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Methoden der Ökologie Seite 1

Methoden der Ökologie Methoden zur Untersuchung des Mineralstoff-, Kohlenstoff-

und Stickstoffhaushalts Skript erstellt von Dr. Hans-Werner Koyro

Inhalt des Praktikumsteil: Methoden zur Bilanzierung des Mineralstoff, des Kohlenstoff- und

Stickstoffhaushalts (inkl. Aminosäurezusammensetzung). Zur Verdeutlichung der

Aussagekraft werden die Verhältnisse in Kontrollpflanzen und salzbelasteten Pflanzen (am

Beispiel der Art Chenopodium quinoa gegenüber gestellt.

Die Betreuung des Praktikums erfolgt durch PD Dr. Koyro, Frau Bölke, Herrn Mayer, Herrn

Stein und Herrn Hussin.

1. Thema: Pflanzenanzucht und Versuchsbedingungen

Die Anzucht der Pflanzen erfolgte bei kontrollierten Nährstoff- und Klimabedingungen. Der

verwendete Dolomit-Feinkies wurde vor der Befüllung der Eimer mit Leitungswasser und

entmineralisiertem Wasser gereinigt. Nach 3-4 Wochen (Quellung, Keimung und Vorkultur in

einem Vermiculit-Substrat in einem Mini-Gewächshaus) erfolgte das Umsetzen in den

durchfeuchteten Feinkies der Kultureimer (Volumen 5 l, siehe Abb. 2, Nr. 6). Der Feinkies

(Korngröße: 2 mm) neben den Pflanzenwurzeln wurde mit einer lichtundurchlässigen Folie

abgedeckt. Eine selbstansaugende Umwälzpumpe (Water Craft GE800; Nr. 3 in Abb. 2)

versorgte die insgesamt 12 Pflanzen eines Systems mit insgesamt 200 l * h-1 Nährlösung (Tab.

1), wobei all vier Stunden eine 15minütige Bewässerungsphase einsetzte. Die Nährlösung

wurde durch einen Vorfilter (Nr. 2 in Abb. 2) gesaugt, um Verstopfungen im Leitungssystem

zu vermeiden. Die Bewässerungsmenge wurde mit einem Ventil zur Druckregulation (Nr. 4 in

Abb. 2) eingestellt. Eine gleichmäßige Durchfeuchtung des Feinkieses erfolgte durch

Endtropfdüsen (3 Stück, Durchfluß je 2 l * h-1), die in einem ringförmigen

Versorgungsschlauch (Fa. Gardena, Ulm) um die Pflanze herum positioniert waren. Unter der

Feinkiesschicht befand sich eine etwa 4 cm hohe Grobkiesschicht (Korngröße: 5 mm). In den

Boden des Eimers wurde ein Anschlußstutzen für den Abflußschlauch (Nr. 7 in Abb. 2) der

Nährlösung installiert. Die Belüftung der Nährlösung erfolgte durchgängig mit einer


Doppelkolben-Membranbelüftungspumpe (KNF Freiburg Typ 71/4). Die synchrone Aufzucht

von Pflanzenkulturen mit unterschiedlichen Nährlösungen oder unterschiedlichen

Kulturbedingungen wurde durch die Installation von fünf der abgebildeten Systeme im

Gewächshaus erreicht. Der Abstand zwischen den Kulturbehältern war ausreichend für eine

gute Lichtversorgung der einzelnen Aster-Pflanzen ohne gegenseitige Beschattungen.

KOH 6,0

213

4

5

6

7

8

9

Abb. 1.1: Schema eines Kies/Hydrokultursystems mit Durchflußbewässerung. Die Pfeile deuten die

Strömungsrichtung des Nährmediums an. 1) Nährlösungsvorratsbehälter (90 l); 2) Vorfilter (250 µm Maschenweite); 3) Umwälzpumpe; 4) Ventil zur Druckregulation; 5)

Nährlösungszulauf; 6) Kultureimer mit Pflanze, 7) Nährlösungsrücklauf, 8) pH-Regeleinheit mit Elektrode, Regelventil und

Vorratsbehälter für KOH, 9) Dreibein als Halterung

Die fünf verschiedenen Systeme unterschieden sich aufgrund der NaCl-Konzentrationen. Es

wurde eine Kontrolle (ohne NaCl) und 4 NaCl-Varianten (125, 250, 375 und 500 mol * m-3

NaCl) in Basisnährlösung (siehe Tab. 1) kultiviert.


Stammlösung ml pro Liter Nährlösung 1 M KNO3 6 1 M Ca(NO3)2 4 1 M NH4H2PO4 1 1 M (NH4)2HPO4 1 1 M MgSO4 1 20 mM Fe-Na-EDTA 1 25,0 mM H3BO3 1 Spurenelementstammlösung : 1 50,0 mM KCl 2,0 mM MnSO4 2,0 mM ZnSO4 0,5 mM CuSO4 0,5 mM H2MoO4 pH: 6,6 – 6,8 Tab.1.1 Nährlösungszusammensetzung nach Johnson et al. (1957),

modifiziert nach Epstein (1972).


4. Thema: CNS-Analyse

4.1. Funktion des vario MAX CNS 1 CN

Der Elementaranalysator vario MAX CNS ist ein vollautomatisches Gerät zur schnellen und

quantitativen Analyse der Elemente CNS und CN. Das Gerät kann in zwei Betriebsarten/

Meßmodi die Elemente CNS oder CN simultan aus einer Probeneinwaage bestimmen.

Der Analysator vario MAX CNS ist ausschließlich zur Elementaranalyse von Proben bzw.

Probemengen geeignet, die sich unter den modusabhängigen Verbrennungsbedingungen

kontrolliert zersetzen lassen.

Außerdem ist nicht auszuschließen, dass bestimmte Substanzen, wie z.B. fluor-, phosphat-

oder schwermetallhaltige Proben, einen negativen Einfluß auf das Analysenergebnis oder die

Standzeiten von Gerätekomponenten haben können.

Bei strittigen bzw. schwierigen Anwendungen (siehe z.B. Sicherheitshinweis unten),

besonders wenn aggressive Verbrennungsprodukte auftreten können, sollten die Beratungs-

möglichkeiten eines Applikationslabors (z.B. von der Firma Elementar) genutzt werden.

4.2. Allgemeines Messprinzip

Der Elementaranalysator vario MAX CNS arbeitet nach dein Prinzip der katalytischen

Rohrverbrennung unter Sauerstoffzufuhr und hohen Temperaturen. Die Verbrennungsgase

werden von störenden Fremdgasen (z.B. flüchtigen Halogenen) gereinigt. Die jeweils


gewünschten Messkomponenten werden mit Hilfe von spezifischen Adsorptionssäulen von

einander getrennt und nacheinander mit einem Wärmeleitfähigkeitsdetektor (WLD) bestimmt.

Als Spül- und Trägergas dient Helium (He).

4.3. Analysenablauf

Die automatische Steuerung des Analysenablaufs erfolgt über die Software und die

probenspezifische Sauerstoffdosierung. Die O2-Dosierung kann über die Funktion Optionen

=> Dosierparameter in Form von max. 8 alphanumerischen Zeichen zugeordnet werden.

Im Folgenden wird nun der zeitliche und funktionelle Ablauf einer CNS-Analyse erläutert.

Mit Hilfe von Abb. 4 und den Zahlen/Buchstaben in Klammer kann der Ort des

beschriebenen Geschehens verfolgt werden. Abbildung 4 zeigt das Flussschema des CNS-

Modus.


Abb. 4.1. Funktionsschema vario MAX CNS


Abb. 4.2 Vereinfachtes Flussdiagramm der Auftrennung und des CNS-Nachweises im vario

MAX CNS Elementaranalysator

4.4. Probenzuführung

Die homogenisierten Proben werden in wiederverwendbare Tiegel (Keramik) eingewogen

und in den Teller des Probengebers eingesetzt.

Das Probengewicht wird entweder von der Waage über eine Schnittstelle online übertragen

oder manuell in den PC eingegeben.

Die Probenbezeichnung und die probenspezifische Sauerstoffdosierung (Funktion Optionen

=> Dosierparameter) wird dem Probengewicht zugeordnet. Danach kann die Analyse

gestartet werden.


Beim Messstart wird zunächst der Auto-Null-Abgleich des Detektors durchgeführt,

anschließend erfolgt ein Druckabbau (Ventil V6A wird geöffnet, Ventil V6B wird

geschlossen).

Danach fährt der Probengreiferarm aus dem Verbrennungsrohr heraus, streift den Tiegel der

vorausgegangenen Analyse ab und holt den nächsten Tiegel vom Probenteller. Gleichzeitig

erfolgt über das Ventil V 10 eine intensive Gegenspülung des Verbrennungsrohrs, um das

Eindringen von Luftstickstoff (=> Stickstoffblindwert) in das offene Verbrennungsrohr zu

verhindern.

Die Gegenspülung, wird beendet, wenn sich der Probengreiferarm wieder im

Verbrennungsrohr befindet.

Parallel zum Beschickungsvorgang wird außerdem über den MFC K1 ca. 300 mL/min

Helium gespült, um den neuen Tiegel stickstofffrei zu spülen.

4.5. Substanzaufschluß und Entfernung von Fremdgasen

Nach dem Ende der Beschickung erfolgt die Sauerstoffdosierung in den Probentiegel (über

V4,V1 und O2-MFC) durch den hohlen Probengreiferarm. Der Einschaltzeitpunkt der

Sauerstoffdosierung wird von der Ablaufzeit "O2-Verzögerung" im Menü Optionen =>

Parameter bestimmt. Die Sauerstoffdosiermenge wird über den der Probe zugeordneten

Dosierparameter eingestellt.

Die Sauerstoffdosierzeit ergibt sich "halbautomatisch" und zwar einerseits

- in der Betriebsart CNS aus einer Kombination von Verbrennungszeit (=> Dosierparameter)

und Peakverlauf des N-Peaks

und andererseits

- in der Betriebsart CN aus einer Kombination von Verbrennungszeit (=> Dosierparameter)

und dem am Ende der Verbrennung gemessenen O2-Überschuß. Der O2-Überschuß wird

vom O2-Sensor gemessen.


Ca. 30-45 Sekunden nach dem Ende der Beschickung erfolgt der Integrator-Reset, der die

Integrationsanzeige auf Null setzt. Einige Sekunden danach beginnt der N-Peak bzw. die N-

Integration.

Bei der oxidativen Verbrennung entstehen aus den Elementen C, H, N und S neben

molekularem Stickstoff (N2) die Oxidationsprodukte CO2, H20, NO., SO2, SO3 sowie

überschüssiger Sauerstoff. Falls die Probe Halogene enthält entstehen außerdem noch

flüchtige Halogenverbindungen.

Im Verbrennungsrohr befindet sich eine Füllung aus WO3-Granulat. Im nachgeschalteten

Reduktionsrohr (Füllung Kupfer) werden Stickoxide und SO3 quantitativ zu N2 und SO2

reduziert, der überschüssige Sauerstoff wird gebunden, Halogene werden an Silberwolle

gebunden. Sofort nach dem Reduktionsrohr erfolgt die Trocknung der Gase an Sicapent.

Die Gase durchströmen nun die SO2-Adsorptionssäule und anschließend das

Nachverbrennungsrohr (Füllung Cu0 + Pt-Kat. + Kupfer).

Im Nachverbrennungsrohr werden noch nicht quantitativ oxidierte Kohlenstoffverbindungen

(z.B. CO, CH4) quantitativ zu CO2 oxidiert. Hinter dem Nachverbrennungsrohr befindet sich

die CO2-Adsorptionssäule. Aus Sicherheitsgründen ist der CO2-Adsorptionssäule nochmals

eine Feintrocknung nachgeschaltet.

Im Falle der CN-Betriebsart werden andere Rohrf'üllungen verwendet und der Gasweg ändert

sich: Verbrennungsrohr -> Nachverbrennungsrohr -> Wasserabscheider Membrantrocknung -

-> Feintrocknung -> CO2-Adorptionsssäule. SO2 und Halogene werden im Reduktionsrohr

chemisch gebunden.

4.6. Trennung der Meßkomponenten

Da der Wärmeleitfähigkeitsdetektor nicht spezifisch zwischen den verschiedenen

Komponenten des Reaktionsgases unterscheiden kann, müssen die Reaktionsprodukte N2 und

CO2 und SO2 einzeln und nacheinander vom Trägergas in die Meßzelle gespült werden. Die

Trennung der Meßkomponenten erfolgt durch Adsorption des CO2 und SO2 auf beheizbaren

Säulen. Der von den Adsorptionssäulen unbeeinflußte Stickstoff wird als erste Komponente

im WLD gemessen.


Nach dem N-Integrationsende wird der Integralwert gespeichert.

Im Falle der CNS-Messung wird zunächst der C-Integrator-Reset durchgeführt, die CO2-Säule

wird geheizt (Zur CO2-Desorption) und der CO2-Peak integriert.

Danach erfolgt die Gasweg-Umschaltung (Ventile V9A/B), (Umgehung der CO2- Säule), der

S-Integrator Reset wird durchgeführt, die SO2-Säule wird geheizt und der SO2-Peak wird

integriert.

Anmerkung: Zur Abtrennung von CO2-Spuren, die sich auf der SO2-Säule befinden, erfolgt

die SO2-Desorption in zwei Temperaturstufen.

Nach dem SO2-Integrationsende erfolgt der nächste Analysenstart.

Bei der CN-Messung erfolgt der nächste Analysenstart nach dem C-Integrationsende.

Ansonsten bleibt der Ablauf identisch.

4.7. Detektion

Der Wärmeleitfähigkeitsdetektor besteht aus zwei Messzellen, welche mit jeweils konstanter

Stömungsgeschwindigkeit durchströmt werden. Bei Messpausen kann der Trägergasfluß

abgestellt werden, da die Messzellen resistent gegen Sauerstoff sind. Im Betrieb wird die

Referenzmesszelle mit reinem Trägergas He (Referenzgasstrom) gespült, während die andere

vom Messgasstrom, d.h. von der jeweilig desorbierten Fraktion des Reaktionsgases (z.B.

He/N2 - He/CO2-oder He/SO2 - Gemisch), durchflossen wird.

Die zwei Messzellen bilden eine Messbrücke, deren elektrische Verstimmung ein direktes

Maß für den Elementanteil im Messgasstrom darstellt. Die- Zellenausgangsspannung wird in

Abhängigkeit von der Zeit aufgezeichnet, digitalisiert, integriert und als Integralzahl

dargestellt.

Über eine Kalibrierung für jedes Element wird die Integralzahl einem absoluten

Elementgehalt der Probe zugeordnet. Aus dem gefundenen Gehalt und der Einwaage wird der

prozentuale Elementgehalt der Probe berechnet.


Der zeitliche Verlauf des Messsignals kann über die Funktion Ansicht => Grafik auf dem

Bildschirm darstellt werden (s. Kap. 7). Abbildungen eines typischen Messpeakverlaufes sind

in Kapitel 7 unter den jeweiligen Betriebsmodi einzusehen.

Vor Beginn einer Analyse erfolgt ein automatischer Nullabgleich, so dass eine mögliche

Nullpunktdrift des Detektors kompensiert wird. Vor jeder Integration einer Gaskomponente

wird die Integrationsanzeige auf Null gesetzt. Der Zeitpunkt dieses Integrator-Resets kann

durch die "Integrator-Reset-Verzögerung" im Parameter- Menü (s. Kap. 5.3.5) beeinflusst

werden.

Die Empfindlichkeit des Detektors kann vom Anwender verändert werden.

Für die Elemente N, C und S stehen jeweils zwei Empfindlichkeitsstufen (empfindlich /

unempfindlich) zur Verfügung. Die Einstellung erfolgt im Menü Modus =>

Empfindlichkeit.

4.8. Gerätespezifikation und technische Daten

4.8.1. Spezifikation

Analysenmethode Elementaranalyse der Elemente N, CN, CNS aus einer Probe Katalytische Rohrverbrennung der Proben, Abtrennung der Fremdgase, Auftrennung der gewünschten Meßkomponenten, WLD-Detektion.

Einwaage/Probenvolumen 5 mg bis 5 g (1 g organische Substanz, max. 5 mL, max. 400 mg C)

Meßbereiche CNS 0,02 - 30 mg N abs.

0,02 - 200 mg C abs. 0,02 - 15 mg S abs.

CN 0,02 - 150 mg N abs. 0,02 - 200 mg Serienausrüstung 0,02 - 400 mg C abs. mit C-Adsorptionssäule Best.Nr. 25.00-0091

Präzision/ < 0,5 relativ mit ca. 60 mg Sulfadiazin Standardabweichung


Wiederfindungsrate > 99,5 % für Testsubstanzen Analysendauer Selbstoptimierend,

8 - 12 Minuten bei CN simultan 10 - 14 Minuten bei CNS simultan, einwaagenabhängig, substanzabhängig

Kalibration linear und Kurvenanpassung; gegebenenfalls in 2 Abschnitten

Datenspeicherung bzw. Speicherung auf Festplatte oder Diskette. Datenausgabe LIMS-Übertragung möglich.

Datenausgabe auf Bildschirm und Drucker.

4.8.2. Technische Daten

Detektor Wärmeleitfähigkeitsdetektor (WLD) Steuer- und Auswerteeinheit PC mit Windows® Betriebssystem Drucker

(optional) Software Deutsch oder Englisch,

menügeführt, Statusanzeige während der Analyse, Echtzeitgrafik

Schnittstellen RS 232 /V24, Sicherheitskleinspannung .gemäß DIN IEC 380/VDE 0806/08.181

Abmessungen 780 x 560 x 700 mm (B x T x H) für das Grundgerät zuzügl. 200 mm Abstand von Wänden

Gewicht ca. 130 kg Netzspannung 230 Volt AC 10 %, 50/60 Hz Energieverbrauch 0,8 kW Anschlusswert 1,6 kVA Schutzklasse I, Schutzleiteranschluß Schutzart IP 20, Aufstellung nur in trockenen Räumen Geräuschpegel 55 dB (A), 'nach DIN 45635 Teil 1 Umgebungstemperatur zulässig max.. + 35'C

min.: + 15'C

Versorgungsgase He, Reinheit 99,996 %, ca. 750 mL/min. 02, Reinheit 99,995 %;


Normung CE-Konformität gemäß den EG-Richtlinien EMV

89/336/EWG und LVD 73/23/EWG

4.8.3. vario MAX Hilfe-System (das Dialogfeld Daten-Eingabe) Dieses Dialogfeld erlaubt das Eingeben bzw. das Modifizieren von Probendaten. Nachfolgend sind die darin enthaltenen Bedienelernente und deren Bedeutungen beschrieben: Nr.

In diesem Feld können Sie die Nummer der Probe eingeben, die Sie bearbeiten möchten. Sobald Sie nach Eingabe einer Probennummer auf ein anderes Feld wechseln, werden die .Bedienelemente mit den Daten der Probe, deren Nummer Sie soeben eingegeben haben, aktualisiert.

Name In diesem Feld können Sie den Namen der Probe eingeben bzw. verändern. Ein Probenname kann bis zu 16 Zeichen lang sein.

Gew. / Vol.

In diesem Feld können Sie das Gewicht in [mg] bzw. das Volumen in [ml] der Probe eingeben bzw. verändern.

Optionen mg und ml

Wählen Sie die entsprechende Option in Abhängigkeit der zu analysierenden Probe. Die Wahl "mg" bewirkt automatisch die Berechnung der Elementkonzentrationen in „%“ die Wahl "ml" bewirkt automatisch die Berechnung der Elementkonzentrationen in "mg/L".

02-Param.

In diesem Feld können Sie den Namen eines 02-Parametersatzes für die optimale Verbrennung der Probe eingeben bzw. verändern. Hinweis. Um einer fehlerhaften Eingabe vorzubeugen, empfiehlt es sich, anstelle der Direkteingabe den, 02-Parametersatz aus einer Liste auszuwählen. Hierzu klicken Sie einfach das Dialogfeld Verbr.-Parameter wählen. Dort können Sie den passenden Parameter aus einer Liste auswählen.

Prot.-Fakt.

In diesem Feld können Sie den Proteinfaktor eingeben bzw. verändern. Feuchte[%1

In diesem Feld können Sie den Feuchtegehalt der Probe eingeben bzw. verändern. Hinweis- Der Wertebereich für diese Eingabe ist auf 0 bis 99,97% begrenzt. Bei Eingaben kleiner als 0% setzt das vario MAX Programm automatisch den Wert auf 0, bei Eingaben größer als 99',9% auf 99,9%.

Markiert

Durch Klicken auf dieses Feld können Sie die jeweilige Probe markieren. Eine markierte Probe wird hier durch ein Häkchen angezeigt. Durch nochmaliges Klicken kann die Markierung wieder aufgehoben werden.


Letzte Pos. merken Wenn dieses Feld aktiviert ist, bewirkt dies, daß zukünftige Eingaben spaltenweise erfolgen können: Nach Klicken auf die Schaltfläche Nächste (bzw. Vorh.) wird der Datensatz der nächsten (vorherigen) Probe angezeigt und der Eingabekursor befindet sich wieder an der Stelle, wo er zuletzt war. Bei deaktivierteffi Feld befindet sich nach dem Weiterschalten dagegen der Eingabekursor immer im Feld Nr..

Fläche

In diesem Feld können Sie den entsprechenden Flächenwert der Probe eingeben bzw. verändern.

Blindw. In diesem Feld können Sie den entsprechenden Blindwert der Probe eingeben bzw. verändern.

Faktor

In diesem Feld können Sie den entsprechenden Tagesfaktor der Probe eingeben bzw. verändern.

Nächste

Klicken auf diese Schaltfläche bewirkt die Übernahme der eingegebenen Daten und das Weiterspringen zur nächsten Probe.

Vorh.

Klicken auf diese Schaltfläche bewirkt die Übernahme der eingegebenen Daten und das Weiterspringen zur vorherigen Probe.

Schließen

Klicken auf diese Schaltfläche bewirkt die Übernahme der eingegebenen Daten und das Schließen des Eingabedialogs.

Abbruch

Klicken auf diese Schaltfläche bewirkt das Schließen des Eingabedialogs. Die Änderungen an der zuletzt bearbeiteten Probe werden ignoriert.

Spalte

Klicken auf diese Schaltfläche bewirkt, dass der Inhalt derselben Spalte von der vorausgehenden Probe übernommen und zur nächsten Probe gesprungen wird. Dieses Verhalten ermöglicht so das spaltenweise Kopieren von Daten.

Zelle

Klicken auf diese Schaltfläche bewirkt, dass der gesamte Inhalt der vorausgehenden Probe übernommen und zur nächsten Probe gesprungen wird. Dieses Verhalten ermöglich so das zeilenweise Kopieren von Daten.

Einfügen

Klicken auf diese Schaltfläche bewirkt, dass an die aktuelle Position eine Blanko-Probe (d. h. eine Probe mit voreingestellten Daten) eingefügt wird. Alle folgenden Proben rücken somit um eine Position weiter.


Löschen Klicken auf diese Schaltfläche bewirkt, daß die Probe aus dem Probenspeicher entfernt wird. Alle folgenden Proben rücken somit um eine Position zurück.

4.9. Standardkurven

Für die Erstellung von Standardkurven dient eine 3 Punktekalibrierung, d.h. es sollten 3

verschiedene S-Mengen im Bereich der zu erwartenden Ergebnisse eingesetzt werden. Die

Messmethode des CNS-Analysators ermöglicht theoretisch die Kalibrierung mit einem

einzigen definierten Standard wenn die Einwaage entsprechend variiert wird. Für die

Kalibrierung des CNS-Analysators werden zunächst die werkseigenen Standards

Glutaminsäure- (C und N) und Sulfanylamid (S) eingesetzt. Zur Imitation der Matrixeffekte

wird außerdem ein pflanzlicher Standard (Gerste (AR2027), Alfalfa (AR2018, Maisgluten

(AR2017) eingesetzt.


4.10. Aufgabenstellung

Nach Beendigung der Standardmessung wird Blattmaterial von Quinoapflanzen verschiedener

Nährlösungsvarianten eingesetzt. Nähere Informationen der Probenanzahl und –typen erhalten

Sie am Versuchsbeginn.

Aufgabenstellung:

1) Diskutieren Sie die Messmethode und ihre Aussagekraft kritisch ! Welche alternativen

Messmethoden gibt es für die Bestimmung von C, N und S ? Diskutieren Sie das für und

wider !

2) Überprüfen Sie manuell die Kalibration des Geräts von S, C und N. Rechnen Sie

exemplarisch die Probenwerte nach und erläutern Sie die zugrunde liegende Formel.

3) Welche Unterschiede zwischen den Nährlösungsvarianten gibt es und wie können diese

Unterschiede interpretiert werden ?

5. Thema: Aminosäureanalyse mit der HPLC (FMOC-Methode)

Die von Tswett entdeckte Chromatographie wurde für analytische und präparative Zwecke

konsequent weiterentwickelt, so dass heute mehrere modifizierte Verfahren für die

Auftrennung der unterschiedlichsten Substanzgruppen zur Verfügung stehen.

Was ist HPLC (High Performance Liquid Chromatographie oder High Pressure Liquid

Chromatographie) ?

Mit Chromatographie bezeichnet man Trenn(analysen)verfahren, die durch Verteilung des zu

trennenden Stoffgemisches zwischen zwei nicht oder nur beschränkt mischbaren Phasen

ermöglicht werden. Dabei bewegen sich die beiden Phasen gegeneinander (beide Phasen sind

mobil) oder die eine bewegt sich gegen die andere (stationäre) Phase. Typische Techniken der

analytischen Chromatographie sind z.B. GC (Gaschromatographie), HPLC

(Flüssigchromatographie) oder SFC (superkritische Flüssigchromatographie) Die HPLC

wiederum kann in folgende Gebiete getrennt werden:

Reversed-Phase Chromatographie

Ionenaustausch Chromatographie (IC)

Ionenausschluss Chromatographie (ICE)


Ionenpaar Chromatographie (MPIC)

Normalphasen Chromatographie

Das Praktikumsgerät arbeitet nach dem Prinzip der Ionenaustausch-Chromatographie (HPIC,

High Performance Ion Chromatography). Diese Trennmethode beruht auf einem

Ionenaustausch-Prozess zwischen der mobilen Phase und den am Trägermaterial gebundenen

Austauschergruppen. Speziell bei stark polarisierbaren Ionen tragen auch nicht-ionische

Adsorptionsprozesse zum Trennmechanismus bei. Die Ionenaustausch-Chromatographie wird

für die Trennung von anorganischen und organischen Anionen und Kationen herangezogen,

wobei die Austauschfunktion für die Trennung von Anionen eine quartäre Ammoniumbase

und für die Trennung der Kationen eine Sulfonatgruppe ist.

Die preparative HPLC dient dem Prozess der Isolation und Aufreinigung von

Lösungsbestandteilen. Wichtig sind der Grad der Substanzreinheit und die

Durchlaufeffizienz, das heißt die Menge an Substanz die pro Zeit produziert werden kann. Die

analytische HPLC hat demgegenüber die Zielrichtung bestimmte Informationen über die

Probenzusammensetzung zu erhalten. Diese Informationen beinhalten Identifizierung,

Quantifizierung und Nachweisgrenze einer Substanz.

Die chemische Separation kann durch den Einsatz der HPLC erreicht werden. Diese Methode

basiert darauf, das sich die Migrationsraten (-zeiten) bestimmter Substanzen bei einem

gegebenen Säulentyp und bei einer bestimmten mobilen Phasenzusammensetzung

unterscheiden. Der Grad der Separation hängt hauptsächlich von der Wahl der stationären

Phase und der mobilen Phase ab.

Die Identifizierung der Substanzen mit der HPLC ist ein kritischer (entscheidender) Teil von

jedem HPLC-Assay. Bei der Aufreinigung werden zwei Phasen unterschieden. Eine

Vorreinigung kann zur Eliminierung störender Substanzen (z.B. Proteine bei der

Aminosäureanalyse) führen. Ziel der folgenden Auftrennung mit der HPLC ist ein

substanzspezifischer Peak bei bestimmten chromatographischen Bedingungen. Kunst der

HPLC ist es die Migrationsrate der zu analysierenden Substanzen so zu spreiten, das eine

eindeutige Peakauftrennung möglich ist und das alle anderen störenden Substanzen verzögert

oder beschleunigt die Säule durchlaufen. Zur Veränderung der Retentionszeiten können


verschiedene Parameter manipuliert werden. Zumeist wird zu diesem Zweck zunächst der

Säulentyp, die Zusammensetzung der mobilen Phase und die Fließgeschwindigkeit verändert.

Im Rahmen des Praktikums wird eine Möglichkeit für Aminosäureauftrennungen am Beispiel

verschiedener Nährlösungsvarianten der Strandaster demonstriert. HPLC kann aber auch für

die Aufreinigung von Substanzen wie Proteinen und Polynukleotiden verwendet werden. Die

Methodenentwicklung zur Identifizierung von Bestandteilen mit der HPLC wird begleitet

durch Literatursuche und durch „trial and error“! Dieser Teil der Arbeit ist zumeist weitaus

zeitkonsumierender als die letztendliche Messung. Es gibt dabei nicht eine Ideallösung für

alle denkbaren Probentypen. Eine Anpassung der Methode an das jeweilige Probenmaterial ist

generell notwendig. Z.B. bedingt eine hohe Salzfracht, wie es in Probenmaterial von den

Hochsalzvarianten der Strandaster vorkommt eine Vorreinigung des Probenextrakts mit

einem Ionenaustauscher, da sonst eine Resultatsverfälschung bis hin zur Zerstörung der Säule

erfolgen kann.


5.1. Extraktion der Aminosäuren mit Sulfosalicylsäure und internem Standard

(quantitative Fehlerbestimmung)

5.1.1. Deproteinisierung

Zur Analyse der freien Aminosäuren in Gewebehomogenaten ist es erforderlich, die noch in

Lösung befindlichen Proteine und Peptide zu entfernen. Für 5-Sulfosalicylsäure ergaben sich

die besten Werte bezogen auf Vollständigkeit der Fällung ohne Hydrolyse der gefällten

Proteine.

a) 0,4 g FG (0, 1 g TG) + 8,8 ml 4 % Sulfosalicylsäure, 0,0284 mM ß-Thienylalanin, 40

sec homogenisieren in großem Zentrifugenglas

b) Proteinfällung ca. 1 h auf Eis

c) Neutralisation mit 2 N NAOH (pH > 3)

1,2 ml 2 M NaOH (80,02 g NaOH/l) zugeben, schütteln

d) Zentifugation

Extrakt in Zentifugenröhrchen umfüllen und zentrifugieren (1 0 min x 20000 UPM)

e) Filtration über 0,45 µm Cellulose-Acetat-Filter (OE 67)

Überstand in 1 0 ml Schnappdeckelglas übertragen

Überstand mit 5 ml Kunststoffspritze aufziehen

0,45 µm Filter aufsetzen

Extrakt in Eppendorfgefäß überführen

Einfrieren bei -20 °C

Verdünnung (1:10) mit 0, 1 M Boratpuffer (pH 8,4 - 8,5)

0,1 ml des filtrierten Extrakts in Eppendorfreaktionsgefäß geben

0,9 ml 0,1 M Boratpuffer pH 8,5 zugeben und mischen

Einfrieren bei –20 °C

f) Verdünnung Das Erstellen einer Eichkurve einer Eichkurve erfolgt mit einem

Aminosäure-Standard-Gemisch, jeweils nach Wechsel der Säule oder der Detektor-

lampe

5.2. Beschickung des Autosamplers

a) 30 µl Pflanzenextrakt/Aminosäure-Standard-Gemisch in Vial füllen, mit Kappe und

Septum verschliessen und in den Autosampler stellen.

b) Derivatisierung mit FMOC-CI/Flüssig-Flüssig-Extraktion


Probenvial ohne Mikroinsert mit ImM acetonischer FMOC-CI-Lösung füllen

Probenvial ohne Mikroinsert mit Pentan-Ethylacetat (80:20 v/v) füllen

5.3. Programmierung des Autosamplers und PC's

a) Programm für Funktionsablauf im Autosampler erstellen

b) Automixing-Routine festlegen

A: 30 µl Transfer von 1 mM FMOC zu Proben und Standard Derivatisierung, Mixing:

4xmixing mit80% Spritzenvolumen, Luft, Reaktionszeit4 min.

B: 90 µl Transfer von Pentan/Ethylacetat

Flüssig-.Flüssig-Extraktion: Zugabe von 75 µl Pentan-Ethylacetat (80 % + 20 %)

Mixing: 6 x mixing mit 80 % des Spritzenvolums, Luft); dient der Reduktion von

Nebenprodukten des FMOC, die im Chromatogramm stören.

c) Sequenz erstellen

d) Sequenzfile mit Chromatographie-Software erstellen

e) Injektion

f) Methode: AMIDE

5.4. HPLC in Laufbedingungen überführen (Methode 1)

a) Trennsäule einbauen

b) Säule ca. 10-20 min mit 70 % Methanol spülen (Anschluß B)

c) Aqua. reinst und 70 % Methanol anschliessen und Gradient fahren (von 70 %

Methanol auf Startbedingungen für Analyse, 40 min)

time (min) A (%) B (%) C (%)

A.reinst. 70 % Methanol Acetonitril

0 0 100 0

15 0 100 0

20 75 0 25

100 75 0 25


Pmax: 250 atm equilibration time: 0 min

Pmin: 10 atm link to method #

column temp.: 32 °C analog output: B

Aux temp.: off

end time: 100 min flow: 1,4 ml/min

detector time constant: 0,5 Säulendruck Ende: ca. 134 atm

d) Eluenten A und B für Aminosäurcanalyse anschliessen und Säule equilibrieren (20

min),

5.5. Gradient für Aminosäuretrennung mit Amiden (Methode 2)

time (min) A (%) B (%) C (%)

Puffer A Puffer B Acetonitril

0 75 0 25

13 61 0 39

14,5 60 0 40

15 31 30 39

16 0 62 38

19,5 0 62 38

27 0 30 70

29 0 25 75

31 0 25 75

25 33 75 0

Pmax- 250 atm equilibration time: 0 min

Pmin: 10 atm link to method: #

column temp.: 32 °C analog output: B

Aux temp.: off




Die Gradientenelution endet mit 50 % Acetonitril. Dadurch ist gewährleistet, daß nach den

Aminosäurederivaten überschüssiges Reagenz und Nebenprodukte quantitativ von der Säule

eluiert werden.

5.6. Spülen der Säule mit 100 % Acetonitril (Methode 4)

time (min) A (%) B (%) C (%)

Puffer A Puffer B Acetonitril

0 75 0. 25

2 75 0 25

5 0 0 100

13 0 0 100 .

15 75 0 25


Pmin: 10 atm link to method: #

column temp.: 32 °C analog output. B

Aux temp.: off



5.7. Herunterfahren der HPLC (Methode 3)

Die Säule darf nicht länger als 2,4 h in Puffer gelagert werden. Um Bakterienwachstum zu

verhindern, wird die Säule in 70 % Methanol gelagert (Gesamtlaufzeit 30 min).

time (min) A (%) B (%) C (%)

A.reinst 70 % Methanol Acetonitril

0 75 0 25

5 0 100 0

50 0 100 0


Pmin: 1 0,atm link to method: #

column temp.: 32 °C analog butput: B


Aux temp.: off



5.8. Lösungen

4 % Sulfosalicylsäure mit 0,0284 mM ß-Thienylalanin

A) 40 g Sulfosalicylsäure in A.reinst lösen und auf 1000 ml auffüllen

B) 24,3 mg ß-Thienylalanin in ca. 400 ml Sulfosalicylsäure-Lösung lösen und auf 500

ml auffüllen; ergibt 0,284 mM ß-Thienylalanin

C) 1:10 verdünnen: 100 ml 0,284 mM ß-Thienylalanin mit 4 % Sulfosalicylsäure auf

1000 ml auffüllen. Fertiges Extraktionsmedium im Kühlschrank bis 1 Woche

aufbewahren oder in 2-3 Portionen zu ca. 102 ml abfüllen und in ffir späteres

Ansetzen des Extraktionsmediums in der Tiefkühltruhe lagern (maximal 6 Monate).

2 M NAOH

4,001 g NaOH in 50 ml A.reinst lösen.

0,1 M Boratpuffer (pH 8,5)

3,09 g Borsäure in 450 ml A.reinst lösen, mir 2 N NaOH auf pH 8,5 einstellen und auf

500 ml auffüllen. pH-Wert nach fünf Tagen nochmals überprüfen und eventuell

korrigieren. Lösung bei Zimmertemperatur aufbewahren (4 Wochen).

Lösungen für Aminosäure-Standard-Gemische

Aminosäure-Standard-Gemisch in 0, 1 M Boratpuffer (pH 8,5)

19 Aminosäuren 0,0025 mM (25 pmol/0,01 ml)

ß-Thienylalanin 0,0025 mM. (25 pmol/0,01 MI)

A) Glutamin

1 mM

36,55 mg Glutamin in ca. 200 ml A.reinst lösen und auf 250 ml auffüllen. Ein Aliquot

der Lösung (ca. 2x20 ml) bei -20 °C lagern. Wegen der Hydrolyse von Glutamin zu

Glutamat sollte die Lösung nur maximal 14 Tage verwendet werden.


0,02 mM (200 pmol/10 µl)

1 mM Glutamin 1: 50 mit 0,1 M Boratpuffer verdünnen (0,2 ml 1 mM Lösung mit

Boratpuffer auf 1 0 ml auffüllen)

B) Asparagin

1 mM

37,55 mg Asparagin in ca. 200 ml A.reinst lösen und auf 250 ml auffüllen.:Ein Aliquot

der Lösung (ca. 2x20 ml) bei -20 °C lagern. Wegen der Hydrolyse von Asparagin zu

Aspartat sollte die Lösung nur maximal 14 Tage verwendet werden.

0,02 mM (200 pmol/10 µl)

1 mM Asparagin 1:50 mit 0,1 M Boratpuffer verdünnen (0,2 ml 1 mM Lösung mit

Boratpuffer auf 1 0 ml auffüllen)

C) ß-Thienyl-Alanin

0,25 mM

21,4 mg ß-Thienyl-Alanin in ca. 450 ml A.reinst lösen und auf 500 ml auffüllen. Ein

Aliquot der Lösung (ca. 2x20 ml) bei -20 °C lagern. ß-Thienyl-Alanin ist im Gegensatz

zu den Amiden relativ stabil.

0,02m (200pmo1/10µl)

0,25 mM ß-Thienyl-Alanin 1: 12,5 mit 0, 1 M Boratpuffer verdünnen (1 ml 0,25 mM

Lösung. mit 11,5 ml Boratpuffer mischen)

D) AA-S-18-Standard von Sigma

2,5 mM

Dieser Standard liegt vor als 0,1 M HCI saure Lösung mit mehreren Aminosäuren,

(jeweils 2,5 mM, bis auf Cystin: 1,25 mM).

0,02 m (200 pmol/10 µl)

2,5 mM Lösung 1:125 mit 0,1 M Boratpuffer verdünnen (0,4 ml 2,5 mM Lösung mit

Boratpuffer auf 50 ml auff'üllen)


Herstellung des Aminosäure-Gemischs mit 25 pmol/ 10 µl ml der Aminosäuren (Cystin 2,5

pmol/ 10 µl)

2,5 ml 0,02. mM ß-Thienyl-Alanin

2,5 ml 0,02 mM Glutamin

2,5 ml 0,02 mM Asparagin

2,5 ml 0,02 mM H-Standard

1,0 ml 0, 1 M Boratpuffer

Gesamt: 20 ml

Herstellung des Aminosäure-Gemischs mit 5 pmol/10 µl der Aminosäuren (Cystin 2,5

pmol/10 µl)

2 ml 0,02 mM ß-Thienyl-Alanin

0,4 ml 0,02 mM Glutamin

0,4 ml 0,02 mM Asparagin

0,4 ml 0,02 mM H-Standard

12,8 ml 0,1 M Boratpuffer

Gesamt: 16 ml

Der fertige Standard wird in Eppendorfgefäße gefüllt (1 ml) und bei - 20 °C gelagert.

(Standardkonzentrationen: 1/ 2,5/ 5/ 12,5 und 25 pmol)

Derivatisierungsreagenz 4 mM FMOC-CI (9-Fluorenylmethyl)-chloroformiat)-Lösung in

Aceton

9-Fluorenylmethyloxycarbonyl (FMOC) ist ein Derivatisierungsreagenz, das 1983 erstmals

für die Pre-Column-Derivatisierung von Aminosäuren verwendet wurde. FMOC reagiert mit

primären und sekundären Aminen, die Derivate zeigen hohe Fluoreszensausbeuten, damit

werden Analysen bis in den fMol-bereich möglich. Da FMOC selbst und seine

Hydrolyseprodukte fluoreszieren und damit die Detektion der Aminosäurederivate stören,

muß vor der Chromatographie ein Extraktionsschritt eingefügt werden. Die Reaktion ist nach

45 sec abgeschlossen, die FMOC-Aminosäurederivate sind im Sauren über 30 Stunden stabil.

Die Fluoreszenz-Spektren von FMOC bzw. seiner Derivate zeigen ein Anregungsmaximum

bei 260 nm und das Emissionsmaximurn bei 310 nm. Die Nachweisgrenze bei Verwendung

eines Fluorometers und automatischer Injektion beträgt 800 fmol. Die Grenze der Detektion

liegt bei 1 FM pro Arninosäure. Ein bei der Derivatisierungsreaktion gebildetes


Hydrolyseprodukt kann durch die Extraktion nicht quantitativ entfernt werden und taucht im

Chromatogramm im Bereich der Aminosäurederivatr auf. Durch geringe pH-Verschiebung

läßt sich die Position des Hydrolyseproduktes verschieben, so daß auf diese Weise ein

interferieren mit Aminosäure-Peaks verhindert werden kann.

25,9 rng FMOC-CI abwiegen, in 25 ml Meßkolben umfüllen, mit Aceton bis auf Eichmarke

auffüllen, mit Stopfen verschliessen, kurz schütteln. Fertige Lösung im Kühlschrank dunkel

aufbewahren (mindestens 4 Monate haltbar). FMOC-CI-Lösung vor starkem Licht und vor

Kontakt mit Wasser schützen (zerfällt in FMOC-OH).

Extraktionsmittel Pentan/Ethylacetat (80:20 v/v)

80 ml Pentan und 20 ml Ethylacetat mischen. Im Kühlschrank aufbewahren.

Eluenten für die Aminosäureauftrennung

A) Eluent A (0,0 1 5 M Natriumcitrat, 0,01 M Tetramethylammoniumchlorid, pH 3,85)

8,823 g Natriurncitrat und 2,192 g Tetramethylammoniumchlorid in 1800 ml A.reinst

lösen. Ca. 3,2 ml 85 % Phosphorsäure zugeben (pH ca. 4,00) und mit A.reinst auf 2000

ml auffüllen. Puffer kühl lagern und am nächsten Tag mit den pH-Eichlösungen

erwärmen (ca. 30 rnin in ein Wasserbad mit 25 °C stellen). pH-Wert des Puffers mit 85

% Phosphorsäure oder 2 M NaOH und 100 µl Pipette auf pH 3,85 einstellen. Puffer A

über 0,45 µm Celluloseacetatfilter filtrieren. In Glasflaschen unter Zugabe von ca. 0,5

ml Chloroform pro Liter Puffer lagern, um das Bakterienwachstum zu verhindern.

Puffer A bis zum Gebrauch bei 4 °C (im Kühlschrank) lagern. Direkt vor Gebrauch

nochmals pH-Wert prüfen (wichtig für die Trennung der Amide Glutamin und

Asparagin sowie für die Abtrennung des Alanins aus dem FMOC-OH Peak).

B) Eluent B (900 ml Eluent A pH 4,5 mit 100 ml Methanol

8,823 g Natriumcitrat und 2,192 g Tetramethylammoniumchlorid in 1800 ml A.reinst

lösen. Ca. 3,2 ml 85 % Phosphorsäure zugeben (pH ca. 4,00) und mit A.reinst auf 2000

ml auffüllen. Puffer kühl lagern und am nächsten Tag mit den pH-Eichlösungen

erwärmen (ca. 30 min in ein Wasserbad mit 25 °C stellen). pH-Wert des Puffers mit 85

% Phosphorsäure oder 2 M NaOH und 100 µl Pipette auf pH 4,5 einstellen. Puffer A

über 0,45 µm Celluloseacetatfilter filtrieren. 900 ml Puffer A mit 100 ml Methanol

mischen. Puffer B bis zum Gebrauch bei 4 'C (im Kühlschrank) lagern.


Spülflüssigkeit des Autosamplers

70 % Wasser mit 30. % Acetonitril mischen

Auswertung

Mit Hilfe eines geeichten Standards wird die Fluoreszenzausbeute der einzelnen Aminosäuren

bestimmt. Über die Fläche des internen Standards ß-t-Alanin können Verluste bei der

Probenaufarbeitung korrigiert werden. Die Intergration der Peakflächen und Kalibrierung

erfolgt über einen Integrator.

Typische Beispiele für Standardläufe:


Standardkurve für Asparagin:


Hydrolyse

Die am häufigsten verwendete Methode ist die saure Hydrolyse mit 6 N HCI bei 110°C unter

Stickstoff. Nach entsprechende Hydrolysezeit, z.B. 24 Stunden, in Hydrolysebomben

(verhindern ungewolltes Aufspringen der Gefäße im Hydrolyseofen und Zutritt von

Sauerstoff) wird der Inhalt in Eppendorfgefäße überfuhrt. Zum Schutz von Tryptophan

können 2% Thioglycolsäure zugegeben werden. Zur Entfernung der Salzsäure werden die

Hydrolysate mit NaOH neutralisiert. Vor der Derivatisierung werden die Proben in

entsprechenden Elutionspuffer aufgenommen.


Im Rahmen dieses Praktikumsversuchs sollen Sie den Grad der Wiederfindung von

Aminosäuren (Fehlerbestimmung), sowie qualitativ und quantitativ die

Aminosäurezusammensetzung von verschiedenen Nährlösungsvarianten der Quinoa Kulturen

bestimmen Nach Beendigung der Standardmessung wird Blattmaterial von Quinoapflanzen

verschiedener Nährlösungsvarianten eingesetzt. Nähere Informationen der Probenanzahl und

–typen erhalten Sie zum Versuchsbeginn. Die Aufarbeitung des Probenmaterials, die

Beschickung der HPLC und die Auswertung erfolgt nach den Angaben in den Kapiteln 4.1

bis 4.7.

1) Ordnen Sie die HPLC in das Spektrum chromatographischer Messmethoden ein.

2) Diskutieren Sie die Messmethode und ihre Aussagekraft kritisch !

3) Überprüfen Sie manuell die Kalibrierung des Geräts für Asparagin und Prolin.

Rechnen Sie exemplarisch die Probenwerte für diese beiden Aminosäuren nach und

erläutern Sie die zugrunde liegende Formel !

4) Welche Unterschiede zwischen den Nährlösungsvarianten gibt es und wie können

diese Unterschiede interpretiert werden ?


Typischer HPLC-Ausdruck der Aminosäurezusammensetzung von Kontrollblättern:

9


9. Thema: Bestimmung von K, Ca und Mg mittels Flammen-AAS

9.1 Probenvorbereitung 9.1.1. Aufarbeitung des Pflanzenmaterials Zur quantitativen Bestimmung von K, Ca und Mg mittels atomspektrometrischer Analyse (Flammen-AAS) wurden die Proben durch Veraschung und anschließendes Kochen in Salpetersäure aufgeschlossen. Hierzu wurden 0,5 g des gemahlenen Pflanzenmaterials in Porzellantiegel eingewogen und über 12 Stunden bei 550 0C im Muffelofen verascht. Die Asche wurde mit wenigen Tropfen Aqua bidest. benetzt, mit 2,5 ml 32 %iger HN03 aufgenommen und kurz zum Sieden gebracht.

Anschließend wurde der aufgeschlossene Tiegelinhalt quantitativ in Kolben überführt und mit A. bidest. auf 25 ml aufgefüllt. Nach guter Durchmischung wurde die Lösung durch einen Faltenfilter (MN 595 1/4, 0 185 mm) in Szintillationsgefäße filtriert. Damit die Konzentrationen der Proben im linearen Messbereich lagen, mussten folgende Verdünnungen erstellt werden (Tab. 8.1.) Element Fraktion Faktor Probe(ml) A. bidest(ml) Säure(ml) Kalium Korn 1: 5 2.00 8.00 Stroh 1: 25 0.40 9.44 0.16 Magnesium Korn 1:100 0.10 9.90 Stroh 1:100 0.10 9.90 Calcium Korn 1: 10 1.00 4.00 * Stroh 1:100 0.10 4.81 * 0.09 Tab. 9.1: Verdünnung der zu bestimmenden Elemente *Anmerkung: plus 5 ml Arbeitslösung

Alle Arbeiten wurden mit Eppendorf-Pipetten oder geeichten Dispensetten (größere Volumina) durchgeführt. Für die Calciumanalyse wurde zur Behebung möglicher Ionisationsstörungen Cäsiumchlorid, ein leicht ionisierbarer Stoff, dem A. bidest. zugegeben. Die zu diesem Zwecke erstellte Stammlösung enthielt 2,3 mg CsCl und 200 ml 1 N HCl, aufgefüllt mit A. bidest auf 1 1 Lösung. Eine Verdünnung der Stammlösung von 1 : 20 ergab die Arbeitslösung, welche im Verhältnis 1: 2 zum Gesamtvolumen der Proben und Standards hinzugegeben wurde. Für die Analyse der meßfertigen Proben stand ein Flammen-Atomabsorptionsspektrometer PE 2100 der Firma Perkin & Elmer zur Verfügung.


9.2. Die Kalibrierung

Um die Konzentrationen in Relation zum Meßsignal des Atomspektrometers zu bringen, wurden gebrauchsfertige Einelement- Standardlösungen zur Kalibrierung verwendet. Die aus diesen Standard-Stammlösungen hergestellten Eichreihen, für jedes zu messende Element, sind in Tabelle 8.2 dargestellt. Hierzu gehörte jeweils auch ein Reagenzienblindwert. Beim Herstellen der Verdünnungsreihen war zu beachten, dass die Säurekonzentrationen der Kalibrierlösungen denen der Probelösungen entsprachen. Daher wurde den Standardlösungen (S1 – S8) die entsprechende Säuremenge zugegeben. Standard Kalium (mg/l) Magnesium (mg/l) Calcium (mg/l) S1 2 0,100 0,50 S2 5 0,200 1,00 S3 10 0,300 1,50 S4 15 0,400 2,00 S5 20 0,500 2,50 S6 25 0,600 3,00 S7 30 3,50 S8 4,00 Tab. 9.2: Konzentrationen der Eichlösungen für die zu bestimmenden Elemente

9.3. Prinzip der Methode und Durchführung Die AAS beruht auf folgendem physikalischem Prinzip: Atome können Lichtquanten derjenigen Wellenlängen absorbieren, die sie selbst emittieren. Die Probelösungen werden hierzu durch thermische Energiezufuhr in die Dampfphase überführt und durch diesen Dampf wird Licht mit der entsprechenden Wellenlänge gesendet. Das Licht wird durch eine Hochintensitäts-Hohlkathodenlampe (HKL) erzeugt. Das Ausmaß der Absorption ist proportional zur Konzentration des zu messenden Elements. Unter Ausnutzung des Lambert-Beer'schen Gesetzes kann aus der Abschwächung der Intensität dieses Lichtstrahles die Konzentration des zu analysierenden Elementes errechnet werden. Zum Aufbau eines AAS-Gerätes siehe Abb. 8.1.


a)

b)

Abb. 9.1: AA-Spektrometer PE 2100 nach Perkin & Elmer. a) Strahlungsführung (schematisch) 1 Primarstrahlungsquelle (HKL oder EDL), 2 Deuteriumlampe-Untergrundkompensator , 2.1 Deuterinmlampe, 2.2 Linse, 2.3 Strahlvereiniger , 3 Probenraum, 4A Brenner während der Meßwertbildung, Graphitrohrofen oder MHS-Kuvette, 4B Brenner während der Referenzmessung, 5 Monochromator, 5.1 Gitter , 5.2 Spalte, 6 Detektor b) Schematischer Aufbau eines Flammenphotometers (ohne Hohlkathodenlampe) bzw. Atomabsorptionsspektralphotometers (mit Hohlkathodenlampe) aus Volk (1996).


Die in Szintillationsgefäße vorgelegten Proben wurden durchmischt und anschließend

manuell der Analyse mittels Flammen-AAS unterzogen. Die Probelösungen wurden über eine

Ansaugkapillare in eine Zerstäuberkammer gebracht, in der die Zerstäubung zu einem feinen

(Photomultiplier)Aerosol erfolgte. Das getrocknete Aerosol wurde mit den Brenn- und

Oxidansgasen gemischt und in der heißen Flamme (Luft-Acetylen Gemisch) atomisiert. Das

Atomabsorptionsspektrometer wird über einen PC gesteuert, auf dem auch die Messdaten

gespeichert und aufbereitet werden können.

Durch die Messung der Eichlösungen wurde die Eichkurve ermittelt und mit zertifizierten

Standardreferenzmaterialien auf ihre Richtigkeit überprüft. Bei der anschliessenden Messung

der Probelösungen wurden die Extinktionen direkt bestimmt und die Ergebnisse als

Konzentrationsangaben ausgedruckt. Für die spätere Auswertung der Ergebnisse wurden die

Werte auf mg Nährstoffgehalt pro g Trockensubstanz umgerechnet.

Die optimale Einstellung der Geräte-Parameter Lampenjustage, Brennereinstellung und

Justierung des Zerstäubers erfolgte nach Bedienungshandbüchern der Firma Perkin & Elmer

(Software-Revision V9.0). In Tabelle 8.3 sind alle geräte- und probespezifischen Parameter,

die während der Analysen benutzt wurden, aufgeführt.

Kalium Magnesium Calcium Wellenlänge (nm) 770 285,2 422,7 Spaltbreite (nm) 0,7 0.7 0.7 Lampenstrom (mA) 8 10 10 Oxidans-Fluss (l/min) 8,o 7.4 8 Acetylen-Fluss (1/min) 3,1 2,5 2,6 Charakteristische Konzentration (mg/l) 0,043 0,008 0,092 Empfindlichkeitsprüfung (mg/l) 2,0 0,3 4,0 Linearer Bereich (mg/l) 20.0 0,5 5.0 Messwiederholungen 3 3 3 Kalibrierung AUTO AUTO AUTO Tab. 9.3 : Charakteristische Geräteparameter am AAS PE 2100

9.4. Betriebsschema AAS PE 2100 Im Einzelnen beschreibt das nachfolgende Betriebsschema die Bedienung des AAS PE 2100:


Besonders die nachstehend erläuterten Parameter mußten sorgfältig geprüft werden, um optimale Arbeitsbedingungen zu schaffen: Empfindlichkeitsprüfung: Mit der hier angegebenen Elementkonzentration wurde vor jeder

Analyse die Empfindlichkeit überprüft; es sollte damit eine Extinktion von mindestens 0,200 digits erreicht werden.

Charakteristische Konzentration: Diejenige Konzentration, welche eine Signalhöhe von 1%

Absorption (0,0044 Extinktion) bewirkt.


Im Rahmen dieses Praktikumsversuchs soll die Quantifizierung der Atomabsorption

nachgerechnet sowie qualitativ und quantitativ die Mineralstoffzusammensetzung (K,Ca,Mg

und Na) von verschiedenen Nährlösungsvarianten der Quinoa Kulturen bestimmt werden.

Nach Beendigung der Standardmessung wird Blattmaterial von Quinoapflanzen verschiedener

Nährlösungsvarianten eingesetzt. Nähere Informationen der Probenanzahl und –typen erhalten

Sie zum Versuchsbeginn. Die Aufarbeitung des Probenmaterials, die Beschickung der AAS

und die Auswertung erfolgt wie zuvor beschrieben.

5) Vergleichen Sie Analysemethoden mit ihren unterschiedlichen Messbereichen !


7) Überprüfen Sie manuell die Kalibrierung des Geräts für ein nachgewiesenes Atom.

Rechnen Sie exemplarisch die Probenwerte nach und erläutern Sie die zugrunde

liegende Formel !

Welche Unterschiede zwischen den Nährlösungsvarianten gibt es und wie können diese

Unterschiede interpretiert werden ?


10 Betriebsanleitung für die Ionenchromatographie

Abb.: 1 Fotografie vom Metrohm Ionenchromatograph 690 (a) und Blockschema (b) des Ionenchromatographiesystems

a)

b) N2-Begasung CO2-Absorber Injektor IC-Trennsäule Detektor IC-Pumpe 697 Abfall Eluent PC

Autosampler 698


Abb.:2 Blockschema der IC-Pumpe 697

Entlüftungsventil

Anzeige Bedienungselemente Pumpenköpfe

10.1 Ionenchromatographie 10.1.1 Ionenaustausch als Trennmechanismus Der überwiegende Teil der Ionenchromatographischen Trennungen erfolgt durch Ionen-austausch an stationären Phasen (Trennsäulen) mit geladenen funktionellen Gruppen. Es wird zwischen Kationen- und Anionensäulen unterschieden. In der Nähe der funktionellen Gruppen befinden sich die entsprechenden Gegenionen, welche gegen andere Ionen gleicher Ladung in der mobilen Phase ausgetauscht werden können. Der Austausch-Prozess ist für jedes Ion durch ein entsprechendes Ionenaustauschgleichgewicht charakterisiert, das die Verteilung zwischen mobiler und stationärer Phase bestimmt. Dieses Ionenaustauschgleichgewicht bestimmt (u.a. neben Flussrate des Eluenten und Druck in der Trennsäule) auch den Zeitraum der zum Durchfliessen der Trennsäule und zum Erreichen des Leitfähigkeitsdetektors benötigt wird. 10.1.2 Leitfähigkeitsdetektion Als universelle Methode zur Erfassung ionischer Komponenten nimmt die Leitfähigkeitsmes-sung (Konduktometrie) in der Ionenchromatographie eine zentrale Stellung ein. Als Leitfähigkeit bezeichnet man bei Elektrolytlösungen die Fähigkeit, in einem zwischen zwei Elektroden angelegten elektrischen Feld durch Ionenwanderung Strom zu transportieren. 10.1.3 Auswertung und Kalibrierung Die ionenspezifische Trennung führt zum zeitversetzten Durchlauf. Der Leitfähigkeitsdetektor misst permanent die Leitfähigkeit und zeichnet diese als Chromatogramm auf. Bei einem Chromatogramm, das mit einem Leitfähigkeitsdetektor aufgenommen wurde, ist die Fläche unter einem Substanzpeak direkt proportional zur Substanzmenge (in erster Näherung kann aber auch die Peakhöhe zur Erstellung einer Eichkurve verwendet werden). Zur Bestimmung der Peakflächen (bzw. –integral) werden heute fast ausschließlich elektronische Auswerte-systeme eingesetzt, die spezielle Algorithmen zur Kurvenglättung, Peakerfassung und Berücksichtigung von Basisliniendrifts enthalten.


Abb. 3 Ausschnitt eines typischen Chromatogramms mit Basislinie, (Brutto-) Peak , (

= Netto-Peakintegral plus Backgroundintegral)

t0 Analysebeginn tR1 Retentionszeit für die Substanz 1 tR2 Retentionszeit für die Substanz 2 10.1.4 Kalibrierung mit externem Standard Der direkte Vergleich der Signalgröße (Peakfläche oder Peakhöhe) in einer unbekannten Probe mit der von Standardlösungen der gleichen Substanz ist die in der Ionenchromatographie weitaus am häufigsten angewendete Methode zur Kalibrierung. Mit Standardlösungen unterschiedlicher Konzentration kann eine Eichkurve erstellt werden. Es ist prinzipiell für die Kalibrierung überaus wichtig, das konstante Volumina unter gleichbleibenden chromatographischen Bedingungen injiziert werden.


Abb. 4 Beispiel einer Standardkurve für das Anion Nitrat

10.2 Herstellung der Eluenten für Anionenchromatographie Für die Anionenchromatographie mit der Anionensäule PRP – X 100 (Fa. Metrohm) wird ein p-Hydroxybenzeosäure/Benzoat-Eluent verwendet. Zusammensetzung: 2,5 mmol/l p-Hydroxybenzoesäure 1 mmol/l Natriumbenzoat 2,5 % Methanol NaOH (1M) pH = 8,5 ( Leitfähigkeit ca. 300 µS/cm ) Anwendung: Bestimmung von F¯ , Cl¯ , NO2¯, Br¯ , NO3¯ , HPO4²¯, SO4²¯ Herstellung des Eluenten ohne Konzentrat: 345,3 mg 4-Hydroxybenzoesäure, 144,1 mg Natriumbenzoat und 25 ml Methanol werden in 900 ml

Reinstwasser gelöst. Es empfiehlt sich die Verwendung eines Magnetrührers da er wesentlich die

Durchmischung erleichtert. Der pH-Wert wird dann mit NaOH (1 M) auf pH 8,5 ± 0,1 eingestellt. Die Lösung

wird abschließend mit Reinstwasser auf 1 Liter aufgefüllt.


Herstellung des Eluenten mit Konzentrat: Zunächst wird eine Stammlösung (Konzentrat) hergestellt Sie enthält 3,453 g 4-Hydroxy-benzoesäure und 1,441

g Natriumbenzoat. Beide Substanzen werden zunächst in 250 ml Methanol gelöst und bis zum Endvolumen der

Stammlösung (1 Liter) mit Reinstwasser aufgefüllt. Hinweis: Das Konzentrat dieses Eluenten ist nur bedingt

lagerstabil ( ca. 2 –3 Wochen im Kühlschrank )

Der gebrauchsfertige Eluent wird wie folgt hergestellt: 100 ml Konzentrat wird mit ca. 800 ml Reinstwasser verdünnt und der pH-Wert mit NaOH (1 M) auf ca. 7 eingestellt. Danach wird bis zu einem Volumen von 1 Liter mit Reinstwasser aufgefüllt, diese Lösung membrangefiltert und der pH-Wert abschliessend auf 8,5 ± 0,1 eingestellt.

Hinweise: - Der Eluent muss während der Analyse permanent gerührt werden und sollte in einer

Kunststofflasche aufbewahrt werden. - Da der Eluent gegenüber CO2-Absorption relativ empfindlich ist, wird er mit N2

permanent belüftet und die Aufbewahrungsflasche zusätzlich mit einem CO2-Absorber ausgerüstet.

Die verwendeten Chemikalien zur Herstellung der Eluenten sollten mindestens den Reinheits-grad p. A.

aufweisen und es ist grundsätzlich Reinstwasser zu verwenden.

10.3 Probenaufarbeitung für IC 10.3.1 Herstellung von Presssaft Das gefrorene Probenmaterial ( - 20°C ) wird (falls es sich nicht ohnehin in einem Eppendorfgefäß befindet) in

ein Eppendorfgefäß überführt und darin mit dem Spatel oder einem geeigneten Pistill grob zerkleinert. Zur

Denaturierung der Proteine wird die Probe ca. 10 min bei 80°c im Wasserbad gekocht.

Der Boden des Eppendorfgefäßes wird mit einer heißer Nadel (oder Lötkolben) vorsichtig durchstochen.

WICHTIG: Um eine Verfälschung des Ergebnisses zu vermeiden sollte das Gefäß dazu trocken sein ! Vor dem

Anstechen sollte außerdem der Deckel des Eppendorfgefäßes zum Ablassen des Überdrucks kurz geöffnet

werden.

Anschließend wird das Probengefäß komplett geöffnet und mit festem Druck in ein weiteres, leeres Eppendorfgefäß gestellt. Dieses Eppendorfpaar wird nach dem Wiegen in eine Eppendorfzentrifuge verbracht. Auf die GENAU entgegengesetzte Position in der Zentrifuge wird ein weiteres leeres Eppendorfpaar gestellt, das nach Zugabe von Wasser als gleichschweres Gegengewicht dient. Alternativ kann auch eine zweite Probe (als Eppendorfpaar) als Gegengewicht dienen. Es können beliebig viele Proben bis zur vollständigen Bestückung der Zentrifuge hineingestellt werden. Die Zentrifugation erfolgt für 10 min bei 13000 Umdrehungen. Diese Methode ist für die IC nur wenig geeignet, da nur geringe Menge Presssaft entstehen. Die nachfolgenden Verdünnungen sind somit mit einem relativ großem Fehler behaftet. (Kommentar: Dieser Fehler tritt nicht auf wenn frisches oder gefriergetrocknetes Material in Wasser extrahiert werden – s.u.)


Der Presssaft wird anschließend verdünnt. Erfahrungsgemäss sind Verdünnungen (je nach Salzvariante) von V:V 1 : 1000, 1: 500 und 1 : 100 messbar. 10.3.2 Probenaufarbeitung mit Weinsäure Zur Verdünnung wird auch die Verwendung von Weinsäure empfohlen. Die Weinsäure dient u.a. auch zur

Reinigung der Trennsäule. Die verwendete Säule reagiert allerdings sehr negativ auf Analysen von

Weinsäureextrakten (0.01M). Die Basislinie steigt an , es entstehen riesige „Geisterpeaks“ und es ist keine

Analyse möglich. Weinsäure ist somit ungeeignet zur Probenaufarbeitung.

10.3.3 Probenaufarbeitung von Frisch-, Tiefkühl- und gefriergetrocknetem Material Die Einwaagen in Eppendorfgefäße betragen bei Frisch- und Tiefkühlmaterial (– 20°C ) zwischen 0,1 bis 0,3g, bei gefriergetrocknetem und gemahlenem Probenmaterial zwischen 20 und 30 mg. Das Frisch- und Tiefkühlmaterial wird zusätzlich mit einem Micropistill oder Spatel zerkleinert Das Probenmaterial wird vollständig (!) mit 5 ml Reinstwasser in ein großes Zentrifugenglas (Durchmesser ca. 3cm) überführt, dort 40 Sek mit einem Ultraturrax homogenisiert und anschließend in kleines Zentrifugenglas verbracht. Dieser zweite Transfer ist Voraussetzung für die anschließende, wasserverlustfreie Extraktion im Wasserbad (80 °C für 1 Stunde). Glasmurmeln sind ideal geeignet um diese kleinen Reagenzgläser zu verschließen ohne das ein Druckstau entsteht und verhindern außerdem eine ungeregelte Verdunstung. Nach Abschluss der Extraktion werden die Proben 15 min zentrifugiert (z.B. mit einer Heraeus Omnifuge), sukzessive durch Filter (Porengröße: 0,45µl) filtriert und je nach Bedarf mit Reinstwasser (normalerweise V/V=1/3) verdünnt. 10.4 Benutzung des Ionenchromatographs Metrohm 690 Zur Inbetriebnahme des Ionenchromatographs werden zunächst alle Bausteine (siehe Abb. 1 und 2) eingeschaltet.

- untere Pumpeneinheit : Hauptschalter – Rückseite und Standby–Taste – links unten - Ionenchromatograph 690 : Hauptschalter – links unten - Autosampler – roter Hauptschalter - zur Datenaufnahme Hauptschalter der oberen Pumpeneinheit der Varian HPLC-

Anlage einschalten (Begründung: In diesem Baustein befindet sich der A/D-Wandler und die Schnittstelle zum PC)

- Steckerleiste hinter dem Bildschirm zur Spannungsversorgung des PC einschalten - PC einschalten und hochfahren - Icon links oben (Computersymbol mit 3 Bildschirmen) anklicken und warten bis das

Programm Varian Star hochgefahren wird - im Menu Systemcontrol Feld File ( links oben) Activate Method anklicken - die Methode „ ANION 1 „ für Anionenchromatographie aktivieren - bis zum später erfolgenden Programmstart bleibt der PC in diesem Zustand !

10.4.1 Vorarbeiten für die Messung Jetzt wird zunächst der vorbereitete Eluent (s.o.) angeschlossen und 2 –3 Minuten mit N2 begast. Anschliessend wird die Zuleitung vom Eluenten zur Pumpe gelöst und mit


beiliegender Spritze zwei Füllungen mit Eluent zum Spülen durch die Zuleitung gezogen. Die Zuleitung wird danach wieder angeschlossen und das System damit wieder geschlossen. Zum Entlüften der Pumpe wird das Entlüftungsventil rechts oben geöffnet und die Taste PURGE im gedrückten Zustand gehalten. Die Pumpe arbeitet nun mit einem konstanten Fluss von 10 ml/min und entlüftet Leitungen sowie Pumpenköpfe, füllt sie mit Eluent und spült das Methanol/Wassergemisch heraus. (Zur Erklärung: Bei längerer Standzeit wird das System inkl. der Trennsäule mit einem Methanol/Wassergemisch (V/V=1/4) gespült um Druckänderungen zu vermeiden). Danach wird das Entlüftungsventil wieder geschlossen. Mit der Taste FLOW (gedrückt halten !) und mit Taste SET DATA ↑↓ einen Wert für Fluss von 0,5 ml/min angeben. Mit der Taste PUMP R / S wird die Pumpe eingeschaltet und der eingestellte Druck baut sich auf. Für die Anzeige des aktuellen Drucks muss von FLOW auf PRESSURE actual umgeschaltet werden. PRESSURE min und max geben die Druckbegrenzungen der Säule (nicht verändern) an. Der Druck wird in mPa (millipaskal) angegeben. Der Minimumdruck für die Anionensäule PRP X-100 von Metrohm beträgt 0,5 mPa, der Maximumdruck 18,5 mPa. Der Druck muss regelmässig überprüft werden ! Er darf 41 mPa nie überschreiten, da sonst die Trennsäule zerstört wird. Wenn der Druck bei der IC-Pumpe stabil ist wird die Flussrate in 0,5 ml Schritten bis auf 2,5 ml/min erhöht. Nun wird die Säule so lange gespült bis sich eine konstante Basislinie einstellt. 10.4.2 Programmierung des Autosamplers (AS) für die Standardmessung und Probenanalyse Vor der Analyse der Proben muss zunächst eine Eichkurve mit bekannten Standards erstellt werden (siehe Abb. 4). Die dazu benötigten Standardlösungen von 1, 5, 10, 25 und 50 mg/l werden in die Probengläser für den Autosampler ( AS ) gefüllt und in den Probenteller des AS gestellt. Die Position der Probengläser wird danach am AS einprogrammiert. Um den Progamm-Dialog zu starten, wird die Taste STOP gedrückt. In der Anzeige erscheint : VIAL NN Zuerst wird die Nummer des ersten Probenglases eingeben und dann die Taste ENTER gedrückt. VIAL 1 ENTER. In der Anzeige erscheint: THRU NN Nun wird die Position des letzten Probenglases im AS (z.B. Position 15), das analysiert werden soll eingetippt [oder derselben Nummer wie unter VIAL (z.B. Position 1), wenn die Probengläser einzeln programmiert werden sollen]. THRU 15 ENTER (oder THRU 1 ENTER) In der Anzeige erscheint INJ N An dieser Stelle wird die Anzahl Injektionen (Werte von 1 bis 3 also z.B. 2) pro Probenglas angegeben. Achtung - damit ist die Anzahl Messparallelen gemeint ! Bei Eingabe von „0“ werden die zuvor definierten Probengläser ( VIAL NN THRU NN) übersprungen. Bei Eingabe von „9“ werden diese Probengläser zum Spülen verwendet. Nach der Eingabe der gewünschten Nummer muss die Taste ENTER gedrückt werden. INJ 2 ENTER In der Anzeige erscheint TIME NNN Hier wird die Analysendauer je Durchgang (z.B. 20 min) eingegeben. Der Bereich umfasst jeden Wert von 0,01 bis 999 Minuten. TIME 20 ENTER


10.4.3 Programm-Start Die Programme werden durch Drücken der Taste START am AS gestartet. In der Anzeige erscheint dann INIT V Eingabe der Probenglasnummer der ersten Probe. INIT V 1 ENTER Der Probenteller dreht sich, bis sich die erste Probe unter der Injektionsnadel befindet. Als nächstes erscheint RINSE 0 Auswahl der Positionen von Probengläsern die zum Spülen der Säule verwendet werden (=Spül-Funktion RINSE ). Bei der Engabe von 0 wird jedes Probenglas gemäß Programm abgearbeitet. Eingaben von 1 bzw. 2 haben zur Folge, dass jedes ungerade bzw. gerade nummerierte Probenglas zum Spülen verwendet wird. RINSE 0 ENTER In der Anzeige erscheint dann LAST V Eingabe der Probenglasnummer für die letzte Probe, die injiziert werden soll. Die Eingabe von 99 erlaubt einen kontinuierlichen Betrieb. LAST V 15 ENTER Durch Drücken der Taste STOP wird der Programmablauf sofort beendet und der Auto- sampler kehrt in den Dialog-Modus zurück.


10.5 Datenerfassung und Auswertung Nach dem Programmstart (am PC) werden mit der Probenschleife (je Injektion) 100 µl Probenextrakt (oder Standardlösung) ins System gegeben. Das entspricht einer Menge von 100 ng je Anion und Injektion. Durch den Einbau einer anderen (z.B. größeren) Probenschleife kann die Probenmenge verändert (z.B. erhöht) werden und auf diese Weise der nachweisbare Konzentrationsbereich erweitert werden. Wichtig: Für die spätere Quantifizierung ist die Lösungsmenge ohne Bedeutung solange für Probe und Standards die gleichen Lösungsmengen ins System eingegeben werden. Die zeitlich versetzt aus der Trennsäule heraustretenden Anionen werden als Änderung der Leitfähigkeit (Messung mit dem Leitfähigkeitsdetektor) für einen Zeitraum von 15 bis 20 min aufgezeichnet.

Abb.5: Typisches Chromatogramm. In diesem Fall handelt es sich um eine Standard der je Anion 25pg enthält..

Die Chromatogramme werden nach Beendigung jedes einzelnen Durchlaufs als Datei gespeichert.

Für die Auswertung wird die jeweilige Datei geöffnet und ein Auswertungsprogramm gestartet (Details siehe Betriebsanleitung für die Aminosäure-HPLC). Das Programm erkennt bei der Auswertung automatisch die Peaks aufgrund der (zuvor ermittelten) ionenspezifischen Retentionszeiten [Ret.Time (min) s.u.]. Das Ergebnis der Auswertung wird als Textdatei (*.txt) abgespeichert.


10.5.1 Quantifizierung Für die weitere Quantifizierung wird der angegebene Wert im Feld Nettointegral [(Area (counts)] der Auswertung (s.o.) benötigt. Dieser Wert wird rechnerisch in die Funktion der Standardkurve des jeweiligen Anions A- (Abb.4 z.B. für Nitrat im angegebenen Beispiel y = +1.302484e+005x –1.504320e+004) an die Stelle des y eingesetzt. Als Resultat erscheint eine Angabe in „x mg A-/ 1000 ml“. Abb. 4: Beispiel für einen Textausdruck als Ergebnis der Auswertung

Es gibt einige Unterschiede bei der weiteren Quantifizierung von Presssaft und extrahierten Proben (gefriergetrocknete, tiefgekühlte oder frische Proben). 10.5.2 Berechnung der Konzentration eines Anions (in µmol] je Gramm Frisch-, Tiefkühl-

oder gefriergetrocknetem Material

x mg A- * Ev [ml] * Verd. 1000 1 µmol [A-] = ________________________ * _______________ * _______ in ______ 1000 [ml] Probengewicht [g] Mw g Probe x mg A- : Konzentration des Anions in der Probelösung (siehe Auswertung oben) Ev : Extraktionsvolumen in [ml] (routinemässig 5) Verd. : Verdünnungsfaktor (routinemässig 4) Mw : Molekulargewicht in [mg pro mmol]


10.5.3 Berechnung der Konzentration eines Anions (in mmol] je Liter Presssaft

x mg A- * Verd. 1 mmol

[A-] = ________________________ * _______ in ______

1000 [ml] Mw 1000 ml Pressaft

x mg A- : Konzentration des Anions in der Probelösung (siehe Auswertung oben) Verd. : Verdünnungsfaktor (routinemässig 100, 500 oder 1000) Mw : Molekulargewicht in [mg pro mmol] - 10.6 Aufgabenstellung

Im Rahmen dieses Praktikumsversuchs soll die Quantifizierung der Ionenchromatographie

nachgerechnet sowie qualitativ und quantitativ die Mineralstoffzusammensetzung (Chlorid,

Nitrat, Phosphat und Sulfat) von verschiedenen Nährlösungsvarianten der Quinoa Kulturen

bestimmt werden. Nach Beendigung der Standardmessung wird Blattmaterial von

Quinoapflanzen verschiedener Nährlösungsvarianten eingesetzt. Nähere Informationen der

Probenanzahl und –typen erhalten Sie zum Versuchsbeginn. Die Aufarbeitung des

Probenmaterials, die Beschickung der IC und die Auswertung erfolgt wie zuvor beschrieben.

8) Vergleichen Sie chromatographische Analysemethoden mit ihren unterschiedlichen

Messbereichen !


10) Überprüfen Sie manuell die Kalibrierung des Geräts für ein nachgewiesenes Atom.

Rechnen Sie exemplarisch die Probenwerte nach und erläutern Sie die zugrunde

liegende Formel !

Welche Unterschiede zwischen den Nährlösungsvarianten gibt es und wie können diese Unterschiede interpretiert werden ?

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