Mikroorganismen in der Arbeitsplatz- atmosphäre ... · 13 Verein zur Förderung der...

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Verein zur

Förderung

der Arbeitssicherheit

in Europa

Mikroorganismen

in der Arbeitsplatz-

atmosphäre

– Aktinomyceten

KommissionArbeitsschutz undNormung

Das Projekt „Kommission Arbeitsschutz und Normung“ wird finanziell durch das Bundes-ministerium für Arbeit und Sozialordnung gefördert.

Autoren Teil 1:Teil 2 und 3:

Dr. Gerhard Danneberg, Prof. Dr. Albert J. DrieselDr. Gerhard Danneberg, Regine ThelenTÜV Energie und Systemtechnik GmbH Abteilung: Institut für Sicherheit in der Biotechnologie (ISB) Unternehmensgruppe TÜV SüddeutschlandMergenthalerallee 27, 65760 Eschborn

Herausgeber Verein zur Förderung derArbeitssicherheit in Europa e.V.

Redaktion Kommission Arbeitsschutz und Normung (KAN)GeschäftsstelleAlte Heerstraße 111, 53754 Sankt AugustinTelefon (0 22 41) 2 31−34 53Telefax (0 22 41) 2 31−34 64

– 2., erweiterte Auflage Februar 1999 –

Gesamtherstellung Druckerei Plump OHG

ISBN 3−88383−517−X

Mikroorganismenin der Arbeitsplatz-atmosphäre– Aktinomyceten

KAN-Bericht 13

Verein zurFörderung der Arbeitssicherheitin Europa

Teil 1 KAN-Bericht: Mikroorganismen in der Arbeitsplatzatmosphäre – Aktinomyceten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

Teil 2 Ringversuch: Mikroorganismen in der Arbeitsplatzatmosphäre – Aktinomyceten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85

Teil 3 Vorschlag für eine Meßstrategie zur Erfassungluftgetragener thermophiler Aktinomycetenin der Arbeitsplatzatmosphäre . . . . . . . . . . . . . . . 103

Diese Neuauflage umfaßt im Teil 1 (Seite 3 – 84) den zuerst im Juni 1997 veröffentlichtenKAN-Bericht „Mikroorganismen in der Arbeitsplatzatmosphäre – Aktinomyceten“. Erwurde gegenüber der Erstauflage in einigen Punkten aktualisiert.

Erweitert wird dieser Bericht im Teil 2 (Seite 85 – 102) durch die Ergebnisse von zweiRingversuchen in den Jahren 1997 und 1998, die zur Erprobung des in der Studie ent-wickelten Meßverfahrens in einer Kompostieranlage durchgeführt wurden.

Teil 3 (Seite 103 – 106) enthält, basierend auf der Studie und den Ergebnissen des Ring-versuchs, den Vorschlag für eine Meßstrategie zur Erfassung luftgetragener thermophilerAktinomyceten in der Arbeitsplatzatmosphäre.

Inhaltsübersicht

Inhaltsverzeichnis

Zu diesem Bericht . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5Zusammenfassung der Studie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7Empfehlungen der KAN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

This Report . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12Summary . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14KAN’s recommendations . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

A ce propos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19Résumé . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21Recommendations de la KAN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

1 Einleitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

2 Welche Aktinomyceten sind relevant unter dem Gesichtspunkt des Arbeitsschutzes? . . . . . . . . . . . . 29

2.1 Arbeitsplätze mit einer möglichen Belastung durch Aktinomyceten . . . . . 34

3 Erfassung des Aktinomyceten-Gehalts in der Luft . . . . . . . . . . . 37

3.1 Einleitende Bemerkungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

3.2 Personengebundenes und nicht personengebundenes Sammeln . . . . . . 37

3.3 Verfahren zum Sammeln von Luftkeimen . . . . . . . . . . . . . . . . 39

3.3.1 Die Sedimentationsplattenmethode . . . . . . . . . . . . . . . . . . 393.3.2 Das Impaktionsverfahren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 393.3.3 Filtrationsverfahren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 423.3.4 Das Impinger-Verfahren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

3.4 Auswahl eines geeigneten Probenahmeverfahrens . . . . . . . . . . . 44

Teil 1Mikroorganismen in der Arbeitsplatzatmosphäre –Aktinomyceten

3.5 Strategie der Probenahme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50

3.6 Transport . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52

3.7 Nachweis und Differenzierung von Aktinomyceten im Labor . . . . . . . 56

3.7.1 Isolierung von Aktinomyceten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 563.7.2 Differenzierung im Labor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59

3.8 Alternativen zur Erfassung der kultivierbaren Aktinomyceten . . . . . . . 60

3.8.1 Staubmessungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 603.8.2 Alternative Verfahren zur Bestimmung

der Belastung der Luft mit Mikroorganismen . . . . . . . . . . . . . . 62

4 Ansätze für die Normung von Verfahren zur Erfassung von Aktinomyceten . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65

4.1 Literaturrecherche . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65

4.2 Recherche in der Datenbank PERINORM . . . . . . . . . . . . . . . 66

5 Empfehlungen für den Auftraggeber . . . . . . . . . . . . . . . . . 67

6 Forschungsbedarf . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69

7 Literatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71

Anhang/Annex/Annexe

1 Nährmedien/Culture media/Milieux de culture . . . . . . . . . . . 77

2 Vorschlag für eine Meßstrategie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79Proposal for a measuring strategy . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81Stratégie de mesure préconisée . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83

Teil 1Mikroorganismen in der Arbeitsplatzatmosphäre –Aktinomyceten

Zu diesem BerichtDie Kommission Arbeitsschutz und Nor-mung (KAN) wurde 1994 eingerichtet, umdie Belange des deutschen Arbeitsschutzesvor allem in der Europäischen Normunggeltend zu machen. Sie setzt sich zu-sammen aus Vertretern der Sozialpartner(Arbeitgeber, Arbeitnehmer), des Staates(Bund, Länder), des Hauptverbandes dergewerblichen Berufsgenossenschaften(HVBG) und des DIN Deutsches Institut fürNormung. Die KAN hat u.a. die Aufgabe,die öffentlichen Interessen im Arbeitsschutzzu bündeln und mit Stellungnahmen auf lau-fende oder geplante NormungsvorhabenEinfluß zu nehmen.

Zur Analyse von arbeitsschutzrelevantenSachverhalten in der Normung und zur Er-mittlung von Defiziten oder Fehlentwick-lungen in der Normungsarbeit vergibt dieKAN u.a. Studien und Gutachten.

Der vorliegenden Studie lag folgender Auf-trag zugrunde:

Während für eine Vielzahl biologischerAgenzien (z.T. auch als Summen- und Leit-parameter) die Erarbeitung einheitlicherMeßverfahren auf der Basis von Vorwissenmit vertretbarem Aufwand gegenwärtig alsleistbar angesehen wird, bereitet die Aus-arbeitung eines Verfahrens für Aktinomy-ceten große Schwierigkeiten.

Aktinomyceten sind grampositive Bakterien,die myzelartig wachsen (sog. „Strahlen-pilze“) und ubiquitär in der Umwelt, insbe-

sondere im Boden, vorkommen. EinigeArten verschiedener Gattungen besitzenpathogene Eigenschaften (z.B. Actinomy-ces, Nocardia) und können chronischeInfektionssyndrome hervorrufen. Danebenkönnen thermophile Aktinomyceten (z.B.Thermoactinomyces vulgaris, Saccharopoly-spora rectivirgula) beim Menschen eineexogen-allergische Alveolitis (EAA) aus-lösen. Die EAA wird durch Inhalationgroßer Mengen von in der Luft dispen-sierten Konidiosporen hervorgerufen. HoheKonidienkonzentrationen in der Atemluftfinden sich insbesondere bei bestimmtenArbeitsabläufen und im weiteren tech-nischen Umfeld des Menschen. Beispielehierfür sind landwirtschaftliche Betriebe(Farmerlunge), Kompostieranlagen, Pilz-zucht (Pilzarbeiterlunge), aber auch Räumemit technischer Luftbefeuchtung (Befeuchter-lunge).

Für die Bestimmung der Aktinomycetenkon-zentrationen in der Luft in Arbeitsbereichenstehen bislang keinerlei standardisierteMeßverfahren zur Verfügung. Da sie fürden Menschen durch ihre krankheitserzeu-genden Eigenschaften eine besonderemedizinische Bedeutung besitzen, ist einstandardisiertes Meßverfahren für Aktino-myceten von hohem Interesse, um in derZukunft eine einheitliche Beurteilung ver-schiedener Arbeitsplätze zu gewährleisten.Dabei stellen Aktinomyceten besondereAnforderungen an die Meßtechnik, da sieschwierig nachzuweisen sind. Neben

Zu diesem Bericht

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einer großen systematischen Vielfalt wach-sen Aktinomyceten auf den Kulturnähr-böden im allgemeinen wesentlich lang-samer als begleitende andere Bakterienund Pilze und bilden zudem kleinere Kolo-nien. Die Identifizierung gestaltet sichkompliziert, da neben der Heranziehungmorphologischer Kriterien auch unterschied-liche physiologische Tests, z.B. Abbauunterschiedlicher Biopolymere, durch-zuführen sind.

Ein zu entwickelndes Meßverfahren für Akti-nomyceten muß den spezifischen Ansprü-chen des Arbeitsschutzes genügen. Da dieLuftsporen der Aktinomyceten im Vergleichzu vegetativen Formen relativ austrock-nungsresistent sind, bietet sich ein Probe-nahmeverfahren auf der Basis des Filtra-tionsprinzips unter Beachtung der EN 481an.

Ziel einer Projektstudie müßte es dahersein, das vorhandene Wissen zur Messungvon Aktinomyceten aus der Literatur zu-sammenzutragen, ggf. Defizite zu be-schreiben und damit Ansätze für Aufgaben-verteilungen im Vorfeld der als notwendigerachteten Normung in einer vom BTS 4als wünschenswert erachteten WG 5„Probenahmeverfahren biologischer Agen-zien“ des CEN/TC 137 zu liefern, umdie Aussichten und Möglichkeiten für eineNormung zu beschreiben.

Die KAN dankt den Verfassern für dieDurchführung des Projekts und für die Vor-

lage des Berichts sowie den folgendenExperten für die kritische Begleitung unddie Unterstützung bei der Auswertung derArbeit:

Frau Dr. Arnold-SundermannVerwaltungs-Berufsgenossenschaft, Mainz

Herrn Dr. Dieter BrauerHoechst AG, Frankfurt a.M.

Frau Cornelia EckrichInstitut WAR, Technische Hochschule Darmstadt

Frau Angela JanowitzKAN-Geschäftsstelle, Sankt Augustin

Herrn Dr. Rüdiger PipkeBundesanstalt für Arbeitsschutz und Arbeits-medizin, Dortmund

Herrn Dr. RumlerArbeitsmedizinischer Dienst der Tiefbau-Berufsgenossenschaft, Höchberg

Herrn Dr. B. Schappler-ScheeleNiedersächsisches Landesamt für Öko-logie, Hannover

Frau Dr. Ursula SchiesTiefbau-Berufsgenossenschaft – Technischer Aufsichtsdienst –, München

Herrn Dr. D. TommerdichZentralverband des Deutschen Bau-gewerbes, Bonn

Frau Barbara Zeschmar-LahlBZL GmbH, Oyten

Frau Dorit ZimmermannKAN-Geschäftsstelle, Sankt Augustin

Zu diesem Bericht

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Die folgende Zusammenfassung der Studieund die Empfehlungen wurden von derKAN am 28. Juni 1996 verabschiedet.

Zusammenfassung der Studie

1 Einleitung

Im Rahmen der Studie wird zur Vor-bereitung eines standardisierten Meßverfah-rens zur Erfassung luftgetragener Aktinomy-ceten (gram-positive, überwiegend aerobe,mycelbildende Bakterien) in der Arbeits-platzatmosphäre das hierzu vorhandeneWissen zusammengestellt und ein erster An-satz für eine mögliche Normung erarbeitet.

Bedarf an einem solchen Meßverfahren be-steht, da luftgetragene Aktinomyceten – ins-besondere thermophile, thermotolerantesowie mesophile Arten – ein Risiko für denArbeitnehmer insbesondere durch die Aus-lösung einer allergischen Lungenerkran-kung, der exogen-allergischen Alveolitis(EAA), darstellen. Die für den Arbeitnehmergesundheitlich relevanten Aktinomycetenfinden sich vor allem in Kompostier-, Wert-stoffsortier- und mechanisch-biologischenRestabfallbehandlungsanlagen, in geschlos-senen Stallungen, Silos, Getreidemühlensowie Klimaanlagen und können bei derBodensanierung und der Pilzzucht in höhe-ren Konzentrationen in der Atemluft auf-treten.

2 Entwicklung einer Meßstrategie fürdie Bestimmung von Aktinomyceten

2.1 Probleme bei der Entwicklung einerstandardisierten Meßstrategie

Ein wesentliches Problem bei der Entwick-lung eines standardisierten Meßverfahrensbesteht darin, daß alle gängigen Verfahrenzur Quantifizierung der aerogenen Keim-konzentration lebens- und vermehrungs-fähiger Mikroorganismen auf der Kultivie-rung der gesammelten Keime beruhen. Auflange Sicht muß das Probenahmeverfahrenaber auch die Möglichkeit bieten, denGehalt an nicht-kultivierbaren abgestor-benen Zellen oder Zellfragmenten zu be-stimmen, da auch diese eine allergischeReaktion hervorrufen können.

2.2 Anforderungen an ein Meßverfahren

Das Meßverfahren sollte folgenden Anfor-derungen genügen:

l einfache Handhabung (hohe Mobilitätder Apparatur, einfaches Wechseln derMedien, einfache Reinigung bzw. Des-infektion, Unempfindlichkeit gegenAußeneinflüsse);

l geringer personeller, zeitlicher und finan-zieller Aufwand;

l hohe Leistungsfähigkeit (gute Reprodu-zierbarkeit, großer Meßbereich, Unter-scheidung verschiedener Parameter undPartikelgrößen, Erfassung auch ab-gestorbener Zellen oder Zellfragmente);

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l Ermittlung repräsentativer Meßergeb-nisse für die Exposition der Beschäftig-ten (durchschnittliche und maximale[worst case] Belastung).

l Nachweisgrenze, Empfindlichkeit undPräzision des Meßverfahrens sind ent-sprechend einem (noch zu entwickeln-den) vorläufigen, nationalen Orientie-rungswert für Aktinomyceten bzw.deren allergieauslösende Strukturein-heiten in der Luft am Arbeitsplatz aus-zuwählen. Dabei stellt dieser Orientie-rungswert den arbeitshygienischenStandard dar, der durch technischeMaßnahmen erreicht und möglichstunterschritten werden muß.

l Es sollten mehrere Parallelmessungendurchgeführt werden. Die Zahl der Ein-zelmessungen hängt von der Probe-nahmedauer ab und sollte mindestensdrei betragen.

l Zur Bestimmung der Hintergrundbela-stung sollte eine Kontrollmessung imAußenbereich auf der zum Wind hingerichteten Seite erfolgen.

2.3 Vorschlag für ein Meßverfahren

Es wird das zur Messung von Stäuben be-reits praxiserprobte Filtrationsverfahren fürdie Probenahme von Aktinomyceten ausder Arbeitsplatzatmosphäre empfohlen.

Dieses Verfahren bietet neben der Analyseder lebenden Zellen den Vorteil, daß prin-zipiell auch der Gehalt der Probe an nichtmehr lebensfähigen Zellen und Zellbruch-stücken (z.B. an spezifischen Allergenenüber Immunoassays oder an relevantenAktinomyceten durch spezifische DNA1-Sonden oder PCR2-Verfahren) bestimmtwerden kann. Allerdings besteht hier weite-rer Forschungsbedarf.

2.4 Strategie der Probenahme

Der Arbeitsplatz sollte zuerst hinsichtlichder möglicherweise vorkommenden Mikro-organismen sowie des zeitlichen Verlaufsder Exposition der Arbeitnehmer ab-geschätzt werden.

Es ist wichtig, daß

l die Probenahme in Atemhöhe und inunmittelbarer Nähe der Beschäftigtenerfolgt,

l die Probenahme zum Zeitpunkt derhöchsten Belastungen erfolgt, jedochauch relevante Arbeitsgänge mit erfah-rungsgemäß niedrigerer Belastung be-probt werden, sofern eine durchschnitt-liche Belastung ermittelt werden soll,

l kurze Probenahmezeiten verwendetwerden, um eine Schädigung des bio-logischen Materials möglichst geringzu halten (max. 60 Minuten),

Zu diesem Bericht

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1) DNA = Desoxyribonucleinsäure2) PCR = Polymerase chain reaction

l die verwendeten Filtermaterialien denäußeren Bedingungen (Temperatur,Feuchtigkeit) entsprechend angepaßtausgewählt werden.

2.5 Transport

Spezielle Anforderungen an das Transport-system für Aktinomycetenproben sind:

l Zeit zwischen Probenahme und Unter-suchung im Labor: < 24 Stunden,

l keine Zufuhr von Feuchtigkeit,l Transporttemperatur sollte maximal bei

Raumtemperatur liegen.

2.6 Nachweis und Differenzierung vonAktinomyceten im Labor

Da Aktinomyceten in der Regel langsamerwachsen als andere Bakterien und Pilze,sollte bei der Aufarbeitung im Labor dasKulturmedium so gewählt werden, daß esden Aktinomyceten einen Selektionsvorteilbietet.

l Beim Kulturmedium sollte soweit mög-lich auf chemisch genau definierteMedienbestandteile zurückgegriffenwerden (Vorschlag: Glycerin-Arginin-Agar nach El-Nakeeb und Lechevalierunter Zugabe geeigneter Antibiotika,z.B. Cycloheximid und/oder Nystatin).

l Die Bebrütung sollte bei 50 8C (thermo-phile und thermotolerante Aktinomyce-ten) sowie bei 28 8C (mesophile Aktino-myceten) erfolgen.

l Beimpfte Platten sollten maximal14 Tage bebrütet werden.

3 Vorschlag an die KAN

Der vorliegende Vorschlag für ein Meßver-fahren sollte in einem Ringversuch evaluiertwerden, bevor er an die Normung weiter-gereicht wird.

Die Forschung im Bereich der Meßver-fahren für Aktinomyceten sollte gefördertwerden, um

l die Einflüsse von Probenahmestrategie,Anzahl der Proben, Probentransportund Probenaufbereitung auf die er-haltenen Meßwerte sowie die ein-gesetzten Nährmedien hinsichtlich derQualität der erhaltenen Meßwertegenau zu evaluieren,

l den Entwurf des Meßverfahrens fürluftgetragene Aktinomyceten auf Grund-lage der genannten Aspekte weiter-zuentwickeln.

Über das Meßverfahren hinaus besteht zufolgenden Punkten Forschungsbedarf:

l Vergleich der derzeit gängigen Ver-fahren zur Ermittlung lebensfähigerKeime in der Arbeitsplatzatmosphäremit alternativen Verfahren, die die ge-samte Belastung an lebenden und totenKeimen sowie deren Bruchstücke er-fassen,

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l Weiterentwicklung der Meßstrategie,Förderung epidemiologischer Studienzur Belastung der Arbeitnehmer durchAktinomyceten sowie die Schaffung derGrundlagen zur Festlegung eines natio-nalen Orientierungswertes für Aktino-myceten.

Empfehlungen der KAN

Gesamteinschätzung

Die KAN schließt sich den Ergebnissender Studie an und beschließt, sie als KAN-Bericht zu veröffentlichen.

Der Bericht gibt einen guten Überblick überden zum Zeitpunkt der Studie vorliegendenStand des Wissens bzgl. der Messung vonluftgetragenen Aktinomyceten. Alle für denBereich relevanten Meßverfahren sind mit-einander verglichen und daraus ein ersterEntwurf (siehe Anhang) für ein möglicheszu standardisierendes Meßverfahren ent-wickelt worden.

Handlungsbedarf für die KAN und ihre Geschäftsstelle

Der in der Studie entwickelte Vorschlag fürein Meßverfahren bedarf der Evaluierungund Weiterentwicklung. Besonderen For-schungsbedarf sieht die KAN zu folgendenPunkten:

l Beurteilung des Einflusses der Unter-suchung in verschiedenen Laboratorien,

l Einfluß von Probenahmeverfahren,Probenanzahl, -transport, -aufbereitungund der eingesetzten Nährmedien aufdie Qualität der Meßergebnisse,

l Vergleichbarkeit der derzeit gängigenVerfahren zur Ermittlung lebensfähigerKeime in der Arbeitsplatzatmosphäremit alternativen Verfahren, die die ge-samte Belastung an lebenden und totenKeimen sowie deren Bruchstücke er-fassen,

l Weiterentwicklung dieser Verfahren zurErfassung von abgestorbenen Zellenund Zellbruchstücken,

l Entwicklung eines nationalen Orientie-rungswertes.

Die Forschungsförderung (z.B. bei derBundesanstalt für Arbeitsschutz und Arbeits-medizin [BAuA] oder beim Berufsgenossen-schaftlichen Institut für Arbeitssicherheit[BIA]) soll hierzu angestoßen werden.

Parallel dazu soll das vorgeschlagene Meß-verfahren vor der Weiterleitung an dieNormungsebene in der Praxis erprobt undeine erste Überarbeitung des Vorschlagserfolgen. Die Mitglieder der Projekt-begleitenden Arbeitsgruppe haben sich be-reit erklärt, im Rahmen ihrer Möglichkeitenan einem hierzu notwendigen, vom Projekt-nehmer koordinierten einmaligen Ringver-such teilzunehmen. Die KAN trägt die fürdie Probenahme vor Ort anfallenden Reise-kosten der Arbeitsgruppenmitglieder.

Zu diesem Bericht

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Die KAN wird das anschließend über-arbeitete Meßverfahren als Normungsvor-schlag beim DIN einreichen.

Die Ergebnisse der Studie, die Empfeh-lungen der KAN und das Meßverfahrensind an den Ausschuß für BiologischeArbeitsstoffe (ABAS) weiterzuleiten. Diesersoll gebeten werden, die Meßstrategie anschon vorhandene, beim ABAS entwickelteMeßstrategien zur Bestimmung von bio-logischen Arbeitsstoffen anzupassen.

Handlungsbedarf für das DIN

Das DIN soll über die Ergebnisse derStudie und die Empfehlungen der KANinformiert werden, damit diese in dieArbeit der WG 5 „Probenahmeverfahrenbiologischer Agenzien“ des CEN/TC 137„Gefährliche Stoffe am Arbeitsplatz“ ein-fließen können. Das DIN wird gebeten, fürdie Meßstrategie die Ergebnisse des ABASund für den Bereich des Meßverfahrensden Normungsvorschlag der KAN auf-zugreifen.

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This ReportThe Commission for Occupational Health,Safety and Standardization (KAN) wasfounded in 1994 to assert German inter-ests in OH & S matters, especially with re-gard to European standardization. KAN iscomposed of representatives of the socialpartners, the federal state and the Laender,the Hauptverband der gewerblichen Berufs-genossenschaften (HVBG, Federation ofthe statutory accident insurance institutionsof the industrial sector) and the GermanStandards Institute (DIN). One of KAN’stasks is to focus the public interests in thefield of occupational health and safety andto exert influence on current and future stan-dardization projects by delivering opinionson specific subjects.

KAN procures studies and expert opinionsin order to analyse occupational healthand safety aspects in standardization andto reveal deficiencies or erroneous develop-ments in standardization work.

This study was based on the following taskin hand:

While it is currently considered possible todevelop uniform measuring methods for nu-merous biological agents relatively straight-forwardly on the basis of previous knowl-edge (also as sum and guide parametersin some cases), the development of amethod for actinomycetes presents consider-able difficulties.

Actinomycetes are Gram-positive bacteriawhich grow mycelially (so-called “ray-fun-gi”) and are to be found in all areas of theenvironment, especially in the ground. Sev-eral types of different species have patho-genic properties (e.g. actinomycetes, no-cardia) and can cause chronic infectionsyndromes. Moreover, thermophile actino-mycetes (e.g. Thermoactinomyces vulgaris,Saccharopolyspora rectivirgula) can bringabout extrinsic allergic alveolitis (EAA) inpeople. EAA is caused by inhaling largequantities of conidium spores dispensed inthe air. High conidia concentration in theair we breathe is produced during certainwork routines and in some of our technicalenvironments. Examples include agriculturalfacilities (farmer’s lung), composting plants,mushroom cultivation (mushroom worker’sdisease) and also rooms with technical airhumidifiers (air-conditioner disease).

There are as yet no standardized measur-ing methods available for determiningthe actinomycete concentration in the airin work areas. Actinomycetes representa special medical problem for people be-cause of their allergenic pathogenic proper-ties. Therefore a standardized method formeasuring actinomycetes is of consider-able interest if the uniform assessment ofdifferent workplaces is to be guaranteed inthe future. However, since their presence isdifficult to prove, actinomycetes representa special problem for measuring technol-ogy. In addition to their wide systematic

This Report

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diversity, actinomycetes in general growconsiderably more slowly on culture mediathan other bacteria and fungi present andalso form smaller colonies. Identification iscomplicated because as well as taking mor-phological criteria into account, variousphysiological tests, e.g. tests in biopolymerdegradation, have to be carried out.

A measuring method for actinomycetesmust meet the specific demands of occupa-tional health and safety. Since the airspores of actinomycetes are relatively resis-tant to drying compared with vegetativemicroorganisms, a sampling procedurebased on the filtration principle taking ac-count of EN 481 would provide a solution.

In order to describe the prospects and pos-sibilities for standardization, this study isaimed at collecting existing knowledge onmeasuring actinomycetes from various sour-ces of literature, describing possible defi-cits and thus at providing initial ideas fortask distribution in the run-up to the neces-sary standardization in a WG 5 “Sam-pling procedures for biological agents” ofCEN/TC 137 which BTS 4 considers de-sirable.

KAN thanks both the authors for carryingout the study and presenting the report andthe following experts for their critical assis-tance and support throughout the evalua-tion of the study:

Dr. Arnold-SundermannVerwaltungs-Berufsgenossenschaft, Mainz

Dr. Dieter BrauerHoechst AG, Frankfurt a.M.

Cornelia EckrichInstitut WAR, Technische Hochschule Darm-stadt

Angela JanowitzKAN-Geschäftsstelle, Sankt Augustin

Dr. Rüdiger PipkeBundesanstalt für Arbeitsschutz und Arbeits-medizin, Dortmund

Dr. RumlerArbeitsmedizinischer Dienst der Tiefbau-Berufsgenossenschaft, Höchberg

Dr. B. Schappler-ScheeleNiedersächsisches Landesamt für Ökolo-gie, Hannover

Dr. Ursula SchiesTiefbau-Berufsgenossenschaft – Technischer Aufsichtsdienst–, München

Dr. D. TommerdichZentralverband des Deutschen Baugewerbes, Bonn

Barbara Zeschmar-LahlBZL GmbH, Oyten

Dorit ZimmermannKAN-Geschäftsstelle, Sankt Augustin

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KAN adopted the following summaryof the study and recommendations onJune 28, 1996.

Summary of KAN Study“Microorganisms in theworkplace atmosphere –Actinomycetes –”

1 Introduction

Within the framework of the study, existinginformation has been compiled and an ini-tial approach for possible standardizationdrawn up in preparation for a standard-ized measuring method for the evaluationof airborne actinomycetes (Gram-positive,mainly aerobic, mycel-forming bacteria) inthe workplace atmosphere.

This kind of measuring procedure isneeded since airborne actinomycetes – par-ticularly thermophilic, thermotolerant andmesophilic types – represent a risk for work-ers, especially as they can cause an aller-gic lung disease known as extrinsic aller-gic alveolitis (EAA). Actinomycetes whichcan be damaging to workers’ health arefound above all in composting, recyclingand mechanical/biological residual wastetreatment plants, in closed stables, silos,grain mills and air conditioning systems.High actinomycete concentration in the aircan also occur during soil purification pro-cedures and mushroom cultivation.

2 Development of a measuring strategyfor determining actinomycetes

2.1 Problems involved with developinga standardized measuring strategy

One of the main problems involved with de-veloping a standardized measuring pro-cess is that all conventional processes usedto quantify the airborne concentration ofliving and reproducing microorganisms arebased on cultivating the germs collected.In the long term, however, the samplingprocedures must also make it possible todetermine the proportion of dead cells orcell fragments which cannot be cultivated,since these can also cause an allergic re-action.

2.2 Measuring procedure requirements

The measuring process must satisfy thefollowing requirements:

l Simple to use (highly mobile apparatus,easily changeable media, simplecleaning and disinfection, insensitivitytowards outside influences).

l Minimum staff, time and financial re-quirements.

l High efficiency (good reproducibility,large measuring range, discriminationbetween different parameters andparticle sizes, dead cells and cell frag-ments also recorded).

This Report

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l Establishing representative measure-ment results for worker exposure (aver-age and maximum [worst case] level).

l Cut-off limit, sensitivity and precision ofthe measuring procedure must be se-lected in accordance with a temporary,national reference value (still to be de-veloped) for actinomycetes and theirallergy-causing structural units in theworkplace atmosphere. This referencevalue represents the standard for occu-pational hygiene which must be metand, if possible, bettered with the helpof technical measures.

l Several parallel measurements shouldbe carried out. The number of individ-ual measurements depends on thesampling period, but there should beat least three.

l In order to determine background expo-sure, a check measurement should betaken outdoors on the side located up-wind.

2.3 Proposal for a measuring procedure

The filtration process already tried andtested for measuring dust is recommendedfor sampling actinomycetes in the work-place atmosphere. This process has the ad-vantage that in principle, the proportion of

dead cells and cell fragments contained inthe sample can also be determined (e.g.of specific allergens by immunoassays orof relevant actinomycetes using specificDNA1) probes or PCR2) processes) in addi-tion to living cells. Further research in thisfield is, however, necessary.

2.4 Sampling strategy

First of all, the workplace should be as-sessed with regard to the microorganismswhich could possibly occur and the timefor which workers are exposed to them.

It is important that

l samples are taken at the level at whichair is breathed in and in the worker’sdirect proximity,

l samples are taken when concentrationis at its highest. Relevant operationswhich are known to subject workers toa lower level of concentration should,however, also be tested if an averagelevel is to be established,

l short sampling times are used in orderto minimize damage to the biologicalmaterial (max. 60 minutes),

l filter materials used are selected accord-ing to external conditions (temperature,humidity).

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1) DNA = deoxyribonucleic acid2) PCR = polymerase chain reaction

2.5 Transport

Special requirements concerning the trans-port system for actinomycete samples areas follows:

l Time between sampling and laboratoryexamination: < 24 hours.

l The sample has to be protected frommoisture.

l Transport temperature should be nohigher than room temperature.

2.6 Detection and differentiation ofactinomycetes in the laboratory

Since actinomycetes generally grow moreslowly than other bacteria and fungi, itis important to chose for the treatment inthe laboratory a culture medium that givesactinomycetes a selective advantage.

l As far as the culture medium is con-cerned, media components which areprecisely defined in chemical termsshould be used as far as possible (pro-posal: glycerine-arginine-agar accord-ing to El-Nakeeb and Lechevalier, withthe addition of suitable antibiotics, e.g.cycloheximide and/or nystatine).

l Incubation should take place at 50 8C(thermophilic and thermotolerant actino-mycetes) or at 28 8C (mesophilic actino-mycetes).

l Inoculated plates should not be incu-bated for longer than 14 days.

3 Proposal to KAN

This proposal for a measuring procedureshould be evaluated in an inter-laboratorytest before being introduced into standardiz-ation.

Research in the field of measuring proce-dures for actinomycetes should be sup-ported in order to

l evaluate precisely the effects of sam-pling strategy, number of samples, sam-ple transport, sample treatment and theculture media used on the quality ofmeasuring results,

l develop the draft of the measuring pro-cedure for airborne actinomycetes onthe basis of the aspects just mentionedabove.

In addition to the measuring procedure it-self, there is need for research in the follow-ing areas:

l Comparing conventional proceduresfor establishing living germs in the work-place atmosphere with alternative pro-cedures which record overall exposureto living and dead germs and their frag-ments.

l Developing the measuring strategy,supporting epidemiological studies onworker exposure to actinomycetesand creating the basis for establishinga national reference value for actino-mycetes.

This Report

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KAN’s recommendations

Overall evaluation

KAN endorses the results of the study andhas decided to publish them as a KAN re-port.

The report provides a good overview ofthe information available at the time of thestudy concerning the measurement of air-borne actinomycetes. All measuring proce-dures relevant to this field have been com-pared and an initial draft (see annex; alsoin English) developed for a possible measur-ing procedure suitable for standardization.

Need for KAN and its Secretariat to take action

The proposal for a measuring proceduredeveloped in the study must be evaluatedand developed further. KAN sees a particu-lar need for research in the following areas:

l Assessing the effect of examinations car-ried out in different laboratories.

l Effect of sampling procedures, numberof samples, sample transport, sampletreatment and the culture media usedon the quality of measuring results.

l Comparability of conventional proce-dures used to establish living germs inthe workplace atmosphere with alterna-

tive procedures which record overallexposure to living and dead germs andtheir fragments.

l Developing these procedures with theaim of recording dead cells and cellfragments.

l Developing a national reference value.

In addition, research projects (e.g. at theBundesanstalt für Arbeitsschutz und Arbeits-medizin [BAuA] or at the Berufsgenossen-schaftliches Institut für Arbeitssicherheit[BIA]) should be encouraged.

Parallel to this, the proposed measuringprocedures should be tested in practiceand the proposal revised for the first timebefore being passed on to the standardiza-tion stage. The members of the workinggroup accompanying the project haveagreed, within their means, to take part ina necessary one-off inter-laboratory testcoordinated by the contractor of the KANproject. KAN is to bear the travel expensesof working group members incurred duringon-site sampling.

KAN will then submit the subsequently re-vised measuring procedure to DIN as aproposal for a standard.

The results of the study, KAN’s recommenda-tions and the measuring procedure shouldbe passed on to the „Ausschuß für Biologi-sche Arbeitsstoffe“1) (ABAS). The ABAS

17

1) Committee for Biological Work Substances

should be requested to adapt the measur-ing strategy in line with existing measuringstrategies which it has developed for deter-mining other biological agents.

Need for DIN to take action

DIN should be informed of the results ofthe study and KAN’s recommendations sothat they can be incorporated into the workof WG 5 “Procedures for sampling biolog-ical agents” of CEN/TC 137 “Assessmentof workplace exposure”. DIN is requestedto adopt the ABAS’ results for the measur-ing strategy and KAN’s proposal for astandard for the measuring procedure.

This Report

18

A ce proposLa Commission pour la sécurité et la santéau travail et la normalisation (KAN) a étéfondée en 1994 pour représenter les inté-rêts allemands en matière de sécurite et desanté au travail surtout dans la normalisa-tion européenne. Elle est composée des re-présentants des partenaires sociaux, del’état fédéral et des Laender, du Hauptver-band der gewerblichen Berufsgenossen-schaften (HVBG, Fédération des orga-nismes d’assurance accident de l’industrie)et de l’Institut allemand de normalisation(DIN). La KAN a pour mission de réunir lesintérêts publics quant à la sécurité et lasanté au travail et d’influer sur les projetsde normalisation en cours d’élaboration etde planification en soumettant des avis.

La KAN commissionne des études et exper-tises pour l’analyse des questions qui tou-chent à la sécurité et la santé au travaildans la normalisation et pour révéler desdéficits ou développements érronés dans letravail de normalisation.

La présente étude a été fondée sur la mis-sion suivante:

Tandis que l’élaboration de procédures uni-formes de mesure pour de nombreuxagents biologiques (parfois comme paramè-tre principal ou comme ensemble de para-mètres), sur la base de connaissances pré-alables, est considérée à l’heure actuellecomme faisable et justifiable, la concep-tion d’une procédure pour les actinomy-cètes pose de gros problèmes.

Les actinomycètes sont des bactéries Grampositif qui ont une croissance de type mycé-lien et que l’on trouve, ubiquitaire, dansl’environnement, dans le sol en particulier.Quelques espèces de la famille possèdentdes caractéristiques pathogènes (Actinomy-ces et Nocardia, par exemple) et peuventprovoquer des syndromes de maladieschroniques. Par ailleurs, les actinomycètesthermophiles (Thermoactinomyces vulgaris,Saccharopolyspora rectivirgula, par exem-ple) peuvent déclencher chez l’homme unealvéolite allergique extrinsèque. Cette aller-gie est la conséquence de l’inhalation degrandes quantités de spores conidies ré-parties dans l’air. On trouve une concentra-tion élevée de conidies dans l’air respiréen particulier dans certaines activités profes-sionnelles et dans l’environnement tech-nique de l’individu. Les exploitations agri-coles (poumon du fermier), les installationde compostage industriel et la culture dechampignons (poumon des champignon-nistes) en sont des exemples, ainsi que lessalles équipées d’humidificateur d’air (mala-die des climatiseurs).

On ne dispose actuellement d’aucune mé-thode normalisée qui permette de détermi-ner la concentration d’actinomycètes dansl’air sur les lieux de travail. Etant donnéque les actinomycètes jouent un rôle essen-tiel sur le plan médical en raison de leurspropriétés pathogènes, il serait très intéres-sant de disposer d’une méthode de mesurenormalisée afin de pouvoir, à l’avenir, éva-

A ce propos

19

luer les lieux de travail en fonction de cri-tères identiques. Les actinomycètes consti-tuent une difficulté particulière d’un pointde vue technique de mesure car il est diffi-cile d’apporter la preuve de leur présence.Outre le fait qu’elles sont par principe trèsdiverses, les actinomycètes se développentbeaucoup moins rapidement en bouillonde culture que les autres bactéries égale-ment présentes; elles constituent, par ail-leurs, des groupements plus réduits. Celarend leur identification compliquée étantdonné qu’il faut recourir aux critères mor-phologiques et de surcroît effectuer égale-ment divers tests physiologiques, un catabo-lisme de différents biopolymères par exem-ple.

La procédure de mesure à développer doitsatisfaire aux critères requis en matière desécurité et santé au travail. Etant donnéque les spores des actinomycètes dans l’airsont relativement résistantes à la dessicca-tion par comparaison aux formes végéta-tives, une méthode d’échantillonage repo-sant sur le principe de filtration conformé-ment à l’EN 481 conviendrait.

Par conséquent, l’objectif de cette étudeconsiste à rassembler ce qui est publié surles connaissances concernant la mesured’actinomycètes, d’identifier le cas échéantles manques en la matière et de fournirainsi le prélude à la répartition des travauxà réaliser au sein d’un WG 5 „Méthoded’échantillonnage d’agents biologiques“

considéré comme souhaitable par le BTS 4à la veille de la normalisation jugée néces-saire, cela afin d’en décrire les possibilitéset les perspectives.

Les remerciements de la KAN vont auxauteurs de l’étude pour son travail et la pré-sentation du rapport ainsi qu’aux expertssuivants pour leurs appréciations critiqueset leur apport aux conclusions de l’étude:

Dr. Arnold-SundermannVerwaltungs-Berufsgenossenschaft, Mainz

Dr. Dieter BrauerHoechst AG, Frankfurt a.M.

Mme. Cornelia EckrichInstitut WAR, Technische Hochschule Darm-stadt

Mme. Angela JanowitzKAN-Geschäftsstelle, Sankt Augustin

Dr. Rüdiger PipkeBundesanstalt für Arbeitsschutz und Arbeits-medizin, Dortmund

Dr. RumlerArbeitsmedizinischer Dienst der Tiefbau-Berufsgenossenschaft, Höchberg

Dr. B. Schappler-ScheeleNiedersächsisches Landesamt für Ökolo-gie, Hannover

A ce propos

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Dr. Ursula SchiesTiefbau-Berufsgenossenschaft – Technischer Aufsichtsdienst–, München

Dr. D. TommerdichZentralverband des Deutschen Bau-gewerbes, Bonn

Mme. Barbara Zeschmar-LahlBZL GmbH, Oyten

Mme. Dorit ZimmermannKAN-Geschäftsstelle, Sankt Augustin

Le 28 juin 1996, la KAN a adopté lerésumé et les recommandations suivants.

Résumé de l’étude de la KAN«Les micro-organismes dansl’atmosphère au poste de travailles actinomycètes»

1 Introduction

Cette étude a pour objet d’élaborer uneprocédure de mesure standardisée per-mettant de détecter les actinomycètes (bac-téries à Gram +, pour la plupart aérobies,provoquant la formation de mycélium) véhi-culés par l’air dans l’atmosphère du postede travail. A cet effet, les auteurs ont com-pilé les connaissances disponibles sur le su-jet et élaboré une première approche pourune normalisation possible.

Une telle procédure de mesure s’avère né-cessaire, car les actinomycètes véhiculéspar l’air, et en particulier ceux de type ther-mophile, thermotolérant et mésophile, cons-tituent un risque pour la santé des travail-leurs. Ces bactéries déclenchent en parti-culier une maladie pulmonaire de typeallergique, l’EAA (alvéolite allergique extrin-sèque). Les actinomycètes, qui ont une in-cidence sur la santé des travailleurs, se trou-vent surtout dans les installations de com-postage, de tri de déchets valorisables, detraitement mécanique et biologique de dé-chets résiduaires, dans les étables fermées,les silos, les moulins à céréales, ainsi quedans les systèmes de climatisation. Ils peu-vent également se présenter en concentra-tions élevées dans le contexte de la dépol-lution des sols et de la culture de champi-gnons.

2 Elaboration d’une stratégie demesure pour la déterminationd’actinomycètes

2.1 Problèmes rencontrés lors del’élaboration d’une stratégie demesure standardisée

L’un des principaux problèmes rencontréslors de l’élaboration d’une procédure demesure standardisée réside dans le faitque toutes les procédures classiques uti-lisées pour quantifier la concentration engermes véhiculés par l’air dans les micro-organismes viables et capables de se

21

reproduire se basent sur la culture desgermes recueillis. Or, le procédé de prélè-vement d’échantillons doit, à long terme,permettre également de déterminer la quan-tité de cellules, ou fragments de cellules,mortes et non cultivables, qui sont en effetégalement susceptibles de provoquer uneréaction allergique.

2.2 Conditions auxquelles doit satisfaireune procédure de mesure

La procédure de mesure doit satisfaire auxexigences suivantes:

l Etre simple d’exécution (grande mobi-lité des appareils, facilité de change-ment des milieux, simplicité de net-toyage et/ou de désinfection, insensibi-lité aux facteurs d’influence externes).

l Ne pas requérir de moyens importants(personnel, temps, investissements).

l Etre performante (bonne reproductibili-té, grande fourchette de mesure, diffé-renciation de divers paramètres et detaille de particule, détection des cel-lules ou fragments de cellules morts).

l Permettre d’obtenir des mesures repré-sentatives pour l’exposition des travail-leurs, en termes de charge moyenne etmaximale (worst case).

l La limite de décèlement, la sensibilité etla précision de la procédure de mesuredoivent correspondre à une valeur de

référence provisoire (qu’il restera à dé-finir), applicable au niveau national,relative aux actinomycètes et à leurs uni-tés structurelles allergènes présentesdans l’atmosphère du poste de travail.En termes d’hygiène industrielle, cettevaleur de référence constituera lestandard que des mesures techniquesdevront permettre d’atteindre, mais au-dessous duquel il sera préférable derester.

l Il conviendra d’effectuer plusieurs me-sures parallèles. Le nombre de mesures,qui devra être au minimum de trois, dé-pendra de la durée du prélèvement deséchantillons.

l Pour déterminer la contrainte d’arrière-plan, une mesure de référence devraêtre effectuée à l’extérieur du bâtiment,du côté du vent.

2.3 Procédure de mesure préconisée

Pour mesurer les poussières, il est recom-mandé d’utiliser le procédé par filtration,largement éprouvée dans la pratique, pourprélever des échantillons d’actinomycètesdans l’atmosphère du poste de travail. Ceprocédé permet non seulement d’analyserles cellules vivantes, mais présente en outrel’avantage de déterminer également, dansles échantillons prélevés, la quantité decellules ou fragments de cellules qui nesont plus viables (p.ex. d’allergènes spéci-fiques, par immunoassays, ou d’actinomy-

A ce propos

22

cètes importants, par sondes ADN1) ouprocédé PCR2). Il y a toutefois lieu de pour-suivre la recherche dans ce domaine.

2.4 La stratégie de prélèvement des échantillons

Il convient, en un premier temps, d’évaluerle poste de travail pour ce qui est de laprésence éventuelle de micro-organismes,ainsi que, au niveau temporel, de l’exposi-tion du travailleur à ces micro-organismes.

Il est important:

l d’effectuer le prélèvement à proximitéimmédiate du travailleur et à hauteurde respiration;

l d’effectuer le prélèvement au momentoù la charge atteint son niveau maxi-mum. Si l’on souhaite calculer unecharge moyenne, des prélèvements peu-vent toutefois être effectués lors d’opéra-tions significatives, pour lesquelles onsait par expérience que la charge estmoins élevée;

l d’effectuer les prélèvements sur des pé-riodes courtes (maximum 60 minutes),afin de réduire au maximum les risquesd’endommagement du matériau biolo-gique;

l de choisir des matériaux filtrants adap-tés aux conditions extérieures (tempéra-ture, humidité).

2.5 Transport

Le transport des échantillons d’actinomycè-tes est soumis à des conditions particu-lières:

l la période écoulée entre le prélèvementet l’analyse en laboratoire doit être infé-rieure à 24 h,

l l’échantillon doit être parfaitement pro-tégé contre l’humidité,

l la température de transport ne doit pasêtre supérieure à la température am-biante.

2.6 Détection et différenciation desactinomycètes en laboratoire

Les actinomycètes se propageant générale-ment plus lentement que d’autres bactérieset champignons, on veillera, pour la pré-paration en laboratoire, à choisir un milieude culture apte à offrir aux actinomycètesun avantage sélectif.

l Le milieu de culture choisi devra, autantque possible, se composer d’élémentschimiques parfaitement définis (recom-mandation: glycérine-arginine-agar-

23

1) ADN = Acide désoxyribonucléique2) PCR = Polymerase chain reaction

agar selon El-Nakeeb et Lechevalier,avec adjonction d’antibiotiques adé-quats, p.ex. cycloheximide et/ou nysta-tine);

l la température d’incubation devra êtrede 50 8C (actinomycètes thermophileset thermotolérants) et de 28 8C (actino-mycètes mésophiles);

l la durée d’incubation des coupelles ino-culées ne devra pas dépasser 14 jours.

3 Recommandation à l’adresse de la KAN

Il conviendra, lors d’un essai interlabora-toire, d’évaluer la procédure de mesure pré-conisée, avant de la transmettre à la norma-lisation.

Il convient de promouvoir la recherche rela-tive aux procédures de mesure pour actino-mycètes, et ce dans les buts suivants:

l être en mesure d’évaluer avec exacti-tude l’influence des stratégies de prélè-vement des échantillons, du nombre,du transport et de la préparation deséchantillons, ainsi que des milieuxde culture utilisés sur la qualité desmesures obtenues,

l en se basant sur les aspects évoquésplus haut, poursuivre le perfectionne-ment d’une procédure permettant demesurer les actinomycètes véhiculés parl’air.

Outre la procédure de mesure, il y a lieude faire progresser la recherche égalementdans les domaines suivants:

l Comparaison des procédures cou-ramment utilisées pour déterminer lesgermes viables dans l’atmosphère d’unposte de travail, avec des procéduresalternatives permettant de déterminer lacharge totale causée par des germesvivants et morts, ainsi que par des frag-ments de ces germes,

l Perfectionnement de la stratégie demesure, promotion des études épidémio-logiques portant sur le risque que repré-sentent les actinomycètes pour les tra-vailleurs, et mise en place de règles fon-damentales destinées à définir, enmatière d’actinomycètes, une valeur deréférence applicable au niveau natio-nal.

Recommandations de la KAN

Evaluation globale

La KAN se rallie aux conclusions de l’étu-de et décide de publier celle-ci sous formede rapport KAN.

Ce rapport donne un vaste aperçu desconnaissances disponibles au moment del’étude au sujet de la détermination desactinomycètes véhiculés par l’air. Toutes lesprocédures de mesure pertinentes ont étécomparées entre elles, et ont servi de base

A ce propos

24

à un premier projet (cf. annexe, aussi enfrançais) portant sur une procédure de me-sure possible, qu’il resterait à standardiser.

Interventions souhaitées de la part de la KAN et de son secrétariat

Il restera à évaluer et à perfectionner la pro-cédure de mesure proposée et élaboréedans l’étude.

La KAN estime qu’il y a lieu d’approfondirparticulièrement la recherche dans les do-maines suivants:

l Evaluation de l’impact de l’étude dansdifférents laboratoires,

l Influence des procédures de prélève-ment des échantillons, du nombre, dutransport et de la préparation deséchantillons, ainsi que des milieux deculture utilisés sur la qualité des me-sures obtenues,

l Comparabilité des procédures utiliséescouramment pour déterminer lesgermes viables dans l’atmosphère duposte de travail, avec des procéduresalternatives capables de déterminer laquantité totale de germes vivants etmorts, et de leurs fragments,

l Perfectionnement de ces procédurespermettant de déterminer les cellules oules fragments de cellules mortes,

l Elaboration d’une valeur de référenceapplicable au niveau national.

Il conviendra de solliciter à cet effet desaides à la recherche (p.ex. auprès deBundesanstalt für Arbeitsschutz und Arbeits-medizin [BAuA] ou Berufsgenossenschaft-liches Institut für Arbeitssicherheit [BIA]).

Avant de passer au niveau de la normalisa-tion, la procédure de mesure préconiséedevra, parallèlement, être expérimentéedans la pratique, une première révision dela proposition devant alors être effectuée.Les membres des groupes de travail qui ac-compagnent le projet se sont déjà déclarésdisposés à participer, dans la mesure deleurs possibilités, à un essai unique inter-laboratoire. Cet essai nécessaire serait co-ordonné par le mandataire de l’étudeKAN. Les frais de déplacement des mem-bres du groupe de travail occasionnésdans le contexte du prélèvement in situseront à la charge de la KAN.

La procédure de mesure revue et corrigéesera ensuite transmise au DIN, sous formede proposition de norme.

Les résultats de l’étude, les recommand-ations de la KAN et la procédure de me-sure devront être transmis à l’Ausschuß fürBiologische Arbeitsstoffe1) (ABAS). Il serademandé à celui-ci d’adapter la stratégiede mesure aux stratégies de mesure déjà

25

1) Comité pour Substances de travail Biologiques

existantes élaborées par l’ABAS, utiliséespour déterminer les substances biologiquesde travail.

Interventions souhaitées de la part du DIN

Il conviendra d’informer le DIN des conclu-sions de l’étude et des recommandationsde la KAN, pour permettre de les intégrerdans le travail du WG 5 «Procédures deprélèvement d’agents biologiques» duCEN/TC 137 «Substances dangereusesau poste de travail». Il est demandé auDIN de recourir aux conclusions de l’ABASpour ce qui est de la stratégie de mesure,et à la proposition de normalisation de laKAN pour ce qui relève de la procédurede mesure.

A ce propos

26

1 EinleitungFür eine Vielzahl chemischer Verbindungensind zahlreiche Daten über die Toxizitätund Kanzerogenität verfügbar. Probenahme-verfahren und Analytik sind für diese Agen-zien erprobt und standardisiert. Ebensosind Richt- und Grenzwerte in einer Füllevon Normen und technischen Regeln fest-gelegt.

Derzeit wird das Gefährdungspotentialbiologischer Agenzien diskutiert. Für dasLand Niedersachsen (1995) wurde eineerste Richtlinie für die Erfassung von biolo-gischen Agenzien in Wertstoffsortier-anlagen vorgelegt. Durch das berufs-genossenschaftliche Institut für Arbeitssicher-heit (BIA, 1995) wurde ein Meßverfahrenfür die Erfassung von luftgetragenen Pilz-sporen publiziert.

Für luftgetragene Aktinomyceten steht der-zeit noch kein standardisiertes Meßver-fahren zur Verfügung. Ziel dieser Studie istes, das für die Erfassung von luftgetrage-nen Aktinomyceten vorhandene Wissen zu-sammenzustellen und erste Ansätze für einemögliche Normung eines Verfahrens zurErfassung von Aktinomyceten darzulegen.

Die Studie liefert eine Übersicht zur Frageder Erfassung der für die Sicherheit der Be-schäftigten relevanten Aktinomyceten in derArbeitsplatzatmosphäre. Ein Bedarf für einMeßverfahren für luftgetragene Aktinomyce-ten besteht, da insbesondere thermophile,aber auch mesophile Vertreter eine aller-gische Lungenerkrankung, die exogen-all-ergische Alveolitis (EAA), auslösen können.

Die Arbeit enthält eine kurze Einführung indie Biologie der Aktinomyceten, wobei derSchwerpunkt auf den Vertretern liegt, diean typischen Arbeitsplätzen (Land- und Forst-wirtschaft, Gartenbau, Entsorgungswirt-schaft etc.) vorkommen können. Eine Tabel-le entsprechender Arbeitsplätze ist in derStudie enthalten.

Die Problematik der Erfassung luftgetrage-ner Keime wird in dieser Studie abgehan-delt. Dabei wird sowohl die personenbezo-gene Probenahme wie auch die nicht-per-sonenbezogene Probenahme diskutiert. Diederzeit gängigen Verfahren zur Erfassungluftgetragener Keime werden abgehandeltunter dem Gesichtspunkt der Erfassung vonAktinomyceten in der Arbeitsplatzatmo-sphäre. Derzeit etabliert sind nur Verfahren,die lebende Keime nachweisen. Da Aller-gien auch durch Zellfragmente oder Zell-bestandteile ausgelöst werden können,sollte ein Meßverfahren aber auch dieMöglichkeit bieten, tote Zellen oder Zell-bruchstücke und -komponenten zu erfassen.

Derzeit existieren keine Normen oder Richt-linien für die Erfassung luftgetragener Akti-nomyceten. Es ist ein Ziel dieser Studie,einen entsprechenden Norm-Entwurf vor-zubereiten.

Als Ergebnis der Studie wird ein Vorschlagfür ein Meßverfahren gemacht. Es wird einFiltrationsverfahren empfohlen, da dieseTechnik bereits in der Staubmessung praxis-erprobt ist. Sie ist weiterhin auch für die Er-fassung lebender Zellen aus der Luft eta-

1 Einleitung

27

bliert und bietet prinzipiell die Möglichkeitder Erfassung toter Zellen oder von Frag-menten (z.B. über Immunoassays, PCRetc.). Hier besteht aber noch Forschungs-bedarf. Die Studie enthält Angaben zurProbenahme sowie zum Transport derProben. Der Einfluß einzelner Parameter(Temperatur, Feuchte etc.) auf die Proben

beim Transport muß jedoch noch praktischuntersucht werden. Für die Laborunter-suchung wird zunächst die Lebendkeimzahl-bestimung auf einem mineralischen Agarbei zwei Bebrütungstemperaturen vor-geschlagen. Das vorgeschlagene Meßver-fahren sollte erprobt und ggf. modifiziertwerden.

1 Einleitung

28

2 Welche Aktinomycetensind relevant unter dem Gesichtspunkt desArbeitsschutzes?Aktinomyceten sind grampositive, über-wiegend aerobe Bakterien, die im Gegen-satz zu anderen Bakterien ein Mycelbilden, was in der Bezeichnung Aktinomy-ceten zum Ausdruck kommt. Es handelt sichdabei nicht um Vertreter der eukaryonti-schen Klasse der Pilze, sondern um proka-ryontische Organismen.

Zur Gruppe der Aktinomyceten werdeneine Reihe von Bakteriengattungen gezählt.Namengebend ist die Gattung Actino-myces, wobei es sich um anaerobe oderfakultativ aerobe Organismen handelt,die Filamente bilden. Diese zerfallen aberleicht in einzelne coryneforme Zellen.Vertreter dieser Gattung können human-oder auch tierpathogen sein.

Nach Brock und Madigan (1991) wer-den folgende Gruppen zu den Aktino-myceten im weiteren Sinne gerechnet (vgl. Tabelle 1 auf Seite 30).

Für die Betrachtung der Arbeitsplatz-atmosphäre sind solche Gruppen be-sonders relevant, die aufgrund ihrerBiologie in den Biotopen gute Bedin-gungen vorfinden, die an Arbeitsplätzenvorkommen. Weiterhin besitzen die imZusammenhang dieser Studie wichtigenKeime die Eigenschaft, daß sie sich gutüber die Luft verbreiten und dort eine hoheToleranz gegenüber Trockenheit undWärme besitzen.

Dies ist vor allem bei solchen aerob wach-senden Vertretern gegeben, die starkeLuftmycelien ausbilden und hier insbe-sondere dann, wenn Sporen gebildetwerden.

Aus der Sicht des Arbeitsschutzes istdie Gruppe der wichtigen Organismenweiter einzugrenzen auf die Arten, dieeine nachteilige Wirkung auf den Men-schen ausüben können. DerartigeWirkungen auf den Menschen könneneinerseits Infektionen und andererseitsallergische Reaktionen sein.

Infektionen sind charakterisiert durch dasEindringen eines Infektionserregers inden Wirt (hier: Mensch), gefolgt von einerVermehrung und damit verbunden derAuslösung einer Reaktion im Wirtsorganis-mus. Die Zeitspanne zwischen dem Ein-dringen des Erregers und dem Auftretender Reaktion wird als Inkubationszeitbezeichnet.

Eine Allergie ist hingegen eine über-schießende Reaktion des Immunsystems,die durch bestimmte Epitope von Anti-genen hervorgerufen werden kann undKrankheitssymptome zur Folge hat (Kayseret al., 1993). Allergieauslösende Anti-gene können in der Natur häufig vor-kommen, wie z.B. Pollen oder Schimmel-pilzsporen.

2 Welche Aktinomyceten sind relevant unter dem Gesichtspunkt des Arbeitsschutzes?

29

Gruppe Gattungen ÖkologiePhysiologie

Anmerkungen

Aktinomycetenim engerenSinne

Actinomyces anaerob oder fakultativ aerob,filamentös, Filamente zerbrechen leicht inEinzelzellen

können pathogen für Menschund Tier sein

Mycobacterien Mycobacterium obligat aerob, Saprophyten,keine Mycelbildung

M. tuberculosis erregtTuberkulose,pathogene Vertreter wachsenlangsam und haben komplexeNährstoffansprüche1

N2-bindendeAktinomyceten

Frankia microaerophil, symbiontisch mitPflanzen (z.B. Erlen)

Dermatophilus Dermatophilus gelegentlich treten Hautinfektionen auf,keine Sporen

Nocardia-artige Nocardia,Rhodococcus

Mycel zerfällt leicht in Einzel-zellen, gelegentliche Bildungvon Luftsporen, Nocardiaobligat aerob, kommt imBoden vor, Rhodococcus imBoden und im Verdauungstraktvon Insekten

Streptomyceten Streptomyces undandere

stark entwickeltes, stets intaktbleibendes Mycel, langeKetten von Luftsporen

Micromono-spora-artige

Micromonospora,Thermoactinomyces, Thermomonospora

Mycel bleibt intakt, Sporenwerden einzeln, in Paarenoder in Ketten gebildet, Saprophyten, an verrottendemPflanzenmaterial, einige thermo-phil

1 Schlegel, 1985

Tabelle 1: Die wichtigen Vertreter der Aktinomyceten (nach Brock und Madigan, 1991)


30

Die aus der medizinischen Sicht wichtigenGruppen unter den Aktinomyceten sind inder folgenden Tabelle 2 (Seite 32) auf-geführt.

Kutzner et al. (1993) stellen fest, daß In-fektionen mit Aktinomyceten vor allemopportunistische Erkrankungen darstellen.Allerdings können durch obligat aerobeAktinomyceten wie den verschiedenen Mit-gliedern der Gattungen Nocardia, Rhodo-coccus, Gordona und Tsukamurella sowiedurch fakultativ anaerobe Aktinomycetenauch bei abwehrgesunden Personen Infek-tionen hervorgerufen werden. Am Arbeits-platz relevant können z.B. Nocardia-Artensein, die bei der Bodensanierung zum Ab-bau von polyaromatischen Kohlenwasser-stoffen eingesetzt werden. Hier könnte einespeziellere Betrachtung und ggf. eine An-passung der Strategie von Probenahmeund Laboruntersuchung notwendig sein.

Land et al. (1991) geben als Infektions-krankheiten der Actinomycetales für immun-kompetente Patienten Mycetome der Hautan. Dabei handelt es sich nach Pschyrem-bel (1982) um „chronisch-fiestelnde Haut-prozesse“, die nach Land et al. (1991)durch das traumatische Eindringen konta-minierter Vegetation oder kontaminiertenBodens verursacht werden. Somit ist derInfektionsweg in diesem Falle nicht die Luft,so daß derartige Erkrankungen bei der Be-wertung der mikrobiologischen Qualitätder Arbeitsplatzatmosphäre außer Betrachtbleiben können.

Für immunkompetente Patienten könnennach Land et al. (1991) daneben nochInfektionen mit Dermatophilus congolensisauftreten. Als Infektionsweg wurde der Um-gang mit erkrankten Tieren (z.B. Aus-weiden nach der Jagd) beschrieben. Somitscheint der direkte Kontakt entscheidend zusein. Für eine luftgetragene Infektion gibt eskeine Hinweise. Zusätzlich kommt derKeim nicht in Europa vor (vgl. Tabelle 2),so daß er in dieser Studie für die weiterenBetrachtungen nicht relevant ist.

Das für die Betrachtung der Arbeitsplatz-atmosphäre vordringlichste Risiko stellendie Allergien dar. Nach Kutzner et al.(1993) und Kempf und Kutzner (1994)sind hier thermophile Aktinomyceten die Ver-ursacher einer allergischen Lungenerkran-kung, der „exogen-allergischen Alveolitis“(EAA). Als wichtigste Verursacher werdenvon diesen Autoren Saccharopolyspora rec-tivirgula und Saccharomonospora viris undverschiedene Spezies der Gattung Thermo-actinomyces angesehen.

Diese Angaben decken sich auch mit denAusführungen anderer Autoren. Die all-ergische Erkrankung der Atemwege wirddabei als wesentliches Krankheitsbild aero-ber und hier insbesondere thermophilerAktinomyceten beschrieben.

Ökologisch ist das Vorkommen von thermo-philen Aktinomyceten beschrieben fürgeschlossene Stallungen, Silos, Getreide-

31

Keim Krankheit Vorkommen Sporenbildung Luftmycel Anmerkungen

Nocardia asteroides

Abszesse inder Lunge,systemischeErkrankung,häufig mit ZNS-Involvierung

ubiquitär in Böden,Tiere, Menschen

ja(Ketten vonArthrosporen)

ja Wachstum bei 46 8C

Nocardiabrasiliensis

Mycetom Vorkommenvorwiegend in Amerika


ja kein Wachstumbei 46 8C

Nocardia otiti-discaviarum

Mycetom ubiquitär in Böden, vorwiegend in südlichenLändern


ja variablesWachstum bei 46 8C

Actinomaduramadurae

Mycetom ubiquitär in Böden,zerfallenderVegetation

ja (in kurzenKetten)

spärlich entwickelt

Temperatur-optimum 30 8C

Actinomadurapellitieri

Mycetom Boden undPflanzen inAfrika undIndien

? spärlich entwickelt

Temperatur-optimum 30 8C −37 8C

Nocardiopsisdassonvillei

Mycetom ubiquitär inBöden

ja reich entwickelt,lange Kettenvon Sporen

Wachstum bei 40 8C,kein Wachstumbei 45 8C

Streptomycessomaliensis

Mycetom Böden inAfrika,Arabien, USA

ja ja Optimum bei 30 8C

Tabelle 2: Liste einiger medizinisch relevanter aerober Aktinomyceten (verändert nach Land et al., 1991)


32

Keim Krankheit Vorkommen Sporenbildung Luftmycel Anmerkungen

Streptomycesssp.

nicht pathogen ubiquitär in Um-weltproben,Mist, Kompost,an Pflanzenund in Klima-anlagen

ja (in langenKetten)

ja (Mycel fragmen-tiert nicht)

Micropolyspora-Gruppe:Saccharomono-spora viridisMicropolysporafaeni1

restriktiveallergische Lungen-erkrankung

ubiquitär in Luft-kanälen, Mist,Kompost

ja (gebildet inPaaren oderkurzen Kettensowohl an Luft-wie auchSubstratmycel)

ja

Thermoactino-myces-Gruppe2:Thermoactino-myces vulgarisT. sacchariT. candidus

allergische Lungen-erkrankung

ubiquitär in Luft-kanälen, Mist,Kompost, Be-feuchterwasser,Heu, Zuckerrohr

ja (Endosporen),einzeln an Luft-oderSubstratmycel

ja

Dermatophiluscongolensis

epidemischesEkzem

bei Menschenund Tieren inAustralien,Afrika, USA

? ja(Zoosporen)

kein Wachstumauf Sabouraud-Glucose-Agar

1 = Saccharopolyspora rectivirgula = Faenia rectivirgula2 Die Gattung Thermoactinomyces wird heute der Familie der Bacillariaceae zugeordnet, wurde jedoch langeden Actinomyceten zugerechnet, da sie ein mycelartiges Wachstum aufweist. Sie wird auch heute noch z.B.von Kutzner et al. (1993) mit den Actinomyceten zusammen bearbeitet. Dies soll daher auch in dieser Studiegeschehen, zumal diese Gattung auch für die Auslösung von EAA wichtig ist.

33

mühlen, Bagassen und Klimaanlagen(Williams et al., 1984).

Neben den oben erwähnten Arten wird alsweniger häufiger Erreger der EAA nochder mesophile Streptomyces albus genannt(Kutzner et al., 1993; Sennekamp, 1991;Kagen et al., 1981).

In Kläranlagen wurde das Vorkommen vonRhodococcus ssp. und Nocardia ssp. be-schrieben. Diese sollen die Hauptursachefür starke Schaumbildung sein, wobei siemöglicherweise auch als Aerosol in die Luftübergehen können. Dabei gibt es kryophi-le wie auch mesophile Vertreter (Soddellund Seviour, 1995). Spezies aus beidenGattungen können pathogen sein. Inwie-weit es hier jedoch zu einem gesundheit-lichen Risiko für Beschäftigte kommt, ist ausden uns vorliegenden Daten nicht ersicht-lich.

Neben aeroben Organismen gehörenzu den Aktinomyceten auch anaeroblebende Vertreter. Klinisch bedeutend isthier vor allem die Gattung Actinomycesmit den wichtigsten Vertretern A. israelii,A. naeslundii, A. gerencseriae und Pro-pionibacterium propionicum. Nebendiesen beiden Arten sind noch A. viscosus,A. odontolyticus, A. pyogenes und A. meyeri als humanpathogen beschrieben(Hillier und Moncla, 1991). Das natürlicheHabitat dieser Mikroorganismen sind dieSchleimhäute und die Mundhöhle. NachKayser et al. (1993) handelt es sich bei

Aktinomykosen zu 90 % um Infektionen mitA. israelii und zu 7 % um Infektionen mitA. naeslundii. Die Ursache derartiger In-fektionen sind stets die in der endogenenFlora vorkommenden Keime der GattungActinomyces. Aus diesem Grunde könnendie Vertreter dieser Gattung bei einer weite-ren Betrachtung der Mikroorganismen inder Arbeitsplatzatmosphäre außer Betrachtbleiben.

Zusammenfassend läßt sich sagen, daßdas wesentliche Risiko in einer Belastungder Arbeitsplatzatmosphäre bei solchenaeroben Aktinomyceten liegt, die EAAhervorrufen. Dies sind im wesentlichen ther-mophile bzw. thermotolerante Aktinomyce-ten. Somit focussieren die weiteren Erörte-rungen in dieser Arbeit auf diese zuletztgenannte Gruppe, wobei aber auch meso-phile Vertreter mit betrachtet werden sollen,um z.B. Streptomyces albus mit zu erfassen.

2.1 Arbeitsplätze mit einermöglichen Belastung durch Aktinomyceten

Im nachfolgenden Abschnitt wurde der Ver-such unternommen, eine Auflistung allerArbeitsplätze zu erstellen, an denen dasAuftreten von Aktinomyceten und insbe-sondere von thermophilen Vertretern dieserGruppe möglich ist.


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Bereich bearbeitete Materialien auftretende Aktinomyceten Anmerkungen

Landwirt-schaft

Heu, Stroh, Dreschstaub,Gemüse

thermophile

Tabakblätter thermophile

Viehhaltung: Kuhställe, Pferdeställe, Schweineställe

thermophile

Futtersilos thermophile

Forstwirt-schaft

Holzstaub, verschimmelteHolzschnitzel

thermophile nachgewiesen:Thermoactinomyces vulgaris

Landwirt-schaft und Garten-bau

Champignonanbau aufspeziellem Substrat, Umgang mit Speise- undGiftpilzen, Pilzkompost

thermophile und mesophile nachgewiesen:Thermomonospora ssp.,Streptomyces ssp.

Gartenbau Umgang mit Rindenmulch thermophile

Entsorgungs-wirtschaft

Kompostierung thermophile und mesophile

Wertstoffsortieranlagen,mechanisch-biologische Restmüllbehandlung

thermophile und mesophile

biologische Sanierungs-verfahren

?

diverse Klimaanlagen ?

Tabelle 3: Arbeitsplätze mit dem Risiko des Auftretens luftgetragener Aktinomyceten in hohen Konzentrationen

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Wenngleich thermophile Aktinomycetendie EAA auslösen können, sind sie keines-wegs die einzige Ursache dieser Erkran-kung. So wurden auch Pilze als Erregernachgewiesen (Kutzner et al., 1993) wieauch Serumproteine von Vögeln, die mitdem Kot ausgeschieden werden (Nolte,1980).

Unter den Aktinomyceten werden nachLacey und Crook (1988) bzw. Kutzner etal. (1993) folgende Organismen als Ur-sache von EAA in der Literatur beschrieben:

l Saccharopolyspora rectivirgula

l Saccharomonospora viridis

l Streptomyces albus

l Streptomyces olivaceus

l Thermoactinomyces sacchari

l Thermoactinomyces vulgaris

l Streptomyces albus

Hinsichtlich der Biologie thermophiler Akti-nomyceten weisen Kutzner et al. (1993)darauf hin, daß sie durch ein Wachstums-optimum bei Temperaturen zwischen50 8C und 65 8C gekennzeichnet sind.Dies führt dazu, daß es zu einer Massenver-mehrung vor allem bei der Selbsterhitzungorganischer Materialien kommt. Dies kannvor allem bei der Lagerung von feuchtemHeu, Getreide sowie bei der Kompostie-rung von Bioabfall und der mechanisch-bio-logischen Restmüllbehandlung vorkommen.Eine Massenentwicklung von thermophilenAktinomyceten kann auch bei einer län-geren Lagerung von Müll in den Sommer-monaten auftreten.


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3 Erfassung desAktinomyceten-Gehalts in derLuft3.1 Einleitende Bemerkungen

Dieses Kapitel befaßt sich vorwiegend mitder Erfassung von kultivierbaren Mikro-organismen aus der Luft, da dieser Ansatzderzeit der nahezu ausschließlich prak-tizierte Weg zur Erfassung eines mikrobio-logischen Gefährdungspotentials ist. Diesberuht auf der Tatsache, daß die klassi-schen Verfahren der Differenzierung vonOrganismen in der Mikrobiologie auf denphänotypischen Eigenschaften des leben-den Organismus beruhen.

Bei der Erfassung der kultivierbaren Mikro-organismen werden jedoch sowohl ab-gestorbene Zellen wie auch Zellbruch-stücke nicht erfaßt; beide können aber so-wohl durch gebildete Toxine wie auchdurch allergenes Potential ein Risiko be-deuten. Ebenfalls nicht erfaßt werden leben-de, aber nicht mehr kultivierbare Keime,sogenannte „viable but not culturable“Mikroorganismen.

Generell ist die Beschränkung auf lebendeMikroorganismen gerade dann proble-matisch, wenn diese Mikroorganismen All-ergien auslösen können, wie es bei denAktinomyceten und der EAA der Fall ist.Die Fähigkeit, Allergien hervorzurufen, istnicht mit der Lebensfähigkeit eines Organis-mus korreliert, da auch Teile von Orga-nismen wie Eiweiße etc. Allergien verur-sachen können. Eine Erfassung auch dertoten Mikroorganismen wäre von Vorteil, zu-mal die Relation zwischen der Zahl der le-

benden Mikroorganismen und der Gesamt-zahl von lebenden und toten Zellen nichtfest ist, sondern je nach Umweltbedin-gungen schwanken kann (Nielsen undBreum, 1995).In der BIA-Verfahrensbeschreibung 9420„Verfahren zur Bestimmung der Schimmel-pilz-/Hefenkonzentration am Arbeitsplatz“werden zur Analyse derzeit ausschließlichKulturverfahren beschrieben. Dennochwird von den Verfassern die Problematikder Erfassung aller (lebenden und toten)Mikroorganismen gesehen; denn es ist einausdrücklicher Vorbehalt formuliert dahin-gehend, daß in Zukunft auch weitere ana-lytische Verfahren eingesetzt werden kön-nen, die zur Erfassung aller Organismengeeignet sind wie die direkte Zählungdurch Fluoreszenzmikroskopie.In dieser Studie werden daher ungeachtetihrer derzeit noch geringen Bedeutungunter 3.8.2 Verfahren diskutiert, die eineErfassung auch der abgestorbenen Mikro-organismen erlauben.

3.2 Personengebundenes undnicht personengebundenesSammeln

Bei Messungen der Arbeitsplatzatmo-sphäre z.B. auf Feinstaub oder Gesamt-staub werden häufig personengebundeneProbenahmesysteme eingesetzt, die so be-schaffen sind, daß der Arbeitnehmer sie

3 Erfassung des Aktinomyceten-Gehalts in der Luft

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bei seiner Tätigkeit tragen kann, ohne starkbehindert zu werden. Diese Methodik er-möglicht es, die tatsächliche Belastung desArbeitnehmers z.B. mit Gesamtstaub zu er-fassen. Für Fein- oder Gesamtstaub-messungen, die am ehesten mit der in dervorgelegten Studie behandelten Proble-matik vergleichbar sind, kommen Probe-nahmesysteme bestehend aus einer Pumpesowie einem 37-mm-Quarzfilter zum Ein-satz. Die Geräte werden mit einem Luft-durchsatz von 2 oder 3,5 l/Minute be-trieben. Die Meßdauer beträgt mindestenszwei Stunden, so daß sich ein Luftvolumenvon 240 bis 420 Litern erfassen läßt.

Personengebundene Verfahren werden beider Erfassung von Luftkeimen derzeit kaumeingesetzt. Für vegetative Keime ist eineProbenahmedauer von zwei Stunden vielzu hoch. Diese lange Verweilzeit auf demFilter kann zu einer Schädigung führen, sodaß zumindest eine Erfassung der leben-den Keime mit einem hohen Fehler behaftetist. Die Halbwertszeit z.B. für E. coli be-trägt an Luft 70 Minuten bei 50 % Luft-feuchte (Müller, 1987). Insbesondere gram-negative Keime sind vergleichsweise emp-findlich gegen Austrocknung, so daß hierbei langer Verweilzeit auf dem Filter ineinem Luftstrom eine Inaktivierung zu er-warten ist. Staphylococcus aureus ist hin-gegen vergleichsweise resistent gegenHitze und Austrocknung (Schmidt, 1994).So werden auch im Rahmen des derzeit imLand Niedersachsen durchgeführten Vor-

habens zur Untersuchung von Arbeits-plätzen und Beschäftigten bei der Abfall-entsorgung personengebundene Systemelediglich bei der Probenahme für Sporeneingesetzt. Dabei kommen Geräte zum Ein-satz, die für die Sammlung von Feinstaubverwendet werden (Missel, 1996).

Die veröffentlichten Daten sind in der Regelmit ortsgebundenen Systemen ermitteltworden.

Cohen et al. (1984) berichten von einemVergleich zwischen personengebundenerProbenahme und nicht personengebun-denen Systemen bei der Staubmessung.Sie fanden mit personengebundenen Syste-men im Durchschnitt dreifach höhere Meß-werte. Als Hauptursache beschreiben dieAutoren den Eintrag von Staub, der sichvon der Arbeitskleidung gelöst hat, auf denFilter des personengebundenen Systems.Poulsen et al. (1995) schließen aus den An-gaben von Cohen et al. (1984), daß dievorhandenen Expositionsdaten für Luftkeimemöglicherweise zu niedrig sind.

Das oben angesprochene Problem des Aus-trocknens auf der Filtermembran bei langenProbenahmezeiten könnte bei der Erfas-sung luftgetragener Aktinomyceten einegeringere Rolle spielen, da hier, wie auchdie Daten von Kutzner et al. (1993) zei-gen, überwiegend Sporen erfaßt werden.Diese wiederum sind nach allgemeiner Lehr-meinung gegen Austrocknung vergleichs-weise resistent.


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In der BIA-Verfahrensbeschreibung 9420wird für Schimmelpilze und Hefen der Ein-satz personengetragener Probenahme-systeme als „erstrebenswert angesehen“.Die entsprechenden Geräte müßten je-doch ausreichend erprobt und validiertwerden.

Zusammenfassend müßte der Einfluß per-sonengetragenen Sammelns sicherlichgründlich überprüft werden, um zu klären,ob es nicht durch die üblicherweise ein-gesetzte nicht-personengetragene Probe-nahme in der Nähe des Beschäftigten zueiner Unterbewertung der tatsächlichenBelastung kommt.

3.3 Verfahren zum Sammelnvon Luftkeimen

Luftkeime werden derzeit in der Regel nichtdurch direkte Beobachtung nachgewiesen(z.B. Filtration mit anschließender Vital-färbung und mikroskopischer Betrachtung).Alle derzeit gängigen Meßverfahrenberuhen darauf, daß die gesammeltenProben einem Kultivierungsschritt mit ge-eigneten Nährmedien unterzogen werden,wobei auf diese Weise die Zahl der Kolo-nie-bildenden Einheiten (KBE) ermittelt wird.Derartige Verfahren sind somit nur in derLage, die Anzahl der lebensfähigen Mikro-organismen in einer Luftprobe zu ermitteln.Abgestorbene Zellen oder Zellfragmente,die möglicherweise als Allergene wirken

könnten, werden nicht erfaßt. Die Vor- undNachteile der einzelnen Geräte sind ins-besondere bei Wallhäußer (1995) undDaschner (1995) zusammengefaßt. Da-neben bestehen am ISB auch eigene Erfah-rungen mit unterschiedlichen Geräten zurErfassung der Luftkeimzahl.

3.3.1 Die Sedimentationsplattenmethode

Diese Methode stellt das älteste Verfahrenzur Ermittlung der Keimbelastung der Luftdar. Dabei wird eine Agarplatte mit ab-genommenem Deckel für eine festgelegteZeit an Raumluft exponiert. Dieses Ver-fahren liefert keine quantitativen Ergebnisseüber den Keimgehalt pro VolumeneinheitLuft, wohl aber gute Vergleichswerte für dieRoutinekontrolle von Sterilräumen. Da keinequantitativen Aussagen möglich sind, solldieses Verfahren hier nicht weiter diskutiertwerden.

3.3.2 Das Impaktionsverfahren

Geräte nach dem Impaktionsverfahrenwerden von einer Reihe von Herstellern an-geboten. Die Keime bzw. die mit Keimenkontaminierten Partikel werden dabei direktoder durch Nutzen der bei einem kreis-förmigen Luftstrom auftretenden Zentrifugal-kräfte auf einen Agar-Nährboden auf-geschleudert. Nach diesem Prinzip arbei-ten unterschiedliche Geräte wie der Schlitz-sammler, der Reuter-Zentrifugal-Sammler

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und der Andersen-Sammler. Die Vor- undNachteile der einzelnen Geräte sollen hierfür jedes Gerät einzeln aufgezeigt werden.

Der Andersen-Sammler wurde z.B. auchvon Kutzner et al. (1993) bzw. Kempf undKutzner (1994) eingesetzt. Der größte Vor-teil der von diesen Autoren verwendetensechsstufigen Ausführung liegt darin, daßeine Analyse der luftgetragenen Keimebzw. keimtragenden Partikel nach Größeerfolgt. Es lassen sich gut lungengängigePartikel mit einer Größe von weniger als4,7 mm von den größeren, nicht-lungen-gängigen Partikeln unterscheiden.

Für jede Einzelmessung sind jedoch beidiesem Gerät sechs Petrischalen mit Nähr-agar erforderlich. Die Ansaugleistung be-trägt 28,3 l pro Minute, so daß bei einermaximalen Probenahmedauer von fünfMinuten, wie von den o.a. Autoren ver-wendet, 141,5 l Luft analysiert werdenkönnen. Eine solche Analysezeit wird auchvon Wallhäußer (1995) als optimal be-schrieben. Die untere Erfassungsgrenzebeträgt somit 7 Keime pro Kubikmeter Luft.Diese für die Untersuchung von Steril-räumen recht hohe Erfassungsgrenze bedeu-tet für Arbeitsplatzuntersuchungen keinenNachteil und dürfte auch bei Immissions-messungen nicht kritisch zu bewerten sein.

Bei einer Probenahme an hoch belastetenStellen hat aber der Andersen-Sammler wiealle Impaktionsgeräte den großen Nach-teil, daß die Keimzahlen zu hoch liegenkönnen, um noch einzelne Kolonien unter-scheiden zu können. Generell wird in derMikrobiologie eine Keimzahl von ca. 50 –150 pro Petrischale (Durchmesser: 9 cm)für optimal erachtet (Süßmuth et al.,1987). Somit würden beim Andersen-Sammler, eine gleichmäßige Verteilung aufdie sechs Stufen vorausgesetzt, bis zu ca.200 – 1000 Keime optimal auszuwertensein. Dies bedeutet bei einer Keimzahl von105 pro Kubikmeter ca. 100 l Luft1). Beihöheren Keimzahlen müßte das Luftvolumenentsprechend reduziert werden. Da in derRegel keineswegs genau bekannt ist,welche Keimkonzentration vorherrscht, sindu.U. auch mehrere Parallelmessungen mitunterschiedlichen Probevolumina erforder-lich, was den Aufwand erheblich steigert.

Für die Untersuchung unterschiedlicher Para-meter müssen jeweils neue Nährbödenverwendet werden. Eine Untersuchungunterschiedlicher Parameter aus derselbenLuftprobe ist leider nicht möglich. DieserNachteil gilt zwar für alle Impaktions-geräte, jedoch ist der Materialaufwandbeim Andersen-Sammler besonders hoch,da hier für jede Einzelmessung jeweilssechs Agarplatten eingesetzt werden


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1) Diese Annahme ist optimistisch, da in der Praxis nicht von einer gleichmäßigen Verteilung der Keime auf dieeinzelnen Fraktionen des Andersen-Sammlers auszugehen ist.

müssen. Auch Abdou (1979) und Dasch-ner (1995) sprechen von einem hohenMaterialaufwand für den Andersen-Samm-ler. Zwar ist das Thema dieser Studie nurdie Erfassung von luftgetragenen Aktino-myceten, jedoch wäre eine parallele Er-fassungsmöglichkeit anderer mikrobio-logischer Parameter aus einer Luftprobe,wie sie bei anderen Verfahren möglich ist,auf jeden Fall sinnvoll.

Der größte Vorteil des Andersen-Sammlersscheint in seiner hohen Genauigkeit zuliegen. So beschrieben Jensen et al.(1992) – allerdings bei Arbeiten mit künst-lich hergestellten Aerosolen – Fehlerbreitenvon 10 % für einen sechsstufigen Andersen-Sammler, wohingegen andere Geräte weit-aus ungenauer waren. Auch Buttner undStetzenbach (1993) und Kang und Frank(1989) fanden mit dem Andersen-Sammlerdie besten Ergebnisse.

Der RCS-Sammler ist sehr einfach zu hand-haben. Die Keime werden dabei auf einenspezifischen, vom Hersteller mitgeliefertenAgarstreifen aufgeschleudert. Kritisch wirdbemerkt, daß hier keine genaue Trennungvon ein- und ausströmender Luft aufgrunddes Konstruktionsprinzips möglich ist(Daschner, 1995), was möglicherweisezu einer Verfälschung der Ergebnisseführen kann. Die Sammeleffizienz soll mitder Größe der Partikel (Macher und First,1983) oder deren Masse (Kang undFrank, 1989) korreliert sein. Kanz undKanz (1986) vertreten die Auffassung, daß

der RCS-Sammler ohnehin keine absolutenAngaben über die Luftkeimzahl ermögliche.

Ebenso wie beim Andersen-Sammlermüssen zur Bestimmung unterschiedlicherParameter verschiedene Agarstreifen ver-wendet werden, die Bestimmung mehrererParameter aus einer Luftprobe ist nicht mög-lich. Dabei ist der Aufwand im Vergleichzum Andersen-Sammler deutlich geringer,da hier nur jeweils ein Agarstreifen neu ein-gelegt werden muß.

Wie auch beim Andersen-Sammler könnendie Streifen leicht überwachsen werden,wenn die Luftkeimzahlen zu hoch liegen.

Der große Vorteil des RCS-Sammlers liegtin seiner Handlichkeit und geringenGröße, die einen Einsatz an nahezu allendenkbaren Probenahmepunkten möglichmachen.

Der SAS-Luftkeimsammler (Firma Zinsser)verwendet statt spezifischer Agarstreifen,wie beim RCS-Sammler erforderlich,RODAC-Abklatschplatten, die von zahl-reichen Herstellern angeboten werdenoder mit einem gewissen Aufwand auchselbst hergestellt werden können. DasGerät ist wie der RCS-Sammler leicht undkompakt, so daß es bei Außenmessungengut eingesetzt werden kann. Die Nachteiledes Impaktionsverfahrens treffen auch fürdieses Gerät zu und wurden oben bereitsdiskutiert.

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Der Luftkeimsammler KS 101 der FirmaMLE kann ebenfalls mit RODAC-Platten unddarüber hinaus mit konventionellen Petri-schalen bestückt werden. Derartige Scha-len werden zur Herstellung von Nähr-böden in jedem mikrobiologischen Laboreingesetzt. Auch dieses Gerät besitzt einegute Handlichkeit als positives Merkmalund die oben beschriebenen, mit demImpaktionsverfahren generell verbundenenNachteile.

Der Schlitzsammler ist nach Wallhäußer(1995) vor allem durch seine Unhandlich-keit und schlechte Transportierbarkeitgekennzeichnet, so daß er für Arbeitsplatz-messungen in Kompostierwerken oder land-wirtschaftlichen Betrieben wenig geeigneterscheint.

3.3.3 Filtrationsverfahren

Bei diesem Verfahren wird die Keime bzw.mit Keimen kontaminierte Partikel enthal-tende Luft durch ein Membranfilter gesaugt,auf dem die Mikroorganismen bzw. diekontaminierten Partikel zurückgehalten undabgeschieden werden. Nach dem Filtra-tionsverfahren arbeiten die Luftkeimsammel-geräte der Firma Sartorius (MD 8). Es wirdein spezieller Gelatinefilter eingesetzt,wobei sich der Filter steril verpackt in einerEinweghalterung befindet, die einerseitszum Sammeln der Probe wie auch zum an-schließenden Transport eingesetzt werdenkann. Im Labor können die Filter direkt auf

geeignete Agarmedien aufgelegt werden,wo sie sich dann auflösen, so daß keiner-lei Barriere für die Diffusion von Nähr-stoffen aus dem Agar besteht. Eine solcheBehandlung der Filter ermöglicht denNachweis von sehr geringen Keimkon-zentrationen. Werden höhere Keimkonzen-trationen erwartet, kann der Filter in sterilerKochsalzlösung oder anderen geeignetenSolventien gelöst werden. Dabei ist nachden Erfahrungen des ISB ein Mindest-volumen von 20 ml Flüssigkeit erforderlich.Die so hergestellte Suspension kann alsBasis für Verdünnungsreihen dienen. Ausder Suspension können dann zahlreicheunterschiedliche Nährböden beschicktwerden. Somit ist nach dem Auflösen derFilter die Untersuchung einer Luftprobeauch auf verschiedene mikrobiologischeParameter möglich. Während aber beieinem direkten Auflegen der Filter auf Nähr-böden noch ein lebensfähiger Keim proFilter nachgewiesen werden kann, kommtes durch das Auflösen und unter Berück-sichtigung der Tatsache, daß üblicher-weise 0,1 ml Bakteriensuspension zur Be-stimmung der Keimzahl auf einen Agar auf-gespatelt werden, zu einer Senkung derNachweisgrenze auf 200 Keime pro Filter.Dieser Empfindlichkeitsverlust dürfte jedochfür Arbeitsplatzmessungen unerheblichsein. Selbst für Immissionsmessungen er-scheint diese Nachweisgrenze durchausausreichend, da in „normaler“ Luft bereitsKeimzahlen von mehr als 200 KBE/m3

vorkommen.


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Daneben kann im Falle niedriger Keim-zahlen der Filter immer noch direkt auf denNähragar gelegt werden. Es bleibt aberdie Frage offen, ob bei Auflösen der Mem-branfilter gleiche Ergebnisse erzielt werdenwie beim direkten Auflegen auf die Agar-oberfläche. Werden die Filter direkt aufdie Agaroberfläche aufgelegt, muß aller-dings für jeden Parameter ein neuer Filtereingesetzt werden, wie auch beim Impak-tionsverfahren für jeden Parameter einneuer Nähragar eingesetzt werden muß.

Das geringste Volumen des Sartorius MD 8liegt bei 41,67 l (Sammeldauer 1 Minute).Angesichts der Möglichkeit zur Anlage vonVerdünnungsreihen dürfte dies nicht limitie-rend sein.

Als Nachteil der Filtrationsmethode wird dis-kutiert, daß die Keime bei zu hohen Probe-volumina durch Austrocknen geschädigtwerden könnten. Im Jahre 1988 schriebWallhäußer in Bezug auf dieses Problem,daß der Keimdurchsatz bei der Nutzungder Filtrationsmethode auf 250 l/Filterzu begrenzen sei, da sonst die Gefahr derSchädigung bestünde (Wallhäußer,1988). Diese Behauptung wird in der neue-sten Auflage seines Standardwerks zurSterilisation (Wallhäußer, 1995) aber nichtmehr wiederholt. Jensen et al. (1992)fanden für die Filtrationsmethode mit Zellu-losefiltern im Vergleich zu anderen Luftkeim-sammlern eine schlechtere Ausbeute fürvegetative Zellen von E. coli, wohingegendie Ausbeuten mit Bacillus subtilis vergleich-

bar zum als gut bewerteten sechsstufigenAndersen-Sammler lagen. Die Autorenführen dies auf das Austrocknen von E. coliauf der Membran zurück.

Gelatine-Membranfilter sind nach Angabendes Herstellers nur bis zu einer relativen Luft-feuchte von 85 % zu verwenden. Einesolche Luftfeuchte wird nach unseren Erfah-rungen aber an manchen Arbeitsplätzenwie z.B. umhausten Kompostierwerken inEinzelfällen durchaus überschritten. NachAngaben von Jaschhof (1992) verändertsich die Konsistenz des Filters aber auchbei 90 % Luftfeuchte nicht. Nach Angabendes Herstellers kann das Filter für kurz-zeitige Messungen auch bei einer Luft-feuchte von über 90 % eingesetzt werden,solange es sich nur um kurzzeitige Messun-gen handelt und Gewähr dafür getragenwird, daß das Filter nicht naß wird. Da anArbeitsplätzen hohe Keimkonzentrationenzu erwarten sind, können hier durchauskurzzeitige Messungen (wenige Minuten)durchgeführt werden. Ebenso berichten An-wender darüber, daß die Filter sich beiTemperaturen deutlich über 30 8C in ihrerKonsistenz verändern.

Es besteht die Möglichkeit, auf wasserunlös-liche Filter auszuweichen (z.B. auf Zellu-losebasis), die in der Mikrobiologie beider Membranfilteranalytik wäßriger Probenebenfalls eingesetzt werden. Diese müßtendann in einem wäßrigen Medium (z.B.physiologische Kochsalzlösung) suspendiertwerden, wobei die auf dem Filter vorhan-

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denen Keime durch Plattieren von Ali-quoten der wäßrigen Phase quantifiziertwerden. Dabei geht allerdings der be-sondere Vorteil der Wasserlöslichkeit derGelatine verloren, und es besteht die Mög-lichkeit, daß Teile der Probe nicht vomFilter abgewaschen und somit nicht erfaßtwerden.

3.3.4 Das Impinger-Verfahren

Bei diesem Verfahren wird die mit Keimenbzw. keimtragenden Partikeln befrachteteLuft in eine Flüssigkeit geleitet. Dabei kannes sich um einen Puffer oder aber auch umeine Nährlösung handeln. Im Prinzip han-delt es sich bei einem Impinger um eineWaschflasche, wobei allerdings die Eintritts-öffnung für die Luft in die Flüssigkeit spezi-ell und für verschiedene Typen auch unter-schiedlich gestaltet ist.

Wallhäußer (1995) beschreibt den Impin-ger als recht aufwendig und zeitraubend.Nach seinen Angaben liefert er keinebesseren Ergebnisse als die Membranfilter-methode. Hier kamen Jensen et al. (1992)jedoch zu einem anderen Ergebnis. DieseAutoren arbeiteten aber mit Aerosolen vonca. 2 mm Durchmesser und fanden füreinen Endosporenbildner vergleichbare Er-gebnisse zwischen Membranfilterverfahrenund Impinger.

Der von Wallhäußer (1995) kritisierte ge-ringe Luftdurchsatz dürfte zumindest bei

Arbeitsplatzmessungen mit hohen Keim-konzentrationen keinen Nachteil darstellen.

Auch Daschner (1995) hält die Anwen-dung des Impingers für relativ aufwendig.Kiefer (1992) weist auf die schlechte Des-infizierbarkeit des Impingers unter Freiland-bedingungen hin.

Die Handhabung eines Impingers unter Pra-xisbedingungen erscheint bereits aufgrundder Tatsache, daß hier eine Flüssigkeit imImpinger vorhanden ist, problematisch imVergleich zu Filtern oder auch Agarstreifenoder -platten.

3.4 Auswahl eines geeignetenProbenahmeverfahrens

Generell wird in der Literatur stets daraufhingewiesen, daß nach wie vor ein For-schungsbedarf hinsichtlich des optimalenVerfahrens zur Erfassung von Luftkeimenbesteht. Ein Standardverfahren für die Er-fassung von Luftkeimen allgemein existiertderzeit nicht. Hinzu kommt, daß die der-zeit am Markt befindlichen Verfahrenhöchst unterschiedliche Resultate liefern,die sowohl nach den Angaben der Litera-tur wie auch nach unseren eigenen Erfah-rungen um bis zu 50 % und mehr vonein-ander abweichen können, selbst wenneine größere Zahl von Messungen proMeßpunkt durchgeführt wird. Alle derzeiteingesetzten Verfahren beruhen auf derQuantifizierung lebender Zellen; tote


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Zellen, Zellbruchstücke und -teile werdensomit nicht erfaßt. Diese könnten möglicher-weise teilweise mit der Nukleinsäureanaly-tik oder Immunoassays erfaßt werden.

Für die Erfassung von Luftkeimen allgemeinim Reinraumbereich werden derzeit unter-schiedliche Verfahren empfohlen (Wall-häußer, 1995; DIN prEN 1632−4). FürArbeitsplatzmessungen existiert derzeit eineAnweisung des Landes Niedersachsen(Niedersächsisches Landesamt für Öko-logie, 1995).

Daher gilt es festzustellen:

1. Ein standardisiertes Meßverfahren fürLuftkeime allgemein und speziell für Aktino-myceten fehlt derzeit.

2. Aus der Literatur und aus eigenen prak-tischen Erfahrungen ergibt sich, daß mit ver-schiedenen Verfahren für vergleichbareProben unterschiedliche Meßwerte ermitteltwerden.

3. Es läßt sich aus der Literatur kein einheit-licher Trend entnehmen dergestalt, daß dieResultate mit einem Verfahren immer ineinem bestimmten, festen Verhältnis zueinem anderen Verfahren liegen. Dies istsicher auch darin begründet, daß unter-schiedliche Verfahren gegenläufige Effektebeinhalten. So können im Impinger Keimedurch die plötzliche Hydrierung geschädigtwerden, wohingegen sowohl für das Mem-branfilterverfahren wie auch für verschie-dene Impaktionsverfahren eine Schädigung

der Keime durch Austrocknen diskutiertwird. Die Auswirkungen dieser Effekte aufkonkrete Meßergebnisse dürften von denerfaßten Spezies abhängig sein.

Somit ist die Vergleichbarkeit von Meßer-gebnissen, die an unterschiedlichen Arbeits-plätzen und mit unterschiedlichen Gerätengewonnen wurden, nicht gegeben. Auf deranderen Seite ist eine Bewertung desGefährdungspotentials für die Arbeitsplatz-atmosphäre dringend notwendig. Diesbeinhaltet die Notwendigkeit, für die Be-wertung aller Arbeitsplätze untereinandervergleichbare Meßwerte zu haben.

Aus unserer Sicht sollte daher eine Fest-legung auf ein Meßverfahren erfolgen, dasfür alle Arbeitsplatzmessungen eingesetztwird. Dies würde zur Vergleichbarkeit derMeßergebnisse führen und aufgrund dergrößeren Datenbreite in Zukunft auch einesicherere Beurteilung eventueller Gefahren-potentiale ermöglichen.

Ein solches Meßverfahren sollte folgendeKriterien erfüllen:

l hohe Reproduzierbarkeit der Meß-ergebnisse auch mit unterschiedlichenGeräten des gleichen Typs,

l großer Meßbereich,

l hohe Mobilität (geringes Geräte-gewicht, Möglichkeit zu netzunab-hängigem Betrieb),

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l einfaches Wechseln der Medien, mitdenen die Einzelproben aufgefangenwerden (insbesondere auch unterBerücksichtigung der Kontaminations-gefahr in einer stark belasteten Um-gebung), oder die Verwendung sterilerEinwegeinheiten,

l einfache Reinigung bzw. Desinfektionoder Sterilisation zwischen den Einzel-messungen,

l Unempfindlichkeit gegen Außenein-flüsse (hohe Feuchte, extreme Tempera-turen),

l geringer zeitlicher und personeller Auf-wand, geringe Kosten.

Daneben sind weitere Kriterien wünschens-wert wie z.B.

l Diskriminierung zwischen Partikeln unter-schiedlicher Größe,

l Möglichkeit zur Untersuchung einer Luft-probe auf unterschiedliche Parameter(verschiedene Keimgruppen, Endo-toxine, Staub etc.).

Die DIN prEN 1632−4 (1994) beschreibtzwei Haupttypen von Sammelverfahren fürRisikozonen mit normaler (auf niedrigemNiveau liegender) Biokontamination als ge-eignet: Aufprallsammelgeräte (Impaktions-verfahren) und Filtersammelgeräte. Die BIA-Verfahrensbeschreibung 9420 empfiehltdie Probenahme mit einem Filtersammelge-rät für die Beprobung der Arbeitsplatzatmo-sphäre.

Unter der Berücksichtigung aller oben ge-machten Ausführungen sollte aus unsererSicht derzeit das Filtrationsverfahren für dieProbenahme von Aktinomyceten aus derLuft am Arbeitsplatz empfohlen werden. Eshandelt sich hier um eine Arbeitstechnik,die bei der Messung von Stäuben ver-breitet und erprobt ist und ihre Praxistaug-lichkeit für Arbeitsplatzmessungen bereitsbewiesen hat. Im Gegensatz zum Impak-tionsverfahren ist mit dieser Technik die Er-fassung eines hinreichend großen Meß-bereichs möglich, ohne daß zahlreicheProben mit unterschiedlichen Luftvoluminagenommen werden müssen. Die Filterlassen sich nach der Probenahme leichtund schnell in sterile Beutel verstauen, sodaß die Handhabbarkeit unter Praxisbedin-gungen gut ist.

Der häufig genannte Nachteil beim Filtra-tionsverfahren, das Austrocknen der Orga-nismen während der Probenahme, er-scheint für Aktinomyceten weniger erheb-lich zu sein, da es sich bei den in der Luftbefindlichen, vermehrungsfähigen Aktino-myceten in der Regel um Sporen handelt(Kutzner et al., 1993). Sporen stellen Dau-erformen dar, die sich durch eine erhöhteToleranz gegenüber Streß wie Trockenheitauszeichnen. In Übereinstimmung mitdieser Feststellung spricht auch die BIA-Ver-fahrensbeschreibung 9410 „Probenahmevon Bioaerosolen am Arbeitsplatz“ davon,daß sich robustere Zellen wie Sporen vonBakterien mit dem Filtrationsverfahren sehr


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gut erfassen lassen. Ebenso beschreibenJensen et al. (1992), daß Endosporen-bildner mit dem Filtrationsverfahren in ver-gleichbarer Größenordnung wie mit demImpinger nachgewiesen werden konnten.

Weiterhin bietet ein Filtrationsverfahrenauch die Möglichkeit, auf direktem Wegez.B. den Gehalt der Probe an spezifischenAllergenen über Immunoassays zu ermittelnoder auch durch spezifische DNA-Analy-sen den Gehalt einer Luftprobe auf dieDNA relevanter Aktinomyceten hin zu unter-suchen und auf diesem Wege die nichtmehr lebensfähigen Keime mit zu erfassen.Dies erscheint bei Impaktionsverfahren nurschwer möglich, wohl aber beim Impinger-Verfahren.

Gegen den Einsatz des Andersen-Samm-lers spricht der vergleichsweise hohe Mate-rialaufwand bei der Probenahme sowiedie Notwendigkeit, u.U. mehrere Parallel-messungen mit unterschiedlichen Luftvolu-mina durchführen zu müssen.

Der Impinger erscheint wegen der Tat-sache, daß die einzelnen Sammelflaschenmit Flüssigkeit gefüllt sind, sowie der Bruch-anfälligkeit (Glas) unter Praxisbedingungenweniger geeignet.

Zwar sind die verschiedenen Impaktions-geräte für eine mobile Probenahme auf-grund ihrer Handlichkeit noch bessergeeignet als Filtrationsgeräte wie der Sarto-rius MD 8, jedoch spricht gegen Impak-

tionsgeräte die Tatsache, daß die Nähr-böden insbesondere bei hohen Keimkon-zentrationen leicht überladen werden. Beiunbekannter Mikroorganismenkonzentra-tion müssen daher zahlreiche Proben mitunterschiedlichen Volumina genommenwerden, um auswertbare Ergebnisse zu er-reichen. Beim Filtrationsverfahren kann hin-gegen aus einer Probe ein weiter Konzen-trationsbereich untersucht werden, wobeihier noch der Vorteil hinzukommt, daß par-allel auch verschiedene Parameter getestetwerden können.

Das hier für die Erfassung von Aktinomyce-ten empfohlene Filtrationsverfahren decktsich mit der in der BIA-Verfahrensbeschrei-bung 9420 gegebenen Empfehlung für dieErfassung von Schimmelpilzen, wo eben-falls das Filtrationsverfahren empfohlenwird. In beiden Fällen sind die nachzuwei-senden Agenzien Sporen, die sich überdie Luft verbreiten und gegenüber vegeta-tiven Zellen gegen Austrocknung vergleichs-weise resistent sind.

Die Vor- und Nachteile der einzelnenVerfahren sind auf Seite 48 noch einmaltabellarisch zusammengefaßt.

Insgesamt ergibt sich aus dieser Tabelle,daß die Streßbelastung der Mikroorganis-men der größte Nachteil des Membran-filterverfahrens ist. Diese Belastung istjedoch bei sporenbildenden Mikroorganis-men als nicht so schwerwiegend zubewerten.

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In Tabelle 5 findet sich eine Abschätzungder Kosten und des notwendigen Zeitauf-wands. Die Gerätekosten liegen mit Aus-nahme des Andersen-Sammlers in derGrößenordnung zwischen 3.500 und6.000 DM, da für das Impinger-Verfahrenauch eine entsprechende Zahl an Impin-gern angeschafft werden muß (bei zweiMeßpunkten mit jeweils dreifacher Probe-nahme sind das bereits Kosten von

DM 2.100). Dem bei Impinger- und Mem-branfiltermethode entstehenden Labor-aufwand steht beim Andersen-Sammler undanderen Impaktionsgeräten der u.U.höhere Aufwand bei der Probenahmegegenüber, da bei einer nicht genau be-kannten Keimkonzentration aus Sicherheits-gründen mehrfach Proben mit unterschied-lichen Luftvolumina genommen werdensollten.

Andersen-Sammler Impaktionssamm-ler (z.B. SAS, RCS-Sammler, MLE KS101)

Impinger Membranfilterver-fahren(stationär oder per-sonengebunden)

Transportierbarkeit weniger gut sehr gut weniger gut gut

Materialaufwandfür die Probenahme

hoch gering gering gering

Handhabbarkeitunter Arbeitsplatz-bedingungen

weniger gut gut weniger gut gut

Eignung für die Er-fassung hoher Keim-konzentrationen1

weniger gut weniger gut sehr gut sehr gut

Streßbelastung fürdie Mikroorganis-men

gering gering sehr gering hoch

Eignung für großenProbendurchsatz

weniger gut gut weniger gut gut

1 Keimkonzentrationen $ 105 KBE/m3 Luft

Tabelle 4: Tabellarischer Vergleich verschiedener Verfahren zur Luftkeimsammlung


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Andersen-Sammler

Impaktions-sammler

Impinger Membranfilter-verfahren(stationär oderpersonengebunden)

Gerätepreis1 (DM) ca. 11.000 3.500 bis6.000 DM

350,– pro Impinger,ca. 2.000 DM fürVakuumpumpe

5.400 DM

Verbrauchsmaterialfür eine Einzel-probe2 (DM)

12 DM 2,– (SAS,MLE)4,– (RCS)

wenige Pfennige ca. 10 DM (Filter)

Vorbereitungszeit füreine Probenahme

ca. 2 bis 3 Minuten weniger als1 Minute

ca. 5 Minuten (Beschicken derImpinger im Labor,Anschließen vor derMessung)

weniger als 1 Minute

angesaugtes Luftvolumen in 5 Minuten

141,5 l 200 l (RCS)500 l (MLEKS 101)

62,5 l 17,5 l (personen-gebundene Systeme)bis max. 666 l(Sartorius MD 8)

Aufbereitungszeitder Probe nach der Messung3

keine keine ca. 10 Minuten fürVerdünnungsreiheund Ausplattieren

ca. 15 Minuten(Lösen der Filter,Verdünnungsreiheund Ausplattieren

Materialkosten für die Probenauf-bereitung4

keine keine ca. DM 17,– ca. DM 17,–

Auswertungszeit füreine Einzelprobe

ca. 5 Minuten ca. 1 Minute ca. 5 Minuten ca. 5 Minuten

1 Der Impinger muß mit mindestens 508 mm Hg Unterdruck betrieben werden; daher muß eine ent-sprechende Vakuumpumpe zusätzlich angeschafft werden. Weiterhin müssen die Impinger unter sterilen Be-dingungen mit der Impinger-Flüssigkeit (Puffer o.ä.) beschickt werden, so daß für eine Arbeitsplatzmessungeine Zahl an Impingern mitgeführt werden muß, die zumindest der Anzahl der Einzelproben entspricht.2 Der Preis einer RODAC-Abklatschplatte bzw. einer mit einem Nähragar beschickten 9-cm-Petrischale wurdemit DM 2,– veranschlagt.3 Die Kosten für Glasgefäße, Sterilisation etc. als Vorbereitung für Verdünnungsreihen werden pauschal mitDM 5,– in Rechnung gestellt.4 Hier gehen insbesondere die Kosten für die Nähragarplatten ein. Es wird davon ausgegangen, daß dreiverschiedene Verdünnungsstufen einer dekadischen Verdünnungsreihe jeweils in einer Doppelbestimmung aus-plattiert werden. Die Materialkosten für das Verdünnungsmedium (z.B. physiologische Kochsalz-Lösung) sindzu vernachlässigen. Somit ergeben sich pro Einzelprobe für die Nähragarplatten Kosten von DM 12,–.

Tabelle 5: Zeit- und Kostenaufwand für den Einsatz der unterschiedlichen Luftkeimsammler

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3.5 Strategie der Probenahme

Vor Beginn der Probenahme sollten die Ver-hältnisse am Arbeitsplatz ermittelt werden.Dazu ist es erforderlich, Informationen überden Arbeitsablauf sowie den Aufbau desArbeitsbereichs zu beschaffen. Aus diesenInformationen können dann die möglicher-weise vorkommenden Mikroorganismen,hier Aktinomyceten, abgeleitet werden.Dabei ist vor allem darauf abzuheben, obüberwiegend mesophile oder kryophile Ver-treter oder aber thermophile Spezies zu er-warten sind.

Die Arbeitsplätze sollten aus mikrobio-logischer Sicht bewertet werden hinsicht-lich der unterschiedlichen Expositionsorteund des jeweiligen zeitlichen Verlaufs einermöglichen Exposition (gleichförmige Ver-teilung der Mikroorganismen über die Zeitoder variierende Betriebszustände mit diffe-rierenden Expositionen). Treten unterschied-liche Betriebszustände auf, in denen einejeweils verschiedene Freisetzung von Mikro-organismen zu erwarten ist, müssen die di-versen Betriebszustände einzeln beprobtwerden.

Da möglicherweise auch kurzzeitige Expo-sitionsspitzen Auswirkungen auf die Be-schäftigten haben, sind diese in geeigneterWeise zu erfassen. Die Probenahmedauersollte dabei so gewählt sein, daß die kurz-zeitigen Spitzen der Keimbelastung wirk-lich erfaßt werden können. Für die Bewer-tung der Expositionsspitzen ist ein Referenz-

wert für die durchschnittliche Belastung zuerheben. Dies kann geschehen durch Probe-nahme während Tätigkeiten, die keineExpositionsspitze der Keimbelastung er-warten lassen.Bekannte Expositionsquellen sollten in mög-lichst geringem Abstand beprobt werden,um den Einfluß dieser Quellen möglichstgenau ermitteln zu können.Die BIA-Verfahrensbeschreibung 9420macht keine weiteren Angaben überDetails der Probenahme wie z.B. Höheder Ansaugung über dem Boden etc.Die „Methodik zur lufthygienischen Unter-suchung in Wertstoffsortieranlagen inNiedersachsen“ enthält zu diesem Punktdetailliertere Vorgaben. Weitere Hinweisefür die Probenahme lassen sich derTRGS 402 (1986) entnehmen.Neben einer eindeutigen Festlegung aufein Filtrationsverfahren für die Erfassungder Keime werden in der „Methodik zur luft-hygienischen Untersuchung in Wertstoffsor-tieranlagen in Niedersachsen“ eindeutigeAngaben auch für die Meßorte gemacht.Da sich der o.a. Erlaß aber lediglich aufeinen eng umgrenzten Bereich bezieht mitdefinierten Tätigkeiten, ist eine solche Vor-gabe verhältnismäßig leicht möglich.Die Arbeitsplätze, an denen Aktinomycetenauftreten können, sind sehr vielschichtig(vgl. Tabelle 3). Unter Berücksichtigung derTRGS 402 (1986) können folgende all-gemeine Vorgaben für die Probenahme ge-macht werden:


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1. Die Probenahme sollte bei stationärerProbenahme in Atemhöhe der Beschäftig-ten erfolgen, wie auch in der „Methodikzur lufthygienischen Untersuchung in Wert-stoffsortieranlagen in Niedersachsen“vorgesehen. Dies steht auch in Überein-stimmung mit der TRGS 402, die eineProbenahme „möglichst in Atemhöhe undin unmittelbarer Nähe der Beschäftigten“fordert. Bei einer stehenden Tätigkeit dürftehierfür der in der „Methodik zur lufthygie-nischen Untersuchung in Wertstoffsortier-anlagen in Niedersachsen“ angegebeneWert von 1,5 m Höhe über dem Bodensinnvoll sein. Kutzner et al. (1993) ver-wendeten bei ihrer Untersuchung auf Aktino-myceten eine Höhe von 1,6 m.

Nach TRGS 402 sollten möglichst per-sonenbezogene Probenahmegeräte ein-gesetzt werden, die vom Beschäftigten amKörper getragen werden. Die derzeitkommerziell verfügbaren Luftkeimsammel-geräte sind nicht personenbezogen ein-setzbar, so daß eine derartige Probe-nahme mit diesen Geräten nicht möglichist. Aus unserer Sicht erscheint es nachderzeitigem Stand der Technik tragbar,wenn die Probenahme durch stationäreGeräte direkt am Arbeitsplatz des Mit-arbeiters in Atemhöhe erfolgt. Diese Pro-blemstellung müßte jedoch noch einmalgenauer untersucht werden mit der Ziel-setzung, die Einsatzmöglichkeit nicht per-sonengebundener Staubsammelgeräte zuprüfen.

2. Die Probenahme sollte unter Bedin-gungen erfolgen, bei denen die höchstenEmissionen zu erwarten sind. Dies ist inder Regel dann der Fall, wenn das zu be-handelnde Material bewegt wird.

3. Die TRGS 402 fordert, daß die Nach-weisgrenze sowie „Empfindlichkeit und Prä-zision des Meßverfahrens dem Grenzwertangepaßt sein müssen.“ Dies gilt nachTRGS 402 dann als gewährleistet, wennKonzentrationen der zu messenden Kom-ponente zwischen einem Zehntel, min-destens aber einem Fünftel und dem Dreifa-chen des Grenzwertes gemessen werdenkönnen. Für luftgetragene Aktinomycetenexistieren derzeit noch keine verbindlichenGrenzwerte. Aus der Literatur lassen sichlediglich Angaben entnehmen, die als Ver-gleichswerte dienen können. So gibt Lacey(1981) einen Wert von 106 bis 1010

Sporen thermophiler Aktinomyceten proKubikmeter Luft an, die eine EAA auslösenkönnen. Miller (1992) stellt fest, daß 108

Sporen pro Kubikmeter Luft akute Sym-ptome auslösen können. Crook (1992) stell-te fest, daß Personen, die einer Expositionvon 103 Sporen pro Kubikmeter inSchweineställen ausgesetzt waren, bereitsallergische Symptome entwickelten. Bezüg-lich der Grenzwertproblematik bestehtaber noch großer Forschungsbedarf(vgl. Kapitel 6).

4. Die Meßunsicherheit als integralerFehler aus allen bei einer Messung auftre-tenden systematischen und zufälligen Feh-

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lern soll nach TRGS 402 30 % nicht über-schreiten. Daraus und aus der von Dasch-ner (1995) noch einmal unterstrichenen Er-fahrung, daß Einzelmessungen für Keim-gehalte der Luft relativ ungenau sind, ergibtsich, daß mehrere Parallelmessungendurchgeführt werden sollten. Lembke et al.(1981) stellten fest, daß für eine Ungenauig-keit von weniger als 10 % 16 Einzelmes-sungen notwendig sind. Daschner (1995)hält es in diesem Zusammenhang für mög-lich, daß sich bei Reihenuntersuchungenzwischen verschiedenen Labors Toleranzenum den Faktor 10 ergeben und daher Wert-unterschiede in der entsprechenden Größen-ordnung als irrelevant anzusehen sind. DieZahl der Einzelmeßwerte für einen Meß-punkt und Betriebszustand sollte jeweilsmindestens drei betragen, wobei bei sehrkurzen Probenahmezeiten mehr Einzel-messungen erforderlich sein können (für dieErmittlung der durchschnittlichen Expositionüber eine Schichtlänge vgl. Punkt 6).

5. Eine Kontrollmessung im Außenbereichauf der zum Wind hin gerichteten Seiteder Anlage (luvseits) sollte vorgenommenwerden, um die Hintergrundbelastung inder natürlichen, ungestörten Umgebung zuermitteln.

6. Zur Ermittlung der Exposition über eineganze Schichtlänge gibt die TRGS 402(1986) die Zahl der notwendigen Probenin Abhängigkeit von der Probenahmedauervor. Um die Möglichkeit einer Schädigungdes biologischen Materials gering zuhalten, sollten Probenahmezeiten von maxi-mal einer Stunde verwendet werden.1)

(Vermutlich werden Aktinomycetensporenauch durch längere Probenahmezeitennicht geschädigt, dies müßte jedoch zu-nächst experimentell verifiziert werden,bevor längere Probenahmezeiten z.B. inpersonenbezogenen Sammelsystemen ein-gesetzt werden.) Zur Erfassung der Be-lastung über eine Schichtlänge hinwegsind ggf. mehrere Einzelmessungen durch-zuführen.

3.6 Transport

Der Transport von bakterienhaltigem Unter-suchungsgut für medizinisch-mikrobio-logische Untersuchungen ist in DIN 58942Teil 4 geregelt. Ein Transportsystem wirdhier definiert als diagnostisches Hilfsmittel,das einen hygienisch sicheren Transportvon bakterienhaltigem Untersuchungsgut fürden Zeitraum von der Entnahme der Probe


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1) Aus der Sicht des Arbeitsschutzes erscheinen lange Probenahmezeiten sinnvoll, um eine möglichstwirklichkeitsnahe Aussage über die tatsächliche Belastung zu erhalten. Daher sollte die Frage des Einflusses derProbenahmezeit auf die Meßergebnisse in jedem Falle untersucht werden mit dem Ziel, möglichst langeProbenahmezeiten zu ermöglichen. Eine Probenahmezeit von acht Stunden (Schichtlänge) wurde nachderzeitigem Kenntnisstand auch von der projektbegleitenden Arbeitsgruppe für problematisch gehalten.

bis zur Verarbeitung im Labor gewähr-leistet. Nach DIN 58942 Teil 4 bestehendie Transportbehältnisse aus flüssigen oderhalbflüssigen Medien, dem Behältnis undggf. der Entnahmevorrichtung.

Die Anforderungen an Transportmedienwerden dort zusammenfassend wie folgtdefiniert:

l Das Transportsystem muß keimdichtsein. (Hintergrund dieser Forderung istprimär der Umgebungsschutz vor patho-genen Keimen, die in medizinischenProben vorkommen können.)

l Das Transportsystem muß eine derartigeFallfestigkeit besitzen, daß es sich beieinem Aufprall auf eine harte Ober-fläche aus 1 m Höhe nicht öffnet oderRisse aufweist, die zu einer Kontami-nation in der Umwelt führen können.

l Es darf keine chemischen Reaktionenzwischen dem Transportmedium unddem Material des Behältnisses geben,die den bakteriellen Status des Unter-suchungsgutes verändern könnten.

l Transportsysteme für den allgemeinenEinsatz müssen bei einer Temperaturvon 20 ± 2 8C und einem bakteriellenInokulum von # 5×103 KBE für E. colibzw. Staphylococcus aureus eine Über-lebenszeit von 72 h gewährleisten. FürStreptococcus pyogenes, Haemophilusinfluenzae und Bacteroides fragilis wirdeine Überlebensdauer von 48 h und fürStreptococcus pneumoniae eine Über-

lebenszeit von 24 h verlangt. DieseAnforderungen gelten als erfüllt, wennProben, die aus beimpften Systemennach den entsprechenden minimalenÜberlebenszeiten entnommen wurden,Wachstum des zu testenden Keimeszeigen.

Das Überleben eines Keimes bei einemInokulum von # 5×103 KBE zu gewähr-leisten, bedeutet sicherlich kein hinreichen-des Qualitätsmerkmal für ein Transport-system, das bei der Quantifizierung vonAktinomyceten in der Arbeitsplatzatmo-sphäre eingesetzt werden soll. Das o.a.Kriterium wäre bereits erfüllt, wenn voneinem Inokulum von 5×103 KBE genau einMikroorganismus überleben würde, waseffektiv einer Reduktion der Keimzahl umden Faktor 5×103 während des Transportsentspräche.

Für eine quantitative Erfassung ist es viel-mehr anzustreben, daß sich die Zahl derlebensfähigen Organismen zwischen demZeitpunkt der Probenahme und der Unter-suchung im Labor möglichst wenig ver-ändert.

Die bereits angeführte „Methodik zur luft-hygienischen Untersuchung in Wertstoff-sortieranlagen in Niedersachsen“ gibtfolgende Parameter vor:

l Zeit zwischen Probenahme und Unter-suchung im Labor: < 24 h

l Transporttemperatur: 4 – 7 8C

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Vor allem die Temperatur ist bei einem Ver-sand per Post bzw. Kurierdienst nur schwerund validierbar einzuhalten.

Die BIA-Verfahrensbeschreibung 9420„Verfahren zur Bestimmung der Schimmel-pilz-/Hefenkonzentration“ stellt hier etwasunbestimmtere und allgemeinere Anfor-derungen: „Beim Transport sollten die be-aufschlagten Filter in sicheren Behältnissen… möglichst rasch ins Laboratorium zurAnalyse gebracht werden, das bedeutet inder Regel am Tage der Probenahme. Solltedies aus bestimmten Gründen nicht mög-lich sein (Versand per Post, Probenahmeam Wochenende), ist die Erhaltung derLebensfähigkeit der Pilzeinheiten sowie dieVerhinderung des Pilzwachstums auf denbeaufschlagten Filtern durch Festlegung derUmgebungsparameter (z.B. Kühlung, Dun-kelheit) zu gewährleisten.“

Alle zitierten Empfehlungen sind nicht spezi-fisch auf die Erfassung von Aktinomycetenausgerichtet. Für Erfordernisse des Trans-ports von Proben, die auf Aktinomycetenhin untersucht werden sollen, erscheintuns die Festlegung folgender Parameterwichtig:

Transporttemperatur

Die niedersächsische Richtlinie empfiehltgenerell eine Kühlung auf 4 – 7 8C bei derSammlung von Luftkeimen. Die DIN prEN1632−4 macht über die Transporttempera-tur keine Angaben. Das oben bereits er-

wähnte Meßverfahren des BIA für die Er-fassung von luftgetragenen Pilzsporen legtsich in Bezug auf die Transporttemperaturnicht eindeutig fest. Dies gilt im übrigenauch für die Transportdauer. Hinsichtlichder Temperatur wird davon gesprochen,daß die Proben, sofern sie nicht direktam Tage der Probenahme in das Unter-suchungslabor gebracht werden können,so behandelt werden müssen, daß dieErhaltung der Lebensfähigkeit der Pilzein-heiten sowie die Verhinderung des Pilz-wachstums auf den beaufschlagten Filterndurch Festlegung der Umgebungspara-meter (z.B. Kühlung, Dunkelheit) sicher-zustellen ist.

Die DIN 58942 Teil 4 hebt auf eineTesttemperatur von 20 ± 2 8C für die Be-wertung von Transportmedien im Bereichder medizinischen Mikrobiologie ab. Diesentspricht der Erfahrung, daß derartigeProben auch ohne Kühlung versandtwerden. Da der Inhalt von Untersuchungenim medizinisch-mikrobiologischen Sektorjedoch der qualitative Nachweis eines be-stimmten Keimes und weniger die exakteQuantifizierung von Keimgehalten ist, läßtsich hier eine eventuelle Vermehrung derKeime während des Transports tolerieren.Im Gegensatz hierzu sind Arbeitsplatz-messungen des Luftkeimgehalts jedochMessungen zur möglichst genauen Quanti-fizierung von Keimgehalten, so daß hiereine Vermehrung der Keime während desTransports möglichst zu unterbinden und


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ein Fremdeintrag ausgeschlossen werdenmuß.

Bei der Erfassung thermophiler Aktinomy-ceten muß jedoch beachtet werden, daßes sich hierbei um Organismen handelt,deren Wachstumstemperatur zwischen 45–65 8C liegt (Greiner-Mai et al.,1986).Als vermehrungsfähige Agenzien in der Luftliegen thermophile Aktinomyceten alsSporen vor (Kutzner und Kempf, 1994)Dies ergibt sich schon allein aufgrund derBiologie der Organismen. Bei Sporenhandelt es sich um Ruhestadien, die

l erst unter geeigneten Bedingungenwieder auskeimen und

l eine hohe Toleranz gegen Streß (UV-Strahlung, Austrocknung) besitzen.

Diese beiden Faktoren lassen es aus un-serer Sicht ausreichend erscheinen, denTransport auch ohne Kühlung durch-zuführen, wenn sich die Proben auf einemFilter befinden und somit keine nennens-werte Zufuhr von Feuchtigkeit durch dieMatrix (wie z.B. bei Agar) möglich ist.

Sollen die Proben jedoch nicht nur auf ther-mophile, sondern auch auf mesophile Akti-nomyceten hin untersucht werden, ist eineKühlung (4 – 8 8C Transporttemperatur)empfehlenswert, jedoch aus heutiger Sichtnicht zwingend erforderlich, sofern keineFeuchtigkeit vorhanden ist. Hier solltenaber experimentelle Untersuchungen end-gültige Klarheit schaffen.

Feuchtigkeit

Die Feuchtigkeit ist ein wichtiger Parameter,der das Auskeimen von Sporen generellbeeinflußt. Sporen – die meisten Aktino-myceten bilden Sporen im Sinne von Koni-dien – keimen bei optimalen Umweltbedin-gungen aus, wozu auch eine ausreichendeWasserversorgung gehört. Auf der anderenSeite sind sie selbst im Wassergehalt redu-ziert und besitzen eine deutliche Toleranzgegenüber Trockenheit, um die Verbreitungdurch die Luft zu überdauern. Während desTransports von Proben mit Aktinomycetenspo-ren sollte die Feuchtigkeit somit als Schutzvor dem Auskeimen niedrig gehalten wer-den. Zudem können Aktinomyceten im feuch-ten Milieu auch ohne Anwesenheit größererNährstoffmengen während des Transportsrasch von Gram-negativen Bakterien undsaprophytären Pilzen überwuchert werden.

Dies ist beim Sammeln der Proben aufAgaroberflächen naturgemäß nicht mög-lich, wohl aber dann, wenn das Materialauf Filtern gesammelt wird. Daher ist schonaus dem Grund der geringeren Feuchtig-keitszufuhr während Lagerung und Trans-port das Sammeln der keimtragenden Parti-kel auf Filtern gegenüber einem Impaktions-verfahren zu bevorzugen.

Transportdauer

Während die DIN prEN 1632−4 keineAngaben über die Transportdauer macht,empfiehlt die Richtlinie für die Erfassung vonbiologischen Agenzien in Wertstoffsortier-

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anlagen des Landes Niedersachsen einenZeitraum von maximal 24 h, wobei hierallerdings die aerobe Gesamtkeimzahl inder Luft bestimmt wird. Die BIA-Verfahrens-beschreibung 9420 zur Bestimmung derSchimmelpilz-/Hefenkonzentration emp-fiehlt eine Laboranalyse der Proben nocham Tag der Probenahme, läßt jedoch auchlängere Zeiträume zu, die allerdings nichtgenauer spezifiziert sind. In einem solchenFalle soll aber die Erhaltung der Lebensfä-higkeit der Pilzeinheiten sowie die Verhinde-rung des Pilzwachstums sichergestellt sein.

In der Literatur wird für Streptomyces albuseine Halbwertszeit von 771,6 Minuten beieiner relativen Luftfeuchte von 50 % und22 8C angegeben (Müller, 1987). Diesbedeutet, daß sich die Keimzahl innerhalbvon ca. 13 h halbiert. (Zum Vergleich:Für E. coli gibt der gleiche Autor eine Halb-wertszeit von 70 Minuten bei vergleich-baren Bedingungen an.) Diese Datenzeigen, daß Streptomyces albus, der zurGruppe der Aktinomyceten gehört, ver-gleichsweise unempfindlich gegen dieInaktivierung an Luft ist. Dennoch würdesich die Keimzahl auch hier innerhalb von24 h auf ca. ein Viertel reduzieren. UnterPraxisgesichtspunkten ist heute ein Trans-port in das Prüflabor innerhalb von 24 hmöglich. Diese Zeitdauer sollte nicht über-schritten werden, bevor nicht weitereDaten vorliegen.

Zusammenfassend sollte das Überlebenvon Aktinomyceten nach der Auswahl

eines geeigneten Probeverfahrens nocheinmal untersucht werden, um den Einflußvon Temperatur, Feuchte und Zeitdauerzwischen Probenahme und Aufarbeitungim Labor für die gewählte Probenahme zuprüfen. Diese Prüfung sollte mit Proben austypischen Arbeitsplatzmessungen und nichtmit Testaerosolen erfolgen, da Kompo-nenten der Arbeitsplatzatmosphäre einenEinfluß auf das Überleben der Aktino-myceten während des Transports habenkönnen.

3.7 Nachweis undDifferenzierung vonAktinomyceten im Labor

3.7.1 Isolierung von Aktinomyceten

Aktinomyceten wachsen in der Regel lang-samer als andere Bakterien oder auchPilze. Weiterhin bilden sie relativ kleineKolonien (Kutzner und Kempf, 1994).Daher sollten die Kulturmedien bei der Auf-arbeitung im Labor so gewählt werden,daß sie den Aktinomyceten einen Selek-tionsvorteil bieten. Kutzner und Kempf(1994) verwendeten in ihren Untersuchun-gen Glycerin-Arginin-Agar. Sie beschreibenihn als ein „generelles Medium für dieAnzucht von mesophilen und thermophilenAktinomyceten“.

Kutzner et al. (1993) nutzten vier verschie-dene Nährböden: Glycerin-Arginin-Agarmodifiziert nach El-Nakeeb und Leche-


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valier (1963), R−8-Agar (Amner et al.,1989), Hippurat-Agar (Mattinson-Rose,1986) und einen Standard-I-Malzextrakt-Agar, wobei es sich um Standard-I-Agarvon Merck handelte (enthält Pepton undHefeextrakt), der mit Malzextrakt sowieCaCO3 ergänzt wurde. Diese Autoren ver-setzten alle Medien mit einer Kombinationaus Nystatin und Cykloheximid zur Unter-drückung des Pilzwachstums. Von den vierhier beschriebenen Nährböden enthaltender R-8-Agar sowie der Standard-I-Malz-extrakt-Agar komplexe Bestandteile wieHefeextrakt oder Pepton, während derGlycerin-Arginin-Agar sowie der Hippurat-Agar Medien mit einer exakten stöchio-metrischen Zusammensetzung sind1). EineTabelle mit einer genauen Beschreibungder einzelnen Nährböden befindet sich imAnhang.

Auch am ISB wurde Glycerin-Arginin-Agarbereits erfolgreich zur Erfassung luft-getragener Aktinomyceten eingesetzt.Wichtig ist nach unseren Erfahrungen derZusatz von Antibiotika wie Cykloheximid,die die pilzliche Begleitflora unterdrücken.Viele Pilze wie Aspergillus fumigatus oderandere sind durchaus noch in der Lage,bei Temperaturen von 45 oder 50 8C zuwachsen, wie sie für die Kultur thermophi-ler Aktinomyceten eingesetzt werden. Dadie Pilze auch größere Kolonien bilden

können und dabei leicht die Agarplattenüberwachsen, könnten sie aufwachsendekleine Aktinomyceten-Kolonien überdecken.Das Pilzwachstum muß daher effizient unter-drückt werden.

Spezielle Selektivmedien setzten die glei-chen Autoren für drei im Hinblick auf dieEAA besonders interessante Erreger ein:Hippurat-Agar für Saccharomonosporarectivirgula, R-8-Agar mit Rifampicin für Sac-charomonospora viridis und Standard-I-Malzextraktagar mit Novobiocin für Ther-moactinomyces ssp. Die beiden zuerst ge-nannten Keimarten sollen dabei aber auchgut auf Glycerin-Arginin-Agar wachsen,während zu den Wachstumseigenschaftenvon Thermoactinomyces ssp. auf Glycerin-Arginin-Agar keine Angaben gemachtwerden. Von El-Nakeeb und Lechevalier(1963) wird Glycerin-Arginin-Agar eben-falls als ein universales Nährmedium füraerobe Aktinomyceten beschrieben.

Korn-Wendisch und Weber (1992) habenverschiedene Medien untersucht für dieselektive Isolierung verschiedener Aktino-myceten, wobei insbesondere darauf ge-achtet wurde, daß das Überwachsen derNährböden durch Pilze oder andere Bak-terien unterdrückt wurde. Dabei waren von18 Medien sieben effektiv für die selektiveIsolierung von thermophilen Aktinomyceten,wobei die Selektivität hoch war, so daß

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1) Hippursäure ist N- Benzoylglycin.

immer nur eine oder zwei Arten isoliertwurden. Es ist aus unserer Sicht fraglich,ob eine derartig hohe Selektivität im Hin-blick auf Arbeitsplatzmessungen notwendigist oder ob es nicht vielmehr ausreichendist, generell die thermophilen und evtl.mesophilen Aktinomyceten zu erfassen,ohne eine genauere Differenzierung vor-zunehmen. Die meisten von Korn-Wen-disch und Weber (1992) verwendetenMedien bauten auf TSA (Tryptic Soy Agar= Caseinpepton-Sojamehlpepton-Agar)auf. Dieses Medium ist ohne weitere Zu-sätze ein Universalnährboden, der z.B.bei der Prüfung auf Verkeimung nach demDeutschen Arzneibuch (1991) eingesetztwird. Aufgrund seiner von Hause ausäußerst geringen Selektivität muß dieserNährboden durch den Zusatz eines odermehrerer Antibiotika selektiv gemachtwerden.

Dunger und Fiedler (1989) geben eineÜbersicht über verschiedene Nährbödenfür Bodenaktinomyceten. Die verwendetenMedien lassen sich dabei grob in zweiGruppen unterteilen:

1. Mineralmedien, die als Kohlenstoff-quelle Glycerin und als Stickstoffquelle eineAminosäure enthalten wie Glycin, Argininoder Aspararaginsäure.2. Komplexe Medien. Diese enthalten ent-weder eine hochmolekulare C-Quelle wieStärke mit Casein oder Ammoniumsulfatoder aber auch Casein mit Glucose als C-Quelle.

Greiner-Mai (1988) gibt in ihrer Disser-tation eine Reihe von verschiedenen Nähr-böden für die Kultivierung von Aktinomyce-ten an. Diese Medien enthalten einen odermehrere komplexe Bestandteile wie Hefe-extrakt, Kartoffel-Karotten-Extrakt, Malz-extrakt etc. Leider werden in dieser Arbeitkeine allgemeinen Angaben dazu ge-macht, welche Nährböden universellgeeignet sind und welche eine hohe Selek-tivität besitzen.

Medien, die in den Handbüchern derklinischen Mikrobiologie angeführtwerden, erscheinen weniger hilfreich fürArbeitsplatzmessungen zu sein, da dieAngaben auf die pathologisch wichtigstenAktinomyceten ausgerichtet sind, währenddie Erreger der EAA, wenn überhaupt, nuram Rande aufgeführt sind. So empfiehltLand (1992) für die Erfassung von Aktino-myceten Hirn-Herz-Agar oder Columbia-Agar, wobei Chloramphenicol und Cyklo-heximid bzw. Colistin und Nalidixinsäureals Hemmstoffe zur Unterdrückung derBegleitflora zugesetzt werden. Unter denvon diesem Autor als wichtig angeführtenAktinomyceten ist jedoch kein thermophilerVertreter, sondern lediglich die mesophilenVertreter Nocardia ssp., Actinomadurassp., Streptomyces ssp., Rhodococcus ssp.und Dermatophilus congolensis. Im Manualof Clinical Microbiology empfehlen Landet al. (1991) ebenfalls ähnliche Komplex-medien für die Erfassung von Aktinomyce-ten.


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Zusammenfassend sind zahlreiche Medienzur Erfassung von Aktinomyceten be-schrieben, wobei allerdings keine Datenexplizit vorliegen über den Vergleich derAusbeute verschiedener Medien für dieMessungen der Arbeitsplatzatmosphäre.Grundsätzlich erscheint es sinnvoll, so weitwie möglich auf chemisch genau definierteMedienbestandteile zurückzugreifen, dadiese die Nährmedien gerade im Sinneeiner späteren Normierung eines Verfah-rens national und auch international ambesten reproduzierbar sind. Dies sprichtgegen komplexe Medien, die nicht stöchio-metrisch definierte Bestandteile wie Hefe-extrakt, Pepton oder andere Komponentenenthalten. Die in der Arbeitsgruppe um Pro-fessor Kutzner zusammengetragenen Datensprechen dafür, daß Glycerin-Arginin-Agarnach El-Nakeeb und Lechevalier (1963)mit einer Bebrütungstemperatur von 50 8Cein geeignetes Medium für die Erfassungvon thermophilen Aktinomyceten darstellt,wobei nach Kempf und Kutzner (1994)das gleiche Medium mit einer Bebrütungs-temperatur von 28 8C auch für die Erfas-sung mesophiler Aktinomyceten wie Strepto-myces ssp. geeignet ist.

3.7.2 Differenzierung im Labor

Es stellt sich grundsätzlich die Frage, inwie-weit über die Klassifizierung als mesophileoder thermophile Aktinomyceten hinauseine genauere Identifizierung notwendig

ist, da einige verschiedene Gattungen alsAuslöser der EAA in Frage kommen kön-nen. Für eine erste Beurteilung der Arbeits-platzatmosphäre erscheint es zunächst aus-reichend, die Konzentration an thermo-philen und evtl. mesophilen Aktinomycetengenerell zu bestimmen. Für die Erhebunggenauer epidemiologischer Daten wäreeine möglichst weitgehende Differenzie-rung jedoch wichtig.

Eine einfache Differenzierung ist nachKempf und Kutzner (1994) sowie Kutzneret al. (1993) bereits anhand der Farbevon Substratmycel und Luftmycel sowie derAnordnung der Sporen und der Sporen-oberfläche möglich. Während die beidenzuerst genannten Kriterien sich mit bloßemAuge bzw. mit einer Lupe gut erkennenlassen, wird für die Untersuchung der Spo-renanordnung ein Lichtmikroskop und fürdie Bewertung der Sporenoberfläche einElektronenmikroskop benötigt, was die Ana-lyse natürlich aufwendiger macht.

Weitere biochemische Analysen sind dasZuckerspektrum in Ganzzellhydrolysatensowie der Abbau verschiedener Biopoly-mere (Kempf und Kutzner, 1989).

Moderne molekularbiologische Verfahren,die auf der selektiven Erkennung bestimm-ter Gensequenzen beruhen, werden dieIdentifizierung von Mikroorganismen in Zu-kunft sicherlich sehr erleichtern. Neben denVerfahren, die mit Sonden für Gene derribosomalen RNS erarbeitet wurden und

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die sogar eine In-situ-Identifizierung ermög-lichen können, werden sich auch weitereDNA-Techniken etablieren und durch einenhohen Grad an Automatisierung eineschnelle und präzise Identifizierung vonMikroorganismen ermöglichen (DeBruijn,1996). Wenn eine solche Methodik fürAktinomyceten verfügbar ist, erscheint nachIsolation einer entsprechenden Anzahl vonKolonien aus der Arbeitsplatzatmosphäreauch die Bestimmung einer großen Anzahlvon Einzelisolaten (einige hundert) inner-halb eines Tages durchaus möglich.

Der Laboraufwand zur Erfassung von Mikro-organismen aus der Luft läßt sich durcheine Charakterisierung von Einzelisolatenzur Erfassung einer genauen Speziesver-teilung praktisch beliebig steigern. Esbleibt jedoch die Frage zu beantworten,inwieweit eine Identifizierung der Keimebis zur Speziesebene und gar darunter füreine Erfassung des Gefahrenpotentials derLuft an Arbeitsplätzen notwendig ist. Füreine generelle Erfassung der Gefährdungdurch Aktinomyceten in der Arbeitsplatz-atmosphäre, die ja im wesentlichen in derMöglichkeit einer EAA gegeben ist, er-scheint es ausreichend, die thermophilenbzw. mesophilen Aktinomyceten zunächstsummarisch zu bestimmen und von eineraufwendigen weiteren Differenzierung ab-zusehen.

3.8 Alternativen zur Erfassungder kultivierbarenAktinomyceten

3.8.1 Staubmessungen

Kutzner et al. (1993) führten bei ihrenUntersuchungen parallel zur Erfassung derkultivierbaren Aktinomyceten auch Staub-messungen durch. Dies liegt begründet inder Tatsache, daß Keime und insbeson-dere Sporen Teil des in der Luft befind-lichen Staubes sind. Es erhebt sich dieFrage nach einer Parallelität zwischen demKeimgehalt und dem Staubgehalt in derLuft. So berichtet Wallhäußer (1995) imZusammenhang mit der Beschreibung derProblematik bei der Herstellung von Arz-neimitteln, daß in entsprechenden Räum-lichkeiten ein Verhältnis von Keimzahl zuPartikelzahl zwischen 1:1000 und1:5000 vorliegt.

Kutzner et al. (1993) fanden für Aktino-myceten eine Tendenz zu höheren Konzen-trationen in der Luft an Stellen hoherStaubbelastung nur dann, wenn sie dieMeßwerte innerhalb eines Werkes betrach-teten. Wurden hingegen alle acht be-probten Werke (drei Kompostwerke, einWertstoff- und Humuswerk, eine Wertstoff-sortieranlage, zwei Müllheizkraftwerkesowie eine Mülldeponie) betrachtet, wareine solche Beziehung nicht mehr zu er-kennen. Die Autoren führen dies auf eineunterschiedliche Beschaffenheit des Mülls


60

und der Meßbedingungen zurück. DaMikroorganismen keineswegs die einzigeQuelle für Staub in der Luft darstellen, mußeine solche Korrelation zwischen Staub-gehalt und Mikroorganismenkonzentrationauch keineswegs zwingend sein, da dieAnteile aus mikrobiologischen und nicht-mikrobiologischen Quellen am Gesamt-staubgehalt mit Sicherheit variieren kön-nen. Diese Schwankungen sind durch dieunterschiedliche biologische Aktivität wieauch durch die variierende Größenver-teilung der übrigen eingetragenen Staub-partikel gegeben.

Die Befunde von Kutzner et al. (1993)stehen auch nur in einem scheinbarenWiderspruch zu den Angaben von Dutkie-wicz und Molocznik (1970), die eineKorrelation zwischen Staubgehalt undKeimzahl beschrieben. Diese Autoren be-trachteten jedoch lediglich Bereiche, woGetreide verarbeitet wird. In derartigenBereichen ist aber ein weitaus homogene-rer Eintrag als bei Kompostierung undWertstoffsortierung zu erwarten, die in denArbeiten von Kutzner et al. (1993) unter-sucht wurden.

Für die pharmazeutische Produktion undsomit für reine Räume wird, wie obengesagt, in der Literatur ein Verhältnis zwi-schen Partikelzahl und Mikroorganismen-konzentration in der Luft angegeben, daszwischen 5000:1 und 1000:1 schwan-ken soll (Wallhäußer, 1995). Die für dieBereiche der pharmazeutischen Produktion

gemachten Angaben lassen sich aberkaum mit der Arbeitsplatzatmosphäre inWertstoffsortieranlagen oder Kompostier-werken vergleichen.

Aus diesen Ausführungen ergibt sich, daßeine reine Staubmessung als Ersatz für eineErfassung der Aktinomyceten zur Risiko-bewertung der Arbeitsplatzatmosphärewenig geeignet ist. Allenfalls bei Abwesen-heit von Staub bzw. bei extrem geringenStaubkonzentrationen wie in der Reinraum-technik kann geschlossen werden, daßkeine oder nur sehr geringe Mikroorganis-men- bzw. Aktinomycetenkonzentrationenvorhanden sind. Das Vorkommen hoherStaubkonzentrationen ist jedoch keines-wegs zwingend mit einer hohen Luftkonzen-tration an Aktinomyceten korreliert.

Ein Einsatz der Partikelmessung erscheintallenfalls möglich bei der Beurteilung derSicherheit von Maschinen gemäß DIN EN292−1 (1991). In dieser Norm wird unter4.8 beschrieben, daß Maschinen ein bio-logisches Gefährdungspotential durchSchimmel, Bakterien und Viren besitzenkönnen. Die Überprüfung eines derartigenGefährdungspotentials wäre durch Einsatzeines „Modellstaubs“ mit entsprechenderStaubmessung oder Partikelzählung denk-bar.

Im Sinne eines „worst case“-Szenariossollte in diesem Falle die Partikelgröße desModellstaubs durch die kleinstmöglichereal vorkommende Partikelgröße festgelegt

61

werden. Dies wäre im Falle der Aktinomy-ceten die Größe einer Einzelspore, dienach Kutzner et al. (1993) 0,8 – 2 mmbeträgt. Für Thermoactinomyces wird angleicher Stelle eine Größe zwischen 0,5und 1,5 mm angegeben.

Würde eine Maschine zur Überprüfung miteinem Modellstaub von 0,5 mm Korngrößebetrieben und würde keinerlei Emission ge-messen, kann mit hoher Wahrscheinlichkeitdavon ausgegangen werden, daß aucheinzelne Aktinomycetensporen oder garAggregate solcher Sporen emittiert werdenkönnen, sofern die sonstigen Rahmenbedin-gungen wie insbesondere die Feuchte ent-sprechend eingehalten werden.

Hinsichtlich der Größenverteilung von Parti-keln mit Aktinomycetensporen in der Arbeits-platzatmosphäre geben Kutzner et al.(1993) an, daß die meisten Kolonien miteiner Partikelgröße zwischen 1,1 und2,2 mm assoziiert waren, wohingegen diezu den Bacillariaceae gehörende GattungThermoactinomyces Kolonien überwiegendauf den Agarplatten bildete, wo Partikelmit einer Größe von mehr als 7 mm ab-geschieden wurden. Somit kann davon aus-gegangen werden, daß die Aktinomycetenüberwiegend als Einzelsporen in der Luftvorkommen, während bei der GattungThermoactinomyces entweder größereAggregate aus Myzel und Sporen gebildetwerden oder die Sporen stärker an Staub-partikel gebunden sind als die Aktinomyce-tensporen (Kutzner et al., 1993).

3.8.2 Alternative Verfahren zurBestimmung der Belastung der Luft mit Mikroorganismen

Alle Mikroorganismen und Viren besitzenNukleinsäuren. Daher ist die Bestimmungdes Nukleinsäure-Gehalts einer Probe einAnsatz zur Bestimmung der Biomasse, wo-bei die modernen Verfahren der PCR dar-über hinaus auch die Möglichkeit bieten,die zugehörigen Spezies zu ermitteln. ErsteAnsätze in dieser Richtung werden bereitsin der neueren Literatur beschrieben (Alva-rez et al., 1995). Diese Autoren zeigten,daß PCR-Verfahren auch dann noch guteErgebnisse erbringen, wenn die Empfindlich-keit der konventionellen Lebendkeimzahl-bestimmung durch Streßphänomene bereitsdeutlich reduziert ist. Inwieweit sich PCR-An-sätze auch für exakte Quantifizierung derin der Luft vorkommenden Mikroorganismeneignen, bleibt noch abzuwarten. EinenÜberblick über molekulare Techniken undihre Anwendung bei der Überwachung derLuftqualität liefern Macneil et al. (1995).Solche Verfahren können nach Angabendiese Autoren sein: Hybridisierung mit Son-den, Restriktionsanalyse, Pulsfeldgelelektro-phorese, DNA-Fingerprints, PCR-Techniken.Macneil et al. vertreten die Überzeugung,daß die PCR-Verfahren auch mit gutem Er-folg zur quantitativen Erfassung von Mikro-organismen eingesetzt werden können,sofern die Bedingungen gut kontrolliert sind.

Ebenso wie die DNA ist der Proteingehalteiner Probe in der Regel mit der Biomasse


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korreliert. Colorimetrische Proteinbestimmun-gen mit einer Empfindlichkeit bis in denmg-Bereich (Bradford, 1976) dürften je-doch möglicherweise noch nicht empfind-lich genug sein. Weiterhin ergibt eine Aus-sage über das Gesamtprotein noch keineAussage über qualitative Eigenschaftenwie Toxizität oder Allergenität.

Sowohl quantitative Aussagen über die Kon-zentration einer Meßgröße wie auch quali-tative Aussage erlauben immunologischeMethoden wie ELISA („Enzyme-linked immu-nosorband assay“). Hiermit lassen sich mithoher Spezifität unter Verwendung von Anti-körpern z.B. allergene Substanzen quanti-fizieren. Die Antigene, die die EAA hervor-rufen können, sind allerdings bislang erstunzureichend charakterisiert. Es handeltsich dabei um Proteine oder Glycoproteine.Ein derartiges Antigen wurde aufgereinigt.Es handelte sich dabei um ein Protein miteinem Molekulargewicht von ca. 16 kD,das mit allen Seren von 15 Farmerlunge-Patienten in einer Studie reagierte (Kurup etal., 1984). Kurup (1985) berichtet, daßSeren von 18 Farmerlunge-Patienten mitAntigenen aus Kulturfiltraten von Saccharo-polyspora rectivirgula reagierten. KeineReaktion erfolgte jedoch mit zellfreien Zell-extrakten oder Zellwandextrakten. Diesspricht dafür, daß die antigenen Determi-nanten durch den Mikroorganismus nachaußen abgegeben werden und nicht festmit der Zellwand verbunden sind. Zu-sammenfassend kann festgestellt werden,

daß zwar prinzipiell die Möglichkeit be-steht, die Antigene der Aktinomyceten immu-nologisch nachzuweisen. Da diese Anti-gene bislang jedoch noch nicht hinreichendcharakterisiert sind und daher auch keineallgemein verfügbaren Antiseren zur Ver-fügung stehen, scheidet dieser Ansatz der-zeit für eine Quantifizierung des Risikopoten-tials dieser Organismen in der Luft aus.

Theoretisch ist weiterhin noch eine klassi-sche chemische Analytik denkbar, um dasRisikopotential für Aktinomyceten in derArbeitsplatzluft zu erfassen. Einen solchenAnsatz als Ersatz für einen biologischen Testschlagen Walters et al. (1994) für Endoto-xine gramnegativer Bakterien vor, die Endo-toxine als 3’-Hydroxyfettsäuren über Gas-chromatographie gekoppelt mit Massen-spektrometrie bestimmten. Für Protein-Anti-gene ist jedoch eine derartige Analytikwenig sinnvoll.

Schließlich sei noch erwähnt, daß einigeAutoren auch die Gesamtzahl der lebendenund toten Mikroorganismen durch direktesmikroskopisches Auszählen ermitteln (Niel-sen und Breum, 1995). Diese Technik er-scheint jedoch aufgrund des Aufwands fürRoutinemessungen weniger geeignet, zumalsie auch ohne weitere Hilfsmittel kaum Infor-mationen z.B. über die Speziesverteilungliefert. Möglicherweise bringt hier die elek-tronische Bildanalyse eine Senkung des Zeit-aufwands und eine Steigerung der Spezi-fität, so daß auch dieses Verfahren evtl. spä-ter routinemäßig eingesetzt werden kann.

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4 Ansätze für die Normungvon Verfahrenzur Erfassung vonAktinomyceten4.1 Literaturrecherche

Im Rahmen der Studie wurde eine Literatur-recherche in den Jahrgängen 1994 und1995 des Referateorgans „Current Con-tents, Agriculture, Biology and Environmen-tal Sciences“ vorgenommen. Als Such-begriffe wurden dabei unter anderem„Actino?“1) und „Air“ verwendet, wobei so-wohl die Titel und Keywords als auch dieAbstracts der Veröffentlichungen abgesuchtwurden. Während nach dieser Recherche1994 keine Arbeit zur Untersuchung vonAktinomyceten in Luft erschienen ist, konn-ten im Jahrgang 1995 einige Arbeiten er-mittelt werden.

So untersuchten Lavoie et al. (1995) unteranderem Aktinomyceten in der Schweine-zucht und kommen zu der Schlußfolgerung,daß in den von ihnen untersuchten spezi-fischen Systemen ideale Bedingungen fürdie Vermehrung von Aktinomyceten und As-pergillus fumigatus herrschen. Die Beschäf-tigten sollten daher HEPA-Filter tragen, diemindestens 99,7 % der Sporen zurück-halten sollten. Die Untersuchungen wurdenmit einem Andersen-Sammler mit extremkurzen Probenahmezeiten (15 oder 30 Se-kunden) durchgeführt, wobei Vollmedienzum Einsatz kamen. Raty et al. (1994) iso-lierten u.a. Aktinomyceten aus der Innen-raumluft, wobei allerdings die biologische

Aktivität der Organismen im Mittelpunkt derArbeit stand.

Poulsen et al. (1995) geben eine umfang-reiche Übersicht über die Gesundheitspro-bleme, die mit dem Sortieren und Recyclenvon häuslichem Abfall verbunden sind.Generell wird in dieser Arbeit auf die stei-gende Bedeutung der Problematik hin-gewiesen, die sich durch den Trend er-geben, weniger Abfall thermisch zu behan-deln bzw. in Deponien zu entsorgen. Einspezielles Risikopotential für thermophileAktinomyceten sehen diese Autoren in Kom-postwerken.

Für die Meßstrategie wird in dieser Arbeitdarauf verwiesen, daß ein großer Mangelan standardisierter Methodik in diesem Be-reich besteht, wobei es wünschenswertwäre, nicht nur die lebensfähigen und kulti-vierbaren, sondern auch die Gesamtzahlaller Mikroorganismen in der Luft zu er-fassen. Personengebundene Probenahmekönnte höhere Meßwerte ergeben als dieüblicherweise durchgeführten nicht-per-sonengebundenen Probenahmesysteme. Eswird auf die hohe Bedeutung einer durch-dachten Strategie der Probenahme hin-gewiesen, wobei es nach den Angabenvon Poulsen et al. besonders wichtig ist,daß die Ursachen einer Variation in derExposition bei der Erarbeitung einer der-artigen Strategie berücksichtigt werden.

4 Ansätze für die Normung von Verfahrenzur Erfassung von Aktinomyceten

65

1) „?“ ist eine sogenannte Wildcard, die es ermöglicht, beliebige Zeichenfolgen mit dem Präfix Actino zu erkennen.

Besonders wird unter Verweis auf eineArbeit von Heedrik (1990) vermerkt, daßfür allergische Alveolitis, wie sie durch Akti-nomyceten hervorgerufen werden kann,die Expositionsspitzen wichtig sind, wäh-rend für Bronchitis Durchschnittswerte überlängere Zeiträume eine größere Bedeutunghaben. Nach Poulsen et al. (1995) bestehtderzeit noch ein großer Forschungsbedarf,um die kausalen Verknüpfungen zwischender Exposition gegenüber Bioaerosoleneinerseits und bestimmten gesundheitlichenAuswirkungen andererseits zu klären. Ineiner Literaturübersicht werden von Poulsenet al. (1995) 17 Literaturzitate aufgeführt,die eine Korrelation zwischen einer mikro-biellen Exposition in der Arbeitsplatzatmo-sphäre und gesundheitlichen Problemenuntersucht haben, wobei sich allerdingskeine der Arbeiten mit Aktinomyceten be-schäftigt.

4.2 Recherche in der DatenbankPERINORM

In der CD-ROM-Datenbank PERINORMwurde im Februar 1996 eine Recherchedurchgeführt hinsichtlich bereits bestehen-der Normen oder Richtlinien für die Samm-lung von Luftkeimen und insbesondere vonAktinomyceten.

Für die Erfassung von Aktinomycetenkonnte keine Norm oder Richtlinie ermitteltwerden. Für die Bestimmung des Luft-keimgehalts allgemein wird derzeit dieEN 1632 in nationale Normen umgesetzt,wobei in Deutschland die im Entwurf vor-liegende DIN EN 1632−4 speziell dieGrundsätze und Analyseverfahren fürdie Bewertung der Luft in Risikozonen be-schreibt. Diese Norm bezieht sich aberexplizit auf die Reinraumtechnologie undist daher auf Arbeitsplatzmessungen nurbedingt zu übertragen. Darüber hinaus exi-stieren lediglich drei ältere Angaben ausden Jahren 1972 bis 1975 über die Be-stimmung des Luftkeimgehalts in der Lebens-mittel- und Verpackungsindustrie, die vomFraunhofer Institut für Lebensmitteltechno-logie und Verpackung in Stuttgart heraus-gegeben wurden.

4 Ansätze für die Normung von Verfahrenzur Erfassung von Aktinomyceten

66

5 Empfehlungen für denAuftraggeberDerzeit existiert noch keine verbindlicheNorm für die Erfassung luftgetragener Akti-nomyceten in der Arbeitsplatzatmosphäre.Die Erfassungsverfahren für Luftkeime ins-gesamt bedürfen somit einer Standardisie-rung, wobei die derzeit verfügbaren Metho-den noch nicht hinreichend validiert sind.

Ungeachtet dessen besteht die Notwendig-keit einer möglichst einheitlichen und über-tragbaren Erfassung von Aktinomyceten anArbeitsplätzen.

Als Meßstrategie wird vorgeschlagen:

1. Die zu untersuchenden Arbeitsplätzewerden hinsichtlich der möglicherweise vor-kommenden Mikroorganismen bewertet.Besteht die Möglichkeit des Vorkommenssolcher Organismen in höheren Konzentra-tionen, werden die Arbeitsvorgänge dahin-gehend untersucht, wann die höchstenund wann niedrige Belastungen auftretenkönnen.

2. Zum Zeitpunkt der höchsten Belastun-gen erfolgt eine Erfassung der Luftkeime mitdem Membranfilterverfahren in einer Drei-fachmessung pro Meßpunkt. Daneben soll-ten auch relevante Arbeitsgänge mit erfah-

rungsgemäß niedrigerer Belastung beprobtwerden, sofern eine durchschnittliche Be-lastung ermittelt werden soll.

3. Die Proben werden möglichst innerhalbder nächsten 24 h in das Labor gebrachtund nach Aufarbeitung auf Glycerin-Arginin-Agar plattiert, dem zur Unterdrückung desPilzwachstums geeignete Antibiotika wieCykloheximid oder Nystatin beigefügt sind.

4. Die Bebrütung erfolgt bei 50 8C undbei 30 8C, um sowohl thermophile wieauch mesophile Aktinomyceten zu erfassen.

5. Die beimpften Platten werden maximal14 Tage bebrütet, wobei sichergestelltwerden muß, daß sie während dieser Zeitnicht austrocknen.

6. Parallel erfolgt eine Staubmessung, umdie Belastung der Arbeitsplatzatmosphäremit Staub zu ermitteln und somit noch einenunabhängigen Parameter zur Bewertungder Luft am Arbeitsplatz zur Verfügung zuhaben.

7. Zur besseren Bewertung der Ergebnissekann eine Referenzmessung an Außenluftsinnvoll sein.

5 Empfehlungen für den Auftraggeber

67

6 ForschungsbedarfDer bestehende Forschungsbedarf läßt sichwie folgt darlegen:

1. Die Einflüsse von Probenahmestrategie,Anzahl der Proben, Probentransport undProbenaufarbeitung auf die erhaltenen Meß-werte müssen genau evaluiert werden.

2. Die im Labor eingesetzten Nährmedienmüssen hinsichtlich der Qualität der erhal-tenen Meßwerte evaluiert werden. Dazumüssen neben dem hier vorgeschlagenenGlycerin-Argin-Nährboden auch andere imVergleich untersucht werden, um die Fragezu beantworten, welcher Nährboden ggf.die optimale Ausbeute ermöglicht.

3. Die unter 1. und 2. zusammengefaßtenFaktoren sollten zunächst in einem Laborpraxisnah untersucht und bewertet werden,um daraus einen Entwurf für ein Meßver-fahren luftgetragener Aktinomyceten zu er-arbeiten. Dieser Entwurf sollte dann unab-hängig in einem Ringversuch getestetwerden.

4. Derzeit existieren noch keine Grenz-werte hinsichtlich der Bewertung der Keim-

zahlen. Lediglich Lacey (1981) gibt einenWert von 106 bis 1010 Sporen thermo-philer Aktinomyceten pro Kubikmeter Luftan, die eine EAA auslösen können. Miller(1992) stellt fest, daß 108 Sporen proKubikmeter Luft akute Symptome auslösenkönnen. Crook (1992) stellte fest, daßPersonen, die einer Exposition von 103

Sporen pro Kubikmeter in Schweineställenausgesetzt waren, bereits allergische Sym-ptome entwickelten. Da nur wenige Datenvorhanden sind, sollten Grenzwerte durchepidemiologische Studien unter Einsatzeines einheitlichen Meßverfahrens er-arbeitet werden.

5. Die derzeit gängigen Verfahren zur Er-mittlung der lebensfähigen Keime in derArbeitsplatzatmosphäre sollten abgegli-chen werden mit alternativen, weiter zu ent-wickelnden Verfahren, die die gesamteBelastung an lebenden und toten Keimensowie deren Bruchstücken erfassen (DNA-Analytik, Immunologie etc.). Ziel soll essein, eine allgemeingültige Bezugsgrößezu erhalten.

6 Forschungsbedarf

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Wallhäußer, K. H. (1995): Praxis derSterilisation Desinfektion – Konservierung,5. Aufl., Thieme Verlag, Stuttgart

Walters, M.; Milton, D.; Larsson, L.; Ford,T. (1994): Airborne environmental endo-toxin – a cross-validation of sampling andanalysis techniques, Appl. Environm. Micro-biol., 60, 996−1005

Williams, S.T.; Lanning, S.; Wellington,E.M.H. (1984): The ecology of actino-mycetes. In: Goodwin, M.; Mordarski,M.; Williams, S. T. (eds.): The biology ofthe actinomycetes, Academic Press, London

75

Anhang 1/Annex 1/Annexe 1Nährmedien/Culture media/Milieux de cultureDarstellung, leicht verändert, nach Kutzner et al., 1993.Presentation, slightly modified, according to Kutzner et al., 1993.Cette description se réfère, sous une forme légèrement modifiée, à Kutzner et al., 1993.

Glycerin-Arginin-Agar/Glycerine-arginine-agar/Glycérine-arginine-agar-agar

Dieses Nährmedium ist in Anhang 2 (Vorschlag für eine Meßstrategie) genau beschrieben.This culture medium is described in detail in annex 2 (proposal for a measuring strategy).Ce milieu de culture fait l’objet d’une description détaillée à l’annexe 2 (stratégie demesure préconisée).

R 8-Agar/R8-agar/R 8-agar-agar

(Amner et al. 1989)

Hefeextrakt/Yeast extract/Extrait de levure 10,0 g/l

MgCl2 × 6 H2O 5,1 g/l

NaOH (1 M) 7,0 ml/l

Agar/Agar-agar 12,0 g/l

Nach dem Autoklavieren zugeben:Added after autoclaving:Après le passage en autoclave, ajouter:

L-Prolin/Proline L 3,0 g/l

CaCl2 (5 M) 10,0 ml/l

Anhang 1/Annex 1/Annexe 1

Nährmedien/Culture media/Milieux de culture

77

Hippurat-Agar/Hippurate-agar/Hippurate-agar-agar

(Mattinson-Rose, 1986; modifiziert von/modified by/modifié par Kutzner et al., 1993)

Natrium-Hippurat/Sodium hippurate/Hippurate de sodium 3,0 g/l

(NH4)H2PO4 1,0 g/l

K2HPO4 1,0 g/l

MgSO4 × 7 H2O 0,4 g/l

NaCl 20,0 g/l

Agar/Agar-agar 12,0 g/l

Der pH-Wert wird auf 7,2 eingestellt.The pH value is set at 7.2.Le pH est amené à 7,2.

Standard-I-Malzextrakt-Agar/Standard I-malt extract-agar/Agar-agar-extrait de malt-I standard

(Greiner-Mai, 1988)

Standard-I-Agar (Merck, Nr. 7881)Standard I-agar (Merck, No. 7881)Agar-agar I standard (Merck, n8 7881)

37,0 g/l

Malzextrakt/Malt extract/Extrait de malt 10,0 g/l

CaCO3 2,0 g/l

Der pH-Wert wird auf 7,2 eingestellt.The pH value is set at 7.2.Le pH est amené à 7,2.

Anhang 1/Annex 1/Annexe 1

Nährmedien/Culture media/Milieux de culture

78

Anhang 2Vorschlag für eine MeßstrategieAerobe Aktinomyceten und darunter insbe-sondere thermophile Vertreter können beieinem Vorkommen in der Arbeitsplatzatmo-sphäre ein gesundheitliches Risiko für dieBeschäftigten bedeuten. Daher soll hiereine Kurzanleitung für die Erfassung der-artiger Organismen in der Arbeitsplatzatmo-sphäre gegeben werden.

Procedere

l Probenahme in Atemhöhe oder im Atem-bereich der Beschäftigten (ca. 1,50 mHöhe).

l Dreifachproben mit Membranfilterver-fahren (bei sehr kurzen Probenahme-zeiten wird eine höhere Zahl an Einzel-proben empfohlen).

l Empfohlene Dauer der Probenahme 10oder 15 Minuten. (Eine Zeit von einerStunde sollte jedoch in keinem Fall über-schritten werden!)

l Transport der Proben ins Labor mög-lichst innerhalb von 24 h. (Für Actinomy-cetensporen sind wahrscheinlich län-gere Transportzeiten zulässig. Diessollte jedoch zunächst geprüft werden.)

l Auflösen oder Suspendieren der Filter in20 ml steriler physiologischer Kochsalz-lösung.

l Plattieren auf Glycerin-Arginin-Agar.(Dieses Medium ist ein Mineralmedium,daher gut standardisierbar und für meso-phile wie auch thermophile Aktinomyce-ten geeignet.)

l Von jedem aufgelösten bzw. suspen-dierten Filter ist jeweils eine Doppel-bestimmung bei jeder Bebrütungstempe-ratur durchzuführen.

l Bebrütung bei 50 8C und 28 8C fürmaximal 14 Tage.

l Wichtig ist der Zusatz von Antibiotika,um das Aufwachsen von Pilzen zu ver-hindern. Vorgeschlagen werden Cyklo-heximid und Nystatin, jeweils mit einerEndkonzentration von 50 mg/ml.

l Wegen der langen Bebrütungsdauer istdas Austrocknen ein Problem. Kutzneret al. (1993) empfehlen, das üblicheAgar-Volumen von ca. 25 ml auf 40 mlzu erhöhen, evtl. müssen die Schalenauch mit Parafilm verschlossen werden.

l Für die Bewertung der Meßergebnisseist eine Referenzmessung der Außenluftim Luv der Anlage empfehlenswert.

Anhang 2

Vorschlag für eine Meßstrategie

79

Rezept für Glycerin-Arginin-Agar

(El-Nakeeb und Lechevalier, 1963; modifiziert nach Kutzner et al., 1993)

Glycerin 12,5 g/l

L-Arginin 1,0 g/l

KH2PO4 0,3 g/l

K2HPO4 0,7 g/l

MgSO4 × 7 H2O 0,5 g/l

NaCl 1,0 g/l

Spurenelemente nachDrews (1983, s. rechts)

1,0 ml

Agar 12,0 g/l

Der pH-Wert wird auf 7,2 eingestellt.

Spurenelement-Lösung nach Drews (1983)

Die Substanzen werden getrennt in Wassergelöst und zur EDTA-Lösung gegeben.Danach wird der pH-Wert auf etwa 4 ein-gestellt und die Lösung mit Wasser auf1000 ml aufgefüllt.

EDTA 500 mg/l

FeSO4 × 7 H2O 300 mg/l

MnCl2 × 4 H2O 3 mg/l

CoCl2 × 6 H2O 5 mg/l

CuCl2 × 6 H2O 1 mg/l

NiCl2 × 6 H2O 2 mg/l

NaMoO4 × 2 H2O 3 mg/l

ZnSO4 × 7 H2O 5 mg/l

H3BO3 2 mg/l

Anhang 2

Vorschlag für eine Meßstrategie

80

Annex 2Proposal for a measuring strategyAerobic actinomycetes, especially thermo-philic types, can constitute a health risk forworkers if present in the workplace atmo-sphere. For this reason, here is a brief intro-duction to recording organisms of this typein the workplace atmosphere.

Procedure

l Sampling at workers’ breathing leveland within their breathing range(at a height of approx. 1.50 m).

l Triple samples using membrane filterprocess (a higher number of single sam-ples is recommended if sampling timesare very short).

l Recommended sampling period: 10 or15 minutes. (A period of one hourshould not be exceeded under any cir-cumstances!)

l Samples should be brought into the lab-oratory within 24 hours if possible. (Alonger transport period is probably per-missible for actinomycete spores. Thisshould, however, be checked first.)

l Dissolving or suspending filters in 20 mlof sterile physiological sodium chloridesolution.

l Making plates on glycerine-arginine-agar. (This is a mineral medium and istherefore suitable for standardizationand for both mesophilic and thermophi-lic actinomycetes.)

l Two evaluations should be made ofeach dissolved and suspended filter ateach incubation temperature.

l Incubation at 50 8C and 28 8C for amaximum of 14 days.

l It is important to add antibiotics to pre-vent fungi from growing. Cyclohexi-mide and nystatine are recommendedwith a final concentration of 50 mg/ml.

l Due to the long incubation period,drying out is a problem. Kutzner et al.(1993) recommend that the usual vol-ume of agar be increased fromapprox. 25 ml to 40 ml; dishes mayalso have to be sealed with parafilm.

l A reference measurement of the outsideair on the windward side of the labora-tory is recommended for assessing mea-suring results.

Annex 2

Proposal for a measuring strategy

81

Formula forglycerine-arginine-agar

(El-Nakeeb and Lechevalier, 1963; modi-fied according to Kutzner et al., 1993)

Glycerine 12.5 g/l

L-arginine 1.0 g/l

KH2PO4 0.3 g/l

K2HPO4 0.7 g/l

MgSO4 × 7 H2O 0.5 g/l

NaCl 1.0 g/l

Trace elements acc. toDrews (1983, see right)

1.0 ml

Agar 12.0 g/l

The pH value is set at 7.2.

Trace element solution accordingto Drews (1983)

Substances are dissolved separately inwater and added to the EDTA solution. ThepH value is then set to approx. 4 and thesolution is filled up with water to 1000 ml.

EDTA 500 mg/l








H3BO3 2 mg/l

Annex 2

Proposal for a measuring strategy

82

Annexe 2Stratégie de mesure préconiséeLes actinomycètes aérobies, et en particu-lier les espèces thermophiles, peuvent, parleur présence dans l’atmosphère d’unposte de travail, constituer un risque pourla santé des travailleurs. On trouvera doncci-dessous de brèves instructions sur lamanière de détecter ces organismes dansl’atmosphère du poste de travail.

Procédure à suivre

l Effectuer le prélèvement à la hauteur oudans la zone de respiration des travail-leurs (à environ 1,50 m de hauteur).

l Effectuer un triple prélèvement en uti-lisant un filtre à membrane (si les du-rées de prélèvement sont très courtes, ilest conseillé de prélever un nombreplus important d’échantillons).

l Durée de prélèvement conseillée : 10à 15 minutes (on ne dépassera enaucun cas une durée d’une heure).

l Les échantillons devront être transportésau laboratoire si possible dans les 24heures qui suivent (pour les sporesd’actinomycètes, un laps de temps pluslong est probablement admissible.Ceci reste toutefois à vérifier).

l Dissolution ou suspension des filtresdans 20 ml de solution saline physiolo-gique stérile.

l Mise en culture dans un milieu glycéri-ne-arginine-agar-agar (étant de natureminérale, ce milieu est facile à standar-diser et convient donc aussi bien pourles actinomycètes mésophiles que ther-mophiles).

l Pour chaque filtre dissous ou mis en sus-pension, on effectuera une double éva-luation pour chaque température d’incu-bation.

l Incubation à 50 8C et 28 8C. Duréemaximum : 14 jours.

l Il est important d’ajouter des antibio-tiques pour éviter l’apparition de cham-pignons. Antibiotiques recommandés :cycloheximide et nystatine, à une con-centration finale de 50 g/ml.

l Du fait de la période d’incubation pro-longée, le dessèchement peut poser unproblème. Kutzner et al. (1993) recom-mandent d’augmenter le volume usueld’agar-agar de 25 ml à 40 ml. Le caséchéant, il conviendra de fermer lescoupelles à la paraffine.

l Pour pouvoir évaluer les résultats desmesures, il est recommandé de procé-der à une mesure de référence de l’air,prise à l’extérieur des bâtiments, ducôté du vent.

Annexe 2

Stratégie de mesure préconisée

83

Formulation duglycérine-arginine-agar-agar

(El-Nakeeb et Lechevalier, 1963; modifiéselon Kutzner et al., 1993)

Glycérine 12,5 g/l

Arginine L 1,0 g/l

KH2PO4 0,3 g/l

K2HPO4 0,7 g/l

MgSO4 × 7 H2O 0,5 g/l

NaCl 1,0 g/l

Oligo-éléments selonDrews (1983, cf. àdroite)

1,0 ml

Agar-agar 12,0 g/l

Le pH est amené à 7,2.

Solution d’oligo-éléments selon Drews (1983)

Les substances sont dissoutes séparémentdans l’eau et ajoutées à la solutiond’EDTA. Le pH est ensuite amené à 4 en-viron. De l’eau est ajoutée à la solutionjusqu’à obtenir 1000 ml.

EDTA 500 mg/l








H3BO3 2 mg/l

Annexe 2

Stratégie de mesure préconisée

84

Teil 2Ringversuch:Mikroorganismen in der Arbeitsplatzatmosphäre –Aktinomyceten

1 Einleitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87

2 Experimentelle Durchführung . . . . . . . . . . . . . . . . . . 872.1 Teil 1: Probenahme mit anschließender Laborauswertung . . . . . . 872.1.1 Probenahme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 872.1.2 Laboruntersuchungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 882.2 Teil 2: Zusätzliche Laboraufarbeitung einer geteilten Probe . . . . . . 90

3 Ergebnisse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 913.1 Teil 1: Probenahme mit anschließender Laborauswertung . . . . . . 913.2 Teil 2: Zusätzliche Laboraufbereitung einer geteilten Probe . . . . . . 91

4 Diskussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 984.1 Teil 1: Probenahme mit anschließender Laborauswertung . . . . . . 984.2 Teil 2: Zusätzliche Laboraufarbeitung einer gesplitteten Probe . . . . 100

5 Empfehlungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101

6 Literatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102

Teil 2Ringversuch:Mikroorganismen in der Arbeitsplatzatmosphäre –Aktinomyceten

85

Teil 2 Ringversuch1 Einleitung

Die KAN hatte in einer Literaturstudie dieMöglichkeiten zur Erfassung von luftgetrage-nen Aktinomyceten in der Arbeitsplatzatmo-sphäre untersuchen lassen.1

Diese Arbeit enthielt eine Empfehlung fürein mögliches Verfahren zur Probenahmeund Laborauswertung, wobei dies aber imRahmen der Studie nicht experimentell ab-gesichert werden konnte.

Es wurde in dieser Literaturstudie jedochdie Empfehlung ausgesprochen, das vor-gestellte Verfahren in einem Ringversuch zuerproben. Dies geschah mit dem Ziel, einePraxisbewertung zu erhalten. Sofern er-forderlich, sollten auf der Basis experimen-teller Daten auch Modifikationen vor-genommen werden.

Inhalt dieses Berichtes ist eine Zusammen-stellung der Ergebnisse und eine Bewer-tung.

Die experimentellen Arbeiten wurden1997 und 1998 durchgeführt. Am Ring-versuch haben teilgenommen:

l Berufsgenossenschaftliches Institut fürArbeitssicherheit (BIA), Sankt Augustin

l Justus-Liebig-Universität Gießen, Institutfür angewandte Mikrobiologie, Gießen

l Labor Dr. Rabe, Essen

l Tierärztliche Hochschule Hannover,Hannover (konnte am Teil 2 des Ring-versuchs nicht teilnehmen)

l TÜV Energie- und SystemtechnikGmbH, Institut für Sicherheit in der Bio-technologie (ISB), Freiburg/Eschborn

l Universität Hohenheim, Institut für Um-welt und Tierhygiene sowie Tiermedizinmit Tierklinik, Stuttgart

Allen Teilnehmern, dem Kompostwerk Leon-berg bei Stuttgart, in dem die Probenahmedurchgeführt wurde, sowie der KAN sei andieser Stelle gedankt.

2 Experimentelle Durchführung

2.1 Teil 1: Probenahme mitanschließender Laborauswertung

2.1.1 Probenahme

Die Probenahme erfolgte in der Rottehalledes Kompostwerks Leonberg. In der Rotte-halle wurde zum Zeitpunkt der Probe-nahme eine Intensiv-Kompostierung durch-geführt, wobei das Material während derProbenahme an der Probenahmestelle nichtumgesetzt oder anderweitig stark bewegtwurde. Im hinteren Teil der Halle wurdenjedoch zeitweise Umsetzarbeiten durch-geführt.

Teil 2 Ringversuch

87

1) KAN-Bericht 13 (1. Auflage, 1997); jetzt Teil 1 in der vorliegenden Broschüre.

Starke Luftbewegungen waren in derHallenluft nicht wahrnehmbar.

Die Probenahmestelle befand sich seitlich inWandnähe etwa in der Mitte der Längs-achse der Halle. Die Probenahme erfolgtein einer Höhe von ca. 1,5 m, wobei dieProbenahmeköpfe der einzelnen Geräteeinen seitlichen Abstand von ca. 1 m hatten.

Es wurden insgesamt 7 Einzelproben ge-nommen in den in Tabelle 1 genanntenVarianten.

Die beaufschlagten Filter wurden nachProbenahme so gelagert, daß ein Zutrittvon Keimen ausgeschlossen war. Die Filterwurden bei Umgebungstemperatur durchdie Probenehmer in die einzelnen Laborsverbracht.1

Die Aufarbeitung der Filter für die Labor-untersuchungen erfolgte nach maximal24 h.

2.1.2 Laboruntersuchungen

Die Filter wurden in physiologischerKochsalzlösung (0,9 % NaCl versetztmit 0,01 % Tween 80) suspendiert (10 mlVolumen für die großen Filter (Ø 80 mm)und 5 ml Volumen für die kleinen Filter(Ø 37 mm)). Danach wurden die Ansätzefür ca. 15 Minuten bei 35 – 40 8C ge-schüttelt, darauf gevortext und dekadischeVerdünnungsreihen angelegt.

Jeweils 0,1 ml aus jeder Verdünnungsstufewurde auf Agarplatten (Ø 90 mm) in dreiParallelen ausplattiert.

Für Aktinomyceten wurde Glycerin-Arginin-Agar (abgekürzt: GA-Agar) verwendet.Die Zusammensetzung ist nachfolgend be-schrieben.

Probenahmegerät Filter Volumen Probenahmedauer(Minuten)

Anzahl derEinzelproben

LuftkeimsammlerSartorius MD 8

Gelatinemembranfilter, [ 80 mm

1 m3 10 3

LuftkeimsammlerPGP

Gelatinemembranfilter, [ 37 mm

0,105 m3 30 2

LuftkeimsammlerPGP

Polycarbonatfilter,[ 37 mm

0,105 m3 30 2

Tabelle 1: Varianten der Probenahme im Kompostwerk Leonberg

Teil 2 Ringversuch

88

1) Bei der Gruppe Gießen wurden Kühlelemente in der Rottehalle temperiert und anschließend mit den Proben in einer Kühltasche transportiert.

Glycerin 12,5 g/l

L-Arginin 1,0 g/l

KH2PO4 0,3 g/l

K2HPO4 0,7 g/l

MgSO4 × 7 H2O 0,5 g/l

NaCl 1,0 g/l

Spurenelemente 1,0 ml

Agar 12 g/l


Spurenelement-Lösung: Die Substanzenwerden getrennt in Wasser gelöst und zurEDTA-Lösung gegeben. Danach wird derpH-Wert auf etwa 4 eingestellt und dieLösung mit Wasser auf 1000 ml aufgefüllt.

EDTA 500 mg/l








H3BO3 2 mg/l

Die Agarplatten enthielten Cykloheximidund Nystatin jeweils mit einer Endkonzen-tration von 50 mg/ml.

Die Bebrütung erfolgte bei 50 8C zur Er-fassung der thermophilen Aktinomyceten,die bei der Bewertung der Arbeitsplatzat-mosphäre aufgrund der Art der Arbeits-plätze die bedeutendste Aktinomyceten-Gruppe darstellen. Zusätzlich wurden par-allel GA-Platten bei 30 8C bebrütet, um diemesophilen Aktinomyceten zu erfassen. DieBebrütungsdauer betrug 14 Tage.

Um eine bessere Bewertung der Ergeb-nisse zu ermöglichen, wurde aus den glei-chen Proben heraus weiterhin die Schimmel-pilz-Konzentration ermittelt. Hierbei wurdedas eingeführte Verfahren nach TRBA 4301

in der Fassung vom Oktober 1997 verwen-det (Bebrütungsdauer: 7 Tage).

Als Nährmedium kam dabei gemäß TRBA430 Dichloran-Glycerin-(DG 18)-Agar zumEinsatz. Die Zusammensetzung ist:

Pepton 5,0 g/l

Glucose 10,0 g/l

KH2PO4 1,0 g/l

MgSO4 0,5 g/l

Dichloran 0,002 g/l

Chloramphenicol 0,1 g/l

Glycerin 18 %

Agar 15,0 g/l

pH-Wert 5,6 ± 0,2

89

1) TRBA = Technische Regeln für Biologische Arbeitsstoffe.

Die Platten wurden wie oben beschriebenin drei Parallelen beschickt und für eineWoche bei 25 8C bebrütet. Die Inkubationder inokulierten Platten erfolgte zum Schutzgegen Austrocknung stapelweise in ver-schlossenen Kunststoffbeuteln. Eine Gruppesetzte zusätzlich noch oberhalb und unter-halb jedes Plattenstapels eine Petrischalemit feuchter Watte ein.

Alle Platten wurden nach Abschluß der Inku-bationszeit ausgewertet in Anlehnung andie Vorgaben der TRBA 430. Die Ergeb-nisse wurden unter Berücksichtigung derVerdünnungsstufe und des Probenahmevolu-mens auf ein Luftvolumen von einem Kubik-meter umgerechnet.

2.2 Teil 2:Zusätzliche Laboraufarbeitungeiner geteilten Probe

Im Kompostwerk Leonberg wurden durchdie Universität Hohenheim vier Proben mitdem Sartorius MD 8 auf Gelatinefiltern ge-nommen. Die vier Gelatinefilter wurden zu-sammen in 40 ml physiologischer Kochsalz-lösung suspendiert und bis zum Erreichender Homogenität geschüttelt.

Anschließend wurden Aliquote von ca.5 ml in sterile Gefäße gegeben und per

Post an die einzelnen Versuchsteilnehmerverschickt. Aus einem Aliquot wurde sofortnach Herstellung der Suspension eine Keim-zahlbestimmung durchgeführt.

Die Proben trafen am folgenden Tage inden beteiligten Labors ein. Die weitere Auf-arbeitung (Erstellung der Verdünnungs-reihen, Plattieren) wurde in allen beteiligtenLabors zur gleichen Zeit begonnen.

Es wurden dekadische Verdünnungsreihenwie oben beschrieben hergestellt. Medienund Inkubationsbedingungen sind in zusam-mengefaßt. Der im Teil 1 nicht verwendeteDIFCO-Agar ist ein kommerziell erhältlichesMedium zur Isolierung von Aktinomyceten.Es handelt sich dabei um ein Medium, dasvom Hersteller unter der Artikelnummer0957−17 vertrieben wird und folgendeKomponenten enthält:

Natrium-Caseinat, 2 g/l

Asparagin 0,1 g/l

Natrium-Propionat 4 g/l

Di-Kalium-Phosphat 0,5 g/l

Magnesium-Sulfat 0,1 g/l

Eisen (III)-Sulfat 0,001 g/l

Agar 15 g/l

Teil 2 Ringversuch

90

3 Ergebnisse

3.1 Teil 1:Probenahme mit anschließenderLaborauswertung

Die Ergebnisse dieses Versuchs sind in Ta-belle 3 und in Tabelle 4 zusammengestellt.

In Tabelle 5 und Tabelle 6 sind die für eineBewertung der Schwankung der Meßwertewichtigen Parameter zusammengefaßt.

3.2 Teil 2:Zusätzliche Laboraufbereitung einer geteilten Probe

Die Ergebnisse lassen sich Tabelle 7 ent-nehmen.

Tabelle 8 zeigt die für eine Bewertung derVariation der Meßwerte wichtigen Para-meter.

Nr. Medium Inkubationstemperatur Inkubationsdauer Parameter

1 GA 50 8C 14 Tage thermophileAktinomyceten

2 GA 55 8C 14 Tage thermophileAktinomyceten

3 DIFCO 50 8C 14 Tage thermophileAktinomyceten

4 DIFCO 55 8C 14 Tage thermophileAktinomyceten

5 GA 30 8C 14 Tage mesophileAktinomyceten

6 DG 18 25 8C 7 Tage mesophileSchimmelpilze

Tabelle 2: Medien und Inkubationsbedingungen bei der Laboruntersuchung einer gesplitteten Probe

91

Eschborn Essen St. Augustin Hannover Gießen Hohenheim

Nr.Gerät/Filter Parameter KBE/m3 KBE/m3 KBE/m3 KBE/m3 KBE/m3 KBE/m3

1 MD8,Gelatine

Aktinomy-ceten 308

1,3×105 4,5×105 4,9×105 4,6×105 3,9×105 4,6×104

2 MD8,Gelatine

Aktinomy-ceten 308

2,7×105 4,5×105 1,3×106 6,7×105 5,8×105 1,3×105

3 MD8,Gelatine

Aktinomy-ceten 308

3,1×105 2,9×105 1,4×106 4,7×105 6,0×105 7,6×104

4 PGP, Poly-carbonat

Aktinomy-ceten 308

2,3×105 4,7×105 2,0×105 1,5×105 3,4×105 1,2×105


Aktinomy-ceten 308

6,5×104 5,7×105 1,6×105 8,7×104 3,6×105 2,2×105

6 PGP,Gelatine

Aktinomy-ceten 308

2,9×104 7,1×105 4,9×105 2,7×105 9,8×104 1,1×105

7 PGP,Gelatine

Aktinomy-ceten 308

3,8×104 3,2×105 3,9×105 2,0×105 1,3×105 8,9×104

1 MD8,Gelatine

Aktinomy-ceten 508

8,0×104 1,6×105 6,5×105 1,6×105 1,1×106 8,9×104

2 MD8,Gelatine

Aktinomy-ceten 508

1,7×105 3,0×105 1,5×106 1,1×105 2,7×106 1,7×105

3 MD8,Gelatine

Aktinomy-ceten 508

2,0×105 2,0×105 1,2×106 4,2×104 3,4×106 1,1×105


Aktinomy-ceten 508

2,2×105 4,4×105 5,6×105 4,8×104 1,4×106 1,6×105


Aktinomy-ceten 508

6,5×104 6,3×105 3,1×105 4,5×104 1,4×106 1,9×105

6 PGP,Gelatine

Aktinomy-ceten 508

3,5×104 4,4×105 8,4×105 1,3×104 3,8×105 1,0×105

7 PGP,Gelatine

Aktinomy-ceten 508

1,8×104 2,5×105 8,9×105 8×103 2,3×105 7,8×104

Tabelle 3: Erfassung der Konzentration an luftgetragenen Mikroorganismenbei Probenahme und Laboraufarbeitung durch verschiedene Gruppen: Aktinomyceten

Teil 2 Ringversuch

92

Eschborn Essen St. Augustin Hannover Gießen Hohenheim

Nr.Gerät/Filter Parameter KBE/m3 KBE/m3 KBE/m3 KBE/m3 KBE/m3 KBE/m3

1 MD8,Gelatine

Schimmel-pilze

2,8×104 8,6×104 1,5×105 3,0×105 2,1×105 4,5×104

2 MD8,Gelatine

Schimmel-pilze

8,5×104 4,0×105 5,4×105 5,4×105 5,1×105 2,1×105

3 MD8,Gelatine

Schimmel-pilze

5,1×104 3,6×105 6,0×105 6,8×105 5,7×105 1,0×105


Schimmel-pilze

1,4×105 8,9×105 3,7×105 2,3×105 2,0×105 4,0×105


Schimmel-pilze

1,4×104 3,8×105 1,8×105 6,0×104 1,5×105 5,7×105

6 PGP,Gelatine

Schimmel-pilze

9×103 6,7×105 3,5×105 4,1×105 1,4×105 5,1×105

7 PGP,Gelatine

Schimmel-pilze

9×103 1,3×105 3,4×105 3,0×105 3,5×104 9,5×104

Tabelle 4: Erfassung der Konzentration an luftgetragenen Mikroorganismenbei Probenahme und Laboraufarbeitung durch verschiedene Gruppen: Schimmelpilze

93

Maximum Minimum MedianMax./Min.

Mittel-wert

Standard-abweichung

Nr.Gerät/Filter

Para-meter KBE/m3 KBE/m3 KBE/m3 KBE/m3 KBE/m3

% desMittel-wertes

1 MD8,Gelatine

Aktinomy-ceten 308

4,9×105 4,6×104 4,2×105 10,7 3,3×105 1,9×105 58

2 MD8,Gelatine

Aktinomy-ceten 308

1,3×106 1,3×105 5,2×105 9,8 5,6×105 4,0×105 71

3 MD8,Gelatine

Aktinomy-ceten 308

1,4×106 7,6×104 3,9×105 18,4 5,3×105 4,6×105 88


Aktinomy-ceten 308

4,7×105 1,2×105 2,2×105 3,9 2,5×105 1,3×105 52


Aktinomy-ceten 308

5,7×105 6,5×104 1,9×105 8,7 2,4×105 1,9×105 78

6 PGP,Gelatine

Aktinomy-ceten 308

7,1×105 2,9×104 1,9×105 24,3 2,8×105 2,7×105 93

7 PGP,Gelatine

Aktinomy-ceten 308

3,9×105 3,8×104 1,6×105 10,2 1,9×105 1,4×105 71

1 MD8,Gelatine

Aktinomy-ceten 508

1,1×106 8,0×104 1,6×105 13,8 3,7×105 4,2×105 112

2 MD8,Gelatine

Aktinomy-ceten 508

2,7×106 1,1×105 2,3×105 25,7 8,2×105 1,1×106 129

3 MD8,Gelatine

Aktinomy-ceten 508

3,4×106 4,2×104 2,0×105 81,0 8,5×105 1,3×106 154


Aktinomy-ceten 508

1,4×106 4,8×104 3,3×105 29,2 4,7×105 4,9×105 104


Aktinomy-ceten 508

1,4×106 4,5×104 2,5×105 31,1 4,4×105 5,2×105 118

6 PGP,Gelatine

Aktinomy-ceten 508

8,4×105 1,3×104 2,4×105 64,2 3,0×105 3,2×105 106

7 PGP,Gelatine

Aktinomyceten 508

8,9×105 8×103 1,5×105 111,5 2,5×105 3,3×105 136

Tabelle 5: Maximum-, Minimum-, Median und Mittelwerte der einzelnen Meßwertefür die Erfassung luftgetragener Aktinomyceten gemäß Tabelle 3

Teil 2 Ringversuch

94

Maximum Minimum Median Max./Min.

Mittel-wert

Standard-abweichung

Nr.Gerät/Filter Parameter KBE/m3 KBE/m3 KBE/m3 KBE/m3 KBE/m3

% desMittel-wertes

1 MD8,Gelatine

Schimmel-pilze

3,0×105 2,8×104 1,6×105 10,8 1,4×105 1,1×105 77

2 MD8,Gelatine

Schimmel-pilze

5,4×105 8,5×104 4,5×105 6,4 3,8×105 1,9×105 51

3 MD8,Gelatine

Schimmel-pilze

6,8×105 5,1×104 4,7×105 13,3 3,9×105 2,7×105 68


Schimmel-pilze

8,9×105 1,4×105 3,0×105 6,4 3,7×105 2,7×105 74


Schimmel-pilze

5,7×105 14×104 1,7×105 40,7 2,3×105 2,1×105 93

6 PGP,Gelatine

Schimmel-pilze

6,7×105 9×103 3,8×105 74,1 3,5×105 2,4×105 69

7 PGP,Gelatine

Schimmel-pilze

3,4×105 9×103 1,1×105 38,1 1,5×105 1,4×105 91

Tabelle 6: Maximum-, Minimum-, Median und Mittelwerte der einzelnen Meßwertefür die Erfassung luftgetragener Schimmelpilze gemäß Tabelle 4

95

Hohenheim

Eschborn EssenSankt

Augustin GießenHohen-heim

Tag derProbe-nahme

Verände-rung

Nr.Nähr-boden

Tempe-ratur KBE/m3 KBE/m3 KBE/m3 KBE/m3 KBE/m3 KBE/m3 (%)

1 GA 30 8C 8,9×105 4,9×105 2,4×105 6,1×105 6,4×105 8,2×105 – 22

2 GA 50 8C 7,1×105 1,8×105 4,4×105 3,6×105 4,1×105 5,7×105 – 28

3 GA 55 8Ckein

Wachst. 1,0×105kein

Wachst. 5,8×104 5,6×104 1,7×104 + 229

4 DIFCO 50 8C 4,7×105 4,7×105 2,0×105 2,5×105 6,9×105 7,2×105 – 4

5 DIFCO 55 8C 5,1×104 2,0×105 1,4×104 4,7×104 5,4×104 8,6×104 – 37

6 DG 18 25 8C 4,8×105 3,0×105 1,6×105 2,9×105 3,8×105 3,9×105 – 3

Anmerkung:Die Probe wurde durch die Gruppe Hohenheim auf Membranfilter genommen. Direkt nach der Probenahmewurden die Filter suspendiert und eine Keimzahlbestimmung durchgeführt. Das Ergebnis ist in der 2. Spaltevon rechts dargestellt. Ein Aliquot der Probe wurde dann von der Uni Hohenheim per Post an die eigeneAdresse versandt, wo sie am folgenden Tage eintraf, ebenso wie die anderen Aliquote bei den übrigenLabors. Darauf wurde die auf dem Postweg erhaltene Probe in Hohenheim zeitlich parallel mit allen anderenArbeitsgruppen untersucht.

Die Spalte „Hohenheim Veränderung“ gibt die prozentuale Veränderung der Hohenheimer Werte zwischendem am Tag der Probenahme erhaltenen Wert und der Keimzahl, die einen Tag später nach Postversand inHohenheim ermittelt wurde, wieder.

Tabelle 7: Ergebnisse der Keimzahlbestimmung einer gesplitteten Luftkeimprobe in unterschiedlichen Labors

Teil 2 Ringversuch

96

Maximum Minimum Median Max./Min.

Mittel-wert

Standard-abweichung

Nr.Nähr-boden

Tempe-ratur KBE/m3 KBE/m3 KBE/m3 KBE/m3 KBE/m3

% desMittel-wertes

1 GA 30 8C 8,9×105 2,4×105 6,1×105 3,7 5,7×105 2,4×105 41

2 GA 50 8C 7,1×105 1,8×105 4,1×105 3,9 4,2×105 1,9×105 45

3 GA 55 8C 1,0×105 0 5,6×104 ` 4,4×104 4,4×104 100

4 DIFCO 50 8C 6,9×105 2,0×105 4,7×105 3,5 4,2×105 2,0×105 47

5 DIFCO 55 8C 2,0×105 1,4×104 5,1×104 14,3 7,3×104 7,3×104 100

6 DG 18 25 8C 4,8×105 1,6×105 3,0×105 3,0 3,2×105 1,2×105 37

Tabelle 8: Maximum-, Minimum-, Median und Mittelwerte der einzelnen Meßwertebei der Keimzahlbestimmung einer gesplitteten Luftkeimprobe gemäß Tabelle 7

97

4 Diskussion

4.1 Teil 1: Probenahme mitanschließender Laborauswertung

Der durchgeführte Versuch erfolgte unterpraxisnahen Bedingungen, d.h. jeder Ver-suchsteilnehmer stellte die Medien selbsther und führte die Beprobung mit den eige-nen Meßgeräten und Ausrüstungsgegen-ständen selbst durch, wobei die Probe-nahme der Einzelproben für alle Gruppenexakt zeitgleich erfolgte. Während dieLaboraufarbeitung bei Teil 1 nicht synchro-nisiert erfolgte, wurde dieser Vorgang inTeil 2 (Aufarbeitung einer gesplittetenProbe) genau zeitgleich durchgeführt.

Es wurde hier bewußt darauf verzichtet,in Analogie zum publizierten Ringversuchüber Schimmelpilzmessungen (Averdiek etal., 1997) sämtliche erforderlichen Mate-rialien (Probenahmesysteme, Filter, Nähr-medien, Verdünnungslösungen) aus einerHand zur Verfügung zu stellen. Es sollte aufdiese Weise die Streuung der Meßergeb-nisse ermittelt werden, die bei Praxis-messungen durch unterschiedliche Meßinsti-tute zu erwarten ist.

Die Erfassung von Schimmelpilzen wurdeparallel durchgeführt, um eine Vergleichbar-keit der hier gewonnenen Aussagen mitdem publizierten Ringversuch „Schimmel-pilze“ zu ermöglichen. In jenem Versuchwurden für die Meßwerte von Schimmel-pilzen auf DG18-Agar ein Verhältnis Maxi-

mum/Minimum von weniger als 4 ermittelt.Die Standardabweichung lag dort um40 % oder niedriger bezogen auf denMittelwert.Im Vergleich dazu streuen die hier fürSchimmelpilze gewonnenen Meßergeb-nisse deutlich stärker (vgl. Tabelle 6). In4 Fällen (Zeile 1 – 4) lag das VerhältnisMaximum/Minimum in einer Größenord-nung von 10, in den drei übrigen Fällensogar deutlich höher. Dies war unabhän-gig davon, ob Gelatine- oder Polycarbonat-filter zum Einsatz kamen.Für Aktinomyceten bei einer Bebrütungstem-peratur von 30 8C wurde in einem Einzel-fall (vgl. Tabelle 5) ein Maximum/Minimum-Verhältnis von 3,9 erzielt. In 4 weiterenFällen lag der Maximalwert um das Zehn-fache über dem Minimalwert. In den letz-ten zwei Fällen war aber ein Verhältnis ineiner Größenordnung von 20 zu verzeich-nen. Die Standardabweichung aller Resul-tate lag für Aktinomyceten und eine Bebrü-tungstemperatur von 30 8C zwischen 52und 93 % des jeweiligen Mittelwertes.Somit war in diesem Versuch die Streuungder Daten für Aktinomyceten bei einer Be-brütungstemperatur von 30 8C tendenzielleher noch günstiger als die Streuung derunter den gleichen Bedingungen erhal-tenen Werte für Schimmelpilze, die nachder etablierten Methode (TRBA 430) er-mittelt wurden.Für thermophile Aktinomyceten (Tabelle 5,Bebrütungstemperatur 50 8C) wurde im

Teil 2 Ringversuch

98

ersten Teil des Ringversuchs eine höhereStreuung der Meßergebnisse verzeichnet.Das Verhältnis Maximum/Minimum lag ineinem Falle in einer Größenordnung von10 (genau 13,8), in drei weiteren Fällenin einer Größenordnung von 30 und inden letzten drei Fällen über 60 (Spitzen-wert über 111). Entsprechend wurde hierauch eine Standardabweichung verzeich-net, die stets größer war als der zugehö-rige Mittelwert.

Somit kann zusammenfassend für den er-sten Versuchsteil festgestellt werden, daßdie Streuung der Meßergebnisse in demhier durchgeführten Ringversuch sowohl fürSchimmelpilze als auch für Aktinomycetenhöher war als im publizierten Ringversuch„Schimmelpilze“ (Averdiek et al., 1997).

Es stellt sich die Frage nach den Ursachen.Diese können einerseits im Bereich derProbenahme und andererseits im Bereichder Laboraufarbeitung liegen.

Probenahme:

l Die Verteilung der Mikroorganismenin der Luft ist wahrscheinlich nichthomogen, so daß auftretende Schwan-kungen in den Meßergebnissen z.T. aufdie real existierenden Konzentrations-schwankungen zurückzuführen sind.

l Die Meßgeräte waren nicht speziell kali-briert worden. Im Gegensatz zum PGP-System ist beim Sartorius MD8 keineKontrolle des Volumenstroms über einen

Durchflußmesser möglich. Ein Teil-nehmer berichtete auch von deutlichenAbweichungen vom nominalen Volu-menstrom bei seinem MD8-System.Diese Beobachtungen waren jedochzu einem weiter zurückliegenden Zeit-punkt gemacht worden. Aus den hiererhaltenen Ergebnissen läßt sich jedochkeine höhere Streuung der Daten fürdas MD 8 im Vergleich zum PGP-System ersehen.

l Die Zeit zwischen Probenahme undAufarbeitung war nicht standardisiert.Da der Transport aber trocken und beiUmgebungstemperatur (vgl. 2.1.1) er-folgte, sind für Sporen keine deutlichenKonzentrationsabnahmen zu erwarten.Dies wird auch in der Literatur für Schim-melpilze berichtet sowie für thermophileBakterien (Thorne et al., 1994). Eswurde im Rahmen der Arbeiten nichtweiter untersucht, ob und zu welchemAnteil auch Hyphenfragmente in derLuft enthalten waren, die eine geringereAustrocknungstoleranz haben dürftenund für die damit eine Konzentrations-abnahme eher zu erwarten wäre.

Laboraufarbeitung:

l Der Glycerin-Argin-Agar ist aus ver-gleichsweise zahlreichen Komponentenzusammengesetzt, so daß hier bei derHerstellung möglicherweise Fehler vor-kommen können, die zu unterschied-lichen Eigenschaften des Nährbodens

99

der verschiedenen Labors geführthaben könnten.

l In Art und Geschwindigkeit der Auf-arbeitung wie auch den Inkubations-bedingungen (Temperaturschwan-kungen der Brutschränke, relative Luft-feuchte bei der Bebrütung) kann esUnterschiede zwischen den einzelnenLabors geben, die sich in Ergebnis-schwankungen ausdrücken. Vergleichs-weise hohe Konzentrationen wurdenvon der Gruppe Gießen festgestellt,die neben einer relativ schnellen Auf-arbeitung nach Probenahme (ca. 5 h)auch versuchte, durch die Inkubationvon Petrischalen mit feuchter Watte inden verschlossenen Kunststoffbeutelneine besonders hohe Luftfeuchte zu er-zielen.

l Die beteiligten Versuchsteilnehmer be-sitzen Erfahrungen in der Erfassung vonArbeitsplatzkonzentrationen für bio-logische Agenzien, sind jedoch keineausgewiesenen Spezialisten auf demGebiet der Aktinomyceten. Daher könn-ten die Schwankungen der Meßergeb-nisse auch in einer unterschiedlichenInterpretation der kultivierten Platten be-gründet sein. Die gewählten Kultivie-rungsbedingungen für thermophile Akti-nomyceten gewährleisten jedoch einweitgehend ausschließliches Wachstumdieser Keimgruppe (Kutzner, mdl. Mit-teilung).

4.2 Teil 2:Zusätzliche Laboraufarbeitungeiner gesplitteten Probe

Bei der Abschlußbesprechung des 1. Ver-suchsteils wurde vereinbart, einen weiterenVersuch durchzuführen. Es sollte ermitteltwerden, ob die gefundene Streuung derResultate im Bereich der Probenahme oderder Laboraufarbeitung zu suchen ist.

Daher wurden Gelatinefilter einer Luftprobegemeinsam suspendiert, in verschiedeneAliquote geteilt und dann nach Postversandgetrennt durch unterschiedliche Labors auf-gearbeitet und ausgewertet. Die Ergeb-nisse sind in Tabelle 7 dargestellt, dieDaten in Tabelle 8 hinsichtlich ihrer Streu-ung analysiert.

Die Daten zeigen sowohl für Schimmel-pilze wie auch für Aktinomyceten bei denBebrütungstemperaturen 30 8C und 50 8Cein Verhältnis Maximum/Minimum zwi-schen 3 und 4. Diese Streuung wurdeauch im ersten Ringversuch für die Bestim-mung von Schimmelpilzen ermittelt (Aver-diek et al., 1997).

Für die hier noch zusätzlich gewählte Inku-bationstemperatur von 55 8C wurde abereine sehr hohe Streuung verzeichnet. Sokonnte auf GA-Agar in zwei Fällen hier garkein Wachstum festgestellt werden. Offen-sichtlich ist diese Temperatur für die in derLuftprobe enthaltenen Aktinomyceten ander oberen Grenze ihrer Wachstumsfähig-keit. Damit können auch geringfügige

Teil 2 Ringversuch

100

Schwankungen der Temperaturen, wie siein Brutschränken auftreten können, deut-liche Auswirkungen haben (die Schwan-kungsbreite der Temperatur in den Brut-schränken wurde hier nicht aufgezeichnet).

Auffällig ist auch, daß fehlendes Wachs-tum beim GA-Agar verzeichnet wurde, wäh-rend beim komplexen DIFCO-Agar ledig-lich große Schwankungen zu verzeichnenwaren. Der nährstoffreichere Nährbodenfördert offensichtlich die Überlebensfähig-keit in Grenzbereichen.

Beim Vergleich beider Nährböden bei derBebrütungstemperatur 50 8C wurde jedochkein signifikanter Unterschied in den Ergeb-nissen festgestellt. Beide Nährböden er-geben vergleichbare Keimzahlen und ver-gleichbare Schwankungsbreiten der Daten.

Somit kann für die Laboraufarbeitung fest-gestellt werden, daß das hier durch-geführte Verfahren mit Glycerin-Arginin-Agar bei Durchführung in unterschiedlichenLabors vergleichbare Ergebnisse bringt.Diese haben eine ähnlich Qualität wie dieErgebnisse, die für das etablierte Verfahrenfür die Ermittlung der Konzentration an luft-getragenen Schimmelpilzen erhalten wur-den.

Der DIFCO-Aktinomyceten-Agar ist eineAlternative zum in der KAN-Studie (Teil 1dieser Broschüre) vorgestellten Glycerin-Arginin-Agar, die hinsichtlich der ermitteltenKonzentrationen für thermophile Aktinomy-ceten vergleichbar ist.

Als Bebrütungstemperatur sollte 50 8C ge-wählt werden.

5 Empfehlungen

Es wird empfohlen, das hier durchgeführteVerfahren zur Ermittlung der Konzentrationvon Aktinomyceten in der Arbeitsplatzatmo-sphäre an die zuständigen Gremien weiter-zuleiten. Dazu sollte eine detaillierte Verfah-rensanweisung ausformuliert werden.

Die für die Laborphase in der KAN-Studiegemachten Vorschläge sind grundsätzlichgeeignet, sollten ggf. noch ergänzt werdendurch die in diesem Ringversuch gewon-nen Erfahrungen (z.B. DIFCO-Medium alsalternatives Medium).

Hinsichtlich der Probenahme erscheinendie im Ringversuch festgestellten Schwan-kungen noch zu hoch und müssen durchgeeignete Maßnahmen verringert werden.Mögliche Verbesserungen lassen sich z.B.durch eine zeitnahe Kalibrierung der Samm-ler erreichen. Entsprechende Anweisungensollten noch formuliert werden, wobeidies durchaus im Verlauf des Diskussions-prozesses in den zuständigen Gremienerfolgen kann.

Nach mündlicher Auskunft vonProf. Schaal, Bonn, dem kultivierte Petri-schalen für eine qualitative Bewertung über-lassen wurden, befanden sich unter dengewachsenen Kolonien kaum medizinisch

101

wichtige thermophile Aktinomyceten. Obdies auf eine entsprechende Selektivitätdes Mediums oder auf eine entsprechendeZusammensetzung der beprobten Luft hin-deutet, kann nicht ausgesagt werden.

Der hier dokumentierte Ringversuch stellteine Methodenevaluation verschiedenerLabors dar, wobei lediglich ein Ort be-probt wurde, was bei generalisierendenAussagen berücksichtigt werden muß.

6 Literatur

Averdiek, B.; Deininger, C.; Engelhart, S.;Missel, T.; Philipp, W.; Riege, F. P.;Schicht, B.; Simon, R. (1997): Bestimmungder Konzentration biologischer Arbeits-stoffe in der Luft am Arbeitsplatz. ErsterRingversuch „Schimmelpilze“. Gefahr-stoffe – Reinhaltung der Luft, 57, 129 – 136

Thorne, P. S.; Lange, J. L.; Bloebaum, P.;Kullmann, G. (1994): Bioaerosol samplingin field studies: Can samples be expressmailed?. Am. Ind. Hyg. Assoc. J., 55,1072 – 1079

TRBA 430 (1997): Technische Regel fürBiologische Arbeitsstoffe: Verfahren zur Be-stimmung der Schimmelpilzkonzentration inder Luft am Arbeitsplatz, BArbBl. Nr. 10,S. 74 – 77

Teil 2 Ringversuch

102

Teil 3Vorschlag für eineMeßstrategiezur Erfassung luftgetragenerthermophiler Aktinomycetenin der ArbeitsplatzatmosphäreNachfolgend werden Empfehlungen für einMeßverfahren zur Erfassung von vermeh-rungsfähigen luftgetragenen thermophilenAktinomyceten gegeben. Die Erfassung er-folgt durch ein kulturelles Verfahren. DieKeimkonzentration wird angegeben in KBE(koloniebildende Einheiten) pro m3 Luft.

1 Probenahmeverfahren

1.1 Probenahmestellen

l Die Probenahme sollte in Atemhöhe derBeschäftigten erfolgen. Dazu ist vor Be-ginn der Probenahme eine Ermittlungder Verhältnisse vor Ort durchzuführen,um die Stellen zu definieren, an deneneine Exposition der Arbeitnehmer durchluftgetragene thermophile Aktinomyce-ten insbesondere über die Atemluft statt-finden kann.

1.2 Vorbereitung der Probenahme

l Die Situation am Arbeitsplatz sollte wiein der BIA-Verfahrensbeschreibung9411 beschrieben erhoben werden.Dies gilt insbesondere im Hinblick aufdie Frage, ob das Auftreten thermophi-ler Aktinomyceten in der Arbeitsplatzat-mosphäre des betreffenden Arbeits-platzes überhaupt zu erwarten ist.

l Der Luftdurchfluß der Keimsammler soll-te maximal vier Wochen vor der Bepro-bung kalibriert worden sein. Bevorzugtsollten solche Keimsammler verwendetwerden, die mit einem Durchflußmesserausgestattet sind und so eine Kontrolledes Luftflusses während der Probe-nahme ermöglichen. Derartige Durch-flußmesser sollten entsprechend kali-briert sein (vgl. Teil 2, Kap. 5).

1.3 Probenahme

l Die Probenahme sollte mit dem Mem-branfilterverfahren erfolgen, wobeigenerell sowohl Polycarbonat- als auchGelatinefilter eingesetzt werden können.

l Für eine orientierende Messung solltenmindestens drei Proben an einer Probe-nahmestelle gezogen werden.

l Für Schichtmessungen gelten die in derBIA-Verfahrensbeschreibung 9411bzw. in der TRBA 405 gemachten Vor-gaben.

l Es wird eine Probenahmezeit von min-destens 10 Minuten empfohlen. EineProbenahmezeit von einer Stunde solltenicht überschritten werden.

l Als Referenz sollte eine Probenahme inder Umgebung der Anlage (luv) durch-geführt werden, wobei auch dieseProbenahme jeweils mindestens dreiEinzelproben pro Probenahmestelleumfassen sollte.

Teil 3Vorschlag für eine Meßstrategiezur Erfassung luftgetragener thermophiler Aktinomycetenin der Arbeitsplatzatmosphäre

103

2 Transport1

l Die Proben können trocken bei Um-gebungstemperatur (maximal 25 8C)transportiert werden.

l Während des Transports sollen dieFilter in entsprechenden Behältnissenvor Sonnenlicht, übermäßiger Feuchtig-keit oder Trockenheit, Staub und ins-besondere dem Zutritt von Keimengeschützt werden.

l Die Transportzeit sollte in der Regel24 Stunden nicht überschreiten.

3 Laboraufarbeitung

l Die Membranfilter sollten in einem an-gemessenen Volumen physiologischerKochsalzlösung (0,9 % NaCl versetztmit 0,01 % Tween 80) suspendiert wer-den (z.B. 10 ml für 85 mm Gelatine-filter, bei 37 mm Gelatinefilter 5 ml).

l Die Filter sollen in der Stammlösung 15bis maximal 30 Minuten bei einer Tem-peratur von 35 – 40 8C geschüttelt wer-den.

l Es ist ggf. eine dekadische Ver-dünnungsreihe in physiologischerKochsalzlösung mit 0,01 %TWEEN 80 anzusetzen.

l Von jeder Verdünnungsstufe solltenmindestens zwei gleiche Aliquote aufeinen entsprechenden Nährboden aus-gespatelt werden. Sofern notwendig,müssen die Platten vorgetrocknet wer-den.

l Als Medien lassen sich mit Glycerin-Arginin-Agar (mit jeweils 50 mg/mlCykloheximid und Nystatin2) und mitAktinomyceten-Agar (Difco, angesetztnach Herstellervorschrift) vergleichbareErgebnisse erzielen. Diese werdendaher zunächst vorgeschlagen.3)

l Für thermophile Aktinomyceten wirdeine Bebrütungstemperatur von 50 8Cvorgeschlagen bei einer Bebrütungszeitvon maximal 14 Tagen.

l Wegen der langen Bebrütungsdauermuß das Austrocknen verhindert wer-den. Dazu sollte pro Petrischale 40 mlAgar verwendet werden, sofern nichtsichergestellt ist, daß ein Austrocknender inokulierten Nährböden auf andere


104

1) Der genaue Einfluß der Temperatur und anderer Transportbedingungen sollte noch systematisch untersuchtwerden.

2) Eine konzentrierte Stammlösung von Nystatin läßt sich in DMSO herstellen.3) Diese Medien ergaben mit Praxisproben bei unterschiedlichen Labors vergleichbare Werte. Es wurde bislang

nicht das Kulturverhalten verschiedener Aktinomyceten-Typstämme geprüft. Möglicherweise könnten hierkomplexe Medien noch bessere Ergebnisse bringen. Bei der Verwendung derartiger Medien müßte dieVergleichbarkeit von Meßergebnissen unterschiedlicher Labors durch Ringversuche hinreichend belegt werden.

Weise für die Dauer der Bebrütung zu-verlässig verhindert wird. Stapel voninokulierten Platten sollten in Kunststoff-beuteln inkubiert werden. Es ist empfeh-lenswert, auf der Ober- und Unterseiteder in den Beuteln befindlichen Platten-stapel leere Petrischalen mit feuchterWatte einzuschließen.

4 Auswertung

l Eine Zwischenablesung sollte nacheiner Woche erfolgen, die Endaus-wertung nach 14 Tagen.

l Für die Auswertung sind die gleichenKriterien wie für Schimmelpilze an-zulegen (vgl. TRBA 430, BIA-Verfahrens-beschreibung 9420).

l Es wird empfohlen, Einzelkolonienvon Kultivaren, deren Anteil an derGesamtzahl der erfaßten Aktinomyce-ten (bewertet anhand ihrer Kolonie-morphologie) höher als 10 % liegt, zuisolieren, damit sie für eine evtl. not-wendige genaue systematische Zuord-nung (z.B. über Fingerprints) zugäng-lich bleiben.

5 Medien

5.1 Glycerin-Arginin-Agar

Die Zusammensetzung ist nachfolgendbeschrieben.

Glycerin 12,5 g/l

L-Arginin 1,0 g/l

KH2PO4 0,3 g/l

K2HPO4 0,7 g/l

MgSO4 × 7 H2O 0,5 g/l

NaCl 1,0 g/l

Spurenelemente 1,0 ml

Agar 12 g/l


Spurenelement-Lösung: Die Substanzenwerden getrennt in Wasser gelöst und zurEDTA-Lösung gegeben. Danach wird derpH-Wert auf etwa 4 eingestellt und dieLösung mit Wasser auf 1000 ml aufgefüllt.

EDTA 500 mg/l








H3BO3 2 mg/l

105

Nach dem Autoklavieren werden Nystatinund Cykloheximid in einer Endkonzen-tration von 50 mg/ml zugegeben.

5.2 Aktinomyceten-Agar (DIFCO)

Hierbei handelt es sich um ein kommerziellerhältliches Medium, das über den Fach-handel zu beziehen ist und nach Hersteller-angaben angesetzt wird.

6 Literatur

BIA-Arbeitsmappe Messung von Gefahr-stoffen, Loseblattsammlung, Hg.: Berufs-genossenschaftliches Institut fürArbeitssicherheit (BIA), Erich SchmidtVerlag, Bielefeld– Verfahrensbeschreibung 9411: Anwen-dung von Meßverfahren für luftgetragenebiologische Arbeitsstoffe– Verfahrensbeschreibung 9420: Ver-fahren zur Bestimmung der Schimmelpilz-konzentration in der Luft am Arbeitsplatz

TRBA 405 (1997): Technische Regel fürBiologische Arbeitsstoffe: Anwendung vonMeßverfahren für luftgetragene biologischeArbeitsstoffe, BArbBl., Nr. 1, S. 47 – 50

TRBA 430 (1997): Technische Regel fürBiologische Arbeitsstoffe: Verfahren zur Be-stimmung der Schimmelpilzkonzentration inder Luft am Arbeitsplatz, BArbBl., Nr. 10,S. 74 – 77


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