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Aus der Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover

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Modifizierte durchflusszytometrische Methode

zum empfindlicheren Nachweis der Produktion

von reaktiven Sauerstoffspezies neutrophiler

Granulozyten in vitro.

INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer

Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von

Liliya Mironova aus Omsk, Russland

Hannover 2004

Wissenschaftliche Betreuung : Univ.-Prof. Dr. med. vet., Dr. h.c. W. Leibold 1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. med. vet., Dr. h.c. W. Leibold

2. Gutachter: Prof. Dr. rer. nat. D. Steinhagen

Tag der mündlichen Prüfung: 4. Juni 2004

Für

Juri und meine Eltern

in Liebe und Dankbarkeit

INHALTVERZEICHNIS

Verzeichnis der Abkürzungen und Termini technici

Glossar 1 Einleitung und Zielsetzung 13

2 Literaturübersicht 14

2.1 Polymorphkernige neutrophile Granulozyten 14

2.1.1 Entwicklung und morphologische Eigenschaften neutrophiler

Granulozyten

14

2.1.2 Phänotypische Eigenschaften von neutrophilen Granulozyten 18

2.1.3 Funktionelle Eigenschaften neutrophiler Granulozyten 20

2.1.3.1 Extravasation und Chemotaxis 20

2.1.3.2 Phagozytose 22

2.1.3.3 Bildung reaktiver Sauerstoffspezies 24

2.1.3.3.1 Die in-vitro-Beurteilung der Bildung reaktiver Sauerstoffspezies 26

2.1.3.4 Zytotoxizität 28

2.2 Aufgaben der Granulozyten im Rahmen der Infektionsabwehr 28

3 Material und Methoden 30

3.1 Geräte und Materialien 30

3.1.1 Geräte, Klinik- und Laborbedarf 30

3.1.2 Reagenzien und andere Verbrauchsmaterialien 33

3.1.3 Puffer, Lösungen und Medien 35

3.1.4 Materialien für die Separation, Differenzierung und

Vitalitätsbestimmung von Zellen

36

3.1.5 Materialien für die Durchflusszytometrie 37

3.1.6 Materialien zur durchflusszytometrischen Bestimmung absoluter

Zellzahlen

37

3.1.7 Materialien für die Bestimmung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) 38

3.1.8 Probanden 39

3.2 Methoden 41

3.2.1 Gewinnung und Isolierung von Leukozyten aus dem Blut 41

3.2.1.1 Blutentnahme 41

3.2.1.2 Isolierung der Leukozyten aus dem peripheren Blut 41

3.2.1.2.1 Isolierung boviner Leukozyten aus dem peripheren Blut 41

3.2.1.2.1.1 Isolierung der polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten (PMN) 41

3.2.1.2.1.2 Separation der Gesamtleukozyten 42

3.2.1.2.2 Isolierung equiner Leukozyten aus dem peripheren Blut 43

3.2.1.2.3 Isolierung caniner Leukozyten aus dem peripheren Blut 43

3.2.1.2.4 Isolierung humaner Leukozyten aus dem peripheren Blut 44

3.2.1.3 Isolierung boviner Thrombozyten aus dem peripheren Blut 44

3.2.2 Durchflusszytometrie 45

3.2.3 Bestimmung der Zellzahl 46

3.2.3.1 Herstellung der Referenzzellen zur Zellzahlbestimmung 47

3.2.3.1.1 Referenzzellmethode (durchflusszytometrische Bestimmung absoluter

Zellzahlen)

48

3.2.4 Leukozytendifferenzierung 50

3.2.5 Vitalitätsbestimmung 51

3.2.6 Bestimmung reaktiver Sauerstoffspezies 52

3.2.6.1 Herstellung der eingesetzten Zellsuspension 52

3.2.6.2 Vorbereitung des Testansatzes (der Reagenzien für den ROS-Test) 52

3.2.6.3 Ansatz der Percoll-Kissen 53

3.2.6.4 Durchführung der ROS-Tests 53

3.2.6.4.1 Percoll-Test: Induktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) auf Percoll-

Kissen

53

3.2.6.4.2 Plastik-Test: ROS-Induktion auf Plastik ohne Percoll-Kissen 54

3.2.6.5 Durchflusszytometrische Auswertung der ROS-Produktion 54

3.2.7 Datenverarbeitung und statistische Auswertung 57

4 Ergebnisse 58

4.1 Zellverluste und ihre Ursachen 58

4.1.1 Plastikadhärenz als Ursache für Zellverluste 58

4.1.2 Einfluss von PMA, Plastik oder Percoll auf die Vitalität der Zellen 61

4.1.3 Zellverluste in Probenröhrchen 63

4.1.4 Zellverluste in Mikrotiterplatten unterschiedlicher Beschaffenheit 65

4.2 Aufbau eines modifizierten ROS-Verfahrens 67

4.2.1 Vergleich zwischen sequentieller und gleichzeitiger Zugabe von PMA

und DHR bei der Bestimmung reaktiver Sauerstoffspezies

67

4.2.2 Einfluss von Percoll und von Plastik auf die Morphologie und die

„spontane“ ROS-Bildung von PMN

70

4.2.3 Einfluss von Percoll und Plastik auf die Bildung reaktiver

Sauerstoffspezies (ROS) von PMN nach konzentrationsabhängiger

Stimulation mit PMA

72

4.2.4 Relevanz der Aussagen für andere Spezies 78

4.3 Einfluss von zellulären Bestandteilen auf die PMN des Blutes 85

4.3.1 Einfluss von MNC auf die Bildung von Sauerstoffmetaboliten durch

die PMN des Blutes

85

4.3.2 Einfluss von Thrombozyten auf die Bildung von

Sauerstoffmetaboliten durch die PMN des Blutes

87

5 Diskussion 90

5.1 Konzeptionelle Überlegungen zu Untersuchungen über den Einfluss

von Percoll™ und von Plastik auf die funktionelle Kapazität

neutrophiler Granulozyten

90

5.2 Erarbeitung einer Methode zur Bestimmung der ROS-Bildung von

PMN

91

5.3 Erarbeitung optimaler Inkubationsbedingungen für die ROS-Bildung


93

5.4 Einfluss von Percoll auf PMN 94

5.5 Testoptimierung 94

6 Zusammenfassung 96

7 Summary 99

8 Literaturverzeichnis 102

Verzeichnis der Abkürzungen und Termini technici

Abb. Abbildung ADCC antibody dependent cellular cytotoxicity –

Antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität Aqua dest. Aqua destillata – destilliertes Wasser Aqua tridest. Aqua tridestillata – dreifach destilliertes Wasser AICC antibody independent cellular cytotoxicity –

Antikörper-unabhängige zelluläre Zytotoxizität BLAD bovine leukocyte adhesion deficiency –

bovine Leukozytenadhäsionsdefizienz Br- Bromid-Ionen BSA Bovines Serum Albumin bzw. beziehungsweise C3, C3a, C3b, iC3b, C4b, C5, C5a, C5b

Complement factor(s) – Komplementkomponenten und ihre Spaltprodukte

ca. circa CD cluster of differentiation –

System zur Bezeichnung zellulärer Differenzierungsantigene CFU-GEMM colony forming unit of granulocytes, erythrocytes, monocytes and

megacaryocytes Kolonie bildende Einheit an gemeinsamen Stammzellen für Granulozyten, Erythrozyten, Monozyten und Megakaryozyten

CFU-GM colony forming unit of granulocytes and monocytes Kolonie bildende Einheit an gemeinsamen Stammzellen für Granulozyten und Monozyten

CGD chronic granulomatous disease – chronische septische Granulomatose

Cl- Chlorid-Ionen CLAD canine leukocyte adhesion deficiency –

canine Leukozytenadhäsionsdefizienz CO2 Kohlenstoffdioxid CR-1, 3 und 4 Complement receptor – Komplementrezeptor-1, 3 und 4 CRP C-reaktives Protein Cy™5 Cytochrom 5 Cy™5-DαM IgG (H+L) Mit dem Fluorochrom Cy™5 konjugierte (donkey anti mouse)

Esel-Antikörper-mit Spezifität gegen schwere und leichte Ketten (heavy and light chains) von murinem IgG

d.h. das heisst DCF Dichlorofluoreszein DCFH Dichlorofluoreszin

DCFHDA Dihydrochlorofluoreszindiacetat DHE Dihydroethidium DHR 123 Dihydrorhodamin 123 DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium mit L-Glutamin und

NaHCO3 DMSO Dimethylsulfoxid EB Ethidiumbromid EDTA Ethylendiamintetraacetat ELISA enzyme-linked immunosorbent assay

Enzymgekoppelter Immunadsorptionstest Eos. Gr. eosinophile Granulozyten Fa. Firma FACS fluorescence activated cell scanner –

Fluoreszenz-aktiviertes Zellanalysegerät, Durchflusszytometer Fc fragment cristalline – kristallisierbares Antikörperfragment des

konstanten Teils der schweren Immunglobulinketten FITC Fluorescein Isothiocyanate FL 1, 2, 3, 4 Fluoreszenzemmissionsfenster nach Anregung durch Argonlaser =

488 nm: 1=grün: 500-560 nm, 2=orange: 543-627 nm, 3=rot: >649 nm, und nach Anregung durch Diodenlaser = 635 nm: 4=rot: 645-676 nm

FSC forward scatter – Vorwärtsstreulicht g Gramm G-CSF granulocyte–colony stimulating factor –

Granulozyten-Wachstumsfaktor GM-CSF granulocyte–monocyte–colony stimulating factor –

Granulozyten-Monozyten-Wachstumsfaktor Gra Granulozyt(en) H2O2 Wasserstoffperoxid IAP Integrin-Associated-Protein – Integrinassoziiertes Protein ICAM intercellular adhesion molecule –

interzelluläres Adhäsionsmolekül IgG Immunglobulin G IgM Immunglobulin M J- Jodid-Ionen IL-1, 2, usw. Interleukin-1, 2, usw. LAD I Leucocyte adhesion protein deficiency Typ I –

Leukozytendefizienz Typ I LFA1 Leukozyten-funktionsassoziiertes-Antigen 1 LPS Lipopolysaccharid LRI Leukocyte-Response-Integrin

Leukozytereaktionsintegrin LTB4 Leukotriene B4

Lym Lymphozyt(en) Mac-1 macrophage receptor 1 – Makrophagenantigen 1 mAk monoklonaler Antikörper MHC Major Histocompatibility Complex –

Haupthistokompatibilitätskomplex µ Mikro (x 10-6) mg Milligramm mL Milliliter Min Minute(n) mmol millimolar M Mol MNC mononuclear cells – mononukleäre Zellen (umfassen v.a.

Lymphozyten, Monozyten und Makrophagen) Mon Monozyt(en) MW arithmetischer Mittelwert n Stichprobengröße NADPH Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphat NBT Nitroblautetrazolium nm Nanometer (= 10-9

m) Nr. Nummer o.g. oben genannt 1O2 Singulet-Sauerstoff O2 Molekularer Sauerstoff O2˙¯ Superoxidanion OH˙ Hydroxylradikal OH¯ Peroxidanion PBS phospate buffered saline –

Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (2xPBS = doppelt konzentriertes PBS)

PECAM platelet endothelial cell adhesion molecule Adhäsionsmolekül (CD31) auf Thrombozyten, Leukozyten und Endothelzellen

PFA Paraformaldehyd PJ Propidiumjodid PMA Phorbol-Myristat-Acetat PMN polymorphkernige neutrophile Granulozyten R-123 Rhodamin-123 ROS reactive oxygen species – reaktive Sauerstoffmetaboliten RT Raumtemperatur s. siehe s.o. siehe oben SD standard deviation – Standardabweichung SSC side scatter – Seitwärtsstreulicht

Tab. Tabelle TNF-α tumor necrosis factor-α – Tumornekrosefaktor-α To-Pro-3 To-Pro-3iodid u. und u.a. unter anderem usw. und so weiter v.a. vor allem vgl. vergleiche x g multipliziert mit der Gravitationsbeschleunigung (9,81 m/s²) z.B. zum Beispiel z.T. zum Teil ZÜ Zellkulturüberstand

Glossar Basopenie Verringerung der absoluten Zahl basophiler Granulozyten pro

Blutvolumen unter die physiologische Norm Blut-PMN Aus dem peripheren venösen Blut gewonnene

segmentkernige neutrophile Granulozyten Eosinopenie Verringerung der absoluten Zahl eosinophiler Granulozyten

pro Blutvolumen unter die physiologische Norm Falcon Röhrchen-förmiges Reaktionsgefäß (50 mL) aus Kunststoff Interphase Ansammlung von Zellen nach einer Dichtezentrifugation

oberhalb einer Phase definierter Dichte Neutrophilie Steigerung der absoluten Zahl segmentkerniger neutrophiler

Granulozyten pro Blutvolumen über die physiologische NormNeutrozytose Steigerung der absoluten Zahl segmentkerniger neutrophiler

Granulozyten pro Blutvolumen über die physiologische NormPellet Ansammlung von Zellen zumeist am Boden eines

Reaktionsgefäßes meist nach Zentrifugation oder Spontansedimentation

well Vertiefung einer Zellkulturplatte

Einleitung und Zielsetzung

13

1 Einleitung und Zielsetzung

Die um die Jahrhundertwende von dem russischen Zoologen ELIE METCHNIKOFF

(1884) entdeckten polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten (STICKLE 1996) sind

ein wichtiger Bestandteil der unspezifischen Abwehr des Körpers. Sie schützen den

Organismus vor schädigenden Einflüssen in Form von Mikroorganismen oder anderen

Fremdkörpern, können jedoch auch apoptotische, geschädigte, überalterte oder opsonisierte

körpereigene Zellen erkennen und beseitigen. Sie tätigen somit gleichzeitig unerlässliche

Abwehr- und Aufräumarbeiten. Eine Störung dieser Zellpopulation und ihrer Funktionen

führt oft zu schweren Erkrankungen des gesamten Organismus und möglicherweise zum

Tod. Es ist daher sehr wichtig, rechtzeitig mittels labortechnischer Verfahren

Funktionsdefekte der neutrophilen Granulozyten aufzudecken. Eine der wichtigsten

funktionellen Eigenschaften der neutrophilen Granulozyten (PMN) ist die Bildung reaktiver

Sauerstoffspezies (ROS). Für die Bestimmung der Bildung reaktiver Sauerstoffspezies

werden verschiedene Verfahren, wie die Erfassung der Lichtemission über

Photonenverstärker (Lumineszenz) oder die photometrische Darstellung oxidativer

Reaktionsprodukte eingesetzt. In letzter Zeit kommen zunehmend durchflusszytometrische

Messverfahren zur Anwendung. Es werden die relative Anzahl und Intensität von positiven

und negativen PMN bewertet. Probleme bereiten allerdings starke Schwankungen der

Messergebnisse bei quantitativer Auswertung.

Die vorliegende Arbeit versucht Ursachen für diese Unregelmässigkeiten zu ergründen und,

wenn möglich, zu beseitigen. Ziel ist eine Optimierung und Standardisierung geeigneter

durchflusszytometrischer Verfahren für die quantitative Messung der Bildung reaktiver

Sauerstoffspezies beim Rind. Zudem soll die Übertragbarkeit dieser Technik auf andere

Spezies geprüft werden.

Literaturübersicht

14

2 Literaturübersicht

2.1 Polymorphkernige neutrophile Granulozyten (PMN)

Bei der unspezifischen zellulären Abwehr zählen PMN neben Monozyten und

Makrophagen zu der wichtigsten Zellpopulation. Zur Abwehr von Fremdorganismen

benötigen sie keine Spezifität gegenüber Antigenstrukturen. Ihre Hauptaufgabe verrichten

sie bei akuten Entzündungen und in Zusammenarbeit mit geeigneten Antikörpern und

Komplementfaktoren bei der Bekämpfung parasitärer und bakterieller Infektionen. Nach

ihrer Bildung im Knochenmark werden sie in den Blutstrom abgegeben, in dem sie nur

wenige Stunden zirkulieren (WECKER 1990, KLEIN 1991). Die Lebensdauer von PMN

wird bei Mensch (ZINK 1990) und Ratte mit 2 bis 3 Tagen angegeben (ROITT et al.

1995); die Halbwertszeit von humanen PMN beträgt nach DALE et al. (1998) ungefähr 19

Stunden. Nach JANEWAY et al. (2002) zählt die Lebensdauer von PMN nur wenigen

Stunden.

2.1.1 Entwicklung und morphologische Eigenschaften von neutrophilen

Granulozyten

Morphologisch stellen sich PMN als im Durchmesser 10-12 µm messende Zellen dar

(DORE et al. 1990).

Die Granulozyten erhielten ihre Bezeichnung auf Grund der deutlichen Granula im

Zytoplasma. Wegen ihres unregelmäßig geformten Zellkerns nennt man die ausgereifte

Formen auch polymorphkernige neutrophile Granulozyten (PMN). Neben dem mehrfach

gelappten Kern zählen die lichtmikroskopisch neutralen (azurophilen, primären) Granula zu

den charakteristischen morphologischen Merkmalen ausgereifter neutrophiler

Granulozyten. Ihre primären Granula sind reich an mikrobiziden Enzymen wie Hydrolasen,

Lysozym, Myeloperoxidasen, Proteinasen, sauren Hydrolasen und Histaminase sowie an

Literaturübersicht

15

kationischen Proteinen. Sekundäre (spezifische) Granula enthalten zudem noch Lactoferrin

und Kollagenasen (GEMSA et al. 1991, KLEIN 1991).

Bovine neutrophile Granulozyten haben noch eine dritte Art von Granula im Zytoplasma.

Diese Granula sind größer als die anderen Granula und enthalten kationische antibakterielle

Proteine, wie z.B. Bactenecin (ROMEO et al. 1988), Indolicin und β-Defensin (SELSTED

et al. 1992, 1993).

Wie jede Blutzelle haben auch die neutrophilen Granulozyten ihren Ursprung in den

pluripotenten hämatopoetischen Stammzellen des Knochenmarks (ROITT et al. 1995, da

SILVA et al. 1994, JANEWAY et al. 2002). Der Stammzellpool der Blutzellen wird in der

Embryonalphase gebildet und erhält sich danach durch Replikation selbst (LICHTMAN

1983, KWON 1987, da SILVA et al. 1994).

Die hämatopoetischen Wachstumsfaktoren, vor allem Stammzellfaktor (SCF) und

Interleukin 3 (IL-3) regen die Stammzellen zur Replikation an. Der SCF wirkt spezifisch

auf die Teilung der pluripotenten Stammzellen ein, wogegen IL-3 nahezu alle

haematopoetischen Vorläuferzellen einschließlich der pluripotenten Stammzellen zur

Teilung anregt (BAUER 1994). Interleukine werden von aktivierten Blutzellen vermehrt

gebildet und abgegeben. Neben IL-3 wirken Interleukin 6 (IL-6), Interleukin 9 (IL-9),

Interleukin 11 (IL-11) (da SILVA et al. 1994) und Interleukin 2 (IL-2) (BAUER 1994)

positiv auf die Stammzell-und Vorläuferzellreplikation ein. Aus einem mitotischen

Teilungsprozess entstehen zum einen die multipotenten, lymphatischen Vorläuferzellen

als Ausgangspunkt der lymphozytären Zellreihe, zum anderen die für die Granulopoese

weitaus wichtigeren multipotenten, myeloischen Vorläuferzellen. Diese sind Ursprung

aller Zellen der myeloischen Linie wie Erythrozyten, Thrombozyten, Monozyten,

eosinophiler, basophiler und neutrophiler Granulozyten (LICHTMAN 1983, da SILVA et

al. 1994, KRAFT et al. 1997) und werden deshalb auch colony forming unit of

granulocytes, erythrocytes, monocytes and megacaryocytes (CFU-GEMM) genannt (da

SILVA et al. 1994). Im Rahmen der Granulozytopoese entwickelt sich während der

Vermehrungsphase im Knochenmark aus der myeloischen Vorläuferzelle durch

mitotische Prozesse der Myeloblast. Dieser Zelltyp ist ca. 10-15 µm groß und hat ein

hohes Kern/Plasma-Verhältnis. Im Zytoplasma befinden sich reichlich Mitochondrien und

freie Polysomen mit hydrolytischen und oxidativen Enzymen (da SILVA et al. 1994). Der

Literaturübersicht

16

Myeloblast teilt sich in Vorläuferzellen für eosinophile und basophile Granulozyten und

in die gemeinsamen Vorläuferzellen von neutrophilen Granulozyten und Makrophagen,

der colony forming unit of granulocytes and monocytes (CFU-GM). Diese nächste

Zellstufe wird auch Promyelozyt genannt. Er ist mit 15-25 µm der größte Vertreter in der

granulozytären Zellreihe (LIEBICH 1993, da SILVA et al. 1994). Sein Zellkern ist von

runder Gestalt und im Zytoplasma von zahlreichen peroxidasepositiven, d.h. azurophilen

Granula umgeben. Über die erneute Zellteilung entsteht der neutrophile Myelozyt

(KWON 1987, LIEBICH 1993, da SILVA et al. 1994, KRAFT et al. 1997). Hierbei

kommt es zur Differenzierung in peroxidase-positive, azurophile Granula und in die

kleineren, peroxidase-negativen, „spezifischen“ Granula. Die Zelle ist ca. 10µm groß, hat

einen gezackten Zellkern und einen sekretorisch aktiven, prominenten Golgiapparat (da

SILVA et al. 1994). Der Myelozyt ist der letzte zur mitotischen Teilung fähige Vertreter

der Granulozytopoese. Dessen Nachkomme ist der Metamyelozyt. Im

Entwicklungsprozess der neutrophilen Granulozyten ist jetzt die Reifungsphase im

Knochenmark erreicht. Ab diesem Zeitpunkt sind die Zellen im Notfall zur

Phagozytoseaktivität fähig (KWON 1987), d.h. die Nachkommen der Vorläuferzellen

erlangen die Fähigkeit zu spezifischen Funktionen, verlieren gleichzeitig jedoch die

Möglichkeit zur Replikation (da SILVA et al. 1994). Ein Drittel der Zellen im

Knochenmark gehört zum aktiven, sich teilenden Pool, die Granulopoese betreffend sind

das Myeloblasten, Promyelozyten und Myelozyten. Zwei Drittel gehören zum maturen,

sich nicht teilenden Pool (da SILVA et al. 1994). Der Metamyelozyt hat einen

sekretorisch inaktiven Golgiapparat. Im Zytoplasma befinden sich gemischte

Granulapopulationen, Ansammlungen von Glykogenpartikeln und wenige Mitochondrien.

Während der Reifung verändert sich das Aussehen des Zellkerns und die Zellgrösse

nimmt kontinuierlich ab (LIEBICH 1993).

Der neutrophile Metamyelozyt („jugendlicher“ Granulozyt) weist einen bohnen- oder

nierenförmigen Zellkern mit grobscholligem Chromatin auf. Der daraus entstehende

stabkernige neutrophile Granulozyt ist unter physiologischen Bedingungen das erste

Stadium im Blut. Die Kerngestalt ist hierbei verschmälert, C- oder S-förmig ohne

erkennbare Schnürfurchen, und die Chromatinschollen sind noch gröber

(Leopardenmuster). Nach weiterer Reifung ist das Chromatin dem des stabkernigen

Literaturübersicht

17

ähnlich, der Kern weist aber drei bis fünf mit fädigen Verbindungen aneinandergereihte

Segmente auf (segmentkerniger neutrophiler Granulozyt). Als segmentkerniger

neutrophiler Granulozyt ist die Funktionsphase erreicht und die Zellen sind bereit, ins

Blut abgegeben zu werden, um von dort aus ihre Aufgaben wahrzunehmen (da SILVA et

al. 1994, KRAFT et al. 1997). Eine positive Wirkung auf die Ausdifferenzierung und

Reifung der Granulozyten haben die haematopoetisch wirksamen Faktoren granulocyte–

monocyte–colony stimulating factor (GM-CSF) und granulocyte–colony stimulating

factor (G-CSF) (TILL u. THIELMANN 1989, BAUER 1994, da SILVA et al. 1994),

gebildet u.a. von aktivierten Granulozyten und Makrophagen, unterstützt von IL-3 und

IL-6 (BAUER 1994).

Nach der Freisetzung aus dem Knochenmark zirkulieren die PMN im Blutstrom, wobei sie

besonders im Kapillargebiet engen Kontakt zum Endothel haben. Dieser Kontakt zu

Endothelzellen wird über Adhäsionsmoleküle vermittelt.

Neutrophile Granulozyten stellen den Hauptanteil der zirkulierenden Granulozyten dar

(GEMSA et al. 1991). Bei Mensch, Pferd, Hund und Katze (s. Tab.1) sind die neutrophilen

Granulozyten die mengenmäßig größte Fraktion der weißen Blutzellen (da SILVA et al.

1994, KRAFT et al. 1997). Beim Rind stellen die segmentkernigen neutrophilen

Granulozyten mit 25-45% neben den Lymphozyten (45-65%) der insgesamt 4.000 bis

12.000 Leukozyten pro µL Blut die zweitstärkste Leukozytenpopulation dar (KRAFT und

DÜRR 1999). In geringeren Anteilen treten bei gesunden Rindern eosinophile (1-10%),

basophile (0-2%) und stabkernige neutrophile Granulozyten (0-3%) auf (HOFMANN

1992).

Literaturübersicht

18

Tab. 1: Differenzialblutbild (Roche Lexikon Medizin 1991, KRAFT et al. 1997)

Zellform Hund Katze Pferd Mensch % % % % stabkernige Granulozyten

0-4 0-4 0-6 3-5

segmentkernige Granulozyten

55-75 60-78 45-70 50-70

Lymphozyten 12-30 15-38 20-45 25-40 Monozyten 0-4 0-4 0-5 2-6 eosinophile Granulozyten

0-6 0-6 0-4 2-6

basophile Granulozyten

bis 1 bis 1 0-2 0-1

absolute Zellzahl /µL /µL /µL /µL stabkernige Granulozyten

0-500 0-600 0-600 120-450

segmentkernige Granulozyten

3000-9000 3000-11000 3000-7000 2000-6300

Lymphozyten 1000-3600 1000-4000 1500-4000 1000-3600 Monozyten 40-500 40-500 40-400 80-540 eosinophile Granulozyten

40-600 40-600 40-350 80-360

basophile Granulozyten

bis 40 bis 40 0-150 0-90

2.1.2 Phänotypische Eigenschaften neutrophiler Granulozyten

Polymorphkernige neutrophile Granulozyten exprimieren an ihrer Oberfläche zahlreiche

Moleküle, die entsprechend ihrer Antigenstruktur und Funktion bezeichnet werden.

Darüber hinaus kommen Oberflächenmoleküle bei Interaktionen mit anderen Zellen zum

Tragen.

RÖNSCH (1992) teilt die Oberflächenstrukturen von Leukozyten in drei funktionelle

Gruppen ein:

1) Antigenspezifische Rezeptormoleküle.

Sie finden sich auf der Oberfläche von Lymphozyten und vermitteln die Antigenerkennung.

Bei Granulozyten kommen sie nicht vor (RÖNSCH 1992).

2) Die Transplantationsantigene („major histocompatibility complex“, MHC).

Literaturübersicht

19

Sie werden auf allen kernhaltigen Zellen des Körpers außer auf Spermien gefunden. Durch

die Präsentation endogener Antigene ermöglichen sie T-Zellen die Unterscheidung

zwischen körpereigenen und –fremden Proteinen sowie zwischen gesunden und entarteten

Strukturen. MHC-Klasse-I-Moleküle werden innerhalb einer Spezies polymorph, innerhalb

eines Individuums aber konstant exprimiert (SCHUBERTH et al. 1991). Dagegen kommen

MHC-Klasse-II-Moleküle in der Regel konstitutiv nur auf monozytären Zellen und B-

Lymphozyten vor. PMN können jedoch zu einer Expression angeregt werden. MHC-II-

Moleküle präsentieren den T-Zellen vornehmlich extrazellulär aufgenommene

Proteinsequenzen.

3) Differenzierungsantigene (CD-Moleküle).

Beim Menschen sind bisher über 260 verschiedene Differenzierungsantigene bekannt. Die

Expression von Oberflächenmolekülen und deren Dichte auf der Zelloberfläche wird durch

zelluläre Kontakte und humorale Faktoren reguliert. Sie werden je nach Funktion auf allen

Zellen in unterschiedlicher Menge und Zusammensetzung exprimiert. Sie ermöglichen eine

genauere Differenzierung von Zellpopulationen als es aufgrund morphologischer

Charakteristika möglich ist. Der Nachweis von Differenzierungsantigenen findet in diesem

Fall über monoklonale Antikörper (mAk) statt. Aufgrund des Reaktionsverhaltens von mAk

gegenüber Zelloberflächenmolekülen werden diese einem „Cluster of differentiation“ (CD)

zugeordnet (SCHUBERTH et al. 1991).

Unter den Differenzierungsantigenen sind für PMN v.a. funktionsassoziierte

Oberflächenmoleküle, beispielsweise bei der transendothelialen Migration von Bedeutung.

Dieser Prozess kann nur unter Beteiligung der sogenannten CD11a/18-Integrine der PMN

ablaufen. Diese Membranstruktur wird auch Leukozyten-Funktionsassoziiertes-Antigen

(LFA-1) genannt. Dieses stellt ein Adhäsionsmolekül dar, welches an das interzelluläre

Adhäsionsmolekül-1 („intercellular adhesion molecule“, ICAM-1), das auf aktivierten

Endothelzellen exprimiert werden kann, bindet. CD11b bildet zusammen mit CD18 den

Komplementrezeptor-3 (CR-3 oder Mac-1), der an der Extravasation und an der

Vermittlung der Phagozytose und der ROS-Bildung der PMN beteiligt ist (SMITH 1993,

ROITT et al. 1995). Die gleichen Funktionen erfüllt auch der Komplementrezeptor-4 (CR-

4), der aus der Zusammensetzung von CD11c und CD18 entsteht (ROITT et al. 1995).

Literaturübersicht

20

Bei der Leucocyte adhesion protein deficiency Typ I (LAD I), einer autosomal oder x-

chromosomal rezessiv vererbten Erkrankung (GIGER et al. 1987, TROWALD-WIGH et al.

1993), kommt es zu einer verminderten oder sogar vollkommen ausbleibenden

Exprimierung von Oberflächenantigenen der ß2-Integrinfamilie, wie LFA-1 und Mac-1.

Verursacht wird der genetische Defekt durch Punktmutation in der Codierungsregion

ITGB2 von CD18, also der ß-Untereinheit der Integrine (ARNAOUT et al. 1990, KIJAS et

al. 1999). Der Typ I dieser Erbkrankheit ist bisher bei Mensch (LAD I) (ARNAOUT et al.

1985, 1990, 1990a), Rind (BLAD) (MULLER et al. 1994, GERARDI 1996, MEYLAN et

al. 1997) und Hund (CLAD) (GIGER et al. 1987, KIJAS et al. 1999, TROWALD-WIGH et

al. 1992, 1993, 2000) beschrieben. Da keine funktionsfähigen CD18-abhängigen

Oberflächenmoleküle ausgebildet werden, ist die Adhäsion der PMN an Endothelzellen und

somit ihre Extravasation gestört (SMITH und ANDERSON 1991).

Die Aktivierung von Granulozyten durch Entzündungsmediatoren oder chemotaktische

Substanzen führt zu einer Verminderung oder Erhöhung der Expressionsdichte von

Oberflächenmolekülen. Da durch die Modulation membranständiger Strukturen die

Funktionalität von Zellen beeinflusst werden kann, besitzt der Nachweis von

Oberflächenmolekülen diagnostische Bedeutung (RÖNSCH 1992). Der Nachweis kann

mittels fluorochromkonjugierter monoklonaler Antikörper unter Verwendung von

immunzytochemischen (ELISA, „enzyme-linked immunosorbent assay“),

fluoreszenzmikroskopischen oder durchflusszytometrischen Methoden geführt werden

(GUIDRY et al. 1992, LOHMEYER et al. 1994, MAGYAR et al. 1995).

2.1.3 Funktionelle Eigenschaften neutrophiler Granulozyten

2.1.3.1 Extravasation und Chemotaxis

Die Wanderung von Leukozyten aus dem Blutgefäß heraus bezeichnet man als

Extravasation (JANEWAY und TRAVERS, 1997). Dieser Prozess kann entweder durch

die PMN selbst oder durch die Gefäßendothelzellen des betroffenen Gewebes in Gang

gebracht werden (ZIMMERMAN et al. 1992, HOGG 1992).

Literaturübersicht

21

Unter Chemotaxis versteht man die gerichtete Bewegung von Zellen entlang eines

Konzentrationsgradienten bestimmter chemoattraktiver Faktoren. Das können z.B.

Komplementkomponenten (z.B. C3a und C5a), von lokalen Zellen sezernierte Zytokine

(z.B. Interleukin-8, IL-8), bakterielle Toxine oder endogene Pyrogene (z.B.

Lipopolysaccharide, LPS) sein, die u.a. PMN aus dem Kapillarsystem ins betreffende

Gebiet locken. Die PMN reagieren auf diese Signale, indem sie ihre Expression von

Adhäsions-vermittelnden Oberflächenmolekülen ändern. Dadurch kommt es zu reversiblen

Anheftungen der PMN an die stimulierten Endothelzellen. So wird die Wirkung der

angreifenden Scherkräfte gemindert und die Granulozyten rotieren durch die reversible

Adhäsion langsam an der Epithelwand entlang („rolling“). Nach JANEWAY und

TRAVERS (1997) wird dieser Vorgang dabei durch LTB4, C5a und Histamin-aktivierte P-

Selektine ausgelöst, die in Granula von Epithelzellen (Weibel-Palade-Körperchen)

enthalten sind. Die Expression von P-Selektinen läuft innerhalb weniger Minuten ab,

wohingegen die auch beteiligten E-Selektine erst Stunden nach der Interaktion mit TNF-α

oder LPS aktiv werden (NORMAN et al. 1995). Die Selektine erkennen

Kohlenhydratepitope bestimmter Glykoproteine auf Leukozyten (JANEWAY und

TRAVERS 1997). Nachdem die Leukozyten durch das „rolling“ an Geschwindigkeit

verloren haben, kommt es zur Adhärenz, wobei besonders Leukozytenintegrine

(CD11a/CD18 (LFA-1 (Leukozyten-Funktionsassoziertes-Antigen 1)) und CD11b/CD18

(CR3 oder Mac-1)) und L-Selektin eine wichtige Funktion übernehmen. IL-8 ruft

Konformationsänderung von LFA-1 und CR3 hervor und erhöht damit deutlich die

Affinität dieser Moleküle für ihre Liganden. Die nun feste Bindung mit

Oberflächenstrukturen der Gefäßendothelzellen (z. B. ICAM-1 (interzelluläres

Adhäsionsmolekül)) führt zur Diapedese der PMN durch die Endothelwand. Diese wird

wiederum durch die Leukozytenintegrine und durch das immunglobulinähnliche Molekül

PECAM (platelet endothelial cell adhesion molecule, CD31) vermittelt. Letzteres wird

sowohl von Endothelzellen als auch durch Leukozyten exprimiert (JANEWAY und

TRAVERS 1997). Diapedese findet zwischen den Kontaktstellen von 3 Endothelzellen

(„tricellular corners“) statt. Die PMN durchstoßen die Basalmembran mit Hilfe

proteolytischer Enzyme (JANEWAY und TRAVERS 1997, FRANK 2000). Beim Kontakt

des an der Phagozytenoberfläche sitzenden LRI (Leukocyte-Response-Integrin) mit dem

Literaturübersicht

22

Basalmembranprotein Eutactin kommt es zur weiteren Aktivierung der Granulozyten. Das

mit LRI vergesellschaftete IAP (Integrin-Associated-Protein) fungiert als Ca2+-Kanal. Bei

Kontakt erfolgt ein starker intrazellulärer Ca2+-Anstieg. Die PMN zeigen eine erhöhte

Phagozytoseaktivität und einen gesteigerten O2-Stoffwechsel (EICKHOFF 2002).

Im Gewebe reagieren die neutrophilen Granulozyten auf chemotaktische Botenstoffe.

Hierbei kommt es zu einer Bindung des Mediators mit einem heptahelikalen, G-Protein

gekoppelten Leukozytenoberflächenrezeptor für Chemoattraktoren. Über das G-Protein

wird abhängig vom Mediator eine spezielle Enzymkaskade aktiviert, die ihrerseits eine

stimulierende Wirkung auf die Migration, Adhärenz oder Loslösung der Zelle sowie die

Verformung des Zytoskeletts der Leukozyten besitzt (BOKOCH 1995).

2.1.3.2 Phagozytose

Seit der Entdeckung der Phagozytose durch METCHNIKOFF (1884) wird diesem

zellulären Mechanismus eine primäre Funktion im Rahmen des unspezifischen

Immunsystems zugeschrieben. Als Phagozytose bezeichnete er die Aufnahme und

Verdauung von Mikroben durch wandernde Mesodermzellen. Heutzutage wird dieser

Begriff etwas anders gefasst und steht hauptsächlich für die Aufnahme körperfremder

Partikel, mutierter oder abgestorbener eigener Zellen und Mikroorganismen durch

bestimmte Körperzellen – den Phagozyten (KWON 1987).

Die neutrophilen Granulozyten wandern solange im Gewebe gegen

Konzentrationsgradienten chemotaktischer Faktoren, bis sie die zu eliminierenden Partikel

erreichen und neutralisieren (ROITT 1988). Meistens sind diese Partikeln Bakterien. Viele

Mikroorganismen verfügen über Oberflächenstrukturen, die die Anheftung der Phagozyten

erschweren. PMN verfügen dagegen über Rezeptoren für opsonisierte Zellen oder Partikel.

Die Opsonine stellen eine Verbindung zwischen den spezifischen Rezeptoren der

Phagozyten her. Man unterscheidet 3 Klassen von Opsoninen: Immunglobuline vom Typ

IgG, die an Fcγ-Rezeptoren der PMN binden, Spaltprodukte der Komplementkaskade (z.B.

C3b, iC3b, C4b), die von den korrespondierenden Komplementrezeptoren der PMN

erkannt werden (hier CR1, CR3 und CR4), und schließlich membranständige

Literaturübersicht

23

Kohlenhydratgruppen auf Mikroorganismen, die seitens der PMN an Lektin-Rezeptoren

binden (KLEIN 1991, ZERBE 1994).

Das an der Opsonisierung der Erreger beteiligte Komplementsystem wird meist über den

sogenannten alternativen Weg aktiviert. Hierbei kommt es direkt zur Spaltung des C3-

Faktors in einen kleineren Anteil C3a und den mengenmässig grösseren Teil C3b, welcher

sich wegen seiner Instabilität schnell zu iC3b wandelt (TROWALD-WIGH et al. 1993).

Das agierende Enzym C3-Konvertase bindet an der Oberfläche vieler Bakterien, so dass

dort große Mengen von C3b und iC3b entstehen. Es kommt zu einer Komplexbildung

zwischen C3b und dem weiteren Komplementfaktor C5. Der instabile C5-

Komplementfaktor wird zu C5a und C5b gespalten. C3a und C5a fungieren als effektive

Chemotaxine und führen außerdem zu einem erhöhten O2-Stoffwechsel in den PMN, dem

sogenannten Respiratory Burst (ROITT 1988, TILL u. THIELMANN 1989). C3b, iC3b

und C5b verbleiben an der Bakterienmembran und bilden zum einen zusammen mit den

Komplementfaktoren C6, C7, C8 und C9 den Membranangriffskomplex (ROITT 1988,

BAUER 1994), welcher zur Lyse der Bakterienzellwand führen kann. Andererseits wirken

sie als sogenannte Opsonine und erleichtern somit die Phagozytose durch die

Entzündungszellen. Der klassische Weg der Komplementkaskade beginnt mit der

Aktivierung des Komplementfaktors C1q durch Immunkomplexe von IgM oder geeigneten

IgG-Isotypen und Mikroorganismen. Über die Aktivierung verschiedener Faktoren mündet

dieser Weg auch in die Spaltung des Faktor C3 und verläuft dann weiter wie der alternative

Weg (ROITT 1988, BAUER 1994). Das u.a. durch IL-1-Einfluss vermehrt in der Leber

produzierte CRP (C-reaktives Protein), welches zur Familie der akuten Phase-Proteine

gezählt wird, bindet an der Oberfläche zahlreicher Bakterien und Pilze (ROITT 1988, TILL

u. THIELMANN 1989, BAUER 1994). Dies führt wiederum zu einer verstärkten Bindung

von Komplement und ist somit phagozytosefördernd (TILL u. THIELMANN 1989). Die

Anlagerung der PMN an opsonisierende Komplementfaktoren oder Antikörper erfolgt

durch spezifische C3b- (CR1), C3bi- (CR3 oder CR4) (ARNAOUT 1990b, TROWALD-

WIGH et al. 1993, BAUER 1994) und Fc-Rezeptoren (FcγRII, FcγRIII) der

Phagozytenmembran (TROWALD-WIGH et al. 1993, BAUER 1994) und macht die

nachfolgende Aufnahme der Erreger effizienter. Man spricht von einer opsonisierenden

Adhärenz.

Literaturübersicht

24

Wurde ein Antigen über Rezeptoren der Granulozytenmembran fixiert, beginnt der

Vorgang der Ingestion. Vorraussetzung ist, dass die Phagozytoseobjekte nicht zu groß

sind. Ein Partikeldurchmesser von 1 µm oder auch mehr (etwa 10% des PMN-

Durchmessers) lässt eine Phagozytose zu (DONNELLY et al. 1987, KLEIN 1991). Die

PMN-Membran bildet unter Aktivierung von intrazellulären Aktin- und

Myosinfilamenten Pseudopodien, die das zu inkorporierende Material becherartig

umschließen und als Vakuole in die Zelle aufnehmen (ENGELKE 2000). Diese als

Phagosomen bezeichneten Vakuolen verschmelzen im Zellinneren mit den

zytoplasmatischen Lysosomen, die als Granula der PMN viele verschiedene zytotoxische

Enzyme enthalten, zu den Phagolysosomen. Die Lysosomen werden in primäre und

sekundäre Granula unterteilt. Die primären Granula enthalten Lysozym, Myeloperoxidase

und Proteinasen. Dagegen beinhalten die sekundären Granula u.a. Laktoferrin und

Kollagenasen, die im Phagolysosom auf das phagozytierte Antigen einwirken (GEMSA et

al. 1991, LONNERDAL und IYER 1995). Die unverdaulichen Spaltprodukte der durch

Enzymeinwirkung abgetöteten Bakterien werden exozytiert oder sammeln sich im

Granulozyten an und können dessen Absterben bedingen (KLEIN 1991). Zerfallsprodukte

lysierter Bakterien und PMN wiederum dienen als Entzündungsmediatoren und fördern

die weitere Rekrutierung von PMN aus dem Blutstrom sowie deren Aktivierung (GEMSA

et al. 1991).

2.1.3.3 Bildung reaktiver Sauerstoffspezies

Ein weiterer Mechanismus, durch den sowohl phagozytierte als auch Noxen außerhalb des

Granulozyten geschädigt werden, ist die Bildung reaktiver Sauerstoffmetaboliten (reactive

oxygen species, ROS).

Bereits die Anheftung opsonisierter Antigene an die Zelloberflächenrezeptoren der PMN

verursacht Membranveränderungen und induziert damit biochemische Reaktionen. Diese

führen u.a. zur Bildung einer Reihe mikrobizider Substanzen, die den PMN zur

Infektionsabwehr zur Verfügung stehen. Darüber hinaus wird das phagozytierte Material in

den Phagolysosomen zersetzt. Zu den angesprochenen Substanzen gehören antimikrobielle

Literaturübersicht

25

Proteine (u.a. Defensine), Enzyme (z.B. Lysozym), Kompetitoren (z.B. Laktoferrin),

Stickstoffoxide (NOx) und reaktive Sauerstoffmetaboliten (H2O2, O2˙¯ etc). Die Bildung der

reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) erfolgt nach entsprechender Stimulation in einer

explosionsartigen Kaskade, dem sogenannten „respiratory burst“ (auch „metabolic burst“,

„oxidative burst“). Dabei kommt es zu einer erhöhten Aktivität der membranständigen

NADPH-Oxidase, dem Schlüsselenzym der Sauerstoffradikalbildung von Granulozyten

(KWON 1987, TILL u. TIELMANN 1989). Diese Flavinoxidase katalysiert die Reduktion

von molekularem Sauerstoff (O2) zum Superoxidanion (O2˙¯). Es führt dann weiter durch

Radikal-Kettenreaktionen zur Produktion anderer ROS. Spontan (z.B. unter Einwirkung des

sauren Milieus) oder durch Enzyme katalysiert (Superoxid-Dismutase) wird dieses schwach

toxische Superoxidanion (O2˙¯) in Hydroxylradikale (OH˙), Peroxid-Anionen (OH¯)

(jeweils hochreaktive Radikale), atomaren oder Singulet-Sauerstoff (1O2) (potentes

Oxidationsmittel) sowie in Wasserstoffperoxid (H2O2) überführt (KWON 1987, ROITT

1988, TILL u. THIELMANN 1989). Es handelt sich bei diesen um hochreaktive,

keimtötende Agenzien, die Enzyme oder Membranbestandteile oxidieren und somit

funktionell inaktivieren können (KLEBANOFF 1980, KWON 1987).

Unter Einfluss der lysosomalen Myeloperoxidase bilden H2O2 und Halogenionen wie Cl-, J-

oder Br- ein stark antimikrobiell wirkendes Halogenierungssystem. Die entstehenden

Halogensäuren führen zu einer Halogenierung und damit zur Schädigung der Membranen

des aufgenommenen Materials. Außerdem katalysiert die Myeloperoxidase durch H2O2

induzierte oxidative Decarboxylierung und Abspaltung membranständiger Aminosäuren

und Peptide (KWON 1987, TILL u. THIELMANN 1989). Die entstehenden O2-

Metaboliten haben alle stark zytotoxisches Potential.

Die respiratorische Entladung kann aber auch unabhängig von der Phagozytose durch

andere Wechselwirkungen der Zelle mit Stimulanzien ausgelöst werden. Die Bindung von

Antikörpern an den Fcγ-Rezeptoren der PMN (JANEWAY und TRAVERS 1997) sowie

von komplementopsonisierten Bakterien an den Komplementrezeptoren oder die

Ankopplung anderer Zellen über die Adhäsionsmoleküle CD11b/18 kann ebenso zu einer

ROS-Ausschüttung führen (GOODMAN et al. 1995, RUIZ et al. 1995), wie der Kontakt

mit Entzündungsmediatoren (z.B. TNFα, JANEWAY et al. 2002). Neben PMN können

Literaturübersicht

26

mit geringerer Kapazität auch eosinophile Granulozyten, Monozyten sowie Makrophagen

ROS bilden (GEMSA et al. 1991).

Oft kommt es durch systemische Erkrankungen des Organismus zu sekundär bedingten

Störungen der Granulozytenfunktion. Primäre Störungen der Granulozyten sind äußerst

selten (STICKLE 1996). Bei der myeloischen Leukämie des Menschen z.B. zeigen die

Tumorzellen einen verminderten Gehalt an NADPH-Oxidase (TAICHMAN 1994), dem

wohl wichtigsten Enzym bei der ROS-Bildung. Eine verminderte Bildung von

Sauerstoffradikalen zeigen ebenfalls die PMN HIV infizierter Patienten (LAFRADO et al.

1989). Auch therapeutische Behandlung mit Glukokortikoiden oder längerbestehende,

stressbedingte Ausschüttung von Cortisol kann zu einer gestörten Funktion der PMN

führen. Einen hemmenden Einfluss auf die reaktiven Sauerstoffradikale haben

Glukokortikoide (FUKUSHIMA et al. 1990, SALAK et al. 1993, HOEBEN et al. 1998).

Neben den Glukokortikoiden zeigen vereinzelt Vertreter der Antibiotika, wie Ceftiofur oder

Oxytetracyclin, über eine Interaktion mit dem Myeloperoxidase-Komplex einen

hemmenden Einfluss auf die bakterizide Wirkung der reaktiven Sauerstoffspezies

(HOEBEN et al. 1997a, HOEBEN et al. 1997b).

2.1.3.3.1 Die in-vitro-Beurteilung der Bildung reaktiver Sauerstoffspezies

Für die Bestimmung der Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) wurden verschiedene

Verfahren, wie die Erfassung der Lichtemission über Photonenverstärker oder die

photometrische Darstellung von oxidativen Reaktionsprodukten eingesetzt.

Bei dem erstgenannten Verfahren wird entweder direkte (low level) Chemilumineszenz

durch Singulett-Sauerstoff erfasst (ALLEN 1977) oder PMN werden nach Stimulation zur

nativen Chemilumineszenz angeregt. Diese wird durch Indikatoren wie Luminol oder

Lucigenin verstärkt und damit messbar (MÜLLER-PEDDINGHAUS 1984). Dabei ist die

Chemilumineszenz ein Maß für die Menge an gebildetem Wasserstoffperoxid (H2O2),

kenntlich gemacht durch Luminol, bzw. für die Menge an Superoxidanion (O2˙¯),

verstärkt durch Lucigenin (KWON 1987).

Für die photometrische Bestimmung von Superoxidanion (SCHLOBACH 1988, CHACIN

et al. 1990) oder Wasserstoffperoxid (ROTH und KAEBERLE 1981) ist der sogenannte

Literaturübersicht

27

Nitroblau-Tetrazolium-(NBT)-Reduktions-Test sehr bekannt. Das Prinzip beruht darauf,

dass NBT vom gelben Redoxfarbstoff bei der Aufnahme in aktive PMN zu blauem

Formazan reduziert wird. Dieses kann durch organische Lösungsmittel gelöst und dann

photometrisch quantifiziert werden.

In jüngster Zeit kommen zunehmend durchflusszytometrische Messverfahren zur

Anwendung (BASS et al.1983, MÜLLER-PEDDINGHAUS 1987, ROTHE et al.1988,

SZEJDA et al.1984, TRINKLE et al.1987). Dabei beruhen alle auf demselben Prinzip. Ein

nicht fluoreszierendes Substrat wird in aktivierten Zellen unter Einfluss der dort

gebildeten reaktiven Sauerstoffmetaboliten zu einem fluoreszierenden Farbstoff

umgewandelt (EICKHOFF 2002). Die entstehende Fluoreszenz kann im

Durchflusszytometer quantitativ gemessen werden. Dabei kann sowohl der Prozentanteil

der fluoreszierenden und damit ROS-bildenden Zellen, als auch die mittlere

Fluoreszenzintensität der einzelnen Zellen ermittelt werden. Als erstes mögliches Substrat

wurde 2`,7`-dihydrochlorofluoreszindiacetat (DCFHDA) verwendet (BASS et al. 1983)

und ist auch bei neueren Untersuchungen noch häufig im Gebrauch (SZEJDA et al. 1984,

RYAN et al. 1990, VUORTE et al. 1996, SMITS et al. 1997, RAIDAL et al. 1998). Das

stabile, nichtfluoreszierende, unpolare DCFHDA kann durch die Plasmamembran der

PMN diffundieren. Im Inneren der Zellen kommt es durch Esterasen zur Abspaltung der

Acetylgruppe (RYAN et al. 1990). Das entstehende Dichlorofluoreszin (DCFH) ist jetzt

polar und kann die Zelle nicht mehr verlassen. Bei Anwesenheit von reaktiven

Sauerstoffprodukten wird das nicht fluoreszierende DCFH schnell zum

grünfluoreszierenden Dichlorofluoreszein (DCF) oxidiert (SZEJDA et al. 1984).

Vereinzelt wird als Substrat Dihydroethidium (DHE) verwendet. Durch Oxidation entsteht

das rotfluoreszierende Ethidiumbromid (EB) (PERTICARARI et al. 1991, LEHMANN et

al. 1998).

Die praktikabelste durchflusszytometrische Methode zur Bestimmung intrazellulärer ROS-

Bildung wurde von EMMENDÖRFFER et al. (1990) entwickelt. ZERBE et al. (1996)

etablierte diese Methode für bovine PMN. Dabei wird der Gehalt an Wasserstoffperoxyd in

einer Zellsuspension als Maß für die ROS-Bildung mittels einer Myeloperoxidase-

abhängigen Oxidation von nichtfluoreszierenden Dihydrorhodamin 123 (DHR 123) zum

grünfluoreszierenden Metaboliten Rhodamin 123 durchflusszytometrisch erfasst. Rhodamin

Literaturübersicht

28

123 emittiert nach Anregung durch den Argon-Ionen-Laser (488 nm) Licht im grünen

Bereich von 534 nm. Dihydrorhodamin 123 stellt im Vergleich zu DHE und DCFHDA ein

viel sensitiveres Substrat dar und wird deshalb öfter eingesetzt (ROTHE et al. 1988,

VOWELLS et al. 1995, SMITS et al. 1997, LEHMANN et al. 1998).

2.1.3.4 Zytotoxizität

Unter der zellvermittelten Zytotoxizität versteht man die Zerstörung von Zielzellen (z.B.

körperfremde Zellen, infizierte und körpereigene entartete Zellen) durch Effektorzellen, wie

zytotoxische T-Zellen und NK-Zellen. Auch PMN können zytotoxische Effekte ausüben,

indem sie zytolytische Enzyme und reaktive Sauerstoffmetabolite ihrer Granula

extrazellulär freisetzen. Dadurch werden die Zielzellen geschädigt. Dieser als

zellvermittelte Zytotoxizität bezeichnete Prozess kann unter Vermittlung von Antikörpern

(ADCC, antibody dependent cellular cytotoxicity), aber auch ohne diese (AICC, antibody

independent cellular cytotoxicity) stattfinden.

2.2 Aufgaben der Granulozyten im Rahmen der Infektionsabwehr

PMN gehören zum unspezifischen zellulären Teil des Immunsystems, d.h. sie verfügen

über kein immunologisches Gedächtnis und benötigen keine Spezifität gegenüber

Antigenstrukturen (KWON 1987). Sie erscheinen als erste Immunzellen am Ort eines

Infektionsgeschehens (LEHRER et al. 1988).

Nach ihrer Bildung im Knochenmark werden sie in den Blutstrom abgegeben, in dem sie

nur wenige Stunden zirkulieren (WECKER 1990, KLEIN 1991). Aus dem Blut wandern sie

durch amöboide Bewegung vornehmlich in Regionen, welche stark den Angriffen durch

Mikroorganismen oder Fremdstoffe von außen ausgesetzt sind, wie Haut und Schleimhäute

von Respirationstrakt, Magen-Darm-Trakt, Harn- und Reproduktionstrakt und Augen, und

schützen den Organismus dort durch ihre Abwehrtätigkeit vor diesen Eindringlingen (da

SILVA et al. 1994). Dabei phagozytieren Granulozyten Erreger und Zelldetritus

abgestorbener Zellen. Inaktivierert werden Pathogene mit Hilfe reaktiver

Sauerstoffmetabolite und bakterizider lysosomaler Enzyme/Polypeptide nach

Literaturübersicht

29

Verschmelzung der Phagosomen mit den Lysosomen zu Phagolysosomen (CASSATELLA

1996).

Aber PMN erweisen sich nicht nur als reine „Entsorger“ von Fremdorganismen.

Neben den direkten Interaktionen der PMN mit Fremdorganismen ist auch deren

Freisetzung von Zytokinen ein wichtiger Beitrag zur Immunantwort. Nach LLOYD und

OPPENHEIM (1992) werden PMN durch verschiedene Mediatoren (Lipopolysaccharide

(LPS), IL-1, IL-2, Tumornekrosefaktor (TNF) oder GM-CSF) zur Produktion und

Freisetzung von Zytokinen stimuliert. Immunregulatorisch wird durch die aktivierten PMN

über lösliche molekulare Botenstoffe auf andere PMN (u.a. IL-1, IL-6, IL-8, G-CSF u. GM-

CSF), B-Zellen (IL-6), T-Zellen (IL-1, TNF u. IL-6) und auf das Monozyten-Makrophagen-

System (IL-1, TNF, Makrophagen-Wachstumfaktor (M-CSF) und GM-CSF) Einfluss

genommen. Über die Fähigkeit, aktivierungsabhängig Zytokine und Chemokine zu

sezernieren, beeinflussen PMN unmittelbar auch Mechanismen der adaptiven

Immunantwort (CASSATELLA 1999).

Die große Bedeutung von polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten vor allem für die

Abwehr von bakteriellen Infektionen wird bei Individuen deutlich, deren PMN eine

verringerte funktionelle Kapazität aufweisen. Das erbliche Krankheitsbild der humanen

septischen Granulomatose (CGD, chronic granulomatous disease), das in der Herabsetzung

der ROS-Bildungskapazität durch neutrophile Granulozyten begründet ist, löst

typischerweise wiederkehrende pyogene Erkrankungen des Patienten aus (MA et al. 2000).

Weiterhin wiesen BRENNEIS et al. (1993) bei etwa einem Viertel der untersuchten

humanen Patienten mit wiederkehrenden Infektionen eine verminderte ROS-Bildung oder

eine verminderte Chemotaxis von PMN nach.

Eine Abnahme der Verfügbarkeit und eine reduzierte Funktionsfähigkeit der neutrophilen

Granulozyten ist also mit einer abnehmenden Immunkompetenz und einer ansteigenden

Zahl von den Körper heimsuchenden Infektionen verbunden (da SILVA et al. 1994).

Materialen und Methoden

30

3 Material und Methoden

3.1 Geräte und Materialien

3.1.1 Geräte, Klinik- und Laborbedarf

Geräte

Aqua dest. Aufbereitungsanlage „SG Umkehr-Osmose Anlage Typ RO 50/14 SMB TypI“

Fa. Wasser- und Regenerierstation, Barsbüttel

Aqua tridest. Aufbereitungsanlage „SG Reinstwasser System Typ SG-RS 90-4 UF“

Fa. Wasser- und Regenerierstation, Barsbüttel

Autoklav „Typ GE406“ Fa. Getinge AB, Getinge, Schweden Brutschrank mit CO2-Begasung „Typ BK5060E“

Fa. Heraeus-Christ (26146040), Hanau

Bunsenbrenner mit automatischer Zündung „gasprofi1“

Fa. Wartewig (6.001.000), Göttingen

CO2-Flasche zur Sterilfiltration Fa. Kohlensäurewerk Hannover, Hannover

Durchflusszytometer mit Computereinheit „Typ FACSCalibur®“

Fa. Becton Dickinson, Heidelberg

Einmal-Filter, 0,2 µm Fa. Renner (06001), Dannstadt Eismaschine „Typ UBE 30-10“ Fa. Ziegra, Isernhagen Feuchte Kammer (Plastikbox mit Gittereinsatz)

Einzelhandel

Fluoreszenzmikroskop mit Ploemiluminator und Phasenkontrasteinrichtung Okular: Kpl 10xW Objektive: Ph2 Neofluar 16/0,40 Ph2 Neofluar 40/0,75 Planneofluar 63 x/1,25; Öl Filtereinsatz 09: Erregerfilter 450-490 nm Farbteiler 510 nm Sperrfilter 520 nm

Fa. Zeiss (476250-9901), Oberkochen

Heißluftsterilisator „Typ ST5050“ Fa. Heraeus, Hanau


31

Invertmikroskop Okular: CPL W 10x/18 Objektive: Ph1-F-LD 20/0,25 Ph1 10/0,22

Fa. Zeiss (471202-9901), Oberkochen

Kühlschrank mit Gefrierfach (–20°C) Einzelhandel Laborfeinwaage „B6“ Fa. Mettler, Zürich, Schweiz Labor-pH-Meter „766 Calimatic“ Fa. Knick, Berlin Laborwaage „BL310“ Fa. Sartorius, Göttingen Magnetrührer mit Heizplatte „IKAMAG®RH“ Fa. Janke u. Kunkel, Staufen Pinzette, gebogen, anatomisch Fa. Eickemeyer (170710), Tuttlingen Pipette, einstellbar „Transferpette®“ (2-20 µL) Fa. Brand (09U2539), Wertheim Pipetten, einstellbar „pipetman“ (100-1.000 µL, 20-200 µL, 10-100 µL, 1-20 µL)

Fa. Gilson, Villers Le Bel, Frankreich

Pipettierhilfe „accu-jet®“ Fa. Brand (26404), Wertheim Röhrchen-Schüttler „Typ Reamix“ Fa. ASID, Unterschleißheim Röhrchen-Schwenker „Typ Automix“ Fa. ASID, Unterschleißheim Rüttler für Mikrotiterplatten „AM69 Microshaker“

Fa. Dynatech, Zug, Schweiz

Schere, rostfrei Fa. Fisher Scientific (9204013), Schwerte

Schlauchpumpe zum Absaugen von Flüssigkeiten „Rumo100“

Fa. Heidolph (52100), Schwabach

Sterile Werkbank, „Heraeus Lamin Air® HLB 2472“

Fa. Heraeus-Christ, Hanau

Wasserbad mit Temperaturregelung Typ 1003

Fa. GFL Hannover, Hannover

Zellzählkammer nach Bürker Fa. Brand, Wertheim

Zentrifugen

Kühlzentrifuge „Varifuge K Typ 4500“ Fa. Heraeus-Christ, Osterode Tischzentrifuge „Hermle Z230M“ Fa. Hermle, Gosheim Zentrifuge „Megafuge 1.0R“ Fa. Heraeus-Christ, Osterode

Klinikbedarf

Butterfly-Kanüle „Micro-FloTM“ 21GA 0,8 mm

Fa. Industria Biomedica (AS2102), Mailand, Italien

Einmalspritze Luer 10 mL Fa. AMEFA (302020), Limburg Einmalspritze Luer 50 mL „Plastipak®“ Fa. Becton Dickinson (300865),

Drogheda, Irland Einmalspritze Luer 5 mL Fa. AMEFA (302010), Limburg Einmal-Untersuchungs-Handschuhe „Gentle Fa. Meditrade® (1221R), Kiefersfelden


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Skin® sensitive“ Kanülen 1,8 x 40 mm „TSK STERIJEKT“ Fa. TSK Tochigi, Japan Kanülen 1,0 x 100 mm „TSK STERIJEKT“ Fa. TSK Tochigi, Japan Staugurt zur Blutentnahme beim Menschen Fa. Medicalis (31001), Garbsen Staukette nach Witte Fa. Eikemeyer (442015), Tuttlingen Vacutainer® Brand Luer Adapter Fa. Becton Dickinson (367300),

Heidelberg Vacutainer-Kanülen Fa. Becton Dickinson (360215),

Heidelberg Vacutainer® Systems, Halter Fa. Becton Dickinson, Heidelberg Vacutainer®-Röhrchen (10 mL) mit EDTA-K2 (18 mg)

Fa. Becton Dickinson (367525), Heidelberg

Laborbedarf

Combitips biopur, 1,25 mL Fa. Becton Dickinson (38161024), Heidelberg

Combitips plus, 0,5 mL Fa. Eppendorf (0030069.420), Hamburg Combitips plus, 2,5 mL Fa. Eppendorf (0030069.447), Hamburg Eppendorf-Reaktionsgefäß mit Deckel 0,5 mL

Fa. Sarstedt (72699), Nürnbrecht

Eppendorf-Reaktionsgefäß mit Deckel 1,5 mL

Fa. Greiner (616201), Frickenhausen

Filter 0,22 µm „Sartobran-PH Capsule Sartobran®“

Fa. Sartorius (5231307H7SOB), Göttingen

Händedesinfektionsmittel „Sterilium®“ Fa. Bode Chemie (669), Hamburg Laborflaschen mit Gewinde, 100 mL, 500 mL und 1.000 mL

Fa. VWR international, Hannover

Mikrotiterplatten mit Abdeckung, 96-Loch, Rundboden, steril, Polystyrol

Fa. Techno Plastic Products TPP®, Trasadingen, Schweiz, bezogen von Biochrom (P92970), Berlin

Mikrotiterplatten, 96-Loch, Rundboden, unsteril, Polystyrol


Mikrotiterplatten, 96-Loch, Rundboden, unsteril, Polystyrol

Fa. Nerbe Plus (10.101.0000), Winsen/Luhe

Mikrotiterplatten, 96-Loch, Rundboden, steril, Polypropylen


Mikrotiterplatten, 96 Well, Non-Binding Surface Plates

Fa. Corning (3604), Wiesbaden

Multipette® pro Fa. Eppendorf (4985000.013), Hamburg Papier, saugfähig Einzelhandel Pasteurpipetten, 22,5 mm aus Glas Fa. Brand (747720), Wertheim


33

Pipettenspitzen „Plastibrand®“ 0,5 µL-20 µL

Fa. Brand (702565), Wertheim

Pipettenspitzen, blau und gelb Fa. Sarstedt (70/762002 und 70/760002), Nürnbrecht

Röhrchen für die Durchflusszytometrie (FACS-Röhrchen), 5 mL, Polystyrol

Fa. Becton Dickinson (352008), Heidelberg

Röhrchen für die Durchflusszytometrie (FACS-Röhrchen), 5 mL, Polypropylen

Fa. Sarstedt (55.1578), Nürnbrecht

Röhrchen, 15 mL, Polypropylen Fa. Corning (430791), New York, USA Saugpipetten (10 mL) Fa. Sarstedt (86.1254.01), Nürnbrecht Tesafilm-Klebeband Einzelhandel Tiegelzange 400 mm Fa. Fisher Scientific (9310240),

Schwerte Zellkulturflaschen, 200 mL „NunclonTMdelta Surface“

Fa. NuncTM (156499), Wiesbaden

Zentrifugenröhrchen, 50 mL, steril, Polypropylen

Fa. Corning (430829), New York, USA

3.1.2 Reagenzien und andere Verbrauchsmaterialien

Acridinorange Fa. Sigma-Aldrich (A6014), Steinheim Bovines Serumalbumin (BSA), Fraktion V, 98%

Fa. Roth (8076.2), Karlsruhe

Cy™5-Esel-anti-Maus Antikörper IgG, schwere und leichte Ketten Cy™5-DαM IgG (H+L)

Fa. Dianova (715175150), Hamburg

Desinfektionslösung Helipur H Plus Fa. Tierärztebedarf Lehnecke (2390082), Schortens

Dextran T 500 Fa. Roth (9219.1), Karlsruhe Dihydrorhodamin 123 (DHR 123) (Molekulargewicht: 346,38 g/mol)

Fa. MoBiTec (D632), Göttingen

Dimethylsulfoxid (DMSO) Fa. Sigma (D5879), Steinheim Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) (Trockensubstanz)

Fa. Biochrom (T-043-10), Berlin

Ethanol, absolut Fa. J.T. Baker (8228), Deventer, Holland Ethidiumbromid Fa. Sigma (E8751), Steinheim Ethylendiamine-Tetraacetat (EDTA) Fa. Sigma (ED2SS), Steinheim Fetales Kälberserum (FCS) Fa. Biochrom (SO 113/431B), Berlin Feuerzeug Einzelhandel


34

Ficoll® (Ficoll) Fa. Cytogen (04-60500), Ober-Mörlen Kupfer(II)-sulfat-5-hydrat Fa. Roth (8175.1), Karlsruhe L-Glutamin Fa. Biochrom (K0282), Berlin Natriumazid (NaN3), 10%ig Fa. Sigma (S-2002), Steinheim Natriumbicarbonat (NaHCO3) Fa. Biochrom (L1703), Berlin Natriumchlorid (NaCl) Fa. Roth (9265.2), Karlsruhe Natriumhydroxyd-Pellets (NaOH), wasserfrei Fa. Sigma (S-5881), Steinheim Natriumhypochlorit-Lösung 12% Fa. Roth (9062), Karlsruhe Paraformaldehyd Fa. Sigma (P6148), Steinheim PBS Dulbecco, Instant (9,55 g/L, phosphatgepufferte Salzlösung) (PBS)

Fa. Biochrom (L-182-10), Berlin

PercollTM (Percoll) Fa. Amersham Biosciences (17-0891-01), Freiburg

Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA) Fa. Sigma (P-8139), Steinheim Salzsäure (HCl), konzentriert (37%) Fa. J.T. Baker (6081), Deventer, Holland To-Pro-3iodide (To-Pro-3) Fa. Molecular Probes (T36-05), Leiden,

Niederlande


35

3.1.3 Puffer, Lösungen und Medien

Puffer und Lösungen

MIF (Membranimmunfluoreszenz)-Puffer: BSA NaN3 PBS

ad

0,5 0,01 100

g g mL

Natriumchloridlösung 0,9%: NaCl Aqua tridest.

ad

8,77 1.000

g mL

Phosphatpuffer (PBS): (hergestellt aus Trockensubstanz Dulbecco PBS, s. 3.1.2) NaCl Na2HPO4 x H2O KH2PO4

KCl Aqua tridest. HCl / NaOH

ad ad

8 1,24 0,2 0,2 1.000 pH 7,4

g g g g mL

Phosphatpuffer, doppelt konzentriert (2xPBS): Zur Herstellung wurde doppelt soviel Trockensubstanz wie bei PBS eingesetzt und mit Aqua tridest. auf 1.000 mL ergänzt. HCl / NaOH

ad

pH 7,4

Alle Puffer wurden für 30 Min. bei 121°C autoklaviert und bei 4°C gelagert.

Medien

Zellkulturmedium DMEM- DMEM-Grundlösung (135,3 g DMEM-Trockensubstanz [s. 3.1.2] in 10 L Aqua tridest. gelöst) mit L-Glutamin 2 mmol/L, NaHCO3 18 mmol/L, ohne Zusatz von Antibiotika


36

3.1.4 Materialien für die Separation, Differenzierung und

Vitalitätsbestimmung von Zellen

Acridinorange-Ethidiumbromid

Die bei 4°C gelagerte Gebrauchslösung enthielt 2,5 mg Acridinorange und 2,5 mg

Ethidiumbromid (s. 3.1.2), die in 1.000 mL PBS (s. 3.1.3) mit 0,02% NaN3 (s. 3.1.2)

gelöst wurden. Die Lösung wurde zur Zellzahl- und Vitalitätsbestimmung eingesetzt.

Dextran-Lösung

Um eine 3%ige Dextran-Lösung zu erhalten, wurden 3 g Dextran T 500 (s. 3.1.2) in 100

mL sterilem PBS (s. 3.1.3) aufgenommen.

Ficoll®

Ficoll® (s. 3.1.2) ist eine isotone, wässrige Lösung eines hochmolekularen Zuckers mit

einem Zusatz Isopaque (ein Röntgenkontrastmittel hoher Dichte), welches bei 10°C eine

Dichte von 1,077 g/mL hat. Das kommerzielle Ficoll (s. 3.1.2) wurde unverdünnt

verwendet.

Percoll™

Dieses synthetische Sol, bestehend aus Polyvinyl-Pyrrolidon-beschichteten Silikat-

partikeln, hat bei 20°C ein spezifisches Gewicht von 1,130 g/mL. In dieser Arbeit wurde

100%iges Percoll (s. 3.1.2) durch Zugabe von kristallinem NaCl (s. 3.1.2; 0,9 g/100 mL

Percoll) in einen isotonen Zustand gebracht. Für eine 54, 60, 70 oder 76%ige

Endverdünnung wurde die Ausgangslösung mit einer entsprechenden Menge 0,9%iger

NaCl-Lösung (s. 3.1.3) versetzt.


37

3.1.5 Materialien für die Durchflusszytometrie

Aqua tridest. und Natriumhypochlorit

Sterilfiltriertes Aqua tridest. (Porengröße des Sterilfilters: 0,2 µm, s. 3.1.1) und 1%ige

Natriumhypochlorit-Lösung (s. 3.1.2) wurden zur Spülung und Reinigung des Messkanal-

und Schlauchsystems innerhalb des Durchflusszytometers verwendet.

To-Pro-3iodide (To-Pro-3)

Bei To-Pro-3iodide handelt es sich um einen Fluoreszenzfarbstoff, der nach Laseranregung

bei 635 nm (Diodenlaser) zum Emissionsmaximum bei 661 nm Wellenlänge aktiviert wird.

Dieses wird im Fluoreszenzkanal 4 des Durchflusszytometers FACSCalibur© (s. 3.1.1)

registriert. Die gelieferte 1mM/L Lösung wurde mit PBS (s. 3.1.3) zu einer 1 µmol/L

Gebrauchslösung verdünnt, in 1 mL aliquotiert und bei –20°C lichtgeschützt gelagert. Bei

durchflusszytometrischen Messungen enthielt jede Probe eine Endkonzentration von 0,1

µmol To-Pro-3/L.

Trägermedium zur Messung (Sheath fluid)

Das Trägermedium bestand aus mit Hilfe des Filters „Sartobran“ (Porenweite 0,22 µm, s.

3.1.1) sterilfiltriertem PBS (s. 3.1.3) mit 0,1 g/L Natriumazid (s. 3.1.2).

3.1.6 Materialien zur durchflusszytometrischen Bestimmung absoluter

Zellzahlen

Referenzzellen zur Zellzahlbestimmung

Als Referenzzellen wurden Cy™5-markierte (s. 3.1.2) bovine mononukleäre Zellen

(MNC) eingesetzt. Diese wurden, wie unter 3.2.3.1 beschrieben, mit Hilfe eines Ficoll-

Dichtegradienten mit einer Reinheit von über 98% aus EDTA-Blut gewonnen und in

einer Endkonzentration von 1 x 106 Zellen/mL Sheath (s. 3.1.5) bei 4°C bis zu mehreren

Monaten lichtgeschützt gelagert.


38

Monoklonale Antikörper

mAk

Synonym Donor Isotyp Gebrauchs- verdünnung

Art Spezifität

Bo11) 3W-586 Maus IgG1 1:1 ZÜ fast monomorpher Bereich des bovinen MHC-Klasse-I-Moleküls

Abkürzungen: Ig, Immunglobulin; mAk, monoklonaler Antikörper; ZÜ, Zellkulturüberstand

Referenzen und Herkunft der monoklonalen Antikörper

1) SCHUBERTH et al. (1991)

Arbeitsgruppe Immunologie, Tierärztliche Hochschule Hannover

Konjugierte Antikörper

Der affinitätschromatographisch isolierte Antikörper „Esel (donkey)-anti-Maus IgG,

schwere und leichte Kette“ wird mit Cy™5-Fluorescein konjugiert (Cy™5- DαM IgG

(H+L), s. 3.1.2). Dieser Antikörper wird von Serumproteinen verschiedener Arten

(Mensch, Rind, Pferd, Ziege, Ratte, Schwein, Hamster, Huhn und Schaf) absorbiert, und

hat eine Konzentration von 1,4 mg/mL. Die Stammlösung wurde 1:100 mit MIF-Puffer

(s. 3.1.3) verdünnt.

3.1.7 Materialien für die Bestimmung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS)

Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA)

Phorbol-Myristat-Acetat (PMA, s. 3.1.2) greift ohne Beteiligung von Rezeptoren in die

Enzymkaskade ein, die an der Bildung von reaktiven Sauerstoffmetaboliten (EMMEN-

DÖRFFER et al. 1990) beteiligt ist. Durch PMA wird die Proteinkinase C und damit

indirekt auch die für die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies wichtige NADPH-

Oxidase aktiviert. PMA wurde in DMSO (s. 3.1.2) gelöst und in einer Konzentration von

1 mmol/L in aliquoten Teilen je 200 µL bei -20°C gelagert.


39

Dihydrorhodamin 123

Das nichtfluoreszierende Dihydrorhodamin 123 (DHR 123, s. 3.1.2) wird von Zellen

aufgenommen und durch Oxidation (katalysiert durch Myeloperoxidase) zum

grünfluoreszierenden Metaboliten Rhodamin 123 umgewandelt (EMMENDÖRFFER et

al. 1990). Gekoppelt an die Zellmembran ist dieser Farbstoff durchflusszytometrisch

bestimmbar und stellt ein Maß für die ROS-Bildung einer Zelle dar. Rhodamin 123

emittiert nach der Anregung durch den Argonlaser (488 nm) Licht im grünen Bereich von

534 nm.

Die Ausgangsubstanz wurde in DMSO (s. 3.1.2) gelöst (1,5 mg/mL) und in aliquoten

Teilen zu 100 µl aufbewahrt. Durch Verdünnungen der Stammlösung mit PBS entstanden

zwei Gebrauchslösungen: erste (1:100) Gebrauchslösung (15 µg/mL) und zweite (1:66,6)

Gebrauchslösung (22,5 µg/mL). Alle DHR-Lösungen wurden bei einer Temperatur von –

20°C gelagert. Dabei galt zu beachten, dass die Verdünnung mit PBS aufgrund einer

geringeren Stabilität innerhalb weniger Wochen aufzubrauchen war.

Feuchte Kammer

Um das Verdunsten von Flüssigkeiten während der Inkubationsphase im Brutschrank

möglichst gering zu halten, wurde eine feuchte Kammer (s. 3.1.1) eingesetzt. Hierbei

handelte es sich um eine Kunststoffbox mit Gittereinsatz, die mit etwa 20 mL einer

1%igen Kupfersulfatlösung (s. 3.1.2) befüllt wird.

3.1.8 Probanden

Bei allen Rindern handelte es sich um „Deutsche Schwarzbunte“ oder „Deutsche

Rotbunte“. Die Tiere stammten entweder aus der Klinik für Geburtshilfe und

Gynäkologie des Rindes oder aus der Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen

Hochschule Hannover.

Für die Experimente mit aus Pferdeblut isolierten PMN dienten insgesamt 3 klinisch

gesunde Warmblutstuten aus der Klinik für Pferde der Tierärztlichen Hochschule

Hannover.


40

Das benötigte Hundeblut wurde von Hunden der Rasse Beagle der Arbeitsgruppe

Immunologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover gewonnen.

Für die hier vorgestellten Experimente mit PMN anderer Spezies stellten sich auch drei

Mitarbeiter der Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztliche Hochschule Hannover zur

Blutspende zur Verfügung.

Alle Probanden waren bei der Probenentnahme klinisch gesund.


41

3.2 Methoden

3.2.1 Gewinnung und Isolierung von Leukozyten aus dem Blut

3.2.1.1 Blutentnahme

Das Blut wurde mit Hilfe des Vacutainersystems (s. 3.1.1) unter sterilen Bedingungen aus

der gestauten Vena jugularis beim Pferd und Rind, aus der Vena cephalica antebrachii

beim Hund und aus der Vena intermedia antebrachii beim Menschen entnommen. Dabei

wurden Vacutainer-Röhrchen mit Kalium-EDTA Zusatz (s. 3.1.1) verwendet.

3.2.1.2 Isolierung der Leukozyten aus dem peripheren Blut

Nach der Entnahme wurde das Blut je nach Fragestellung und Spezies unterschiedlich

sofort weiterverarbeitet.

3.2.1.2.1 Isolierung boviner Leukozyten aus dem peripheren Blut

3.2.1.2.1.1 Isolierung der polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten (PMN)

Vom Rind wurden etwa 15 mL EDTA-Blut 1:2 mit sterilem PBS verdünnt und in einem 50

mL Röhrchen über einen einstufigen diskontinuierlichen Gradienten von 15 mL Ficoll (s.

3.1.4) geschichtet. Bei 10°C und 1.275 x g wurde für 30 Minuten ohne Bremse

zentrifugiert. Aufgrund ihrer spezifischen Dichte sammelten sich die mononukleären Zellen

(Lymphozyten und Monozyten) und einige Thrombozyten in einer Interphase zwischen

dem Plasma und dem Ficoll. Unterhalb des Ficolls lagen in einem Pellet die Erythrozyten

und die polymorphkernigen Blutzellen vor. Die MNC-Interphase wurde zuerst

abgenommen und, wenn erforderlich, zur Herstellung von Referenzzellen (s. 3.2.3.1)


42

eingesetzt, ansonsten verworfen. Mit dem darunter liegenden Erythrozyten-Granulozyten-

Sediment wurde bei 4°C anschließend eine hypotone Lyse durchgeführt, um Erythrozyten

zu eliminieren. Dazu wurden 20 mL Aqua tridest. zu etwa 10 mL Erythrozytensediment

gegeben und dieses 10 Sekunden geschwenkt. Die Isotonie wurde durch Zugabe von 20 mL

2xPBS (s. 3.1.3) wieder hergestellt. Dieses Gemisch wurde 10 Minuten bei 500 x g und 4°C

zentrifugiert. Nach Entfernung des Überstandes wurde das Zentrifugat in der restlichen

Flüssigkeit resuspendiert. Da in der Regel beim Rind mit einer hypotonen Lyse nicht alle

Erythrozyten entfernt werden, ist der Lysevorgang zu wiederholen: zum resuspendierten

Zellpellet werden 20 mL Aqua tridest. zugegeben, 10 Sekunden geschwenkt und erneut 20

mL 2xPBS zugegeben, bei 4°C, 220 x g pelletiert und anschließend mit PBS gewaschen:

das Zellpelet wird mit 20 mL PBS resuspendiert, dann bei 100 x g für 10 Minuten und bei

4°C abzentrifugiert, der Überstand wird anschließend entfernt. Die Reinheit so gewonnenen

PMN lag über 95%. Sie hatten eine Vitalität (s. 3.2.5) von über 98%.

3.2.1.2.1.2 Separation der Gesamtleukozyten

Gerinnungsgehemmtes Vollblut (Kalium-EDTA, Volumen: 10 mL, s. 3.1.1) wurde in ein

50 mL Röhrchen (s. 3.1.1) überführt. Alle anschließenden Schritte wurden auf Eis bzw. bei

4°C durchgeführt. Die Erythrozyten des Vollblutes wurden hypoton lysiert, indem 20 mL

Aqua tridest. in das Röhrchen gegeben wurden. Nach 10sekündigem Schwenken wurden

20 mL doppelt konzentriertes PBS (2xPBS, s. 3.1.3) hinzugefügt und das Röhrchen erneut

geschwenkt. Nach der Zentrifugation bei 220 x g für 10 Minuten wurde der Überstand

abgegossen, das Pellet resuspendiert und der Lysevorgang wiederholt. Nach erneuter

Zentrifugation (s. oben) schloss sich ein Waschschritt an. Hierzu wurde das Pellet in

20 mL PBS resuspendiert und dann bei 220 x g für 10 Minuten zentrifugiert. Nach

Abgießen des Überstandes wurde der Waschschritt wiederholt. Schließlich wurde das Pellet

erneut in der restlichen Flüssigkeit resuspendiert und auf die gewünschte Zellkonzentration

mit DMEM (s. 3.1.3) eingestellt.


43

3.2.1.2.2 Isolierung equiner Leukozyten aus dem peripheren Blut

Beim Pferd wurde nach 30 Minuten der Spontansedimentation bei Raumtemperatur (RT)

der leukozytenreiche Überstand möglichst ohne Erythrozyten abgenommen und über einen

zweistufigen Percoll-Gradienten geschichtet. Dafür wurde in einem 50-mL-Polypropylen-

Zentrifugenröhrchen (s. 3.1.1) Percoll-Lagen (20°C) unterschiedlicher Dichte (54 und 76%,

s. 3.1.4) übereinander geschichtet. Zunächst wurden 15 mL 54%igen Percoll in das

Röhrchen gegeben. Diese Lage wurde mit Hilfe einer auf einer 10 mL Spritze (s. 3.1.1)

aufgesetzten Kanüle (1,0 x 100 mm, s. 3.1.1) durchstochen und mit dem 10 mL 76%igen

Percoll behutsam unterschichtet. Nach der Zentrifugation (1.000 x g, 20 Minuten, 20°C,

ohne Bremse) wurde die obere Interphase mit den mononukleären Zellen abpipettiert und

verworfen, bevor die untere Interphase mit den Granulozyten vorsichtig abgenommen und

dreimal mit PBS gewaschen wurde. Hierzu werden die Zellen in 20 mL PBS resuspendiert

und dann beim ersten Waschen bei 500 x g, beim zweiten – bei 200 x g und beim dritten -

bei 80 x g, jeweils bei 4°C für 10 Minuten abzentrifugiert. Nach jeder Zentrifugation wurde

der Überstand abgegossen. Nach dieser Separation lagen die PMN in einer Reinheit von

über 98% vor.

3.2.1.2.3 Isolierung caniner Leukozyten aus dem peripheren Blut

Die Separation der Zellen wurde wie unter 3.3.1.2.1.1 beschrieben durchgeführt, nur

erfolgte die Separation über Ficoll bei 1.100 x g, 4°C. Die MNC-Interphase wurde

verworfen. Da die caninen Erythrozyten gegenüber hypotoner Lyse resistenter sind als

bovine Erythrozyten, war in der Regel für die PMN-Phase eine viermalige hypotone Lyse

erforderlich, wobei die anschließenden Zentrifugationen bei unterschiedlicher

Sedimentationsstärke erfolgten (1. bei 500 x g, 2. bei 320 x g, 3. bei 200 x g, 4. bei 100x g,

jeweils bei 4°C für 10 Minuten). Die das Pellet bildenden PMN wurden in DMEM (s. 3.1.3)

auf eine definierte Zellkonzentration eingestellt.


44

3.2.1.2.4 Isolierung humaner Leukozyten aus dem peripheren Blut

Humane Granulozyten wurden nach der von KWON (1987) beschriebenen Methode

gewonnen, bei der keine Erythrozytenlyse vorgenommen werden muss. Hierbei wurde

EDTA-Blut 1:2 mit einer 3%igen Dextran-Lösung (s. 3.1.4) versetzt. Nach 20-30 Minuten

der Spontansedimentation bei RT wurde der leukozytenreiche Überstand abgenommen und

bei 500 x g, 20°C für 10 Minuten abzentrifugiert. Das Sediment wurde in 25 mL PBS

resuspendiert und über einen zweistufigen Percoll-Gradienten gegeben. Hierfür

unterschichtete man eine 60%ige Percoll-Lösung (15 mL, s. 3.1.4) mit einer 70%igen

Percoll-Lösung (10 mL, s. 3.1.4). Nach der Zentrifugation (750 x g, 25 Minuten, 20°C,

ohne Bremse) wurde die obere Interphase mit MNC verworfen und die untere Interphase

mit PMN vorsichtig abgenommen und zweimal mit PBS gewaschen (200 x g, 4°C für 10

Minuten) und mit DMEM (s. 3.1.3) auf eine definierte Zellkonzentration eingestellt..

Nach dem letzten Waschgang lagen die PMN in einer Reinheit und Vitalität von über 95%

vor.

3.2.1.3 Isolierung boviner Thrombozyten aus dem peripheren Blut

10 mL gewonnenes EDTA-Vollblut wurde in einem 50 mL Röhrchen (s. 3.1.1) mit 20

mL PBS (s. 3.1.3) verdünnt und bei 800 x g, 4°C, für 10 Min, ohne Bremse

abzentrifugiert. Der Überstand wurde fast vollständig abgenommen und in ein neues

Röhrchen überführt. Nach Auffüllen des Röhrchens mit PBS wurde es bei 2.500 x g, 4°C

für 10 Minuten abzentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, das Thrombozytenpellet

in der restlichen Flüssigkeit resuspendiert. Anschließend wurde die Suspension noch

einmal in PBS gewaschen (s. oben) und mit DMEM (s. 3.1.3) auf eine definierte

Zellkonzentration eingestellt.


45

3.2.2 Durchflusszytometrie

Ein Durchflusszytometer besteht aus einem optischen System, einem Fliesssystem,

Signaldetektoren und Konvertern, sowie der dazugehörigen Computereinheit (JOHNSON

1992, GOETZMAN 1993).

Die Durchflusszytometrie basiert darauf, dass in Suspension befindliche Partikel

(Zellen) durch besondere Führung in einer Trägerflüssigkeit (Sheath fluid, s. 3.1.5)

vereinzelt werden, so dass sie nacheinander einen bzw. zwei Laserstrahlen passieren

können. Dabei streuen die Zellen das einfallende Laserlicht ohne Veränderung von dessen

Wellenlänge, zum einen in Verlängerung des Strahls (Vorwärtsstreulicht, Forward Scatter,

FSC) und zum anderen im rechten Winkel dazu (Seitwärtsstreulicht, Side Scatter, SSC).

Dieses Streulicht wird von zwei Detektoren mit jeweils 1024 Kanälen aufgefangen, in ein

elektronisches Signal umgewandelt und an die angeschlossene Computereinheit weiter

geleitet. Das Ausmaß des FSC spiegelt die Größe des Partikels wieder und ist von seinem

Refraktionsindex abhängig, während das SSC von der Komplexität, die sich aus

Oberflächenbeschaffenheit und Granularität der Zelle zusammensetzt, beeinflusst wird.

Das optische System des für die Untersuchungen eingesetzten Durchflusszytometers

FACSCalibur© (s. 3.1.1) entspricht einem Dual-Lasersystem, d.h. es verfügt über zwei

Laser. Der Argonlaser erzeugt Licht der Wellenlänge 488 nm, der ihm zeitlich

nachgeschaltete Diodenlaser Licht der Wellenlänge 635 nm. Dem Argonlaser sind

zusätzlich zu den Streulichtdetektoren drei Fluoreszenzdetektoren zugeordnet. Der Detektor

„FL1“ nimmt Licht im Wellenlängenbereich von 500 – 560 nm (Grünfluoreszenz) auf, der

Detektor „FL2“ arbeitet bei 543 – 627 nm (Orangefluoreszenz), und „FL3“ registriert Licht

im Bereich von ≥ 650 nm (Rotfluoreszenz). Dem Diodenlaser ist der Detektor „FL4“

zugeordnet, der Ereignisse erfasst, die Licht im Bereich von 645 – 676 nm (Rotfluoreszenz)

emittieren und die in definiertem zeitlichen Abstand nach der Passage des Argonlasers

auftreten. Die Fluoreszenzintensität wird logarithmisch verstärkt und auf einer linearen

Skala mit 1.024 Kanälen, die 4 Log-Dekaden (0-10.000) entspricht, dargestellt. So können

pro Partikel, das die beiden Laser passiert, bis zu 6 Parameter (FSC, SSC, FL1 – FL4)

erfasst werden und mit Hilfe der zugehörigen Software (WinMDI©, TROTTER 1999)

untereinander korreliert und ausgewertet werden.


46

Die graphische Darstellung der Messwerte kann entweder als „Dotplot“, „Densityplot“ oder

Histogramm erfolgen. Beim auch als Punktgraph bezeichneten „Dotplot“ werden zwei

Parameter gegeneinander aufgetragen und bei jeder Schnittstelle der beiden Werte ein

Punkt angezeigt (korrelierte Zweiparameterdarstellung). Der „Densityplot“ erweitert diese

Darstellung um den Parameter der Häufigkeit, mit der das jeweilige Wertepaar während der

Messung aufgetreten ist. Bereiche mit großer Häufigkeit bzw. Dichte („Densityplot“-

„Dichtegraph“) werden hellgrau dargestellt, mit abnehmender Häufigkeit wird die Farbe

der Bereiche zunehmend dunkler. Somit handelt es sich beim „Densityplot“ um eine

Darstellung, die es ermöglicht, Schwerpunkte von Populationen besser zu differenzieren.

Das Histogramm stellt anhand der Abszisse die 1.024 Kanäle des jeweiligen Parameters dar

und anhand der Ordinate die Anzahl der jeweiligen Messsignale in diesem Kanal.

Werden FSC und SSC in einem „Dotplot“ gegeneinander aufgetragen, so stellen sich

morphologisch ähnliche Zellen als zusammenhängende Wolke dar. Werden aus Blut

isolierte Zellen untersucht, so bilden ruhende lymphoide Zellen, Blasten und Monozyten

sowie Granulozyten drei voneinander abgrenzbare Wolken. Allerdings lassen sich

eosinophile Granulozyten nicht rein morphologisch von neutrophilen Granulozyten (PMN)

unterscheiden. In der Korrelation von FL2 mit SCC stellen sich diese beiden Zellarten aber

durch die höhere rotorange Autofluoreszenz der Eosinophilen als getrennte Wolken dar.

Mit Hilfe dieser Darstellungen lassen sich die gemessenen Partikel oder Zellen empfindlich

charakterisieren und differenzieren sowie bestimmte Teilpopulationen gezielt untersuchen.

Ebenso ist es möglich, schon vor der Messung diese Teilbereiche zu definieren und nur

diese Messwerte zu erfassen („lifegate“).

3.2.3 Bestimmung der Zellzahl

Um die über Erythrozytenlyse gewonnenen Leukozyten bzw. über Ficoll oder Percoll (s.

3.1.4) gewonnenen mononukleären Zellen oder polymorphkernige neutrophile

Granulozyten (s. 3.2.1) in der für den jeweiligen Versuch vorgesehenen Konzentration

einzusetzen, wurde die Zellzahl der in DMEM (s. 3.1.3) aufgenommenen separierten Zellen

bestimmt.


47

Durchführung

Es wurden 10 µL der Zellsuspension (s. 3.2.1) entnommen und mit Hilfe der

Zellzählkammer nach Bürker (s. 3.1.1) unter dem Mikroskop ausgezählt. Um nur lebende

Zellen zu erfassen, wurden 10 µL Acridinorange/Ethidiumbromid (s. 3.2.4) dazugegeben,

und die vitalen Zellen im UV-Mikroskop (s. 3.1.1) gezählt.

Auswertung

Die Berechnung erfolgte mit der für diese Kammer bestehenden Formel:

(2) Verdünnung x mm) (0,1 eKammertief x )mm (1 Fläche)1mm (Quadrat großem pro Zellen gezählte

µL Leukozyten

2

2==

Es wurde ein großes Quadrat der Bürkerkammer ausgezählt, dieses hatte eine Fläche von

1 mm2. Die Kammertiefe betrug bei dieser Zählkammer 0,1 mm, und wurde die ausgezählte

Zellsuspension 1:2 mit Acridinorange/Ethidiumbromid verdünnt, betrug der

Verdünnungsfaktor 2.

Das entsprach in diesem Verdünnungsfall folgender Formel:

20µL

Leukozyten llenxgezählteZe=

Da die Zellkonzentration pro mL angegeben wird, ist dieses Ergebnis mit 1.000 zu

multiplizieren.

3.2.3.1 Herstellung der Referenzzellen zur Zellzahlbestimmung

Bovine mononukleäre Zellen (MNC) wurden, wie oben beschrieben (s. 3.2.1.2.1.1), der

Ficoll-Interphase entnommen, bei Bedarf (Kontamination mit Erythrozyten) einer

einmaligen hypotonen Lyse unterzogen (s. 3.2.1.2.1.1) und anschließend zwei mal mit PBS

gewaschen (s. 3.2.1.2.1.1). Ca. 20-30 x 106 pelettierte gewaschene MNC wurden in 500 µL

unverdünnten mAk Bo1 (s. 3.1.6), die bovine MHC-I Moleküle erkennen, resuspendiert

und für 30 Minuten bei 4°C inkubiert. Nach den drei Waschgängen (jeweils 300 x g, 10


48

Minuten, 4°C, s. 3.2.1.2.1.2) mit MIF-Puffer (s. 3.1.3) folgte eine weitere Inkubation bei

4°C für 30 min mit dem Cy™5-konjugierten Antikörper (IgG(H+L), 500 µL von 1:100

Verdünnung, s. 3.1.6). Nach weiteren zwei Waschgängen in MIF-Puffer wurde ein letzter

Waschgang mit PBS (s. 3.1.3) durchgeführt. Nach der Entfernung der Waschlösung wurden

die Zellen in der restlichen Flüssigkeit gründlich resuspendiert und in 35 mL 4%igem

Paraformaldehyd in PBS (s. 3.1.2) 24 Stunden lichtgeschützt bei 4°C fixiert. Nach der

Fixation wurden die Zellen 3 mal mit PBS gewaschen (300 x g, 10 Minuten, 4°C) und dann

in einer Konzentration von 1 x 106 Zellen/mL Sheath bei 4°C bis zu mehreren Monaten

lichtgeschützt gelagert.

3.2.3.1.1 Referenzzellmethode (durchflusszytometrische Bestimmung absoluter

Zellzahlen)

Um durchflusszytometrisch nicht nur relative, sondern auch absolute Zellzahlen

bestimmen zu können, wurden Referenzzellen nach der Methode von PECHHOLD et al.

(1994) in der Modifikation von HENDRICKS (1998) eingesetzt. Der Messprobe mit

unbekannter Zellmenge wurde eine bekannte Anzahl von fluorochrommarkierten bovinen

mononukleären Zellen (s. 3.1.6) zugegeben, die sich durch ihre erhöhte FL4-Fluoreszenz

von anderen Zellen differenzieren lassen. Der Messprobe wurden je nach deren Zelldichte

4-10 x 104 Referenzzellen zugesetzt. Über folgende Formel konnte unabhängig vom

untersuchten Volumen die absolute Zellzahl in einer Probe bestimmt werden:

gemessenllen Referenzze Anzahlzugesetzt Probeder llen Referenzze Anzahlgemessen Leukozyten Anzahlabsolut Zellzahl ×

=

Die Berechnung der absoluten Zellzahlen bei durchflusszytometrischen Untersuchungen

mittels Referenzzellmethode soll durch ein Beispiel verdeutlicht werden:

Zu einer Suspension mit unbekannten Zellmengen verschiedener

Leukozytensubpopulationen werden 50 µL der Referenzzellsuspension mit bekannter

Zellzahl (50.000 Referenzzellen/50 µL) hinzugegeben.


49

Ein unbekanntes Volumen des entstandenen Zellgemisches wird im Durchflusszytometer

analysiert (s. 3.2.2). Aufgrund morphologischer Charakteristika und unterschiedlicher

Fluoreszenzintensitäten können die Leukozytensubpopulationen sowohl untereinander (s.

3.2.4), als auch von den Referenzzellen differenziert werden. Wie in Abbildung 1

dargestellt, kann mit Hilfe des Auswertungsprogramms WinMDI© (TROTTER 1999) die

Zellzahl jeder einzelnen Zellpopulation des durchflusszytometrisch analysierten Teils der

Gesamtprobe bestimmt werden.

Im vorgestellten Beispiel enthielt die durchflusszytometrisch analysierte Zellsuspension

2.431 Zellen der zu bestimmenden Zellpopulation GAL. Von den insgesamt 50.000

eingesetzten Referenzzellen wurden bei dieser Messung 611 Zellen detektiert (GAR).

Nach der oben angegebenen Formel ergibt diese folgende Berechnung:

936.198611

431.2000.50=

×

Die untersuchte Leukozytensuspension enthält etwa 198.936 Granulozyten/Probe.

Abb. 1: Charakteristische durchflusszytometrische Zweiparameterdarstellung („Dotplot“) Leukozyten mit Referenzzellen.

Die Abbildung zeigt die Korrelation zwischen der Komplexität der Zellen (SSC, Ordinate) und der Fluoreszenzintensität der Zellen im FL4-Bereich (Abszisse). Dargestellt sind die gemessenen Referenzzellen (GAR) und die Zellen, deren absolute Zellzahl in der Gesamtprobe bestimmt werden soll (GAL, in diesem Fall: Granulozyten). Abkürzungen: FL., Fluoreszenz; GAR, gemessener Anteil der Referenzzellen (pro FACS-Messung); GAL, gemessener Anteil der Leukozytensuspension (pro FACS-Messung); SSC, „side scatter“.


50

3.2.4 Leukozytendifferenzierung

Durchflusszytometrische Leukozytendifferenzierung

Aufgrund der Morphologie und der Eigenfluoreszenz lassen sich bovine Leukozytensub-

populationen mit Hilfe des Durchflusszytometers (s. 3.1.1 und 3.2.2) differenzieren.

Eosinophile Granulozyten weisen im FL1-Bereich (s. Abb. 2, Mitte) eine höhere

Eigenfluoreszenz auf als neutrophile Granulozyten. Wegen ihrer höheren Komplexität

unterscheiden sich die Granulozyten im SSC (s. Abb. 2, links) von mononukleären Zellen

(MNC). Diese können wiederum aufgrund ihrer unterschiedlichen Größe im FSC (s.

3.2.2) differenziert werden, da Monozyten / Makrophagen im Durchschnitt größer als

Lymphozyten sind. Nicht berücksichtigt werden die basophilen Granulozyten, wobei

deren Anteil maximal 2% der Gesamtleukozyten ausmachen sollte (KRAFT und DÜRR

1999).

Abb. 2: Charakteristische durchflusszytometrische Zweiparameterdarstellungen („Dotplots“) boviner Leukozyten.

In der linken Abbildung (FSC/SSC) werden die morphologischen Eigenschaften der Zellen miteinander korreliert. Die Abszisse entspricht der Zellgröße und die Ordinate der Komplexität der Zelle. (D – Zelldetritus; G – Granulozyten; M – Monozyten; L – Lymphozyten). Die mittlere Abbildung (FL1/SSC) zeigt die Korrelation zwischen der Fluoreszenzintensität im grünen Bereich (FL1, Abszisse) und der Komplexität der Zellen (SSC, Ordinate). (E – eosinophile Granulozyten; N – neutrophile Granulozyten). Die rechte Abbildung (FL4/SSC) zeigt die Beziehung zwischen der Fluoreszenzintensität im roten Bereich (FL4, Abszisse) und der Komplexität der Zellen (SSC, Ordinate). Durch den Zusatz von To-Pro-3 in der Probe stellen sich membrangeschädigte Zellen rot dar (T – tote Zellen). Abkürzungen: FL, Fluoreszenz, FSC, „forward scatter“, SSC, „side scatter“.


51

3.2.5 Vitalitätsbestimmung

Acridinorange-Ethidiumbromid

Die Vitalitätsbestimmung wurde mit Hilfe der Acridinorange-Ethidiumbromid Färbung und

der Fluoreszenz-Mikroskopie durchgeführt.

Die Gebrauchslösung enthielt 2,5 mg Acridinorange (s. 3.1.2) und 2,5 mg Ethidiumbromid

(s. 3.1.2), die in 1.000 mL PBS (s. 3.1.3) mit 0,02% NaN3 (s. 3.1.2) gelöst wurden.

Grünfluoreszierende Acridinorange (AO) dringt in alle Zellen ein und fluoresziert nach

Interkalierung mit der doppelsträngigen DNA grün. Ethidiumbromid (EB) lagert sich an die

Zellmembran an, gelangt jedoch nicht durch die intakte Kernmembran. Verliert die Zelle

ihre Kernmembranintegrität, so dringt der rotfluoreszierende Farbstoff in den Kern ein. Die

Rotfluoreszenz des Ethidiumbromids überlagert dabei die Grünfluoreszenz des

Acridinoranges. Die rotfluoreszierenden Zellen werden als nicht vital beurteilt.

Durchflusszytometrische Beurteilung der Zellvitalität

Geschädigte Zellen zeigen häufig Veränderungen in Größe und Komplexität. Außerdem

lassen sich Membranintegritätsverluste durch Anwendung von To-Pro-3iodide (To-Pro-3,

s. 3.1.2 und 3.1.5) nachweisen, da To-Pro-3 durch Zellmembrandefekte ins Zellinnere

gelangt und im Zellkern mit der DNA-Doppelhelix interkaliert. To-Pro-3-positive („tote“)

Zellen liefern Fluoreszenzsignale in FL4 und unterscheiden sich so von membranintakten

(„vitalen“) Zellen. Für den Einsatz dieses Fluorochroms muss das verwendete

Durchflusszytometer mit einem zusätzlichen Diodenlaser (Helium-Neon-Laser) mit der

Anregungswellenlänge von 635 nm ausgestattet sein, da nur dieser den Farbstoff zur

Aussendung seines spezifischen Fluoreszenzlichtes anregt.

Mit dieser Methode können jedoch nicht jene membrangeschädigten Zellen detektiert

werden, deren zelluläre Struktur soweit zerstört wurde (Zellbruchstücke), dass sie keine

DNA-Reste mehr enthalten, oder deren Bruchstücke so klein sind, dass sie bei den

gegebenen Einstellungen des Durchflusszytometers nicht erkannt werden können. Somit

werden mit To-Pro-3 nur kern- bzw. ausreichend DNA-haltige, genügend große tote

Zellen erfasst.


52

3.2.6 Bestimmung reaktiver Sauerstoffspezies

Zur Abtötung von Mikroorganismen besitzen die neutrophilen Granulozyten neben der

Aktivierung von zahlreichen lysosomalen Enzymen auch die Fähigkeit, mikrobizide

Sauerstoffmetaboliten (ROS) (SAWYER et al. 1989) zu generieren. Die in vivo u.a.

durch Mikroorganismen verursachte Aktivierung des Schlüsselenzyms beim

Sauerstoffmetabolismus - die NADPH-Oxidase - wurde hier in vitro durch die Zugabe

von PMA (s. 3.1.2 und 3.1.7) erreicht. PMA ist ein rezeptorunabhängiger ROS-Stimulator

(EMMENDÖRFFER et al. 1990).

Die NADPH-Oxidase katalysiert spontan oder zusammen mit der Superoxid-Dismutase die

Bildung des relativ schwach toxischen Wasserstoffperoxids, das aber mit Hilfe von

Halogenionen durch die Myeloperoxidase aus den primären Granula zu einer stark

bakteriziden unterchlorigen Säure umgesetzt wird (CLIFFORD u. REPINE 1982). Um die

intrazelluläre Bildung von Wasserstoffperoxid nachzuweisen, wird der PMA-stimulierten

Zellsuspension DHR 123 (s. 3.1.2 und 3.1.7) hinzugegeben, welches durch die

Myeloperoxidase in das grünfluoreszierende Rhodamin 123 umgebaut wird. Da dieses

Oxidationsprodukt an den Membranen der Zelle haftet und sie nicht verlassen kann, sind

Granulozyten mit erhöhtem Sauerstoffmetabolismus aufgrund ihrer Grünfluoreszenz

differenzierbar.

3.2.6.1 Herstellung der eingesetzten Zellsuspension

Falls nicht anders angegeben, wurden die PMNs jeder Spezies auf die finale Konzentration

von 6 x 106 Zellen pro mL DMEM eingestellt und auf Eis bei 4°C bereitgehalten.

3.2.6.2 Vorbereitung des Testansatzes (der Reagenzien für den ROS-Test)

Die DHR-Gebrauchslösungen (s. 3.1.7) wurden unmittelbar vor Versuchsdurchführung

aufgetaut. Aus der ersten Gebrauchslösung (15 µg/mL) wurde durch Verdünnung mit PBS

(1:5) eine Arbeitslösung von 3 µg/mL für den Test ohne Percoll (Plastik-Test) erstellt, für


53

den Test mit Percoll™-Kissen (Percoll-Test) wurde die zweite Gebrauchslösung (22,5

µg/mL) ohne weitere Verdünnung eingesetzt.

Die PMA-Stammlösung (1 mmol/L, s. 3.1.7) wurde ebenfalls direkt vor der

Versuchsdurchführung aufgetaut. Um die Endkonzentrationen im Testansatz von 0, 1, 10,

100, 1.000, 10.000 nmol/L zu erzielen, wurden mit PBS zwei Verdünnungsreihen

angesetzt: die erste Verdünnungsreihe für den Percoll-Test mit 0, 30, 300, 3.000, 30.000

und 300.000 nmol/L PMA, die zweite für den Plastik-Test mit 0, 4, 40, 400, 4.000 und

40.000 nmol/L PMA.

3.2.6.3 Ansatz der Percoll-Kissen

Um möglichst feindisperses isotones Percoll (ohne Kristallbildung oder anderweitig

bedingte Trübung) zu benützen, wird jeweils am Testtage steriles nicht isotones Percoll

(s. 3.1.2) in der benötigten Menge frisch mit NaCl versetzt (100%iges frisches isotones

Percoll, s. 3.1.4). Dieses wurde mit der zweiten DHR-Gebrauchslösung (s. 3.1.7) von 22,5

µg/mL Konzentration und den vorverdünnten PMA-Lösungen für den Percoll-Test (s.

3.2.5.2) so vermischt, dass im vollständigen Testansatz (einschließlich der Zellsuspension)

das DHR in einer Endkonzentration von 0,75 µg/mL und das PMA in den für den

jeweiligen Versuch gewünschten Endkonzentrationen von 0, 1, 10, 100, 1.000 und 10.000

nmol/L vorliegt (jeweils 5 µL DHR und PMA-Vorverdünnung zu 90 µL 100%iges isotones

Percoll). Damit wird ein 90%iges Percoll-Kissen erreicht. Dieser Ansatz der Percoll-Kissen

soll unmittelbar vor dem Einpipettieren in die Mikrotiterplatte unter lichtgeschützten

Kautelen erfolgen.

3.2.6.4 Durchführung der ROS-Tests

3.2.6.4.1 Percoll-Test: Induktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) auf Percoll-

Kissen

In Triplikaten wurden 100 µL Percoll-Kissen (s. 3.2.6.3) mit jeder PMA-Konzentration (s.

3.2.6.2) je Vertiefungen einer 96-Well-Rundbodenmikrotiterplatte (s. 3.1.1) vorgelegt. Auf


54

jedes Percoll-Kissen wurden 50 µL der PMN-Suspension (6 x 106 PMN/mL DMEM)

vorsichtig überschichtet. Die abgedeckten Platten wurden für 45 Minuten bei 37°C und 5%

CO2 in Luft inkubiert. Anschließend wurde die Reaktion durch Abkühlung der Platte auf

Eis bei 4°C für 20 Minuten im Dunkeln gestoppt.

3.2.6.4.2 Plastik-Test: ROS-Induktion auf Plastik ohne Percoll-Kissen

In jede Vertiefung einer 96-Well-Rundbodenmikrotiterplatte (s. 3.1.1) wurden 25 µL der

ersten DHR-Arbeitslösung (3 µg/mL, s. 3.2.6.2) und 25 µL der jeweiligen in 4facher

Endkonzentration vorbereiteter PMA-Lösungen in PBS (s. 3.1.3) für den Plastik-Test (s.

3.2.6.3) vorgelegt. Anschließend wurden 50 µL der PMN-Suspension (6 x 106 PMN/mL

DMEM) zugegeben. Alle Ansätze wurden in Triplikaten durchgeführt. In der abgedeckten

Platte folgte eine 45minütige Inkubation bei 37°C und 5% CO2 in Luft. Die Reaktion wurde

durch Abkühlung der Platte auf Eis bei 4°C für 20 Minuten im Dunkeln gestoppt.

3.2.6.5 Durchflusszytometrische Auswertung der ROS-Produktion

Vorbereitende Maßnahmen

Während des ROS-Tests wurden je FACS-Röhrchen (s. 3.1.1) 100 µL Sheath (s. 3.1.5)

vorgelegt und bei 4°C auf Eis gekühlt.

Die To-Pro-3 Gebrauchslösung (1 µmol/L PBS, s. 3.1.5) wurde 10 Minuten vor der

Messung dem Ansatz mit einer Endkonzentration von 0,1 µmol/L zugesetzt.

Messdurchführung

Für den Percoll-Test waren zusätzliche Einstellungen zu beachten:

1. Da das Percoll (wenig bei frischem, mehr bei altem) in der Leukozyteneinstellung

hineinstrahlt, und damit die Anzahl der erfassten Zellen mindert (s. Abb. 3: Region 1), muss

vor dem Messen des Percoll-Tests eine bestimmte Voreinstellung durchgeführt werden

(lifegate, s. 3.2.2): man schneidet mit der Region 1 (R1) im Dotplot Fenster SSC/FSC

Percoll heraus und gatet R1 not, damit nur eingesetzte PMN erfasst werden können.


55

Abb. 3: Notwendige Voreinstellung (lifegate) beim durchflusszytometrischen Messen nach dem Percoll-Test.

In der linken Abbildung (FSC/SSC) werden die morphologischen Eigenschaften der Zellen miteinander korreliert. Die Abszisse entspricht der Zellgröße und die Ordinate der Komplexität der Zelle. (PMN – neutrophilen Granulozyten; Ref.Zellen – Referenzzellen (bovine mononukleäre Zellen); Region 1 – Percoll Partikel). Die rechte Abbildung (FSC/SSC) zeigt das Leukozytenbild ohne Percoll Partikel. Abkürzungen: FSC, forward scatter, SSC, side scatter

2. Auch für den Percoll-Test war ein langsamer Messmodus erforderlich, um

Zellverformung bei der schnellen Erfassung zu vermeiden (s. Abb.4).

Die Proben wurden unmittelbar vor der Messung aus der Mikrotiterplatte durch

gründliches Pipettieren entnommen und in die vorbereiteten FACS-Röhrchen (s. oben)

gegeben, gut durchgemischt und sofort, wenn nicht anders beschrieben, gemessen. Die

Platte blieb dabei im Dunkeln und bei 4°C auf Eis stehen. Es wurden jeweils 10.000

Events pro Ansatz im Durchflusszytometer (s. 3.1.1) gemessen. Die Daten wurden dann

mit Hilfe des Computerprogrammes WinMDI© (TROTTER 1999) ausgewertet. Da in

diesem Fall die eosinophilen Granulozyten nicht von den neutrophilen zu unterscheiden

waren, mussten sie bei der Messung der mittleren Fluoreszenzintensität mit berücksichtigt

werden. Der Mittelwert der drei Fluoreszenzintensitäten (Triplikate) der Granulozyten

galt als Ergebnis der jeweiligen Probe.


56

Langsamer Messmodus

Schneller Messmodus

Abb. 4: Zellverformung durch Percoll bei schnellem Messmodus im FASCCalibur©.

Von drei gesunden Rindern wurden Triplikate à 3 x 105 gereinigter PMN (s. 3.2.1.2.1) in 50 µL DMEM (s. 3.1.3) entweder direkt in die Vertiefung (auf Plastik) oder auf ein zuvor in dieselbe Mikrotiterplatte eingefülltes Kissen aus 100 µL isotonem Percoll (s. 3.1.4) eingebracht. Die Zellen wurden für 45 Minuten bei 37°C und 5% CO2 in Luft inkubiert. Die Reaktion wurde durch Transfer der Platten auf 4°C (feuchtes Eis) beendet. Es folgte die zellmorphologische Analyse im Durchflusszytometer (s. 3.2.6.5) mit schnellem und langsamem Messmodus. Die Darstellung zeigt die Zellkomplexität (SSC) in Abhängigkeit von der Größe (FSC) der Zellen. Abkürzungen: FSC, forward scatter, SSC, side scatter


57

3.2.7 Datenverarbeitung und statistische Auswertung

Alle durchflusszytometrisch gewonnenen Daten wurden mit Hilfe der Software

WinMDI© (TROTTER 1999) analysiert und ausgewertet. Mit der Software Extract©

(SCHUBERTH 1993) konnten durch WinMDI© gewonnene Daten umformatiert und

dadurch in Microsoft Excel® weiter verarbeitet werden.

Die beschreibenden Parameter Mittelwert (MW), Standardabweichung (SD) und

Variationskoeffizient wurden mittels der Excel-Statistikfunktion berechnet. Bei den

dargestellten Mittelwerten handelt es sich um das arithmetische Mittel, die

Standardabweichungen geben an, wie weit die jeweiligen Werte um den Mittelwert

streuen.

Alle Testverfahren zur Charakterisierung von PMN-Parametern wurden an Triplikaten

oder Quadruplikaten durchgeführt, und es wurden mindestens 10.000 Events

durchflusszytometrisch beurteilt. Die mittleren Fluoreszenzintensitäten der Triplikate

oder Quadruplikate eines Tieres und von einem Ansatz streuten um maximal 10%.

Ergebnisse

58

4 Ergebnisse

4.1 Zellverluste und ihre Ursachen

In der Immunologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover wurden für Untersuchungen

funktioneller Eigenschaften neutrophiler Granulozyten zum Nachweis reaktiver

Sauerstoffspezies (ROS) bisher zwei relative Messverfahren regelmäßig eingesetzt: Die

Methode nach EMMENDÖRFFER et al. (1990) und das daraus von ZERBE et al. (1996)

modifizierte Verfahren (s. 3.2.6.4.2). Dabei werden im Durchflusszytometer die relativen

Anteile der negativ und positiv reagierenden PMN sowie die Intensität von positiven PMN

bewertet, die aus den Reaktionsansätzen in Plastikgefäßen entnommen werden können. Erst

durch die Umstellung von der relativen auf die absolute Durchflusszytometrie mit Hilfe der

Referenzzellmethode von PECHHOLD et al. (1994) in der Modifikation von

HENDRICKS (1998) (s. 3.2.3.1.1) konnten erhebliche und sehr variable Verluste an PMN

in den unterschiedlichen Reaktionsansätzen dokumentiert werden. Damit wurde fraglich,

wie repräsentativ die aus den Ansätzen gewonnen „restlichen“ PMN für die zu prüfende

und in die Reaktion eingesetzte Zellpopulation war. Zuvor aber war zu prüfen, warum es zu

den Zellverlusten kam.

4.1.1 Plastikadhärenz als Ursache für Zellverluste

Auf Grund vorausgegangener Beobachtungen, dass in Abhängigkeit von der Stimulation

der PMN unterschiedliche große Verluste auftraten und dabei vermehrt Zellen am Boden

des Reaktionsgefäßes aus Plastik stark adhärent zurückblieben, wurde als ein wesentlicher

Verlusteinfluss die intensive Plastikadhärenz von PMN vermutet. Zur Verminderung des

Kontaktes von PMN mit der Plastikoberfläche von Reaktionsgefäßen wurde ein Verfahren

adaptiert, das ZERBE et al. (2003) zur Minderung des PMN-Verlustes in der

Transmigrationskammer erfolgreich einsetzen: Die PMN durch ein Percoll-Kissen am

Kontakt mit der Plastikoberfläche zu hindern.

In drei unabhängigen Versuchen mit 3 unterschiedlichen gesunden Spendern wurden

jeweils Triplikate von 3 x 105 aufgereinigte PMN (s. 3.2.1.2.1.1) pro Vertiefung in

Ergebnisse

59

derselben Mikrotiterplatte (s. 3.1.1) sowohl direkt auf dem Plastikboden (s. 3.2.6.4.2) als

auch auf einem Percoll-Kissen von 50 µL und von 100 µL für 45 Min. bei 37°C und 5%

CO2 in Luft mit und ohne PMA (s. 3.1.7) oder DHR (s. 3.1.7) inkubiert (s. 3.2.6.4.1). Die

quantitative Auswertung der aus der Mikrotiterplatte zurückgewonnenen PMN erfolgte im

Durchflusszytometer anhand der Referenzzellmethode (s. 3.2.3.1.1).

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 - 0 + 1 + 10 + 100 + 1000 + 10000 +PMA nmol/L und DHR (-/+)

Zellv

erlu

ste

in %

Ohne Percoll-Kissen 50 µl Percoll-Kissen 100 µl Percoll-Kissen

Abb. 5: Zellverluste gereinigter PMN nach 45 Minuten Inkubation in Mikrotiterplatten entweder direkt auf Plastik, oder auf 50 µL bzw. auf 100 µL Percoll-Kissen.

Von drei gesunden Rindern wurden Triplikate à 3 x 105 gereinigter PMN (s. 3.2.1.2.1.1) in 50 µL DMEM (s. 3.1.3) entweder direkt in die Vertiefung (auf Plastik) oder auf ein zuvor in dieselbe Mikrotiterplatte eingefülltes Kissen aus 50 µL oder 100 µL isotonem Percoll (s. 3.1.4) eingebracht. Es wurden 3 verschiedene Ansätze parallel durchgeführt: 1. Zellen ohne jeden Zusatz (0-), 2. Zellen mit dem Zusatz von 0,75 µg/mL DHR (s. 3.1.7 und 3.2.6.3)(0+), 3. Zellen mit 0,75 µg/mL DHR und mit zusätzlichem Zusatz von PMA (s. 3.1.7 und 3.2.6.3) in Endkonzentrationen von 1 bis 10.000 nmol/L. Es folgte eine Inkubation für 45 Minuten bei 37°C und 5% CO2 in Luft. Die Reaktion wurde durch Transfer der Platten auf 4°C (feuchtes Eis) beendet und die Zellen im Durchflusszytometer (s. 3.2.6.5) mit der Referenzzellmethode (s. 3.2.3.1.1) quantifiziert. Die Abbildung zeigt Mittelwerte und Standardabweichungen von 3 Untersuchungen, bezogen auf die absolute Zahl vitaler eingesetzter PMN (=100%). Abkürzungen: PMA, Phorbol-Myristat-Acetat, DHR, Dihydrorhodamin 123

Ergebnisse

60

Bereits ohne Stimulation mit PMA und in Abwesenheit des Indikators DHR waren nach 45

Minuten Inkubation von den direkt auf Plastik kultivierten Zellen nur ca. 50% wieder zu

gewinnen (Abb.5: 0-). Die Zugabe von DHR hatte keinen Einfluss auf den Zellverlust

(Abb.5: 0+). Durch Zugabe von PMA war ab einer Konzentration von 10 nmol/L ein

steigender Zellverlust zu sehen, der bei 100 – 10.000 nmol PMA/L in die Andeutung eines

Plateaus (75-82% PMN-Verlust) überging. In anderen Untersuchungen (vgl. Abb. 9) waren

die Verluste noch erheblich stärker, teils. bis zu 95%.

Durch ein Percoll-Kissen von 50 µL ließen sich die PMN-Verluste ohne Stimulation von

50% auf 25% mindern. Ab einer Stimulation von 10 nmol/l PMA stiegen die Zellverluste

deutlich bis über 60% an. Im Gegensatz dazu waren bei 100 µL Percoll-Kissen bis 10

nmol/L nahezu keine Verluste zu erkennen. Allerdings traten ab 100 nmol/L PMA-

Stimulation langsam steigende Zellverluste bis zu 20% ein. Hierbei ist zu berücksichtigen,

dass die Ergebnisse in Abb. 5 sowohl die Inkubation in den Mikrotiterplatten (s. 3.1.1) als

auch den vorübergehenden Aufenthalt in den Plastikröhrchen während der

durchflusszytometrischen Auswertung umfassten (vgl. 4.1.3).

Wie aus Abbildung 6 zu ersehen ist, besteht bei 50 µL Percoll eine schräge und somit noch

relativ große Kontaktfläche zwischen Zellsuspension und Plastikwand, welche durch ein

Percollvolumen auf 100 µL zwar vermindert, jedoch nicht ganz beseitigt wird. Diese

verbleibende Adhärenzfläche könnte bei stärker aktivierten PMN zu den Zellverlusten bis

zu 20% beitragen.

Abb. 6: Schematische Darstellung von Percoll-Kissen.

Die Abbildung zeigt die Percoll-Kissen in der Vertiefung einer Mikrotiterplatte. Unten (gestreift) isotones Percoll (s. 3.1.4) links = 50 µL und rechts = 100 µL. Oben (rot) sind 50 µL PMN-Suspension (s. 3.2.1.2.1.1) in DMEM (s. 3.1.3) darauf geschichtet.

Ergebnisse

61

4.1.2 Einfluss von PMA, Plastik oder Percoll auf die Vitalität der Zellen

Um zu prüfen, ob neben der Adhärenz Zelltod durch PMN-Kultivierung mit und ohne

PMA-Stimulation eine Ursache für Zellverluste sein könnte, wurde nach Präparation und

Behandlung gereinigter PMN wie unter 4.1.1 den Zellen erst in den Röhrchen (s. 3.1.1)

kurz vor der durchflusszytometrischen Messung der Fluoreszenzfarbstoff To-Pro-3 (s.

3.1.5) zugegeben. Dieser ist nur in membrangeschädigten „toten“ Zellen (positive

Fluoreszenz), jedoch nicht in Zellen mit intakter Membran („vitalen“ Zellen) nachweisbar

(s. 3.2.5).

In Abbildung 7 sieht man, dass der relative Anteil von „toten“ (To-Pro-3-positiven) Zellen

(FL4-positiv) in der Ausgangssuspension an PMN vor der Inkubation mit 1,7%±1% sehr

niedrig war. Nach 45 minütiger Inkubation direkt auf Plastik ohne PMA-Stimulation waren

9%±2,2% der wiedergewinnbaren PMN (ca. 50% der eingesetzten PMN – vgl. Abb.5)

„tot“. Diese Zunahme an „toten“ Zellen verstärkte sich bei 10 nmol/L PMA auf 19%±4,3%

und bei 10.000 nmol/L PMA auf 30,3%±2% (zusätzlich zu den starken Zellverlusten – vgl.

Abb.5). Bei den gleichen Zellen unter identischen Bedingungen, jedoch auf einem Kissen

von 100 µL Percoll inkubiert, blieb der Anteil an „toten“ Zellen unter 2%, selbst bei

maximaler PMA-Konzentration von 10.000 nmol/L.

Ergebnisse

62

In der Ausgangssuspension

Auf Plastik

Auf Percoll

Abb. 7: Vitalitätsunterschiede zwischen PMN, die auf Plastik und Percoll mit und ohne PMA-Stimulation inkubiert wurden.

Von drei gesunden Rindern wurden Triplikate à 3 x 105 gereinigter PMN (s. 3.2.1.2.1.1) in 50 µL DMEM (s. 3.1.3) pro Vertiefung entweder direkt auf Plastik oder auf ein zuvor in dieselbe Mikrotiterplatte eingefülltes Kissen aus 100 µL isotonem Percoll (s. 3.1.4) eingebracht. Die Zellen wurden entweder ohne jeden Zusatz, allein durch Zusatz von 0,75 µg/mL DHR (s. 3.1.7 und 3.2.6.3) oder mit zusätzlichem PMA (s. 3.1.7 und 3.2.6.3) in Endkonzentrationen von 1 bis 10.000 nmol/L für 45 Minuten bei 37°C und 5% CO2 in Luft inkubiert. Die Reaktion wurde durch Transfer der Platten auf 4°C (feuchtes Eis) beendet und die Zellen im Durchflusszytometer (s. 3.2.6.5) mit der Referenzzellmethode (s. 3.2.3.1.1) quantifiziert. In den oberen Quadranten sind jeweils Mittelwerte und Standardabweichungen der relativen Anteile der To-Pro-3-positiven Zellen (rechts im Fluoreszenzkanal 4: FL4) von je 3 Untersuchungen angegeben. Abkürzungen: FL4, Fluoreszenzintensität 4, SSC, side scatter, PMA, Phorbol-Myristat-Acetat, DHR, Dihydrorhodamin 123

Ergebnisse

63

Wird eine Kultivierung und Aktivierung von PMN auf einem Percoll-Kissen von 100 µL /

Vertiefung ausgeführt, dürfte zumindest der Zelltod als Ursache für die - relativ geringen -

Verluste bei höheren PMA-Konzentrationen (ab 100 nmol/L – vgl. Abb. 5) auszuschließen

sein. Im Gegensatz dazu könnte bei einer PMN-Kultivierung direkt auf Plastik,

insbesondere bei einer zusätzlichen Aktivierung durch PMA neben Adhärenz auch Zelltod

für die erheblichen PMN-Verluste verantwortlich sein. Zu dem erhöhten Zelltod (To-Pro-3

Positivität) mag aber auch verstärktes Pipettieren beigetragen haben, um möglichst viele der

plastikadhärenten Zellen zur Auswertung zur Verfügung zu haben.

4.1.3 Zellverluste in Probenröhrchen

Die starke Plastikadhärenz von PMN in Mikrotiterplatten (4.1.1) verlangte auch die

Überprüfung möglicher Adhärenzverluste in den Probenröhrchen („FACS-Röhrchen“, s.

3.1.1), in die die Zellen am Ende ihrer Inkubation in Mikrotiterplatten zur

durchflusszytometrischen Auswertung überführt wurden.

Zu diesem Zweck wurden direkt aus der Stammsuspension (ohne vorherige Behandlung in

einer Mikrotiterplatte) Quadruplikate von 1 x 105 und 3 x 105 gereinigten PMN (s.

3.2.1.2.1.1) pro 50 µL DMEM von 3 Tieren in zwei verschiedenen Arten von FACS-

Röhrchen (Polypropylen: PP und Polystyrol: PS) (s. 3.1.1) in 100 µl Sheath mit To-Pro-3

(s. 3.1.5) einpipettiert und 40 Minuten auf Eis bei 4°C gehalten oder sofort (unter 1 Minute)

nach gründlicher Resuspension durch Schütteln mit der Referenzzellmethode (s. 3.2.3.1.1)

im Durchflusszytometer quantitativ gemessen.

Im Hinblick auf die Vitalität der PMN war zu keinem der beiden Zeitpunkte eine Zunahme

an „toten“ (To-Pro-3-positiven) Zellen gegenüber der Stammsuspension festzustellen.

Anders war es im Hinblick auf Zellverluste (Abb. 8): Während beim Messen unmittelbar

nach dem Einfüllen der PMN in die „FACS-Röhrchen“ selten mehr als 5% Zellverlust

auftrat, waren allein bei unstimulierten PMN nach 40 Minuten auf Eis (4°C) Verluste bis zu

20% bei Polypropylenröhrchen und sogar bis über 60% bei Polystyrolröhrchen

auszumachen. Der relative Zellverlust war umso stärker, je geringer die eingesetzte Zellzahl

war. Somit ist nicht ausgeschlossen, dass die in Abb. 5 dokumentierten Zellverluste teils

auch auf Adhärenzverluste in den „FACS-Röhrchen“ zurückzuführen sind. Das könnte

Ergebnisse

64

insbesondere für die – relativ geringen - Verluste an stärker (100 nmol/L PMA und mehr)

stimulierten PMN auf Percoll relevant sein.

A)

PMN (1 x 10´5)

1,9

65,9

0

18,7

0

20

40

60

80

100

Unter 1 Minute 40 Minuten

Zellv

erlu

ste

in %

PS-RöhrchenPP-Röhrchen

B)

PMN (3 x 10´5)

5,9

32,6

011

0

20

40

60

80

100

Unter 1 Minute 40 Minuten

Zellv

erlu

ste

in %

PS-RöhrchenPP-Röhrchen

Abb. 8: Zellverluste gereinigter PMN ohne und nach 40 Minuten Inkubation auf Eis in unterschiedlichen „FACS-Röhrchen“.

Von drei gesunden Rindern wurden Quadruplikate von je 1 x 105(A) und 3 x 105 (B) gereinigter PMN (s. 3.2.1.2.1.1) in 50 µL DMEM (s. 3.1.3) in 2 unterschiedlichen „FACS-Röhrchen“ (Polypropylen:PP und Polystyrol:PS) in 100 µL vorgelegtes auf 4°C abgekühltes Sheath-To-Pro-3 (s. 3.1.5) eingebracht. Die Zellen wurden entweder sofort, oder nach 40 Minuten bei 4°C im Durchflusszytometer (s. 3.2.6.5) mit der Referenzzellmethode (s. 3.2.3.1.1) quantitativ ausgewertet. Die Abbildung zeigt Mittelwerte und Standardabweichungen der prozentualen Anteile wiedergefundener Zellen in Abhängigkeit von der Zeit und dem Material der Reaktionsgefäße. Die Werte sind dabei auf die absolute Zahl eingesetzter vitaler Zellen bezogen (unter 1 Minute, Popypropylen=100%).

Ergebnisse

65

Auf Grund dieser Ergebnisse wurden bei allen weiteren Untersuchungen die Zellen aus

jeder Vertiefung der Mikrotiterplatten (auf Eis) erst unmittelbar vor

durchflusszytometrischer Messung in ein Polypropylenröhrchen überführt und sofort

gemessen.

4.1.4 Zellverluste in Mikrotiterplatten unterschiedlicher Beschaffenheit

Die deutlich geringeren Zellverluste in Polypropylen- gegenüber Polystyrolröhrchen (4.1.3)

empfahlen die Prüfung von Mikrotiterplatten unterschiedlicher Beschaffenheit in der

Absicht, die Adhärenzverluste statt durch Percoll-Kissen (s. 3.2.6.3) durch weniger

adhärenten Platten, insbesondere durch sogenannte „low adherence plates“, auf „Percoll-

Niveau“ zu reduzieren.

Dazu wurden von jeweils 3 Tieren Triplikate von 3 x 105 PMN in 50 µL DMEM (s. 3.1.3)

pro Vertiefung in fünf verschiedenen Platten (s. 3.1.1) direkt auf Plastik und – in einer der

Platten - auch auf 100 µL Percoll-Kissen inkubiert: 1. ohne PMA oder DHR (s. 3.2.6.3), 2.

ohne PMA, jedoch mit DHR und 3. mit PMA und DHR. Die Ansätze wurden für 45

Minuten (37°C, 5%CO2 in Luft) inkubiert und nach Abkühlung auf 4°C mit der

Referenzzellenmethode (s. 3.2.3.1.1) im Durchflusszytometer quantitativ ausgewertet (s.

3.2.6.5).

Keine der geprüften fünf verschiedenen Mikrotiterplatten (s. Abb. 9) zeigte auch nur

annähernd geringe Zellverluste wie die Anwendung des Percoll-Kissens. Selbst die Non-

Binding Surface (NBSTM) Mikroplatten, die ohne und bis zu 1 nmol/L PMA-Stimulus - im

Gegensatz zu den weit stärkeren Zellverlusten der übrigen Platten - „nur“ 30-40% weniger

PMN zur Auswertung freigaben, konnten ab 10 nmol/L PMA Zellverluste von 70-80%

ebenfalls nicht verhindern. Somit konnte bisher keine Alternative zur Inkubation auf

Percoll-Kissen gefunden werden, wenn man die zu prüfende Zellpopulation zum größten

Teil oder vollständig in die durchflusszytometrische Auswertung einbeziehen will.

Ergebnisse

66

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 - 0 + 1 + 10 + 100 + 1.000 + 10.000 +PMA nmol/L und DHR (-/+)

Zellv

erlu

ste

in %

PS. Nerbe Plus PS. Greiner PS. TTP steril PP. Greiner Nicht adhärent Percoll

Abb. 9: Zellverluste gereinigter PMN nach 45 Minuten Inkubation in 5 unterschiedlich beschaffenen Mikrotiterplatten im Vergleich zum Percoll-Kissen.

Von drei gesunden Rindern wurden Triplikate à 3 x 105 gereinigter PMN (s. 3.2.1.2.1.1) in 50 µL DMEM (s. 3.1.3) entweder direkt in die Vertiefung von 5 unterschiedlichen Mikrotiterplatten (auf Plastik) oder auf ein zuvor in einer von diesen Mikrotiterplatten eingefülltes Kissen aus 100 µL isotonem Percoll (s. 3.1.4) eingebracht. Die Zellen wurden entweder ohne jeden Zusatz (0-), allein durch Zusatz von 0,75 µg/mL DHR (0+) (s. 3.1.7 und 3.2.6.3) oder zusätzlich mit PMA (s. 3.1.7 und 3.2.6.3) in Endkonzentrationen von 1 bis 10.000 nmol/L für 45 Minuten bei 37°C und 5% CO2 in Luft inkubiert. Die Reaktion wurde durch Transfer der Platten auf 4°C (feuchtes Eis) beendet. Die Bestimmung der Vitalität (s. 3.2.5) und der absoluten Zellzahl mittels Referenzzellmethode (s. 3.2.3.1.1) erfolgte anhand durchflusszytometrischer Messungen. Als vitale, nicht nekrotische Zellen sind die nachweisbaren To-Pro-3-negativen Zellen anzusehen. Dargestellt sind die Mittelwerte der absoluten Zahlen vitaler PMN in Prozent, bezogen auf die absolute Zahl eingesetzter vitaler Zellen (=100%), in Abhängigkeit von der im ROS-Test eingesetzten PMA-Konzentration sowie abhängig von der Zugabe von DHR. Die Fehlbalken stellen den Standardfehler (SEM, Standard Error of Mean) dar. Abkürzungen: PS. Nerbe Plus, Polystyrol Rundbodenplatten von Nerbe Plus (s.3.1.1), PS. Greiner, , Polystyrol Rundbodenplatten von Greiner (s. 3.1.1.), PS. TPP steril, Polystyrol sterile Rundbodenplatten von TPP (s. 3.1.1), PP. Greiner, Polypropylen Rundbodenplatten von Greiner (s. 3.1.1), Nicht adhärent, Non-Binding Surface Platten von Corning (s. 3.1.1), Percoll, Percoll-Kissen in Polystyrol Rundbodenplatten von Nerbe Plus (s. 3.1.1), PMA, Phorbol-Myristat-Acetat, DHR, Dihydrorhodamin 123

Ergebnisse

67

4.2 Aufbau eines modifizierten ROS-Verfahrens

Nach den vorteilhaften Aspekten des Percoll-Kissens im Hinblick auf die hohe

Wiederfindung der eingesetzten PMN und ihre nahezu hundertprozentige Vitalität war

nun zu prüfen, ob Percoll oder die Plastikoberfläche irgend einen erkennbaren Einfluss

auf die PMN haben und ob dieser die Induktion und Erfassung reaktiver

Sauerstoffmetaboliten (ROS) mittels DHR-Fluoreszenz beeinträchtigt.

4.2.1 Vergleich zwischen sequentieller und gleichzeitiger Zugabe von PMA

und DHR bei der Bestimmung reaktiver Sauerstoffspezies

In Vorversuchen (ohne Abbildung) war festgestellt worden, dass Zellen – nicht wie

erwartet alle auf der Percoll-Oberfläche liegen bleiben, sondern während der

Inkubationszeit bei 37°C in beachtlicher Menge in die oberen Percollschichten einsinken.

Deshalb werden reproduzierbare und zuverlässige Ergebnisse nur dann erzielt, wenn alle

Reagenzien, wie unter 3.2.6.3 beschrieben, gleichmäßig in Percoll und Überstand verteilt

werden, d.h. dass im gesamten Volumen aus 100 µL Percoll und 50 µL PMN die gleichen

Bedingungen und Konzentrationen gewährleistet sind. Das widerspricht allerdings der

Empfehlung von EMMENDÖRFFER et al. (1990), die eine optimale ROS-Induktion bei

sequentieller Zugabe von PMA (s. 3.1.7) und anschließend von DHR (s. 3.1.7) beschreiben.

Deswegen wurde im Hinblick auf die Erfassung der ROS-Produktion die sequentielle

Zugabe aller Reagenzien mit ihrer gleichzeitigen Gabe zu Beginn der Reaktion verglichen.

Dafür wurden von 3 Tieren Triplikate von 3 x 105 PMN in 50 µL DMEM (s. 3.1.3) pro

Vertiefung 15 Minuten bei 37°C und 5% CO2 in Luft vorinkubiert. Dem folgte die Zugabe

von PMA in den Endkonzentrationen von 0 bis 1.000 nmol/L (s. 3.2.6.4.2) mit weiteren 15

Minuten Inkubation und anschließender Zugabe von DHR in einer Endkonzentration von

0,75 µg/mL (s. 3.2.6.4.2) gefolgt von einer dritten Inkubation von 15 Minuten. Parallel dazu

wurden die gleichen Zellen in derselben Mikrotiterplatte direkt auf Plastik mit

entsprechender PMA- und DHR-Konzentration für 45 Minuten (37°C, 5% CO2 in Luft)

Ergebnisse

68

inkubiert. Anschließend wurden alle Proben im Durchflusszytometer (s. 3.2.6.5) qualitativ

im Hinblick auf ihre Fluoreszenzintensität (Indikator der ROS-Produktion) ausgewertet.

Dabei war eindrucksvoll festzustellen (s. Abb.10):

Die gleichzeitige Zugabe aller Reagenzien war nicht schlechter als die sequentielle

Methode. Sie war sogar sensitiver bei der Bestimmung der dosisabhängigen ROS-Induktion

(erzielte Fluoreszenzintensität FL1). Folglich wurde in allen nachfolgend beschriebenen

Untersuchungen die gleichzeitige Zugabe aller Reagenzien zu Beginn der Inkubationszeit

angewandt, sowohl bei Inkubation auf Plastik (Plastik-Test, s. 3.2.6.4.2) als auch auf

Percoll-Kissen (Percoll-Test, s. 3.2.6.4.1).

Ergebnisse

69

0

50

100

150

200

250

300

350

400

0 + 10 + 100 + 1.000 +

PMA nmol/L und DHR(+)

Fluo

resz

enzi

nten

sitä

t (FL

1)

Sequenzielle Zugabe Gleichzeitige Zugabe

Abb. 10: Vergleich der sequentiellen mit der gleichzeitigen Zugabe von PMA bzw. DHR im Hinblick auf die Bildung reaktiver Sauerstoffmetaboliten (ROS) durch PMN direkt auf Plastik.

Von drei gesunden Rindern wurden Triplikate à 3 x 105 gereinigter PMN (s. 3.2.1.2.1.1) in 50 µL DMEM (s. 3.1.3) direkt in die Vertiefung einer Mikrotiterplatte (auf Plastik) eingebracht. Die Zellen wurden für 15 Min. bei 37°C und 5% CO2 in Luft inkubiert, es folgte die Zugabe von PMA in Endkonzentrationen von 0 bis 1.000 nmol/L (s. 3.1.7 und 3.2.6.3) und eine weitere Inkubation für 15 Min. mit anschließender Zugabe von 0,75 µg/mL DHR (s. 3.1.7 und 3.2.6.3) und einer dritten Inkubation für 15 Min. unter sonst gleichen Bedingungen. Parallel wurden Triplikate derselben Zellen in derselben Platte mit zuvor eingefüllten 0,75 µg/mL DHR ohne (0+) und mit zusätzlichem PMA in Endkonzentrationen von 10 bis 1.000 nmol/L durchgehend für 45 Minuten bei 37°C und 5% CO2 in Luft inkubiert. Die Reaktion wurde durch Transfer der Platten auf 4°C (feuchtes Eis) beendet und die Zellen im Durchflusszytometer (s. 3.2.6.5) mit der Referenzzellmethode (s. 3.2.3.1.1) quantifiziert. Dargestellt sind Mittelwerte und Standardabweichungen der mittleren Fluoreszenzintensität (FL1) der To-Pro-3-negativen PMN sowohl nach der sequentiellen als auch nach gleichzeitiger Zugabe von PMA und DHR. Abkürzungen: PMA, Phorbol-Myristat-Acetat, DHR, Dihydrorhodamin 123

Ergebnisse

70

4.2.2 Einfluss von Percoll und von Plastik auf die Morphologie und die

„spontane“ ROS-Bildung von PMN

Um zu prüfen, ob Percoll oder Plastik Einfluss auf die Morphologie bzw. auf die

„spontane“ ROS-Bildung von PMN haben, wurden dieselben PMN-Präparationen unter

sonst identischen Bedingungen parallel im Plastik-Test (3.2.6.4.2) und im Percoll-Test (s.

3.2.6.4.1) untersucht:

Von 3 Tieren wurde zum selben Zeitpunkt Blut entnommen und daraus gereinigte PMN

gewonnen (s. 3.2.1.2.1.1). In Triplikaten wurden 3 x 105 PMN in 50 µL DMEM (s. 3.1.3)

direkt auf Plastik bzw. auf 100 µL Percoll-Kissen (s. 3.2.6.3) in denselben Mikrotiterplatten

mit DHR jedoch ohne PMA für 45 Minuten bei 37°C und 5% CO2 in Luft inkubiert.

Anschließend wurden alle Ansätze im Durchflusszytometer quantitativ ausgewertet (s.

3.2.6.5).

Abb.11 dokumentiert, dass allein durch den 45 minütigen Kontakt der PMN mit der Wand

des Plastikgefäßes sowohl die Morphologie der PMN verändert: Anstieg des Medianwertes

der Zellgröße (FSC) von 191 auf 202, als auch ihre ROS-Aktivität erhöht wird: Die mittlere

Fluoreszenzintensität (FL1) der Zellen stieg sogar von 1 auf 14 an. Diese Veränderungen

werden auf dem Percoll-Kissen offensichtlich verhindert: Die mittlere Zellgröße wird nicht

erhöht. Der FSC bleibt mit 187 sogar gering unter dem Ausgangswert von 191 und die

mittlere Fluoreszenzintesität bleibt mit 2 gegenüber 1 praktisch unverändert.

Diese auffälligen Veränderungen der PMN durch Inkubation auf Plastik ohne PMA sind

sehr reproduzierbar (vgl. auch Abb.12) und sprechen für eine Voraktivierung der PMN

durch die Plastikoberfläche, die sich bei Zugabe eines zu prüfenden Stimulans (wie PMA)

als unkontrollierbare Costimulation auswirken könnte.

Ergebnisse

71

Ausgangsuspension

ohne DHR

Ausgangsuspension

mit DHR

Plastik-Test

mit DHR

Percoll-Test

mit DHR

Abb. 11: Einfluss von Percoll und von Plastik auf die Morphologie und auf die „spontane“ ROS-Bildung von PMN.

Aus dem peripheren Blut von drei gesunden Rindern wurden gereinigte PMN isoliert (s. 3.2.1.2.1.1) und in Triplikaten von 3x105 PMN pro 50 µL DMEM (s. 3.1.3) in derselbe Mikrotiterplatte im Plastik- und Percoll ROS-Bildung Test (s. 3.2.6.4.2 & 1) mit DHR, aber ohne PMA (s. 3.1.7) Zugabe eingesetzt. Nach der 45 Min. Inkubation bei 37°C und 5% CO2 in Luft wurden die Zellen im Durchflusszytometer (s. 3.2.6.5) mit der Referenzzellmethode (s. 3.2.3.1.1) quantifiziert. Die Abbildung stellt die Komplexität (SSC) in Abhängigkeit von der Größe (FSC) und der DHR-Fluoreszenzintensität (FL1) dar. Es werden nur zellmembranintakte (To-Pro-3-negative) Ereignisse gezeigt. In den oberen Quadranten sind die mittleren Werte der relativen Einheiten der Größe (FSC) und Fluoreszenzintensität (FL1) gesamter Zellpopulation angegeben. Bei der hier gewählten Einstellung des Durchfusszytometers ist bei Zellen ohne DHR keine Fluoreszenz zu sehen (Ausgangsuspension ohne DHR). Abkürzungen: PMA, Phorbol-Myristat-Acetat, DHR, Dihydrorhodamin 123

Da diese Plastik bedingten Veränderungen der PMN auf dem Percoll-Kissen fehlen, war

nun zu prüfen, ob Percoll eine gezielte Stimulation (z.B. durch PMA) eventuell negativ

beeinflusst.

Ergebnisse

72

4.2.3 Einfluss von Percoll und Plastik auf die Bildung reaktiver

Sauerstoffspezies (ROS) von PMN nach konzentrationsabhängiger

Stimulation mit PMA

Um zu prüfen, welchen Einfluss Percoll oder die Plastikoberfläche auf die PMA induzierte

ROS-Bildung von PMN haben, wurden von 3 gesunden Rindern zum selben Zeitpunkt Blut

entnommen und daraus nach dem unter 3.2.1.2.1.1 beschriebenen Protokoll gereinigte

PMN gewonnen. Diese wurden unter sonst identischen Bedingungen im Plastik-Test

(3.2.6.4.2) und im Percoll-Test (s. 3.2.6.4.1) auf ihre ROS-Bildung in Anwesenheit

unterschiedlicher PMA-Konzentrationen (0 – 10.000 nmol/L) und 45 Min. Inkubation bei

37°C geprüft (s. Abb. 12 und Tab. 2 & 3).

Ergebnisse

73

Plastik-Test:

0 nmol/L PMA 1 nmol/L PMA 10 nmol/L PMA 100 nmol/L PMA 1.000 nmol/L PMA 10.000 nmol/L PMA

Percoll-Test:

0 nmol/L PMA 1 nmol/L PMA 10 nmol/L PMA 100 nmol/L PMA 1.000 nmol/L PMA 10.000 nmol/L PMA

Ergebnisse

74

Abb. 12: Einfluss von Percoll und von Plastik auf die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies von PMN mit und ohne PMA-Stimulation.

Von drei gesunden Rindern wurden Triplikate à 3 x 105 gereinigter PMN (s. 3.2.1.2.1.1) in 50 µL DMEM (s. 3.1.3) entweder direkt in die Vertiefung (auf Plastik) oder auf ein zuvor in dieselbe Mikrotiterplatte eingefülltes Kissen aus 100 µL isotonem Percoll (s. 3.1.4) eingebracht. Die Zellen wurden allein mit Zusatz von 0,75 µg/mL DHR (s. 3.1.7 und 3.2.6.3)(0 nmol/L PMA) oder mit PMA (s. 3.1.7 und 3.2.6.3) in Endkonzentrationen von 1 bis 10.000 nmol/L für 45 Minuten bei 37°C und 5% CO2 in Luft inkubiert. Die Reaktion wurde durch Transfer der Platten auf 4°C (feuchtes Eis) beendet und die Zellen im Durchflusszytometer (s. 3.2.6.5) mit der Referenzzellmethode (s. 3.2.3.1.1) quantifiziert. Die Abbildung stellt die Komplexität (SSC) in Abhängigkeit von der Fluoreszenzintensität FL1 dar. Es werden nur zellmembranintakte (To-Pro-3-negative) Ereignisse gezeigt. In den oberen Quadranten sind die repräsentativen Werte der mittleren Fluoreszenzintensität FL1 eines Tiers angegeben. Die mittlere Fluoreszenzintensität (FL1) stellt das Maß für die ROS-Bildung dar. Abkürzungen: PMA, Phorbol-Myristat-Acetat, DHR, Dihydrorhodamin 123, FL1, Fluoreszenzintensität FL1

Ergebnisse

75

Die Ergebnisse bestätigen (vgl. Abb. 11), dass die PMN im Plastik-Test schon allein durch

Kontakt mit der Plastikoberfläche deutlich voraktiviert (0 nmol/L PMA: 27 im Gegensatz

zu 2 bei denselben PMN auf Percoll) werden. Die Stimulation mit niedrigen Dosen von 1

und 10 nmol/L PMA führten nur auf Percoll zu einer deutlichen Steigerung der ROS-

Bildung. Erst ab 100 nmol/L PMA zeigen PMN auf Plastik eine deutliche Zunahme ihrer

ROS-Produktion (236), die jedoch noch deutlich geringer ausfällt als bei denselben Zellen

auf Percoll mit nur 10 nmol/L PMA (1.268). Gegenüber der ROS-Produktion bei gleicher

PMA-Konzentration (100 nmol/L) auf Percoll (2.159) macht diejenige derselben Zellen auf

Plastik nur etwa 10% davon aus (236). Während bei den Zellen auf Percoll die maximale

ROS-Produktion (2.159) bereits bei 100 nmol/L PMA erreicht ist, wird das Maximum auf

Plastik erst mit 10.000 nmol/L PMA erzielt. Es erreicht mit einer mittleren

Fluorezenzintensität von 1.362 jedoch lange nicht das Niveau derselben Zellen auf Percoll

(2.076-2.159).

Die Unterschiede zwischen Plastik-Test und Percoll-Test werden deutlicher, wenn man die

Differenzen darstellt (s. Tab. 2), und noch deutlicher, wenn man Quotienten bildet (s. Tab.

3).

Ergebnisse

76

Tab. 2: Vergleich der Delta-Werte der PMN aus Plastik-Test und Percoll-Test bezüglich der ROS-Bildung

Delta-Werte Mittlere Fluoreszenzintensität (FL1)1

PMA (nmol/L) DHR (µg/mL) Tier Plastik-Test Percoll-Test 1 0,75 1

2 3

1 0 2

10 2 2

10 0,75 1 2 3

10 9 12

1.266 1.217 744

100 0,75 1 2 3

209 207 240

2.157 2.049 1.825

1.000 0,75 1 2 3

1.192 1.495 1.595

2.112 2.070 1.917

10.000 0,75 1 2 3

1.335 1.634 1.623

2.074 2.018 1.882

1Die Delta-Werte der mittleren Fluoreszenzintensität (FL1) stellen die Differenz zu Ansätzen ohne PMA-Stimulation dar.

Aus dem peripheren Blut von drei gesunden Rindern wurden am selben Tag PMN im Plastik-Test (s. 3.2.6.4.2) und Percoll-Test (s. 3.2.6.4.1) zur Bestimmung der Bildung reaktiver Sauerstoffmetaboliten (ROS) eingesetzt. Anschließend wurden die Zellen im Durchflusszytometer (s. 3.2.6.5) mit der Referenzzellmethode (s. 3.2.3.1.1) quantifiziert. Die Tabelle stellt die Differenzen (Delta-Werte) der mittleren Fluoreszenzintensität (FL1) der PMN mit unterschiedlichen PMA-Stimulationen zu Ansätzen ohne PMA-Stimulation (Plastik-Test ohne PMA, mit DHR: 27; Percoll-Test ohne PMA, mit DHR: 2) dar. Es werden nur zellmembranintakte (To-Pro-3-negative) Ereignisse gezeigt. Abkürzungen: PMA, Phorbol-Myristat-Acetat, DHR, Dihydrorhodamin 123, FL1, Fluoreszenzintensität FL1

Ergebnisse

77

Tab. 3: Vergleich der Quotienten-Werte der PMN aus Plastik-Test und Percoll-Test bezüglich der ROS-Bildung

Quotienten-Werte Mittlere Fluoreszenzintensität (FL1)1

PMA (nmol/L) DHR (µg/mL) Tier Plastik-Test Percoll-Test 1 0,75 1

2 3

1 1 1

6 2 2

10 0,75 1 2 3

1 1 1

634 610 373

100 0,75 1 2 3

9 8 10

1.080 1.026 914

1.000 0,75 1 2 3

45 53 62

1.057 1.036 960

10.000 0,75 1 2 3

50 57 63

1.038 1.010 942

1Die Quotienten-Werte der mittleren Fluoreszenzintensität (FL1) sind auf Ansätze ohne PMA-Stimulation bezogen. Aus dem peripheren Blut von drei gesunden Rindern wurden am selben Tag PMN in Plastik- und Percoll-Test (s. 3.2.6.4.2 & 1) zur Bestimmung der Bildung reaktiver Sauerstoffmetaboliten (ROS) eingesetzt. Anschließend wurden die Zellen im Durchflusszytometer (s. 3.2.6.5) mit der Referenzzellmethode (s. 3.2.3.1.1) quantifiziert. Die Tabelle zeigt die Quotienten der mittleren Fluoreszenzintensität (FL1) der PMN mit unterschiedlichen PMA-Stimulationen zu Ansätzen ohne PMA-Stimulation (Plastik-Test ohne PMA, mit DHR: 27; Percoll-Test ohne PMA, mit DHR: 2). Es werden nur zellmembranintakte (To-Pro-3-negative) Ereignisse gezeigt. Abkürzungen: PMA, Phorbol-Myristat-Acetat, DHR, Dihydrorhodamin 123, FL1, Fluoreszenzintensität FL1

Während sich die mittlere Fluoreszenzintensität (FL1) der Granulozyten im Plastik-Test

bis zu einer Stimulation mit 100 nmol/L PMA kaum voneinander unterschieden, wurde die

FL1 der PMN im Percoll-Test mit 1 nmol/L PMA-Stimulation um das 2– bis 6fache und

mit 10 nmol/L PMA um das 373- bis 634fache gesteigert (s. Tab. 3). Auffällig ist die

deutlich schwächere ROS-Bildung der PMN auf Percoll-Kissen von Versuchstier 3.

Nach einer Stimulation mit 100, 1.000 und 10.000 nmol/L PMA im Percoll-Test erhöhte

sich die mittlere Fluoreszenzintensität FL1 nicht mehr (s. Abb. 12). Es war schon ein

Plateau erreicht, welches im Plastik-Test erst ab 1.000 nmol/L PMA zu sehen war. Dabei

war aber die ROS-Sensitivität im Percoll-Test viel höher, manchmal sogar um den Faktor

Ergebnisse

78

100. Die Zellen wurden schon mit geringerer PMA-Konzentration getriggert, wobei die

PMN einheitlich reagierten (s. Abb. 12).

4.2.4 Relevanz der Aussagen für andere Spezies

Um festzustellen, ob die Beobachtungen, die beim Rind gemacht wurden, im Hinblick auf

die Zellverluste und auf die ROS-Bildung ebenfalls für andere Spezies relevant sind,

wurden von jeweils 3 gesunden Menschen, Hunden, Rindern und Pferden Triplikate von 3

x 105 PMN in DMEM (s. 3.1.3) pro Well unter identischen Bedingungen in derselben

Mikrotiterplatte direkt auf Plastik sowie auf Percoll-Kissen mit und ohne PMA oder DHR

(s. 3.2.6.4.2 & 1) für 45 Minuten bei 37°C und 5% CO2 in Luft inkubiert und anschließend

mit der Referenzzellmethode (s. 3.2.3.1.1) im Durchflusszytometer gemessen. Dabei wurde

die mittlere Fluoreszenzintensität im FL1 als Ausdruck der ROS-Intensität bestimmt (s.

Abb. 13) und die absoluten Zellzahlen von erhaltenen PMN berechnet (s. Abb. 14).

Dabei wurde festgestellt, dass die Zellverluste bei allen untersuchten Spezies durch Percoll-

Kissen (s. 3.2.6.3) deutlich reduziert werden können (s. Abb. 13). Außerdem besitzen die

PMN im Percoll-Test eine deutlich stärkere ROS-Bildungskapazität und eine höhere

Sensitivität, sodass man teilweise bei einigen Spezies die maximale Stimulation bei 100

nmol/L PMA liegt (s. Abb.14).

Die Unterschiede zwischen Plastik-Test und Percoll-Test werden deutlicher, bildet man die

Differenzen der mittleren Fluoreszenzintensität (FL1) (s. Tab. 4), die Quotienten daraus (s.

Tab. 5).

Ergebnisse

79

Mensch (n=3)

0

20

40

60

80

100

0 - 0 + 1 + 10 + 100 + 1.000+

10.000+

PMA nmol/L und DHR (-/+)

Zellv

erlu

ste

in %

PlastikPercoll

Pferd (n=3)

0

20

40

60

80

100

120

0 - 0 + 1 + 10 + 100 + 1.000+

10.000+

PMA nmol/l und DHR (-/+)

Zellv

erlu

ste

in %

PlastikPercoll

Hund (n=3)

0

20

40

60

80

100

0 - 0 + 1 + 10 + 100 + 1.000+

10.000+


Zellv

erlu

ste

in %

PlastikPercoll

Rind (n=3)

0

20

40

60

80

100

0 - 0 + 1 + 10 + 100 + 1.000+

10.000+


Zellv

erlu

ste

in %

PlastikPercoll

Ergebnisse

80

Abb. 13: Einfluss von Percoll und von Plastik auf die Zellverluste unterschiedlicher Spezies während des ROS-Bestimmungtests.

Von je drei gesunden Menschen, Pferden, Hunden und Rindern wurden Triplikate à 3 x 105 gereinigter PMN (s. 3.2.1.2.1.1) in 50 µL DMEM (s. 3.1.3) entweder direkt in die Vertiefung (auf Plastik) oder auf ein zuvor in dieselbe Mikrotiterplatte eingefülltes Kissen aus 100 µL isotonem Percoll (s. 3.1.4) eingebracht. Die Zellen wurden entweder ohne jeden Zusatz (0-), allein durch Zusatz von 0,75 µg/mL DHR (s. 3.1.7 und 3.2.6.3)(0+) oder zusätzlichen Zusatz von PMA (s. 3.1.7 und 3.2.6.3) in Endkonzentrationen von 1 bis 10.000 nmol/L für 45 Minuten bei 37°C und 5% CO2 in Luft inkubiert. Die Reaktion wurde durch Transfer der Platten auf 4°C (feuchtes Eis) beendet und die Zellen im Durchflusszytometer (s. 3.2.6.5) mit der Referenzzellmethode (s. 3.2.3.1.1) quantifiziert. Dargestellt sind die Mittelwerte der absoluten Zahl vitaler PMN in Prozent, bezogen auf die absolute Zahl vitaler eingesetzten Zellen (=100%), in Abhängigkeit von der im ROS-Test eingesetzten PMA-Konzentration sowie von der Zugabe von DHR. Die Fehlbalken stellen den Standardfehler (SEM, standard error of the mean) dar. Abkürzungen: PMA, Phorbol-Myristat-Acetat, DHR, Dihydrorhodamin 123, FL1, Fluoreszenzintensität FL1 bezogen auf absolute Zahl vitaler eingesetzter Zellen(=100%).

Ergebnisse

81

Mensch (n=3)

-

500

1.000

1.500

2.000

2.500

0 - 0 + 1 + 10 +

100 +

1.000

+10

.000 +


Fluo

resz

enzi

nten

sitä

t (FL

1)PlastikPercoll

Pferd (n=3)

-

500

1.000

1.500

2.000

2.500

0 - 0 + 1 + 10 +

100 +

1.000

+10

.000 +


Fluo

resz

enzi

nten

sitä

t (FL

1)

PlastikPercoll

Hund (n=3)

-

500

1.000

1.500

2.000

2.500

0 - 0 + 1 + 10 +

100 +

1.000

+10

.000 +


Fluo

resz

enzi

nten

sitä

t (FL

1)

PlastikPercoll

Rind (n=3)

-

500

1.000

1.500

2.000

2.500

0 - 0 + 1 + 10 +

100 +

1.000

+10

.000 +


Fluo

resz

enzi

nten

sitä

t (FL

1)

PlastikPercoll

Ergebnisse

82

Abb. 14: Einfluss von Percoll und von Plastik auf die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies von PMN des Blutes unterschiedlicher Spezies.

Von je drei gesunden Menschen, Pferden, Hunden und Rindern wurden Triplikate à 3 x 105 gereinigter PMN (s. 3.2.1.2.1.1) in 50 µL DMEM (s. 3.1.3) entweder direkt in die Vertiefung (auf Plastik) oder auf ein zuvor in dieselbe Mikrotiterplatte eingefülltes Kissen aus 50 µL oder 100 µL isotonem Percoll (s. 3.1.4) eingebracht. Die Zellen wurden entweder ohne jeden Zusatz (0-), allein durch Zusatz von 0,75 µg/mL DHR (s. 3.1.7 und 3.2.6.3)(0+) oder zusätzlichen Zusatz von PMA (s. 3.1.7 und 3.2.6.3) in Endkonzentrationen von 1 bis 10.000 nmol/L für 45 Minuten bei 37°C und 5% CO2 in Luft inkubiert. Die Reaktion wurde durch Transfer der Platten auf 4°C (feuchtes Eis) beendet und die Zellen im Durchflusszytometer (s. 3.2.6.5) mit der Referenzzellmethode (s. 3.2.3.1.1) quantifiziert. Die Abbildung stellt die Komplexität (SSC) in Abhängigkeit von der Fluoreszenzintensität FL1 dar. Dargestellt sind Mittelwerte und Standardabweichungen der mittleren Fluoreszenzintensität (FL1) der PMN in Abhängigkeit von der im ROS-Test eingesetzten PMA-Konzentration sowie von der Zugabe von DHR. Es werden nur zellmembranintakte (To-Pro-3-negative) Ereignisse gezeigt. Die mittlere Fluoreszenzintensität (FL1) stellt das Maß für die ROS-Bildung dar. Abkürzungen: PMA, Phorbol-Myristat-Acetat, DHR, Dihydrorhodamin 123, FL1, Fluoreszenzintensität FL1

Ergebnisse

83

Tab. 4: Vergleich der Delta-Werte der PMN verschiedener Spezies aus Plastik-Test und Percoll-Test bezüglich der ROS-Bildung

Delta-Werte Mittlere Fluoreszenzintensität (FL1)1

PMA (nmol/L) DHR (µg/mL) Spezies Plastik-Test Percoll-Test 1 0,75 Mensch

Pferd Hund Rind

0 0 1 2

3 1 2 1

10 0,75 Mensch Pferd Hund Rind

63 6 12 25

756 133

1.076 336


244 57 387 248

1.917 1.176 2.011 1.462

1.000 0,75 Mensch Pferd Hund Rind

721 859

1.478 1.169

1.980 1.525 2.033 1.752


823 1.286 1.565 1.250

1.749 1.627 1.913 1.912

1Die Delta-Werte der mittleren Fluoreszenzintensität (FL1) stellen die Differenz zu Ansätzen ohne PMA-Stimulation dar.

Aus dem peripheren Blut von drei gesunden Rindern wurden am selben Tag PMN im Plastik-Test (s. 3.2.6.4.2) und Percoll-Test (s. 3.2.6.4.1) zur Bestimmung der Bildung reaktiver Sauerstoffmetaboliten (ROS) eingesetzt. Anschließend wurden die Zellen im Durchflusszytometer (s. 3.2.6.5) mit der Referenzzellmethode (s. 3.2.3.1.1) quantifiziert. Die Tabelle stellt die Differenzen (Delta-Werte) der mittleren Fluoreszenzintensität (FL1) der PMN mit unterschiedlichen PMA-Stimulationen zu Ansätzen ohne PMA-Stimulation (Plastik-Test: Mensch – 61, Pferd – 9, Hund – 24, Rind – 7; Percoll-Test: Mensch – 3, Pferd – 1, Hund – 2, Rind – 1) dar. Es werden nur zellmembranintakte (To-Pro-3-negative) Ereignisse gezeigt. Abkürzungen: PMA, Phorbol-Myristat-Acetat, DHR, Dihydrorhodamin 123, FL1, Fluoreszenzintensität FL1

Ergebnisse

84

Tab. 5: Vergleich der Quotienten-Werte der PMN verschiedener Spezies aus Plastik-Test und Percoll-Test bezüglich der ROS-Bildung

Quotienten-Werte Mittlere Fluoreszenzintensität (FL1)1

PMA (nmol/L) DHR (µg/mL) Spezies Plastik-Test Percoll-Test 1 0,75 Mensch

Pferd Hund Rind

1 1 1 1

2 2 2 2


2 2 2 4

285 134 647 281


5 7 17 35

720 1.177 1.207 1.219


13 96 63 161

743 1.526 1.221 1.461


15 144 66 172

657 1.628 1.149 1.594

1Die Quotienten-Werte der mittleren Fluoreszenzintensität (FL1) sind auf Ansätze ohne PMA-Stimulation bezogen. Aus dem peripheren Blut von drei gesunden Rindern wurden am selben Tag PMN in Plastik- und Percoll-Test (s. 3.2.6.4.2 & 1) zur Bestimmung der Bildung reaktiver Sauerstoffmetaboliten (ROS) eingesetzt. Anschließend wurden die Zellen im Durchflusszytometer (s. 3.2.6.5) mit der Referenzzellmethode (s. 3.2.3.1.1) quantifiziert. Die Tabelle zeigt die Quotienten der mittleren Fluoreszenzintensität (FL1) der PMN mit unterschiedlichen PMA-Stimulationen zu Ansätzen ohne PMA-Stimulation (Plastik-Test: Mensch – 61, Pferd – 9, Hund – 24, Rind – 7; Percoll-Test: Mensch – 3, Pferd – 1, Hund – 2, Rind – 1). Es werden nur zellmembranintakte (To-Pro-3-negative) Ereignisse gezeigt. Abkürzungen: PMA, Phorbol-Myristat-Acetat, DHR, Dihydrorhodamin 123, FL1, Fluoreszenzintensität FL1

Die Ergebnisse zeigen, dass frühere Aussagen beim Rind auch für Mensch, Hund und Pferd

relevant sind.

Ergebnisse

85

4.3 Einfluss von zellulären Bestandteilen auf die PMN des Blutes

Bei der Bestimmung der Bildung reaktiver Sauerstoffspezies durch neutrophile

Granulozyten fielen manchmal größere intra- und interindividuelle Unterschiede auf.

Deshalb war zu prüfen, ob unterschiedliche Anteile an MNC in der PMN-Suspension dafür

verantwortlich sein könnten.

4.3.1 Einfluss von MNC auf die Bildung von Sauerstoffmetaboliten durch

PMN des Blutes

Zunächst war die Frage zu stellen, welchen Einfluss mononukleäre Zellen (MNC) auf

autologe PMN bezüglich der ROS-Bildung haben.

Nach dem unter 3.2.1.2.1.1 und 3.2.1.2.1.2 beschriebenen Protokollen wurden von 3 Tieren

aus peripherem Blut parallel PMN und die gesamten Leukozyten isoliert. Es wurden je 3 x

105 Zellen in DMEM (s. 3.1.3) in Triplikaten unter identischen Bedingungen in derselben

Mikrotiterplatte auf Percoll-Kissen mit und ohne PMA oder DHR (s. 3.2.6.4.1) für 45

Minuten bei 37°C und 5% CO2 in Luft inkubiert und anschließend mit der

Referenzzellmethode (s. 3.2.3.1.1) im Durchflusszytometer die mittlere

Fluoreszenzintensität (FL1) der eingesetzten PMN und der PMN-Anteil in den Leukozyten-

Ansätzen als Maß der ROS-Bildung bestimmt (s. Abb. 15).

Ergebnisse

86

-

500

1.000

1.500

2.000

2.500

3.000

0 - 0 + 1 + 10 + 100 + 1.000 + 10.000 +

PMA (nmol/L) und DHR (+/-)

Fluo

resz

enzi

nten

sitä

t (FL

1)

PMN Leukozyten

Abb. 15: Einfluss von mononukleären Zellen (MNC) auf die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies von PMN des Blutes.

Von drei gesunden Rindern wurden Triplikate à 3 x 105 gereinigter PMN (s. 3.2.1.2.1.1)(PMN) und Leukozyten (s. 3.2.1.2.1.2)(PMN+MNC) in 50 µL DMEM (s. 3.1.3) auf ein zuvor in dieselbe Mikrotiterplatte eingefülltes Kissen aus 100 µL isotonem Percoll (s. 3.1.4) eingebracht. Die Zellen wurden entweder ohne jeden Zusatz (0-), allein durch Zusatz von 0,75 µg/mL DHR (s. 3.1.7 und 3.2.6.3)(0+) oder zusätzlichen Zusatz von PMA (s. 3.1.7 und 3.2.6.3) in Endkonzentrationen von 1 bis 10.000 nmol/L für 45 Minuten bei 37°C und 5% CO2 in Luft inkubiert. Die Reaktion wurde durch Transfer der Platten auf 4°C (feuchtes Eis) beendet und die Zellen im Durchflusszytometer (s. 3.2.6.5) mit der Referenzzellmethode (s. 3.2.3.1.1) quantifiziert. Dargestellt sind Mittelwerte und Standardabweichungen der mittleren Fluoreszenzintensität (FL1) der PMN und der PMN-Anteile in den Leukozyten-Ansätzen in Abhängigkeit von der im ROS-Test eingesetzten PMA-Konzentration sowie von der Zugabe von DHR. Es werden nur zellmembranintakte (To-Pro-3-negative) Ereignisse gezeigt. Die mittlere Fluoreszenzintensität (FL1) stellt das Maß für die ROS-Bildung dar. Abkürzungen: PMA, Phorbol-Myristat-Acetat, DHR, Dihydrorhodamin 123, FL1, Fluoreszenzintensität FL1

Ergebnisse

87

Obwohl die in Abbildung 15 erkennbaren Unterschiede der mittleren

Fluoreszenzintensität zwischen Ansätzen mit isolierten, reinen PMN und solchen mit

PMN in Gesamtleukozyten-Ansätzen statistisch nicht signifikant sind, lässt sich doch

nach einer Stimulation ab 10 nmol/L PMA die Tendenz höherer Werte in reinen PMN-

Ansätzen erkennen. Deswegen ist es für die Prüfung funktioneller Eigenschaften der

neutrophilen Granulozyten sehr wichtig, eine möglichst saubere Isolation von Zellen aus

peripherem Blut durchzuführen.

4.3.2 Einfluss von Thrombozyten auf die Bildung von Sauerstoffmetaboliten

durch PMN des Blutes

Da es während der Isolierung der polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten (PMN) zu

Verunreinigung durch Thrombozyten kommen kann, war auch der Einfluss von

Thrombozyten auf autologe PMN zu prüfen.

Nach den beschriebenen Protokollen wurden von 3 Tieren aus peripherem Blut parallel

PMN (s. 3.2.1.2.1.1) und Thrombozyten (s. 3.2.1.3) isoliert. Je 3 x 105 PMN in 25 µL

DMEM (s. 3.1.3) wurden in Triplikaten unter identischen Bedingungen in derselben

Mikrotiterplatte auf zuvor eingefüllten und mit 25 µL 3 x 104 (PMN+0,1Tr), 3 x 105

(PMN+1Tr), 3 x 106 (PMN+10Tr), 3 x 107 (PMN+100Tr) Thrombozyten oder DMEM

(PMN) beschichteten Percoll-Kissen (s. 3.2.6.4.1) für 45 Minuten bei 37°C und 5% CO2 in

Luft inkubiert. Anschließend wurde mit der Referenzzellmethode (s. 3.2.3.1.1) im

Durchflusszytometer die mittlere Fluoreszenzintensität (FL1) der eingesetzten PMN und

des PMN-Anteils in Ansätzen mit Thrombozyten als Maß der ROS-Bildung bestimmt. Die

Ergebnisse sind in Abbildung 16 zusammengefasst.

Ergebnisse

88

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

0- 0+ 1+ 10+ 100+ 1.000+ 10.000+

PMA (nmol/L) und DHR (-/+)

Fluo

resz

enzi

nten

sitä

t (FL

1)

PMN PMN+0,1Tr PMN+1Tr PMN+10Tr PMN+100Tr

Abb. 16: Einfluss von Thrombozyten auf die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies von PMN des Blutes.

Von drei gesunden Rindern wurden Triplikate à 3 x 105 gereinigter PMN (s. 3.2.1.2.1.1) in 25 µL DMEM (s. 3.1.3) auf ein zuvor in dieselbe Mikrotiterplatte eingefülltes und mit 25 µL 3 x 104

(PMN+0,1Tr), 3 x 105 (PMN+1Tr), 3 x 106 (PMN+10Tr), 3 x 107 (PMN+100Tr) Thrombozyten oder DMEM (PMN) beschichtetes Kissen aus 100 µL isotonem Percoll (s. 3.1.4) eingebracht. Die Zellen wurden entweder ohne jeden Zusatz (0-), allein durch Zusatz von 0,75 µg/mL DHR (s. 3.1.7 und 3.2.6.3)(0+) oder zusätzlichen Zusatz von PMA (s. 3.1.7 und 3.2.6.3) in Endkonzentrationen von 1 bis 10.000 nmol/L für 45 Minuten bei 37°C und 5% CO2 in Luft inkubiert. Die Reaktion wurde durch Transfer der Platten auf 4°C (feuchtes Eis) beendet und die Zellen im Durchflusszytometer (s. 3.2.6.5) mit der Referenzzellmethode (s. 3.2.3.1.1) quantifiziert. Dargestellt sind Mittelwerte und Standardabweichungen der mittleren Fluoreszenzintensität (FL1) der PMN und des PMN-Anteils in Ansätzen mit Thrombozyten in Abhängigkeit von der im ROS-Test eingesetzten PMA-Konzentration sowie von der Zugabe von DHR. Es werden nur zellmembranintakte (To-Pro-3-negative) Ereignisse gezeigt. Die mittlere Fluoreszenzintensität (FL1) stellt das Maß für die ROS-Bildung dar. Abkürzungen: PMA, Phorbol-Myristat-Acetat, DHR, Dihydrorhodamin 123, FL1, Fluoreszenzintensität FL1, Tr, Thrombozyten

Ergebnisse

89

Verglichen mit autologen gereinigten Granulozyten wiesen die PMN in Ansätzen mit

unterschiedlichen Thrombozyten-Anteilen etwa gleiche ROS-Bildungskapazitäten auf. Nur

bei Stimulation mit 10 nmol/L PMA war die mittlere Fluoreszenzintensität (FL1) von PMN

ohne Thrombozyten und von PMN mit 10% Thrombozyten (PMN+0,1Tr) ungefähr zwei

Mal stärker als in Ansätzen mit 100 (PMN+1Tr), 1.000 (PMN+10Tr) und 10.000

(PMN+100Tr) Prozent von Thrombozyten. Es kann daraus gefolgert werden, dass sogar

eine starke Verunreinigung der untersuchten Proben mit Thrombozyten keinen gerichteten

Einfluss auf die ROS-Bildung hat.

Diskussion

90

5 Diskussion

5.1 Konzeptionelle Überlegungen zu Untersuchungen über den

Einfluss von Percoll und von Plastik auf die funktionelle Kapazität


Die polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten (PMN) sind ein wichtiger Bestandteil

der unspezifischen Abwehr unseres Organismus. Ihre Hauptaufgabe ist die schnelle und

unspezifische Erregerabwehr durch Phagozytose, Bildung freier Radikale und Freisetzung

zytotoxischer Mediatoren.

Es wurde nach einem Testverfahren gesucht, das für eine objektive Auswertung mit dem

Durchflusszytometer geeignet ist. Die Methode der Wahl war die durchflusszytometrische

Methode zur Bestimmung der intrazellulärer ROS-Bildung nach EMMENDÖRFFER et al.

(1990), die für humane PMN etabliert wurde, und bei der Dihydrorhodamin123 (DHR 123,

s. 3.1.7) als Nachweisreagenz eingesetzt wird. Diese Methode war von ZERBE (1996) in

folgenden Punkten für das Rind modifiziert worden:

In die Vertiefung einer 96-Well-Rundboden-Mikrotiterplatte werden 2 x 105 Leukozyten in

100 µL PBS pipettiert. Da die Zellisolierungsschritte auf Eis erfolgen müssen, werden die

Leukozyten zu Beginn des Tests 15 Minuten bei 37°C vorinkubiert, um die Zellen in einen

homogenen metabolischen Ausgangszustand zu versetzen. Es folgt die 15minütige

Inkubation mit der Stimulanz-Substanz PMA (s. 3.1.7) in unterschiedlichen

Konzentrationen. Anschließend wird DHR (s. 3.1.7) zur Probe hinzupipettiert. Die

Reaktion wird nach weiteren 15 Minuten gestoppt, indem die Proben auf Eis gestellt

werden.

Bei beiden Verfahren wurden starke Schwankungen festgestellt, die auf gewaltige Verluste

an eingesetzten Zellen zurückzuführen sein dürften, sodass man keine repräsentative

Zellpopulation für die Auswertung der ROS-Produktion zur Verfügung hatte.

Daher war es Ziel dieser Studie, Ursachen für die auftretenden Schwankungen zu erfassen

und soweit möglich zu beseitigen und schon existierende Methoden zur Bestimmung der

Diskussion

91

ROS-Bildung von neutrophilen Granulozyten zu verbessern, bzw. zu modifizieren, um

möglichst alle eingesetzten Zellen zu erfassen. Außerdem sollte die Methode die

Möglichkeit geben, direkte Auswirkungen von verschiedenen Stoffen (z.B. Medikamente,

bakterielle Produkte, andere Zellen etc.) auf die ROS-Bildung durch PMN zu untersuchen.

5.2 Erarbeitung einer Methode zur Bestimmung der ROS-Bildung

von PMN

Über einige Zeit wurden die beiden Methoden von EMMENDÖRFFER (1990) und

ZERBE (1996) als Messverfahren in der Arbeitsgruppe Immunologie für die Bestimmung

der ROS-Produktion neutrophiler Granulozyten regelmäßig eingesetzt. Es wurde dabei die

relative Anzahl und die mittlere Fluoreszenzintensität von positiven und negativen PMN

bewertet. Um durchflusszytometrisch nicht nur relative, sondern auch absolute Zellzahlen

bestimmen zu können, wurden Referenzzellen nach der Methode von PECHHOLD et al.

(1994) in der Modifikation von HENDRICKS (1998) eingesetzt (s. 3.2.3.1.1). Jedoch

musste zur Feststellung der absoluten Zellzahl in den Ansätzen aufgrund der überlappenden

Emissionsspektren der für die Überprüfung der ROS-Bildung eingesetzten

Dihydrorhodamin 123 (s. 3.1.7) die oben genannte Referenzzellmethode mit FITC-

markierten Zellen modifiziert werden. Da für die Untersuchungen ein Dual-Laser-System

zur Verfügung stand, wurde mit Cy™5 (s. 3.1.6) ein Farbstoff gewählt, dessen Emission

nach Anregung durch den zweiten Laser in einem vierten Fluoreszenzkanal (FL4) ganz

unbeeinflusst von der Rhodamin-123 Fluoreszenz gemessen werden kann.

Die Ergebnisse entsprechender Untersuchungen zeigten, dass bei beiden Methoden zur

Bestimmung der ROS-Produktion von PMN ein Zellverlust von teilweise bis zu 95%

auftritt. Die durch PMA verstärkt angeregte ROS-Bildung führte vor allem über Produkte

des Myeloperoxidase-Komplexes über kurz oder lang, abhängig von der PMA-

Konzentration, zum Zelltod (TSAN 1980, TSURUBUCHI et al. 2001). Um den Gehalt an

toten Zellen in den einzelnen Ansätzen feststellen zu können, wurde Fluorochrom To-

Pro-3 eingesetzt. Die Verwendung des herkömmlich zu diesem Zweck eingesetzten

Farbstoffes Propidiumjodid (PJ) war in unseren Untersuchungen aufgrund der starken

Überlappung der Emissionsspektren dieses Fluorochroms mit denen von Rhodamin-123

Diskussion

92

und der daraus resultierenden Störung in den Fluoreszenzkanälen nicht möglich. Eine

gegenseitige Kompensation der beteiligten Fluoreszenzkanäle FL1 und FL3 ist am

verwendeten Durchflusszytometer FACSCalibur© nicht vorgesehen. Das Fluorochrom

To-Pro-3 kann wie Propidiumjodid nicht in lebende Zellen eindringen. Erst der Tod der

Zellen ermöglicht dem Fluoreszenzfarbstoff das Anfärben der DNA. Während der

durchflusszytometrischen Messung im Dual-Laser-System wird der Farbstoff To-Pro-3

durch den Helium-Neon-Laser mit der Wellenlänge 633 nm zur Emission von Licht der

Wellenlänge 661 nm angeregt. Diese Fluoreszenz kann unbeeinflusst durch andere

Emissionen im Fluoreszenzkanal 4 registriert werden. Tote Zellen lassen sich eindeutig

identifizieren und von den lebenden unterscheiden. Der Gehalt an toten Zellen in den

Ansätzen nimmt ohne Percoll-Kissen (Plastik-Test) im Vergleich zum Assay mit Percoll-

Kissen (Percoll-Test) mit zunehmender PMA-Konzentration zu (s. Abb. 7). Dies ist

darauf zurückzuführen, dass ohne Percoll-Kissen die lebenden, starken Zellen am

Kunststoff der Mikrotiterplatten und der FACS-Röhrchen kleben bleiben und so zu einem

großen Teil schwache und tote Zellen in das Durchflusszytometer überführt und

gemessen werden. Eine zunehmende PMA-Konzentration führt zu einer Selbstschädigung

und damit zur Schwächung der Zellen. Durch Percoll-Kissen können die lebenden,

starken Zellen nicht mehr an den Mikrotiterplatten adhärieren und gehen so in die

Messung mit ein. Die Anzahl an toten Zellen wird dadurch schnell verringert. Der

gemessene Anteil toter Zellen von meist unter 2% erklärt nicht die Schwankungen in den

Messungen und hat keinen Einfluss auf die Ergebnisse der hier beschriebenen

Funktionsüberprüfung der PMN. Der Anteil an toten Zellen kann daher für die weiteren

Überprüfungen der PMN-Funktionen unberücksichtigt bleiben.

Aber obwohl PMA in höheren Konzentrationen Apoptosis der Zellen bewirken kann,

kann es nicht die höheren Zellverluste bei niedrigen Konzentrationen von Stimulans (s.

Abb. 5: 45 - 60%) oder gar ohne PMA (s. Abb. 5: ca. 45%) erklären.

Unter Einsatz des Fluoreszenzmikroskops wurde als Ursache hierfür eine starke Adhärenz

der Zellen am Kunststoff der Mikrotiterplatten festgestellt. Es wurden unterschiedliche

Mikrotiterplatten getestet (s. Abb. 9), um weniger adhärenten Kunststoff zu finden.

Obwohl Non-Binding Surface (NBSTM) Mikroplatten einen geringeren Zellverlust

verursachten, betrug dieser immerhin bis zu 85%. Deswegen kam zur Verminderung der

Diskussion

93

Adhärenz Percoll in Frage. Der Gradient wurde als Auskleidung der Vertiefung von

Mikrotiterplatten eingesetzt. Durch Percoll konnte sowohl eine deutliche Verminderung der

Zellverluste als auch der Schwankungen bei den Messungen erzielt werden.

5.3 Erarbeitung optimaler Inkubationsbedingungen für die ROS-

Bildung neutrophiler Granulozyten

Nach der Auswahl des Testprinzips mussten optimale Kulturbedingungen und die

passenden Inkubationszeit etabliert werden.

In Vorversuchen war festgestellt worden, dass Zellen in die obersten Schichten von Percoll

einsinken können und dass es reproduzierbarer und zuverlässiger ist, wenn alle

Reagenzien, wie unter 3.2.6.3 beschrieben ist, mit Percoll vermischt worden sind, sodass im

gesamten Volumen aus 100 µL Percoll und 50 µL PMN die gleichen Bedingungen

gewährleistet sind. Das widerspricht aber der Erfahrung von EMMENDÖRFFER (1990),

der optimale ROS-Induktion bei sequentieller Zugabe von PMA (s. 3.1.7) und anschließend

von DHR (s. 3.1.7) beschreibt.

Beim Vergleich zwischen sequentieller und gleichzeitiger Zugabe von PMA und von DHR

zur Zellsuspension auf Plastik wurde festgestellt, dass bei gleichzeitiger Zugabe die ROS-

Sensitivität 3 mal höher als bei sequenzieller Zugabe war (s. Abb.10). Aufgrund dieser

Ergebnisse ist die sequentielle Zugabe von PMA und von DHR nicht zu empfehlen.

In der Literatur werden unterschiedliche Inkubationszeiten für in vitro-ROS angegeben.

In hier nicht dargestellten Untersuchungen hatte sich gezeigt, dass bovine PMN schon

nach 30 Minuten in Hinsicht auf ihre ROS-Kapazität ein Plateau erreichen. In den

folgenden 15 Minuten steigt die mittlere DHR-Fluoreszenz (FL1) neutrophiler

Granulozyten als Surrogat für ihre ROS-Bildung nur noch geringgradig. Somit wurde die

Inkubationszeit für bovine PMN im ROS-Test auf 45 Minuten festgelegt. Untersuchungen

zur optimalen Inkubationszeit für humane, equine und canine PMN wurden nicht

durchgeführt.

Diskussion

94

5.4 Einfluss von Percoll auf PMN

Zwar werden aus Percoll ausgekleideten Vertiefungen nach der Testinkubation die

eingesetzten PMN-Zahlen weitgehend vollständig wiedergewonnen und stehen

repräsentativ für die Ausgangspopulation zur Messung zur Verfügung, doch stellt sich die

Frage, wie sich das Percoll auf die einzelnen Zellfunktionen auswirkt.

Die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies bleibt durch Percoll weitgehend unbeeinflusst.

Den Ergebnissen der Untersuchungen mit Percoll-Kissen (s. Abb. 5) zufolge scheint

PMA seine stimulierende Wirkung am Enzymsystem der ROS-Bildung ungehindert zu

erfüllen. Das im Zellinneren gebildete fluoreszierende Rhodamin-123 verliert durch das

Percoll nicht an Fluoreszenzintensität. Der frühere und stärkere Anstieg der

Fluoreszenzintensität auf Percoll gegenüber Untersuchungen ohne Percoll-Kissen liegt

vermutlich an dem höheren Anteil besonders aktiver Zellen, die an der Plastikoberfläche

adhärieren – vielleicht sogar durch den Doppelstimulus (Plastik plus PMA) desintegrieren

auf Percoll aber mit zur Auswertung zur Verfügung stehen.. Dadurch wird der Wert der

durchschnittlichen Fluoreszenzintensität pro Zelle im Ansatz erhöht, was einerseits das

Percoll-Verfahren empfindlicher macht, andererseits aber der tatsächlichen ROS-

Kapazität der zu prüfenden PMN wesentlich näher kommt, als die nicht-adhärenten

„Restzellen“ nach Plastikinkubation.

5.5 Testoptimierung

Um den Test zu optimieren ist auch von Bedeutung, dass nicht nur Zellverluste durch

Mikrotiterplatten minimiert werden, sondern möglichst keine weiteren Zellverluste durch

die Probenröhrchen hinzukommen (s. Abb. 8). Deswegen es ist wichtig, die Probe aus der

Mikrotiterplatte direkt vor der Messen in die vorgekühlten FACS-Röhrchen mit Sheath-To-

Pro-3 zu übertragen und sofort zu messen.

Wie in zahlreichen Veröffentlichungen bereits beschrieben, regt Phorbol-Myristat-Acetat

(PMA) die Zellen zur ROS-Bildung an (PERTICARARI et al. 1994, RAIDAL et al.

1998). Mit steigender Konzentration erhöht sich die Menge der gebildeten

Diskussion

95

Sauerstoffspezies. Ab einer Konzentration von 100 nmol/L PMA erreicht die ROS-

Bildung auf Percoll-Kissen ein Plateau. Es ist deshalb ausreichend, die

Sauerstoffradikalbildung bei Konzentrationen von 0 bis 100 nmol/L PMA zu überprüfen.

Wichtig ist auch, dass für den Percoll-Test beim Messen im Durchflusszytometer ein

langsamer Messmodus gewählt wird, um Zellverformung bei einer schnellen Erfassung zu

vermeiden (s. Abb. 4).

Die modifizierte durchflusszytometrische Methode zur Bestimmung der ROS-Produktion

von neutrophilen Granulozyten hat viele Vorteile im Vergleich zu anderen

durchflusszytometrischen Verfahren. Sie ist technisch einfacher, da alle Reagenzien vor

dem Testablauf in das Percoll-Kissen eingemischt werden, womit 15 minütige

Reaktionsschritte mit stets erneuten Reagenzienzugaben und Temperaturschwankungen

entfallen. Insgesamt wird die Erfassung der ROS-Bildungskapazität nicht nur sensitiver

sondern auch „wirklichkeitsnäher“: Es werden weitgehend alle eingesetzten Zellen

ausgewertet, nicht nur die wenigen, die nicht am Kunststoff der Mikrotiterplatten und der

FACS-Röhrchen haften bleiben. Zudem sind die Zellen nur einem kontrollierten Stimulus

(hier PMA) und nicht zusätzlich einem unkontrollierten Einfluss durch die Plastikadhärenz

ausgesetzt. So hat man ein weitgehend komplettes Bild des ROS-Bildungsvermögens der

eingesetzten neutrophilen Granulozyten. Allerdings muss gesagt werden, dass bei älteren

FACS-Geräten, die eventuell belastete Schläuche haben, unter Umständen eine längere

Messzeit beobachtet werden kann, weil zu viele Percoll-Partikel gemessen und den Zellfluß

eventuell beeinträchtigen können. Bei neueren FACS-Geräten ist das nicht der Fall. Eine

gründliche Durchspülung des Systems nach der Percoll Messung ist auf jeden Fall zu

empfehlen.

So konnten in der vorliegenden Studie viele Ursachen für mögliche Schwankungen

erkannt und bei der Überprüfung der ROS-Bildung auch beseitigt werden.

Zusammenfassung

96

6 Zusammenfassung

Liliya Mironova: Modifizierte durchflusszytometrische Methode zum empfindlicheren

Nachweis der Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies neutrophiler Granulozyten in

vitro.

In der vorliegenden Arbeit wird eine verbesserte Technik vorgestellt, die nicht nur eine

empfindlichere qualitative, sondern auch eine zuverlässigere und aussagekräftigere

quantitative Auswertung der Bildung von reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) neutrophiler

Granulozyten (PMN) in vitro ermöglicht. In den bisher eingesetzten

durchflusszytometrischen Verfahren besteht der größte Nachteil in den stark variablen und

teils sehr hohen Zellverlusten während der Aktivierungsphase der PMN in

Reaktionsgefäßen aus Plastik. Diese variablen Zellverluste bieten ein unzuverlässiges

Ergebnis, da sie die Frage offen lassen, wie repräsentativ die auswertbaren restlichen Zellen

für die eingesetzte Gesamtzellpopulation sind.

Um diese Verluste weitgehend zu vermeiden, wird in dem hier entwickelten neuen

Verfahren die Reaktion der PMN in einer Zellkulturmikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen

auf einem isotonen Percoll-Kissen von 100 µL/ Vertiefung (Percoll-Test) statt wie bisher

auf der Plastikoberfläche geprüft. Zur Bewertung des Percoll-Tests wurden die meisten

Parameter vergleichend an identischen Zellpräparationen zeitgleich – und meist in

denselben Mikrotiterplatten – direkt auf Plastik (ohne Percoll-Kissen) jedoch unter sonst

gleichen Bedingungen durchgeführt (Plastik-Test). In diesen Vergleichsuntersuchungen

waren somit die einzigen Unterschiede der Kontakt der Zellen mit der Plastikoberfläche

oder mit dem isotonen Percoll.

In beide ROS Testarten wurden stets Triplikate von 3 x 105 gereinigter PMN in 50 µL

Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium (DMEM) alleine, unter Zusatz des

Fluoreszenzfarbstoffes Dihydrorhodamin 123 (DHR) – als grünfluoreszierender (FL1)

Indikator der intrazellulären ROS-Produktion - in einer Endkonzentration von 0,75 µg/mL

sowie ohne oder mit dem rezeptorunabhängigen Zellaktivator Phorbol-12-Myristat-13-

Acetat (PMA) in Endkonzentrationen von 1 bis 10.000 nmol/L eingesetzt. Beide Testarten

wurden für 45 Min. bei 37 °C und 5% CO2 in Luft inkubiert und die Reaktion durch

Zusammenfassung

97

Lagerung auf feuchtem Eis (4°C) angehalten. Durch Zugabe einer definierten Anzahl

Cy™5-markierter (rotfluoreszierender: FL4) mononukleärer Referenzzellen wurde eine

Quantifizierung der geernteten PMN möglich. Der Zusatz des tief rot fluoreszierenden

(FL4) Farbstoffes To-Pro-3 erlaubte eine Beurteilung der Vitalität der PMN.

Diese vergleichenden Untersuchungen, primär mit gereinigten PMN aus dem Blut gesunder

Rinder durchgeführt, brachten eine Reihe überraschender Ergebnisse:

Werden PMN ohne jeden Zusatz für 45 Min. bei 37°C auf Plastik inkubiert, so gehen allein

dadurch ca. 50 % der Zellen für die Auswertung verloren. Werden sie zusätzlich noch mit

10 bis 10.000 nmol/L PMA stimuliert, betragen die Verluste über 80 bis 95 %. Da die

gewonnen und im Durchflusszytometer auswertbaren „restlichen“ PMN auch zunehmend

Anteile an „toten“ (To-Pro-3 positiven) Zellen (9% ohne PMA bis 30% mit PMA) zeigen,

dürften die drastischen Verluste sowohl auf Plastikadhärenz als auch auf Zelltod beruhen.

Dazu mag noch beitragen, dass in den üblichen Röhrchen zur durchflusszytometrischen

Auswertung (FACS-Röhrchen) aus Polystyrol selbst nicht aktivierte PMN während 40 Min.

Lagerung bei 4°C in beachtlichen Mengen verloren gehen. Diese Verluste lassen sich

jedoch durch Polypropylenröhrchen und direkte Messung nach der Zellentnahme aus der

Mikrotiterplatte weitgehend reduzieren.

Werden die gleichen PMN statt auf Plastik auf einem isotonen Percoll-Kissen von 100

µL/Vertiefung jedoch sonst identisch behandelt, so treten ohne und mit bis zu 100 nmol/L

PMA maximal 5% PMN-Verluste auf und selbst bei Zugabe von 10.000 nmol/L PMA

erreichen die Verluste höchstens 20% der eingesetzten Zellmenge. Zudem ist gegenüber der

Vitalität der Ausgangspopulation (< 2% „tote“ PMN) auch nach 45 Min auf Percoll ohne

und mit bis 10.000 nmol/L PMA keine Änderung zu sehen. Die durch Percoll erzielte

Vermeidung oder starke Reduktion der PMN-Verluste ließ sich durch keine der hier

geprüften 5 unterschiedlichen kommerziellen Mikrotiterplatten auch nur annähernd

erreichen.

Funktionell unterschieden sich PMN ebenfalls erheblich, wenn sie direkt auf Plastik oder

auf Percoll inkubiert wurden: Die alleinige Inkubation von PMN auf Plastik ohne jeden

weiteren Zusatz führte zu einer Zunahme der Zellgröße und einer Induktion der ROS-

Produktion (gemessen an der Intensität der DHR-Fluoreszenz) um den Faktor 14 bis 27 im

Vergleich zur Ausgangspopulation. Im Gegensatz dazu wurde die Morphologie der PMN

Zusammenfassung

98

durch Percoll nicht vergrößert und ihre ROS-Aktivität war lediglich 2 x die der

Ausgangspopulation. Diese Ergebnisse sprachen dafür, dass Plastik alleine einen

unkontrollierbaren Einfluss auf die PMN hatte, der sich neben den Zellverlusten als

Costimulator mit unbekannter Auswirkung bemerkbar machen konnte. Dafür sprachen auch

die Ergebnisse unter Zusatz von PMA als Zellaktivator: Während auf Plastik erst ab 100

nmol/L PMA eine deutliche ROS-Produktion nachweisbar und ein Plateau erst bei 1.000

bis 10.000 nmol/L PMA erreicht wurde, reagierten die gleichen PMN auf Percoll um den

Faktor 10 bis 100 x empfindlicher: Ab 10 nmol/L PMA war bereits eine starke ROS-

Produktion zu messen, die meist schon bei 100 nmol/L PMA ihr Plateau erreichte, das

häufig deutlich über dem des vergleichbaren Plastik-Tests lag. Neben der Empfindlichkeit

war auch die Reaktionsbreite auf Percoll (bei 10 nmol/L PMA: 373 – 634 x und bei 100

nmol/L PMA: 914 – 1.080 x die ROS-Produktion der Kontrolle ohne PMA) wesentlich

höher als auf Plastik (bei 100 nmol/L PMA: 8 – 10 x und bei 1.000 – 10.000 nmol/L PMA:

45 – 63 x). Da auf Percoll bereits mit 100 nmol/L PMA das Stimulationsplateau erreicht

war, der PMA-Konzentration, bei der auch auf Percoll die Zellverluste über 5% stiegen,

war eine nahezu verlustfreie Bestimmung der ROS-Produktion von PMN in vitro dank des

Percoll-Kissens und dem hier beschriebenen Verfahren möglich.

Prinzipiell ähnlich vorteilhaft erwies sich dieses neue Verfahren auch bei Hund, Mensch

und Pferd. Zudem ermöglichte es den Nachweis, dass autologe Thrombozyten im

Verhältnis 0,1 bis 100 pro PMN keinen erkennbaren Einfluss auf die ROS-Produktion nach

PMA-Stimulation hatten. Deutlich anders war es bei 50% autologen MNC, die vermutlich

durch Absorption von PMA als auch möglicherweise durch regulativen Einfluss die ROS-

Produktion von PMN minderten.

Summary

99

7 Summary

Liliya Mironova: A modified flow citometric method with enhanced sensitivity for the

detection of reactive oxygen spezies generated by neutrophilic granulocytec in vitro.

An improved technique is described providing a more sensitive qualitative as well as a

more reliable and informative quantitative evaluation of the generation of reactive oxygen

species (ROS) by neutrophils in vitro. A major drawback of presently practised flow

cytometric ROS-measurements is the variable loss of considerable amounts of PMN during

their activation on plastic. These variable cell losses provide unreliable results because it is

unknown to which extend the residually measurable cells really represent the initial

population to be tested.

In order to largely avoid such cell losses our new technique monitors the reactivity of PMN

in 96 well microtiter plates on an isotonic Percoll cushion of 100 µL per well (Percoll-test)

instead of placing the cell directly on plastic. For evaluation of the Percoll-test most of the

parameters investigated were achieved contemporarily by identical cell preparations and

conditions – usually within the same microtiter plate – however placing the cells directly

on plastic. Thus, the only differences in these comparative tests were the contact of PMN to

either plastic or Percoll.

Both types of ROS-tests included triplicates of 3 x 105 purified PMN in 50 µL Dulbecco`s

modified Eagle`s medium (DMEM) alone, with the addition of Dihydrorhodamine 123

(DHR), a green fluorescing indicator (FL1) of intracellular ROS-production, in a final

concentration of 0,75 µg/mL with or without 1 to 10.000 nmol/L of phorbol-12-myristat-

13-acetate (PMA), a receptor independent activator of cells. All tests were incubated for 45

min. at 37°C in 5% CO2 in air and stopped by placing them on wet ice (4°C). Prior to

flowcytometric evaluation the addition of a defined amount of red fluorescing (FL4)

CyTM5-labelled mononuclear reference cells permitted quantitation of the harvested PMN.

Addition of the infra red fluorescing (FL4) dye To-Pro-3 allowed evaluation of cell

viability.

These comparative investigations were mainly performed with PMN purified from the

peripheral blood of various healthy cows. They provided a number of surprising results:

Summary

100

About 50% of the PMN incubated on plastic without any addition were lost for evaluation

within 45 min. of incubation at 37°C. Stimulation of these cells by 10 to 10.000 nmol/L of

PMA increased PMN losses to more than 80 and 95% of the input. Due to the fact that the

residually harvested cells comprised an increasing number of “dead” (To-Pro-3 positive)

cells (9% without and up to 30 % with PMA) the remarkable cell losses might be caused by

cell death in addition to strong adherence to plastic. An additional loss factor is most likely

the polystyrene tubes usually employed for flow cytometry (FACS tubes). Simple storage

of none activated PMN for 40 min. at 4°C in these tubes can cause a considerable cell loss.

This can be reduced or avoided by using polypropylene tubes instead plus measuring the

cells in the flow cytometer immediately after harvest from the well into the tube.

Identical treatment of PMN on a 100 µL Percoll-cushion per well instead on plastic reduced

cell losses to a maximum of 5% of the input when incubated with or without up to 100

nmol/L of PMA. More than 100 nmol/L of PMA increased cell losses but hardly above

20%. Moreover the cell viability of the stock PMN preparation (< 2% “dead” cells) will not

change during 45 min. of incubation with and without up to 10.000 nmol/L of PMA. The

reduction of PMN losses achieved by the Percoll-cushion could by no means be reached by

any of the 5 different brands of commercial microtiter plates tested.

Also the functional differences were remarkable between plastic or Percoll incubated PMN:

Plain incubation of PMN on plastic without any addition resulted in an increase in cell size

plus an induction of ROS-production (by means of DHR fluorescence) by factors between

14 and 27 as compared to the stock suspension of PMN. In contrast to plastic Percoll did

neither increase cell morphology nor did it induce ROS-production by more than 2. These

results indicate an unpredictable costimulatory influence of the plastic surface on PMN.

This view is supported by the results achieved in the presence of PMA as cell activator: On

plastic a minimum concentration of 100 nmol/L of PMA was required to induce a clearly

detectable ROS-production and only 1.000 or 10.000 nmol/L of PMA were able to achieve

a plateau level of ROS. On Percoll, however, the same PMN responded 10 to 100 times

more sensitive to PMA: With 10 nmol/L of PMA a strong ROS-production could be

reliably documented and 100 nmol/L of PMA was enough to generate the plateau level of

ROS which was frequently clearly above the plateau on plastic. In addition to improved

sensitivity the range of reactivity was considerable wider on Percoll as compared to plastic:

Summary

101

PMN stimulated with 10 nmol/L of PMA diplayed a ROS-production which was 373 – 634

times that of the same cells under identical conditions but without PMA. And with 100

nmol/L of PMA even factors of 914 – 1.080 were achieved. These were remarkable higher

than those on plastic and with higher concentration of PMA: 1.000 to 10.000 nmol/L of

PMA resulted only in factors of 45 – 63.

As 30 to 100 nmol/L of PMA are sufficient to induce maximal ROS-production in PMN on

Percoll these concentrations stay below those were cell losses on Percoll might exceed 5%.

Thus, ROS studies on Percoll can be performed without any PMN loss greater than 5 % for

most of the species tested.

This new technique has been shown to be basically applicable to cattle as well as to dogs,

humans and horses. It also made possible to document that 0,1 up to 100 autologous

platelets have no detectable influence on the PMA induced ROS-production of PMN. In

contrast, 50 % of autologous MNC reduce the ROS-production of PMN due to absorption

of PMA and perhaps also by means of regulatory influence.

Literaturverzeichnis

102

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Erklärung

113

Erklärung

Bei der Anfertigung wurden folgende Hilfen und Hilfsmittel, insbesondere Hilfen Dritter in

Anspruch genommen:

• Materialien und Geräte wurden von der Arbeitsgruppe Immunologie der

Tierärztlichen Hochschule Hannover zur Verfügung gestellt.

• Die durchflusszytometrische Auswertung der Proben geschah mit dem

Durchflusszytometer FACSCalibur© der Zentrumsabteilung Hygiene und

Technologie der Milch der Tierärztlichen Hochschule Hannover.

• Die Zubereitung einiger Puffer bzw. Zellkulturmedien wurde freundlicherweise von

Frau Silke Schöneberg, Frau Sonja Kordex und Herrn Udo Rabe durchgeführt.

• Konzeptionelle und praktische Unterstützung bei der Versuchsdurchführung erhielt

ich durch die Mitarbeiter der Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen

Hochschule Hannover.

• Tiere und Blutproben wurden mir von der Klinik für Geburtshilfe und Gynäkologie

des Rindes und von der Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen Hochschule

Hannover zur Verfügung gestellt.

Ich habe die Dissertation an folgender Einrichtung angefertigt:

Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover.

Hannover, den 29.02.2004

Danksagung

114

Danksagung

Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. W. Leibold für die Überlassung des Themas, die

Bereitstellung eines Arbeitsplatzes und die jederzeit freundlich gewährte Unterstützung.

Ein herzliches Dankeschön geht an ihn für seine Menschlichkeit, tolle Zusammenarbeit und

seinen Optimismus („Wir schaffen es Lilija“).

Herrn Prof. Dr. H.-J. Schuberth danke ich für seine Hilfe bei fachlichen, Computer- und

FACS-Fragen, für die wichtigen Tipps und ständige Diskussionsbereitschaft.

Der Zentrumsabteilung Hygiene und Technologie der Milch der Tierärztlichen Hochschule

Hannover gilt mein Dank für die jederzeit gewährte Benutzung ihres FACSCalibur.

Herrn Udo Rabe, Frau Silke Schöneberg und Frau Sonja Kordex danke ich für die

reibungslose Bewältigung des Laboralltages und ihre unendliche Hilfsbereitschaft.

Allen derzeitigen und ehemaligen Mitarbeitern und Doktoranden der Arbeitsgruppe

Immunologie danke ich ganz herzlich für die freundliche Arbeitsatmosphäre. Ich möchte

mich besonders bei Frau Barbara Scholz und Jutta Parker bedanken. Sie haben mir immer

bei allen möglichen „bürokratischen“ und organisatorischen Problemen im fremden Land

geholfen.

Ein ganz besonderer Dank gebührt Frau Dr. Rita Weber, die nicht nur meine Betreuerin,

sondern auch eine Freundin von mir geworden ist. Ich hätte mir keine nettere und bessere

Mitstreiterin wünschen können. Ich danke ihr nicht nur für den wissenschaftlichen

Beistand während der gemeinsamen Doktorandenzeit, sondern vor allem für ihre stetige

Bereitschaft sich der kleinen und großen Sorgen anzunehmen, um mit Rat und Tat die

Welt wieder in Ordnung zu bringen. Ich wünsche ihr und ihrer Familie für die Zukunft

alles Glück der Welt.

Danksagung

115

Mein besonderer Dank gilt auch Herrn Prof. Dr. Hugo Höller und seiner Frau Hannelore

Rieder-Höller, die meine Familie und mich während der ganzen Zeit meines Aufenthalts

in Deutschland unterstütz haben. Trotz allem blieben sie immer treu an meiner Seite.

Herrn Dr. Rimantas Stakauskas danke ich für die jederzeit gewährte Gesprächsbereitschaft

und die freundliche fachliche Beratung.

Auch Frau Maritta Ledwoch, Leiterin des Auslandsamts der TiHo Hannover, gilt mein

herzlicher Dank. Sie wurde mir wie eine zweite Mutter. Vielen, vielen Dank!

Meine Freunde aus Russland: Natalija Lobanova, Jewgenij Washenko, Denis und

Anastasija Konine, Frau Walentina Pleschakova. Ich danke Euch für die moralische

Unterstützung fern von der Heimat.

Ich danke meinen Eltern, die trotz zahlreicher Unwegsamkeiten nie den Glauben an mich

verloren haben und mich immer unterstützt haben. Durch ihren Beistand waren meine

Ausbildung und diese Arbeit überhaupt erst möglich.

Mein größter Dank gilt jedoch meinem Mann Juri. Für Deine Liebe, Dein Verständnis,

Deine Zuneigung und Deine Geduld mit mir und der kleinen Sophie möchte ich Dir von

Herzen danken.

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