Chlamydiendiagnostik mit der PCR:

Methodische Aspekte, vergleichendeUntersuchungen und Ergebnisse bei

Rindern

Wolfgang Gaede, Susanne Kenklies und Wolfgang Peter

Landesamt für Verbraucherschutz Sachsen-Anhalt, Fachbereich 4: Veterinäruntersuchungen und -epidemiologie in Stendal

Ausgangspunkt:Chlamydien als Problemkeim in derRinderhaltung und Zoonose-Erreger

• Erkrankungen von Rindern in Großviehhaltungen mitangenommener Beteiligung von Chlamydien(Fortpflanzungsstörungen, Bronchopneumonien,Mastitiden)

• Erhöhte Milchzellzahl in Beständen mit„Chlamydienproblemen“

• Forderung der Landwirte nach Einsatz bestands-spezifischer bzw. kommerzieller Vakzine

• Erkrankungen bei Tierpflegern mit Chlamydien-Titern• Ergebnisse des Milchmonitoring von

Sammelmilch/Rohmilch

Der Konflikt:

Wittenbrink et al.,1988:• Kulturelle und morphologische Untersuchung• 12 von 15 Rinder (=80%) positive Chlamydienisolierung

aus Vaginalschleimhaut ohne entzündlicheVeränderungen

Sting, 1997:Dank verbesserter Diagnostik mit Antigen-ELISA :• 33 % der Genitaltupfer und• 79 % der Nachgeburten und Feten positiv für Chlamydien

Zielstellung für die Diagnostik vonChlamydieninfektionen beim Rind :

Unmittelbar: Sicherer Antigen-Nachweis• Sensitivität für verschiedene Untersuchungsmaterialien• Spezifität (für Chlamydia und Chlamydophila sp.)• ggf. Spezies-Differenzierung

Langfristig: Aussagen zur Kausalität• Nachweis von Virulenzmarkern• Quantitative Bewertung

Das diagnostische Repertoire:

Serologie (ELISA, KBR)

Antigen-ELISA:• bis 2001: IDEIA Chlamydien-Antigen (DAKO)• ab 2002: PCE Chlamydia Screening und PCE-Blockingtest (DAKO)

PCR:• OMP-Gen (Kaltenböck et al. 1997 und Schiller et al. 1997)• 23SrRNA (Everett et al. 1999), derzeit Modifikation zur Verbesserung der Robustheit in Validierung• (16S/23S-Interspacer-Region - Hotzel 2002, pers. Mitteilung)

Kulturelle Anzüchtung (BGM, Brutei)

Chlamydiendiagnostik mit der PCR:

Methodische Aspekte, vergleichendeUntersuchungen und Ergebnisse bei

Rindern

Wolfgang Gaede, Susanne Kenklies und Wolfgang Peter

Landesamt für Verbraucherschutz Sachsen-Anhalt, Fachbereich 4: Veterinäruntersuchungen und -epidemiologie in Stendal

Epidemiologische Erhebungen zu Chlamydieninfektionenin Rinderbeständen Sachsen-Anhalts

Epidemiologische Erhebungen zu Chlamydieninfektionenin Rinderbeständen Sachsen-Anhalts

Chlamydia-Antigen-Nachweis 2002

Untersuchungsumfang:

? 432 Proben von

? 102 Beständen aus

? 20 Landkreisen

92%

8%

0%

negativ

PCR positiv

ELISA positiv

Landesübersicht

64%

5%

31%

negativ

PCR positiv

ELISA positiv

Chlamydia-Antigen-Nachweis 2001

Untersuchungsumfang:

? 404 Proben von

? 50 Beständen aus

? 16 Landkreisen

Landesübersicht

Methodenvergleich mit klinischemMaterial von Rindern aus 2001:

IDEIA-ELISA Chomp-PCR AnzüchtungMaterial n

pos neg pos neg pos neg

Organe 61 18 43 6 49 1 21Tupfer 250 122 95 16 229 2 186Milch 20 5 15 0 5 0 0

Summe 155 153 19 283 3 207ges. 308 302 300

%pos. 50,3 6,3 1,0(nach Peter, Gaede, Borgwardt, 2002)

Schlussfolgerung: Wahrscheinlich unspezifische Reaktionen imAntigen-ELISA bei Rinderproben (nicht bei Geflügel/Schaf)

Vergleiche im Rahmen einesImpfversuches (Chlamyvax FQ):

Anzüchtung PCE-ELISA PCE-Blocking(BGM) (Screening) (Bestätigung)

gesamt 312 12 312 303 142positiv 8 233 144

positiv (%) 3% 75% 48%fraglich 5negativ 299 12 79 159 142

negativ (%) 96% 100% 25% 52% 100%

Vaginaltupfter Chomp-PCR IDEIA-ELISA

Vorbericht: 3 Betriebe mit Reproduktionsstörungen und klinischer Verdachtsdiagnose Chlamydieninfektion

Nach Vakzinierung: - Serokonversion im ELISA - klinische Besserung für ca. 6-9 Monate

Ausscheidungsversuch(Applikation von Cp.abortus-LV):

Ablauf: - 1 Milchviehbetriebe ohne Verdacht auf Chlamydieninfektion (klinisch und KBR)

- einmalige Vakzinierung, Kontrolle Erregerausscheidung in Versuchs- und Kontrollgruppe

Ergebnis: - keine Ausscheidung des Impfstammes - keine signifikante Beeinflussung der ubiqitären Chlamydien

PCE-ELISA PCE-Blocking Sequenzierung(Screening) (Bestätigung) (BFAV Jena)

Vaginal- und Augentupfter

gesamt 176 176 176 7positiv 46 52* 7 1 23 x Cp. pecorum

positiv (%) 26% 30% 4% 0,6% 9 x Cp. psiitaci

Kotproben

gesamt 72 72positiv 38 41* 17 x Cp. pecorum

positiv (%) 52,8 56,9 14 x Cp. psiitaci

Chomp-PCR Real Time PCR

Vergleichende Untersuchungenan klin. und pathol. Proben 2003

Erläuterungen:*) 39/41 positiv: fehlende Übereinstimmung bei 8 Proben (1 Eihaut, 7 Tupfer), diese sind kulturell und im Antigen-ELISA ausnahmslos negativ

AnzüchtungScreening Bestätigung (BGM)

davonpositiv 39* 41* 42** 3*** 5****

PCE-Antigen-ELISA

263 Proben von Rindern

Chomp-PCR PCR-Sonde

**) 41 positiv: davon nur 13 Proben positiv in der PCR und 3 Proben positiv in der kulturellen Anzüchtung (ergo: Unspezifität)

***) 3 positiv: davon 2 Proben positiv in der kulturellen Anzüchtung, und alle 3 Proben positiv in der PCR

Vergleichende Untersuchungenan klin. und pathol. Proben 2003

****) Anzüchtung: insgesamt 44 PCR-positive oder -verdächtige Proben

davon 5 x positiv: - 3 x pos. und 2 x neg. in Screening-ELISA

- 2 x pos. und 3 x neg. in Bestätigungstest

AnzüchtungScreening Bestätigung (BGM)

davonpositiv 39* 41* 42** 3*** 5****

PCE-Antigen-ELISA

263 Proben von Rindern

Chomp-PCR PCR-Sonde

unter Bestätigungs-ELISA-negativen Proben sind: Cl 90: 8 Tupfer pos. PCR, 6 x pos. im Screening-ELISA,

2 x pos. in Anzüchtung, stallspez.Vakzine in Gießen in Arbeit

Untersuchung von Verdachtsprobenvon Rindern mit der PCR

13(5,2% )

249 26(4,5% )

601

57(6,7% )

849

31(9,5% )

366

0

200

400

600

800

1000

2000 2001 2002 August 03

positive PCR Summe PCR

Untersuchte Betriebe:- 2002: 135 Betriebe, davon 29 (21,5%) mit Reagenten- 2003: 31 „ „ 10 (32,3%) „ „

*) weitere Ergebnisse:

Chomp-PCR positivAntigen-ELISA negativ

Sequenzanalyse im BgVV / BFAV Jena: C. pecorum

Nachweis von Chlamydien mit derReal Time-PCR in Abortmaterial

*) weitere Ergebnisse:

Chomp-PCR positiv (Cp.psittaci)Antigen-ELISA negativ

Anzüchtung 2 x positiv, davon Vakzine in Herstellung

Nachweis von Chlamydien mit derReal Time-PCR in Zervixtupfern

ZusammenfassungBewertung diagnostischer Verfahren zum Chlamydien-Screening:• PCR: - Chomp-PCR und Real Time-PCR verfügen über vergleichbare und für die Falldiagnostik hinreichende Sensitivität - Vorteile Real Time-PCR: Semiquantitative Auswertung, weniger arbeitsaufwendig, geringeres Kontaminationsrisiko - Vorteile Chomp-PCR: Speziesdifferenzierung möglich aber gegenwärtig ohne Belang für klinische Wertung

• Antigen-ELISA (PCE) als Screening- und Bestätigungstest im Hinblick auf Sensitivität völlig unzureichend - Spezifität des Screeningtests ebenfalls unzureichend

Chlamydien als Infektionserreger beim Rind: - Abgrenzung ubiquitärer Schleimhautbesiedlung / Pathogen weiter unklar - keine „Rinderseuche“, aber einzelne Bestandserkrankungen möglich

Die Sorgen mancher Rinderhalter

© Zwickmühle Magdeburg: Unter allen Zipfeln ist Ruh

Herzlichen Dank

• Dr. Helmut Hotzel und Dr. Konrad Sachse;BFAV Jena

• Frau Uta Rahn, Frau Kerstin Schenk; Stendal