1 M Stammlösung)

10 mM EDTA (pH 8,0) 4 ml (0,5 M Stammlösung)

100 µg/ml RNaseA 2 ml (10 mg/ml Stammlösung)

A. dest. ad 200 ml

Die Zugabe der RNaseA erfolgte nach dem Autoklavieren. Der Puffer wurde bei 4 °C gelagert.


Puffer P2

1 % [w/v] SDS 10 ml (10 % Stammlösung)

200 mM NaOH 2 ml (1 M Stammlösung)

A. dest. ad 100 ml

Der Puffer wurde nicht autoklaviert. Die Lagerung erfolgte bei RT.

Puffer P3

Kaliumacetat 58,88 g

A. dest. ad 100 ml

Der pH-Wert wurde mit Eisessig auf 5,5 eingestellt. Anschließend wurde der Puffer

autoklaviert.

2.8.1.2 Isolierung chromosomaler DNA aus Clostridien

Zur Isolierung von chromosomaler DNA aus C. acetobutylicum, C. beijerinckii und C. kluyveri

wurden jeweils 50 ml CGM (2.3.2) mit 0,1 Vol. einer entsprechenden Vorkultur inokuliert

und bis zu einer OD600 von 1,0 bei 37 °C inkubiert. Im Anschluss folgte die Sedimentation der

Zellen (5000 Upm, 10 min, 4 °C), das Waschen der Zellpellets mit 10 ml Waschpuffer und die

Überführung in 2-ml-Eppendorfreaktionsgefäße. Bis zur Weiterverwendung wurden die

Zellen bei -20 °C gelagert. Die Isolierung der chromosomalen DNA erfolgte nach der

Methode von Bertram (1989):

1. Resuspension der gefrorenen Zellpellets in 1 ml Waschpuffer

2. Zentrifugation bei 6000 g und 4 °C für 5 min

3. Suspendieren des Zellpellets in 1 ml Lysispuffer

4. Zugabe von 100 µl Lysozymlösung (200 mg/ml) und 5 µl RNase-A-Lösung (10 mg/ml)

5. Ansatz schwenken und Inkubation für 30 min bei 37 °C

6. Zugabe von 30 µl SDS-Lösung (20 % [w/v]) und 30 µl Proteinase K (20 mg/ml)

7. Inkubation des Ansatzes für 30-60 min bei 37 °C

8. Zugabe von 1 Vol. Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol (PCI, 25:24:1 [v/v])

9. Zentrifugation bei 8000 Upm, 4 °C für 10 min

10. Überführung der oberen, wässrigen Phase in ein neues Eppendorfreaktionsgefäß

11. Zweimalige Wiederholung der Schritte 8-10


12. Extraktion mit 1 Vol. Chloroform-Isoamylalkohol (24:1 [v/v]) zur Phenolentfernung


14. Abnehmen der oberen, wässrigen Phase und Fällung der DNA mit 0,1 Vol. 3 M Na-

Acetat (pH 5,2) und 2,5 Vol. Ethanol (96 % [v/v], reinst)

15. Inkubation für 5 min bei RT


17. Dekantieren des Überstandes und Trocknung des Pellets

18. Aufnahme des Pellets in 60 µl TE-Puffer

19. Zugabe von 30 µl RNase-A-Lösung (10 mg/ml)

20. Inkubation für 15 min bei 37 °C

21. Zugabe von 30 µl Proteinase K (20 mg/ml)

22. Inkubation über Nacht bei 37 °C

23. Erhöhung des Volumens mit A. dest. auf 400 µl

24. Zugabe von 60 µl 3 M Na-Acetat (pH 5,2)

25. Extraktion mit 1 Vol. Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol (Schritte 8-10)

26. Extraktion mit 1 Vol. Chloroform-Isoamylalkohol (Schritte 12 und 13)

27. Fällung der DNA mit 1 Vol. 3 M Na-Acetat (pH 5,2) und 2,5 Vol. Ethanol (96 % [v/v],

reinst)


29. Zweimaliges Waschen des Pellets mit eiskaltem Ethanol (70 % [v/v], reinst)


31. Trocknung und Aufnahme des Pellets in 50 µl TE-Puffer bzw. A. dest.

Die Qualität der DNA wurde anschließend in einem 0,8 % igen Agarosegel (2.8.4) überprüft.

Waschpuffer Lysispuffer

EDTA (0,5 M; pH 8,0) 40 ml NaCl (5 M) 4 ml

Tris-HCl (1 M) 10 ml EDTA (0,5 M; pH 8,0) 20 ml

KCl (1 M) 25 ml A. dest. ad 200 ml

A. dest. ad 200 ml Der pH wurde mit HCl auf 7,5 eingestellt.


RNase-A-Lösung Lysozym-Lösung

RNase-A 10 mg Lysozym 200 mg

Tris-HCl (1 M; pH 8,0) 0,1 ml A. dest. ad 1 ml

NaCl 9 mg

A. dest. ad 1 ml

Der pH wurde mit HCl auf 7,5 eingestellt.

1 ml Aliquots wurden bei -20 °C gelagert.

Proteinase K TE-Puffer

Protinase K 20 mg EDTA (0,5 M; pH 8,0) 1 ml

A. dest. ad 1 ml Tris-HCl (1 M; pH 8,0) 0,2 ml

Aliquots zu je 30 µl wurden bei -20 °C gelagert. Der pH wurde mit HCl auf 8,0 eingestellt.

2.8.2 PCR-Techniken

Zur Erzeugung von DNA-Fragmenten, die für weitere Klonierungsschritte (2.8.3) benötigt

wurden und zur Verifikation positiver Klone wurde die Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

eingesetzt. Die Amplifikation fand in Thermocyclern mit Deckelbeheizung (PCR-Cycler,

Biometra) statt. Standard-PCR-Analysen wurden mit der Pwo DNA-Polymerase (2,5 U/µl)

(Genaxxon biosciene GmbH, Ulm) durchgeführt.

2.8.2.1 Oligonukleotid-Design

Zur Amplifizierung von DNA-Fragmenten wurden spezifisch an die entsprechenden

Zielsequenzen angepasste Oligonukleotide (Tab. 2.4) abgeleitet. Darüberhinaus wurden die

Oligonukleotide derart konstruiert, dass die Amplifikate am 5´- und 3´-Ende über

entsprechende Restriktionsschnittstellen für eine spätere Klonierung verfügten. Zur

Berechnung der Schmelztemperaturen und zur Überprüfung der Ausbildung von Homo- und

Heterodimeren der Oligonukleotide wurden diese mit dem Oligo-Analyzer von IDT

(http://eu.idtdna.com/calc/analyzer) überprüft. Bei Oligonukleotid-Paaren wurde darauf

geachtet, dass sich die Schmelztemperaturen nicht mehr als 3 °C unterschieden.


2.8.2.2 Standard-PCR

Ein Standard-PCR Reaktionsansatz setzte sich wie folgt zusammen:

Template DNA 10-100 ng

dNTPs (10 mM) 1 µl

Fw-Primer (10 µM) 1 µl

Rev-Primer (10 µM) 1 µl

10 x Pwo PCR-Puffer (komplett) 5 µl

Pwo DNA-Polymerase (2,5 U/µl) 1 µl

A. dest. ad 50 µl

Nachfolgendes PCR-Programm wurde durchgeführt:

Denaturierung 94 °C 2 min 1x

Denaturierung 94 °C 30 s

Annealing Tm(Primer)-3 °C 30 s 30x

Elongation 72 °C 1 min/kBp

Elongation 72 °C 5 min 1x

Lagerung 4 °C ∞ unendlich

2.8.2.3 „Colony“-PCR

Zur Verifikation von positiven C. acetobutylicum-Klonen wurden entsprechende

Einzelkolonien mit einer sterilen Impföse von RCA-Platten entnommen und in 25 µl sterilem

A. dest. resuspendiert, bei 99 °C für 10 min aufgekocht und die Zelltrümmer sedimentiert

(13000 Upm, 1 min, 4 °C). Anschließend konnte 1 µl des zellfreien Überstands für einen

25 µl-Standard-PCR-Reaktionsansatz (2.8.2.2) eingesetzt werden.

2.8.3 Enzymatische Modifikation von DNA

2.8.3.1 Restriktion von DNA

Zur Erzeugung von DNA-Fragmenten mit definierten Enden wurde die DNA mit

nachfolgenden Restriktionsendonukleasen (Tab. 2.6) behandelt. Die erzeugten linearen

DNA-Fragmente wurden zum einen für eine Agarosegelelektrophorese (2.8.4) und zum


anderen für Ligationsreaktionen (2.8.3.3) eingesetzt. Die Verwendung der empfohlenen

Puffer und Inkubationszeiten erfolgte nach Herstellerangaben (Thermo Scientific,

Braunschweig). Das Mindestvolumen des Restriktionsansatzes für den Verdau von 1 µg DNA

betrug 10 µl.

Tab. 2.6: Restriktionsendonukleasen

Restriktionsendonuklease Erkennungssequenz1 Puffersystem

BamHI 5'-G˄GATCC-3' 3'-CCTAG˅G-5'

1x BamHI-Puffer, 1x TangoTM

Cfr9I (XmaI) 5'-C˄CCGGG-3' 3'-GGGCC˅C-5'

1x Cfr9I-Puffer, 1x TangoTM

NheI 5'-G˄CTAGC-3' 3'-CGATC˅G-5'

1x TangoTM

KasI (SspDI) 5'-G˄GCGCC-3' 3'-CCGCG˅G-5'

1x TangoTM

SacI 5'-GAGCT˄C-3'

3'-C˅TCGAG-5' 1x SacI-Puffer, 1x TangoTM

SatI (Fnu4HI) 5'-GC˄NGC-3'

3'-CGN˅CG-5' 1x Puffer G, 1x TangoTM

1 N = A, T, C oder G; ˄˅ Restriktionsschnittstellen

2.8.3.2 Dephosphorylierung von DNA-Fragmenten

Zur Verminderung der Selbstligation enzymatisch hydrolysierter Vektor-DNA wurde diese

mit einer alkalischen Phosphatase (FastAP, Thermo Scientific, Braunschweig) behandelt, was

zu einer Dephosphorylierung der freien 5´-Ende führte. Hierfür wurden 2 U FastAP (1 U/µl)

zu dem Restriktionsansatz gegeben und für 20 min bei 37 °C inkubiert. Im Anschluss daran

wurde die Phosphatase hitzeinaktiviert (75 °C, 5 min) und die DNA mittels „Plasmid PLUS

DNA Purification Mini Prep Kit“ (Genaxxon BioScience GmbH, Ulm) aufgereinigt (2.8.5.2).

2.8.3.3 Ligation von DNA-Fragmenten

Die Ligation von DNA-Fragmenten erfolgte unter Verwendung der T4-DNA-Ligase (1 U/µl)

(Thermo Scientific, Braunschweig) in einem 20 µl-Standardvolumen mit 1x T4-Ligase-Puffer

bei 22 °C für 1 h oder bei 16 °C über Nacht. Für eine optimale Ligationseffizienz wurde ein

molares Verhältnis von Vektor zu Insert von 1:3 gewählt. Der Ligationsansatz konnte

anschließend für die Transformation in CaCl2-kompetente E. coli-Zellen verwendet werden.


2.8.3.4 in vivo Methylierung von Plasmid-DNA

Für eine Transformation von Plasmid-DNA in C. acetobutylicum müssen die Plasmide zuvor

spezifisch methyliert werden, da diese andernfalls als Fremd-DNA erkannt und abgebaut

werden. Hierfür wurden die entsprechenden Plasmide in E. coli ER2275 pANII transformiert

(2.9.1.2). Dieser Stamm verfügt über eine auf dem Plasmid pANII kodierte Methyltransferase

Φ3T I (B. subtilis Phage), die das gleiche Methylierungsmuster wie C. acetobutylicum

(Cac824I) aufweist (Mermelstein et al., 1992). Die Plasmide wurden erneut isoliert (2.8.1.1),

auf Methylierung mittels Restriktionsverdau mit SatI kontrolliert (2.8.3.1) und anschließend

für die Transformation in C. acetobutylicum (2.9.2.1) eingesetzt.

2.8.4 Agarosegelelektrophorese (Sambrook und Russell, 2001)

Zur qualitativen und quantitativen Beurteilung der DNA diente die horizontale

Agarosegelelektrophorese. Dabei variierten in Abhängigkeit von den DNA-Fragmenten die

Agarosekonzentrationen von 0,8 - 2,0 % (w/v) in 1x TAE-Puffer. Zum Beschweren der Proben

und um eine Markierung der Lauffront zu gewährleisten, wurden die Ansätze mit 0,2 Vol. 6x

Loading Dye versetzt. Weiterhin wurden zur Größenabschätzung linearisierter DNA die

Längenstandards GeneRulerTM 1 kb Ladder bzw. MassRulerTM DNA Ladder Mix (Thermo

Scientific, Braunschweig) mitgeführt. Letzterer ermöglichte zudem eine

Konzentrationsabschätzung der DNA. Die Auftrennung der DNA-Fragmente erfolgte in 1x

TAE-Laufpuffer bei einer konstanten Spannung von 90 V (Power Pack P 25; Biometra,

Göttingen) für ca. 45 min. Zur Visualisierung der DNA kamen zwei Techniken zum Einsatz:

einerseits wurden die Gele in einem Ethidiumbromidbad (1 µg/ml in A. dest.) für 15-30 min

inkubiert und anschließend die Nukleinsäuren mit einer Photodokumentationsanlage

(Gelprint 2000; MWG-Biotech, Ebersberg) bei einer Wellenlänge von 254 nm visualisiert und

dokumentiert; andererseits konnten die Nukleinsäuren durch die Anwendung des

Farbstoffes „GelRed“ (Genaxxon BioScience GmbH, Ulm) im Loading Dye direkt bei einer

Wellenlänge von 312 nm mittels einer Photodokumentationsanlage (DarkHood DH-50;

Biostep GmbH, Barkhardtsdorf) sichtbar gemacht und dokumentiert werden.


50x TAE-Puffer

Tris 242 g

Eisessig (konz.) 57 ml

EDTA (0,5 M, pH 8,0) 100 ml

A. dest. ad 1000 ml

Der pH-Wert wurde mit 0,1 M HCl auf 7,5 eingestellt.

2.8.5 Reinigung von Nukleinsäuren

2.8.5.1 Extraktion von DNA aus Agarosegelen

Für die Extraktion von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen wurde das „Gel extraction Mini

Prep Kit“ (Genaxxon BioScience GmbH, Ulm) verwendet. Die gewünschten DNA-Banden

wurden nach gelelektrophoretischer Auftrennung (2.8.4) unter UV-Licht mit einem Skalpell

ausgeschnitten und nach Herstellerangaben unter Verwendung der entsprechenden Puffer

behandelt. Es folgte die Qualitätsüberprüfung der DNA in einem 0,8 %igem Agarosegel

(2.8.4).

2.8.5.2 Kit-basierte DNA-Aufreinigung

Die Aufreinigung von DNA-Fragmenten aus einem PCR-Ansatz oder nach einem

Restriktionsverdau erfolgte mit dem „Plasmid PLUS DNA Purification Mini Prep Kit“

(Genaxxon BioScience GmbH, Ulm) gemäß den Herstellervorgaben.

2.9 Erzeugung rekombinanter Organismen

2.9.1 DNA-Transfer in E. coli

2.9.1.1 CaCl2-vermittelte Transformation in E. coli

Für die CaCl2-vermittelte Transformation von Vektor-DNA in E. coli-Zellen (Tab. 2.1) wurden

10 µl eines Ligationsansatzes (2.8.3.3) zu 50 µl auf Eis aufgetauter, kompetenter Zellen

gegeben und für 30 min auf Eis inkubiert. Es folgte ein Hitzeschock für 90 s bei 42 °C, eine

anschließende Inkubation für 2 min auf Eis und die Zugabe von 500 µl LB-Medium (2.3.1).

Die Regenerierung der Zellen erfolgte für 1 h bei 37 °C unter Schütteln (180 rpm).


Abschließend wurden je 50 µl, 100 µl und 150 µl des Transformationsansatzes zur Selektion

auf Antibiotika-haltigen LB-Agarplatten ausplattiert und über Nacht bei 37 °C inkubiert.

2.9.1.2 Transformation von E. coli durch Elektroporation

Die Elektroporation von E. coli Zellen (Tab. 2.1) erfolgte nach der Methode von Dower et al.

(1988) unter Verwendung eines GenePulserIITM (Bio-Rad Laboratories, München). Während

die elektrokompetenten E. coli Zellen auf Eis aufgetaut wurden, wurden Elektroporations-

küvetten mit einem Elektrodenabstand von 0,2 cm bei -20 °C vorgekühlt und die Plasmide

entsprechend ihrer Konzentration 1:5 bzw. 1:10 verdünnt. Die verdünnten Plasmide (2 µl)

wurden zu 40 µl kompetenter Zellen gegeben und der Ansatz in die Elektroporations-

küvetten überführt. Die Elektroporation erfolgte bei einer Kapazität von 25 µF, einem

Widerstand von 200 Ω und einer Spannung von 2,5 kV. Ideale Zeitkonstanten lagen im

Bereich von 4,5 - 5,5 ms. Nach dem Elektroporationsvorgang wurden die Zellen zur

Regeneration in 500 µl LB-Medium aufgenommen und für 1 h bei 37 °C inkubiert. Jeweils

10 µl, 20 µl und 50 µl des Transformationsansatzes wurden auf LB-Agarplatten mit

entsprechenden Medienzusätzen (2.3.3) ausplattiert und über Nacht bei 37 °C inkubiert.

2.9.2 DNA-Transfer in C. acetobutylicum

2.9.2.1 Transformation von C. acetobutylicum durch Elektroporation

Die Transformation methylierter Vektor-DNA (2.8.3.4) in C. acetobutylicum erfolgte nach der

Methode von Mermelstein et al. (1992) unter zu Hilfenahme eines GenePulserIITM (Bio-Rad

Laboratories, München) unter anaeroben Bedingungen in einer Anaerobenwerkbank (MACS-

MG 1000; Meintrup dws, Lähden-Holte). Für die Elektroporation wurden stets frisch

kultivierte Zellen eingesetzt. Hierfür wurden 50 ml CGM mit einer exponentiell wachsenden

CGM-Vorkultur inokuliert (2.5.2) und bis zu einer OD600 von 1,0 bei 37 °C inkubiert. Die

nachfolgenden Schritte wurden auf Eis durchgeführt:

1. Inkubation der Hauptkultur für 30 min auf Eis

2. Zentrifugation für 5 min bei 5000 x g und 4 °C

3. Waschen der Zellen mit 10 ml vorgekühltem Elektroporationspuffer

4. Zentrifugation für 5 min bei 5000 x g und 4 °C

5. Resuspendieren des Zellpellets in 0,5-2,0 ml Elektroporationspuffer


6. Überführung von 400 µl kompetenter Zellen und 25 µl Plasmid-DNA in vorgekühlte Elektroporationsküvetten (0,4 cm Elektrodenabstand)

7. Inkubation des Ansatzes für 5 min auf Eis

8. Elektroporation: 50 µF, 600 Ω und 1,8 kV (Zeitkonstanten: 10 - 20 ms)

9. Zugabe von 1 ml CGM und Überführung des Ansatzes in 2-ml Schraubdeckelröhrchen

10. Regeneration der Zellen für ca. 4 h bei 37 °C

11. Ausplattieren von 300 µl Zellsuspension und Auftropfen von max. 500 µl auf RCA-Platten mit entsprechenden Medienzusätzen

12. Inkubation für mindestens 48 h bei 37°C

Natriumphosphat-Puffer (pH 7,4)1 Elektroporationspuffer2

NaH2PO4 (200 mM) 22,6 ml Saccharose-Lsg. (270 mM) 10 ml

Na2HPO4 (200 mM) 77,4 ml Natriumphosphat-Puffer (pH 7,4) 150 µl

1 Der Puffer wurde autoklaviert. 2 Der Elektroporationspuffer wurde steril filtriert.

2.10 Arbeiten mit Proteinen

2.10.1 Zellaufschluss von C. acetobutylicum mittels Ultraschall

Für den Nachweis der heterologen Proteinexpression wurden die Zellen der rekombinanten

C. acetobutylicum Stämme mittels Ultraschall (UP200S Hielscher, Teltow) aufgeschlossen.

Dazu wurde eine 200-ml CGM-Hauptkultur mit 0,1 Vol. einer entsprechenden 10-ml CGM-

Übernachtkultur inokuliert und bei 37 °C bis zu einer OD600 von 2,0 - 3,0 inkubiert. Die Zellen

wurden unter Antibiotika-Zusatz (2.3.3) kultiviert. Die Zellernte erfolgte durch Zentrifugation

(Sorvall RC6+, Rotor F12S-6x500 LEX) für 10 min bei 10000 Upm und 4 °C. Anschließend

wurde das Zellpellet in 5 ml Puffer W (2.10.2) aufgenommen und bis zur weiteren

Verwendung bei -20 °C gelagert. Nach dem Auftauen der Zellen wurden diese in einen

Glasmessbecher überführt, auf Eis gelagert und für die Ultraschallbehandlung eingesetzt.

Der Aufschluss der Zellen erfolgte mittels Ultraschall und einer S2 bzw. S3 Sonotrode bei

einem Zyklus von 3 min Beschallung (Amplitude: 50 %, cycle: 0,5) und 1 min Pause für eine

Dauer von 30 min. Der Erfolg des Aufschlusses wurde mittels Lichtmikroskopie überprüft. Es

folgte die Sedimentation der Zelltrümmer (13000 Upm, 4 °C, 10 min). Der geklärte

Überstand wurde anschließend für eine Affinitätschromatographie eingesetzt (2.10.2).


2.10.2 Proteinaufreinigung mittels Affinitätschromatografie

Die Aufreinigung rekombinanter Strep-tagII Fusionsproteine aus geklärten Lysaten von

C. acetobutylicum (2.10.1) erfolgte chromatografisch über eine mit Strep-Tactin

immobilisierte Sepharose-Säule (IBA, Göttingen). Der aus dem Ultraschallaufschluss (2.10.1)

gewonnene Überstand wurde auf die Säule gegeben und der daraus resultierende

Durchfluss aufgefangen. Es folgte zur Entfernung überschüssiger Proteine das fünfmalige

Waschen der Säule mit jeweils 1 ml Puffer W und das Sammeln der einzelnen

Waschfraktionen in 1,5-ml Eppendorfreaktionsgefäßen. Die aufgrund des Strep-tagII

zurückgehaltenen Fusionsproteine wurden durch Zugabe von 6x 0,5 ml Puffer E von der

Säule eluiert und in 1,5-ml Eppendorfreaktionsgefäßen aufgefangen. Die Proteinfraktionen

wurden bei -20 °C gelagert und zur Konzentrationsbestimmung (2.10.3) und für die SDS-

PAGE (2.10.4) eingesetzt. Zur Regeneration der Säule wurde selbige mit 10 ml Puffer R

behandelt, erkennbar durch einen Farbumschlag der Säule von weiß zu orange-rot. Die

anschließende Zugabe von 10 ml Puffer W führte zu einer Entfärbung der Säule. Die so

behandelte Säule konnte mit 1 ml Puffer W beschichtet bei 4 °C bis zur weiteren

Verwendung gelagert werden.

Puffer W1 Puffer E

Tris 100 mM Tris 100 mM

NaCl 100 mM NaCl 100 mM

EDTA (pH 8,0) 0,5 mM EDTA (pH 8,0) 0,5 mM

A. dest. ad 300 ml Desthiobiotin 2,5 mM

1 Der pH wurde mit 1 M HCl auf 8,0 eingestellt. Der Puffer wurde anschließend autoklaviert

und bei RT gelagert.

Puffer R

Tris 100 mM

NaCl 100 mM

EDTA (pH 8,0) 0,5 mM

HABA 1,0 mM


2.10.3 Konzentrationsbestimmung von Proteinen (Bradford, 1976)

Für die Bestimmung der Proteinkonzentration in wässrigen Lösungen wurde die Methode

nach Bradford (1976) angewandt. Es wurden 1 ml Bradford-Reagenz mit 50 µl Proteinprobe

(gegebenenfalls verdünnt) versetzt, gut durchmischt und für 5 min bei RT inkubiert.

Anschließend erfolgte die Messung der Absorption bei 595 nm in einer Plastikküvette

(Schichtdicke: 1 cm) in einem Photometer (WPA Biowave II) gegen einen Blindwert (1 ml

Bradford-Reagenz + 50 µl A. dest.). Die Berechnung der Proteinkonzentration erfolgte mit

Hilfe einer mit Rinderserumalbumin (BSA) erstellten Eichreihe (0 - 0,15 mg/ml).

Bradford-Reagenz

Brilliant-Blau G-250 70 ml

Ethanol (96 % [v/v]) 50 ml

H3PO4 (85 % [v/v]) 100 ml

A. dest. ad 1000 ml

Das Reagenz wurde lichtgeschützt bei RT gelagert.

2.10.4 Eindimensionale SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)

Zur Auftrennung von Proteinen in Abhängigkeit von ihrem Molekulargewicht wurde die

denaturierende SDS-PAGE nach Laemmli (1970, mod.) durchgeführt. Die Bindung von

negativ geladenen SDS-Molekülen („Sodium Dodecyl-Sulfate“) an die hydrophoben Regionen

der Proteine führt zu einer Überlagerung der nativen Proteinladung, sodass alle Proteine

eine negative Ladung erhalten. Die Durchführung der SDS-PAGE erfolgte in entsprechenden

Gelkammern (Biometra, Göttingen) unter Verwendung der in Tabelle 2.7 dargestellten

Gellösungen. Das Sammelgel, mit einem Acrylamidgehalt von 4 % [w/v] und neutralem pH-

Wert, diente der Bündelung der Proteine, welche anschließend im Trenngel

(Acrylamidgehalt 12 % [w/v]) separiert wurden.


Tab. 2.7: SDS-PAGE-Gellösungen

Reagenz Sammelgel (4 % [v/v]) Trenngel (12 % [v/v])

A. dest. 3,1 ml 3,1 ml

Acrylamid-Lösung (40 % Acrylamid) 0,52 ml 2,35 ml

4x Sammelgelpuffer 1,25 ml ---

4x Trenngelpuffer --- 1,88 ml

TEMED 10 µl 10 µl

APS (10 % [w/v]) 100 µl 100 µl

Die Proteinproben wurden vor der gelelektrophoretischen Auftrennung im Verhältnis von

4:1 [v/v] mit SDS-Probenpuffer versetzt und für 10 min bei 100 °C denaturiert. Nach dem

Auftragen der behandelten Proteinproben erfolgte die Elektrophorese bei einer konstanten

Stromstärke von 10 mA (Sammelgel) bzw. 20 mA (Trenngel) in 1x SDS-Laufpuffer bei RT.

Sobald die Lauffront das untere Gelende erreicht hatte, wurde die Elektrophorese gestoppt

und das Gel für die Coomassie-Färbung (2.10.5) bzw. für den Transfer der Proteine auf eine

Nitrocellulose-Membran (2.10.6) eingesetzt. Die Größenabschätzung der Proteine erfolgte

durch parallel mitgeführte Proteinmarker („prestained proteinmarker“, „prestained plus

proteinmarker“ bzw. „unstained proteinmarker“; Thermo Scientific, Braunschweig).

4x Trenngelpuffer 4x Sammelgelpuffer

Tris-HCl (pH 8,8) 0,5 M Tris-HCl (pH 6,8) 0,5 M

SDS [w/v] 4 % SDS [w/v] 4 %

A. dest. ad 400 ml A. dest. ad 400 ml

Der pH von 8,8 wurde mit HCl eingestellt. Der pH von 6,8 wurde mit HCl eingestellt.

10x SDS-Laufpuffer SDS-Probenpuffer

Tris 0,25 M Glycerin [v/v] 40 %

Glycin 1,92 M DTE 40 mM

SDS [w/v] 1 % SDS [w/v] 10 %

A. dest. ad 1000 ml Bromphenolblau [w/v] 0,4 %

Tris-HCl (pH 6,8) 250 mM

A. dest. ad 50 ml


Ammoniumpersulfatlösung (APS)

Ammoniumpersulfat 10 %

A. dest. ad 100 ml

2.10.5 Kolloidale Coomassie-Färbung

SDS-Polyacrylamidgele (2.10.4) wurden nach der Methode von Neuhoff et al. (1988)

behandelt und zunächst für mindestens 1 h in einer Fixierlösung unter Schwenken inkubiert.

Im Anschluss daran wurde die Fixierlösung entfernt und durch die kolloidale Coomassie-

Lösung ersetzt, in welcher die Gele über Nacht bei RT unter Schwenken inkubiert wurden.

Durch mehrmaliges Waschen mit destilliertem Wasser konnten die Gele anschließend

entfärbt werden, bis ein ausreichender Kontrast zwischen Hintergrund und Probe vorlag.

Kolloidales Coomassie Fixierlösung

Coomassie Brilliant Blue G-250 0,75 g Essigsäure 10 %

o-Phosphorsäure (85 %) 15 ml Ethanol (96 % [v/v], reinst) 50 %

Ammoniumsulfat 75 g A. dest. ad 1000 ml

Methanol 250 ml

A. dest. ad 1000 ml

2.10.6 Transfer von Proteinen auf Membranen (Western Blot)

Bei einem Western Blot (Towbin et al., 1979) werden die Proteine von einem

Polyacrylamidgel auf eine Nitrocellulose-Membran übertragen, um diese mit

immunologischen Methoden spezifisch detektieren zu können. Der Transfer der

aufgereinigten Proteinproben (2.10.2) auf eine Nitrocellulose-Membran wurde nach einer

gelelektrophoretischen Auftrennung (2.10.4) in einer Semi-Dry-Blottingapparatur (Biometra,

Göttingen) durchgeführt. Hierfür wurden zuvor zwei Lagen extra dickes Blottingpapier (Bio-

Rad Laboratories, Hercules) und die Nitrocellulose-Membran (0,2 µm, Biometra) auf die

Gelgröße (abzüglich des entfernten Sammelgels) zugeschnitten und mit Transferpuffer

befeuchtet. Auf die Anodenseite der Blottingapparatur wurde luftblasenfrei eine Lage

Blottingpapier gelegt, gefolgt von der Nitrocellulose-Membran, dem ebenfalls mit


Transferpuffer benetztem Polyacrylamidgel und der zweiten Lage Blottingpapier.

Überschüssiger Puffer wurde mit einem saugfähigen Papier entfernt. Durch Auflegen der

Kathodenplatte wurde die Blotting-Kammer geschlossen und der Transfer bei einer

konstanten Stromstärke von 5 mA/m2 durchgeführt. Sobald die Spannung auf die Hälfte

ihres Ausgangswertes absank, wurde der Blotvorgang beendet.

Transferpuffer

Tris 125 mM

Glycin 192 mM

Ethanol (96 % [v/v], reinst) 20 %

A. dest. ad 1000 ml

Der Puffer wurde bei 4 °C gelagert.

2.10.7 Detektion von Strep-tag II Fusionsproteinen

Die Detektion der rekombinanten Fusionsproteine erfolgte über einen Strep-Tactin-

Antikörper, welcher gegen das Strep-tag Antigen der Fusionsproteine gerichtet und an eine

alkalische Phosphatase gekoppelt ist. Durch die Umwandlung der Substrate

Nitroblautetrazoliumchlorid (NBT) und 5-Bromo-4-Chloro-3-Indoyl-Phosphat (BCIP) kommt

es aufgrund der gekoppelten alkalischen Phosphatase zu einer Farbreaktion.

Nach Beendigung des Blotvorgangs (2.10.6) wurde die Membran in 50 ml Blocking-Puffer

über Nacht bei 4 °C inkubiert. Im Anschluss daran wurde die Membran zweimal mit 1x TGST-

Puffer für jeweils 10 min gewaschen und mit 50 ml 1x TGST-Puffer und 5 µl Strep-Tactin-AP-

Konjugatlösung (IBA, Göttingen) für 45 min bei RT unter Schwenken inkubiert. Zur

Entfernung von ungebundenen Antikörpern wurde die Membran erneut dreimal mit 50 ml

1x TGST-Puffer für jeweils 10 min gewaschen. Anschließend wurde die Membran mit 5 ml

1x AP-Puffer und 45 µl NBT/BCIP-Lösung (Roche, Mannheim) im Dunkeln und bei RT

gelagert, bis die Signale erkennbar waren. Die Farbreaktion konnte bei ausreichender

Intensität der Signale durch Spülen der Membran mit destilliertem Wasser abgestoppt und

die Membran getrocknet und fotodokumentiert werden.


10x TGST-Puffer 10x AP-Puffer

Tris 1,21 g Tris 1,21 g

NaCl 3,55 g NaCl 5,7 g

Tween20* 0,5 g MgCl2 0,47 g

A. dest. ad 100 ml A. dest. ad 100 ml

*Zugabe nach dem Autoklavieren Der pH wurde mit HCl auf 9,5 eingestellt.

Der pH wurde mit HCl auf 8,0 eingestellt.

Blocking-Puffer

Magermilchpulver 2,5 g

BSA 0,5 g

1x TGST-Puffer ad 50 ml

Dem Puffer wurde eine Spatelspitze Avidin zugegeben.

2.11 Bezugsquellen

Chemikalien ohne zusätzlichen Vermerk wurden mit dem Reinheitsgrad „reinst“ oder „zur

Analyse“ von den Firmen AppliChem (Darmstadt), Carl Roth GmbH & Co.KG (Karlsruhe),

Diagonal (Münster), Merck KG (Darmstadt) und Sigma-Aldrich (Taufkirchen) bezogen. Gase

wurden von der Westfalen AG (Münster) geliefert.

Tab. 2.8: Bezugsquellen für Chemikalien

Bezugsquelle Produkt

AppliChem GmbH, Darmstadt

Acrylamid, Agarose, Ammoniumsulfat,

Ammoniumhydroxid, Ampicillin, Asparagin,

Avidin, β-NADH, BSA, DNase I, Erythromycin,

Ethidiumbromid, Glukose, Glycin, Lysozym,

Magermilchpulver, Mannose, MES, Phenol-

Chloroform-Isoamylalkohol, Proteinase K,

RNase A, SDS, TEMED, Tris,

Biolab Inc., Lawrenceville, USA Hefeextrakt, Trypton

Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe Brilliant Blue G-250, Tris, Vanillin, Xylose

Chemos GmbH, Regenstauf Thiamphenicol


Tab 2.8: Bezugsquellen für Chemikalien (Fortsetzung).

Bezugsquelle Produkt

Difco Laboratories, Hamburg Agar-Agar

Genaxxon Bioscience GmbH, Ulm GelRed

IBA GmbH, Göttingen Desthiobiotin, Strep-Tactin-Sepharose,

Strep-Tactin AP-Konjugatlösung

Merck KGaA, Darmstadt Chloramphenicol, Magnesiumsulfat,

Mangansulfat, PABA

Oxoid GmbH, Wesel Reinforced Clostridial Agar (RCA)

Peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen Pwo-Polymerase I

Roche Diagnostics GmbH, Mannheim NBT/ BCIP, Hexokinase/ Glucose-6-

Phosphat-Dehydrogenase

Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen 1,4-Butandiol; 2,3-Butandiol,Oligonukleotide

1,4-Butandiol-d8, γ-Hydroxybutyrat-d6

Tab. 2.9: Bezugsquellen für Geräte und Materialien

Bezugsquelle Geräte/ Materialien

Agilent Technologies GmbH, Böblingen Agilent 6890, Agilent 7890A, EZ Chrom Elite,

Amersham Buchler GmbH, Braunschweig Photometer Ultrospec 3000

Biochrom, Camebridge, UK Photometer WPA Biowave II

Biometra GmbH, Göttingen Agarosegelelektrophorese-Kammern,

Blotting-Apparatur, Nitrocellulosemembran,

PCR-Cykler, Power Pack P25,

Biorad GmbH, München Gene PulserTM II, Blottingpapier

Biostep GmbH, Jahnsdorf Geldokumentationsanalge Dark Hood DH+50

Braun AG, Melsungen sterile Kanülen

Eppendorf Research AG, Hamburg Reaktionsgefäße, Thermomixer Comfort

Genaxxon Bioscience GmbH, Ulm Gel Extraction Kit, Plasmid Plus DNA

Purification Mini Prep Kit

Heraeus-Holding GmbH, Hanau Tischzentrifuge Biofuge fresco

Hielscher Ultrasonic GmbH, Teltow Hielscher UP200S

Kendro Laboratory Products GmbH,

Langenselbold

Sorvall RC 6C Plus Zentrifuge


Tab. 2.9: Bezugsquellen für Geräte und Materialien (Fortsetzung).

Bezugsquelle Geräte/ Materialien

Macherey-Nagel GmbH & Co. KG, Düren ALUGRAM SIL G DC-Fertigfolie, Kieselgel

0,2 mm

Megazyme International Ltd., Wicklow Laktat-Kit

Meintrup DWS Laborgeräte GmbH, Lähden-

Holte

MACS-MG-500/MG-1000-

anaerobic workstation

Memmert GmbH & Co.KG, Schwabach Brutschrank

Mettler-Toledo GmbH, Giessen pH Meter SevenEasy

Müller&Krempel AG, Bülach Müller&Krempel Serumflaschen

MWG-Biotech AG, Ebersberg Geldokumentationsanalage TFP-M/WL

Ochs Laborfachhandel e. K., Bovenden Hungateröhrchen

Olympus Deutschland GmbH, Hamburg Mikroskop CH20

Peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen Elektroporationsküvetten, peqGold Gel

Extraction Kit

Sartorius AG, Göttingen Biostat B Plus Twin Fermenter

Sarstedt AG & Co., Nürnberg 50-ml Röhrchen, 0,2 µm Sterilfilter,

Plastikküvetten, Einmal-Impföse, Einmal-

Spatel

Schütt Labortechnik GmbH, Göttingen Wasserbad

Thermo Scientific Inc., Braunschweig dNTPs, Fast-AP, GeneRuler 1kB DNA Ladder,

Mass Ruler (SM403), Restriktionsenzyme,

Protein Molecular Weight Marker (SM0431,

SM0672), T4-DNA-Ligase

Ergebnisse 46

3. Ergebnisse

Zur Erzeugung und Optimierung biotechnologischer Produktionsstämme werden

unterschiedliche Strategien angewandt, welche Veränderungen in enzymatischen und

regulatorischen Funktionen im jeweiligen Produktionsstamm bewirken (Steinbüchel & Lütke-

Eversloh, 2003; Atsumi et al., 2008; Keasling, 2010). Diese sind auch unter dem Begriff

„Metabolic Engineering“ zusammengefasst (Stephanopoulos et al., 1998). Dementsprechend

war das Ziel dieser Arbeit die Veränderung des Metabolismus des obligaten Anaerobiers

C. acetobutylicum zur Produktion von 1,4-Butandiol (1,4-BDO).

Die Etablierung des neuen Biosyntheseweges von 1,4-BDO erfolgte durch eine

plasmidbasierte, heterologe Expression der bifunktionellen 4-Hydroxybutyryl-CoA

Dehydratasen/Vinylacetyl-CoA-∆-Isomerasen (4HBD) aus C. aminobutyricum, C. beijerinckii

bzw. C. kluyveri im Wirtsorganismus C. acetobutylicum. Neben unterschiedlichen Strategien

zur Produktionssteigerung konnte ebenso die Verwertung verschiedener Kohlenstoffquellen

für die 1,4-BDO-Produktion gezeigt werden. So ist der Einsatz von

Lignocellulosehydrolysaten als kostengünstiges, nicht mit der Lebensmittelindustrie

konkurrierendes Substrat für die 1,4-BDO-Produktion möglich. Darüber hinaus erfolgte

neben dem GC/MS-Nachweis von 1,4-BDO auch die Validierung mittels einer auf

Dünnschichtchromatografie basierten Nachweismethode.

3.1 1,4-Butandioltoleranz von C. acetobutylicum ATCC 824

Zur Vorbereitung dieser Arbeit erfolgte die Überprüfung der Toleranz von C. acetobutylicum

gegenüber der zu produzierenden Verbindung 1,4-BDO. Chemische Verbindungen, die von

biotechnologischen Produktionswirten heterolog erzeugt werden, können einen

inhibierenden Effekt auf den jeweiligen Produktionsstamm ausüben und dadurch die

Ausbeuten negativ beeinflussen (Maiorella et al., 1983).

Bisher ist nicht bekannt, dass die hochreduzierte Verbindung 1,4-BDO natürlich synthetisiert

wird (Yim et al., 2011). Da die Produkttoleranz ein wesentlicher Faktor bei der

Realisierbarkeit von biotechnologischen Produktionsprozessen ist (Burk, 2010), wurde das

Wachstum des Wirtsstamms bei verschiedenen Konzentrationen von 1,4-BDO dokumentiert.

Ergebnisse 47

Dazu erfolgte die Anzucht von C. acetobutylicum in 10 ml MS-MES mit unterschiedlichen

Konzentrationen an 1,4-BDO (0 bis 144 g/l) für 75 h bei 37 °C. Der Wachstumsverlauf ist in

der Abbildung 3.1 dargestellt.

Abb. 3.1: Wachstum von C. acetobutylicum ATCC 824 in Anwesenheit von unterschiedlichen 1,4-BDO-

Konzentrationen. 10 ml MS-MES, 37 °C, 75 h. 0 g/l ( ); 18 g/l ( ); 36 g/l ( ); 54 g/l ( ); 72 g/l ( ); 144 g/l ( ).

n ≥ 3.

C. acetobutylicum ist in der Lage, Konzentrationen von bis zu 5 % [w/v] 1,4-BDO zu tolerieren

und verfügt damit im Vergleich zu E. coli (5 - 6 %) über eine ähnliche Toleranz gegenüber

1,4-BDO (Burk, 2010). Erste signifikante Inhibitionseffekte auf das Wachstum traten erst ab

einer Konzentration von 54 g/l auf (p < 0,05). Es kam zu einer Verlangsamung des

Wachstums und zu einem Peak mit Erreichen der stationären Phase, gefolgt von einer

Abnahme der OD600. Jenes spiegelte sich ebenfalls in den Wachstumsraten und

Verdopplungszeiten wider (Tab. 3.1). Dieser Effekt verstärkte sich bei einer Konzentration

von 72 g/l. Bei 144 g/l konnte kein Wachstum mehr festgestellt werden.

Tab. 3.1: Wachstumsraten (µ) und Verdopplungszeiten (td) von C. acetobutylicum bei unterschiedlichen

1,4-BDO-Konzentrationen.

1,4-BDO [g/l] Wachstumsrate [h-1] Verdopplungszeit [min]

0 0,11 378 18 0,10 398 36 0,084 491 54 0,075 553** 72 0,061 675

144 --- --- ** p < 0,05

0,1

1

10

0 20 40 60 80

OD

60

0

Zeit [h]

Ergebnisse 48

Der Einfluss von 1,4-BDO zeigte sich nicht nur beim Wachstumsverhalten, sondern auch auf

morphologischer Ebene. Parallel zu den Messungen der optischen Dichte (2.6.1) wurden die

Kulturen lichtmikroskopisch (Olympus CH20) untersucht.

Im Konzentrationsbereich von 0 - 36 g/l 1,4-BDO zeigten die Zellen für C. acetobutylicum

charakteristische Morphologien (Jones et al., 1982) (Abb. 3.2). So wiesen Zellen der späten

exponentiellen Wachstumsphase (24 h) ein stäbchenförmiges und im Phasenkontrast

dunkles Erscheinungsbild auf. Nach 48 h und dem Erreichen der stationären

Wachstumsphase (Abb. 3.1) konnten zunehmend Vorsporen detektiert werden und nach

75 h waren auch einzelne freie Sporen sichtbar. Mit zunehmender 1,4-BDO-Konzentration

(54 g/l) zeigten die Zellen weiterhin ihre stäbchenförmige Morphologie, die Anzahl der

gebildeten Vorsporen sowie freien Sporen war jedoch stark reduziert. Die deutlichsten

morphologischen Veränderungen traten bei den beiden höchsten 1,4-BDO-Konzentrationen

auf (72 g/l und 144 g/l). Diese führten zu einem kompletten Ausbleiben der Bildung von

Vorsporen bzw. freien Sporen. Stattdessen kam es zu einer Verlängerung der vegetativen

Zellen, was unter Mikroorganismen ein weitverbreitetes Verhalten ist, wenn sie unter

stressvollen Bedingungen leben (Shi und Xia, 2003; Pianetti et al., 2009; Zhang et al., 2012).

0 g/l 18 g/l 36 g/l 54 g/l 72 g/l 144 g/l

24 h

48 h

72 h

Abb. 3.2: Phasenkontrastmikroskopische Aufnahmen von C. acetobutylicum bei verschiedenen 1,4-BDO-

Konzentrationen. 40-fache Vergrößerung; Größenbalken: 50 µm; n = 2.

Ergebnisse 49

3.2 Nachweismethoden für 1,4-Butandiol

Nachdem gezeigt werden konnte, dass C. acetobutylicum in der Lage ist, 1,4-BDO-

Konzentrationen von mindestens 54 g/l zu tolerieren, sollte im nächsten Schritt eine

geeignete Nachweismethode für 1,4-BDO etabliert werden. Hierfür wurden zwei

verschiedene Ansätze erprobt.

3.2.1 Dünnschichtchromatografie-basierte Nachweismethode

Zu Beginn der Arbeiten sollte eine möglichst schnelle, einfache und kostengünstige Methode

zum Nachweis von 1,4-BDO entwickelt werden. Hierfür wurde eine auf

Dünnschichtchromatografie-basierende Nachweismethode evaluiert (2.7). Die auf eine mit

Kieselgel beschichtete DC-Fertigfolie (Macherey-Nagel) aufgetragenen Proben wurden nach

entsprechender Auftrennung mit einem Vanillinreagenz zur Visualisierung der Spots

besprüht und zeigten eine für 1,4-BDO spezifische Pinkfärbung (Abb. 3.3). Ähnliche

Moleküle, wie das 1,3-Propandiol und 2,3-Butandiol, wiesen unter gleichen Bedingungen

eine Lila- bzw. Blaufärbung auf (Anand und Saxena, 2012).

(A) (B)

Abb. 3.3: Dünnschichtchromatogramm von 1,4-BDO. Zur Visualisierung wurde ein Vanillin-Sprühreagenz

angewandt. (A) 1,4-BDO und 2,3-BDO (Sigma-Aldrich). (B) 1,4-BDO (Sigma-Aldrich) gemischt mit

C. acetobutylicum-Kulturüberstand (48 h). K, Kontrolle, Kulturüberstand ohne Zusatz von 1,4-BDO.

1 10 100 1 10 mM mM mM mM mM

10 100 1000 K mM mM mM

1,4-BDO

2,3-BDO

1,4-BDO

Ergebnisse 50

Mit Hilfe der Dünnschichtchromatografie (DC) war es also möglich, 1,4-BDO aus einem

Gemisch aufzutrennen und zu visualisieren. Dabei ließ sich 1,4-BDO durch eine Vanillin-

Färbelösung spezifisch anfärben (rosa Spots), während strukturell ähnliche Moleküle, wie

2,3-BDO, eine charakteristische Blaufärbung zur Folge hatten. Die Intensität der 1,4-BDO-

Färbung war von der eingesetzten Konzentration abhängig (Abb. 3.3, A; A1 und A2). Bis zu

10 mM waren die Spots mit bloßen Augen noch feststellbar, bei niedrigeren Konzentrationen

(< 10 mM) erschwerte die Hintergrundfärbung die optische Beurteilung.

Weiterhin wurde die Anwendbarkeit dieser Methode zur Detektion von 1,4-BDO in

Kulturüberständen überprüft. Dazu wurden die Überstände einer 48-stündigen

C. acetobutylicum Kultur mit unterschiedlichen Konzentrationen 1,4-BDO versetzt und über

DC aufgetrennt. Die Visualisierung erfolgte ebenfalls über die Vanillin-Färbelösung. Es zeigte

sich, dass die im Überstand enthaltenen Stoffwechselprodukte (Aceton, Butanol und

Ethanol) keinen Einfluss auf die Auftrennung oder die Anfärbung hatten (Abb. 3.3, B; A2).

Da in den Arbeiten von Yim et al. (2011) und Hwang et al. (2014) eingangs deutlich geringere

1,4-BDO-Konzentrationen (0,6 mM bzw. 0,3 mM) erzielt wurden, ist davon auszugehen, dass

die nachzuweisenden Konzentrationen in C. acetobutylicum in einem ähnlichen Bereich sein

werden. Aus diesem Grund musste eine sensitivere Nachweismethode etabliert werden.

3.2.2 GC/MS-basierte Nachweismethode

1,4-BDO ist aufgrund seiner endständigen Hydroxylgruppen ein sehr polares Molekül, was

seine gaschromatografische Auftrennung deutlich erschwert (pers. Mitteilung, Dr. Rentsch).

Aus diesem Grund wurde 1,4-BDO zunächst mittels N-Methyl-N-tert-butyldimethylsilyl-

tifluoracetamid (MBDSTFA, Macherey-Nagel) silyliert (Abb. 3.4) (2.6.6.2). Durch den

Austausch der endständigen Hydroxylgruppen durch Silylgruppen wechselt der polare

Charakter des Moleküls zu einem apolaren, gleichzeitig wird die Molekülstabilität erhöht und

so eine bessere gaschromatografische Auftrennung ermöglicht (Corey und Venkateswarlu,

1972).

Ergebnisse 51

Abb. 3.4: Schematische Darstellung von 1,4-BDO (links) und GHB (rechts) nach Silylierungsreaktion mit

MBDSTFA. Erläuterungen siehe Text.

Die Normierung der Proben erfolgte über einen isotopenmarkierten internen Standard (IS),

einem 8-fach-deuterierten 1,4-BDO (1,4-BDO-d8, Sigma-Aldrich), in dem alle

Wasserstoffatome im Molekül durch Deuteriumatome ersetzt sind. Die chemischen

Eigenschaften wurden dabei jedoch nicht verändert, sodass sich der IS analytisch ähnlich zu

dem zu untersuchenden 1,4-BDO verhielt. Über einen massenselektiven Detektor konnte

zwischen deuterierten und undeuterierten Verbindungen unterschieden werden. Die

Unterscheidung beider Verbindungen erfolgte über die Auswerteionen 219 für 1,4-BDO und

221 für 1,4-BDO-d8. Vorversuche ergaben, dass in den Kulturproben der rekombinanten

Stämme zusätzlich γ-Hydroxybutyrat (GHB) detektiert werden konnte. Für dessen qualitative

und quantitative Analyse wurde es ebenso wie 1,4-BDO silyliert (Abb. 3.4) und über einen

entsprechenden isotopenmarkierten internen Standard (GHB-d6, Sigma-Aldrich) normiert.

Die für die Auswertung herangezogenen SIM-Ionen waren 317 für GHB und 323 für GHB-d6.

Über ein entsprechendes SIM-Chromatogramm (Abb. 3.5) konnte durch das Verhältnis der

Fläche des Analyten zur Fläche des dazugehörigen IS und mit Hilfe von erstellten

Eichgeraden (Tab. A1; Abb. A3 und A4) die Konzentrationsbestimmung der jeweiligen

Verbindungen erfolgen.

Abb. 3.5: SIM-Chromatogramm von 1,4-BDO und GHB. Erläuterungen siehe Text.

219

221

323

317

Ergebnisse 52

3.3 Generierung von rekombinanten C. acetobutylicum-Stämmen

zur Produktion von 1,4-Butandiol

Die in der Arbeit verwendeten und eingangs beschriebenen 4HBDs aus C. aminobutyricum

(AbfD), C. beijerinckii (Cbei_2100) und C. kluyveri (Ckl_3020) zeigten für die Aminosäure-

Sequenzen in in silico-Analysen (Abb. A5) eine Übereinstimmung von 73 - 79 % und besaßen

das für 4HBDs charakteristische [4Fe-4S]2+-Cluster-Motiv (CX3CX179-183HX6C). Dabei sind die

katalytisch relevanten Aminosäuren in den aktiven Zentren (Martins et al., 2004)

konserviert.

Die jeweiligen 4HBD-kodierenden Gene wurden mittels PCR (2.8.2) amplifiziert (Abb. 3.6, C)

und über entsprechende Oligonukleotide (Tab. 2.4) mit Restriktionsschnittstellen am 5´- und

3´- Ende für eine Insertion in den pTc-Shuttlevektor (Abb. 3.7) versehen. Als PCR-Matrize für

die Gene cbei_2100 und ckl_3020 diente die zuvor isolierte chromosomale DNA (2.8.2.2) aus

C. beijerinckii bzw. C. kluyveri (Abb. 3.6, A). Für die Amplifizierung des abfD-Gens aus

C. aminobutyricum wurde der Vektor pASK-IBA3+::abfD (Gerhardt et al., 2000) herangezogen

(Abb. 3.6, B).

(A) (B) (C) M1 1 2 M2 3 M2 4 5 6

Abb. 3.6: Erzeugung der 4HBD-kodierenden Gene cbei_2100, ckl_3020 und abfD. 0,8%ige Agarosegele. (A)

Chromosomale DNA (1 µg pro Spur) von C. beijerinckii (Spur 1) und C. kluyveri (Spur 2). Spur M1: MassRulerTm

DNA-Ladder Mix. (B) Plasmid-DNA pASK-IBA3+::abfD (4 µg Spur 3). Spur M2: 1kb-GeneRulerTM DNA-Ladder. (C)

PCR-Amplifikate der Gene cbei_2100 (Spur 4), ckl_3020 (Spur 5) und abfD (Spur 6).

ca. 1455 Bp

1,0 kBp

1,5 kBp

3,0 kBp 5,0 kBp 6,0 kBp

10,0 kBp

Ergebnisse 53

Der pTc-Vektor (Wietzke, unveröffentlicht) (Abb. 3.7), ein Derivat des pT-Vektors (Girbal

et al., 2005) (Abb. A6), gestattet die homologe und heterologe Expression von Genen sowohl

in Gram-positiven als auch in Gram-negativen Bakterien. Möglich ist dies durch die beiden

Replikationsursprünge „repL“ und „pBR322“. Diese genetische Ausstattung erlaubte den

Einsatz des Vektorsystems als Shuttle-Vektor für die Bakterien Escherichia coli und

C. acetobtylicum. Darüber hinaus verfügte jener Vektor über einen C-terminalen Strep-tag II

für eine spätere Proteinaufreinigung, zwei Resistenzgene (bla/catP) und über einen

konstitutiven ThiolaseA-Promotor (PthlA), welcher eine starke und konstante Expression

gewährleistet (Tummala et al., 1999).

Abb. 3.7: Vektorkarten. Der obere Vektor stellt den Ausgangsvektor pTc dar. Die untere Vektorreihe zeigt die

generierten Vektoren mit den 4HBD-kodierenden Genen. (Erläuterungen siehe Text).

repL

catP

PthlA

bla

pBR322

Strep-tag II

hydA

Cfr9I BamHI

SacI

cbei_2100 ckl_3020 abfD

NheI

Ergebnisse 54

Durch Behandlung des pTc-Vektors mit den Restriktionsenzymen BamHI und Cfr9I wurde das

Hydrogenase-Gen (hydA) entfernt (2.8.3.1) und nach einer anschließenden Ligationsreaktion

(2.8.3.3) durch die entsprechenden 4HBD-kodierenden Gene ersetzt. Für die Insertion der

beiden Gene cbei_2100 und ckl_3020 in den Vektor waren keine weiteren Anpassungen der

Restriktionsschnittstellen notwendig, jedoch für die Insertion des Gens abfD. Hierfür musste

die BamHI-Restriktionsschnittstelle des pTc-Vektors ausgetauscht werden, da diese auch im

abfD-Gen vorhanden war. Zu diesem Zweck wurde der Vektorbereich zwischen den

Schnittstellen SacI und BamHI (Abb. 3.7) mit spezifischen Oligonukleotiden (Tab. 2.4)

amplifiziert. Die verwendeten Oligonukleotide verfügten am 5´-Ende anstelle der BamHI-

eine NheI-Schnittstelle mit einer nachfolgenden Cfr9I-Erkennungsstelle. Infolgedessen wurde

die BamHI- durch eine NheI-Schnittstelle ersetzt. Die NheI- und Cfr9I-Erkennungsstellen

waren nun direkt aufeinanderfolgend. Anschließend wurde sowohl der pTc::hydA-Vektor als

auch das PCR-Amplifikat mit den Restriktionsenzymen SacI und Cfr9I verdaut. Es ergab sich

für den Verdau des Vektors ein 4515 Bp- und ein 2199 Bp-Fragment, welches den ThiolaseA-

Promotor und das hydA-Gen enthielt. Das 2199 Bp-Fragment wurde nachfolgend durch den

zuvor amplifizierten Vektorbereich ersetzt (2.8.3.3). Der neu generierte Vektor verfügte nun

über den ThiolaseA-Promotor, aber nicht mehr über das hydA-Gen. Es folgten die Restriktion

des angepassten Vektors und des abfD-Gens mit den Restriktionsenzymen NheI und Cfr9I

sowie die anschließende Klonierung des abfD-Gens in den Vektor.

Zur Kontrolle der korrekten Integration der 4HBD-kodierenden Gene wurden die Konstrukte

aus transformierten E. coli-Zellen (Tab. 2.1) isoliert und einem Kontrollverdau unterzogen

(Abb. 3.8). Desweiteren wurden die Genbereiche mittels Sequenzierung (LGC Genomics,

Berlin) auf mögliche Veränderungen in den Nukleotidsequenzen überprüft (Abb. A7-9).

Ergebnisse 55

M 1 2 3 4 5 6 7 8

Abb. 3.8: Kontrollrestriktion der Plasmide pTc::P(thlA)cbei_2100, pTc::P(thlA)ckl_3020 und pTc::P(thlA)abfD.

0,8%iges Agarosegel. Restriktionsenzyme BamHI/SmaI bzw. NheI/SmaI. Spur M: MassRulerTm DNA-Ladder Mix,

Spuren 1-3: pTc::P(thlA)cbei_2100 (Klone 1 [5 µg], 2 [3 µg] und 6 [4 µg]), Spuren 4-6: pTc::P(thlA)ckl_3020

(Klone 8 [3 µg], 15 [3 µg] und 18 [2 µg]), Spuren 7 und 8: pTc::P(thlA)abfD (Klone 22 [4 µg] und 24 [4 µg]).

Vektoren, welche die erwarteten Restriktionsfragmente (ca. 4980 Bp und 1455 Bp)

aufwiesen (Abb. 3.8), wurden anschließend für die Transformation von C. acetobutylicum

eingesetzt (2.9.2.1) und die Klone mittels Colony-PCR (2.8.2.3), SDS-PAGE (2.10.4) und

Western Blot-Analysen (2.10.6) verifiziert (Abb. 3.9). Da die Gene cbei_2100, ckl_3020 und

abfD nicht im Genom von C. acetobutylicum vorkommen und somit keine Falsch-positiven

Signale verursachen, konnte ihr Nachweis mittels „Colony“-PCR (2.8.2.3) erfolgen. Nur Klone,

die das entsprechende Plasmid aufgenommen haben, zeigten Banden auf Höhe von 1,5 kBp

im Agarosegel (Abb. 3.9, A). Jeweils einer der positiven Klone, welche ein entsprechendes

Plasmid aufgenommen haben, wurde in 200 ml CGM kultiviert und für die

Proteinaufreinigung via Affinitätschromatografie eingesetzt (2.10.2). Elutionsfraktionen mit

den höchsten Proteinkonzentrationen wurden für eine SDS-PAGE mit anschließendem

Western Blot verwendet. Im SDS-Polyacrylamidgel (Abb. 3.9, B) und im Western Blot

(Abb. 3.9, C) sind entsprechende Banden bzw. Signale der aufgereinigten Proteine

erkennbar.

Demnach haben die transformierten C. acetobutylicum-Stämme die jeweiligen Plasmide

aufgenommen und die auf den Vektoren kodierten Gene exprimiert.

5,0 kBp

1,5 kBp 4hbd, linear (ca. 1455 Bp)

pTc, linear (ca. 4980 Bp)

Ergebnisse 56

(A) (B) (C)

M1 1 2 3 4 5 6 M2 7 8 9 M2 10 11 12

Abb. 3.9: Verifizierung von rekombinanten C. aetobutylicum-Klonen. (A) Colony-PCR der Gene cbei_2100

(Spur 4), ckl_3020 (Spur 5) und abfD (Spur 6). 0,8%iges Agarosegel. Spur M1: GeneRulerTM 1kb DNA-Ladder,

Spur 1-3: Negativkontrollen der Oligonukleotide mit C. acetobutylicum-WT DNA. (B) SDS-PAGE der

aufgereinigten Proteine Cbei_2100 (Spur 7; 3 µg), Ckl_3020 (Spur 8; 1 µg) und AbfD (Spur 9; 1 µg) nach

kolloidaler Coomassie-Färbung. 12%iges SDS-Polyacrylamidgel. Spur M2: PageRulerTM Prestained-Protein

Ladder. (C) Western Blot der aufgetrennten Proteine Cbei_2100 (Spur 10), Ckl_3020 (Spur 11) und AbfD (Spur

12). Detektion erfolgte über Strep-Tactin Antikörper.

3.4 Wachstumsphysiologische Charakterisierung von generierten

1,4-BDO-Produktionsstämmen

Die rekombinanten C. acetobutylicum-Stämme (C. acetobutylicum pTc::P(thlA)cbei_2100,

C. acetobutylicum pTc::P(thlA)ckl_3020 und C. acetobutylicum pTc::P(thlA)abfD) (3.3)

wurden in 200-ml MS-MES kultiviert (2.5.2.2) und wachstumsphysiologisch charakterisiert

(2.6). Die Abbildungen 3.10 und 3.11 zeigen den Verlauf der optischen Dichten, pH-Werte

und der gebildeten Gärungsprodukte. Weiterhin erfolgte die Analyse der 1,4-BDO-Bildung

(Abb. 3.12). Zu Vergleichszwecken wurden der Typstamm C. acetobutylicum ATCC 824 und

ein Vektorkontrollstamm (pTc-empty) mitgeführt.

55 kDa

70 kDa

1,5 kBp

55 kDa 70 kDa

Ergebnisse 57

3.4.1 Wachstumsverlauf und Gärungsprodukte

Hinsichtlich des Verlaufes der optischen Dichte unterschieden sich die beiden

Expressionsstämme C. acetobutylicum pTc::P(thlA)ckl_3020 und C. acetobutylicum

pTc::P(thlA)abfD nicht von den Kontrollstämmen. Einzig C. acetobutylicum

pTc::P(thlA)cbei_2100 zeigte ein abweichendes Wachstumsverhalten (Abb. 3.10).

(A)

Abb. 3.10: Kultivierungsexperimente von C. acetobutylicum pTc::P(thlA)cbei_2100 ( ), C. acetobutylicum

pTc::P(thlA)ckl_3020 ( ) und C. acetobutylicum pTc::P(thlA)abfD ( ) vergleichend zum C. acetobutylicum

ATCC 824 Typstamm ( ) und C. acetobutylicum Kontrollvektorstamm ( ). (A) Optische Dichte bei 600 nm. (B)

ph-Wert. 200 ml MS-MES, 120 h, 37 °C, n = 3 (aus Übersichtlichkeitsgründen wurde auf die Darstellung der

Fehlerbalken verzichtet).

0,1

1

10

0 30 60 90 120

OD

60

0

4,2

4,5

4,8

5,1

5,4

0 30 60 90 120

pH

Zeit [h]

(B)

Ergebnisse 58

Nach einer ca. 12-stündigen lag-Phase gingen die Kulturen in die exponentielle

Wachstumsphase über (Abb. 3.10, A). Dabei zeigten die Expressionsstämme

C. acetobutylicum pTc::P(thlA)ckl_3020 (µ = 0,13 h-1) und C. acetobutylicum pTc::P(thlA)abfD

(µ = 0,129 h-1) eine ähnliche Wachstumsgeschwindigkeit wie der Vektorkontrollstamm

(µ = 0,134 h-1). Der Expressionsstamm C. acetobutylicum pTc::P(thlA)cbei_2100 (µ= 0,146 h-1)

besaß die höchste ermittelte Wachstumsrate (Tab. A2). Dieser Stamm erreichte bereits nach

48 h als erstes die maximale optische Dichte von 8,35. Im Vergleich zu den weiteren

Stämmen war die Wachstumsrate des Wildtyps (µ = 0,116 h-1) am geringsten. Die

exponentielle Wachstumsphase wurde anschließend nach etwa 40 h von der stationären

Wachstumsphase abgelöst. Hierbei zeigte ebenfalls einzig C. acetobutylicum

pTc::P(thlA)cbei_2100 ein abweichendes Verhalten, indem nach Erreichen eines Peaks die

optische Dichte deutlich abnahm. Die finale OD lag nach 120 h bei 1,5.

Zusätzlich zu der optischen Dichte wurde der extrazelluläre pH-Wert der Kulturen gemessen

(Abb. 3.10, B). Der Ausgangswert von ca. 5,2 sank mit Eintreten der Kulturen in die

exponentielle Wachstumsphase aufgrund der Produktion der Säuren Acetat und Butyrat

(Abb. 3.11, A und B) bis auf einen Minimalwert von pH 4,6 (C. acetobutylicum

pTc::P(thlA)abfD). Die pH-Werte des Wildtyps und von C. acetobutylicum

pTc::P(thlA)cbei_2100 sanken indes nur bis jeweils 4,7. Mit dem Übergang in die stationäre

Wachstumsphase setzte der für C. acetobutylicum charakteristische „Lösungsmittelshift“ ein.

Dieser ging mit der Assimilierung der Säuren und deren Umwandlung in die pH-neutralen

Lösungsmittel Aceton, Butanol und Ethanol einher (Abb. 3.11, C, D und E). Dies wiederum

führte zu einem erneuten, leichten Anstieg des pH-Werts.

Auch im Hinblick auf das Produktspektrum zeigte der Stamm C. acetobutylicum

pTc::P(thlA)cbei_2100 ein abweichendes Verhalten im Vergleich zu allen anderen

untersuchten Stämmen (Abb. 3.11). Deutliche Unterschiede traten vor allem beim

„Lösungsmittelshift“ und somit bei der Assimilation der Säuren Acetat und Butyrat auf

(Abb. 3.11, A und B).

Ergebnisse 59

(A) (B)

(C) (D)

(E) (F)

Abb. 3.11: Gärungsprodukte der Kultivierungsexperimente C. acetobutylicum pTc::P(thlA)cbei_2100 ( ),

C. acetobutylicum pTc::P(thlA)ckl_3020 ( ) und C. acetobutylicum pTc::P(thlA)abfD ( ) vergleichend zum

C. acetobutylicum ATCC 824 Wildtypstamm ( ) und C. acetobutylicum pTc-Kontrollvektorstamm ( ).

(A) Acetat, (B) Butyrat, (C) Aceton, (D) Butanol, (E) Ethanol und (F) Glukose, 200 ml MS-MES, 120 h, 37 °C, n = 3.

0

20

40

60

0 30 60 90 120

Ace

tat

[mM

]

Zeit [h]

0

10

20

30

40

0 30 60 90 120

Bu

tyra

t [m

M]

Zeit [h]

0

20

40

60

80

100

120

140

0 30 60 90 120

Ace

ton

[m

M]

Zeit [h]

0

50

100

150

200

250

300

0 30 60 90 120

Bu

tan

ol [

mM

]

Zeit [h]

0

20

40

60

80

100

0 30 60 90 120

Eth

ano

l [m

M]

Zeit [h]

0

100

200

300

400

0 30 60 90 120

Glu

kose

[m

M]

Zeit [h]

Ergebnisse 60

Die Acetatassimilation der Expressionsstämme C. acetobutylicum pTc::P(thlA)ckl_3020 und

C. acetobutylicum pTc::P(thlA)abfD sowie der beiden Kontrollstämme erstreckte sich über

einen längeren Zeitraum und führte zu einer stetigen Abnahme der Acetatkonzentration

über den gesamten Wachstumsverlauf hinweg. Infolgedessen wurde bis zum Ende der

Kultivierungsexperimente ca. 50 % (C. acetobutylicum pTc::P(thlA)ckl_3020 und beide

Kontrollstämme) bzw. 34 % (C. acetobutylicum pTc::P(thlA)abfD) Acetat assimiliert

(Abb. 3.11, A). Im Gegensatz dazu sank die Acetatkonzentration bei C. acetobutylicum

pTc::P(thlA)cbei_2100 nach 22 h Kultivierung während der exponentiellen Wachstumsphase

deutlich und erreichte nach weiteren 38 h Wachstum einen Minimalwert von ca. 17 mM.

Dies entsprach einer Acetatassimilation von 67,5 %.

Der Butyratstoffwechsel von C. acetobutylicum pTc::P(thlA)cbei_2100 wies ebenfalls einige

Unterschiede zu den anderen Stämmen auf (Abb. 3.11, B). Während des exponentiellen

Wachstums kam es zum Anstieg der Butyratkonzentration, welche nach Erreichen eines

Peaks aufgrund der Butyratreassimilation wieder sank. Dabei betrug die maximale

Butyratkonzentration bei C. acetobutylicum pTc::P(thlA)cbei_2100 17 mM und entsprach

damit lediglich 63 % der Butyratkonzentrationen der weiteren Stämme (ca. 27 mM). Darüber

hinaus wurde das Maximum bereits nach 22 h und somit 14 h eher im Vergleich zu den

anderen Stämmen erreicht. Ebenfalls auffällig war die stärkere Abnahme der

Butyratkonzentration bei C. acetobutylicum pTc::P(thlA)ckl_3020, welche bis auf 5 mM

herabsank und damit die niedrigste Endkonzentration einnahm.

Mit Übergang in die stationäre Wachstumsphase werden die Säuren assimiliert und die

Lösungsmittel Aceton, Butanol und Ethanol gebildet (Jones und Woods, 1986), (Abb. 3.11, C,

D und E). Die Lösungsmittelproduktion setzte bei C. acetobutylicum pTc::P(thlA)cbei_2100

(22 h) deutlich früher ein als bei allen anderen Stämmen (36 h), diese stagnierte jedoch

bereits nach ca. 80 h. Es zeigte sich, dass die Acetonkonzentration trotz früher einsetzender

Produktion durch C. acetobutylicum pTc::P(thlA)cbei_2100 am geringsten war (85,7 mM) und

damit C. acetobutylicum pTc::P(thlA)abfD (89,3 mM) ähnelte. Im Gegensatz dazu produzierte

C. acetobutylicum pTc::P(thlA)ckl_3020 das meiste Aceton nach 120 h (119,0 mM),

(Abb. 3.11, C). Die Ausbeuten an Butanol erhöhten sich bei C. acetobutylicum

pTc::P(thlA)cbei_2100 (193,7 mM) und deutlich bei C. acetobutylicum pTc::P(thlA)ckl_3020

(238,6 mM) im Vergleich zu den beiden Kontrollstämmen (ATCC 824 [169,2 mM] und pTc

[147,1 mM]), (Abb. 3.11, D). Die größte Zunahme konnte jedoch bei der Produktion von

Ergebnisse 61

Ethanol durch die beiden Stämme C. acetobutylicum pTc::P(thlA)cbei_2100 (89,7 mM) und

C. acetobutylicum pTc::P(thlA)ckl_3020 (92,7 mM) detektiert werden. Die Menge des

produzierten Ethanols betrug ca. das 2,5-fache der Konzentration der beiden

Kontrollstämme (ATCC 824 [37,0 mM] und pTc [33,8 mM]), (Abb. 3.11, E).

Die höchste Gesamtkonzentration an Lösungsmitteln (28,9 g/l) konnte bei C. acetobutylicum

pTc::P(thlA)ckl_3020 detektiert werden. Dieser Stamm produzierte 112 % mehr Aceton,

141 % mehr Butanol (p < 0,01) und 250 % mehr Ethanol (p < 0,001) als die Kontrollstämme.

Es bleibt festzuhalten, dass im Hinblick auf das Wachstumsverhalten und das

Produktspektrum der Stamm C. acetobutylicum pTc::P(thlA)abfD ein ähnliches

Wachstumsverhalten wie die Kontrollstämme aufwies. Der Stamm C. acetobutylicum

pTc::P(thlA)cbei_2100 zeigte neben einer früher einsetzenden Assimilation der Säuren auch

eine früher einsetzende Lösungsmittelproduktion, wohingegen C. acetobutylicum

pTc::P(thlA)ckl_3020 sich durch eine deutlich erhöhte Lösungsmittelbildung auszeichnete.

Bei beiden letztgenannten Stämmen konnte zudem eine gesteigerte Ethanolproduktion

festgestellt werden. Einen genauen Überblick über die Wachstumsparameter und

Gärungsprodukte liefert die Tabelle A2 (Anhang).

3.4.2 1,4-Butandiolproduktion

Nachdem die Expressionsstämme C. acetobutylicum pTc::P(thlA)cbei_2100,

C. acetobutylicum pTc::P(thlA)ckl_3020 und C. acetobutylicum pTc::P(thlA)abfD über eine

entsprechende 4HBD verfügten und diese auch exprimierten (3.3), galt es anschließend die

Produktion von 1,4-BDO in Kultivierungsexperimenten nachzuweisen. Aus diesem Grund

wurde neben der gaschromatografischen Analyse der herkömmlichen Gärungsprodukte

(3.4.1) auch die Produktion von 1,4-BDO mittels GC/MS-Analysen überprüft.

Wie aus der Abbildung 3.12 hervorgeht, waren alle drei Expressionsstämme in der Lage

1,4-BDO zu synthetisieren.

Dabei produzierte der Stamm C. acetobutylicum pTc::P(thlA)cbei_2100 mit 0,46 mM

(41,5 mg/l) 77 % mehr 1,4-BDO als C. acetobutylicum pTc::P(thlA)ckl_3020 (0,26 mM,

[23,7 mg/l]) und 3,5 mal so viel wie C. acetobutylicum pTc::P(thlA)abfD (0,13 mM,

Ergebnisse 62

[11,6 mg/l]). Zur Veranschaulichung wurden auch die entsprechenden Produktivitäten

berechnet (Tab. 3.2).

Abb. 3.12: 1,4-BDO- und GHB-Produktion der Expressionsstämme nach 120 h Kultivierung in 200 ml MS-MES.

Cbei_2100, C. acetobutylicum pTc::P(thlA)cbei_2100; Ckl_3020, C. acetobutylicum pTc::P(thlA)ckl_3020; AbfD,

C. acetobutylicum pTc::P(thlA)abfD. 1,4-BDO, GHB. * p < 0,05; ** p < 0,01. n = 3.

Darüber hinaus konnte bei den Expressionsstämmen neben 1,4-BDO auch γ-Hydroxybutyrat

(GHB) detektiert werden. GHB tritt scheinbar als Nebenprodukt der 1,4-BDO-Synthese auf.

Dieses Phänomen wurde bereits 2011 in den Arbeiten von Yim et al. festgestellt und auch

dort produzierten die frühen rekombinanten Stämme in der Regel mehr GHB als 1,4-BDO. Es

zeigte sich, dass mit geringerer 1,4-BDO-Konzentration die Konzentration an GHB zunahm.

Dabei betrug die Gesamtkonzentration beider Produkte etwa 1 mM (95 mg/l). Somit lag das

1,4-BDO zu GHB-Verhältnis auf Seiten des GHBs. Im Falle von C. acetobutylicum

pTc::P(thlA)ckl_3020 war die GHB-Konzentration um den Faktor drei (0,67 mM, [69,8 mg/l])

und bei C. acetobutylicum pTc::P(thlA)abfD um den Faktor 6 (0,64 mM, [66,6 mg/l]) im

Vergleich zur jeweiligen 1,4-BDO-Konzentration erhöht. Der Stamm C. acetobutylicum

pTc::P(thlA)cbei_2100 produzierte mit 0,49 mM (51,0 mg/l) am wenigsten GHB mit einem

Verhältnis zu 1,4-BDO von 1:1,1.

Diese Ergebnisse belegen, dass die plasmidgestützte 1,4-BDO-Bildung in C. acetobutylicum

möglich ist, wodurch der „Proof of Principle“ eindeutig belegt werden konnte. Es ist

weiterhin festzuhalten, dass für die 1,4-BDO-Produktion in C. acetobutylicum eine einzige,

zusätzliche 4HBD ausreichend ist. Für die 1,4-BDO-Bildung konnten die Enzyme aus drei

verwandten Organismen der Clostridien experimentell bestätigt werden.

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Cbei_2100 Ckl_3020 AbfD

Ko

nze

ntr

atio

n [

mM

]

*

**

* *

Ergebnisse 63

Tab. 3.2: 1,4-BDO-Produktivitäten der Expressionsstämme.

Biomasse-spezifische

Produktivität (mg/l/OD)

Produktivität (mg/l/h)

1,4-BDO GHB 1,4-BDO GHB

C. acetobutylicum pTc::P(thlA)cbei_2100

4,97 6,09 0,35 0,42

C. acetobutylicum pTc::P(thlA)ckl_3020

2,73 8,26 0,19 0,58

C. acetobutylicum pTc::P(thlA)abfD

1,63 9,02 0,11 0,55

3.4.3 Zeitlicher Verlauf der 1,4-BDO-Produktion

Neben der Endpunktbestimmung der 1,4-BDO- und GHB-Produktion nach 120 h Kultivierung

(Abb. 3.12) wurde zusätzlich der zeitliche Verlauf der 1,4-BDO-Synthese ermittelt

(Abb. 3.13). Auch hier unterschied sich C. acetobutylicum pTc::P(thlA)cbei_2100 deutlich von

den beiden weiteren Expressionsstämmen C. acetobutylicum pTc::P(thlA)ckl_3020 und

C. acetobutylicum pTc::P(thlA)abfD.

Die 1,4-BDO-Bildung erfolgte im Falle von C. acetobutylicum pTc::P(thlA)cbei_2100 kurz nach

dem Erreichen der maximalen OD während der frühen stationären Phase. Anschließend

stagnierte die gemessene Konzentration nach 60 h Kultivierung auf einem Maximalwert von

ca. 0,46 mM. Dies deckte sich ebenfalls mit dem Ende der Lösungsmittelproduktion

(Abb. 3.11). Im Gegensatz dazu setzte die Produktion von 1,4-BDO bei C. acetobutylicum

pTc::P(thlA)ckl_3020 und C. acetobutylicum pTc::P(thlA)abfD erst nach 60 h Kultivierung ein.

Die Zunahme war jedoch deutlich schwächer ausgeprägt als bei C. acetobutylicum

pTc::P(thlA)cbei_2100. Insbesondere bei C. acetobutylicum pTc::P(thlA)abfD konnte nur ein

geringfügiger Anstieg detektiert werden.

Prinzipiell startete die Synthese von GHB bei allen drei Expressionsstämmen bereits während

der exponentiellen Wachstumsphase und die gemessenen Konzentrationen erreichten im

Falle von C. acetobutylicum pTc::P(thlA)ckl_3020 und C. acetobutylicum pTc::P(thlA)abfD erst

in der späten stationären Wachstumsphase ihre Maxima. Bei C. acetobutylicum

pTc::P(thlA)cbei_2100 stagnierten die gemessenen GHB-Konzentrationen zum selben

Ergebnisse 64

Zeitpunkt wie die 1,4-BDO-Konzentrationen. Die Produktion von GHB setzte somit deutlich

früher und stärker ein als die Synthese von 1,4-BDO.

Abb. 3.13: Zeitlicher Verlauf der 1,4-BDO- und GHB-Produktion. (A) C. acetobutylicum pTc::P(thlA)cbei_2100,

(B) C. acetobutylicum pTc::P(thlA)ckl_3020, (C) C. acetobutylicum pTc::P(thlA)abfD. 1,4-BDO, GHB. 200 ml

MS-MES, 37 °C, n = 3.

0 20 40 60 80 100 120

OD

60

0

0,1

1

10

Ko

nze

ntr

atio

n [

mM

]

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Zeit [h]

0 20 40 60 80 100 120

OD

60

0

0,1

1

10

Ko

nze

ntr

ati

on

[m

M]

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0 20 40 60 80 100 120

OD

60

0

0,1

1

10

Ko

nze

ntr

atio

n [

mM

]

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0(A)

(B)

(C)

Ergebnisse 65

3.5 Optimierungsstrategien

Da nachgewiesen werden konnte, dass die generierten Stämme in der Lage waren, 1,4-BDO

zu synthetisieren (3.4), lag das Interesse weiterer Arbeiten auf ersten Versuchen zur

Optimierung der 1,4-BDO-Produktion. Hierfür sollte zunächst der Einfluss einer Erhöhung

des Kulturvolumens („Scale-up“) und die Anwendung eines anderen Minimalmediums

untersucht werden (3.5.1). Darüber hinaus wurden verschiedene Kohlenstoffquellen für die

Fermentation von C. acetobutylicum und deren Einfluss auf die 1,4-BDO-Produktion geprüft,

um mögliche Alternativen zur Glukose aufzuzeigen (3.5.2). Weiterhin wurden

unterschiedliche Promotoren für die Expression der 4HBD-kodierenden Gene (3.5.3) und

diverse Stoffwechseldefektmutanten von C. acetobutylicum (3.5.4) als Rezipientenstämme

ausgetestet.

3.5.1 pH-regulierte Batch-Fermentation von C. acetobutylicum

pTc::P(thlA)cbei_2100

Für die industrielle Nutzung von mikrobiell erzeugten Verbindungen stellt die Überführung

vom Labormaßstab (0,1 – 10 l) zum Industriemaßstab (10.000 – 500.000 l) einen wichtigen

Aspekt dar (Takors, 2012). Denn mit Erhöhung des Kulturvolumens können Veränderungen

in physiologischen und physikalischen Parametern auftreten, welche zu beeinträchtigenden

Reaktionsbedingungen und infolgedessen zu verringerten Produktausbeuten führen

(Schmidt, 2005). Daher wurde die experimentelle Erhöhung des Kultivierungsmaßstabes von

0,2 l- auf 1,5 l-Batch-Kulturen vorgenommen. Aufgrund der höchsten erzielten 1,4-BDO-

Konzentrationen wurden diese Versuche mit dem Stamm C. acetobutylicum

pTc::P(thlA)cbei_2100 durchgeführt.

In einem 2-l-Bioreaktor erfolgte die Kultivierung unter Regulation des pH-Wertes. Diese

wurde während der Anwachsphase konstant bei pH 5,2 gehalten und erst nach Erreichen

einer OD600 von 2,0 auf pH 4,7 herabgesetzt. Neben MS-MES wurde dabei ein weiteres

Medium (MMfvK, 2.3.2) eingesetzt.

Hinsichtlich des Wachstumsverhaltens (Abb. 3.14) konnte ein Unterschied zwischen den

beiden Medien festgestellt werden. Während der Stamm C. acetobutylicum

Ergebnisse 66

pTc::P(thlA)cbei_2100 auf MS-MES frühzeitig in die exponentielle Phase eintrat, musste beim

Wachstum in MMfvK jeweils nach 14 h und 29 h weitere 100 ml einer MMfvK-Vorkultur

zugeführt werden, damit die Kulturen die lag-Phase überbrücken und in die exponentielle

Phase eintreten konnten. Dementsprechend wurde die maximale OD600 von 9,6 etwa 22 h

später erreicht als beim Wachstum auf MS-MES (OD600 = 9,4 nach 24 h). Weiterhin auffällig

war, dass die optische Dichte nach Erreichen des Maximalwerts beim Wachstum auf MMfvK

weniger stark absank (OD600 ca. 4,6) als beim Wachstum auf MS-MES (OD600 ca. 2,5).

Abb. 3.14: Kultivierungsexperiment von C. acetobutylicum pTc::P(thlA)cbei_2100 in 1,5 l Kulturvolumen. ( )

MS-MES, ( ) MMfvK. 37 °C. n ≥ 2.

Im Hinblick auf die Produktion synthetisierte der rekombinante C. acetobutylicum-Stamm in

MS-MES mehr 1,4-BDO (0,23 mM) als in MMfvK (0,12 mM) (Abb. 3.15). Dennoch sank die

1,4-BDO-Konzentration im Vergleich zum 200 ml-Kulturmaßstab um die Hälfte von 0,46 mM

(Abb. 3.12) auf 0,23 mM. Im Gegensatz dazu kam es bei der Erhöhung des Kulturvolumens

auf 1,5 l zu einer deutlichen Zunahme in der GHB-Produktion. Diese stieg um 225 % von

0,49 mM (Abb. 3.12) auf 1,1 mM. Die GHB-Konzentration beim Wachstum in MMfvK

entsprach hingegen mit 0,45 mM annähernd der Konzentration im 200 ml-Maßstab in MS-

MES.

0,1

1

10

100

0 20 40 60 80 100 120

OD

60

0

Zeit [h]

Ergebnisse 67

Abb. 3.15: 1,4-BDO- und GHB-Produktion von C. acetobutylicum pTc::P(thlA)cbei_2100 in 1,5 l Kulturvolumen

in Abhängigkeit verschiedener Medien. 120 h. 1,4-BDO, GHB. n ≥ 2.

3.5.2 Verwendung verschiedener Kohlenhydratquellen

Für die Entwicklung neuer Biosynthesewege wird im Allgemeinen auf das bevorzugte

Substrat des jeweiligen Produktionsstammes zurückgegriffen. Häufig handelt es sich dabei

um Glukose, da viele heterotrophe Mikroorganismen jene Kohlenhydratquelle präferieren

(Servinsky et al., 2010). Um mit Blick auf eine mögliche, zukünftige 1,4-BDO-Synthese durch

C. acetobutylicum einen größeren Handlungsspielraum im Hinblick auf die Substratnutzung

zu bekommen, wurden während dieser Arbeit verschiedene Kohlenhydratquellen

(Arabinose, Xylose, Galaktose und Mannose) als Substrate für die 1,4-BDO-Fermentation

eingesetzt. Aufgrund der höchsten 1,4-BDO-Produktion wurde dazu der Stamm

C. acetobutylicum pTc::P(thlA)cbei_2100 verwendet (Abb. 3.12).

Dieser Stamm zeigte auf allen untersuchten C-Quellen ein ähnliches Wachstumsverhalten

(Abb. 3.16). Nach einer etwa 12-stündigen lag-Phase erfolgte das exponentielle Wachstum.

Bei den Pentosen Arabinose und Xylose wurde die maximale OD600 von 7,7 bzw. 7,55 nach

ca. 60 h erreicht. Bei den Hexosen erfolgte dies bereits nach 48 h Kultivierung und somit 12 h

früher. Beim Wachstum auf Galaktose wurde nur eine maximale OD600 von 5,5 erzielt.

Jedoch verblieb der Stamm am längsten in der stationären Wachstumsphase. Ein

gegensätzliches Bild zeigte sich beim Wachstum auf Mannose. Die maximale OD600 von 8,4

entsprach in etwa der beim Wachstum auf Glukose (8,35), es folgte jedoch die deutlichste

Absenkung der OD600 bis zum Ende des Kultivierungsexperimentes auf 0,7.

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

MS-MES MMfvK

Ko

nze

ntr

atio

n [

mM

]

Ergebnisse 68

Abb. 3.16: Kultivierungsexperimente von C. acetobutylicum pTc::P(thlA)cbei_2100 auf verschiedenen C-

Quellen. 200 ml MS-MES, 120 h, 37 °C. Glukose ( ), Arabinose ( ), Xylose ( ), Mannose ( ), Galaktose ( ).

n = 3.

Die Abbildungen 3.17 und A10 zeigen die 1,4-BDO-Produktion von C. acetobutylicum

pTc::P(thlA)cbei_2100 in Abhängigkeit der verwendeten C-Quellen. Die Synthese von

1,4-BDO durch C. acetobutylicum erfolgte auf allen getesteten Substraten. Die

Konzentrationen waren jedoch niedriger als beim Wachstum auf Glukose. Die zweithöchste

1,4-BDO-Konzentration konnte auf Arabinose (0,3 mM) detektiert werden, welche ca. 44 %

höher war als auf Mannose (0,23 mM), gefolgt von Xylose (0,15 mM) und Galaktose

(0,11 mM). Die Einbußen gegenüber Glukose entsprachen dabei mindestens 27 %

(Arabinose) und maximal 73 % (Galaktose). Darüber hinaus verschob sich das 1,4-BDO-GHB-

Verhältnis weiter in Richtung GHB.

0,1

1

10

0 30 60 90 120

OD

60

0

0,1

1

10

0 30 60 90 120

OD

60

0

Zeit [h]

Ergebnisse 69

Abb. 3.17: 1,4-BDO- und GHB-Produktion von C. acetobutylicum pTc::P(thlA)cbei_2100 auf verschiedenen C-

Quellen. 200 ml MS-MES, 120 h, 37 °C. 1,4-BDO, GHB. * p < 0,05; ** p < 0,01. n = 3.

Die Fähigkeit von C. acetobutylicum pTc::P(thlA)cbei_2100 1,4-BDO aus verschiedenen C-

Quellen zu synthetisieren, ermöglichte den Einsatz von Kohlenhydratgemischen, welche der

Zusammensetzung landwirtschaftlicher Abfallstoffe entsprechen. Dadurch ist die

Anwendung von kostengünstigen und in hohen Mengen verfügbaren Substraten, wie

Lignocellulosehydrolysaten, für Fermentationsprozesse denkbar (Kuhad und Singh, 1993). In

Anlehnung an die Kohlenhydratzusammensetzung der Hemicellulose von Getreidestroh

wurde ein Kohlenhydratgemisch (39 % Glukose, 22 % Xylose, 5 % Arabinose, 3 % Galaktose

und 2 % Mannose) als Substrat für die Kultivierung eingesetzt. Ähnliche

Zusammensetzungen konnten auch für Reisstroh, Weizenstroh und Bagasse ermittelt

werden (Sarkar et al., 2012).

Wie aus der Abbildung 3.18 hervorgeht, konnte 1,4-BDO von C. acetobutylicum

pTc::P(thlA)cbei_2100 auf dem entsprechenden Kohlenhydratgemisch synthetisiert werden.

Dabei entsprach die gemessene 1,4-BDO-Konzentration der Ausbeute beim Wachstum auf

Xylose. Das Maximum von ca. 0,15 mM 1,4-BDO konnte nach 60 h detektiert werden. Wie

zuvor bereits festgestellt, begann die GHB-Synthese bereits während des exponentiellen

Wachstums und erreichte ein Maximum von 0,5 mM ebenfalls nach 60 h.

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Glukose Arabinose Xylose Mannose Galaktose

Ko

nze

ntr

atio

n [

mM

]

*

** **

**

**

Ergebnisse 70

Abb. 3.18: Zeitlicher Verlauf der 1,4-BDO- und GHB-Produktion von C. acetobutylicum pTc::P(thlA)cbei_2100.

200 ml MS-MES, Kohlenstoffgemisch (39 % Glukose, 22 % Xylose, 5 % Arabinose, 3 % Galaktose und 2 %

Mannose), 120 h, 37 °C. 1,4-BDO, GHB. n = 3.

3.5.3 Modifikation der 4HBD-Expression durch Verwendung

unterschiedlicher Promotoren

Die Expression von Genen wird maßgeblich von ihren jeweiligen Promotoren bestimmt.

Diese regulatorischen Elemente ermöglichen die genaue und effiziente Initiation der

Transkription sowie die Kontrolle der Genexpression (Ayoubi und Van de Ven, 1996). In

Abhängigkeit der Promotoren werden die Transkriptmenge und der Zeitpunkt der

Genexpression festgelegt. Durch den Austausch des thlA-Promotors (PthlA) gegen zwei

weitere clostridielle Promotoren (Phosphotransbutyrylase-Promotor [Pptb] und

Acetoacetatdecarboxylase-Promotor [Padc]) und einem artifiziellen Promotor (Pfac) (Heap et

al., 2007) sollten die Transkriptmengen und der Zeitpunkt der 4HBD-Expression variiert

werden. Dies diente der Überprüfung, ob eine mutmaßliche Erhöhung der Transkriptmenge

und eine auf den Wachstumsverlauf abgestimmte Expression der 4HBDs einen Einfluss auf

die 1,4-BDO-Produktion hatten.

Zeit [h]0 20 40 60 80 100 120

OD

60

0

0,1

1

10

Ko

nze

ntr

ati

on

[m

M]

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Ergebnisse 71

Der thlA-Promotor, welcher standardmäßig im pTc-Vektorsystem vorlag, ermöglichte eine

konstitutive Expression der 4HBDs und zeigt eine konstant hohe Aktivität (Girbal et al., 2003;

Schulz, 2013). Im Gegensatz dazu besitzt der adc-Promotor neben einem Aktivitätsmaximum

in der späten exponentiellen Wachstumsphase auch ein konstantes Aktivitätslevel während

der solventogenen Phase (Girbal et al., 2003). Als gegensätzliche Strategie wurde der ptb-

Promotor verwendet, welcher vor allem mit der frühen Acidogenese assoziiert ist (Tummala

et al., 1999; Girbal et al., 2003). Bei dem dritten eingesetzten Promotor handelte es sich um

den artifiziellen fac-Promotor (Heap et al., 2007), bestehend aus einem lacO-Operator aus

E. coli und dem fdx-Promotor des Ferredoxingens aus C. pasteurianum. Der fac-Promotor

zeichnete sich unter anderem durch ein hohes Expressionslevel von heterologen Genen in

Clostridien aus (Heap et al., 2007).

3.5.3.1 Vektorgenerierung

Als Ausgangspunkt für die Generierung der Plasmide pT::P(ptb)cbei_2100,

pT::P(adc)cbei_2100, pT::P(fac)cbei_2100, pT::P(ptb)ckl_3020, pT::P(adc)ckl_3020,

pT::P(fac)ckl_3020, pT::P(ptb)abfD, pT::P(adc)abfD und pT::P(fac)abfD (Abb. A11) dienten die

von Schulz (2013) erzeugten Vektoren pT::P(ptb)pp2, pT::P(adc)pp2, pT::P(fac)pp2

(Abb. A12).

Die notwendigen Anpassungsschritte bei der Vektorherstellung sind in der Abbildung 3.19

dargestellt.

Für die Klonierung der Gene cbei_2100 und ckl_3020 wurden die Ausgangs-Vektoren (Schulz,

2013) mit den Restriktionsenzymen BamHI und KasI verdaut (I). Dies führte zur Entfernung

des Reporterproteingens pp2. Parallel dazu wurden die Vektoren pTc::P(thlA)cbei_2100 und

pTc::P(thlA)ckl_3020 ebenfalls mit BamHI und KasI hydrolysiert (II). Nach Auftrennung der

Fragmente in einem 2 %igem Agarosegel und einer anschließenden Gelelution wurden die

beiden 4HBD-kodierenden Gene (cbei_2100 und ckl_3020) in einer nachfolgenden

Ligationsreaktion (2.8.3.3) in die vorbereiteten Vektoren (I) ligiert (III).

Ergebnisse 72

Abb. 3.19: Schematische Darstellung der Vektorherstellung mit unterschiedlichen Promotoren. (x), ptb-, adc-,

bzw. fac-Promotor. Erläuterungen siehe Text.

+ Vektor pp2

pT::P(x)pp2

EmR

bla

repL

SacI

pp2

Promotor

pBR322

BamHI

KasI

catP

PthlA KasI

BamHI

pTc::cbei_2100

KasI PthlA

catP

BamHI

NheI_BamHI

SacI

Promotor

pT::P(x)ckl_3020 Promotor

BamHI

KasI Strep-tag II

SacI

pT::P(x)cbei_2100 BamHI

KasI Strep-tag II

SacI

Strep-tag II KasI

SacI

NheI

SacI

NheI BamHI

KasI

NheI

KasI abfD

Strep-tag

pTc::ckl_3020

(I)

(II)

(IV)

(V)

pTc::ckl_3020

pT::P(x)pp2

pT::P(x)abfD

(III)

(VI)

(VII)

Ergebnisse 73

Da der Vektor pTc::P(thlA)abfD über eine BamHI-Schnittstelle innerhalb des Genbereichs

verfügte, wurden die entsprechenden Promotorbereiche der Vektoren pT::P(ptb)pp2,

pT::P(adc)pp2 und pT::P(fac)pp2 über eine PCR amplifiziert (IV). Die verwendeten

Oligonukleotide (Tab. 2.4) waren mit einer zusätzlichen NheI-Erkennungsstelle ausgestattet,

sodass die beiden Schnittsequenzen für BamHI und NheI in den amplifizierten

Promotorbereichen direkt aufeinander folgend waren. Die so veränderten

Promotorbereiche wurden ebenso wie die jeweiligen Vektoren (pT::P(ptb)pp2, pT::P(adc)pp2

und pT::P(fac)pp2) mit den Restriktionsenzymen BamHI und SacI verdaut und in einer

anschließenden Ligationsreaktion in die Vektoren kloniert (V). Die resultierenden Vektoren

entsprachen somit den Ausgangsvektoren pT::P(ptb)pp2, pT::P(adc)pp2 und pT::P(fac)pp2

mit der Ausnahme einer zusätzlichen NheI-Erkennungsstelle. Mittels PCR wurde das abfD-

Gen mit zugehöriger Strep-tag II-Sequenz des Vektors pTc::P(thlA)abfD amplifiziert (VI).

Anschließend folgten die Restriktionen des amplifizierten Genbereiches und der zuvor

veränderten Vektoren mit NheI und KasI und die Klonierung des abfD-Gens in die

vorbereiteten Vektoren (VII).

Die korrekte Integration der Promotoren und Gene in die jeweiligen Vektoren wurde durch

Sequenzierung (LGC Genomics) mit Promotor- und genspezifischen Oligonukleotiden

(Tab. 2.4) bestätigt.

Die generierten Vektoren wurden nach einer in vivo Methylierung in E. coli ER2275 (2.8.3.4)

für die Transformation von C. acetobutylicum (2.9.2) eingesetzt. Die Verifizierung

rekombinanter Klone erfolgte im Anschluss mittels Colony-PCR, SDS-PAGE und Western Blot-

Analysen (Abb. A13-15). Weiterhin wurden die rekombinanten C. acetobutylicum-Stämme

wachstumsphysiologisch charakterisiert (Tab. A3) und im Hinblick auf die 1,4-BDO-

Produktion analysiert (3.5.3.2).

3.5.3.2 1,4-BDO-Produktion rekombinanter C. acetobutylicum-Stämme

Anhand der Abbildung 3.20 ist ersichtlich, dass die unter 3.5.3 generierten

C. acetobutylicum-Stämme in der Lage waren, 1,4-BDO zu synthetisieren.

Ergebnisse 74

Abb. 3.20: 1,4-BDO- und GHB-Produktion rekombinanter C. acetobutylicum-Stämmen nach 120 h

Kultivierung in 200 ml MS-MES. 1,4-BDO, GHB. * p < 0,05; ** p < 0,01. n = 3. Erläuterungen siehe Text.

Der ptb-Promotor in Kombination mit dem Gen cbei_2100 hatte im Vergleich zum thlA-

Promotor (0,46 mM) eine leicht verringerte 1,4-BDO-Bildung (0,37 mM) zur Folge

(Abb. 3.20). Im Gegensatz dazu konnte durch die Verwendung des adc-Promotors bei

cbei_2100 eine geringfügige Zunahme in der 1,4-BDO-Konzentration (0,49 mM) festgestellt

werden. In diesem Fall war das 1,4-BDO-GHB-Verhältnis mit ca. 1:1 nahezu ausgeglichen. Am

auffälligsten war jedoch die deutliche Abnahme der gemessenen 1,4-BDO-Konzentration

unter Verwendung des fac-Promotors, sowohl beim Stamm C. acetobutylicum

pT::P(fac)cbei_2100 (0,062 mM) als auch bei C. acetobutylicum pT::P(fac)ckl_3020 (0,04 mM)

und C. acetobutylicum pT::P(fac)abfD (0,02 mM). Bei den beiden zuletzt genannten

Stämmen war ebenso die GHB-Bildung massiv beeinträchtigt.

Bei den Stämme C. acetobutylicum pT::P(ptb)ckl_3020 und C. acetobutylicum

pT::P(adc)ckl_3020 besaßen die Promotoren Pptb und Padc einen positiven Effekt auf die

1,4-BDO-Produktion. Deren jeweiligen 1,4-BDO-Ausbeuten waren im Vergleich zum thlA-

Promotor um 237 % bzw. 132 % erhöht. Insbesondere der Stamm C. acetobutylicum

pT::P(ptb)ckl_3020 zeigte die bisher höchste Konzentration an 1,4-BDO mit 0,62 mM und

einem 1,4-BDO-GHB-Verhältnis von 1 : 0,5 und ist damit der einzige Stamm, bei dem die

1,4-BDO-Konzentration höher war als die von GHB.

Die gemessenen 1,4-BDO-Konzentrationen der Stämme mit dem abfD-Gen waren im

Vergleich zu den Stämmen mit den Genen cbei_2100 und ckl_3020 am niedrigsten. Der

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0K

on

zen

trat

ion

[m

M]

**

**

* *

** ** **

**

Ergebnisse 75

Einsatz verschiedener Promotoren führte bei jenen Stämmen zu keiner wesentlichen

Erhöhung der 1,4-BDO-Produktion. Im Gegensatz dazu war das 1,4-BDO-GHB-Verhältnis

deutlich auf Seiten des GHBs. Weiterhin wurden bei diesen Stämmen die höchsten

Konzentrationen an GHB gemessen, insbesondere beim Stamm C. acetobutylicum

pT::P(ptb)abfD mit 0,86 mM.

Im Wesentlichen veränderte sich die 1,4-BDO-Konzentration mit den Genen cbei_2100 und

abfD trotz verschiedener Promotoren (Pptb und Padc) nicht. Im Gegensatz dazu führten diese

beiden Promotoren in Kombination mit dem Gen ckl_3020 zu einer Steigerung der 1,4-BDO-

Bildung. Insbesondere mit dem ptb-Promotor konnte eine deutliche Zunahme von 238 % an

1,4-BDO im Vergleich zum Referenzstamm C. acetobutylicum pTc::P(thlA)ckl_3020

verzeichnet werden. Einen deutlichen negativen Effekt konnte bei allen drei Synthesegenen

unter Einfluss des fac-Promotors beobachtet werden, sodass dieser für zukünftige Arbeiten

ausgeschlossen wurde. Desweiteren ist die Verwendung des abfD-Gens aufgrund der

geringen 1,4-BDO-Bildung ebenfalls als ungeeignet einzustufen.

3.5.4 Stoffwechseldefektmutanten von C. acetobutylicum ATCC 824

Aufgrund der Nebenproduktbildung, welche die Gesamtausbeute an 1,4-BDO verringern

kann, wurde im Folgenden auf bereits zuvor erzeugte Stoffwechseldefektmutanten

(Tab. 2.1) (Lehmann, 2012 a) zurückgegriffen. Diese zeichneten sich unter anderem dadurch

aus, dass sowohl die Produktion der Säuren Acetat und Butyrat als auch die Bildung der

Lösungsmittel Aceton, Butanol und Ethanol durch den Funktionsverlust bestimmter Gene

nahezu ausgeschaltet werden konnte (Lehmann et al., 2012 b und c).

Da der Vektor pTc::P(thlA)cbei_2100 (Abb. 3.7) die bisher höchste 1,4-BDO-Produktion

ermöglichte (Abb. 3.12), wurde dieser für die Transformation der nachfolgenden

Stoffwechseldefektmutanten eingesetzt.

3.5.4.1 C. acetobutylicum-Mutanten mit Defekten in der Säurebildung

Die Eingangsenzyme für die Produktion der Säuren Acetat und Butyrat sind die

Phosphotransacetylase (Pta) und die Phosphotransbutyrylase (Ptb) (Abb. 3.21). Durch

Ergebnisse 76

Ausschalten der entsprechenden Gene konnte die Acetat- bzw. Butyrat-Bildung stark

verringert werden (Lehmann et al., 2012 b und c).

Darüber hinaus wurden neben den Pta- und Ptb-Defektmutanten (C. actobutylicum

pta::int(80) und C. acetobutylicum ptb::int(87)) auch die Ldh1- und Ldh2-Mutanten

(C. acetobutylicum ldh1::int(93) und C. acetobutylicum ldh2::int(231)), (Lehmann, 2012 a) für

die Untersuchungen herangezogen (Abb. 3.21). Die Laktatdehydrogenasen sind für die

Laktatbildung unter Verbrauch von NADH+H+ verantwortlich und stehen somit in Konkurrenz

zur 1,4-BDO-Synthese.

Abb. 3.21: Gärungsstoffwechsel von C. acetobutylicum. Inaktivierte Enzyme werden durch ein rotes X

gekennzeichnet. Ldh, C. acetobutylicum ldh1::int(93) bzw. C. acetobutylicum ldh2::int(231); Pta,

C. acetobutylicum pta::int(80) und Ptb, C. acetobutylicum ptb::int(87). Erläuterungen siehe Text. Abkürzungen:

Ac-CoA, Acetyl-CoA; Acetyl-P, Acetyl-Phosphat; AcAld, Acetaldehyd; AcAC-CoA, Acetoacetyl-CoA; AcAc,

Acetoacetat; 3HB-CoA, 3-Hydroxybutyryl-CoA; 4HB-CoA, 4-Hydroxybutyryl-CoA; BuAld, Butyraldehyd; Butyryl-P,

Butyryl-Phosphat, Ack, Acetatkinase; Buk, Butyratkinase; 4-HBD, 4-Hydroxybutyryl-CoA Dehydratase; AdhE,

Aldehyd/Alkoholdehydrogenase.

Die Abbildung 3.22 zeigt die 1,4-BDO-Produktion transformierter Rezipientenstämme. Es ist

ersichtlich, dass die 1,4-BDO-Konzentration durch Verwendung von Stoffwechselmutanten

mit Defekten in der Säurebildung nicht gesteigert werden konnte. Stattdessen kam es zu

einer Verringerung der 1,4-BDO-Produktion, im deutlichsten Fall um bis zu 81 %

(C. acetobutylicum ptb::int(87) pTc::P(thlA)cbei_2100: 0,079 mM) im Vergleich zum

Ergebnisse 77

Referenzstamm C. acetobutylicum pTc::P(thlA)cbei_2100. Die Einbußen der übrigen

Rezipientenstämme lagen zwischen 53-69 %. Dabei konnte beim Pta::int-Rezipientenstamm

die höchste 1,4-BDO-Konzentration mit 0,192 mM detektiert werden. Im Gegensatz zur

1,4-BDO-Produktion konnte eine Erhöhung der GHB-Konzentration mit Ausnahme des

Pta::int-Rezipientenstammes festgestellt werden. Bei den beiden Stämmen

C. acetobutylicum ptb::int(87) pTc::P(thlA)cbei_2100 und C. acetobutylicum ldh2::int(231)

pTc::P(thlA)cbei_2100 stiegen die GHB-Konzentrationen (0,71 mM bzw. 0,73 mM) um ca.

75 % im Vergleich zum Referenzstamm (0,49 mM).

Abb. 3.22: 1,4-BDO- und GHB-Produktion rekombinanter C. acetobutylicum-Mutanten. 200 ml MS-MES,

120 h, 37 °C. thlA cbei, C. acetobutylicum pTc:P(thlA)cbei_2100; pta::int, C. acetobutylicum pta::int(80)

pTc::P(thlA)cbei_2100; ptb::int, C. acetobutylicum ptb::int(87) pTc::P(thlA)cbei_2100; ldh1::int,

C. acetobutylicum ldh1::P(thlA)int(93) pTc::cbei_2100; ldh2::int, C. acetobutylicum ldh2::int(231)

pTc::P(thlA)cbei_2100. 1,4-BDO, GHB. n = 2.

3.5.4.2. C. acetobutylicum-Mutanten mit Defekten in der Lösungsmittelbildung

Nach Einsetzen des „Lösungsmittelshifts“ produziert C. acetobutylicum die Lösungsmittel

Aceton, Butanol und Ethanol (Jones und Woods, 1986). Durch deren Bildung wird der

Kohlenstofffluss mutmaßlich nur in geringem Maße in Richtung 1,4-BDO-Synthese gelenkt,

wodurch es zu einer Limitation kommen kann.

Bei den verwendeten Lösungsmitteldefektmutanten (Abb. 3.23) handelte es sich zum einen

um die Mutante C. acetobutylicum adc::int(180), bei welcher neben einer drastischen

Reduzierung der Acetonbildung auch eine Verringerung in der Butanol- und

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

thlA cbei pta::int ptb::int ldh1::int ldh2::int

Ko

nze

ntr

atio

n [

mM

]

Ergebnisse 78

Ethanolkonzentration festgestellt werden konnte (Lehmann et al., 2012 b). Zum anderen

wurde die Mutante C. acetobutylicum ctfA::int(352) eingesetzt, da diese sich ebenfalls durch

eine deutlich verringerte Lösungsmittelproduktion auszeichnete (Lehmann et al., 2012 b).

Desweiteren wurden Mutanten mit Defekten in der Aldehyd/Alkoholdehydrogenase (AdhE,

C. acetobutylicum adhE1::int(158) und C. acetobutylicum adhE2::int(114)), (Lehmann 2012 a)

ausgewählt, um zu überprüfen, inwieweit die AdhE2 essentiell für die 1,4-BDO-Bildung ist

(Yim et al., 2011).

Abb. 3.23: Gärungsstoffwechsel von C. acetobutylicum. Inaktivierte Enzyme werden durch ein rotes X

gekennzeichnet. Adc, C. acetobutylicum adc::int(180), AdhE, C. acetobutylicum adhE1::int(158) bzw.

C. acetobutylicum adhE2::int(114) ; CtfAB, C. acetobutylicum ctfA::int(352). Erläuterungen siehe Text.

Abkürzungen: Ac-CoA, Acetyl-CoA; Acetyl-P, Acetyl-Phosphat; AcAld, Acetaldehyd; AcAC-CoA, Acetoacetyl-CoA;

AcAc, Acetoacetat; 3HB-CoA, 3-Hydroxybutyryl-CoA; 4HB-CoA, 4-Hydroxybutyryl-CoA; BuAld, Butyraldehyd;

Butyryl-P, Butyryl-Phosphat, 4-HBD, 4-Hydroxybutyryl-CoA Dehydratase.

Die Abbildung 3.24 gibt Aufschluss über die 1,4-BDO- und GHB-Produktion transformierter

C. acetobutylicum-Defektmutanten. Es zeigte sich, dass die 1,4-BDO-Konzentrationen in den

Lösungsmitteldefektmutanten im Vergleich zum Referenzstamm verringert waren. Die

Einbußen lagen dabei im Bereich von 66 - 86 %. Der Stamm C. acetobutylicum adc::int(180)

pTc::P(thlA)cbei_2100 produzierte mit 0,14 mM am meisten 1,4-BDO. Bei den weiteren

Mutantenstämmen lagen die 1,4-BDO-Konzentrationen unter 0,1 mM. Die gemessenen

GHB-Konzentrationen waren ebenfalls verringert, welche jedoch weniger deutlich

Ergebnisse 79

ausgeprägt waren im Vergleich zum 1,4-BDO. Eine Ausnahme bildete dabei jedoch der

Stamm C. acetobutylicum adc::int(180) pTc::P(thlA)cbei_2100, welcher mit 0,73 mM 78 %

mehr GHB produzierte als der Referenzstamm.

Abb. 3.24: 1,4-BDO- und GHB-Produktion rekombinanter C. acetobutylicum-Mutanten. 200 ml MS-MES,

120 h, 37 °C. thlA cbei, C. acetobutylicum pTc::P(thlA)cbei_2100; adc::int, C. acetobutylicum adc::int(180)

pTc::P(thlA)cbei_2100; adhE1::int, C. acetobutylicum adhE1::int(158) pTc::P(thlA)cbei_2100; adhE2::int,

C. acetobutylicum adhE2::int(114) pTc::P(thlA)cbei_2100; ctfA::int, C. acetobutylicum ctfA::int(352)

pTc::P(thlA)cbei_2100. 1,4-BDO, GHB. n = 2.

Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die Verwendung von Stoffwechselmutanten

keine erhöhte 1,4-BDO-Produktion zur Folge hatte, auch wenn die Nebenproduktbildung

eingeschränkt gewesen ist.

Es bleibt abschließend festzuhalten, dass die rekombinanten C. acetobutylicum-Stämme,

welche das Gen cbei_2100 besaßen, eine konstante und hohe 1,4-BDO-Produktion

ermöglichten (ca. 0,45 mM). Daher eignet sich Cbei_2100 am besten von den drei 4HBDs zur

Produktion von 1,4-BDO in C. acetobutylicum. Desweiteren war der Stamm

C. acetobutylicum pT::P(ptb)ckl_3020 der einzige, bei dem das Verhältnis 1,4-BDO zu GHB

auf Seiten des 1,4-BDOs war (1 : 0,5). Dieser stellt somit einen weiteren vielversprechenden

Kandidaten für zukünftige Arbeiten dar. Die Volumenerhöhung und die Verwendung von

Stoffwechseldefektmutanten führten jedoch zu keinem Anstieg der 1,4-BDO-Produktion.

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

thlA cbei adc::int adhE1::int adhE2::int ctfA::int

Ko

nze

ntr

atio

n [

mM

]

Diskussion 80

4. Diskussion

Die heutige Weltwirtschaft ist überwiegend von verschiedenen fossilen Energiequellen, wie

Öl, Kohle und Gas abhängig (Sarkar et al., 2012). In Anbetracht der steigenden

Weltbevölkerung und dem damit einhergehenden Anstieg des Energiebedarfs und der

Ausbeutung nicht-erneuerbarer Energiequellen wird ein kritischer Punkt im Hinblick auf

Nachhaltigkeit und Klimawandel erreicht. Alternative Strategien, wie die Nutzung

erneuerbarer Ressourcen für die biotechnologische Produktion von Treibstoffen und

Basischemikalien, könnten dieser Situation entgegenwirken.

In den letzten Jahrzehnten wurde eine Vielzahl verschiedenster Forschungen auf dem Gebiet

der mikrobiellen Produktion von Chemikalien durchgeführt, welche zukünftig mit der

Petrochemie konkurrieren könnten (u.a. Biebl et al., 1999; Nakamura und Whited, 2003; Ma

et al., 2009; Zhang et al., 2010). Dabei wurden oft gut erforschte Mikroorganismen wie

Saccharomyces cerevisiae, Escherichia coli oder Klebsiella oxytoca durch genetische

Veränderungen des Genoms zu Produktionsstämmen modifiziert und beständig optimiert

(Nissen et al., 2000; Ji et al., 2010; Clomburg und Gonzalez, 2011). Aufgrund der Fähigkeit

zur Bildung der Lösungsmittel Aceton, Butanol und Ethanol rückte ebenso C. acetobutylicum

wieder in den Fokus und bedingte so die Entwicklung neuer genetischer

Manipulationstechniken (Desai & Papoutsakis, 1999; Papoutsakis, 2008; Lütke-Eversloh &

Bahl, 2011). Diese verbesserten das Verständnis über den Metabolismus von

C. acetobutylicum und führten zu „Metabolic Engineering“-Strategien, die gezielt den

Stoffwechsel veränderten (Lehmann et al., 2012 b und c). So kann auch die Synthese von

Verbindungen, welche natürlicherweise nicht in einem Organismus vorkommen, in Betracht

gezogen werden. Hierzu zählt unter anderem das bisher ausschließlich petrochemisch

erzeugte 1,4-Butandiol, welches im industriellen Großmaßstab mit 1,3 Mio. Tonnen pro Jahr

für die Produktion von Plastik und Polyester eingesetzt wird (Yim et al., 2011). Durch die

zusätzliche genetische Information zur heterologen Expression der 4HBD und der damit

einhergehenden Veränderung des Stoffwechsels von C. acetobutylicum sollte diese

Verbindung auf biologische Weise und damit unabhängig von den bisher genutzten

petrochemischen Verfahren erzeugt werden.

Diskussion 81

4.1 1,4-Butandioltoleranz

Alkohole und andere organische Lösungsmittel, wie Aromate und Phenole, besitzen eine

toxische Wirkung auf die Zellen, sodass die mikrobielle Produktion dieser Chemikalien

limitiert wird (Isken und de Bont, 1998; Tomas et al., 2003). Die Akkumulation von

organischen Lösungsmitteln führt unter anderem zu einer Permeabilisierung der

Zellmembran und zu einem passiven Flux von ATP, Protonen und Ionen (Sikkema et al.,

1995). Dadurch kommt es zum Zusammenbruch der Protonenmotorischen Kraft sowie des

Protonengradienten, was wiederum einen Einbruch im Energieaushalt der Zelle nach sich

zieht (Tomas et al., 2003).

Ähnliche Effekte konnten auch bei C. acetobutylicum in Gegenwart von Butanol beobachtet

werden (Bowles und Ellefson, 1985). Butanol bewirkt aufgrund seiner chaotrophen Wirkung

auf die Zellmembran eine Änderung in der Phospholipidzusammensetzung (Ingram, 1976;

Vollherbst-Schneck et al., 1984; Baer et al., 1987) und führt letztlich zu ihrer Zerstörung.

Dadurch ist die Zelle nicht mehr in der Lage, den intrazellulären pH-Wert sowie das

Membranpotential aufrechtzuerhalten (Tomas et al., 2003). Die Aktivitäten der

membrangebundenen ATPase, der Glukose-Aufnahmesysteme und Nährstofftransporter

kommen zum Erliegen (Bowles und Ellefson, 1985). Aufgrund dessen ist die Produktion von

Butanol bei C. acetobutylicum auf etwa 13 g/l limitiert (Jones und Woods, 1986).

Im Gegensatz dazu zeigte sich, dass C. acetobutylicum in der Lage ist, bis zu 5 % an

extrazellulärem 1,4-BDO zu tolerieren. Erste wachstumsinhibierende Effekte traten ab einer

Konzentration von 54 g/l auf (3.1). Damit ist die Toleranzgrenze gegenüber 1,4-BDO ca.

viermal höher als gegenüber Butanol, wenn 1,4-BDO der alleinige Stressfaktor ist. Ein

ähnliches Toleranzverhalten gegenüber 1,4-BDO konnte auch bei E. coli beobachtet werden.

Dessen natürliche Toleranz liegt ebenfalls bei 5 - 6 %, welche durch entsprechende

Adaptationsversuche auf > 10 % angehoben werden konnte (Burk, 2010). Die hohen

biotechnologischen Produktionen anderer Diole deuten auf ebenso hohe Toleranzwerte der

entsprechenden Organismen hin (Zeng und Sabra, 2011). So ist beispielsweise ein

rekombinanter E. coli-Stamm in der Lage, über 130 g/l 1,3-Propandiol (1,3-PDO) zu

produzieren (Nakamura und Whited, 2003). In vergleichbaren Konzentrationen wird

2,3-Butandiol (2,3-BDO) von Klebsiella pneumoniae (130 g/l) bzw. Serratia marcescens

(152 g/l) synthetisiert (Ma et al., 2009; Zhang et al., 2010).

Diskussion 82

Die Toleranz von Mikroorganismen gegenüber Diolen scheint dabei deutlich höher zu sein

als gegenüber Alkoholen. Somit sind Diole im Vergleich zum chemisch ähnlichen Butanol

vermeintlich weniger toxisch für die Zellen. Die Toxizität einer Verbindung korreliert dabei

mit dem Oktanol-Wasser-Koeffizienten (log Pow) (De Bont, 1998). Dieser beschreibt das

Verhältnis der Konzentration einer Substanz in einem Zwei-Phasen-System bestehend aus

n-Oktanol und Wasser (Sangster, 1989) und ermöglicht Rückschlüsse über das Verhalten von

Verbindungen in lipophilen bzw. wässrigen Lösungen. Positive log Pow-Werte deuten auf eine

lipophile Verbindung hin, negative Werte auf eine hydrophile. Generell gilt, je geringer der

log Pow-Wert, desto weniger toxisch ist die Verbindung (Siemerink et al., 2011).

Verbindungen mit einem log Pow-Wert zwischen 1 und 5 sind stark toxisch für

Mikroorganismen (Isken und de Bont, 1998). Butanol mit einem log Pow-Wert von 0,8 (Inoue

und Horikoshi, 1989) besitzt einen positiven Wert und kann dementsprechend gut mit der

lipophilen Zellmembran interagieren, wodurch die zuvor beschriebenen Effekte auf die

Membran hervorgerufen werden. Diole, wie 1,3-PDO, 2,3-BDO und 1,4-BDO, hingegen

besitzen negative log Pow-Werte (-1,0; -0,92 bzw. -0,8) (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov).

Diese sind bis zu einer Einheit niedriger als beim Butanol. Dies bedeutet, dass Diole folglich

schlechter mit der Membran interagieren können und so ein toxischer Effekt dieser

Verbindungen erst bei deutlich höheren Konzentrationen auftritt.

4.2 1,4-Butandiolproduktion

Die heterologe Expression der 4-Hydroxybutyryl-CoA Dehydratase/Vinylacetyl-CoA-∆-

Isomerase (4HBD) generierte einen Abzweig im Stoffwechsel von C. acetobutylicum

(Abb. 1.3) und befähigt die rekombinanten Stämme, 1,4-BDO auf biologischem Wege unter

Nutzung von nachwachsenden Rohstoffen zu produzieren. Dabei lagen die Ausbeuten in

Abhängigkeit der drei in dieser Arbeit heterolog in C. acetobutylicum exprimierten 4HBD-

kodierenden Gene (abfD, cbei_2100 und ckl_3020) im Bereich von ca. 0,1 - 0,5 mM

(9 - 45 mg/l) (Abb. 3.12). Ähnliche Konzentrationen wurden bei den frühen rekombinanten

E. coli-Stämmen von Hwang et al. (2014) (29 mg/l) und Yim et al. (2011) (54 mg/l) erzielt. Im

Falle von E. coli konnten durch Anpassungen und Veränderungen die Produktionen auf

0,66 g/l (Hwang et al., 2014) bzw. 18 g/l (Yim et al., 2011) erhöht werden. Um gegenüber der

Diskussion 83

chemischen Erzeugung von 1,4-BDO wettbewerbsfähig zu sein, wird eine biotechnologische

Produktionsleistung von > 100 g/l, wie bei 1,3-PDO und 2,3-BDO, vorausgesetzt (Zeng und

Sabra, 2011). Die hier bisher erzielten Konzentrationen sind noch deutlich geringer. Sie

zeigten aber erstmalig die prinzipielle Realisierbarkeit der anaeroben 1,4-BDO-Synthese

durch C. acetobutylicum und stellen damit die Grundlage für die weitere Optimierungen dar.

Allerdings ist die Produktion von 1,4-BDO von verschiedenen Faktoren beeinflussbar, welche

die Gesamtausbeute limitieren können. Da sie für die weitere Strategie essentiell sind, sollen

die Faktoren im Folgenden erörtert werden.

4.2.1 Limitierung durch die 4HBD

Zu den limitierenden Faktoren zählt unter anderem das Eingangsenzym der 1,4-BDO-

Synthese, die 4HBD. Dieses Enzym katalysiert die reversible Reaktion von 4-Hydroxybutyryl-

CoA (4-HB-CoA) zu Crotonyl-CoA (Willadsen und Buckel, 1990; Scherf und Buckel, 1993;

Scherf et al., 1994; Müh et al., 1996; Martins, 2004). Dabei liegt die Gleichgewichtskonstante

der Reaktion mit K = 4,2 deutlich auf Seiten von Crotonyl-CoA (Scherf und Buckel, 1993). Die

Bevorzugung der Crotonyl-CoA-Bildung spiegelt sich ebenfalls in der Kinetik der reversiblen

Dehydratation von 4-HB-CoA wider. Während ca. 80 % des 4-HB-CoA durch die 4HBD zu

Crotonyl-CoA umgewandelt wird, beträgt der Anteil der Rückreaktion (Crotonyl-CoA zu

4-HB-CoA) gerade einmal 20 % (Scherf und Buckel, 1993). Eine Ursache für die Begünstigung

der Crotonyl-CoA-Bildung könnte die höhere Stabilität von Crotonyl-CoA im Vergleich zu

4-HB-CoA sein (Müh et al., 1996).

Darüber hinaus ist die spezifische Aktivität der 4HBD für 4-HB-CoA mit 209 nkat/mg relativ

niedrig (Scherf und Buckel, 1993). In der Regel liegt die spezifische Aktivität von Enzymen

zumeist zwischen 1 - 2 µkat/mg (Scherf und Buckel, 1993), wie z. B. die am

Primärstoffwechsel von C. acetobutylicum beteiligte Thiolase (3,6 µkat/mg; Wiesenborn et

al., 1988). Die Aktivität der 4HBD ist somit um den Faktor 5 bis 10 niedriger. Um dies zu

kompensieren, ist die 4HBD das dominierende Enzym im Cytosol mit einem Anteil von

20 - 25 % in C. aminobutyricum (Scherf und Buckel, 1993). Durch die in dieser Arbeit

erzielten heterologen Expressionen der 4HBDs in C. acetobutylicum (Abb. 3.9 und Abb. A14)

ist dieser hohe Anteil nicht gegeben, sodass die geringe spezifische Aktivität des Enzyms

nicht durch die Proteinmenge ausgeglichen werden konnte.

Diskussion 84

Das bedeutet, eine geringe Enzymmenge und die Bevorzugung der Crotonyl-CoA-Bildung

durch die 4HBD lassen in direkter Konsequenz auch nur wenig 4-HB-CoA erwarten und in der

Folge auch nur minimale Mengen an 1,4-BDO.

4.2.2 Limitierung durch die Aldehyd-/Alkoholdehydrogenase (AdhE)

Desweiteren können die beiden nachfolgenden Reduktionsreaktionen von 4-HB-CoA über

4-Hydroxybutyraldehyd zum 1,4-BDO, welche durch die bifunktionelle Aldehyd-/Alkohol-

Dehydrogenase (AdhE) von C. acetobutylicum katalysiert werden, limitierend wirken.

Bereits 1986 stellten Jewell et al. fest, dass der Wildtyp von C. acetobutylicum in der Lage ist,

externes 4-Hydroxybutyrat (4-HB bzw. GHB) zu 1,4-BDO zu verstoffwechseln. Die

verantwortlichen Gene bzw. Enzyme waren jedoch noch nicht identifiziert. Erst 2011 wurde

durch Yim et al. die Beteiligung der AdhE2 von C. acetobutylicum an der Bildung von 1,4-BDO

nachgewiesen. Dies stellte bisher das einzige Enzym dar, welches unter in vivo Bedingungen

dazu befähigt war. Entsprechende Untersuchungen hinsichtlich der Enzymaktivität zeigten

eine spezifische Aktivität von 2,5 - 4,8 U/mg (Yoo et al., 2015). Bei der Nutzung eines nicht-

natürlichen Substrates wird die Umwandlungseffizienz jedoch deutlich herabgesetzt.

Darüber hinaus wird die AdhE2 im Gegensatz zur AdhE1 spezifisch in alkohologenen Kulturen

exprimiert, welche sich durch die Bildung von Ethanol und Butanol, aber nicht von Aceton,

auszeichnen (Fontaine et al., 2002). Dieses metabolische Stadium wird beim Wachstum bei

neutralem pH-Wert und unter hoher NAD(P)H-Verfügbarkeit eingeleitet und unterscheidet

sich somit vom solventogenen Zustand, in dem die Lösungsmittel Aceton, Butanol und

Ethanol in der Regel bei saurem pH-Wert produziert werden (Fontaine et al., 2002), welches

den Kulturbedingungen in dieser Arbeit entspricht. Untersuchungen konnten zeigen, dass

während des solventogenen Zustands der Proteinanteil der AdhE2 in der Zelle

verschwindend gering ist und der Anteil an der Butanolbildung gerade einmal 5 - 9 % beträgt

(Yoo et al., 2015). Ein anderes Bild zeigt sich jedoch beim alkohologenen Stadium. Dieses

wird ausschließlich mit 94 - 100 % Beteiligung an der Butanolbildung von der AdhE2

dominiert (Yoo et al., 2015). Das bedeutet, dass die Verfügbarkeit des mutmaßlich

hauptverantwortlichen Enzyms (AdhE2) für die beiden finalen Syntheseschritte der 1,4-BDO-

Bildung unter den solventogen Bedingungen dieser Arbeit massiv eingeschränkt gewesen ist.

Dadurch wurde die 1,4-BDO-Synthese vermutlich negativ beeinflusst. In diesem Fall könnte

Diskussion 85

sich die parallele Überexpression der AdhE2 in C. acetobutylicum anbieten, da auch Yim

et al. (2011) eine Zunahme der 1,4-BDO-Produktion bei erhöhter AdhE2-Expression

verzeichnen konnten. Desweiteren ist es möglich den alkohologenen Zustand der Kulturen

zu induzieren, indem einerseits der pH-Wert auf pH 6,5 reguliert und andererseits Glycerol

als zusätzliches Substrat eingesetzt wird. Glycerol ist im Vergleich zur Glukose deutlich

stärker reduziert und setzt bei der Umwandlung zum Pyruvat doppelt so viel NADH frei

(Vasconcelos et al., 1994), welches über die NADH-Aufnahmewege (Butanol-/ Ethanol- bzw.

1,4-BDO-Bildung) oxidiert werden muss.

4.2.3 Codon Usage

Wie in Abschnitt 3.4.2 dargestellt, variierte die Produktion von 1,4-BDO der rekombinanten

C. acetobutylicum-Stämme in Abhängigkeit der 4HBD-kodierenden Gene (Abb. 3.12). Dabei

konnte unter Verwendung des Enzyms Cbei_2100 die höchste Konzentration an 1,4-BDO mit

0,46 mM detektiert werden, gefolgt von Ckl_3020 mit 0,26 mM und AbfD mit 0,13 mM.

Obwohl die Aminosäuren im katalytischen Zentrum bei allen drei 4HBDs konserviert sind

(Abb. A5), weichen die 1,4-BDO-Ausbeuten doch erheblich voneinander ab. Dies ist somit

nicht auf das katalytische Zentrum zurückzuführen. Da die 4HBDs untereinander nur bis zu

73 - 79 % übereinstimmen, scheinen die nicht-konservierten Aminosäuren einen Effekt auf

die Bildung der jeweiligen 4HBDs und damit auch auf die erzielbaren 1,4-BDO-

Konzentrationen zu haben. Zusätzlich zu den Aminosäuresequenzen unterscheiden sich die

4HBDs hinsichtlich ihres GC-Gehalts sowohl untereinander als auch zum Wirtsorganismus.

Dieser ist mit ca. 25 % (Cornillot et al., 1997) deutlich niedriger als die GC-Gehalte der 4HBDs

(Cbei_2100: 33,3 %, Ckl_3020: 35,4 % und AbfD: 41,5 %; http://www.bioinformatics.org/sms

2/codon_usage.html). Der GC-Gehalt beeinflusst dabei die Codon-Verteilung eines

Organismus (Gustafsson et al., 2004), welches wiederum einen Einfluss auf das Codon Usage

der 4HBDs hat.

Während bei der Translation von Cbei_2100 überwiegend die gleichen Codons wie in

C. acetobutylicum verwendet werden, variiert das Codon Usage bei Ckl_3020 etwas und bei

AbfD deutlich (Tab. A4). So werden bei Ckl_3020 die drei Aminosäuren Glutamin (Gln),

Aspartat (Asp) und Lysin (Lys) neben den mit dem Wirtsorganismus übereinstimmenden

Codons auch durch weitere synonyme Codons kodiert. Diese zweiten synonymen Codons

Diskussion 86

(CAG, GAC bzw. UGC) werden in C. acetobutylicum wesentlich seltener verwendet.

Besonders deutlich werden die Unterschiede beim Codon Usage zwischen AbfD und

C. acetobutylicum. Hier werden die Aminosäuren Phenylalanin (Phe), Isoleucin (Ile), Prolin

(Pro), Histidin (His), Glutamin (Gln), Asparagin (Asn), Lysin (Lys), Cystein (Cys) und Glycin

(Gly) bevorzugt von anderen Codons kodiert, die in C. acetobutylicum deutlich

unterrepräsentiert sind. Darüber hinaus werden die synonymen Codons der Aminosäuren

Serin (Ser), Tyrosin (Tyr) und Aspartat (Asp) mit ähnlich hoher Häufigkeit verwendet, wie die

bevorzugten in C. acetobutylicum.

Die Häufigkeit, in welcher die unterschiedlichen Codons verwendet werden, variiert dabei

deutlich zwischen den verschiedenen Organismen (Gustafsson et al., 2004, Hershberg und

Petrov, 2008), sodass ein unterschiedliches Codon Usage zum Teil gravierende Auswirkungen

auf die heterologe Proteinexpression haben kann (Kane, 1995; Kurland und Gallant, 1995;

Plotkin und Kudla, 2011). Dabei können Fehler im Ablauf der Proteinsynthese durch

Abstoppen der Ribosomen an Tripletts, welche bestimmte, seltene tRNA-Moleküle

benötigen, auftreten. Dies kann dazu führen, dass entweder die Synthese abbricht, eine

falsche Aminosäure eingebaut wird (Substitution) oder es zum „in-frame hopping“ kommt,

wodurch der Leserahmen um eine Position nach vorne oder hinten verschoben und damit

die Codonabfolge verändert wird (Kurland, 1991; Kurland und Gallant, 1995). Somit ist die

quantitative und qualitative Produktion des zu synthetisierenden Proteins reduziert (Kane,

1995). Die unterschiedliche Verwendung der Codons insbesondere bei AbfD im Vergleich

zum Wirtsorganismus kann daher die Proteinsynthese derart beeinträchtigen, dass

schlussendlich die finale 1,4-BDO-Konzentration am geringsten war. Abhilfe könnte der

Einsatz von synthetischen Genen, die auf den entsprechenden Wirtsorganismus abgestimmt

sind, bringen. Das „Protein-Engineering“ ist heutzutage eine gängige Strategie beim

„Metabolic-Engineering“. So konnte im Vergleich zum nativen Enzym durch eine Codon-

optimierte Variante die 1,4-BDO-Produktion in E. coli gesteigert werden (Yim et al., 2011).

4.3 GHB-Produktion

Neben 1,4-BDO konnte in den rekombinanten C. acetobutylicum-Stämmen GHB (0,49 mM,

0,66 mM bzw. 0,63 mM) nachgewiesen werden (Abb. 3.12). Dabei wurden höhere

Konzentrationen an GHB als an 1,4-BDO gemessen, wodurch das 1,4-BDO-GHB-Verhältnis

Diskussion 87

auf Seiten des GHB lag. Bei niedrigeren 1,4-BDO-Konzentrationen waren erhöhte GHB-

Konzentrationen feststellbar. Die GHB-Bildung konnte bereits während der exponentiellen

Wachstumsphase detektiert werden, wohingegen 1,4-BDO erst in der stationären Phase

vermehrt produziert wurde (Abb. 3.13).

GHB als Nebenprodukt wurde ebenso bei den Arbeiten von Yim et al., (2011) festgestellt. Die

GHB-Konzentrationen des frühen rekombinanten E. coli-Stammes waren mit 2,1 mM etwa

um den Faktor 3 höher als die des 1,4-BDOs (0,6 mM). Es wird angenommen, dass das GHB

spontan durch Abspaltung der CoA-Gruppe aus 4-HB-CoA entsteht (Yim et al., 2011)

(Abb. 4.1) und somit nur indirekt durch den Einsatz einer effizienteren Umwandlung von

4-HB-CoA zu 1,4-BDO beeinflusst werden kann.

Abb. 4.1: Schematische Darstellung der potentiellen Bildungswege von 4-Hydroxbutyrat (GHB).

Darüber hinaus könnte in C. acetobutylicum eine weitere theoretische Möglichkeit der GHB-

Bildung existieren. Ein bereits im Wirtsorganismus vorhandener und somit natürlicher

Stoffwechselweg ist die Umwandlung von Butyryl-CoA über Butyryl-Phosphat zu Butyrat

durch die beiden Enzyme Phosphotransbutyrylase (Ptb) und Butyratkinase (Buk)

(Wiesenborn et al., 1989). Das vielfältige Substratspektrum der Ptb (Wiesenborn et al., 1989)

beinhaltet unter anderem auch 4-HB-CoA (Liu und Steinbüchel, 2000). Dieses wird mit einer

spezifischen Aktivität von 21,7 U/mg Protein zu 4-HB-Phosphat umgewandelt, was einer

Restaktivität von 3 % im Vergleich zum Butyryl-CoA entspricht (Liu und Steinbüchel, 2000).

Analog zum Butyryl-Phosphat könnte 4-HB-Phosphat durch die Buk zu GHB verstoffwechselt

Diskussion 88

werden (Abb. 4.1). Letzterer Schritt ist theoretisch denkbar, da die Buk auch die

entgegengesetzte Reaktion – die Phosphorylierung von GHB – mit einer Restaktivität von 7 %

im Vergleich zum Butyrat katalysiert (Liu und Steinbüchel, 2000). Es ist vorstellbar, dass die

Dephosphorylierungsreaktion von 4-HB-Phosphat mit einer höheren Aktivität abläuft, da

dies mit der eigentlichen Funktion der Buk (Dephosphorylierung von Butyryl-Phosphat)

übereinstimmt. Demnach könnten die beiden in C. acetobutylicum natürlich vorkommenden

Enzyme (Ptb und Buk) zu einem weiteren Stoffwechselweg führen, welcher die Umwandlung

von 4-HB-CoA zu GHB beinhaltet. Durch die Synthese eines zusätzlichen Moleküls ATP kann

dieser unter Umständen vom Organismus bevorzugt werden.

4.4 1,4-BDO-Produktion unter Verwendung verschiedener

Kohlenhydratquellen

Solventogene Clostridien, wie C. acetobutylicum, sind in der Lage, die Lösungsmittel Aceton,

Butanol und Ethanol aus einer Vielzahl verschiedener Kohlenhydratquellen zu generieren

(Ounine et al., 1985; Qureshi et al., 2006; Zverlov et al., 2006; Ren et al., 2010). Dabei

können sowohl Hexosen, wie z. B. Mannose und Galaktose, als auch Pentosen, wie z. B.

Arabinose und Xylose von C. acetobutylicum verstoffwechselt werden (Servinsky et

al., 2010). Dieses weitgefächerte Substratspektrum ermöglicht dem Bakterium einen

Wettbewerbsvorteil gegenüber anderen Mikroorganismen, da unter anderem die Fähigkeit

zur Fermentation von Pentosen bei Mikroorganismen eingeschränkt ist (Ounine et al., 1985).

Desweiteren gestattet die Substratvielfalt eine größere Handlungsfreiheit bei der

industriellen Nutzung von C. acetobutylicum, da bis zu 79 % der Kosten durch Substratkosten

verursacht werden (Green, 2011). Daher wird nachfolgend die Verwertung ausgewählter

Pentosen, wie Xylose und Arabinose aber auch der Hexosen Galaktose und Mannose

erörtert.

4.4.1 Pentosen

4.4.1.1 Xylose

Die Verwendung von D-Xylose als alleinige C-Quelle führte bei C. acetobutylicum

pTc::P(thlA)cbei_2100 zu einem langsameren Wachstum (µ = 0,11 h-1) im Vergleich zum

Diskussion 89

Wachstum auf Glukose (µ = 0,15 h-1). Daraus resultierte, dass die maximale OD600 von 7,55

erst nach 60 h Kultivierung und somit 12 h später als mit Glukose erreicht wurde (Abb. 3.16).

Ursache hierfür ist die schnellere Aufnahme und Metabolisierung von Glukose im Vergleich

zur Xylose (Ounine et al., 1985). Für die Aufnahme von Xylose aus dem Medium sind

entsprechende ABC-Transporter und Symporter verantwortlich (Servinsky et al., 2010).

Innerhalb der Zelle erfolgt die Umwandlung von Xylose zu Xylulose, welche anschließend in

phosphorylierter Form (Xylulose-5-Phosphat) überwiegend in den Phosphoketolase-Weg

(PKW) und zu einem geringen Teil in den Pentosephosphatweg (PPW) eingeht (Abb. 4.2)

(Aristilde et al., 2014).

Abb. 4.2: Schematische Darstellung der Kohlenhydratverwertung in C. acetobutylicum. Essentielle

metabolische Vorstufen sind durch blaue Kästchen hervorgehoben (Sund et al., 2013, mod.).

Hexosen, wie Glukose und Mannose, welche die Glykolyse dominieren, fördern die

Glykolyse-basierte Acidogenese und Solventogenese. Xylose hingegen akkumuliert im PPW,

wodurch die Ribonukleotidsynthese unterstützt und der Kohlenstoff für den PKW zur

Diskussion 90

Verfügung gestellt wird (Aristilde et al., 2014). Da durch die Verwendung von Xylose als C-

Quelle andere Stoffwechselwege gefördert werden, kam es im Vergleich zum Wachstum auf

Glukose zur Verringerung der 1,4-BDO-Synthese um 67 % (Abb. 3.17). Ein weiterer wichtiger

Aspekt, welcher die 1,4-BDO-Bildung beeinträchtigen kann, ist die höhere Anfälligkeit des

Xylose-Metabolismus gegenüber Butanol, aufgrund der Inhibierung der Xylose-Permease ab

einer Butanolkonzentration von 8 g/l (Ounine et al., 1985). Demgegenüber wird der

Stoffwechsel beim Wachstum auf Glukose erst ab einer Butanolkonzentration von 13 g/l

inhibiert (Jones und Woods, 1986).

4.4.1.2 Arabinose

Unter Verwendung von L-Arabinose als Substrat war das Wachstum von C. acetobutylicum

pTc::P(thlA)cbei_2100 im Vergleich zur Glukose (µ = 0,15 h-1) minimal verlangsamt

(µ = 0,13 h-1), erreichte jedoch wie auf Xylose eine maximale OD600 von 7,7 nach 60 h

Kultivierung (Abb. 3.16).

Ähnlich wie Xylose wird Arabinose über Symporter in die Zelle aufgenommen (Servinsky et

al., 2010) und über L-Ribulose und L-Ribulose-5-Phosphat dem Stoffwechsel zugeführt

(Abb. 4.2). Für die Metabolisierung zeigt sich ebenfalls der Phosphoketolaseweg (PKW)

hauptverantwortlich (Aristilde et al., 2014). Darüber hinaus wird der PKW durch den

Pentosephosphatweg unterstützt (Sund et al., 2013). Der metabole Flux in die Glykolyse ist

hingegen nur minimal (Aristilde et al., 2014), was sich ebenfalls auf die 1,4-BDO-Produktion

auswirkt und zu einer Verminderung um 27 % führte (Abb. 3.17). Trotz ähnlich genutzter

Stoffwechselwege ist die 1,4-BDO-Produktion auf Arabinose (0,3 mM) höher als auf Xylose

(0,15 mM). Als Grund ist die Bevorzugung von Arabinose von C. acetobutylicum zu nennen

(Qureshi et al., 2006; Aristilde et al., 2014). Das liegt einerseits daran, dass in Anwesenheit

von Arabinose die mRNA-Expression von Enzymen des PKW um das 100-fache gesteigert

wird (Servinsky et al., 2010). Andererseits gilt der Xylose-Metabolismus als ineffizienter

durch die ratenlimitierenden Schritte beim Transport, bei der Isomerisierung und

Phosphorylierung von Xylose (Xiao et al., 2011), was sich ebenso in der niedrigeren

Wachstumsrate widerspiegelte (Ounine et al., 1983).

Diskussion 91

4.4.2 Hexosen

4.4.2.1 Galaktose

Der rekombinante Stamm C. acetobutylicum pTc::P(thlA)cbei_2100 erreichte beim

Wachstum auf Galaktose die geringste maximale OD600 von 5,5. Dafür konnte sich dieser am

längsten in der stationären Phase halten (Abb. 3.16).

Für die Metabolisierung von Galaktose stehen C. acetobutylicum zwei verschiedene Wege

zur Verfügung (Abb. 4.2): zum einen der Leloir-Weg (LW) und zum anderen der Tagatose-6-

Phosphatweg (T6PW), (Servinsky et al., 2010; Sund et al., 2013). Die Aufnahme von

Galaktose aus dem Medium erfolgt einerseits durch Symporter und andererseits durch das

Phosphoenolpyruvat-Transferase-System (PTS), (Sund et al., 2013). Dabei wird in

Abhängigkeit der Aufnahmesysteme Galaktose entweder über den bevorzugten Leloir-Weg

(Symporter-assoziiert) oder über den T6P-Weg (PTS-assoziiert) metabolisiert (Sund et al.,

2013). Deren Intermediate können anschließend in die Glykolyse eingehen. Das bedeutet,

dass für das Wachstum auf Galaktose zwei verschiedene Stoffwechselwege, die einer

komplexen Regulation unterliegen (Servinsky et al., 2010), aufrechterhalten werden müssen.

Dies bedeutet jedoch höhere Kosten für den Organismus. Infolgedessen ist die

Lösungsmittelproduktion auf Galaktose verringert (Yu & Saddler, 1982) und führte letztlich

zu einer verminderten 1,4-BDO-Synthese, die mit 0,11 mM am geringsten von den

eingesetzten Kohlenhydraten war (Abb. 3.17).

4.4.2.2 Mannose

Mannose zählt zu den bevorzugten Kohlenhydratquellen von C. acetobutylicum (Servinsky et

al., 2010), was sich auch im ähnlichen Wachstumsverhalten des rekombinanten Stammes

auf Glukose und Mannose widerspiegelte (Abb. 3.16). Es wurde eine ähnlich hohe maximale

OD600 von 8,4 nach 48 h Kultivierung verglichen mit Glukose (OD600 = 8,35) erreicht.

Wie bei Hexosen üblich, erfolgt die Aufnahme von Mannose aus dem Medium über das PTS

(Servinsky et al., 2010; Voigt et al., 2014). In der Zelle wird das gebildete Mannose-6-

Phosphat zu Fructose-6-Phosphat umgewandelt, welches anschließend in die Glykolyse

eingeht (Abb. 4.2). Das bedeutet, für den Mannose-Stoffwechsel wird im Gegensatz zu den

anderen getesteten Kohlenhydratquellen nur ein einziges weiteres Enzym (Mannose-6-

Diskussion 92

Phosphat-Isomerase) benötigt (Servinsky et al., 2010), wodurch die entstehenden Kosten für

den Organismus niedrig gehalten werden. Desweiteren werden die Gene, welche für die

Aufnahme und den Metabolismus von Mannose verantwortlich sind, konstitutiv exprimiert

(Servinsky et al., 2010), wodurch eine schnelle und effiziente Umwandlung ermöglicht wird.

Dennoch stellte sich heraus, dass die 1,4-BDO-Produktion (0,23 mM) im Vergleich zur

Glukose (0,46 mM) verringert war (Abb. 3.17). Es lässt daraus schließen, dass in Anwesenheit

von Glukose die am Stoffwechsel beteiligten Enzyme effektiver stimuliert werden und

dementsprechend effizienter sind.

4.4.3 Kohlenhydratgemisch

In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass der rekombinante C. acetobutylicum-Stamm

prinzipiell in der Lage ist, 1,4-BDO durch Fermentation verschiedener, einzelner C-Quellen zu

synthetisieren. Dies eröffnet die Möglichkeit auch Lignocellulose-Hydrolysate, in denen diese

Kohlenhydrate vorkommen, für die 1,4-BDO-Produktion einzusetzen.

Lignocellulose ist ein Bestandteil der pflanzlichen Zellwand und gehört demzufolge zu den

nahezu unbegrenzt auf der Erde verfügbaren, nachwachsenden Rohstoffen (Kuhad & Singh,

1993; Lee, 1997; Ezeji et al., 2007), welche jedoch größtenteils ungenutzt bleiben (Sarkar et

al., 2012). Der Einsatz von Forstabfällen oder landwirtschaftlichen Abfallstoffen, wie

Getreidestroh, Reisstroh und Weizenstroh bieten das Potential, die Kosten für

Fermentationssubstrate deutlich zu senken (Lee, 1997). Die Zusammensetzung der

Lignocellulose umfasst drei Hauptgruppen von Polymeren: Cellulose, Hemicellulose und

Lignin. Cellulose stellt den größten Anteil mit 33 - 51 %, gefolgt von Hemicellulose (19 - 34 %)

und Lignin (21 - 32 %) dar (Ibraheem und Ndimba, 2013) und besteht aus β-1,4-glykosidisch-

verknüpften α-D-Glukosemolekülen. Die Hemicellulose ist hingegen ein sehr heterogenes

Polymer bestehend aus den Zuckern L-Arabinose, D-Galaktose, D-Glukose, D-Mannose und

D-Xylose (Mussatto und Teixeira, 2010). Durch Hydrolyse der Lignocellulose können die

Zuckermoleküle anschließend für Fermentationsprozesse eingesetzt werden (Abb. 4.3).

Diskussion 93

Abb. 4.3: Schematische Darstellung der Lignocellulose-Zusammensetzung. Die Pfeile deuten auf die

Hauptzucker der einzelnen Lignocellulose-Fraktionen hin. (Ibraheem und Ndimba, 2013; mod.).

Die Fermentation von simulierten Lignocellulose-Hydrolysaten basierend auf der

Hemicellulose-Zusammensetzung von Getreidestroh (Sarkar et al., 2012) durch

C. acetobutylicum pTc::P(thlA)cbei_2100 erbrachte eine 1,4-BDO-Produktion von 0,15 mM

(Abb. 3.17). Im Vergleich zum Wachstum auf Glukose verringerte sich dabei die 1,4-BDO-

Konzentration um 67 % und entsprach damit der Ausbeute mit Xylose.

C. acetobutylicum ist jedoch nicht in der Lage, die verschiedenen Kohlenhydrate simultan zu

verwerten, da die im Medium enthaltene Glukose die Aufnahme der anderen Kohlenhydrate

inhibiert (= C-Katabolit-Repression, CCR), (Servinsky et al., 2010). Erst wenn die Glukose

nahezu aufgebraucht ist, wird die CCR aufgehoben und die weiteren Kohlenhydrate können

aufgenommen und verstoffwechselt werden. Die CCR limitiert infolgedessen die

Fermentation von Lignocellulose-Hydrolysaten (Ren et al., 2010). Die geringere Glukose-

Konzentration im Gemisch (30 g/l) im Vergleich zum Medium mit Glukose als alleinige

C-Quelle (60 g/l) und die Verwertung der weniger bevorzugten Xylose (Aristilde et al., 2014)

begünstigten die verminderte 1,4-BDO-Bildung.

Nichtsdestotrotz stellt der Einsatz von Lignocellulose-Hydrolysaten aufgrund der

Verfügbarkeit und Kostenersparnis einen vielversprechenden Ansatz für

Fermentationsstrategien dar. Insbesondere da Ren et al. (2010) eine ccpA-Mutante von

C. acetobutylicum generierten, in welcher die CCR unterdrückt wird.

Diskussion 94

4.5 C. acetobutylicum pT::P(ptb)ckl_3020

Der Zeitpunkt der Expression eines Enzyms kann einen starken Effekt auf die Produktbildung

haben (Sillers et al., 2009). Daher sah die Vorgehensweise dieser Arbeit die Verwendung von

drei unterschiedlichen Promotoren für die Expression der 4HBDs vor, die gut untersucht

waren und eine starke Expression in C. acetobutylicum erwarten ließen (3.5.3).

Der Effekt der Promotoren PthlA, Pptb und Padc auf die 1,4-BDO-Produktion mit Cbei_2100 war

jedoch trotz unterschiedlicher Expressionszeitpunkte minimal. Anders verhielt es sich mit

der 1,4-BDO-Synthese unter Verwendung von Ckl_3020. Hier führten die Promotoren Pptb

und Padc zu einer Steigerung der 1,4-BDO-Bildung im Vergleich zum PthlA und infolgedessen zu

einer Verminderung der GHB-Konzentration (Abb. 3.20). Insbesondere C. acetobutylicum

pT::P(ptb)ckl_3020 zeichnete sich durch eine deutliche Zunahme der 1,4-BDO-Produktion

aus (0,62 mM). Analysen der 1,4-BDO-Synthese über die Zeit (Abb. A16) offenbarten, dass

die 1,4-BDO-Bildung nun mehr dem Verhalten von C. acetobutylicum pTc::P(thlA)cbei_2100

(Abb. 3.13, A) und weniger dem von C. acetobutylicum pTc::P(thlA)ckl_3020 (Abb. 3.13, B)

entsprach. Durch die mutmaßlich frühere Expression von Ckl_3020 durch Pptb stieg die

Konzentration von 1,4-BDO bereits nach 48 h Kultivierung an und erreichte bereits nach 60 h

die Maximalkonzentration. Im Vergleich dazu begann die 1,4-BDO-Produktion bei

C. acetobutylicum pTc::P(thlA)ckl_3020 erst nach 60 h. Diesen Effekt konnten auch Sillers

et al. (2009) feststellen: die frühere Expression von Lösungsmittel-assoziierten Enzymen in

C. acetobutylicum führte ebenfalls zu einer früher einsetzenden und vermehrten

Alkoholbildung. Ein Aspekt weiterer fortführender Arbeiten sollte deshalb eine detailliertere,

zeitliche Analyse der Expression der einzelnen Gene beinhalten. Quantitative RT-PCR-

Analysen können dabei Aufschluss über die mRNA-Transkriptmengen geben.

Immunologische Arbeiten mittels entsprechender Antikörper ermöglichen weiterhin eine

Auskunft darüber, inwieweit gesteigerte Konzentrationen von 1,4-BDO mit erhöhten

Enzymmengen korrelieren.

Diskussion 95

4.6 Stoffwechseldefektmutanten

Die Produktion der Lösungsmittel Aceton, Butanol und Ethanol führte zu einer Verringerung

der 1,4-BDO-Produktion, da der Kohlenstofffluss vom neuen Syntheseweg weggeführt

wurde. Zuvor generierte Stoffwechseldefektmutanten von C. acetobutylicum (Lehmann,

2012 a) zeichneten sich zum Teil durch ein stark verändertes Produktspektrum aus (Lehmann

et al., 2012 b und c). Aus diesem Grund wurden für die weitere Herangehensweise dieser

Arbeit verschiedene C. acetobutylicum-Mutanten (Tab. 2.1) für die 1,4-BDO-Synthese

eingesetzt.

4.6.1 Defekte in der Lösungsmittelproduktion

Die rekombinanten Stämme produzierten ebenso wie der Wildtyp die Lösungsmittel Aceton,

Butanol und Ethanol. Dabei konnten jedoch bei C. acetobutylicum pTc::P(thlA)cbei_2100 und

C. acetobutylicum pTc::P(thlA)ckl_3020 erhöhte Konzentrationen an Butanol und Ethanol

detektiert werden (Abb. 3.11). Die für die Lösungsmittelbildung verantwortlichen Enzyme

sind unter anderem die Acetoacetatdecarboxylase (Adc) und Aldehyd-

/Alkoholdehydrogenase (AdhE). Beide Enzyme sind in den entsprechenden

Mutantenstämmen (Lehmann, 2012 a) ausgeschaltet (Tab. 2.1).

Die transformierte Adc-Defektmutante zeigte einen ähnlichen Phänotyp wie die Adc-

Mutante (Lehmann et al., 2012 b). Die Acetonproduktion erfolgte nur noch durch die

spontane Decarboxylierung von Acetoacetat (Han et al., 2011) und wurde dementsprechend

ohne Enzymunterstützung drastisch reduziert (Endkonzentration ca. 5 mM). Infolgedessen

kam es zu einer deutlichen Akkumulation von Acetat (ca. 67 mM), mutmaßlich

hervorgerufen durch einen Rückstau von Acetoacetat, welches wiederum die Enzymaktivität

der Acetoacetyl-CoA:Acyl-CoA-Transferase (CtfAB) durch Feedback-Inhibierung reduzierte

und somit die Acetatassimilation verringerte. Die Reduktion der Acetonbildung führte jedoch

nicht zu einer erhöhten 1,4-BDO-Synthese. Stattdessen war der gesamte Stoffwechsel der

Mutante derart beeinflusst, dass auch die 1,4-BDO-Bildung deutlich reduziert war

(0,14 mM), (Abb. 3.24). In gleicher Weise wirkte sich dieser Effekt auch auf die

Butanolsynthese aus. Diese ist um etwa die Hälfte (ca. 90 mM) im Vergleich zum

Wildtypstamm gesunken und konnte ebenfalls bei Lehmann et al. (2012 b) festgestellt

Diskussion 96

werden. Durch Akkumulation und verringerter Assimilation des Acetats stand der

verwendete Kohlenstoff nicht mehr für die Bildung der Lösungsmittel und insbesondere für

die 1,4-BDO-Synthese zur Verfügung, sodass eine verringerte 1,4-BDO-Produktion die Folge

war.

Auf ähnliche Weise wirkte sich der Defekt im ctfA-Gen der entsprechenden Mutante auf die

1,4-BDO-Bildung aus. Die Coenzym A-Transferase ist für die Assimilierung der Säure Acetat

verantwortlich (Hartmanis et al., 1984). Der Defekt verursachte eine Akkumulation des

Acetats und führte aufgrund der „Kohlenstoffspeicherung“ infolgedessen zu einer

verminderten Lösungsmittel- (Lehmann et al., 2012 b) sowie 1,4-BDO-Produktion

(Abb. 3.24).

Yim et al. zeigten 2011, dass die AdhE2 von C. acetobutylicum in der Lage ist, die Bildung von

1,4-BDO zu katalysieren. Weitere getesteten Aldehyd- und Alkoholdehydrogenasen waren

dazu nicht befähigt. Da C. acetobutylicum weitere Gene für Aldheyd- und

Alkoholdehydrogenasen im Genom besitzt (Nölling et al., 2001), galt es zu überprüfen, ob

diese Fähigkeit der AdhE2 ein Alleinstellungsmerkmal und somit essentiell für die 1,4-BDO-

Bildung ist oder ob eine andere entsprechende Dehydrogenase ebenso die Funktion

ausführen kann. Aus diesem Grund wurden die beiden Aldehyd-/Alkohohldehydrogenasen

AdhE1 und AdhE2 von C. acetobutylicum für Untersuchungen herangezogen. Wenn die

AdhE2 essentiell für die 1,4-BDO-Bildung ist, müsste die Produktion im

Rezipientenmutantenstamm ausbleiben. Bei der transformierten AdhE1-Mutante hingegen

dürfte der Defekt keine Auswirkungen auf die 1,4-BDO-Produktion haben. Es zeigte sich

jedoch, dass sowohl bei der AdhE1-Mutante als auch bei der AdhE2-Mutante die Bildung von

1,4-BDO im Vergleich zum Referenzstamm C. acetobutylicum pTc::P(thlA)cbei_2100 deutlich

sank, nicht aber komplett eingestellt wurde (0,06 mM bzw. 0,09 mM; Abb. 3.24). Dies

könnte bedeuten, dass die AdhE2 nicht hauptverantwortlich für die 1,4-BDO-Bildung ist,

sondern, dass die finalen Syntheseschritte durch beide AdhEs katalysiert werden können.

Inwieweit weitere Aldehyd- und Alkoholdehydrogenasen, wie die

Butyraldehyddehydrogenase (BYDH) und Butanoldehydrogenase (BDH), daran beteiligt sind,

bleibt weiterhin zu überprüfen.

Obwohl die Lösungsmittelbildung bei den Defektmutanten reduziert werden konnte

(Tab. A5), spiegelt sich der veränderte Kohlenstofffluss nicht in einer erhöhten 1,4-BDO-

Diskussion 97

Konzentration wider. Damit blieb die 1,4-BDO-Bildung der Mutantenstämme hinter den

Erwartungen zurück. „Metabolic Engineering“-Strategien, wie z. B. das Ausschalten von

bestimmten Genen, ermöglichen eine Vielzahl von Veränderungen im Stoffwechsel und

bieten ein großes Potential für zukünftige Arbeiten. Es ist jedoch zu berücksichtigen, dass

einzelne Veränderungen zum Teil drastische Auswirkungen auf den Stoffwechsel haben

können und dementsprechend komplex sind. Desweiteren fehlen noch genaue Angaben zum

Transkriptom und zur biochemischen Charakterisierung der jeweiligen Mutantenstämme.

Das Verhalten jener Mutanten auf molekularer Ebene ist somit noch unklar, weshalb weitere

Analysen folgen müssen. Aus diesem Grund ist eine finale Aussage bezüglich der 1,4-BDO-

Produktion der Mutantenstämme auf diesem Stand schwierig und noch nicht eindeutig.

4.6.2 Defekte in der Säureproduktion

Die Produktion der Säuren Acetat und Butyrat dient C. acetobutylicum der

Energiegewinnung (Hartmanis und Gatenbeck, 1984; Wiesenborn et al., 1989) und stellt

somit einen wichtigen Aspekt im Stoffwechsel dar. Die Eingangsenzyme für die jeweiligen

Biosynthesewege sind die Phosphotransacetylase (Pta) und Phosphotransbutyrylase (Ptb).

Letztere steht, wie zuvor bereits beschrieben, im Verdacht die GHB-Produktion durch die

Umwandlung von 4-HB-CoA zu 4-HB-Phosphat (Liu und Steinbüchel, 2000) zu begünstigen.

Um dies näher zu beleuchten, wurde die Ptb-Rezipientenmutante (Tab. 2.1) hinsichtlich der

1,4-BDO- und GHB-Bildung untersucht. Bei einer Beteiligung der Ptb an der GHB-Produktion

müsste die GHB-Konzentration im Vergleich zum Referenzstamm C. acetobutylicum

pTc::P(thlA)cbei_2100 verringert sein, da der mutmaßliche GHB-Syntheseweg ausgeschaltet

ist. Die Ergebnisse zeigten jedoch, dass es zu einem deutlichen Anstieg der GHB- (0,71 mM)

und zu einer Abnahme der 1,4-BDO-Konzentration (0,08 mM) kam (Abb. 3.22). Dies

bedeutet, dass die Bildung von GHB höchstwahrscheinlich überwiegend spontan abläuft und

somit unabhängig von Enzym-katalysierten Reaktionen ist. Um diesen Sachverhalt weiter zu

untermauern und um auszuschließen, dass die Pta, welche eine ähnliche Reaktion

(Acetyl-CoA zu Acetyl-Phosphat) wie die Ptb katalysiert (Boynton et al., 1996), an der GHB-

Bildung beteiligt ist, wurde zusätzlich die Pta-Mutante näher untersucht. Es stellte sich dabei

heraus, dass die GHB-Konzentration im Vergleich zum Ptb-Rezipientenstamm sank

(0,46 mM) und gleichzeitig die 1,4-BDO-Konzentration anstieg (0,19 mM). Vergleichend zum

Diskussion 98

Referenzstamm C. acetobutylicum pTc::P(thlA)cbei_2100 konnte jedoch kein Effekt des Pta-

Defekts auf die GHB-Produktion festgestellt werden.

Die Hinweise deuten somit verstärkt auf eine spontane Bildung von GHB hin und weniger auf

eine enzymkatalysierte. Dass dies im Konzentrationsbereich von ca. 1 mM möglich ist, zeigt

die nicht-enzymatische Decarboxylierung von Acetaldehyd zu Aceton in entsprechenden

Defektmutanten (Lehmann et al., 2012 b). Nichtsdestotrotz sollte dies durch eine Pta/Ptb-

Doppel-„Knock down“ Mutante überprüft werden. Bei dieser wäre ein Überleben der Zellen

noch möglich und der theoretische Einfluss beider Enzyme auf die GHB-Bildung minimal.

4.7 Fazit

Der globale Bedarf und die Bedeutung von 1,4-BDO wächst Jahr für Jahr (in: 1,4-Butanediol

market analysis and segment forecasts to 2020; www.hexareports.com; Stand: 25.02.2016),

sodass die Produktion von 1,4-BDO immer wichtiger wird. Zukunftsorientierte Forschungen

setzen dabei vermehrt auf Erdöl-unabhängige Produktionen von Plattformchemikalien (Zeng

und Sabra, 2011).

Die in dieser Arbeit vorgestellte Strategie ermöglichte durch die Bereitstellung einer 4HBD-

Aktivität eine Erweiterung des zentralen Stoffwechsels und des Produktspektrums von

C. acetobutylicum und die erstmalige anaerobe biotechnologische Erzeugung von 1,4-BDO.

Somit konnte der „Proof-of-Principle“ gezeigt und ein erster, wichtiger Schritt für eine

petrochemisch unabhängige Synthese von 1,4-BDO erfolgreich genommen werden. Die

1,4-BDO-Produktion in C. acetobutylicum wurde durch drei verschiedene 4HBDs ermöglicht.

Da die erzielten 1,4-BDO-Konzentrationen (11 - 45 mg/l) bisher noch deutlich unter den

wirtschaftlichen 100 g/l lagen, wurden bereits erste Optimierungsansätze angedeutet.

Aufgrund der Komplexität des Wirtsorganismus hatten diese bisher jedoch noch keine

1,4-BDO-Steigerung zur Folge, sodass noch weitere wichtige Arbeiten, wie z. B. die Analyse

und Veränderung der Kultivierungsparameter im „Scale-up“ sowie die Aufklärung der

zeitlichen Expression und mRNA-Menge der 4HBD durch immunologische Methoden und

qRT-PCR, notwendig sind. Ein vielversprechender Ansatz, welcher weiterhin verfolgt werden

sollte, zeigte sich durch die Verwertbarkeit von verschiedenen Kohlenhydratquellen für die

1,4-BDO-Synthese, wodurch Lignocellulose-Hydrolysate als kostengünstiges Substrat

Diskussion 99

denkbar sind. Es müssen jedoch noch weitere Untersuchungen, insbesondere mit

Lignocellulose-Hydrolysaten, folgen. Dabei sollte der Einfluss von inhibierenden

Verbindungen, wie z. B. Furfural, Hydroxymethylfurfural, Ferulasäure, Coumarinsäure und

Glucoronsäure, die bei der Aufarbeitung von Lignocellulose entstehen (Ezeji et al., 2007), auf

C. acetobutylicum genauer untersucht werden.

Es bleibt abschließend festzuhalten, dass C. acetobutylicum das Potential durch

Weiterentwicklung und Modifikation besitzt, sich als zukünftiger 1,4-BDO-Produktionsstamm

zu etablieren.

Literaturverzeichnis 100

5. Zusammenfassung

1. Das nicht-natürlich vorkommende 1,4-Butandiol konnte durch einen neuen

anaeroben Stoffwechselweg in Clostridium acetobutylicum auf biologische Weise

erzeugt werden.

2. Für die Erzeugung von 1,4-BDO in C. acetobutylicum wird nur ein zusätzliches Enzym,

die 4HBD, benötigt.

3. Für den 1,4-BDO-Nachweis wurden zwei verschiedene Methoden etabliert: zum

einen eine schnelle und kostengünstige Methode basierend auf der

Dünnschichtchromatografie und zum anderen ein sensitiver Nachweis via GC/MS-

Analysen.

4. Die 1,4-BDO-Ausbeuten variierten in Abhängigkeit der verwendeten 4HBDs:

Cbei_2100 (0,46 mM), Ckl_3020 (0,26 mM) und AbfD (0,13 mM).

5. Als Nebenprodukt der 1,4-BDO-Synthese konnte γ-Hydroxybutyrat (GHB) detektiert

werden. Die Konzentrationen an GHB waren in den meisten rekombinanten

Stämmen höher als 1,4-BDO.

6. Die 1,4-BDO-Produktion mit Hilfe von C. acetobutylicum war unter Verwendung

verschiedener Kohlenhydratquellen (Arabinose, Xylose, Mannose, Galaktose und

Glukose) möglich. Dadurch ist der Einsatz von Lignocellulose-Hydrolysaten für die

Produktion von 1,4-BDO denkbar.

7. Der Austausch des ThiolaseA-Promotors durch den Phosphotransbutyrylase-

Promotor führte bei dem rekombinanten Stamm C. acetobutylicum

pT::P(ptb)ckl_3020 zu einer erhöhten 1,4-BDO-Produktion (0,62 mM) und zu einer

Verschiebung des 1,4-BDO-GHB-Verhältnisses zum 1,4-BDO.

8. Weitere erste Optimierungsansätze, wie der „Scale-up“ und die Verwendung von

Stoffwechseldefektmutanten, führten bisher noch zu keiner Steigerung der 1,4-BDO-

Produktion.


6. Literaturverzeichnis

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Anhang 113

7. Anhang

Abb. A1: Dünnschichtchromatogramm von 1,4-BDO. 1,4-BDO wurde in unterschiedlichen Konzentrationen

(10-1000 mM) aufgetragen. Zusätzlich wurden 2,3-BDO (2,3B), Butanol (BuOH), Aceton (Ac), Ethanol (EtOH)

und Wasser mitgeführt.

Abb. A2: Dünnschichtchromatogramm von 1,4-BDO mit C. acetobutylicum Kulturüberstand. 1,4-BDO wurde

in unterschiedlichen Konzentrationen (10-1800 mM) aufgetragen und mit dem Kulturüberstand (1:10

verdünnt) einer 48 h C. acetobutylicum-Kultur versetzt.

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 200 500 1000 2,3B BuOH Ac H2O EtOH

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 200 500 1000 2,3B BuOH Ac H2O EtOH

Anhang 114

Tab. A1: Kalibrierung der 1,4-BDO- und GHB-Nachweismethode.

1,4-BDO GHB

Konzentration

[mM]

MW Area Analyt/IS

Rückrechnung

[mM]

Konzentration

[mM]

MW Area Analyt/IS

Rückrechnung

[mM]

0,1 0,062 0,114 0,1 0,076 0,112 0,2 0,163 0,209 0,2 0,190 0,216 0,4 0,348 0,383 0,4 0,362 0,373 0,5 0,454 0,483 0,5 0,488 0,488 1,0 1,016 1,011 1 1,062 1,011

Abkürzungen: MW, Mittelwert bestimmt aus sechs unabhängigen Ansätzen; IS, interner Standard.

Abb. A3: Analysenfunktion für die Kalibrierung der 1,4-BDO-Messung.

Abb. A4: Analysenfunktion für die Kalibrierung der GHB-Messung.

y = 0,9401x + 0,0558R² = 0,998

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

Ko

nze

ntr

atio

n [

mM

]

Area Analyt/IS

Analysenfunktion 1,4-BDO

y = 0,9119x + 0,0427R² = 0,9971

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

Ko

nze

ntr

atio

n [

mM

]

Area Analyt/IS

Analysenfunktion GHB

Anhang 115

AbfD 1 M-LMTAEQYIESLRKLNTRVYMFGEKIENWVDHPMIRPSINCVAMTYELAQDPQYADLMTTKSNLIGKTINRFANLHQST 79

Ckl_3020 1 MSLMTGEEYVESLRKLKLNVYYLGEKIDNPVDNPVLRPSLNSVKMTYDLAQEAEYEDLMTTTSNITGEKINRFTNLHQSS 80

Cbei_2100 1 MPLKTKEQYIESLRKLNLKVYMFGKPVDNVVDNPIIRPSLNSVAMTYELAQMPEYEDLMTATSNLTGEKVNRFAHLHQST 80

AbfD 80 DDLRKKVKMQRLLGQKTASCFQRCVGMDAFNAVFSTTYEIDQKYGTNYHKNFTEYLKYIQENDLIVDGAMTDPKGDRGLA 159

Ckl_3020 81 EDLVKKVKMQRLCGQKTAACFQRCVGMDSFNAVYSTTFEIDKEYNTNYFENFKKFLTYVQKNDLTVDGAMTDPKGDRGLS 160

Cbei_2100 81 DDLIKKVKMQRLLGQKTASCFQRCVGMDAFNALYSSTYEIDKACGTNYHENFNKFLKYVQENDLTVDGAMTDPKGDRGLS 160

AbfD 160 PSAQKDPDLFLRIVEKREDGIVVRGAKAHQTGSINSHEHIIMPTIAMTEADKDYAVSFACPSDADGLFMIYGRQSCDTRK 239

Ckl_3020 161 PSKQADPDLYLRVVERREDGVVVRGAKAHQTGICNSHEVLVMPTIAMRPDDKDYAIAFSVPTDAEGITMIIGRQSCDTRK 240

Cbei_2100 161 PSKQADGDLYLRVVERREDGVVVRGAKCHQTGMLNSHEVVVMPTIALTPNDKDWAISFAVPTDAEGIIHIYGRQSCDTRK 240

AbfD 240 MEEGADIDLGNKQFGGQEALVVFDNVFIPNDRIFLCQEYDFAGMMVERFAGYHRQSYGGCKVGVGDVVIGAAALAADYNG 319

Ckl_3020 241 MEKDADIDVGNKEFGGVEALVVFDDVFVPNDRIFLNGETEYAGMLVERFAGYHRQSYGGCKVGVGDVLIGAAAVAADYNG 320

Cbei_2100 241 LEPGADIDLGNAEFGGQETLTIFDNVFVPNERIFLNGETDFAGMIVERFAGYHRQSYGGCKVGVGDVLIGAAAVAADYNG 320

AbfD 320 AQKASHVKDKLIEMTHLNETLYCCGIACSAEGYPTAAGNYQIDLLLANVCKQNITRFPYEIVRLAEDIAGGLMVTMPSEA 399

Ckl_3020 321 AAKASHIKDKLIEMMHLNETLYACGIACSAEGHATKAGNYQIDLLLANVCKQNITRFPYEIVRLAEDIAGGLMVTMPSEK 400

Cbei_2100 321 AHKASHVKDKLIEMTHLNETLFSCGIACSAMGSKTEAGNYYIDNLLANVCKQNVTRFPYEICRLAEDIAGGIMVTMPSEA 400

AbfD 400 DFKS[8]ETIGDFCNKFFAAAPTCTTEERMRVLRFLENICLGASAVGYRTESMHGAGSPQAQRIMIARQGNINAKKELAK 484

Ckl_3020 401 DYKS PEVGKYVEKYLVGVASVPVEDRMKILRLLENICLGTAAVGYRTESMHGAGSPQAQRIMISRQGNLAHKKKLAK 477

Cbei_2100 401 DFKD EKIGPYIDKYLRGVNSVSTENRMRILRLIENICLGTAAVGYRTESMHGAGSPQAQRIMIARQGNLAAKKKIAK 477

AbfD 485 AIAGIK- 490

Ckl_3020 478 KIARIED 484

Cbei_2100 478 KIARIKE 484

Abb. A5: Aminosäure-Alignment der 4HBDs. Schwarz markierte AS sind konserviert, grün hervorgehobene AS

sind verantwortlich für die katalytische Funktion der Enzyme. Blau unterlegte AS bilden das Eisen-Schwefel-

Cluster-Motiv CX3CX179-183HX6C. Abkürzungen: AS, Aminosäuren; AbfD, 4HBD aus C. aminobutyricum; Ckl_3020,

4HBD aus C. kluyveri; Cbei_2100, 4HBD aus C. beijerinckii.

Anhang 116

Abb. A6: Vektorkarte vom pT-Vektor (Girbal et al., 2005; mod.). Der pT-Vektor verfügt über zwei

Replikationsursprünge („repL“ und „pBR322“), welche den Einsatz des Vektorsystems in Gram-positiven und

Gram-negativen Bakterien ermöglicht. Darüber hinaus besitzt dieser Vektor zwei Resistenzgene- bla

(Ampicillin-Resistenzgen) und EmR (Erythromycin-Resistenzgen), eine C-terminalen Strep-tag II Sequenz und

einen ThiolaseA-Promotor.

CAAGGAGGTTAGTTAGAATGGGATCCATGCCATTAAAAACAAAGGAACAATATATTGAAAGCCTTAGAAAGTTAAACCTA

AAAGTGTACATGTTTGGAAAACCAGTTGACAATGTTGTTGATAATCCAATCATAAGACCATCTCTTAATTCAGTTGCTATGA

CTTATGAATTAGCACAAATGCCAGAGTATGAAGATTTAATGACAGCTACTTCTAATTTAACAGGGGAAAAAGTAAATAGAT

TTGCTCATTTACATCAAAGCACAGATGATCTTATTAAAAAAGTAAAGATGCAAAGATTACTTGGTCAAAAAACCGCATCAT

GTTTCCAAAGGTGCGTTGGTATGGATGCTTTTAATGCATTATACAGTTCAACATACGAAATAGATAAAGCGTGTGGAACAA

ATTATCATGAAAACTTTAATAAGTTTTTAAAATATGTTCAAGAAAACGACTTAACCGTTGATGGTGCAATGACTGATCCTAA

AGGGGACAGAGGATTATCGCCAAGTAAACAAGCTGATGGAGATTTATACTTAAGGGTTGTTGAAAGAAGAGAAGATGGG

GTAGTTGTTAGAGGAGCAAAATGTCACCAAACTGGAATGTTAAATTCTCATGAGGTAGTAGTAATGCCAACAATAGCATTA

ACTCCAAATGATAAGGATTGGGCAATATCTTTTGCAGTGCCTACAGATGCTGAAGGAATAATTCATATATATGGAAGGCAA

TCTTGTGATACAAGAAAATTGGAGCCAGGTGCTGATATAGATCTTGGAAATGCTGAATTTGGTGGACAAGAAACATTAAC

AATATTTGATAATGTATTTGTACCAAATGAAAGAATTTTCTTAAATGGAGAAACTGATTTTGCTGGAATGATAGTTGAAAG

ATTTGCAGGATATCATAGACAAAGTTATGGTGGATGCAAAGTCGGAGTTGGAGATGTTCTAATTGGAGCTGCTGCAGTAG

CTGCTGATTATAATGGAGCTCACAAAGCATCTCATGTTAAAGATAAATTAATAGAAATGACTCACTTAAATGAAACTTTATT

CTCTTGTGGTATTGCATGTTCAGCAATGGGTTCTAAAACAGAAGCTGGAAATTATTATATTGATAATCTGCTAGCAAATGTA

TGTAAGCAAAATGTTACAAGATTCCCTTATGAAATATGTAGACTTGCAGAAGATATTGCTGGAGGAATCATGGTGACTATG

CCATCAGAAGCAGATTTTAAAGATGAAAAGATAGGTCCATATATAGATAAATATTTGAGAGGTGTAAACTCAGTTTCAACA

GAAAATAGAATGAGAATATTAAGATTAATAGAAAATATTTGTTTAGGGACTGCAGCTGTCGGATATAGAACAGAATCAAT

GCATGGAGCTGGATCACCACAAGCTCAAAGAATTATGATAGCTAGACAAGGAAATTTAGCAGCTAAAAAGAAAATAGCTA

AGAAAATAGCTAGAATTAAAGAACCCGGGTGGTCACATCCTCAATTTGAAAAATAAGGCGCCA

Abb. A7: Nukleotidsequenz von cbei_2100 nach Sequenzierung positiver Plasmide. Unterstrichene Sequenzen

signalisieren die Restriktionsschnittstellen. Grün markierte Nukleotide zeigen den Beginn und das Ende des

Gens. Die Nukleotidsequenz des Strep-tag II ist blau hervorgehoben.

Anhang 117

TAGTTAGAGCTAGCATGTCTTTAATGACTGGGGAAGAATATGTAGAAAGTTTACGTAAATTAAAATTAAACGTTTATTATCT

GGGAGAGAAAATAGATAATCCAGTGGATAACCCTGTACTTCGTCCATCTTTAAATTCTGTTAAGATGACTTATGACTTGGC

CCAAGAAGCAGAATATGAGGATTTAATGACAACAACATCAAATATAACAGGTGAAAAAATAAATAGATTTACAAATTTACA

TCAAAGCAGTGAAGATTTGGTAAAAAAAGTTAAAATGCAGAGATTGTGCGGACAAAAAACTGCAGCCTGTTTCCAAAGAT

GCGTTGGTATGGACTCATTTAATGCAGTGTACAGTACTACTTTTGAAATAGATAAGGAATATAATACAAATTATTTTGAAAA

TTTCAAGAAATTTTTAACTTATGTTCAAAAGAACGATTTAACAGTAGATGGAGCTATGACAGATCCAAAAGGAGACAGAG

GATTGTCACCAAGCAAACAGGCTGATCCAGATTTATATTTAAGAGTTGTAGAAAGAAGAGAAGACGGTGTAGTTGTAAGA

GGAGCAAAGGCTCACCAGACAGGTATATGTAATTCTCATGAAGTATTGGTTATGCCAACTATTGCTATGAGACCGGATGAT

AAAGATTATGCAATAGCTTTTTCTGTTCCTACAGATGCAGAAGGAATAACTATGATAATTGGAAGACAGTCCTGTGATACT

AGAAAAATGGAAAAAGATGCGGACATAGATGTTGGTAATAAAGAATTTGGCGGAGTAGAAGCATTAGTAGTATTTGACG

ATGTATTTGTTCCAAATGACAGGATATTCTTAAATGGTGAAACTGAATATGCAGGAATGTTAGTAGAGAGATTTGCAGGAT

ATCATAGACAAAGTTATGGTGGATGCAAAGTAGGAGTGGGAGATGTATTGATAGGCGCTGCTGCAGTGGCTGCAGACTA

TAATGGAGCTGCAAAGGCATCTCACATAAAGGATAAATTAATAGAAATGATGCATTTAAATGAAACTCTTTACGCTTGCGG

AATTGCGTGCTCAGCAGAAGGACATGCAACAAAAGCTGGAAATTACCAAATAGACTTGCTTCTTGCAAATGTATGTAAGCA

AAATATAACAAGATTCCCTTATGAAATTGTGAGATTAGCAGAAGATATAGCAGGAGGATTAATGGTTACTATGCCTTCTGA

AAAGGATTATAAGAGTCCAGAGGTTGGAAAATATGTAGAGAAGTACTTGGTGGGAGTTGCATCCGTACCTGTTGAAGACA

GAATGAAGATATTAAGATTATTAGAAAATATATGTCTTGGAACGGCTGCAGTAGGATATAGAACTGAATCCATGCATGGA

GCAGGTTCACCTCAAGCACAGAGAATAATGATATCAAGACAGGGAAACCTAGCACATAAGAAGAAACTTGCAAAGAAGA

TAGCTAGAATAGAAGATCCCGGGTGGTCACATCCTCAATTTGAAAAATAAGGCGCCAC

Abb. A8: Nukleotidsequenz von ckl_3020 nach Sequenzierung positiver Plasmide. Unterstrichene Sequenzen



CCGTAGGATCAAGGAGGTTAGTTAGAGCTAGCATGTTAATGACAGCAGAACAGTACATTGAGAGTCTAAGAAAGCTAAA

CACAAGAGTTTATATGTTTGGTGAAAAAATCGAGAATTGGGTGGATCATCCAATGATCAGACCTTCCATCAACTGCGTAGC

AATGACTTATGAATTAGCTCAGGATCCTCAGTACGCTGACTTAATGACTACAAAGTCAAACTTAATAGGTAAAACTATCAAC

AGATTTGCAAATCTACACCAGAGCACAGATGACCTTAGAAAAAAGGTTAAGATGCAGAGACTTCTTGGACAGAAGACCGC

ATCATGCTTCCAGAGATGTGTAGGTATGGACGCTTTCAATGCAGTTTTCTCAACTACATATGAAATCGACCAGAAATATGG

AACAAACTATCACAAGAACTTTACTGAATACTTAAAGTATATACAGGAAAATGACCTTATTGTTGACGGTGCAATGACTGA

CCCTAAGGGTGACAGAGGACTTGCTCCATCCGCACAGAAGGATCCAGATCTTTTCTTGAGAATCGTTGAAAAAAGAGAAG

ATGGTATCGTTGTAAGAGGAGCTAAGGCTCACCAGACTGGTTCCATCAACTCCCACGAACACATCATCATGCCTACAATCG

CTATGACAGAAGCTGATAAGGATTATGCAGTATCATTTGCTTGTCCTTCCGATGCTGATGGTCTATTCATGATCTACGGCAG

ACAGTCATGTGACACAAGAAAGATGGAAGAAGGCGCTGACATTGACCTTGGTAACAAGCAGTTCGGCGGACAGGAAGCT

TTAGTCGTATTCGATAACGTATTTATTCCAAATGACAGAATCTTCCTTTGCCAAGAATATGATTTCGCTGGCATGATGGTAG

AAAGATTTGCTGGATACCACAGACAGTCATACGGCGGATGTAAGGTTGGAGTAGGCGACGTTGTAATCGGTGCTGCTGCT

TTAGCTGCTGACTACAATGGAGCTCAGAAGGCTTCTCACGTTAAAGATAAGCTTATCGAAATGACTCACTTAAATGAAACT

TTATATTGCTGCGGTATTGCTTGTTCAGCAGAAGGTTATCCAACTGCTGCTGGTAACTATCAGATTGACCTTCTTCTTGCAA

ATGTATGTAAGCAGAACATCACTAGATTCCCTTACGAAATCGTAAGACTAGCTGAAGATATCGCTGGTGGATTAATGGTTA

CTATGCCTTCAGAAGCTGACTTTAAGTCAGAAACAGTTGTTGGTAGAGATGGCGAAACTATTGGAGATTTCTGCAATAAGT

TCTTCGCTGCTGCTCCTACTTGCACAACAGAAGAAAGAATGAGAGTTCTTAGATTCTTAGAAAACATCTGCTTAGGTGCATC

CGCTGTAGGTTACAGAACTGAATCCATGCATGGTGCAGGTTCCCCTCAGGCTCAGAGAATCATGATCGCTCGTCAGGGCA

ACATCAACGCTAAGAAAGAATTAGCTAAGGCAATCGCTGGAATTAAACCCGGGTGGTCACATCCTCAATTTGAAAAATAA

GGCGCCAC

Abb. A9: Nukleotidsequenz von abfD nach Sequenzierung positiver Plasmide. Unterstrichene Sequenzen



Anhang 118

Tab. A2: Wachstumsparameter und Gärungsprodukte der 200-ml Kultivierungsexperimente.

C. ac

ATCC 824

C. ac

pTc

C. ac

pTc::cbei_2100

C. ac

pTc::ckl_3020

C. ac

pTc::abfD

Wachstumsrate µ (h-1) 0,116 0,134 0,146 0,13 0,129

Verdopplungszeit td (min) 358 310 285 320 322

max. OD600 (nach) 7,07 (66 h) 7,5 (66 h) 8,35 (48 h) 8,41 (96 h) 7,35 (91 h)

min. pH (nach) 4,7 (88 h) 4,63 (40 h) 4,59 (120 h) 4,6 (40 h) 4,56 (36 h)

Acetat [(mM) nach 120 h] 24,7 ± 6,3 21,0 ± 1,9 16,3 ± 4,3 20,6 ± 2,4 34,2 ± 3,7

Butyrat [(mM) nach 120 h] 12,7 ± 2,3 9,5 ± 1,7 7,3 ± 3,0 5,0 ± 0,9 10,2 ± 2,1

Aceton [(mM) nach 120 h] 106,3 ± 15,2 99,9 ± 22,6 85,7 ± 9,7 119,0 ± 6,4 89,3 ± 9,5

Butanol [(mM) nach 120 h] 169,2 ± 13,9 147,1± 15,2 193,7 ± 17,5 238,6 ± 6,1 164,6 ± 18,4

Ethanol [(mM) nach 120 h] 37,0 ± 1,6 33,8 ± 2,9 89,7 ± 21,4 92,7 ± 1,8 43,8 ± 6,2

Aceton : Butanol : Ethanol 2,9 : 4,6 : 1 3 : 4,4 : 1 0,9 : 2,1 : 1 1,3 : 2,6 : 1 2 : 3,8 : 1

Zeit [h]0 20 40 60 80 100 120

OD

600

0,1

1

10

Ko

nze

ntr

atio

n [

mM

]

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Abb. A10: Zeitlicher Verlauf der 1,4-BDO- und GHB-Produktion von C. acetobutylicum pTc::P(thlA)cbei_2100

auf verschiedenen Kohlenstoffquellen. Die Kultivierung erfolgte in 200 ml MS-MES über einen Zeitraum von

120 h. (A) Arabinose, (B) Xylose, (C) Mannose und (D) Galaktose. 1,4-BDO, GHB. n = 3.

A)

Anhang 119

Zeit [h]0 20 40 60 80 100 120

OD

D60

0

0,1

1

10

Ko

nze

ntr

atio

n [

mM

]

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Zeit [h]

0 20 40 60 80 100 120

OD

600

0,1

1

10

Ko

nze

ntr

atio

n [

mM

]

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Zeit [t]

0 20 40 60 80 100 120

OD

600

0,1

1

10

Ko

nze

ntr

atio

n [

mM

]

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Abb. A10: Zeitlicher Verlauf der 1,4-BDO- und GHB-Produktion von C. acetobutylicum pTc::P(thlA)cbei_2100

auf verschiedenen Kohlenstoffquellen. (Fortsetzung). (A) Arabinose, (B) Xylose, (C) Mannose und (D)

Galaktose. 1,4-BDO, GHB. n = 3.

B)

C)

D)

Anhang 120

Abb. A11: Vektorkarten der generierten Vektoren zur Variation der Promotoren. Die Plasmide basieren auf

den Vektoren von Schulz (2013) (Abb. A12) und enthalten neben den 4HBD-kodierenden Genen (cbei_2100,

ckl_3020 und abfD), den Ampicillin- und Erythromycinresistenzgenen (AmpR bzw. EryR), zwei

Replikationsursprünge für Gram-positive (repL) und Gram-negative Bakterien (ori).

pT::P(ptb)ckl_3020

pT::P(adc)ckl_3020 pT::P(fac)ckl_3020

pT::P(ptb)cbei_2100 pT::P(adc)cbei_2100

pT::P(fac)cbei_2100

Anhang 121

Abb. A11: Vektorkarten der generierten Vektoren zur Variation der Promotoren. (Fortsetzung).

Abb. A12: Vektorkarten pT::P(ptb)pp2, pT::P(adc)pp2 und pT::P(fac)pp2 (Schulz, 2013). Die Plasmide

enthalten neben dem pp2-Fluoreszenzreportergen, den Ampicillin- und Erythromycinresistenzgenen (ApR bzw.

EmR), zwei Replikationsursprünge für Gram-positive (repL) und Gram-negative Bakterien (ori).

pT::P(ptb)abfD pT::P(adc)abfD

pT::P(fac)abfD

Anhang 122

M K1 K2 K3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Abb. A13: Colony-PCR auf die 4HBD-kodierenden Gene. 0,8 %iges Agarosegel. Spur M1: 1kb-GeneRulerTM

DNA-Ladder, Spuren K1-K3: Kontrollen, C. acetobutylicum Wildtyp-DNA, Spur 1: C. acetobutylicum

pT::P(thlA)cbei_2100, Spur 2: C. acetobutylicum pT::P(ptb)cbei_2100, Spur 3: C. acetobutylicum

pT::P(adc)cbei_2100, Spur 4: C. acetobutylicum pT::P(fac)cbei_2100, Spur 5: C. acetobutylicum

pT::P(thlA)ckl_3020, Spur 6: C. acetobutylicum pT::P(ptb)ckl_3020, Spur 7: C. acetobutylicum

pT::P(adc)ckl_3020, Spur 8: C. acetobutylicum pT::P(fac)ckl_3020, Spur 9: C. acetobutylicum pT::P(thlA)abfD,

Spur 10: C. acetobutylicum pT::P(ptb)abfD, Spur 11: C. acetobutylicum pT::P(adc)abfD und Spur 12:

C. acetobutylicum pT::P(fac)abfD.


M1 1 2 3 M2 M1 4 5 6 M2 M2 7 8 9 M1

Abb. A14: SDS-PAGE aufgereinigter 4HBDs. Die Expression der Proteine erfolgte in Abhängigkeit verschiedener

Promotoren. Dargestellt sind 12 %ige Polyacrylamidgele. Die Anfärbung der Proteine erfolgte mit Coomassie

Brilliant Blue. Spur M1: PageRulerTM Prestained-Protein Ladder, M2: PageRulerTM Unstained-Protein Ladder,

Spur 1/4/7: Pptb, Spur 2/5/8: Padc, Spur 3/6/9: Pfac.

1,5 kB

70 kDa 55 kDa

66 kDa

45 kDa

70 kDa 55 kDa

70 kDa 55 kDa

Anhang 123


M1 1 2 3 M1 4 5 6 7 8 9 M1

Abb. A15: Western Blot der aufgetrennten Proteinproben. Die Expression der Proteine erfolgte in

Abhängigkeit verschiedener Promotoren. Die rekombinanten Proteine wurden mit Hilfe eines Strep-Tactin

Antikörpers detektiert. Spur M1: PageRulerTM Prestained-Protein Ladder, Spur 1/4/7: Pptb, Spur 2/5/8: Padc, Spur

3/6/9: Pfac.

Tab. A3: Wachstumsparameter und Gärungsprodukte von rekombinanten C. acetobutylicum-Stämmen. Die

Kultivierung der Stämme erfolgte in 200 ml MS-MES für 120 h. n = 3.

Promotor µ (h-1)

max. OD

Acetat (mM)

Butyrat (mM)

Aceton (mM)

Butanol (mM)

Ethanol (mM)

cb

ei_2

100

thlA 0,146 8,35 16,3 ± 4,3 7,3 ± 3,0 85,7 ± 9,7 193,7±17,5 89,7 ± 21,4

ptb 0,140 8,33 18,2± 2,6 6,3± 0,8 91,9± 10,4 207,4±26,5 137,9±24,8

adc 0,138 9,8 16,5± 3,0 8,2± 0,9 85,6± 21,1 186,1±15,9 99,9 19,0

fac 0,139 7,93 14,8± 2,6 8,9± 2,6 83,9± 17,7 152,8± 4,7 86,3± 25,9

ck

l_3

020

thlA 0,130 8,41 20,6 ± 2,4 5,0 ± 0,9 119,0 ± 6,4 238,6 ± 6,1 92,7 ± 1,8

ptb 0,133 8,03 22,6± 0,7 10,2± 3,9 87,8± 18,5 189,9±12,6 145,1±16,2

adc 0,113 7,46 21,4± 0,8 8,2± 0,6 95,9± 9,5 182,7±32,1 72,9± 5,5

fac 0,129 4,53 46,7± 16,3 41,4±16,8 0 0 6,0± 1,2

ab

fD

thlA 0,129 7,36 34,2 ± 3,7 10,2 ± 2,1 89,3 ± 9,5 164,6±18,4 43,8 ± 6,2

ptb 0,129 6,12 27,1± 3,2 15,8± 3,7 82,6± 8,3 155,6± 7,4 40,9± 0,1

adc 0,119 6,96 31,9± 8,9 12,9± 3,8 84,4± 8,6 151,9±12,7 36,7± 3,5

fac 0,09 3,42 44,1± 3,6 49,5± 5,7 0 0 4,8± 0,5

70 kDa 55 kDa

70 kDa 55 kDa 70 kDa

55 kDa

Anhang 124

Tab. A4: Vergleich der Häufigkeiten der verwendeten Codons in C. acetobutylicum, Cbei_2100, Ckl_3020 und AbfD.

C.ac Cbei Ckl AbfD C.ac Cbei Ckl AbfD C. ac Cbei Ckl AbfD C. ac Cbei Ckl AbfD

AS Codon % % % % AS Codon % % % % AS Codon % % % % AS Codon % % % %

Phe UUU 37,9 24,7 20,6 14,3 Ser UCU 16,4 16,5 14,4 2,0 Tyr UAU 33,6 30,9 37,1 22,4 Cys UGU 8,3 18,6 10,3 12,2

UUC 6,8 8,2 8,2 28,5 UCC 4,0 0,0 6,2 16,3 UAC 9,2 8,2 8,2 18,3 UGC 3,6 4,1 10,3 16,3

Leu UUA 36,0 49,5 43,3 26,5 UCA 18,4 18,6 12,4 18,3 Stop UAA 2,1 2,1 2,1 2,0 Stop UGA 0,4 0,0 0,0 0,0

UUG 9,7 4,1 16,5 2,0 UCG 2,3 2,1 0,0 0,0 Stop UAG 0,8 0,0 0,0 0,0 Trp UGG 7,4 2,1 0,0 2,0

CUU 26,7 12,4 12,4 26,5 Pro CCU 12,2 6,2 12,4 18,3 His CAU 10,5 16,5 14,4 4,1 Arg CGU 2,2 0,0 4,1 2,0

CUC 2,4 0,0 0,0 0,0 CCC 1,3 0,0 0,0 0,0 CAC 2,9 6,2 4,1 16,3 CGC 0,6 0,0 0,0 0,0

CUA 9,5 6,2 2,1 10,2 CCA 12,0 26,8 16,5 10,2 Gln CAA 16,3 33,0 18,6 2,0 CGA 1,0 0,0 0,0 0,0

CUG 2,4 2,1 2,1 0,0 CCG 1,7 0,0 2,1 0,0 CAG 7,0 0,0 12,4 42,8 CGG 0,2 0,0 0,0 0,0

Ile AUU 35,5 22,7 8,2 16,3 Thr ACU 19,6 20,6 26,8 30,5 Asn AAU 52,5 47,4 39,2 18,3 Ser AGU 18,8 6,2 10,3 2,0

AUC 4,7 4,1 0,0 46,8 ACC 5,0 4,1 0,0 2,0 AAC 12,8 8,2 8,2 28,5 AGC 7,9 4,1 4,1 2,0

AUA 55,6 37,1 45,4 4,1 ACA 21,9 30,9 24,7 24,4 Lys AAA 63,1 49,5 41,2 16,3 Trp AGA 23,4 45,4 43,3 48,9

Met AUG 25,1 37,1 39,2 42,8 ACG 3,0 0,0 2,1 0,0 AAG 30,4 18,6 33,0 42,8 AGG 5,9 6,2 2,1 0,0

Val GUU 29,8 35,1 30,9 26,5 Ala GCU 23,3 47,4 26,8 73,3 Asp GAU 46,8 55,7 47,4 32,6 Gly GGU 19,8 20,6 16,5 38,7

GUC 2,1 4,1 0,0 2,0 GCC 4,2 0,0 4,1 0,0 GAC 8,5 6,2 20,6 32,6 GGC 6,3 0,0 4,1 16,3

GUA 27,4 22,7 39,2 24,4 GCA 25,6 37,1 49,5 26,5 Glu GAA 49,8 55,7 59,8 57,0 GGA 32,1 51,5 53,6 24,4

GUG 7,0 6,2 12,4 2,0 GCG 3,6 2,1 4,1 0,0 GAG 17,8 6,2 10,3 4,1 GGG 5,0 8,2 2,1 0,0

Anhang 125

Zeit [h]

0 20 40 60 80 100 120

OD

600

0,1

1

10

Ko

nze

ntr

atio

n [

mM

]

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Abb. A16: Zeitlicher Verlauf der 1,4-BDO- und GHB-Produktion von C. acetobutylicum pT::P(ptb)ckl_3020. Die

Kultivierung erfolgte in 200 ml MS-MES über einen Zeitraum von 120 h. 1,4-BDO, GHB. n = 3.

Tab. A5: Gärungsprodukte transformierter C. acetobutylicum-Mutantenstämmen in 200 ml-MS-MES nach

120 h. Die Mutanten enthalten das Plasmid pTc::P(thlA)cbei_2100.

Acetat [mM]

Butyrat [mM]

Aceton [mM]

Butanol [mM]

Ethanol [mM]

1,4-BDO [mM]

GHB [mM]

ATCC 824 24,7 ± 6,3 12,7 ± 2,3 106,3 ± 15,2 169,2 ± 13,9 37,0 ± 1,6 --- ---

pta::int 12,0 ± 2,1 8,3 ± 1,2 84,1 ± 7,6 194,2 ± 14,8 108,0 ± 7,3 0,19 ± 0,03 0,46 ± 0,03

ptb::int 27,1 ± 0,1 1,6 ± 0,2 63,9 ± 8,2 82,9 ± 8,7 89,6 ± 3,1 0,08 ± 0,01 0,71 ± 0,01

ldh1::int 22,0 ± 1,2 9,8 ± 1,3 87,6 ± 4,8 150,7 ± 12,6 79,7 ± 7,2 0,15 ± 0,04 0,58 ± 0,06

ldh2::int 28,5 ± 2,2 14,0 ± 0,7 82,3 ± 0,3 153,5 ± 4,8 65,9 ± 1,8 0,13 ± 0,01 0,73 ± 0,03

adc::int 67,4 ± 2,8 1,4 ± 0,1 8,9 ± 0,7 92,8 ± 2,6 156,9 ± 27,1 0,14 ± 0,01 0,73 ± 0,09

ctfA::int 73,5 ± 5,8 10,9 ± 3,3 0,0 ± 0,0 59,2 ± 10,6 50,9 ± 6,1 0,07 ± 0,01 0,41 ± 0,2

adhE1::int 38,7 ± 1,4 58,7 ± 1,8 4,5 ± 0,5 2,5 ± 0,3 43,9 ± 3,5 0,06 ± 0,0 0,35 ± 0,09

adhE2::int 31,7 ± 1,5 12,7 ± 0,9 79,7 ± 7,4 127,5 ± 5,2 72,2 ± 2,9 0,09 ± 0,0 0,39 ± 0,17

Danksagung 126

Danksagung

Zunächst bedanke ich mich recht herzlich bei Herrn Prof. Dr. Hubert Bahl für das

entgegengebrachte Vertrauen und die Gelegenheit der selbstständigen Anfertigung dieser

Arbeit, sowie für die Freiheiten, die ich er mir bei der Bearbeitung ließ.

Desweiteren möchte ich mich bei Frau Dr. Tina Lütke-Eversloh für die Bereitstellung dieses

Themas, für die wissenschaftliche Betreuung sowie für die interessanten Gespräche und

Anregungen bedanken.

Darüber hinaus möchte ich auch Herrn Dr. Ralf-Jörg Fischer danken, der vor allem im letzten

Jahr mit konstruktiver Kritik und Ratschlägen meine Arbeit voranbrachte. Ebenso danke ich

ihm für das Korrekturlesen dieser Arbeit.

Weiterhin gilt einen großen Dank allen derzeitigen und ehemaligen Mitarbeitern der

Abteilung Mikrobiologie der Universität Rostock, die mich während meiner Zeit begleitet

haben. Insbesondere Ilona Boldt, Hella Goschke, Regina Karstädt und Monika Timm möchte

ich für die vielen großen und kleinen Hilfestellungen während des Laboralltags danken.

Darüber hinaus bedanke ich mich bei Igor Bill, Tina Drenckhan, Franziska Jenzen, Dr. Katja

Kriebel, Maria Lehmann, Anne Lunze, Dr. Antje May, Christoph Prohaska und Dr. Christine

Voigt für Hilfestellungen jeglicher Art und für die gute Arbeitsatmosphäre sowohl im Labor

als auch im Büro.

Ganz besonders bedanke ich mich bei Ronny Uhlig und Dr. Daniela Wetzel, die mich vor

allem mit Ratschlägen und Arbeitseifer stets unterstützt haben und immer ein offenes Ohr

für meine Probleme hatten. Insbesondere die fröhlichen und unterhaltsamen Mittagspausen

werde ich vermissen. Ebenso gilt ein großer Dank Katja Zimmermann, die viel Arbeit und

Mühe in das Korrekturlesen dieser Arbeit gesteckt und es immer wieder geschafft hat, mich

zu motivieren.

Ich danke ebenfalls Dajana Domik für das super Arbeitsklima über Abteilungsgrenzen

hinweg und für den Spaß während langer Labornächte.

Dr. Daniel Rentsch, aus der Abteilung forensische Toxikologie, gebührt ebenfalls ein sehr

großes Dankeschön, da ohne sein Einsatz und Interesse an diesem Thema eine

Danksagung 127

Nachweismethode für das 1,4-Butandiol nicht zustande gekommen und somit die

Anfertigung dieser Arbeit fraglich gewesen wäre.

Der Landesgraduiertenförderung Mecklenburg-Vorpommern danke ich für die finanzielle

Förderung dieser Promotion.

Bei meinen Freunden, besonders bei Sebastian und Gyöngyver Foth und Rene Kaiser,

möchte ich mich für die vielen schönen Zeiten und Ablenkungen außerhalb des Labors

bedanken.

Schließlich gilt jedoch der größte Dank meiner Familie, meinen Eltern Michael und Doris

Klipp und meiner Schwester Carolin Klipp, die mich bei allen meinen Vorhaben unterstützt

haben und ständig für mich da sind. Der Dank, den ich meiner Verlobten Julia Ruttmann

entgegenbringe, ist kaum in Worte zu fassen, da sie immer für mich da ist, mich aufbaut,

mich motiviert, mich beruhigt und mich zum Lachen bringt. Ohne sie wäre es ein viel

beschwerlicherer Weg gewesen. Vielen Dank!

Selbstständigkeitserklärung 128

Selbstständigkeitserklärung

Ich versichere hiermit an Eides statt, dass ich die vorliegende Arbeit selbstständig verfasst

und keine anderen als die angegeben Quellen und Hilfsmittel verwendet habe. Die aus

fremden Quellen direkt oder indirekt übernommenen Gedanken sind als solche

gekennzeichnet

Rostock, den 23.03.2016 Markus Klipp

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