Methodenvergleich PCR-SSP/SSO

Testsysteme

SSP:BAG,Dynal,Olerup

SSO:Elpha,Dynal Reli

Vergleich SSP-SSO

SSP: Sequenz spezifische Primer

SSO: Sequenz spezifische Oligonukleotide

Elpha: Enzyme linked probe hybridization essay

Reli: reverse line dot blot essay

Vergleich SSP-SSO

Überprüft auf :– Eindeutigkeit des Ergebnisses– Notwendigkeit von Wiederholungen– Auflösungsvermögen und detektierte Allele– methodische Probleme– Auswertung– Kosten und Materialverbrauch– Zeitaufwand

Vergleich SSP - SSO

SSP Ergebnis nach

Amplifikation Zeitgewinn

SSO Cyclerbedarf

geringer Probendurchsatz

größer DNA-Bedarf geringer oft bereits im low-

resolution-Set hohe Auflösung

Prinzip der PCR-SSP

Genomischer DNA-Doppelstrang bei Erhitzung auf >92°C denaturiert.

Prinzip der PCR-SSP

5´

3´

3´

5´

Primerannealing bei 37 - 72°C

Antisenseprimer

Senseprimer

Prinzip der PCR-SSP

5´

3´

3´

5´

Elongation durch Taq-Polymerase bei 72°C

Wiederholung Denaturierung, Annealing und Elon-gation, bis PCR-Cyclen beendet.

Prinzip des Dynal RELI

SSO-Molekülewerden auf Membran

immobilisiert

Ziel-DNA wird mitbiotinmarkierten Primern

amplifiziert und dena-turiert auf die Membran

gegeben

Strepavidin-konjugiertes

Reportermolekülmacht Bindung

sichtbar(enzymatisch..)

Erscheinung des Reli-Test

Prinzip des Elpha

Capture Oligo-nukleotid istan Wand des

Reaktions-gefäßesfixiert

PCR-amplifizierte biotinylierte DNAbindet an fixiertes SSO

Streptavidin-reportermolekül

ist mit Enzym gekoppelt,das Substratum-wandlung ver-

mittelt

Im letzten Schritt wird das Substrat, z.B. O-phenylene-

diamin, als Farbreaktionumgesetzt

Erscheinung Elpha-Test

Vergleich SSP - SSO

SSP

Elpha

Reli

Vergleich SSP-SSO

27 Proben DRB und 26 Proben DQB in Vergleich

je 4 Homozygote in DRB und DQB pro Probe DRB:BAG,Elpha,Reli

DQB:Dynal/Olerup,Elpha, Reli

1 x DQB-SSP allein, 2 x DQB SSP-Reli

Vergleich SSP-SSO

SSP Elpha Reli Cycler 47 Min 33,5 Min 48,75 Min

(reine Ampl.)

Detektion 18 Min 110 Min 100 Min(ohne Auswertung)

DNA 12/30 µl 4/2 µl 4 µl(100 ng/ml)

DNA 1:1 1:19/1:22 1:72Verdünnung DQB DRB

Schritte 2 12 21ohne Amplifikation

Vergleich SSP-SSOKosten pro Test

SSP Elpha Reli Kitpreis pro Bestimmung

DRB 37,- 65,- 45,-DQB 15/12 65,- 42,-

ReagenziendNTP-Puffer 10,5

Taq Polymerase 0,86/0,36 0,36 inklusive

RestkostenMaterial, Fotographie, Zeit... 1,50 6/12Pf 6 Pf

Vergleich SSP-SSOHomozygotenerkennung

SSP Elpha Reli

DRB 1/4 1/4 1/4erkannt 4,-nicht erkannt 3,-;15,-;13,-

DQB 3/4 2/4 4/4erkannt 6,-;2,- 6,-;2,- 6,-;2,-nicht erkannt 6,- 6,-;2,-

DRB-Allele der Sets

Allele DRB1 WHO 1998, Elpha, BAG, RELI

221

148

194178

194213

WHO 1998 Serologie Elpha BAG 1 BAG 2 Reli

DQB-Allele der Sets

Allele DQB1 WHO 1998, Elpha, Dynal SSP, Olerup, Reli

39

30

3437 38 38

WHO 1998 Serologie Elpha Dynal SSP Olerup Reli

Reli-Auswerteprogramm

Elpha-Auswerteprogramm

Vergleich SSP-SSOElpha-Frequenzentscheidung

0%

20%

40%

60%

80%

100%

01xx 03xx 04xx 08xx 11xx 12xx 13xx 14xx 15xx 16xx

Allelfrequenzen im HLA-DRB1

01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 15 17 19

Vergleich SSP-SSOAllelfrequenzen DQB (KM)

0

5

10

15

20

25

30

35

DQ201

DQ202

DQ301

DQ302

DQ303

DQ304

DQ402

DQ501

DQ502

DQ503

DQ504

DQ601

DQ602

DQ603

DQ604

Vergleich SSP-SSOeindeutige Ergebnisse

SSP Elpha Relih/v a/v DR2

DR2

DRB 63% 85% 19% 52% 41% 70%

SSP Elpha Relialle Primerausfall

DQB 93% 77% 75% 100%

Vergleich SSP-SSOAuflösung

DRBSSP 15,5%Elpha h/v 82%

a/v 19,6%Reli 48,3%

DQBSSP 30%Elpha h/v 77%

a/v 74%Reli 71%

Vergleich SSP-SSOWiederholungen

SSP Elpha Relih/v a/v DR2 DR2

DRB- insgesamt 37% 15% 81% 41% 59% 30%- Ausfälle 19% 7% 11%- Ag Ausschl. 22% 7% 44% 26%- DR2 0% 4% 33% 30%

DQB- insgesamt 7% 62% 0%- Ag Ausschl. 7%- Ausfälle 0% 15%

Vergleich SSP-SSOSSP-Problemfälle

DRB: BAG-Set kann bei Vorliegen von DRB1*13 *1424 nicht sicher ausschließenbei Vorliegen von *13,- kann auch *1130 nicht ausgeschlossen werdenbei Vorliegen von *3,- kann auch *1420 nicht ausgeschlossen werden

Sets von Dynal oder Biotest zeigen dieses Problem nicht

Vergleich SSP-SSOSSP-Problemfälle

DQB in einem Fall einer DQB1*06 Homozygotie war ein *0304 nicht

auszuschließenin einem Fall einer DQB1*0301

Homozygotie war eine *03032 und *0306 nicht sicher auszuschließen

DQ 3 Splitaufteilung nur in DQ 7 möglich

Vergleich SSP-SSOElpha-Problemfälle

DRB bei Vorliegen von DRB1*03/04 und *11/12 ist im Bewertungsmodus

alle/vollständig auch *13 und *14 möglich

zusätzlich sind bei Vorliegen von *03,*07,*11,*12,*08

ebenfalls *13 oder *14 möglich

Vergleich SSP-SSOElpha-Problemfälle

DQB in Primermixen A oder B trotz positiver Kontrollbande kein

spezifisches Amplifikat in 31% der Amplifikationen; in diesen Fällen nur bei 75% korrelierendes Ergebnis

Wenn in jedem Mix spezifisches Amplifikat korrektes

Ergebnis in 78% d.F.

Vergleich SSP-SSOspezieller Fall Elpha

DNA Probe 990606SSP und Reli DQB1*02,-Elpha-Test:1) alle Kontrollen positiv DQB1* 0301,06012) PM A kein spezif. Amplifikat DQB1* 020x,030x3) PM A kein spezif. Amplifikat DQB1* 02,-

Vergleich SSP-SSOReli-Problemfälle

DRB Bei Vorliegen von 3,- oder 13,-Homozygotie ist auch heterozygote13,3 möglichBei HLA-DRB1*11,12 kann *13 nichtausgeschlossen werdenIm Falle DRB1*03,11 wird homozy-got 3,- oder 11,- von der Auswerte-software als wahrscheinlich angegeben

Vergleich SSP-SSOReli Problemfälle

DQBes steht keine Auswertesoftware zur Verfügung

Vergleich SSP-SSOspezieller Fall Reli

DNA Probe 990291SSP-Ergebnis DRB1*03,11Reli Auswertesoftware:1) 0308,-2) 1109,-3) 03xx,03084) 03xx,11xxreproduzierbar

Bewertung Elpha-Test VorteileVorteile::

– stabile DRB Amplifikation

– automatisches Waschen

– Gesamtprozeß-automatisierung verfügbar

– Mit Update ist eine Auswertung auch früherer Daten hinsichtlich neuer Allele möglich

– für DR2-Auftrennung werden Primer mitgeliefert

Nachteile:Nachteile:– instabile DQB Amplifikation– je nach Softwareeinstellung

werden bestimmte Allele aus der Bewertung ausgeschlossen

– sehr abhängig von technischer Ausstattung, die bei Defekt die Testdurchführung unmöglich macht

– Pipettierarbeit zeit- und materialaufwendig

– Dokumentation der Reaktion nur als Photometermeßwerte im PC und auf Ausdruck

– viel Material nicht im Lieferumfang

Bewertung Reli-Test Vorteile:Vorteile:

– sehr stabile Amplifikationen

– Testdurchführung mit wenig Materialaufwand

– Streifen sind zur Dokumentation archivierbar

– HLA-A und -B bereits verfügbar

– kaum mechanische oder elektrische Geräte nötig

Nachteile:Nachteile:– für DQB keine Auswerte-

software– keine Automatisierung

der Waschschritte oder des gesamten Ablaufs verfügbar

– schlechte optische Aufbereitung des Befundausdrucks

Bewertung SSP Vorteile:Vorteile:

– stabile Amplifikationen– Fotos des Gelbildes

zur Dokumentation archivierbar

– teilweise Automatisierung verfügbar

Nachteile:Nachteile:– hoher Platzbedarf im

Thermocycler– ausgefallene

Amplifikationen machen Neuansatz des gesamten Sets nötig

– höhere Kosten für Polymerase

– mehr Ethidiumbromid-gele als Sonderabfall

– mehr Pipettieraufwand für einen Patienten