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Mitteilung

Korrespondierender Autor: Dr. Markus Wehrlwfk – Cleaning Technology Institute e.V.Campus Fichtenhain 1147807 Krefeld

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Interessenkonflikt: Die Autoren erklären, dass keine Interessenskonflikte bestehen. Mitglieder der AG RMT stellten Testpro-dukte und Informationen diskriminierungsfrei zur Verfügung.

Zitierweise: Wehrl M., Rosenberg U., Brill F.H.H. et al. Prüfmetho-de für die vergleichende Bewertung von Instrumen-tenreinigern zur manuellen Aufbereitung von chirur-gischen Instrumenten auf der Basis von Fibrin. Zentr Steril 2018; 26: 366–381.

Manuskriptdaten: Eingereicht: 10. November 2018 Überarbeitete Version angenommen: 20. November 2018

Zentralsterilization | Volume 26 | 6/2018

HAUPTARBEITEN | Prüfmethode für die vergleichende Bewertung von Instrumentenreinigern zur manuellen Aufbereitung

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FL: Aufzählung

Formatierung FL-Absatz:

Charter Roman9 PTOptisch12 ZA0 SpationierungEnglischBlocksatz

Schlüsselwörter chirurgische Instrumente Aufbereitung Fibrin Reinigung Instrumentenreiniger

Prüfmethode für die vergleichende Bewertung von Instrumentenreini-gern zur manuellen Aufbereitung von chirurgischen Instrumenten auf der Basis von FibrinM. Wehrl1, U. Rosenberg2, F.H.H. Brill3, H. Gabriel3, A. Kampe3, W. Michels4, K. Roth5, L. Schnieder5, P. Frey5, J. Köhnlein6, O. Riebe6, A. Hartung7, R. Bloß8, G. Kirmse9, M.-T. Linner10, D. Martini11, M. Tschoerner12, U. Weber13,

S. Krüger14, H. Martiny15, J. Gebel16, 17

1 wfk – Cleaning Technology Institute e.V., Krefeld; 2 Borer Chemie AG, Zuchwil; 3 Dr. Brill + Partner GmbH Institut für Hygiene und Mikrobiologie, Hamburg; 4 Prüflabor DWM, Warburg5 SMP GmbH, Tübingen; 6 HygCen Germany GmbH, Schwerin; 7 Schülke & Mayr GmbH, Frankfurt a. M.; 8 Bode Chemie GmbH, Hamburg; 9 Aesculap AG, Tuttlingen; 10 Hygiene Lin-ner, München; 11 Borer Chemie Deutschland GmbH, Lörrach; 12 Chemische Fabrik Dr. Weigert GmbH & Co. KG, Hamburg; 13 Miele & Cie. KG, Gütersloh; 14 Hygiene Consulting Grünendeich, Grünendeich; 15 TechnischeHygiene, Berlin; 16 Institut für Hygiene und Öffentliche Gesund-heit, Universitätsklinikum Bonn AöR, Bonn; 17 Verbund für Angewandte Hygiene (VAH)

ZusammenfassungGegenwärtig existieren weder in Deutschland noch international allge-mein akzeptierte Methoden zur Über-prüfung der Wirksamkeit von Reinigern für die Aufbereitung von Instrumenten. Die Anforderungen, die an eine adäqua-te Prüfmethode gestellt werden,,sind: i) Auswahl einer schwierig zu entfer-

nenden praxisrelevanten Testan-schmutzung,

ii) Definierte Aufbringung der Test- anschmutzung auf eine relevante Oberfläche,

iii) Quantitative Elution von Restan-schmutzungen sowie

iv) Festlegung eines repräsentativen Analyten (Leitsubstanz) und ad-äquater Methoden zur Quantifizie-rung des Analyten.

Die 2011 gegründete Arbeitsgruppe Reinigungsmitteltestung (AG RMT) der Deutschen Gesellschaft für Kranken-haushygiene e.V. (DGKH) erarbeitete und etablierte eine neue Prüfmethode zur vergleichenden Bewertung von Rei-nigern für die Instrumentenaufberei-tung.

Im Folgenden wird eine auf einem Fibrinprüfkörper (F-PCD) basierende Methode vorgestellt, die es erlaubt, an-hand der hochmolekularen und wasser- unlöslichen Testanschmutzung Fibrin die Wirksamkeit verschiedener Reini-ger in einem Tauchmodell (keine Me-chanik) vergleichend zu untersuchen

und verschiedene Instrumentenreini-ger hinsichtlich ihrer Wirksamkeit zu unterscheiden. Die Besonderheit der Methode beruht auf dem Einsatz von wasserunlöslichem Fibrin als praxis-relevanter Testanschmutzung. Fibrin gilt als kritische, am schwierigsten zu entfernende Proteinanschmutzungs-komponente chirurgischer Instrumente und konnte bislang mittels etablierter Elutions- und Proteinquantifizierungs-methoden nicht erfasst und bewertet werden. Durch die Entwicklung einer

neuen Elutionsmethode kann die was-serunlösliche Fibrinanschmutzung der Prüfkörper in eine solubilisierte Form überführt und mittels etablierter Pro-teinquantifizierungsmethoden (OPA-,BCA-Methode) erfasst werden. Durch mehrere Ringversuche mit bis zu sechs beteiligten Laboren wurde die Reprodu-zierbarkeit und Vergleichbarkeit der Er-gebnisse der neu entwickelten Methode überprüft und bestätigt. Die Arbeiten der AG RMT führten sowohl zur Ent-wicklung einer neuen Prüfmethode als auch zu einem umfangreich erweiter-ten Verständnis der vollumfänglichen

Arbeitsgruppe Reinigungs-mitteltestung – AG RMT der Deutschen Gesellschaft für Kranken-haushygiene, DGKH e.V.

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einer schnellen und vollständigen Benetzung aller Instrumentenober-flächenundermöglichteinEindrin-gen der Reinigerflotte in schmaleSpalten.

Eine Solubilisierung von Proteinen wird durch alkalisch eingestellte pH-Werte unterstützt und beschleu-nigt.

Der amphiphile Charakter enthalte-ner Tenside ermöglicht die Disper-sion hydrophober Anschmutzungen durch Inklusion in Micellen.

Die Micellenbildung ermöglicht ein hohes Schmutztragevermögen der Reinigerflotte und verhindert eineRedeposition von Anschmutzungen aufOberflächen.

Weitere primär wirksame Inhalts-stoffe von Reinigern können z.B. En-zyme sein, die durch ihre hydroly-tische Aktivität eine Degradation hochmolekularer Anschmutzungs-substanzen hin zu niedermolekula-ren und daher besser wasserlösli-chen Produkten bewirken können.

Instrumentenreiniger sind Medizinpro-dukte der Klasse I entsprechend 93/42/EWG [11], bzw. 2007/47/EG [12]. An-ders als bei der Zulassung von Desin-fektionsmitteln (MP, Klasse IIb), für die gegenwärtig (Juli 2018) 30 EN-Normen zur Verfügung stehen und 23 prNor-men oder „work items“ bearbeitet wer-den, gibt es für Instrumentenreiniger gegenwärtig weder entsprechende nor-mative Prüfverfahren noch andere all-gemein akzeptierte Prüfmethoden zur Bewertung der Wirksamkeit. Im Kon-trast hierzu wird die Wirksamkeit von Instrumentenreinigern durch üblicher-weise nicht offengelegte Prüfungen des jeweiligen Herstellers im Rahmen des Zulassungsverfahrens belegt, sodass für den Anwender von Instrumenten-reinigern gegenwärtig keine objektiven Unterscheidungs-/Bewertungskriterien entsprechend publizierter Testmetho-den bei der Produktauswahl zur Verfü-gung stehen.

Die in ISO/TS 15883-5 [13] aufge-führten Prüfmodelle zur Bewertung der Reinigungswirksamkeit sind für die Prüfung von maschinellen Aufberei-tungsprozessen in Reinigungs-Desin-fektionsgeräten (RDG) vorgesehen. Bei der Auswahl von Prüfanschmutzungen wurden zahlreiche unterschiedliche Vorschläge veröffentlicht, jedoch konn-te bislang kein im Konsensus akzeptier-

Erfassung von Restproteingehalten auf aufbereiteten Medizinprodukten.

1. EinleitungDie Reinigung stellt bei der Aufberei-tung von Medizinprodukten (MP) den ersten und den Prozessschritt mit der grundlegendsten Bedeutung dar. Ziel des Reinigungsprozesses ist die mög-lichst vollständige Entfernung aller auf den MP vorliegenden Anschmutzungen, ungeachtet der chemischen Natur und der jeweiligen Anschmutzungsmenge. Unabhängig von der Art der Aufberei-tung – manuell oder maschinell, ggf. mit teilmaschineller Unterstützung – können nur bei der ausreichenden Ent-fernung von Anschmutzungen - ggf. als Kombination manueller Vorreinigung und maschineller Reinigung - die nach-folgenden Aufbereitungsschritte der Desinfektion und Sterilisation wirksam durchgeführt und die anforderungsge-rechte hygienische Qualität aufbereite-ter MP entsprechend MPG [1] und MP-BetreibV [2] sichergestellt werden. Zur Beurteilung der Reinigungswirkung wird üblicherweise der Proteingehalt als Leitparameter für Restanschmutzun-gen herangezogen [3, 4, 5, 6, 7]. Dies trifft auch für die Bestimmung der Rei-nigungseffektivität in Reinigungs-Des-infektionsgeräten zu. Andere Parameter, wie z.B. der Gehalt an Polysacchariden, Lipiden und Ölen, Kohlenhydraten, En-dotoxinen, Hämoglobin (bezogen auf die Pseudoperoxidaseaktivität), gesam-ter Kohlenstoffgehalt (TOC), gebunde-ner Stickstoffgehalt (TNB), Adenosin-triphosphat (ATP) [8] können Hinweise hinsichtlich der Rückstände spezieller Anschmutzungsarten liefern. Diese Pa-rameter werden jedoch bezüglich ihrer Aussagekraft zur umfassenden Beurtei-lung der Reinigungswirkung aufgrund der Relevanz der jeweiligen Anschmut-zungsart oder der einfachen Entfernbar-keit kritisch diskutiert [9].

Die Wirkung des Reinigungsprozes-ses basiert auf den vier klassischen Fak-toren: i) Chemie, ii) Zeit, iii) Tempe-ratur und iv) Mechanik, entsprechend dem Konzept des Sinner’schen Kreises [10]. Für den Faktor Chemie werden bei der Reinigung von MP spezielle, als Me-dizinprodukte zugelassene, Instrumen-tenreiniger eingesetzt. Die Instrumen-tenreiniger erfüllen bei der Reinigung verschiedene wichtige Funktionen: Eine Herabsetzung der Oberflä-

chenspannung des Wassers führt zu

ter Vorschlag erzielt werden. Dies spie-gelt sich in der großen Anzahl der An-hänge der ISO/TS 15883-5 wieder. Bei maschinellen Reinigungsprozessen lie-fern Mechanik und Temperatur einen großen Beitrag zum Reinigungsergeb-nis. Daher sind diese Prüfmodelle für die Bewertung des alleinigen Beitrags der Komponente „Reiniger“-Chemie ge-mäß des Sinner’schen Kreises nicht un-verändert anwendbar.

Um zukünftig eine objektive und transparente Beurteilung der Wirk-samkeit von Instrumentenreinigern zu ermöglichen, hat die Deutsche Gesell-schaft für Krankenhaushygiene e.V. (DGKH) im Jahr 2011 die Bildung einer Arbeitsgruppe mit dem Ziel beauftragt, geeignete Prüfmethoden zu entwickeln und zu etablieren, mit denen die Wirk-samkeit von Instrumentenreinigern quantitativ und mit guter Reproduzier-barkeit bestimmt werden kann.

Am 22. Juni 2011 fand die konsti-tuierende Sitzung der Arbeitsgruppe Reinigungsmitteltestung (AG RMT) un-ter Leitung von Dr. Jürgen Gebel statt und nahm unmittelbar die Arbeit auf. Es wurden folgende Zielsetzungen (Pri-märziele) formuliert:

Entwicklung einer Prüfmethode zur vergleichenden Beurteilung von In-strumentenreinigern für die manu-elle Aufbereitung. Die Reinigerlö-sung soll in Wasser standardisierter Härte (WSH) angesetzt werden, die Prozesstemperatur soll 25 °C betra-gen à typische Bedingungen bei der manuellen Aufbereitung.

Reinigertestung in einem Tauchver-fahren, aufbauend auf den Arbei-ten der ad hoc-Gruppe am DIN (NA-Med 063-04-09) – publiziert durch Köhnlein et al. 2008 [14] und 2009

[15] à reproduzierbarer einfacher Aufbau, keine Mechanik.

Prüfkörper auf der Basis von rostfreiem, austenitischem Stahl (1.4301)mitOberflächenstrukturie-rung durch Längsschliff, 80er Kör-nung à Bezug zu metallischem, chirurgischem Instrumentarium.

Prüfanschmutzung auf der Basis von koaguliertem Blut, Bezug zur Blutanschmutzung chirurgischer Realinstrumente à Blut mit hohen Anforderungen an Reinigungspro-zesse, insbesondere nach Eintrock-nung und/oder Denaturierung durch hohe Temperaturen und/



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FL: Aufzählung

oder Einwirkung chemischer Agen-zien.

AuftragungeinerflächendefiniertenPrüfanschmutzungsmenge à Erzie-lung einer möglichst hohen Repro-duzierbarkeit bei der Prüfkörper-herstellung. Standardmäßig wurde die von Brill et al. 2014 [16] be-schriebene Methode eingesetzt.

Die Prüfmethode muss die Wirk-samkeit von Instrumentenreinigern im Vergleich zu Wasser zeigen (Dis-kriminierungsfähigkeit der Metho-de) à WSH als Kontrolle.

Nach Etablierung einer Methode zur Erreichung der Primärziele soll die Me-thode angepasst werden, damit sie auch zur Beurteilung von Desinfektionsreini-gern für die manuelle Instrumenten-aufbereitung sowie von Reinigern für maschinelle Aufbereitungsprozesse ein-gesetzt werden kann.

Die AG RMT präsentiert mit die-ser Publikation die Ergebnisse der Ar-beitsgruppe, die in 18 Sitzungen und 10 Ringversuchen erzielt wurden. Teilneh-mende Labore bei den Ringversuchen waren (alphabetisch): Dr. Brill + Partner GmbH Insti-

tut für Hygiene und Mikrobiologie, Hamburg

HygCen GmbH, Schwerin Institut für Hygiene und Öffentliche

Gesundheit (IHPH), Universitätskli-nikum Bonn AöR, Bonn

Schülke & Mayr GmbH, Norderstedt SMP GmbH, Tübingen wfk – Cleaning Technology Institute

e.V., Krefeld

Die Reihenfolge der Aufzählung der La-bore entspricht nicht der Darstellung in den Abbildungen.

2. Material und Methoden

2.1 Lösungen und Geräte Schafblut heparinisiert mit 10 IE

Heparin / ml. Es wurden Schafblute der Fa. Acila GmbH verwendet. Es wurden Gebindegrößen von 10 ml eingesetzt.

Protaminhydrochlorid oder Pro-taminsulfat, zugegebene Menge 15 IE / ml Blut; das Produkt wurde vom Blutlieferanten oder aus örtli-chen Apotheken bezogen.

Gesättigte hygroskopische Salz-lösungen aus i) Kaliumcarbonat, K2CO3, ii) Natriumiodid, NaI, iii)

Natriumchlorid, NaCl, iv) Ammoni-umsulfat, (NH4)2SO4. Zur Herstel-lung wurden 1000 ml VE-Wasser auf 80 °C erwärmt und unter Rühren wurde so viel des jeweiligen Salzes zugegeben, bis unlösliche Rückstän-de am Boden verblieben. Durch Ab-kühlung auf Raumtemperatur (RT) nahm der präzipitierte Anteil zu.

VE-Wasser,Leitwert≤15µS HPLC-Wasser (z.B. Fa. Carl Roth,

ROTISOLV® HPLC gradient grade, Bestell-Nr.: A511.3)

WSH (Wasser standardisierter Här-te) mit einer Härte von 376 ppm, be-zogen auf CaCO3 [17]

Testreiniger 1 (TR-1): Alkalischer Reiniger zur manuellen Reini-gung von Medizinprodukten mit Alkalispendern, Komplexbildnern, Dispergiermitteln, Lösungsver-mittlern, oberflächenaktiven Stof-fen und Netzmitteln, pH = 11,7 bei 1 % Konzentration, 20 °C.

Testreiniger 2 (TR-2): Multienzy-matischer Reiniger für die manu-elle Reinigung von Medizinpro-dukten mit Proteasen, Lipasen und Amylasen, mit 5 – 15 % nichtioni-schen Tensiden, < 5 % anionischen Tensiden, Konservierungsmitteln, pH = 8,4 – 8,6 bei 0,1 – 3 % Kon-zentration, 20 °C.

Stahlplättchen: Stahlplättchen der Charge 1 hatten die Abmessung von 77 x 26 x 1 mm; Stahlplättchen der Charge 2 von 80 x 12 x 1 mm. Die Kanten waren mit einem Radius von 2 mm gerundet. Die Stahlplättchen bestanden aus Edelstahl 1.4301. Die anzuschmutzende Oberfläche wieseine mit 80er Körnung längs bear-beiteteOberflächengüteauf (Bezug z.B. von Fa. Gerätetechnik Briese-lang GmbH oder Fa. JÜLEX Edel-stähle / JÜLEX Maschinenbau Ing. Jürgen Lemke e.K. GmbH).

Auftrageschablone, angepasst nach [16]: Es wurden Auftrageschablo-nen aus gefrästem Polycarbonat bzw. durch 3D-Druck hergestellte Auftrageschablonen aus Nylon (z.B. von Fa. 3D Activation GmbH) mit den passenden Abmessungen zur Aufnahme von Stahlplättchen der Charge 1 und Charge 2 verwendet. Die Auftrageschablonen ermöglich-ten bei Stahlplättchen der Charge 1 die Anschmutzung einer Fläche von 3,0 cm2 und bei Stahlplättchen der Charge 2 von 6,0 cm2.

Decon 90, Decon Laboratories Lim-ited, Hove, East Sussex, UK

Isopropanol, 99,95 % (z.B. Fa. Carl Roth, Bestell-Nr.: AE73.2)

Plastikdosen, dicht schließend (z.B. Fa. Lock & Lock, Typ HPL 834, 3,9 l, 295 x 230 x 84 mm)

Exsikkator (z.B. Fa. Lab Compan-ion, Cubic Vacuum Desiccator, Mod-el VDC-11)

Bechergläser: 250 ml, niedrige Form, Höhe ca. 95 mm, Außen-durchmesser ca. 70 mm (z.B. Fa. Carl Roth, Bestell-Nr.: X691.1)

Klemmen zur Fixierung von Prüf-körpern, korrosionsfest (z.B. Fa. PutzKULT GmbH, Bestell-Nr.: 607122)

Rührfisch mit einer Länge von35 mm und einem Durchmesser von 6 mm (z.B. Fa. Carl Roth, Be-stell-Nr.: 1292)

Magnetrührer mit 350 U / min (la-borabhängig verschiedene Fabrikate)

Petrischalen, 92 mm Durchmesser (z.B. Sarstedt, Bestell-Nr.: 82.1473)

Glasperlen, 3 mm Durchmesser (z.B. Fa. A. Hartenstein, Bestell-Nr.: GP3)

Horizontalschüttler mit 300 U / min (laborabhängig verschiedene Fabri-kate)

Glasschraubröhrchen, Außendurch-messer 16 mm, Höhe 100 mm mit Schraubdeckel (z.B. Fa. A. Harten-stein, Bestell-Nr.: RG10)

Schraubröhrchen, 15 ml mit Schraubdeckel (z.B. Sarstedt, Be-stell-Nr.: 62.554.502)

BCA-Kit (z. B. ThermoFisher Scien-tific,PierceTM BCA Protein Assay Kit, Bestell-Nr.: 23225).

Chemikalien für die OPA-Methode, nach [18].

Acrylamid-Gele (z.B. Carl Roth Roti®-PAGE Gradient 4 – 20 %, Best.-Nr.: 2843.2)

Protein-Ladepuffer (z.B. Carl Roth Roti®-Load 1, Best.-Nr.: K929.1)

Protein-Größenstandard (z.B. Carl Roth Roti®-Mark PRESTAINED, Best.-Nr.: T852.1)

2.2 Methoden

2.2.1 Vorreinigung von Materialien

Zur gründlichen Reinigung der Stahl-plättchen wurden sichtbare Anschmut-zungen zunächst unter fließendemWasser, ggf. unter Einsatz einer wei-chen Bürste, entfernt. Danach wurden


etwa je 30 Stahlplättchen in ein Be-cherglas (500 ml), das mit 400 ml 5 % Decon 90-Lsg. gefüllt war, gegeben und für ca. 10 min aufgekocht. Die De-con 90-Lsg. wurde abgegossen und die Stahlplättchen unter fließendem Was-ser gespült, bis keine Schaumbildung mehr erkennbar war. Die Stahlplätt-chen wurden einzeln mit einer Pinzet-te durch 5maliges Eintauchen in 70 % Isopropanol gespült und luftgetrocknet. Die zur Elution eingesetzten Glaskugeln wurden auf gleiche Weise in Decon 90-Lsg. gereinigt, danach in ein Becherglas mit 250 ml Isopropanol überführt und für ca. 2 min unter Schwenken inku-biert, danach dekantiert, in einem Sieb aufgefangen und getrocknet.

2.2.2 Herstellung von Blut-Prüfkörpern

Für die Herstellung von Blut-Prüfkör-pern (B-PCD) wurden Stahlplättchen der Charge 1 verwendet. Die gerei-nigten Stahlplättchen wurden unter Verwendung der passenden Auftrage-schablone, die die Anschmutzung ei-ner Fläche von 3,0 cm2 erlaubte, mit jeweils 50 µl reaktiviertem Schafblutangeschmutzt. Eine detaillierte Be-schreibung zur flächendefinierten An-schmutzung ist in [16] zu finden. Füreinen Ansatz wurde 900 µl heparini-siertesSchafblutmit100µlHPLC-Was-ser und mit der entsprechenden Men-ge Protamin versetzt, durchmischt und unmittelbar die Anschmutzung von maximal 10 Stahlplättchen vorgenom-men. Restliches Blut wurde verworfen. Die angeschmutzten Stahlplättchen wurden zur konditionierten Trocknung unmittelbar in einen Exsikkator einge-bracht. Zur Erzielung unterschiedlicher definierter Luftfeuchten im Exsikkatorwurde mindestens 24 h vor Konditio-nierungsbeginn der angeschmutzten Stahlplättchen die am Boden des Ex-sikkators befindliche Schale mit etwa300 ml (vollständige Bedeckung der Schale) der jeweiligen gesättigten Salz-lösung eingebracht.

2.2.3 Herstellung von Fibrin-Prüfkörpern

Für die Herstellung von Fibrin-Prüf-körpern (F-PCD) wurden Stahlplätt-chen der Charge 2 verwendet. Die ge-reinigten Stahlplättchen wurden unter Verwendung der passenden Auftrage-schablone, die die Anschmutzung ei-ner Fläche von 6,0 cm2 erlaubte, mit je-weils 100 µl reaktiviertemunverdünn-ten Schafblut angeschmutzt [16]. Für

einen Ansatz wurde 1 ml heparinisier-tes Schafblut mit der entsprechenden Menge Protamin versetzt, durchmischt und unmittelbar die Anschmutzung von maximal 10 Stahlplättchen vorgenom-men. Restliches Blut wurde verworfen. Die angeschmutzten Stahlplättchen wurden unmittelbar in einen Exsikka-tor überführt, dessen Einlegeschale am Boden mit ca. 300 ml VE-Wasser ge-füllt war, sodass die Inkubation in ei-ner Atmosphäre mit 100 % rel. Feuch-te erfolgte. Es erfolgte eine Inkubation für 1 h, um die vollständige Koagulati-on des reaktivierten Schafbluts zu er-möglichen. Die Stahlplättchen mit der feuchten Blutanschmutzung wurden entnommen und das Hämoglobin der Blutanschmutzung durch eine „De-Hä-moglobinisierungs-Behandlung“ ent-fernt. Hierzu wurden jeweils 3 Stahl-plättchen in ein Becherglas so an der Wand anliegend eingestellt, dass die an-geschmutzte Seite zum Inneren des Be-cherglases wies. Das Becherglas wurde mit 250 ml VE-Wasser gefüllt und die-sesmittelsRührfischbei einerUmdre-hungsgeschwindigkeit von 350 U / min durchmischt. Die De-Hämoglobinisie-rung erfolgte bei 22 ± 2 °C. Es erfolg-te eine Inkubation für 10 min, danach wurde das VE-Wasser verworfen und frisches VE-Wasser eingefüllt. Es folgten weitere Waschschritte mit einer Inkuba-tionsdauer von 10 min und 15 min, da-nach wurde nochmals frisches VE-Was-ser eingefüllt und eine Inkubation über Nacht (17 – 20 h) unter ständigem Rüh-ren vorgenommen. Die Prüfkörper wur-den aus dem Becherglas entnommen, durch senkrechtes Halten möglichst viel Wasser entfernt und in eine Plastikdo-se eingebracht, deren Boden mit 300 g getrocknetem Silicagel gefüllt war. Es wurden bis zu 40 Prüfkörper auf dem siebförmigen Zwischenboden aufgelegt und die Prüfkörper getrocknet, bis die Fibrinschicht durch einen Übergang von opakem zu weißem Erscheinungsbild die Trocknung anzeigte. Die Trocknung erfolgte bei 22 ± 2 °C. Zur Lagerung wurden die fertigen F-PCD entnom-men, einzeln in Glasschraubröhrchen eingebracht und im Kühlschrank bei 2 - 8 °C für maximal 4 Wochen gela-gert. Vor den Reinigungsexperimenten wurden gelagerte F-PCD zunächst auf Raumtemperatur gebracht, bevor die Glasschraubröhrchen geöffnet wurden, um Kondensationseffekte auf der Prü-fanschmutzung zu vermeiden.

2.2.4 Durchführung von Reinigungs-

experimenten

Die Reinigerlösung (WSH, Testreiniger 1 oder 2) wurde in einer Glasflascheim Wasserbad auf 25 ± 2 °C vortempe-riert. In Abhängigkeit der Messzeitpunk-te wurden drei oder vier Prüfkörper mit der Prüfanschmutzung zum Zentrum des Becherglases orientiert an die Wand des Becherglases angelegt und am Rand des Becherglases mit einer Klammer so fixiert,dassdiePrüfanschmutzungvoll-ständig in die Reinigerlösung eintauch-te. Die Anordnung der Prüfkörper im Becherglas erfolgte mit jeweils gleichen Abständen zueinander. Pro Reinigungs-ansatz (Becherglas mit Prüfkörpern) wurde ein unbehandelter Prüfkörper als Positivkontrolle mitgeführt. Der Testauf-bau wurde auf einen Heiz-/Magnetrüh-rer gestellt, die Umdrehungsgeschwin-digkeit wurde auf 350 U / min adjustiert und die Temperatur so eingestellt, dass über die gesamte Versuchsdauer von bis zu 30 min die Temperatur von 25 ± 2 °C konstant eingehalten wurde. Eine stän-dige Kontrolle erfolgte mittels einge-hängtem Thermometer. Nach Einfüllen von 250 ml Reinigerlösung wurde eine Stoppuhr gestartet. Nach 5 min, 10 min, 20 min und 30 min wurde je ein Prüf-körper entnommen, dieser wurde für ca. 1 sec in VE-Wasser eingetaucht („ein-dippen“) und danach zur Elution von Restanschmutzungen weiter verarbeitet.

2.2.5 Elution von Restanschmutzungen auf

Blut-Prüfkörpern

Zur Elution von Rückständen reak-tivierten Schafbluts auf B-PCD wur-den die Prüfkörper in eine Petrischa-le (D: ca. 90 mm) überführt, die mit 16 g gereinigten Glasperlen und 10 ml 1 % SDS-Lsg. (pH = 11) gefüllt war. Die Prüfkörper wurden mit der ange-schmutzten Seite auf den Glaskugeln platziert und für 20 min auf einem Ho-rizontalschüttler bei 300 U / min bei RT eluiert. Das Eluat wurde mit einer Pipette in ein 15 ml Schraubröhrchen für die nachfolgende Bestimmung des Restproteingehalts überführt.

2.2.6 Elution von Restanschmutzungen auf

Fibrin-Prüfkörpern

Zur Elution von Fibrinrückständen auf F-PCD wurde jeweils ein Prüfkörper in ein Glasschraubröhrchen überführt, es wurden 10 ml 1 % SDS-Lsg. (pH = 11) hinzu pipettiert und das Röhrchen mit lose aufgelegtem Deckel autoklaviert,



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hierzu wurde ein Dampfsterilisations-programm mit 121 °C und einer Hal-tezeit von 20 min eingestellt. Um ei-nen Siedeverzug beim Abkühlen zu verhindern, wurde, sofern verfügbar, ein Verfahren mit Stützdruck bei der Abkühlung verwendet. Nach Abküh-lung auf Raumtemperatur wurden die Glasschraubröhrchen dicht geschlos-sen und mit der Hand durch Schütteln durchmischt. Es erfolgte eine visuelle Kontrolle, dass keine Rückstände der Prüfanschmutzung auf den Prüfkör-pern verblieben waren, im Zweifelsfall wurde eine Anfärbung von Protein-rückständen mittels Amidoschwarz [19] durchgeführt.

2.2.7 Proteinquantifizierung

Die Quantifizierung solubilisierterProteine in den Eluaten kann sowohl mittels BCA- als auch OPA-Methode erfolgen. Hinsichtlich der Anwendung der BCA- oder OPA-Methode wird auf Anlage 8 zur Leitlinie von DGKH, DGSV, DGVS, DEGEA und AKI [18] und DIN EN ISO 15883-1 [7] verwie-sen. Alternativ können modifizierteMethoden oder kommerzielle Testsät-ze verwendet werden, sofern diese auf den gleichen chemischen Nachweisre-aktionen beruhen und eine gleicharti-geEignungzurProteinquantifizierungnachgewiesen wurde. Gegebenenfalls sindspezifischeBestimmungsgrenzenund Störfaktoren zu beachten. Die Ka-librierung der Methoden erfolgt mit definiertenMengenvonbovinemSe-rum Albumin (BSA), Fraktion V. Zur Proteinquantifizierungderhierdarge-stellten Ringversuchsergebnisse wur-de von den teilnehmenden Laboren stets die modifizierte OPA-Methode[20] angewandt.

2.2.8 Gelelektrophoretische Untersu-

chung von Fibrin in Eluaten

Zur Charakterisierung der durch Dampfsterilisation (121 °C, 20 min) solubilisierten Fibrinrückstände wur-den Fibrinkoagel hergestellt, indem 250µlSchafblutineinem1,5mlRe-aktionsgefäß mit der entsprechen-den Menge Protamin versetzt wurde. Nach Abschluss der Koagulation (1 h) erfolgte eine De-Hämoglobinisierung von fünf Fibrinkoageln durch Wa-schung in 500 ml VE-Wasser. Inner-halb der ersten 8 h der De-Hämoglobi-nisierung wurde das VE-Wasser 3x ge-

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FL: Aufzählung

Abb. 1: Konditionierung von Blutprüfkörpern (B-PCD) bei 22 – 24 °C bei unterschied-lichen relativen Luftfeuchten über eine Dauer von 22 ± 2 h. Konditionierung: A) 43% r. F. über K2CO3-Lsg.; B) 70 % r. F. über KI-Lsg.; C) 75% r. F. über NaCl-Lsg.; D) 81% r. F. über (NH4)2SO4-Lsg.

Abb. 2: B-PCD wurden bei 81 % r. F. über (NH4)2SO4-Lsg. konditioniert, hierbei wur-de eine homogene, getrocknete Blutanschmutzung erzielt (A). Bei Inkubation an der Raumluft (24 °C, 49 % r. F.) trat innerhalb kurzer Zeit (< 5 min) eine starke Rissbil-dung auf (B).

Abb. 3: Schritte der Herstellung von F-PCD: A) mit 100 µl unverdünntem, reakti-viertem Blut homogen beschichtete Stahlplättchen (Charge 2, Größe: 80 x 12 x 1 mm, angeschmutzte Fläche 6 cm2) nach einstündiger Inkubation bei 100% r. F.; B) nasse F-PCD unmittelbar nach dem De-Hämoglobinisierungsschritt, das gequol-lene Fibrin-Hydrogel weist ein opakes Erscheinungsbildung auf; C) F-PCD nach 24 h Trocknung über Silicagel; D) getrocknete F-PCD nach Anfärbung der Fibrinschicht mit Amidoschwarz.

A B

C D

A B

A B

C D

A B

C D


wechselt, danach erfolgte ein täglicher Wechsel über eine Gesamtzeit von 4 Tagen. 2 Fibrinkoagel wurden in einem Glasschraubröhrchen mit 0,25 ml 1 % SDS-Lsg. (pH = 11) überschichtet und durch Dampfsterilisation in die solubili-sierteForm(Eluat)überführt.10µldesEluats wurden mit 3,4 µl Proteinlade-puffer vermischt, für 10 min aufgekocht und auf ein Acrylamidgel (4 – 20 % Gra-dientengel) zusammen mit einem Pro-teingrößenmarker aufgetragen. Die An-färbung erfolgte mittels Coomassie-Fär-bung [21].

2.2.9 Total Organic Carbon–Messungen

Die Messungen des Total Organic Car-bon (TOC) erfolgten mit dem System DIMATOC 2010-LC (DIMATEC Analy-sentechnik GmbH, Essen), einem Kom-pakt-Laboranalysator zur Kohlenstoff-bestimmung in Flüssigkeiten nach dem Prinzip der thermisch-katalytischen Oxidation bei 850 °C mit anschließen-der NDIR Detektion (nicht-dispersive Infrarotspektroskopie). Die Elution der Restanschmutzung auf F-PCD für die-se Messungen erfolgte, wie in 2.2.6 be-schrieben, durch Dampfsterilisation bei 121 °C und 20 min Haltezeit, jedoch mit einer 0,001 N NaOH-Lsg. anstelle der 1 % SDS-Lsg. Es konnten danach keine Rück-stände auf den F-PCD durch Anfärbung mit Amidoschwarz festgestellt werden. Bei der direkten Messung des TOC der erhaltenen Lösung wird gelöstes und zu Natrium(hydrogen)carbonat umgesetz-tes Kohlendioxid miterfasst. Daher wur-den die Lösungen mit Salzsäure angesäu-ert, Kohlendioxid-freies Trägergas 5 min durch die Lösung zum Ausgasen des Koh-lendioxids geleitet und dann ein Aliquot der TOC-Messung zugeführt. Die Mess-werte dieser NPOC (non purgeable orga-nic carbon)-Messung lagen dann im Mit-telum22μgKohlenstoff/mlniedrigergegenüber der direkten TOC-Messung.

3. Ergebnisse

3.1 Herstellung homogener reproduzier-barer PrüfanschmutzungenUnter Verwendung einer Prüfanschmut-zung aus reaktiviertem verdünnten Schafblut wurden Prüfkörper mit einer Blutanschmutzung (B-PCD) hergestellt. Publizierte Methoden zur konditionier-ten Trocknung von Blutanschmutzun-gen [14, 15] bei 43 % relativer Feuchte (r. F.) führten bei den teilnehmenden Laboren zu unterschiedlichen Ergebnis-

sen. Es wurden sowohl homogene, fest anhaftende Anschmutzungen als auch stark rissige Anschmutzungen beob-achtet, die eine Ablösung von der Prüf-körperoberfläche bei mechanischer Er-schütterung zeigten. Zur Optimierung der Konditionierungsmethode wurden Versuche in mehreren Laboren über un-terschiedlichen gesättigten Salzlösun-gen [22] durchgeführt. Die vergleichen-den Konditionierungen erfolgten für 22 ± 2 h bei 43 % r. F. über gesättigter K2CO3-Lsg., bei 70 % r. F. über gesättig-ter KI-Lsg., bei 75 % r. F. über gesättigter NaCl-Lsg. und bei 81 % r. F. über gesät-tigter (NH4)2SO4-Lsg. Die teilnehmen-den Labore konnten trotz mehrfach wie-derholter Versuche unter sonst im Labor konstanten Bedingungen (Temperatur, Blutmenge und -konzentration, etc.) keine einheitlich geeignete Luftfeuchte zur reproduzierbaren Erzielung homo-gen getrockneter und fest anhaftender Blutanschmutzungen auf Stahloberflä-chen ermitteln. Eine exemplarische Bild-zusammenstellung unterschiedlich kon-ditionierter Blutanschmutzungen (Labor A) ist in Abb. 1 dargestellt.

Bei weiteren Experimenten zeigte sich, dass, sofern es gelang, durch Kon-ditionierung eine getrocknete homo-gene Blutanschmutzung herzustellen (s. Abb. 2A), eine nachfolgende kurz-zeitige Inkubation (2-5 min) der Prüf-körper an der Raumluft des Labors (24 °C, 49 % r. F.) eine schnelle Aus-bildung von Rissen in der Anschmut-zungsschicht und ggf. eine Ablösung der Blutanschmutzung von der Stahl- oberflächebedingte(s.Abb.2B).Mut-maßlich führte eine weitere Trock-nung der bei 81 % r. F. konditionierten Blutanschmutzung zu Schrumpfungs-rissen. Diese Instabilität der Blutan-schmutzung erschwerte den reprodu-zierbaren Einsatz von B-PCD.

Durch die Entwicklung von F-PCD konnte die Problematik der konditio-nierten Trocknung der aufgebrachten Blutanschmutzung umgangen werden, indem die Koagulation des Blutes in einer gesättigten wasserhaltigen At-mosphäre (100% r. F., Inkubation über VE-Wasser) erfolgte und die nassen, ko-agulierten Prüfkörper direkt dem nach-folgenden De-Hämoglobinisierungsschritt zur Entfernung des Hämoglobins und weiterer wasserlöslicher Proteinkom-ponenten zugeführt wurden. Eine un-mittelbar anschließende Trocknung der Prüfanschmutzung über Silicagel

führte zu einer homogenen und fest anhaftenden wasserunlöslichen Fibrin-schicht, s. Abb. 3.

3.2 Solubilisierung/Elution von AnschmutzungsrückständenBei der Elution von in Reinigungsver-suchen eingesetzten B-PCD wurde von den teilnehmenden Laboren überein-stimmend beobachtet, dass es zu einer rein mechanischen Entfernung verblie-bener Anschmutzungsrückstände von den Prüfkörpern durch die kreiselnd schüttelnde Bewegung auf den zugege-benen Glasperlen kam und unlösliche Anschmutzungsrückstände als suspen-dierte Flöckchen im Elutionsmedium verteilt vorlagen. Zur Visualisierung der Suspension unlöslicher Anschmut-zungsrückstände zeigt Abb. 4 stellver-tretend die Elution von B-PCD, die im Rahmen von Vorversuchen mit einem desinfizierend wirkenden Reiniger be-

B

D

A

B

Abb. 4: Visualisierung der mechani-schen Entfernung und Suspension was-serunlöslicher Anschmutzungsrückstän-de von B-PCD. Die Einwirkung eines desinfizierend wirkenden Reinigers führte zur Denaturierung der Blutan-schmutzung, welche durch submerses (1 % SDS-Lsg. [pH = 11]) Schütteln auf Glaskugeln nur mechanisch entfernt und suspendiert werden konnte (A). Auf der Oberfläche der behandelten Prüfkörper war eine räumlich begrenzte Ablösung der Anschmutzungsschicht durch me-chanische Einwirkung der Glasperlen zu beobachten (B).



372

3.4 Qualitative Charakterisierung solubi-lisierter FibrinanschmutzungenUm Information über die Größe der Fibrinbruchstücke nach der Eluti-on zu erhalten, wurde eine Polyacryl- amid-Gel-Elektrophorese (PAGE) durch- geführt, s. Abb. 7. Die durch die ther-mische Behandlung solubilisierten Fi-brinbruchstücke lagen in einer sehr un-terschiedlichen Größenverteilung zwi-schen ca. 17 KDa bis hin zu ca. 230 KDa vor. Der Großteil der Bruchstücke wur-de zwischen ca. 20 – 70 KDa detektiert. Die thermische Behandlung vor der Elu-tion führte zu keiner Totalhydrolyse des Fibrins. Es wurden unterschiedlich gro-ße Protein(fragmente) detektiert, die auf eine Partialhydrolyse hindeuteten, jedoch keinen relevanten Einfluss aufdieProteinquantifizierungmittelsOPA-und BCA-Methode hatten, siehe 3.3.

3.5 Konstanz der Fibrinmenge auf Prüfkörpern unter Wiederhol- und Ver-gleichsbedingungenZur Untersuchung, ob F-PCD mit ver-gleichbaren Fibrinmengen in den un-terschiedlichen Laboren ausgehend von einer Blut-Charge hergestellt wer-den können, bezogen fünf teilnehmen-de Labore Schafblut derselben Blutge-winnungs-Charge. Der Proteingehalt

Xxxxx

FL: AufzählungB

D

A B

Abb. 5: F-PCD nach Anfärbung mit Amidoschwarz: A) unbehandelte F-PCD, die dem Elutionsschritt nicht unterzogen wurden; B) F-PCD nach thermischer Elution/Solubi-lisierung der Fibrinschicht mit einem Dampfsterilisationsschritt.

handelt worden waren. Dessen Einwir-kung führte zu einer Denaturierung der Blutanschmutzung, sodass enthaltenes Hämoglobin nicht mehr wasserlöslich war, weshalb keine weiteren Versuche mitdesinfizierendwirkendenReinigerndurchgeführt wurden. Bei Experimen-tenmitnichtdesinfizierendwirkendenReinigern wurden weißlich-farblose, jedoch mit Amidoschwarz anfärbbare Rückstände auf den Prüfkörpern be-obachtet, die durch das Schütteln auf Glasperlen ebenfalls lediglich als un-lösliche Flöckchen suspendiert wer-den konnten. Die Unlöslichkeit von An-schmutzungsbestandteilen wurde als kritisch hinsichtlich der Entnahme ei-ner homogenen Messlösung sowie der nachfolgenden Proteinquantifizierungbeurteilt.

Zur Elution der wasserunlöslichen Fibrinanschmutzung bei F-PCD wur-de eine Methode zur quantitativen So-lubilisierung durch Dampfsterilisation (121 °C / 20 min) bei submerser Inku-bation in 1 % SDS-Lsg. (pH = 11) entwi-ckelt. Dieses Verfahren führte zu einer restlosen Ablösung von Fibrinrückstän-den. Der Nachweis über die Vollstän-digkeit der Elution wurde durch An-färbung möglicherweise verbliebener Fibrinrückstände durch Amidoschwarz geführt und ergab keine nachweisba-ren Rückstände (Nachweisgrenze < 20 ng / cm2 [19]), s. Abb. 5.

3.3 Einfluss des thermischen Elutionsver-fahrens auf die ProteinquantifizierungDa durch das Dampfsterilisationsver-fahren eine starke Erhitzung der Fi-brinrückstände in Gegenwart des al-kalischen Mediums (1 % SDS-Lsg., pH = 11) erfolgte, muss sichergestellt werden, dass es zu keiner Partial- oder Totalhydrolyse der Fibrinrückstände kam, was zu einer starken Veränderung

der Anzahl freier a- und e-Aminogrup-pen sowie Peptidbindungen geführt hätte, für die die OPA-, respektive die BCA-Methode, sensitiv ist. Darüber hi-naus durfte keine Reaktion der vorlie-genden Aminogruppen eintreten, da diese dann nicht mehr mittels OPA-Me-thode erfassbar wären. Zur Überprü-fung wurden Vergleichsuntersuchun-gen unter Verwendung von definierteingestellten Schafblutlösungen (5, 10, 25 µl Blut / ml, mittels OPA-Me-thode bestimmte Proteinkonzentration des Bluts: 168,5 mg / ml) und von BSA (Typ V)-Lösungen definierter Konzen-tration (50, 100, 200 µg /ml) und in1 % SDS-Lsg. (pH = 11) durchgeführt. Eswurde einedirekteProteinquantifi-zierung mittels OPA- und BCA-Metho-de der unbehandelten Lösungen (25 °C) durchgeführt. Eine zuvor abgetrennte Teilmenge der Schafblut- und BSA-Lö-sungen wurden einem Dampfsterilisa-tionsschritt (121 °C, 20 min) unterzo-gen und die jeweiligen Proteingehalte nachfolgend ebenfalls mittels OPA- und BCA-Methode quantifiziert (n= 1), s.Abb. 6.

Für die unterschiedlich konzentrier-ten Blutlösungen wurden für die Be-handlung bei 121 °C im Vergleich zur Lagerung bei 25 °C Unterschiede hin-sichtlich des gemessenen Proteinge-halts bei Anwendung der OPA-Methode von -10,0 % bis +10,6 % und bei Anwen-dung der BCA-Methode von -2,7 % bis +0,8 % ermittelt. Für die unterschied-lich konzentrierten BSA-Lösungen wur-den Unterschiede bei Anwendung der OPA-Methode von -10,4 % bis -6,8 % und bei Anwendung der BCA-Metho-de von -9,1 % bis -7,1 % gemessen. Die als eher gering beurteilten Unterschie-de wurden der methodischen Präzision derjeweiligenProteinquantifizierungs-methode zugeschrieben.

Abb. 7: Denaturierende Polyacryla-mid-Gel-Elektrophorese (PAGE) von Fi-brin, das durch einen Dampfsterilisati-onsschritt (121 °C, 20 min) solubilisiert wurde. M: Molekularer Größenmarker 17 – 245 KDa, 1: 5 µl eines Fibrin-Solubili-sats (nicht quantifiziert), 2: 10 µl des Fi-brin-Solubilisats, 3: 20 µl des Fibrin-So-lubilisats.


der verwendeten Blutcharge wurde von allen Laboren mittels OPA-Methode ge-messen und lag bei 135 ± 5,56 mg / ml (n = 16, jeweils Einfach- oder Dop-pelbestimmung in den fünf Laboren). Die Herstellung der ersten Charge von F-PCD (Charge 1) erfolgte innerhalb von 24 h nach Lieferung bzw. innerhalb von 48 h nach Gewinnung des Schafbluts. Eine zweite unangebrochene Flasche des Schafbluts derselben Blutgewin-nungs-Charge wurde in den jeweiligen Laboren gekühlt (4 – 6 °C) unter täg-lichem Schwenken gelagert. Nach sie-ben Tagen Lagerung wurde eine weite-re Charge von F-PCD (Charge 2) herge-stellt. Der Proteingehalt der F-PCD der Charge 1 und Charge 2 wurde nach So-lubilisierung mittels der OPA-Methode bestimmt, die Ergebnisse sind in Tab. 1 dargestellt. Für die in den fünf Labo-ren untersuchten F-PCD (n = 84) wur-

de ein durchschnittlicher Proteingehalt von686±156µg/F-PCDermittelt,derMaximalgehaltbetrug984µg/F-PCD,der Minimalgehalt 408 µg / F-PCD.Eine systematische Ab- oder Zunahme des messbaren Proteingehalts bedingt durch einwöchige Lagerung des Blutes vor Herstellung der F-PCD konnte nicht ermittelt werden, beobachtete Schwan-kungen wurden der Präzision der Pro-teinquantifizierungsmethodeindenje-weiligen Laboren zugeschrieben.

3.6 Vergleichende Bewertung der Reini-gung mittels Blutprüfkörper (B-PCD)In einem Ringversuch zur vergleichen-den Bewertung der Reinigung un-ter Verwendung von Blutprüfkörpern (B-PCD) nahmen vier Labore (Lab. A – D) teil. Nach einer Behandlungszeit von 5, 10 und 20 min wurden jeweils

Prüfkörper entnommen und hinsicht-lich des Restproteingehaltes unter-sucht. Die Labore A, B, C führten zwei unabhängige Versuchsserien mit je n = 3 B-PCD pro Messpunkt durch (ge-samt n = 6), Labor D führte eine einfa-che Versuchsserie mit n = 3 B-PCD pro Messpunktdurch.DieQuantifizierungdes Restproteingehalts erfolge immer unter Anwendung der OPA-Methode. Standardabweichungen für die Ergeb-nisse der jeweiligen Labore konnten nicht angegeben werden, da nur die arithmetischen Mittelwerte der Rest-proteingehalte von den Laboren mitge-teilt wurden.

Die unbehandelten Kontrollprüfkör-per (0 min) wiesen einen Proteingehalt zwischen8.430und13.682µg/B-PCDauf. Zur Normalisierung der Ergebnis-

Abb. 6: Vergleichende Untersuchung des Einflusses einer thermischen Behandlung (121 °C, 20 min) im Vergleich zur Inkuba-tion bei Raumtemperatur (25 °C) auf die mittels OPA- und BCA-Methode messbaren Proteinkonzentrationen unterschiedlicher Schafblut-Lösungen (A) und BSA-Lösungen (B) (je n = 1).

Labor A B C D E

Charge 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2

n 9 9 9 9 9 9 9 9 6 6

Mittel [µg / F-PCD] 884 856 520 567 624 844 726 722 492 495

SD [µg / F-PCD] 59,2 33,3 39,0 24,8 111 52,9 94,0 73,3 27,6 11,0

SD-Prozent [%] 6,69 3,89 7,49 4,38 17,8 6,27 12,9 10,1 5,61 2,22

Tab. 1: Untersuchung der Konstanz der Fibrinmenge auf F-PCD. Die Labore A, B, C, D und E stellten zwei Chargen (Charge 1 und 2) F-PCD mit jeweils 6 - 9 Prüfkörpern her. Nach Solubilisierung der Fibrinanschmutzung erfolgte die Quantifizierung des Proteingehalts mittels OPA-Methode. Es ist jeweils die Anzahl der untersuchten F-PCD (n), das arithmetische Mittel (Mittel), die Standardabweichung (SD) und die prozentuale Standardabweichung (SD-Prozent) für die gemessenen Proteingehalte der unter-schiedlichen F-PCD-Chargen in jedem Labor angegeben.

A B



374

Xxxxx

FL: Aufzählung

weitert. Die Labore A, B, E und F führten jeweils eine Versuchsserie mit je n = 3 F-PCD pro Messpunkt durch, Labor D setzte n = 4 F-PCD pro Messpunkt ein, Labor C setzte bei der Untersuchung mit WSH n = 2 F-PCD / Messpunkt und bei der Untersuchung mit TR-1 und TR-2 je n = 3 F-PCD / Messpunkt ein. Zur Elu-tion von Anschmutzungsrückständen auf den F-PCD wurde die entwickelte Elutionsmethode unter Anwendung ei-nes Dampfsterilisationsschritts ange-wendet. Die Quantifizierung der Rest-proteingehalte erfolgte entsprechend der Festlegung in allen Laboren mit der OPA-Methode, ermittelte Restprotein-gehalte wurden auf das Standardpro-tein BSA, Typ V, bezogen.

telt. Nach 20 min lagen die Restprotein-gehalte für die Behandlung mit WSH bei 6,1 ± 2,9 % und für die Behandlung mit TR-1 und TR-2 bei 1,7 ± 0,8 % und 3,5 ± 1,8 %. Die Reinigungswirkung von WSH, TR-1 und TR-2 war aufgrund der vergleichbaren Entfernung der Blutan-schmutzung nicht unterscheidbar.

3.7 Vergleichende Bewertung der Reini-gung mittels FibrinprüfkörperAn einem ersten Ringversuch unter Ver-wendung der neu entwickelten F-PCD nahmen sechs Labore (Labor A-F) teil. Die Reinigungswirkung von WSH, TR-1 und TR-2 wurden vergleichend unter-sucht. Aufgrund der schwierigen Ent-fernbarkeit der Fibrinanschmutzung wurden die Messpunkte auf 30 min er-

se wurden die bei den unterschiedlichen Messpunkten ermittelten Rest-proteingehalte auf die unbehandel-ten Kontrollprüfkörper (100 %) be-zogen und der prozentuale Restpro-teingehalt angegeben. Die Ergebnisse für die Reinigungsexperimente unter Verwendung von WSH, Testreiniger 1 und 2 (TR-1, TR-2) sind in Abb. 8A, B, C gezeigt. Die Ergebnisse der teilneh-menden Labore wurden zusammenge-fasst und das arithmetische Mittel der Restproteingehalte zu den jeweiligen Messpunkten bestimmt, die Ergebnis-se sind als Kinetik in Abb. 8D darge-stellt.

Nach 5 min Behandlungszeit mit WSH wurde ein Restproteingehalt von 11,5 ± 1,9 % und für TR-1 und TR-2 von 6,7 ± 4,3 und 6,8 ± 2,9 % ermit-

Abb. 8: Reinigungsversuche in WSH und zwei Testreinigern unter der Verwendung von Prüfkörpern mit reaktivierter Blutan-schmutzung (B-PCD) in vier Laboren (Lab. A-D). Die Prüfkörper wurden unterschiedlich lange in der Reinigerlösung behandelt (5, 10, 20 min) und der verbliebene Restproteingehalt (Blutrückstände) nach Elution mittels OPA-Methode bestimmt. Die Labo-re A - C führten zwei Versuchsserien mit je n = 3 B-PCD / Messpunkt durch, Labor D führt eine Versuchsserie mit je n = 3 B-PCD / Messpunkt durch. Der Restproteingehalt ist als prozentualer Wert angegeben und wurde auf die unbehandelten Kontrollen (0 min) bezogen. A: Reinigung in WSH; B: Reinigung in Testreiniger 1 (TR-1); C: Reinigung in Testreiniger 2 (TR-2); D: Die von den Laboren mitgeteilten Restproteingehalte wurden zur Ermittlung des durchschnittlichen Restproteingehalts eingesetzt (Fehler-balken: Standardabweichung, SD).

A B

C D


Die unbehandelten Kontrollprüfkörper (0 min, insgesamt n = 56) wiesen einen durchschnittlichen Proteingehalt von 625±175µg(Minimum:223µg,Ma-ximum962µg) /F-PCDauf.ZurNor-malisierung der Ergebnisse wurden die bei den unterschiedlichen Messpunk-ten ermittelten Restproteingehalte auf die unbehandelten Kontrollprüfkörper (100 %) bezogen und der prozentuale Restproteingehalt angegeben. Die Er-gebnisse für die Reinigungsexperimen-te unter Verwendung von WSH, TR-1 und TR-2 sind in Abb. 9A, B, C gezeigt. Die Ergebnisse der teilnehmenden La-bore wurden zusammengefasst und das arithmetische Mittel der Restproteinge-

halte zu den jeweiligen Messpunkten bestimmt, die Ergebnisse sind als Kine-tik in Abb. 9D dargestellt.

Eine unterschiedliche Reinigungs-wirkung von WSH, TR-1 und TR-2 konnte ab einer Reinigungszeit von 10 min festgestellt werden; hier lag der prozentuale Restproteingehalt für eine Reinigung mit WSH bei 81,8 ± 8,9 % (n = 18), mit TR-1 bei 59,9 ± 7,5 % und mit TR-2 bei 26,7 ± 23,0 % (je n = 19). Bei TR-2 wurde für längere Reinigungs-zeiten (30 min) eine weitere Reduktion des Restproteingehalts auf 5,7 ± 5,8 % beobachtet, während bei einer Reini-gung in WSH und TR-1 lediglich eine

geringfügige weitere Abnahme des Restproteingehaltes beobachtet wurde, s. Abb. 9D.

Um eine weitere Standardisierung des Fibringehalts auf den F-PCD und den Einfluss einer unterschiedlichenLagerungsdauer des für die Anschmut-zung eingesetzten Schafbluts zu unter-suchen, wurde von der Arbeitsgrup-pe ein weiterer Ringversuch durchge-führt. Dabei bezogen die Labore A - F heparinisiertes Schafblut einer einzi-gen Blutgewinnungs-Charge. Inner-halb von 24 h nach Lieferung des Blu-tes wurde eine erste Charge F-PCD her-

Abb. 9: Reinigungsversuche in WSH und zwei Testreinigern unter der Verwendung von Prüfkörpern mit Fibrinanschmutzung (F-PCD) in sechs Laboren (Lab. A-F). Die Prüfkörper wurden unterschiedlich lange in der Reinigerlösung behandelt (5, 10, 20, 30 min) und der verbliebene Restproteingehalt (Fibrin) nach Elution mittels OPA-Methode bestimmt. Die Labore A, B, E und F führ-ten eine Versuchsserie mit je n = 3 F-PCD / Messpunkt durch, Labor D setzte n = 4 F-PCD / Messpunkt ein, Labor C setzte bei der Prüfung mit WSH n = 2 F-PCD / Messpunkt ein, sonst n = 3. Die Angabe des ermittelten Restproteingehalts erfolgte als prozen-tuale Angabe und wurde auf die unbehandelten Kontrollen (0 min) bezogen. A: Reinigung in WSH; B: Reinigung in Testreiniger 1 (TR-1); C: Reinigung in Testreiniger 2 (TR-2); D: Die von den Laboren mitgeteilten Restproteingehalte wurden zur Ermittlung des durchschnittlichen Restproteingehalts eingesetzt (Fehlerbalken: Standardabweichung, SD).

A B

C D



376

gestellt. Eine zweite unangebrochene Flasche des Schafbluts derselben Her-stellungs-Charge wurde in den jewei-ligen Laboren gekühlt (4 – 6 °C) unter täglichem Schwenken gelagert. Nach sieben Tagen Lagerung wurde eine zweite Charge F-PCD hergestellt. Die Labore führten vergleichende Reini-gungsversuche mit F-PCD der Charge 1 und Charge 2 mit WSH, TR-1 und TR-2 durch. Für jeden Messpunkt (0, 5, 10, 20, 30 min) und jede PCD-Charge wur-den jeweils n = 3 F-PCD untersucht.

Da die Labore D und E eine Char-ge des TR-2 jenseits des Haltbarkeits-datums einsetzten, wiederholten diese beiden Labore die Reinigungsexperi-mente mit F-PCD, die mit einer anderen Blut-Charge hergestellt worden waren.

Die Ergebniskonsistenz wurde durch Kontrollen (Reinigungsexperimente mit WSH) und übereinstimmende Ergeb-nisse gewährleistet.

Die unbehandelten Kontrollprüfkör-per (0 min, insgesamt n = 36 F-PCD) wiesen bezogen auf die jeweilige Her-stellungs-Charge (arithmetisches Mittel aus n = 3 F-PCD) einen Proteingehalt zwischen487und915µg/F-PCDauf.Die normalisierten Ergebnisse für die Reinigungsexperimente unter Verwen-dung von WSH, TR-1 und TR-2 sind in Abb. 10A, B, C gezeigt. Die Ergebnisse der teilnehmenden Labore wurden zu-sammengefasst und das arithmetische Mittel der Restproteingehalte zu den jeweiligen Messpunkten bestimmt, die

Ergebnisse sind als Kinetik in Abb. 10D dargestellt.

In guter Übereinstimmung zum vorhergehenden Ringversuch konnten bereits nach einer Reinigungszeit von 10 min deutliche Unterschiede hin-sichtlich des gemessenen Restprotein-gehalts für die Reiniger WSH, TR-1 und TR-2 ermittelt werden, wenngleich auch in diesem Ringversuch die Stan-dardabweichungen Überlappungen für die unterschiedlichen Produkte zeigten. Bei einer Reinigungszeit von 20 min wurde eine noch deutlichere Differen-zierung im Vergleich zu kürzeren Reini-gungszeiten zwischen den drei Produk-ten ermittelt. Unterschiede hinsicht-

Xxxxx

FL: Aufzählung

Abb. 10: Reinigungsversuche in WSH und zwei Testreinigern unter der Verwendung von Prüfkörpern mit Fibrinanschmutzung (F-PCD) in sechs Laboren (Lab. A-F). Es wurden zwei Chargen F-PCD hergestellt, die Herstellung von Charge 1 erfolgte mit fri-schem Schafblut innerhalb von 24 h nach Lieferung, die Charge 2 wurde mit Schafblut hergestellt, das eine Woche im Kühl-schrank gelagert worden war. Die Prüfkörper wurden unterschiedlich lange in der Reinigerlösung behandelt (5, 10, 20, 30 min) und der verbliebene Restproteingehalt (Fibrin) nach Elution mittels OPA-Methode bestimmt. Die Labore A - F führten eine Ver-suchsserie mit je n = 3 F-PCD / Messpunkt für jede Prüfkörper-Charge (1, 2) durch. Der Restproteingehalt ist als prozentualer Wert angegeben und wurde auf die unbehandelten Kontrollen (0 min) bezogen. A: Reinigung in WSH; B: Reinigung in Testreini-ger 1 (TR-1); C: Reinigung in Testreiniger 2 (TR-2); D: Die von den Laboren mitgeteilten Restproteingehalte wurden zur Ermitt-lung des durchschnittlichen Restproteingehalts eingesetzt (Fehlerbalken: Standardabweichung, SD).

A B

C D


lich der Verwendung von aus frischem Blut (Charge 1) oder aus einer Woche gelagertem Blut (Charge 2) hergestell-ten F-PCD konnten nicht ermittelt wer-den, lediglich bei der Testung mit WSH waren für den 10 min Messpunkt Un-terschiede zu erkennen, die jedoch im Rahmen der Standardabweichung der jeweils anderen Versuchsserie lagen.

3.8 Vergleichende Bewertung der Reini-gungsleistung mittels TOC-MethodeExemplarisch in einem Labor durchge-führte Untersuchungen unter Verwen-dungderTOC-MethodezurQuantifizie-rung von Fibrinrückständen ergaben, dass unbehandelte F-PCD der einge-setzten Charge einen Kohlenstoffge-halt von782µg (NPOC-Methode)auf-wiesen. Bei Reinigungsversuchen unter Einsatz von TR-1 und einer Reinigungs-zeit von 30 min lag der durchschnittli-che Restkohlenstoffgehalt (n = 3) bei 446µg/PCD,bzw.57,0%,wasinsehrguter Übereinstimmung mit den mittels OPA-Methode ermittelten Restprotein-gehalten stand (57,4 % bei 1. Charge und 56,2 % bei 2. Charge, Abb. 10).

4. Diskussion

4.1 Prüfanschmutzung BlutDie Festlegung geeigneter allgemein ak-zeptierter Prüfanschmutzungen zur Be-wertung von Reinigungsprozessen für Medizinprodukte stellt eine bislang un-gelöste Herausforderung dar. So werden in DIN ISO/TS 15883-5:2006 [13] 19 verschiedene Prüfanschmutzungen und -verfahren zur Bewertung maschineller Aufbereitungsprozesse genannt. Darüber hinaus sind viele weitere kommerzielle Testsysteme basierend auf anderen bzw. weiteren Prüfanschmutzungen verfüg-bar, über deren z. T. stark unterschiedliche Entfernbarkeit bei Reinigungspro-zessen berichtet wurde [23–25].

Diese Prüfanschmutzungen und Verfahren werden zur Qualifizierungvon maschinellen Reinigungsprozessen eingesetzt, bei denen entsprechend des Sinner’schen Modells der Faktor Me-chanik vom Reinigungs-Desinfektions-gerät erzeugt wird und damit für das Ergebnis des maschinellen Prozesses eine große Rolle spielt. Daher sind die-se Prüfanschmutzungen und Verfahren nicht zur vergleichenden Bewertung, bzw. Qualifizierung des Faktors Che-mie, d.h. der alleinigen Wirksamkeit ei-nes Reinigers geeignet [26].

Die DIN ad hoc-Gruppe (NAMed 063-04-09) publizierte 2008 [14] und 2009 [15] ihre Ergebnisse zur Entwicklung einer Testmethode zur Bewertung der Reinigungswirkung von Instrumenten-reinigern ohne bzw. mit vernachlässig-bar geringer Mechanik. Hierbei kam ein Tauchbad-Aufbau zum Einsatz, bei dem durch einen Magnetrührer (350 U / min) eine Strömung zur makrosko-pischen Unterstützung von Diffusions-prozessen im Tauchbad erzeugt wurde, jedoch keine Mechanik im Sinne des Sinner‘schen Modells generiert wurde. In Ringversuchen konnte gezeigt wer-den, dass eine reproduzierbare und ver-gleichbare Entfernung des als Prüfan-schmutzung eingesetzten reaktivierten verdünnten Schafbluts [14,15] ermittelt werden konnte.

Die Verwendung von reaktiviertem, d.h. koaguliertem, Schafblut als Prü-fanschmutzung beruht auf der unmit-telbaren Übertragbarkeit der Ergebnis-se auf Realinstrumente mit Anschmut-zungen aus Humanblut. Blut stellt die dominierende Anschmutzung chirurgi-scher Instrumente dar. Blut stellt darü-ber hinaus eine besonders anspruchs-volle Anschmutzung hinsichtlich der Entfernung dar, da Rückstände nach Einwirkung von Hitze (> 55 - 60 °C) oder denaturierenden Chemikalien (z.B. Desinfektionswirkstoffen wie Pe-ressigsäure, Aldehyden, QAV mit Ami-nen [27]) äußerst schwierig zu ent-fernen sind. Aus diesen Gründen wird reaktiviertes Schaf- oder Pferdeblut so-wohl als Surrogat für Anschmutzungen aus Humanblut auf chirurgischen Inst-rumenten als auch von anderen Medi-zinprodukten in den jeweiligen Leitli-nien als auch in DIN ISO/TS 15883-5, Anhang A, E, I und M genannt.

4.2 BlutbestandteileDie Prüfanschmutzung Schafblut be-steht u.a. aus den korpuskulären (zellulären) Bestandteilen Erythrozy-ten, Leukozyten und Thrombozyten mit einem Hämatokrit gemäß Referenz-bereich von 30-38 % (v / v). Die An-zahl der Erythrozyten liegt zwischen 6,5 - 11,3 x 1012 / l, diese sind mit Hä-moglobin (roter Blutfarbstoff) gefüllt. Der Hämoglobingehalt von Schaf-blut beträgt nach Referenztabelle [28] 87 - 128 g / l. Bezogen auf jeweils mitt-lere Proteinkonzentrationen gemäß Re-ferenzbereich, macht Hämoglobin einen Anteil von 70 % des Gesamtproteinge-

halts des Bluts aus und stellt damit die Hauptproteinkomponente des Bluts dar.

Sowohl die Trocknung von Blutan-schmutzungen als auch die Inkubation in VE-Wasser kann aufgrund der von normalen physiologischen Bedingun-gen abweichenden osmotischen Kon-ditionen zu einer Destabilisierung der Erythrozytenmembranen und einem Platzen der Zellen führen. Die Einwir-kung zahlreicher Tenside führt eben-falls zu einer Zerstörung der Membra-nen. In Folge tritt Hämoglobin aus den Erythrozyten aus. Die Löslichkeit des Hämoglobins in Wasser ist mit 50 % [29] außergewöhnlich hoch und erklärt die sehr schnelle Herauslösung großer Proteinmengen aus Blutanschmutzun-gen durch wässrige Medien [14, 15, 23, 24, 25, 30, 31]. Dieser Effekt wurde von allen Ringversuch-Teilnehmern beob-achtet. Unabhängig davon, ob ein alka-lischer oder ein enzymatischer Reiniger oder lediglich WSH eingesetzt wurde, ergaben sich immer nahezu identische Reinigungskinetiken. Blutanschmut-zungen bzw. B-PCD erwiesen sich daher als ungeeignet, um zwischen der Reini-gungswirkung von Wasser und Reini-gern zu differenzieren.

4.3 FibrinNeben den korpuskulären Anteilen sind im Blutplasma weitere Proteine (Albumine, Globuline, Fibrinogen, Ge-rinnungsfaktoren), Ionen und Trans-portstoffe (Aminosäuren, Kohlenhy-drate, Fette, etc.) enthalten. Der Ge-samtproteingehalt des Schafbluts setzt sich zusammen aus dem Hämoglobin- anteil (87 – 128 g / l Blut), dem Protein- anteil des Blutserums (55 – 75 g / l Serum) und dem Fibrinogenanteil (1,8 – 7,2 g / l Plasma) [32], sodass sich für Schafblut ein Gesamtproteingehalt von 122 – 186 g / l ergibt. Der Fibrino-gengehalt beträgt 1,1 – 5,0 g / l Schaf-blut. Für Humanblut gelten vergleich-bare Werte von 1,0 – 2,6 g / l Blut.

Fibrinogen (humaner Gerinnungs-faktor I) ist ein Proteinkomplex, der aus drei unterschiedlichen Fibrinogenunter-einheiten (a, b, g) aufgebaut ist. Das voll-ständige humane Heterohexamer besteht aus ca. 3410 Aminosäuren und weist eine Masse von 340 KDa auf [33]. Im na-tiven Proteinkomplex sind 2 a-, 2 b- und 2 g-Untereinheiten so angeordnet, dass die Amino-Enden der einzelnen Unter-einheiten im Zentrum des Komplexes liegen und untereinander über einen so-



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charge eingesetzt werden müssen und eine ausreichende Anzahl unbehandel-ter Kontrollen mitzuführen ist. Darüber hinaus wurde definiert, dass die Aus-wertung von Reinigungsexperimenten nicht auf der Basis der quantifiziertenFibrinrückstandsmenge, sondern pro-zentual, bezogen auf den Ausgangswert der unbehandelten Kontrollen, erfolgte.

4.6 Solubilisierung von FibrinFür die quantitative Erfassung des hoch-molekularen Fibrins mittels etablierter Proteinquantifizierungsmethoden(OPA-, BCA-Methode) ist es zwingend not-wendig, die Rückstände in eine gelöste Form zu überführen. Für die Spaltung von hochmolekularem Fibrin bis hin zu einzelnen Aminosäuren sind aggressive Bedingungen, wie z.B. die 26-stündige Inkubation in 6 M HCl bei 110 °C (Über-druck) [38], notwendig. Versuche der AG RMT-Teilnehmer zeigten, dass eine zumindest partielle Auflösung des Fi-brinnetzwerks der F-PCD bei Inkubation in alkalischen Lösungen (z.B. 1 % SDS-Lsg, pH = 11) bei 80 °C und mehr als 2-stündiger Inkubation erfolgen kann. Diese Elutionsmethode erwies sich in Ringversuchen jedoch als nicht hinrei-chend reproduzierbar, sodass zur Be-schleunigung der Elution die Inkubati-onstemperatur auf 121 °C unter Anwen-dung von Dampfsterilisationsprozessen erhöht wurde. Da es sich hierbei um ge-schlossene technische Systeme handelt, wurde die Verdampfung der Wasserpha-se in den Elutionsansätzen minimiert, eine zu berücksichtigende Volumenän-derung trat nicht ein. Die Solubilisie-rung des Fibrins von F-PCD verlief bei allen durchgeführten Ringversuchen in den einzelnen teilnehmenden Laboren quantitativ und reproduzierbar, visuell wahrnehmbare Fibrinrückstände auf den behandelten Prüfkörpern konnten nach Färbung mit Amidoschwarz nicht detektiert werden.

Die bei der thermischen Elution des hochmolekularen Fibrins zugrunde lie-genden chemischen Abläufe sind ge-genwärtig nicht vollständig verstanden. Zwar wurde schon vor längerer Zeit be-schrieben, dass durch SDS sowie durch die kationischen Tenside CTAB, MTAB, HTAB und CPC bei 37 °C eine Solubili-sierung von Fibrinzubereitungen [39] oder bei pH-Werten oberhalb von 9,5 in Kombination mit 8 M Harnstoff und 1 M SDS bei 45 °C eine Solubilisierung von Fibrin [40] erfolgt, die mutmaß-

ellen Kontamination zu ermöglichen, erfolgt nach der De-Hämoglobinisie-rung ein Trocknungsschritt. Hierbei tritt eine Entquellung („Dehydratisie-rung“) des Fibrin-Hydrogels ein, die zur Verdichtung (Kompaktierung) der Fibrinschicht und zu einer verstärkten Adhäsion (Daten nicht gezeigt) an der Stahloberfläche führt. Die Entquellungdes Fibrin-Hydrogels ist nicht vollstän-dig reversibel, d.h. auch eine mehrtägi-ge Inkubation von getrockneten Fibrin-prüfkörpern (F-PCD) in VE-Wasser oder WSH führt nicht mehr zum initialen Quellungsgrad, was mutmaßlich durch die Kollabierung der Mikrostruktur durch das Platzen der eingeschlossenen Erythrozyten und dem Auswaschen der Zellinhaltsstoffe verursacht wird.

4.5 Fibringehalt Die zur Polymerisation des Fibrins füh-rende Koagulationsreaktion ist ein komplexer Prozess, der durch eine Kas-kade verschiedener Faktoren (II bis XIV) ausgelöst wird. Darüber hinaus scheinen zahlreiche andere Faktoren wie z.B. Alter des Bluts, Temperatur und Sauerstoffgehalt eine Rolle zu spie-len. Im Rahmen von durch fünf Labore parallel durchgeführten Versuchen zur Herstellung von Fibrinprüfkörpern auf der Basis von Schafblut einer Herstel-lungscharge konnten in den einzelnen Laboren Prüfkörper mit gut reprodu-zierbarem Fibringehalt und homogener Fibrinverteilung hergestellt werden. Die Standardabweichung für die jewei-ligen Prüfkörperchargen (n = 6 - 9) in den Laboren beliefen sich auf durch-schnittlich 7,74 %, was als akzeptabel beurteilt wurde. Bei der Herstellung ei-ner zweiten Prüfkörpercharge mit dem-selben Blut, das eine Woche gelagert worden war, erzielten die meisten La-bore vergleichbare Fibringehalte. Auf-grund nicht benennbarer unterschied-licher Faktoren und Einflüsse bei derKoagulationsreaktion in den jeweiligen Laboren konnten im Vergleich der La-bore untereinander jedoch nur Prüf-körperchargen mit variierenden Fi-bringehalten hergestellt werden. Die durchschnittliche Fibrinmenge lag bei 686µg/F-PCD(n=84)miteinerStan-dardabweichung von 156 µg / F-PCD,dies entspricht einer prozentualen Standardabweichung von 22,7 %. Auf Basis dieser Ergebnisse wurde defi-niert, dass für Reinigungsversuche je-weils Prüfkörper einer Herstellungs-

genanntenDisulfidring verbunden sind[33,34,35]. Dieses Zentrum mit den Amino-Enden wird als E-Domäne be-zeichnet. Die Carboxyenden der Protei-ne sind nach außen gerichtet und bilden die sogenannte D-Domäne. Das Hetero-hexamer verfügt über 29 Disulfidbrü-cken, über drei hochaffine sowie zehnniederaffineBindestellenfürCa2+ [35].

Die makroskopisch als Koagulation des Blutes erkennbare Spaltung des Fi-brinogens in Fibrin und die kovalente Kopplung unendlich vieler Fibrinein-heiten wird durch eine komplexe Kas-kade von Reaktionen ausgelöst, an de-nen die Gerinnungsfaktoren II bis XIV beteiligt sind [36]. Zusammengefasst kommt es zur Abspaltung von vier klei-nen Peptiden (je zwei Fibrinopeptide A und B) aus der E-Domäne und es wer-den vier neue Amino-Enden exponiert, über die intermolekulare Isopeptidbin-dungen zu anderen Fibrinmolekülen ausgebildet werden [35] werden. Dies führt zur Bildung des quervernetzten hochmolekularen Fibrins, das als gelar-tiges Koagel vorliegt und die korpusku-lären Blutbestandteile (z.B. Erythrozy-ten) umschließt. Hieraus ergibt sich die physiologische Funktion als Wundver-schluss verletzter Gefäße.

Durch die kovalente Bindung der Fibrineinheiten entsteht ein Makromo-lekül extrem hohen Molekülgewichts, das unter physiologischen Konditionen in Wasser nicht löslich ist und hohe An-forderungen an Reinigungsprozesse stellt [30,31]. Darüber hinaus zeigten mittels 99mTc-Markierung durchgeführ-te systematische Studien an gereinigten Instrumenten und Prüfkörpern, dass hochmolekulare Fibrinrückstände nicht durch etablierte Elutionsverfahren voll-ständig solubilisierbar und gegenwärtig nicht mittels etablierter Methoden um-fassendquantifizierbarsind[31,37].

4.4 FibrinprüfkörperBei der Herstellung der F-PCD werden durch den Schritt der De-Hämoglobi-nisierung alle wasserlöslichen Kompo-nenten (Hämoglobin, Albumine, Globu-line, etc.) entfernt, sofern diese nicht an derOberflächederFibrinfibrillenadhä-rieren. Zurück bleibt ein Hydrogel aus gequollenem Fibrin, das in VE-Wasser oder WSH über mehr als vier Wochen ohne weitere Veränderung des Protein-gehalts stabil ist (Daten nicht gezeigt). Um eine einfache Lagerung der Fibrin-prüfkörper ohne Gefahr einer mikrobi-

Als Beispiel für einen nach KRINKO-/ BfArM-Empfehlung empfohlenen alka-lischen Reiniger wurde Testreiniger 1 (TR-1) in den Versuchen eingesetzt. Dieser vermochte keine Auflösung undEntfernung der Fibrinanschmutzung herbeizuführen, da Isopeptidbindun-genundDisulfidbrückenunterdenge-gebenen Bedingungen nicht gespalten werden konnten. Enzymatische Reini-gerformulierungen, die Proteasen ent-halten, können das hochmolekulare Fi-brinnetzwerk hydrolysieren, was zur vollständigen Entfernung durch Bildung niedermolekularer und gut wasserlösli-cher Peptide führt. Hierfür sind jedoch abhängig von der Reaktionskinetik der enthaltenen Proteasen längere Behand-lungszeiten notwendig. Das neue Prüf-modell erlaubt, wie in Ringversuchen demonstriert, nicht nur die Bewertung der Wirksamkeit von neu-tral bis alka-lisch eingestellten Reinigern sondern auch die Bewertung der proteolytischen Aktivität von Enzymreinigern. Die von bis zu sechs teilnehmenden Laboren in mehreren Ringversuchen erzielten Er-gebnisse zeigten eine sehr gute Ver-gleichbarkeit und Reproduzierbarkeit der neuen Prüfmethode.

4.8 Zukünftige ArbeitenGegenwärtige und zukünftige Arbeiten der AG RMT befassen sich mit der Un-tersuchung der Reinigungswirksamkeit eines größeren Spektrums unterschied-licher marktverfügbarer Reiniger, um über die Definition von Akzeptanzkri-terien die Eignung von Instrumenten-reinigern bewerten zu können. Weite-re zukünftige Arbeitsaspekte umfassen entsprechend des Arbeitsauftrags die Untersuchung und Bewertung der Rei-nigung von desinfizierend wirkendenReinigern oder reinigenden Desinfekti-onsmitteln.

4.7 Bewertung von Instrumenten- reinigernDas neu etablierte Prüfmodell auf Basis einer getrockneten und langzeitstabi-len Fibrinschicht als Prüfanschmutzung erlaubt die Bewertung der Leistung von Instrumentenreinigern anhand der quan-titativen Bestimmung von Fibrinrück-ständen, die bislang nur qualitativ de-tektierbar waren. Für die Solubilisierung undQuantifizierungderFibrinanschmut-zung darf keine kovalente Quervernet-zung durch chemisch reaktive Inhalts-stoffe in Reinigern auftreten. Produkte mit einer solchen fixierenden Wirkungwären als Reiniger ohnehin ungeeignet.

Die Reinigungsversuche unter Ver-wendung von WSH als Kontrolle ergaben nach einer Behandlungszeit von 30 min eine geringe Abnahme des Protein- gehalts um 23 %. Hierbei wurden ver-mutlich an das unlösliche Fibrin adhä-rierte [37,42] andere Proteinkomponen-ten der Blutanschmutzung entfernt, die während des Prüfkörperherstellungs-prozesses (De-Hämoglobinisierung in VE-Wasser) aufgrund der anderen Io-nenzusammensetzung und Ionenstärke nicht entfernt werden konnten. Im Ver-gleich dazu wurde bei Reinigungsexpe-rimenten mit dem alkalischen Testreini-ger 1 (TR-1) bei pH = 11,7 nach 30 min eine wesentlich höhere Abnahme des Proteingehalts um 43 % ermittelt. Der enzymatische Testreiniger (TR-2) ver-ursachte eine noch stärkere Redukti-on des Proteingehalts um 95 %, s. Tab. 2. Während bei einer Behandlungszeit von 5 min bereits eine erste Differen-zierung zwischen WSH und Reinigern (TR-1/TR-2) auf Basis der Reduktion des Fibringehalts möglich war (Abb. 9, 10), konnte erst ab Behandlungszeiten von 10 min oder länger zwischen alka-lischem und enzymatischem Reiniger differenziert werden.

lich auf der Spaltung der intermoleku-laren Disulfidbrücken beruht, jedochfehlen abschließende Erkenntnisse zum Mechanismus. Eigene Untersuchungen der AG RMT zur Charakterisierung des solubilisierten Fibrins mittels denatu-rierender Protein-Acrylamid-Gelelek-trophorese (PAGE) ergaben, dass die thermische Elution zur Freisetzung ei-nes sehr breiten Größenbereichs von Proteinen führte, ein Maximum wur-de zwischen ca. 20 – 70 KDa beobach-tet. Distinkte Proteinbanden als Indi-kation für freigesetzte Fibrinketten (a, b, g) oder Fibrinopeptid A oder B [41] wurden nicht beobachtet. Die uneinheit- liche Größenverteilung könnte auch auf das mögliche Vorliegen weiterer löslicher Proteinbestandteile aus dem Plasma hin-weisen, da bereits Untersuchungen von Friedrich et al. [37] einen Hinweis auf eine stabile Adsorption von 99mTc-mar-kierten Humanalbumin-Makroaggrega-ten an Fibrin beschrieben hatten. Ver-gleichsuntersuchungen der AG RMT zur Untersuchung des Einflusses einerthermischen Behandlung auf Schafblut sowie bovines Serum Albumin (BSA) erbrachten keine Hinweise, dass es zu einersignifikantenHydrolyse,d.h.Spal-tung vorliegender Proteine und einer re-levanten Veränderung der Anzahl von BCA-sensitiven Peptidbindungen oder freien OPA-sensitiven a- und e-Amino-säuren, kommt. Darüber hinaus kann eineQuantifizierungdes solubilisiertenFibrins prinzipiell auch mittels TOC-Me-thode erfolgen. Die quantitative Proben-gewinnung für die TOC-Bestimmung ist mit 0,001 N NaOH-Lösung und Dampf-sterilisationsverfahren ebenso möglich. Mit der TOC-Bestimmung als NPOC-Me-thode wurden für die Beurteilung der Reinigungswirkung ebenso valide Er-gebnisse mit guter Übereinstimmung zu den mit der OPA-Methode analysierten Reinigungsversuchen erhalten.

Reiniger Arithm. Mittel [%] SD [%] Minimum [%] Maximum [%]

WSH 22,7 6,2 11,1 33,6

TR-1 43,2 8,0 32,1 56,8

TR-2 94,9 4,2 85,3 99,4

Tab. 2 : Reduktion des prozentualen Proteingehalts nach 30 min Behandlung der F-PCD (basierend auf den Ergebnissen des in Abb. 10 dargestellten Ringversuchs, Anzahl der Labore: 6, Anzahl der Versuchsserien je Labor: 2, Anzahl der F-PCD je Versuchs-serie je Messpunkt: n = 3, in Summe n = 36 F-PCD pro Reiniger).

379 Zentralsterilization | Volume 26 | 6/2018



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Prüfanschmutzungen und -verfahren zum Nachweis der Reinigungswirkung. Beuth-Verlag, Berlin

14. Köhnlein J., Glasmacher R., Heide V., Kunde D., Mohr M., Otto D., Roth K., Staffeldt J., Tiarks P., Wagenknecht S., Werner H.-P., Michels W.: Ringversuch zur Standardisierung einer praxisrele-vanten Prüfanschmutzung zur verglei-chenden quantitativen Bewertung der Reinigung in Anlehnung an EN ISO 15883. ZentrSteril 2008;16(6):424–435.

15. Köhnlein J., Glasmacher R., Heide V., Kunde D., Mohr M., Otto D., Pieper M., Roth K., Staffeldt J., Tiarks P., Wa-genknecht S., Werner H.-P., Michels W.: Ringversuch zur Standardisierung einer praxisrelevanten Prüfanschmut-zung zur vergleichenden quantitativen Bewertung der Reinigung in Anlehnung an EN ISO 15883 – Versuchsbeschrei-bung. ZentrSteril 2009;17(6):410–415.

16. Brill F.H.H., Daniel R., Wodrich M., Gabriel H.: Standardisiertes Verfahren zur Anschmutzung von Prüfkörpern für Reinigungsversuche. ZentrSteril 2014;22(6):408–411.

17. Rabenau H.F., Schwebke I., Blümel J., Eggers M., Glebe D., Rapp I., Sauerbrei A., Steinmann E., Steinmann J., Will-kommen H., Wutzler P.: Leitlinie der Deutschen Vereinigung zur Bekämp-fung der Viruskrankheiten (DVV) e.V. und des Robert Koch-Instituts (RKI) zur Prüfung von chemischen Desin-fektionsmitteln auf Wirksamkeit gegen Viren in der Humanmedizin. Bundes-gesundheitsblatt 2015; 58: 493–504. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg

18. Wehrl M., Kircheis U.: Methode zur Überprüfung der Reinigungsleistung von Reinigungs-Desinfektionsgeräten für flexible Endoskope. HygMed2011;36(10):402–406.

19. Popov N., Schmitt M., Schulzeck S., Matthies N.: Reliable micromethod for determination of the protein content in tissue homogenates. Acta Biol Med Ger. 1975;34: 1441–1446.

20. Frister H., Meisel H., Schlimme E.: Ein-satzmöglichkeiten der modifiziertenOPA-Methode in der Proteinanalytik. Ernährungs-Umschau 1990; 37(11): 442–445.

21. Candiano G., Bruschi M., Musante L., Santucci L., Ghiggeri G.M., Carnemol-la B., Orecchia P., Zardi L., Righetti P.G.: Blue silver: A very sensitive col-loidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis 2004;25(9):1327–1333

mission für Krankenhaushygiene und Infektionsprävention (KRINKO) beim Robert Koch-Institut (RKI) und des Bundesinstitutes für Arzneimittel und Medizinprodukte (BfArM). Bundesge-sundheitsblatt 2012;55: 1244–1310

4. DGKH, DGSV, AKI: Leitlinie von DGKH, DGSV und AKI für die Validierung und Routineüberwachung maschineller Reinigungs- und thermischer Desin-fektionsprozesse für Medizinprodukte. 5. Auflage. ZentrSteril 2017;25 (Sup-pl.):1–64

5. DGKH, DGSV, AKI, VAH: Leitlinie zur Validierung der manuellen Reinigung und manuellen chemischen Desinfekti-on von Medizinprodukten. mhp Verlag, Wiesbaden, 2013:1–48

6. DGKH, DEGEA, DGSV, DGVS, AKI: Leitlinie zur Validierung maschineller Reinigungs-Desinfektionsprozesse zur Aufbereitung thermolabiler Endosko-pe. ZentrSteril 2011;19 (Suppl.3):1–72

7. DIN EN ISO 15883-1:2014-10: Reini-gungs-Desinfektionsgeräte – Teil 1: All-gemeine Anforderungen, Begriffe und Prüfverfahren. Beuth-Verlag, Berlin

8. AAMI TIR 30:2011: A compendium of processes, materials, test methods, and acceptance criteria for cleaning reusab-le medical devices. Association for the Advancement of Medical Instrumenta-tion. Arlington, VA, USA

9. Michels W.: Diskussion der unterschiedli-chen internationalen Akzeptanzkriterien zur Bewertung der Reinigungswirkung. Proceedings 2015 zum 7. Kolloquium Me-dizinische Instrumente im Rahmen der 47. International Detergency Conference, Düsseldorf, 2015:30–35.

10. Spencer W.: Reiniger: Eine Einführung. ZentrSteril 2016;24(1):42–43

11. Richtlinie 93/42/EWG des Rates vom 14. Juni 1993 über Medizinprodukte. ht-tps://eur-lex.europa.eu/legal-content/DE/TXT/?uri=celex%3A31993L0042

12. Richtlinie 2007/47/EG des Europäi-schen Parlaments und des Rates vom 5. September 2007 zur Änderung der Richtlinien 90/385/EWG des Rates zur Angleichung der Rechtsvorschrif-ten der Mitgliedstaaten über aktive implantierbare medizinische Geräte und 93/42/EWG des Rates über Medi-zinprodukte sowie der Richtlinie 98/8/EG über das Inverkehrbringen von Bio-zid-Produkten. https://eur-lex.europa.eu/legal-content/DE/TXT/?uri=ce-lex%3A32007L0047

13. DIN ISO/TS 15883-5:2006-02: Rei-nigungs-Desinfektionsgeräte – Teil 5:

4.9 Implikationen für die Beurteilung von Instrumentenaufbereitungs- prozessenDie Arbeiten der AG RMT führten auch zu einem umfangreich erweiterten Ver-ständnis bezüglich der vollständigen Erfassung von Restproteingehalten auf (Instrumenten-)Oberflächen nach Rei-nigungsprozessen. Es konnte erstmals eine Methode zur vollständigen Solubi-lisierung von hochmolekularen wasser- unlöslichen Fibrinrückständen so-wie zur reproduzierbaren Quantifizie-rung unter Anwendung der OPA- und BCA-Methode etabliert werden. Fibrin-rückstände können bekanntlich [24, 27, 30, 31] als Rückstände bei unzureichen-den Aufbereitungsprozessen auf Instru-menten verbleiben. Bislang fehlten die notwendigen Methoden zur Probenge-winnung, um eine umfassende Quanti-fizierungvornehmenzukönnen,sodassdavon ausgegangen werden muss, dass es bei der Beurteilung des Restprotein-gehalts auf Realinstrumenten zu einer Unterschätzung der tatsächlich vor-handenen Restkontamination kommen kann.

Danksagung Wir danken für technische Unterstüt-zung und die Durchführung experi-menteller Arbeiten: Alexander Ham-mermeister1, Richard Daniel3, Lea Küss-ner3, Elena Imenova6, Vivian Jenett6, Beate Nitsch7, Heinrich Mußmann13, Sylvia Koch16, Britta Palm16, Katharina Rohafza16.

Wir danken den Firmen Borer Chemie AG, Zuchwil, und Chemische Fabrik Dr. Weigert GmbH & Co. KG, Hamburg, für die Bereitstellung von Testreinigern, der Firma Miele & Cie. KG, Gütersloh für die Anfertigung von Trockengestel-len für Prüfkörper und dem Verbund für Angewandte Hygiene (VAH) für die finanzielle Unterstützung bei der Be-schaffung von Prüfköpern, Schablonen und Exsikkatoren und der organisatori-schen Durchführung der Ringversuche.

Literatur1. Medizinproduktegesetz, MPG. https://

www.gesetze-im-internet.de/mpg/2. Medizinprodukte-Betreiberverord-

nung, MPBetreibV. https://www.geset-ze-im-internet.de/mpbetreibv/

3. KRINKO/BfArM: Anforderungen an die Hygiene bei der Aufbereitung von Me-dizinprodukten – Empfehlung der Kom-


39. Chakrabarty S.: Fibrin solubilizing properties of certain anionic and cati-onic detergents. Thrombosis research 1989;55(4): 511–519.

40. Loewy A.G., Gallant J.A., Dunathan K.: Fibrinase – IV. Effect on fibrin solubi-lity. Journal of Biological Chemistry 1961;236(10):2648–2655.

41. GaffneyP.J.:Molecularaspectsoffibrinclot solubilization. Nature New Biology 1971;234(29): 281–282.

42. Morton T.J., Fürst W., van Griensven M., Redl H.: Controlled release of sub-stances bound to fibrin-anchors or ofDNA. Drug Delivery 2009;16(2):102–107.

30. Michels W., Pieper M.: Eigenschaften von Blut und Einfluss auf die Reini-gung. ZentrSteril 2004;12(5):324–330.

31. Pfeifer M.: Standardisierte Testan-schmutzung Blut 1: Zusammensetzung, Herstellung, Anwendung. ZentrSteril 1998;6(6):381–385.

32. Baumeister C.: Labordiagnostik in der Tierarztpraxis. Ein Handbuch für Tier-medizinische Fachangestellte. 2. erwei-terteAuflage,LehmannsMediaGmbH,2016, ISBN 13: 9783865418814

33. Doolittle R.F., Spraggon G., Everse S.J.: Three-dimensional structural studies on fragments of fibrinogen andfibrin.Current Opinion in Structural Biology 1998;8:792–798.

34. Hunziker E.B., Straub P.W., Haeberli A.: Molecularmorphologyoffibrinmono-mersandearlyoligomersduringfibrinpolymerization. Journal of Ultrastruc-ture and Molecular Structure Research 1988;98(1):60–70.

35. Lugovskoi E.V., Gritsenko P. G., Komi-sarenko S. V.: Molecular Mechanisms of the Polymerization of Fibrin and the Formation of Its Three-Dimensional Network. Russian Journal of Bioorganic Chemistry 2009;35(4):393–410.

36. Berg J.M., Tymoczko J.L., Gatto G.J., StryerL.:StryerBiochemie.8.Auflage2018, Springer Spektrum Verlag, ISBN 978-3-8274-2989-6

37. Friedrich T., Roth K., Gauer J., Heeg P.: Untersuchungen zur Recovery-Rate von Restkontamination bei der Validierung von Reinigungs-Desinfektionsgeräten nach EN DIN 15883 Teil 1. ZentrSteril 2007;15(2):93–100.

38. Roach D., Gehrke C.W.: The hydrolysis of proteins. Journal of Chromatography A 1970;52:393–404.

22. DIN EN ISO 483:2006-02: Kunststoffe – Kleine Kammern für die Konditionie-rung und Prüfung bei konstanter relati-ver Luftfeuchte über wässrigen Lösun-gen. Beuth-Verlag, Berlin

23. Desbuquois C., Richard M., Khammo N., McDonnel G., Pineau L.: Bewertung künstlicher Prüfanschmutzungen für Studien zur Reinigungswirksamkeit. ZentrSteril 2010;18(1):19–35.

24. Buchrieser N., Buchrieser V., Freund-linger T., Gehrer M., Getreuer H., Gru-ber A., Haljko M., Hell M., Koller W., Lachner P., Miorini T., Mittermayer H., Palmisano G., Percht A., Prüfert-Freese U., Schröttner J., Steinhart A., Sucho-mel M., Weinmayr B.: Prüfmethoden (und Prüfanschmutzungen) für Rei-nigungs-Desinfektionsgeräte für chir-urgische Instrumente im praxisnahen Vergleich. ZentrSteril 2009;17(5):327–337.

25. Crutwell M.: A comparison of sur-gical instrument test soils publis-hed in ISO/TS 15883-5. ZentrSteril 2008;16(4):256–265.

26. RosenbergU.:Qualifizierung vonPro-zesschemikalien. ZentrSteril 2017; 25(6): 382–388.

27. Kampf G., Bloß R., Martiny H.: Surface fixationofdriedbloodbyglutaraldehy-de and peracetic acid. J. Hosp. Infec. 2004;57:139–143.

28. Moritz A. (Hsg.): Klinische Labordia-gnostik in der Tiermedizin. 7. Auflage2013, Schattauer/Thieme-Verlag, Stutt-gart, ISBN: 9783794527373

29. Artmann G.M., Kelemen C., Porst D., Büldt G., Chien S.: Temperature transi-tion of Protein properties in human red blood cells. Biophys. J. 1998;75:3179–3183.

Verlag und Copyright:© 2018 bymhp Verlag GmbHKreuzberger Ring 4665205 WiesbadenISSN 0942-6086

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