Modulation der IL-6-abhängigen Signaltransduktion durch...

Modulation derIL-6-abhängigen Signaltransduktion

durch die Protein-Tyrosinphosphatase SHP2

Von der Medizinischen Fakultätder Rheinisch-Westfälischen Technischen Hochschule Aachen

zur Erlangung des akademischen Gradeseiner Doktorin der Medizin genehmigte Dissertation

vorgelegt von

Cornelia Henke-Gendo geb. Gendoaus

Bad Soden am Taunus

Berichter: Herr UniversitätsprofessorDr. rer. nat. Peter C. Heinrich

Herr UniversitätsprofessorDr. med. Hans Merk

Tag der mündlichen Prüfung: 13. August 2002

Diese Dissertation ist auf den Internetseiten der Hochschulbibliothek onlineverfügbar.

meinem Großvater gewidmet

Wesentliche Teile dieser Arbeit wurden veröffentlicht:

Schaper F., Gendo C., Eck M., Schmitz J., Grimm C., Anhuf D., Kerr I.M. undHeinrich P.C.Activation of the protein tyrosine phosphatase SHP2 via the interleukin-6 signal transducingreceptor gp130 requires tyrosine kinase Jak1 and limits acute-phase protein expressionBiochem. J. (1998) 355: 557-565

Schmitz J., Dahmen H., Grimm C., Gendo C., Müller-Newen G., Heinrich P.C. undSchaper F.The cytoplasmic tyrosine motifs in full-length glycoprotein 130 have different roles in IL-6signal transductionJ. Immunol. (2000) 164:848-854

Inhaltsverzeichnis I

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung 1

1.1 Zytokine und Zytokinrezeptoren 1

1.2 Interleukin-6 und der Interleukin-6-Rezeptorkomplex 3

1.3 Die Interleukin-6 induzierte Signaltransduktion 6

1.4 Struktur und Funktion der SHP2 8

1.5 Zielsetzung der Arbeit 11

2. Material und Methoden 13

2.1 Chemikalien und Verbrauchsmaterialien 13

2.1.1 Radiochemikalien 13

2.1.2 Zellkultur 13

2.1.3 Zytokine und Rezeptoren 13

2.1.4 Antikörper 14

2.1.5 Oligonukleotide 15

2.1.6 Plasmide 16

2.2 Allgemeine molekularbiologische Methoden 17

2.2.1 Verwendete Bakterienstämme und deren Kultivierung 17

2.2.2 Herstellung kompetenter Zellen 18

2.2.3 Transformation nach Hanahan 18

2.2.4 Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli 18

2.2.5 Konzentrationsbestimmung von DNA 19

2.2.6 Oligohybridisierung 19

2.2.7 Modifikation von Plasmid-DNA 19

2.2.8 Polymerase-Ketten-Reaktion 21

2.2.9 Analyse der DNA durch Sequenzierungen 23

2.3 Eukaryonte Zellen und deren Kultivierung 24

2.3.1 Kulturmedien 24

2.3.2 Verwendete permanente Zell-Linien 25

II Inhaltsverzeichnis

2.3.3 Kultivierung von Zell-Linien 26

2.3.4 Transiente Transfektion 27

2.3.4 Stabile Transfektion von Ba/F3-Zellen 28

2.4 Biochemische Methoden 28

2.4.1 Herstellung zytosolischer Extrakte 28

2.4.2 Immunpräzipitation 29

2.4.3 SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese 29

2.4.4 Western Blot 30

2.4.5 Detektion von Proteinen mittels verstärkter Lichtemission 30

2.4.6 Herstellung von Kernextrakten 32

2.4.7 Proteinbestimmung nach Bradford 32

2.4.8 Radioaktive Markierung doppelsträngiger DNA 33

2.4.9 Elektrophoretischer Mobilitäts-Shift Assay (EMSA) 33

2.4.10 Immunfluoreszenz-Analysen eukaryonter Zellen 34

2.4.11 FACS-Analysen von eukaryonten Zellen 35

2.4.12 Reportergen-Assays 35

2.5 Konstruktion der ErG-Mutanten 36

2.6 Konstruktion der GrG-Mutanten 38

2.7 Konstruktion der SHP2-Mutanten 39

3. Ergebnisse 41

3.1 Konstruktion und Expression der ErG-Mutanten 41

3.2 Die SHP2-Tyrosinphosphorylierung 42

3.3 Die IL-6-induzierte Tyrosinphosphorylierung der SHP2 benötigt

das Y759 in gp130 47

3.4 Einfluß der SHP2-Tyrosinphosphorylierung auf die STAT-Aktivierung 50

3.5 Rolle der Janus-Kinasen für die SHP2-Phosphorylierung 51

3.6 Assoziation der SHP2 mit den Jak-Kinasen 54

3.7 Rolle der SHP2 in der Akute-Phase-Protein Gen-Induktion 56

Inhaltsverzeichnis III

4. Diskussion 61

4.1 Ausblick 69

5. Zusammenfassung 73

6. Anhang 75

6.1 Literaturverzeichnis 75

6.2 Abkürzungsverzeichnis 85

6.3 Sequenzen 87

Danksagung

Lebenslauf

Einleitung 1

1. Einleitung

1.1 Zytokine und Zytokinrezeptoren

Für alle vielzelligen Organismen ist die Koordination ihrer verschiedenen Körperfunktionen

die existentielle Voraussetzung, um in einer Welt mit sich fortlaufend ändernden äußeren Be-

dingungen zu überleben. Wachstum, Differenzierung und Stoffwechsel in den verschiedenen

Organen und Geweben erfordern eine ständige Kommunikation zwischen den Zellen. Im Lau-

fe der Evolution haben sich hierfür zwei Systeme herausgebildet: Einerseits das Nervensy-

stem, welches blitzschnell Sinneseindrücke ins Körperinnere leiten kann, andererseits das

System der Hormone, das eher Minuten bis Stunden braucht und dazu dient, definierte Bedin-

gungen im Körper herzustellen (Homöostase).

Die Hormone ihrerseits sind sowohl bezüglich ihrer chemischen Zusammensetzung als auch

hinsichtlich der Wirkungsweise ihrer Mitglieder sehr inhomogen. Neben den klassischen

Hormonen, die von spezialisierten Organen produziert werden und endokrin über den Blut-

strom auf das/die Zielgewebe einwirken, gibt es die sogenannten Gewebshormone. Sie wer-

den von einer Vielzahl von Zellen nach Stimulation produziert und wirken hauptsächlich pa-

ra- und autokrin. Hierzu gehören die Arachidonsäure-Metabolite sowie Polypeptide und Pro-

teine wie Wachstumsfaktoren und Zytokine.

Als Zytokine bezeichnet man im allgemeinen diejenigen Polypeptid-Gewebshormone, die

regulierend auf die Hämatopoese, die Immunantwort und die Entzündungsreaktion einwirken.

Sie besitzen oft ein pleiotropes Wirkungsspektrum, d.h. dasselbe Zytokin ist in der Lage, auf

unterschiedlichen Zellen verschiedene Effekte auszuüben. Untereinander beeinflussen sie sich

in additiver, z.T. synergistischer aber auch antagonistischer Weise.

Anhand ihrer Struktur lassen sich die Zytokine in verschiedene Familien einteilen. Eine be-

kannte Familie ist die Gruppe der 4-α-helix bundle-Zytokine, so benannt, weil sich ihre

Struktur durch vier antiparallel angeordnete α-Helices auszeichnet. Ein wichtiger Vertreter ist

z.B. das Interleukin-6, aber auch das Erythropoetin oder das G-CSF (Granulocyte Colony-

Stimulating Factor) gehören in diese Familie, ebenso wie die klassischen Hormone Prolaktin

und Wachstumshormon [9].

2 Einleitung

Zytokine vermitteln ihre Wirkung über spezifische Oberflächenrezeptoren, die von ihren Ziel-

zellen exprimiert werden. Genau wie die Zytokine sind auch diese Rezeptoren strukturell und

funktionell miteinander verwandt und werden zu einer Zytokinrezeptor-Superfamilie zusam-

mengefaßt (Tab. 1). Extrazellulär zeichnen sich die Mitglieder dieser Familie neben optional

vorhandenen Immunglobulin-ähnlichen Domänen und/oder Fibronektin Typ III-Domänen

durch den Besitz eines sogenannten Zytokinrezeptor-Homologiemoduls aus. Dieses wird von

zwei je etwa 90 Aminosäuren langen Fibronektin Typ III-Domänen gebildet und ist durch vier

in ihrer Position konservierte Cysteinreste und ein Tryptophan-Serin-X-Tryptophan-Serin-

Motiv (WSXWS; X ist eine nicht konservierte Aminosäure) charakterisiert [10]. Die intra-

zellulären Abschnitte der Zytokinrezeptoren sind wenig homolog und strukturell noch nicht

näher charakterisiert. Sie enthalten jedoch zwei konservierte als box1 und box2 bezeichnete

Regionen. Anders als die sogenannten Rezeptor-Tyrosin-Kinasen konnte bei den Zytokinre-

zeptoren bisher noch keine katalytische Domäne identifiziert werden. Vielmehr sind sie kon-

stitutiv mit Tyrosinkinasen der Familie der Janus-Kinasen (Jak) assoziiert [53, 76], die Ligan-

den-induziert den Rezeptor und verschiedene zytoplasmatische Adapterproteine phosphorylie-

ren und so Signale ins Zellinnere leiten.

Die Zytokinrezeptor-Superfamilie

Klasse I: GH-R, PRL-R, Epo-R, G-CSF-R, Mpl bilden Homodimere

IL-6R, IL-11R, LIF-R, OSM-Rβ, CNTF-R bilden Heterodimere mit gp130

IL-3R, GM-CSF-R, IL-5R bilden Hetero-Oligomere mit βc

IL-2R, IL-4R, IL-7R, IL-9R, IL-13R,

IL-15R

bilden Hetero-Oligomere mit γc

Klasse II: IFN-αR, IFN- βR, TF-R, IL-10R

Tab.1: Die Rezeptoren der Zytokinrezeptor-Superfamilie lassen sich nach strukturellen und funktionellen Ei-genschaften in zwei Klassen einteilen. Die signaltransduzierenden Rezeptorkomplexe der Klasse I bil-den Homodimere aus identischen Rezeptorketten oder Hetero-Oligomere aus Liganden-spezifischen α–Rezeptoren und den gemeinsam genutzten β–Rezeptor-Untereinheiten gp130, βc oder γc (nach Wells,1996 [90]). R = Rezeptor; GH growth hormone, PRL Prolaktin, Epo Erythropoetin, G-CSF granulocytecolony-stimulating factor, Mpl myeloproliferative leukemia receptor, IL Interleukin, LIF leukemia inhi-bitory factor, OSM Oncostatin M, CNTF ciliary neurotrophic factor, GM-CSF granulocyte/ macropha-ge colony-stimulating factor, IFN Interferon, TF tissue factor.

Einleitung 3

1.2 Interleukin-6 und der Interleukin-6-Rezeptorkomplex

Das Zytokin Interleukin-6 (IL-6) wurde ursprünglich als ein von T-Zellen sezerniertes Lym-

phokin identifiziert. Es induziert die Differenzierung von aktivierten B-Zellen zu Antikörper

produzierenden Plasmazellen, daher sein ursprünglicher Name: B-cell stimulating factor 2

[37]. Daneben erfüllt IL-6 noch andere physiologische, aber auch pathophysiologische Funk-

tionen [35, 46]. Es wirkt z.B. als Differenzierungsfaktor für weitere hämatopoetische Vorläu-

ferzellen oder aber als Wachstums- bzw. Aktivierungsstimulans für Plasmozytomzellen und

Osteoklasten. Eine weitere Eigenschaft des IL-6, welches bei Verletzungen oder Infektionen

von Monozyten, Endothelzellen und Fibroblasten ausgeschüttet wird, ist die Auslösung der

Akute-Phase-Reaktion. Letztere ist definiert als eine komplexe Allgemeinantwort des Orga-

nismus auf verschiedene schädigende Einflüsse und umfaßt Reaktionen wie Fieber, Leuko-

zytose und Veränderungen der Expression einer Reihe von in der Leber gebildeten Plasma-

proteinen, den sog. Akute-Phase-Proteinen. Deren bekannteste Vertreter sind das C-reaktive

Protein (CRP) oder das Haptoglobin. Weitere Funktionen des IL-6 sind in Tab. 2 zusammen-

gefaßt.

Um die Signaltransduktion auszulösen, benötigt IL-6 wie andere Zytokine einen Plasmamem-

bran-Rezeptorkomplex. Im Falle des IL-6-Rezeptor-Komplexes besteht dieser aus einer IL-6

bindenden Untereinheit, dem IL-6-Rezeptor (IL-6-R, gp80, CD126), und einer signaltransdu-

zierenden Komponente, dem gp130 (CD130) (Abb. 1). Der humane IL-6-Rezeptor gehört zu

den Klasse I-Rezeptoren der Zytokinrezeptor-Superfamilie. Das transmembranäre Protein,

dessen verhältnismäßig kurzer intrazellulärer Abschnitt ohne Funktion zu sein scheint, hat

eine Größe von 80 kDa. Der extrazelluläre Teil des Rezeptors wird von einer Immunglobulin-

ähnlichen Domäne gebildet, gefolgt von einem Zytokinrezeptor-Homologiemodul [92]. Ne-

ben der membranständigen wurde auch eine lösliche Variante des Rezeptors, sIL-6R, be-

schrieben [39], die entweder durch alternatives Spleißen der gp80-mRNA oder durch limi-

tierte Proteolyse (shedding) des Rezeptors unmittelbar vor der Transmembrandomäne entsteht

[40, 60]. Entscheidend an der Auslösung der Signaltransduktion ist jedoch das Glykoprotein

gp130. Dieses beim Menschen 918 Aminosäuren lange membranständige Protein wird ubi-

quitär exprimiert und vermittelt nicht nur die Signaltransduktion des IL-6, sondern auch die

der sogenannten IL-6-Typ Zytokine. Dazu gehören neben IL-6 auch LIF (leukemia inhibitory

factor), OSM (Oncostatin M), CNTF (ciliary neurotrophic factor), IL-11 und Cardiotrophin-1

4 Einleitung

Die pleiotrope Wirkung von IL-6

Effekte auf B-Zellen: Immunglobulin-ProduktionProliferation von MyelomzellenProliferation von Epstein-Barr-Virus infizierten B-Zellen

Effekte auf T-Zellen: Proliferation und Differenzierung von T-ZellenDifferenzierung von T-Lymphozyten zu zytotoxischen T-ZellenInduktion der Expression des IL-2-RezeptorsInduktion der IL-2-ProduktionVermehrung der Aktivität der natürlichen Killerzellen

Effekt auf hämatopoetischeProgenitorzellen:

Verstärkung pluripotenter hämatopoetischer Koloniebildung

Effekt auf Megakaryozyten: Maturation

Effekte auf Makrophagen: Wachstumsinhibition von myeloiden Leukämie-Zellinien undInduktion ihrer Differenzierung zu Makrophagen

Effekte auf Hepatozyten: Regulation der Akute-Phase-Protein SyntheseProliferation während der Leber-Regeneration

Effekte auf den Knochen-metabolismus:

Stimulation der OsteoklastenentwicklungInduktion der Knochenresorption

Effekte auf Blutgefäße: PDGF-InduktionProliferation der glatten Gefäßmuskulatur

Effekte auf Mesangialzellen Stimulation der Proliferation

Effekte auf Hautzellen Stimulation der Proliferaton von Keratinozyten

Effekt auf das Herz: negativer inotroper Effekt auf Herzmuskelzellen

Effekte auf neuronale Zellen: neuronale Differenzierung von PC12-ZellenErhöhung der Überlebenschancen cholinerger NeuroneInduktion der Synthese adrenokortikotroper Hormone

Effekt auf die Plazenta: Sekretion von Choriogonadotropin aus Trophoblasten

Wirkung auf Tumorzellen: Hemmung des Wachstums von Melanom- und Brustkarzinom-zellen

allgemeine Reaktionen: Erhöhung der Körpertemperatur

Tab. 2: nach Heinrich et al. (1998), Kishimoto et al. (1995) [35, 46]

Einleitung 5

(CT-1) [27, 51, 66, 74, 94]. gp130 besteht im extrazellulären Bereich aus sechs Fibronectin

Typ III-Domänen, von denen die zweite und die dritte ein Zytokinrezeptor-Homologiemodul

mit vier konservierten Cysteinresten und einem WSXWS-Motiv bilden. Es handelt sich hier

also ebenfalls um ein Mitglied der Zytokinrezeptor-Superfamilie. Die Struktur des intrazellu-

lären Teils ist noch nicht bekannt, enthält jedoch die für Zytokinrezeptoren typischen box1-

bzw. box2-Regionen. Desweiteren besitzt gp130 sechs Tyrosinmotive, die eine wichtige Rolle

in der Signaltransduktion spielen.

Die Stöchiometrie des IL-6-Rezeptorkomplexes wird noch diskutiert. Neuere Untersuchungen

weisen darauf hin, daß dieser ein Hexamer aus zwei IL-6-, zwei gp80- und zwei gp130-

Molekülen ist [87]; ein anderes Modell, basierend auf Mutagenese-Studien, schlägt jedoch die

Interaktion von je einem Molekül IL-6 und IL-6R mit zwei gp130-Molekülen vor [31].

Abb.1: Schematische Darstellung des IL-6-Rezeptors und des gp130Der extrazelluläre Teil des IL-6-R besteht aus einer aminoterminalen Immunglobulin (Ig-)-ähnlichenDomäne und aus zwei Fibronektin Typ III-Domänen, die ein Zytokinrezeptor-Homologiemodul mitvier konservierten Cysteinresten (C) und einem konservierten WSXWS-Motiv bilden. Die extrazel-luläre Region des gp130 wird von sechs Fibronektin Typ III-Domänen gebildet, von denen diezweite und die dritte Domäne ein Zytokinrezeptor-Homologiemodul darstellen. Im intrazellulärenTeil enthält gp130 die für Zytokinrezeptoren typischen box1- bzw. box2-Regionen und sechs Tyro-sine bzw. Tyrosinmotive, die z.T. eine wichtige Rolle in der Signaltransduktion spielen.

6 Einleitung

1.3 Die Interleukin-6-induzierte Signaltransduktion

Ihre Wirkung entfalten die verschiedenen Zytokine durch Aktivierung ihrer Zielgene im Zell-

kern. Das Signal dafür wird jedoch an der Zellmembran gesetzt. Es muß von dort in den Kern

weitergeleitet werden. Bei der IL-6-Signaltransduktion kann das Signal über zwei verschiede-

ne Wege in den Zellkern gelangen, zum einem über den Jak/STAT-Signalweg, zum anderen

über die Ras/Raf/MAPK-Kaskade.

Den ersten Schritt dieser Signalübertragung bildet die Bindung von IL-6 an den IL-6-

Rezeptor mit nachfolgender Assoziation und Homodimerisierung von gp130 [61]. Anschlie-

ßend kommt es zur Autophosphorylierung und Aktivierung der konstitutiv an gp130 assozi-

ierten Janus-Kinasen Jak1, Jak2 und Tyk2 [53, 76]. Diese Jak-Kinasen sind durch eine C-

terminale Kinase-Domäne, eine anschließende Kinase-ähnliche Domäne und fünf N-terminale

Jak-Homologie-Domänen (JH1-5) charakterisiert. Aktiviert vermitteln sie die Phosphorylie-

rung von gp130 an spezifischen Tyrosinmotiven, die ihrerseits nun mehreren Proteinen mit

SH2-Domänen (Transkriptionsfaktoren, Adaptermoleküle etc.) als Bindungspartner zu Verfü-

gung stehen [77, 88]. Besondere Bedeutung wird hier den STAT (signal transducer and acti-

vator of transcription)- Faktoren beigemessen. Hierbei handelt es sich um eine Familie von

Transkriptionsfaktoren, die sich durch den Besitz einer DNA-Bindungsdomäne, einer SH2-

sowie einer Tetramerisierungsdomäne auszeichnen [11, 15, 23]. An der IL-6-Signaltrans-

duktion sind zwei dieser Faktoren beteiligt, STAT1 und STAT3, die nach ihrer Phosphorylie-

rung an einem konservierten Tyrosin-Rest homo- bzw. heterodimerisieren, indem sie mit ihrer

SH2-Domäne an das Phosphotyrosin ihres Partners binden [75]. STAT-Faktoren translozieren

über noch unbekannte Mechanismen in den Zellkern, binden dort an die Promotoren ihrer

Zielgene und leiten die Transkription ein [88, 95]. Neben der Tyrosinphosphorylierung wurde

auch eine Serinphosphorylierung der STAT-Faktoren in der C-terminalen Region beobachtet

[54, 96]. Sie erfolgt durch eine noch nicht näher identifizierte Kinase.

Die Ras/Raf/MAPK-Kaskade wird ebenfalls durch IL-6 induziert [48, 62]. Der genaue Me-

chanismus hierfür ist jedoch noch nicht bekannt. Wichtig für die Aktivierung der MAPK

scheint das Tyrosin 759 im gp130 zu sein [72]. Weiterhin sind mehrere Proteine beschrieben

worden, die nach IL-6-Induktion tyrosinphosphoryliert werden und als linker mit Kompo-

nenten der anderer Signalwege assoziieren können, z.B. die Protein-Tyrosinphosphatase

SHP2 [50] oder die Adapterproteine Shc [29] und Vav [52].

Die Signaltransduktion des IL-6 ist schematisch in Abb. 2 wiedergegeben.

Einleitung 7

Abb.2: Die IL-6 induzierte SignaltransduktionDie Liganden-induzierte Homodimerisierung des gp130 führt zu einer Aktivierung sowohl desJak/STAT-Signaltransduktionsweges als auch der Ras/Raf/MAPK-Kaskade

8 Einleitung

1.4 Struktur und Funktion der SHP2

Im Jahre 1993 entdeckten gleich mehrere Gruppen ein 65 - 68 kDa großes Protein, welches

nach PDGF- und EGF-Stimulation tyrosinphosphoryliert wird [2, 20, 22, 84]. Hierbei handelt

es sich um die Phosphatase SHP2, SH2 domain containing protein-tyrosine-phosphatase 2,

auch beschrieben als PTP1D oder syp. Dieses Protein, dessen humane Variante eine Gesamt-

länge von 585 Aminosäuren hat, wird – im Gegensatz zu ihrer hämatopoetischen Schwester

SHP1 – ubiqitär exprimiert, wobei sich besonders hohe Proteinmengen in Lungen-, Hirn- und

Lebergewebe befinden [2].

Strukturell gehört die SHP2 in die Klasse der nicht-membranständigen Protein-Tyrosin-

phosphatasen (Abb. 3). Sie besteht aus zwei N-terminal gelegenen SH2-Domänen (aa. 6-214)

und einer sich anschließenden Phosphatase-Domäne. Die beiden SH2-Domänen, welche spe-

zifische Phosphotyrosin-abhängige Protein-Protein-Interaktionsstellen darstellen, dienen zur

Rekrutierung der SHP2 an bestimmte Phosphotyrosinmotive, die die Konsensussequenz

pYXX(L/V/I) aufweisen [14]. Diese finden sich z.B. in den die SHP2 aktivierenden Rezepto-

ren. Neben dieser Rekrutierung an die Rezeptoren scheinen die Domänen auch eine suppri-

mierende regulatorische Funktion wahrzunehmen. Pluskey et al. wiesen nach, daß Bindung

zweier Phosphotyrosin-Peptide aus dem IRS-1, die spezifisch mit den SH2-Domänen der

SHP2 interagieren können, zu einer 37-fachen Stimulation der SHP2-Enzymaktivität führt

[67]. Die SHP2 scheint sich also durch Anlagerung ihrer SH2-Domänen an die Phosphatase-

Domäne selbst inhibieren zu können, was vor kurzem durch die Strukturanalyse des kristalli-

sierten Proteins bestätigt werden konnte [38].

Im C-terminalen Bereich besitzt die SHP2 eine Phosphatase-Domäne mit der für nichttrans-

membranäre Phosphatasen typischen Konsensussequenz VHC459XAGXXR [2]. Entscheidend

für die Aktivität dieses Enzyms ist das Cystein 459 innerhalb des katalytischen Zentrums.

Mutation dieser Aminosäure zu einem Serin führt zu einer komplett inaktiven, dominant ne-

gativen Mutante [8, 59]. Eine verringerte enzymatische Aktivität besitzt auch eine andere, in

dem Fall natürliche Variante der SHP2, bei der vier Aminosäuren (ALLQ) an Position 408

innerhalb der Phosphatase-Domäne eingefügt sind. Sie entsteht wahrscheinlich durch alterna-

tives Spleißen der SHP2-Prä-mRNA [3, 58].

Trotz einer Vielzahl von Untersuchungen ist die Funktion der SHP2-Phosphatase-Aktivität in

der Signaltransduktion weiterhin unbekannt. Schon potentielle Substrate werden kontrovers

diskutiert. Hierfür käme neben den aktivierenden Rezeptoren auch SHPS-1, SHP-substrate 1,

Einleitung 9

in Frage [25, 45, 63]. Es handelt sich hierbei um ein kürzlich entdecktes Transmembran-Pro-

tein mit zwei mal zwei potentiellen SHP2-Bindungsstellen, an denen jeweils beide SH2-

Domänen eines Enzyms binden können. Einen Hinweis darauf, daß die SHP2 dieses Protein

tatsächlich dephosphoryliert, bieten diese Veröffentlichungen allerdings nicht. Auch bezüg-

lich der Dephosphorylierung des PDGF-Rezeptors existieren noch offene Fragen. Vogel et al.

[84] waren nicht in der Lage, die Dephosphorylierung dieses Rezeptors durch die SHP2 nach-

zuweisen, obwohl die Dephosphorylierung einer EGF-c-kit-Chimäre in einem Parallelansatz

sehr wohl gezeigt werden konnte. Zwei anderen Gruppen, Kazlauskas et al. und Dechert et al.

[18, 43] gelang eben dieser Nachweis der Dephosphorylierung des PDGF-R durch die SHP2.

Eine Autodephosphorylierung der SHP2 wurde ebenfalls beschrieben [78].

Abb.3: Struktur der SHP2Die SHP2 gehört zu den nicht-transmembranären Protein-Tyrosinphosphatasen. Das 585 Aminosäu-ren lange Protein besitzt im aminoterminalen Bereich zwei SH2-Domänen (SH2). Am C-Terminusbefindet sich eine Protein-Tyrosinphosphatase-Domäne (PTP) mit dem Cystein 459 im katalytischenZentrum. Eine Spleißvariante besitzt vier zusätzliche Aminosäure (ALLQ) an Position 408.

Die SHP2-Tyrosinphosphorylierung wurde jedoch nicht nur im Zusammenhang mit der Akti-

vierung der Rezeptoren PDGF-R oder EGF-R gezeigt. Eine Vielzahl von Rezeptoren ist in der

Lage, die SHP2 zu rekrutieren. Sie beeinflußt sowohl die Signaltransduktion der Tyrosin-

Kinase-Rezeptoren (Insulin-R, FGF-R, c-kit, IGF-R), als auch die der G-Protein-gekoppelten

Rezeptoren (Angiotensin-R) und Zytokinrezeptoren (IL-2R, IL-3R, IL-5R, IL-6R, IL-11R,

GM-CSF-R, IFNα/β-R, Epo-R) [1, 4, 12, 17, 24, 55, 64, 80, 81, 82]. Interessanterweise füh-

ren jedoch nicht nur Rezeptoren im engeren Sinn zu einer Aktivierung der SHP2. So konnte

eine Tyrosinphosphorylierung dieses Proteins in Endothel-Zellen nachgewiesen werden, die

unterschiedlichen physikalischen Rahmenbedingungen wie erhöhter Fließgeschwindigkeit des

umgebenen Mediums oder hypo- bzw. hyperosmolarem Milieu ausgesetzt waren [56]. Diese

10 Einleitung

Phosphorylierung beinhaltet wahrscheinlich die Aktivierung von Mitgliedern der Integrin-

Familie [41, 42].

Bei einer solchen Fülle von aktivierenden und beeinflussenden Faktoren ist es nicht verwun-

derlich, daß die Elimination des SHP2-Genes in der Maus zu einem frühembryonal letalen

Phänotyp führt [70].

Eine weitere Frage ist, wie trotz der Vielzahl der Aktivierungsmöglichkeiten ein spezifisches,

speziell für diesen Signalweg zugeschnittenes Signal weitergeleitet wird. Eine Antwort auf

diese Frage könnte in der Tatsache liegen, daß viele verschiedene Tyrosin-Kinasen in der La-

ge sind, die SHP2 zu phosphorylieren [65, 83, 93]. Auch werden abhängig vom aktivierenden

Zytokin unterschiedliche Tyrosine innerhalb der SHP2 phosphoryliert. So ist z.B. beschrieben

[85], daß nach EGF-R-Stimulation zwei Tyrosine innerhalb der SH2-Domänen und zwei am

C-terminalen Ende der SHP2 (Y546 und Y584) phosphoryliert werden. Bei PDGF-R-

Aktivierung aber wird neben den beiden letzteren Tyrosinen ein weiteres, in der linker-Region

zwischen Phosphatase- und SH2-Domänen gelegenes Tyrosin phosphoryliert. Jak2 soll hin-

gegen für die Phosphorylierung der SHP2 an Tyrosin 304 und 327 verantwortlich sein [93].

Phosphoryliert ist die SHP2 in der Lage, mit vielen SH2-Domänen-haltigen Proteinen, so z.B.

IRS-1, PLC, Grb2 oder Grb7 zu interagieren [7, 44, 47]. Sie ermöglicht so die Erweiterung

des Signals auf andere Signalwege (Adapterfunktion). Ein wichtiger Bindungspartner scheint

in diesem Zusammenhang Grb2 zu sein, da über Grb2 die Ras/Raf/MAPK-Kaskade aktiviert

wird. Wie SHP2 und Grb2 miteinander agieren, hängt interessanterweise von dem aktivieren-

den Rezeptor ab. Nach PDGF-Stimulation bindet Grb2 die SHP2 über seine SH2-Domänen,

im EGF-Signalweg interagieren beide Partner über die SH3-Domänen des Grb2 [85, 91].

Weitere Interaktionspartner bilden die Janus-Kinasen Jak1 und Jak2. Im Jahre 1995 konnte

gezeigt werden, daß SHP2 und Jak2 in 3T3-L1 Maus Präadipozyten stimulationsunabhängig

interagieren können [24]. Die Assoziation beider Proteine konnte durch IL-11-Stimulation

weiter induziert werden. Zwei Jahre später konnte in Co-Transfektionsexperimenten verkürz-

ter SHP2- bzw. Jak2-Fragmente die Interaktionstelle weiter eingegrenzt werden. In der Phos-

phatase scheinen die Aminosäuren 272 bis 322 für die Bindung notwendig zu sein, innerhalb

der Kinase der N-terminale Bereich [93].

Die Notwendigkeit des tyrosinphosphorylierten Y-Motivs YXX(L/V/I) zur Rekrutierung der

SHP2 an einen Rezeptor legt nahe, daß auch im Interleukin-6-Signalweg die SHP2 am

Y759STV des gp130 aktiviert werden kann. In der Tat konnten Stahl et al. bzw. Fukada et al.

dies nachweisen [26, 77]. Sie verwendeten dazu verkürzte bzw. chimäre Rezeptoren. Auch

Einleitung 11

zur Funktion der SHP2 in der IL-6-Signaltransduktion wurden bereits erste Untersuchungen

durchgeführt. Fukada et al. zeigten, daß die IL-6-abhängige Proliferation einer stabil gp130

exprimierenden Ba/F3-Zellinie von der STAT- und der SHP2-Aktivierung beeinflusst wird.

Während die STAT-Aktivierung für die anti-Apoptose verantwortlich ist, löst das Rekrutieren

der SHP2 an den Rezeptor das mitogene Signal aus [26].

1.5 Zielsetzung der Arbeit

Die Protein-Tyrosin-Phosphatase SHP2 wird im Kontext verschiedener Signaltransduktionen

tyrosinphosphoryliert. Auch für die IL-6-abhängige Signaltransduktion konnte diese Phospho-

rylierung nachgewiesen werden. Welche Kinase für diese Reaktion verantwortlich ist, ist bis

jetzt noch nicht bekannt. Als Kandidaten kommen u.a. die ebenfalls an der IL-6 Signaltrans-

duktion beteiligten, konstitutiv an gp130 assoziierten Janus-Kinasen Jak1, Jak2 und Tyk2 in

Frage. Ihre mögliche Beteiligung an der IL-6-abhängigen SHP2-Tyrosinphosphorylierung

sollte hier analysiert werden.

Weiterhin sollte nachgeprüft werden, welchen Einfluss die SHP2-Tyrosinphosphorylierung

auf IL-6-abhängige Reaktionen in der Zelle hat. Es sollte der Frage nachgegangen werden, ob

und wie die Akute-Phase-Gen-Induktion durch die SHP2-Tyrosinphosphorylierung bzw. ihre

enzymatische Aktivität beeinflusst wird.

Material und Methoden 13

2. Material und Methoden

2.1 Chemikalien und Verbrauchsmaterialien

Alle Chemikalien wurden in der Qualität pro analysi eingesetzt und von den angegebenen

Quellen bezogen.

2.1.1 Radiochemikalien

[α32P]-dATP Amersham Buchler, Braunschweig

[α35S]-dATP Amersham Buchler, Braunschweig

2.1.2 Zellkultur

DMEM Flüssigmedium mit 4,5 g Glukose und Glutamin Gibco, Eggenstein

DMEM/NUT-Mix (1:1) Flüssigmedium mit F12 und Glutamin Gibco, Eggenstein

Penicillin/Streptomycin Gibco, Eggenstein

Trypsin/EDTA-Lösung (0,05%/ 0,02%) Cytogen, Berlin

Fetales Kälberserum Cytogen, Berlin

2.1.3 Zytokine und Rezeptoren

Interleukin-6 humanes IL-6 wurde nach der von Arcone et al. [6] entwickelten Me-

thode rekombinant hergestellt. Die spezifische Aktivität betrug

1x106 BSF2 U/mg Protein [37].

Erythropoetin rekombinantes humanes Erythropoetin (2,2 x 105 E/mg Protein) wurde

von der Firma Boehringer Mannheim, Penzberg, bezogen.

sIL-6R rekombinanter humaner sIL-6R wurde nach der Methode von

Weiergräber et al. [89] hergestellt und freundlicherweise von A.

Küster, Aachen, zur Verfügung gestellt.

14 Material und Methoden

2.1.4 Antikörper

Antikörper gerichtet gegen:

Phosphotyrosin (4G10) monoklonaler Maus-Antikörper,

Upstate Biotechnology, USA

muriner EpoR polyklonaler Kaninchen-Antikörper,


human gp130 cyt polyklonaler Kaninchen-Antikörper gegen den

cytoplasmatischen Teil des gp130,


c-myc monoklonaler Maus-Antikörper,

Boehringer Mannheim, Penzberg

Maus-IgG polyklonaler Ziegen-Antikörper

Dako, Dänemark

Maus-IgG HRP HRP gekoppelter polyklonaler Ziegen-Antikörper,

Dako, Dänemark

Kaninchen-IgG HRP HRP gekoppelter polyklonaler Ziegen-Antikörper

Dako, Dänemark

gp130 (BS12) monoklonaler Maus-Antikörper,

Dr. J. Wijdenes, Besançon, Frankreich

gp130 (BP4) monoklonaler Maus-Antikörper,

Dr. J. Wijdenes, Besançon, Frankreich

STAT3-Phosphotyrosin polyklonaler Kaninchen-Antikörper gegen

Y705-phosphoryliertes STAT3,

New England BioLabs, Schwalbach/Ts.

STAT1-Phosphotyrosin polyklonaler Kaninchen-Antikörper gegen

Y701-phosphoryliertes STAT1,


Jak1 polyklonaler Kaninchen-Antikörper,

Dr. Ziemiecki, Bern, Schweiz

Jak2 polyklonaler Kaninchen-Antikörper,

Dr. Ziemiecki, Bern, Schweiz


Tyk2 monoklonaler Maus-Antikörper,

Transduction Laboratories, USA

SHP2 polyklonaler Kaninchen-Antikörper,

Dr. Ullrich, MPI, Martinsried

SHP2 polyklonaler Kaninchen-Antikörper gegen den

N-terminalen Bereich der SHP2,

Santa Cruz, USA

2.1.5 Oligonukleotide

Alle Oligonukleotide wurden von der Firma MWG, Ebersberg, bezogen.

P1 BstEII lr Y 5’- GCCCAGTGGTCACCTCACACTCC -3’

P2 BstEII lr F 5’- GCCCAGTGGTCACCTCACACTCCTCCAAGGCACAATTTT

AATTCAAAAGATCAAATGTTCTCAGATGGCAATTTCAC -3’

P3 Sac rl 5’- GGACAGTGGAGCTCGTGTTTTGTGAAGATTC -3’

P4 SacIAccIII lr YY 5’- CAAAACACGAGCTCCACTGTCCAGTATTCTACCGTGGTA

CACTCCGGATACAGACACCAAGTTCCGTC -3’

P5 SacIAccIII lr FF 5’- CAAAACACGAGCTCCACTGTCCAGTTCTCTACCGTGGTA

CACTCCGGATTCAGACACCAAGTTCCGTC -3’

P6 AspI rl 5’- CCGCCATCGACATGGTCTACTAATTGTAGATC -3’

P7 AspI lr Y 5’- CAATTAGTAGACCATGTCGATGGCGGTGATGGTATTTTG

CC -3’

P8 AspI lr F 5’- CAATTAGTAGACCATGTCGATGGCGGTGATGGTATTTTG

CCCAGGCAACAGTTCTTCAAACAGAACTGCAG -3’

P9 SfuIBsmI rl 5’- CTTTTAGGCATTCCTTCATCAGTCGCAGCCTCCATGCCAA

CTGTTTCGAATCTTTCTACTTGTCCC -3’

P10 BsmIRsRII lr YY 5’- GCGACTGATGAAGGAATGCCTAAAAGTTACTTACCACAG

ACGGTCCGGCAAGGCGGCTACATGCCTC -3’

P11 BsmIRsRII lr FF 5’- GCGACTGATGAAGGAATGCCTAAAAGTTTCTTACCACAG

ACGGTCCGGCAAGGCGGCTTCATGCCTCAGTGAAGG -3’

P12 pSVL 3 rl 5’- GCATTCTAGTTGTGG -3’

P19 Ymyc lr 5’-GTCCGGCAAGGCGGCTACATGCCTCAGGGCGGCGAGCAG

AAGCTGATATCGGAGGAAGATCTGTGAG -3’


P20 Ymyc rl 5’- GATCCTCACAGATCTTCCTCCGATATCAGCTTCTGCTCG

CCGCCCTGAGGCATGTAGCCGCCTTGCCG -3’

P21 Fmyc lr 5’- GTCCGGCAAGGCGGCTTCATGCCTCAGGGCGGCGAGCA

GAAGCTGATATCGGAGGAAGATCTGTGAG -3’

P22 Fmyc rl 5’- GATCCTCACAGATCTTCCTCCGATATCAGCTTCTGCTCGC

CGCCCTGAGGCATGAAGCCGCCTTGCCG -3’

S1 sypgfp rl 5’- GGCTGGTGCCGGCAAAGCTTTTCTGAAACTTTTCTGCTG

TTGC -3’

S2 sypgfp lr 5’- GGTCCCGGAATTCCCGGGTCTAGAGTCACCATGACATCG

CGGAGATGG -3’

S3 sypmut lr 5’- GGGCCGGTCGTGGTGCAGTCGAGTGCTGGAATTGGCCGG

ACAGGG -3’

S4 sypmut rl 5’- CCCTGTCCGGCCAATTCCAGCACTCGAGTGCACCACGAC

CGGCCC -3’

S8 sypseq lr 345 5’- GGAGGGGAGAAATTTGCC -3’

S17 sypkorr1 lr 5’- GGTTGGACAAGGGAATACGGAGAGAACGG -3’

S18 sypkorr1 rl 5’- CCCTTGTCCAACCTTCGAAAGTTTAAGTTCTCTTAGCG -3’

S20 sypmyc lr 5’- AGCTTTAGAGCAGAAGCTGATATCGGAGGAAGATCT

GGA -3’

S21 sypmyc rl 5’- AGCTTCCAGATCTTCCTCCGATATCAGCTTCTGCTC

TAA -3’

2.1.6 Plasmide

pSVL Expressionvektor für Eukaryonten, Pharmacia, Freiburg

pSVL EG pSVL-Vektor, in den die cDNA eines chimären Rezeptors einkloniert

wurde, der aus dem extrazellulären Anteil des murinen Erythropoetin-Re-

zeptors und der Transmembran- und zytoplasmatischen Domäne des huma-

nen gp130 besteht [28, 36].

pSVL ∆ EcoRI hum gp130 [40‘]

pBS-SK- Klonierungsvektor pBluescript-SK, Stratagene, Heidelberg ohne die Re-

striktionsschnittstellen Eco RV, Acc I, Cla I, Hind III und Sal I

pRC/CMV Expressionsvektor für Eukaryonten, Invitrogen, Breda, Niederlande


pRK 1D Expressionsvektor für Eukaryonten, der die cDNA der humanen SHP2-

Splice Variante enthält, freundlicherweise zur Verfügung gestellt von A.

Ullrich, MPI, Martinsried

pMBC-1Bgfp bicistronischer Expressionsvektor, der die IRF-1-NLS fusioniert an gfp

enthält [71]

pSBC1 bicistronischer Expressionsvektor mit SV40-Promotor [19]

pCBC1 bicistronischer Expressionsvektor mit CMV-Promotor [19]

pSVL STAT3 pSVL-Vektor, der die murine STAT3-cDNA enthält

pGl3α2M215.luc Expressionvektor, der die cDNA des Luciferase-Gen fusioniert an den α2M-

Promotor enthält [95]

pCR(TM) 3lacZ Expressionsvektor für Eukaryonten, der die cDNA des bakteriellen β-

Galactosidase-Gens enthält, Invitrogen, Breda, Niederlande

pSV2 Neo Expressionsvektor mit Gen, das für eine Neomycinresistenz kodiert

2.2 Allgemeine molekularbiologische Methoden

2.2.1 Verwendete Bakterienstämme und deren Kultivierung

JM83 F’ara ∆(lac-proAB) rspL Φ80dlacZ∆M15

XL-1-Blue supE44, hsdR17, recA1, endA1, gyrA64, relA1, lacF’

[proAB+, lac1q, lac Z∆M15, Tn10 (tetr)]

Die Anzucht rekombinanter Bakterien erfolgte in Luria-Bertani (LB)-Medium bei 37°C auf

einem Schüttler bei 220 UpM in der Regel über Nacht. Alle Bakterien wurden unter Zugabe

der entsprechenden Antibiotika (Ampicillin oder Penicillin, 50 µg/ml Medium) inkubiert.

Die Langzeitaufbewahrung der Bakterien erfolgte in LB-Medium mit 50% Glycerin bei

-80°C.

LB-Medium: 10 g/l Bactotrypton, Difco, USA10 g/l Yeast extract, Difco, USA 5 g/l NaCl

Für die Herstellung von Agarplatten wurden dem LB-Medium 15 g Agar pro Liter Medium

zugesetzt. Ampicillinhaltige Agarplatten mischte man nach Abkühlen des LB-Mediums

1/1000 Volumen Ampicillin eines 50 mg/ml konzentrierten Stocks bei.


2.2.2 Herstellung kompetenter Zellen

E. coli-Bakterien wurden in 500 ml Tetracyclin-haltigem LB-Medium bis zu einer OD600 von

0,3 bei 37°C geschüttelt. Dann wurde der Kolben rasch im Eiswasserbad abgekühlt und die

Zellen 5 min bei 6000 UpM und 4°C abzentrifugiert. Das Sediment wurde in 50 ml TSB-

Lösung aufgenommen, aliquotiert und sofort in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Auf

diese Weise vorbehandelte und bei -80°C gelagerte E. colis konnten über mehrere Jahre zur

Transformation verwendet werden.

TSB-Puffer: Poly-Ethylenglykol (PEG) 4000 10 %DMSO 5 %MgSO4 10 mMMgCl2 10 mM

2.2.3 Transformation von Bakterien nach Hanahan

10 µl Ligationsansatz oder Plasmidlösung (ca. 10-100 ng DNA) wurden mit 100 µl auf Eis

aufgetauter kompetenter Bakteriensuspension für 20 min inkubiert. Der Ansatz wurde für

90 sec auf 42°C erhitzt und anschließend 5 min auf Eis abgekühlt. Nach Zugabe von 1 ml LB-

Medium wurden die Bakterien nun 30 min bei 37°C inkubiert und dann in unterschiedlichen

Konzentrationen mit einem Drigalski-Spatel auf Antibiotika-haltigen Agarplatten ausplattiert.

Die so behandelten Platten wurden für 12-18 h bei 37°C inkubiert und anschließend weiter-

verarbeitet [33].

2.2.4 Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli

2.2.4.1 ...im analytischen Maßstab

Kleine Mengen Plasmid-DNA wurden aus 3 ml-Schüttelkulturen nach den Präparationsvor-

schriften des QIAprep Kits der Firma Qiagen, Hilden, gewonnen.

2.2.4.2 ...im präparativen Maßstab

Plasmid-DNA in präparativem Maßstab wurden aus 250-500 ml Schüttelkulturen ebenfalls

mit Hilfe eines Plasmidpräparationskits der Firma Qiagen, Hilden, gemäß der Anleitung des

Herstellers isoliert.


2.2.5 Konzentrationsbestimmung von DNA

Die photometrischen Messungen zur Konzentrationsbestimmung der DNA wurden in 1 ml

Quarzküvetten in einem Zweistrahlphotometer durchgeführt. Dazu verdünnte man die DNA

1:100 mit Wasser und maß die Extinktion bei den Wellenlängen 260 und 280 nm. Eine

gemessene Extinktion E260 von 0,1 entspricht einer Konzentration von 5 µg doppelsträngiger

DNA pro ml Lösung in der Küvette, dementsprechend beträgt die Konzentration der

Ausgangslösung 0,5 µg/µl. Über den Quotienten E260/E280 konnte eine Aussage über die

Proteinverunreinigung der DNA getroffen werden, über die Extinktion bei 320 nm eine

Angabe über den Salzgehalt gemacht werden [68].

2.2.6 Oligonukleotid-Hybridisierung

Die zu hybridisierenden Oligonukleotide wurden in einer 150 mM NaCl-Lösung in einem

Heizblock auf 80°C erhitzt und dann nach Ausschalten des Gerätes langsam auf RT

abgekühlt.

Bei Bedarf wurden die Nukleotide im Anschluß an diese Reaktion mit Hilfe der Poly-Nu-

kleotid-Kinase der Firma Boehringer Mannheim, Penzberg, nach Angaben des Herstellers

phosphoryliert werden und standen so nach anschließender Phenol-/Chloroform-Fällung

gereinigt für die Ligation zur Verfügung.

2.2.7 Modifikation von Plasmid-DNA

2.2.7.1 Restriktionsanalyse von Plasmid-DNA

Ein mit Hilfe der analytischen oder präparativen Plasmidpräparation isoliertes Plasmid kann

durch Spaltung mit Restriktionsendonukleasen charakterisiert oder verändert werden.

Für die enzymatischen Spaltungen mit Restriktionsendonukleasen wurden die von den Her-

stellern der einzelnen Enzyme angegebenen Vorschriften angewendet. Zur Spaltung der

Plasmid-DNA wurde für 1 µg Plasmid-DNA die 1- bis 4-fache Menge an Enzymeinheiten

(units) eingesetzt. Die Menge an zugegebenem Enzym sollte 10% des Gesamtvolumens nicht

überschreiten, da das im Kulturpuffer des Enzyms enthaltene Glycerin die Enzymaktivität

inhibiert oder eine Sternaktivität (Spaltung der DNA außerhalb der spezifischen

Restriktionsschnittstellen) verursachen kann.


Sämtliche Enzyme und die dazugehörigen Reaktionspuffer wurden von den Firmen AGS,

Heidelberg, Boehringer Mannheim, Penzberg, und New England Biolabs, Schwalbach,

bezogen.

2.2.7.2 Elektrophoretische Auftrennung der DNA

Nach einem Verdau mit geeigneten Restriktionsendonukleasen erfolgte die Analyse der DNA

durch Auftrennung der Fragmente nach ihrer Größe im elektrischen Feld. Dazu wurde die

DNA-Lösung mit 1/5 Volumen eines 6x DNA-Probenpuffers versetzt, auf ein Agarosegel

aufgetragen (1-2% Agarose (Biozym, Hameln) in Laufpuffer) und in 1x TAE-Laufpuffer

aufgetrennt. Als Größenstandard diente mit EcoRI/HindIII verdaute Lamba-Phagen-DNA.

Durch Zusatz von Ethidiumbromid zum Gel (1 µg/ml Endkonzentration) war es möglich, die

DNA-Banden unter UV-Licht sichtbar zu machen.

1x TAE-Laufpuffer: 0,4 M Tris-Base1,1 M EDTA0,005 M Natriumacetat0,032 M Essigsäure

6x DNA-Probenpuffer: 15 ml TAE 1x10 ml Glycerin60 mg Bromphenolblau/Xylencyanol

2.2.7.3 Isolierung von DNA aus Agarosegelen

Um bestimmte DNA-Fragmente nach der Gelelektrophorese wieder aus dem Gel zu isolieren,

wurden die entsprechenden Banden unter UV-Licht mit einem Skapell ausgeschnitten und in

ein Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt. Die Freisetzung der DNA aus der Gelmatrix erfolgte

nach Herstellerangaben mit Hilfe des QIAquick Kits der Firma Qiagen, Hilden.

2.2.7.4 Dephosphorylierung linearisierter DNA

Um die Wahrscheinlichkeit einer Selbstligation geschnittener Vektoren in einem Ligations-

ansatz zu vermindern und somit den Anteil der durch Insertion geschlossenen Plasmide nach

der Ligation zu erhöhen, wurde die endständige 5’-Phosphatgruppe der geöffneten Vektoren

entfernt. Dies geschah mit Hilfe der alkalischen Phosphatase (calf intestine phosphatase =

CIP) der Firma Boehringer Mannheim, Penzberg, nach Standardvorschrift.


2.2.7.5 Ligation von DNA-Fragmenten

Bei der Ligation verknüpft die T4-DNA-Ligase DNA-Fragmente, die sowohl kompatible

überstehende, als auch glatte Enden besitzen. Dabei bildet sich eine Phosphodiester-Bindung

zwischen den 3’-OH- und den 5’-P-Enden der DNA aus. Das Enzym wurde von der Firma

Boehringer Mannheim, Penzberg bezogen. Die Reaktion erfolgte unter Standardbedingungen

des Herstellers. In der Regel wurden Vektor und Fragment im Verhältnis 1:1,5 eingesetzt; bei

Ligationen mit synthetischen Oligonukleotiden sollte man den 1000fachen molaren

Überschuß an Fragment verwenden.

2.2.8 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)

Die PCR ist eine einfache Methode, Nukleinsäuren in einer Lösung zu vervielfältigen. Dabei

wird der natürliche Replikationszyklus der Zelle nachgeahmt, wobei sich die Anzahl der

DNA-Moleküle bei jedem Zyklus verdoppelt. Die Methode basiert auf der Wiederholung

einer Abfolge von drei Schritten mit bestimmten Reaktionsbedigungen:

1. Denaturierung der Template-DNA: Die doppelsträngige Ursprungs-DNA wird bei hohen

Temperaturen inkubiert. Die Doppelstränge dissoziieren und liegen solange in Lösung einzel-

strängig vor, bis die Temperatur abgesenkt wird.

2. Annealing von Primern: Bei Abkühlung der Lösung hybridisieren die Einzelstränge mit

den sogenannten Primern. Dies sind Oligonukleotide, die so gewählt werden, daß sie den zu

amplifizierenden Bereich der DNA flankieren. Sie sind so beschaffen, daß einer der Primer

komplementär zum codierenden Strang diesen bindet, der andere Primer aber den nicht-codie-

renden Strang erkennt. Da die Konzentration der Primer in der Lösung sehr hoch ist, wird die

Ausbildung von Primer-Template-Komplexen gegenüber der Renaturierung der beiden Ein-

zelstränge bevorzugt werden.

3. Primer Extension: Der letzte Schritt ist die von der DNA-Polymerase vermittelte Verlänge-

rung der Primer in den Primer-Template-Komplexen. Diese Extensionsreaktion kann z.B. von

der Klenow Polymerase bewerkstelligt werden. Die Reaktionstemperatur dieses Enzyms liegt

allerdings bei 37°C, so daß es bei jedem nachfolgenden Zyklus zerstört wird und neu

hinzugegeben werden muß. Die Verwendung der Taq-Polymerase erlaubt die Erhöhung der

Temperatur für die Extensionsreaktion auf über 70°C. Die hohe Thermostabilität des Enzyms

bedingt gleichzeitig, daß viele Zyklen der PCR durchlaufen werden können, ohne das neues


Enzym zugegeben werden muß. Der Vent-Polymerase spricht man zusätzlich eine proof-

reading Eigenschaft zu, welche den Einbau falscher Nukleotide vermehrt verhindern soll [68].

Ein Standardansatz setzte sich wie folgt zusammen:2 x 5 µl Primer (2x 5 pmol/µl)

5 µl Nukleotide (2,5 mM jedes Nukleotides)4 µl MgCl2 (25mM)5 µl Vent-Polymerase-Pufferx µl Template (1ng)

ad 49 µl H2O

Die Proben wurden mit Mineralöl überschichtet, um ein Verdunsten der Flüssigkeit und damit

die Veränderung der Reaktionsbedingungen zu vermeiden. Anschließend wurden sie den

PCR-Prozessor gegeben und die Reaktion gestartet.

Ein Standardprofil für die DNA-Amplifikation mit ungeschnittenen Plasmiden als Template

sah wie folgt aus:

Erste Denaturierung: 94°C 60 secAnnealing (primer-abhängig): 45°C 30 secExtension: 72°C 240 secDenaturierung: 94°C 30 secLetzte Extension: 72°C 600 sec

2.2.8.1 DNA Mutagenese durch PCR

Gezielte Veränderungen der DNA-Sequenz bei der PCR können lediglich an den Enden der

PCR-Produkte, im Bereich der Homologie zu den Primern eingefügt werden. Hierfür plant

man die Oligonukleotide so, daß sie, wenn sie die Mutation aufweisen, nicht vollständig

komplementär zur Template-DNA sind, sondern entweder einzelne missmatches oder sogar

ein längeres nicht komplementäres 5’-Ende aufweisen. Es ist darauf zu achten, daß am 3’-

Ende wenigstens über eine Länge von 10 Basen vollständige Komplementarität besteht. Um

eine sichere Hybridisierung zwischen Primer und Template zu erreichen, sollten die Oligonu-

kleotide möglichst mit einigen Cytosinen oder Guaninen enden, da GC-Bingungen stabiler als

AT-Bindungen sind. Entsprechend lassen sich auch Verkürzungen in die zu exprimierenden

Proteinen einfügen: C-Terminale Deletionen erreicht man durch das Einfügen eines neuen

Stopcodons in die DNA, welches vor dem natürlichen Stop-Codon, also in Richtung 5‘

(upstream) liegen sollte. N-terminale Verkürzungen werden analog dazu durch Entfernen des

ursprünglichen Startcodons und Einführung eines neuen Translationsstartes an beliebiger

Stelle downstream erzeugt. Interne Deletionen oder Punktmutationen erreicht man durch

Ligation über neu eingefügte Restriktionserkennungs-Sequenzen von PCR-Produkten C- und


N-terminaler Fragmente oder durch die sogenannte Fusions-PCR. Hierbei werden die bei

einer ersten PCR gewonnenen Fragmente zu gleichen Teilen als Matrize einer zweiten PCR

eingesetzt. Als Primer verwendet man entsprechend weiter N- bzw. C-terminal gelegene

Basensequenzen.

2.2.9 Analyse der DNA durch Sequenzierungen

2.2.9.1 Sequenzierung nach Sanger et al. (1977)

Die Sequenzierung erfolgte nach obengenannter Methode mit Hilfe des T7-Sequencing-Kit

der Firma Pharmacia, Freiburg. Zur radioaktiven Markierung der Reaktionsprodukte

verwendete man [α35S]-dATP. Die entstehenden DNA-Fragmente wurden auf einem durch

Zusatz von 7 M Harnstoff denaturierenden 5%-igen Polyacrylamidgel aufgetrennt und durch

Autoradiographie sichtbar gemacht [69].

2.2.9.2 Automatische Sequenzierung mit dem ABI Prism Modell 310 Sequencer

Das Prinzip der automatischen Sequenzierung beruht auf der Anregung und Detektion fluo-

reszenzmarkierter Didesoxynukleotide, die in einer Polymerase-Ketten-Reaktion in ein DNA-

Molekül eingebaut werden.

Zur Präparation der DNA-Proben wurde das PRISM™ Ready Reaction Dye-Desoxy™ Ter-

minator Cycle Sequencing Kit der Firma Perkin Elmer, USA, verwendet.

Der Reaktionsansatz wurde wie folgt angesetzt:

6 µl Terminator Mix1 ng DNA-Matrix5 pmol Oligonukleotid-Primer ad 20 µl H2O

Die DNA-Matrize wurde in 25 Reaktionszyklen in einem PCR-Prozessor unter Einbau der

fluoreszenzmarkierten Didesoxynukleotide amplifiziert. Ein Reaktionszyklus bestand aus:

Erste Denaturierung: 96°C 20 secAnnealing: z.B. 45°C 20 secExtension: 60°C 40 secDenaturierung: 96°C 20 secLetzte Extension: 60°C 240 sec

Nach der Amplifikation wurde die DNA mit 10 µl 3M Na-Acetat, pH 5,2, und 50 µl 100%

Ethanol 20 min lang bei RT gefällt und abzentrifugiert. Das DNA-Sediment wurde in 70%

Ethanol gewaschen und für 10 min bei 37°C getrocknet. Die Proben wurden in TSR-Proben-


puffer der Firma Applied Biosystems ,Foster City, USA, aufgenommen, für 2 min bei 90°C

denaturiert und anschließend in einem 6%-igen Performance Optimized Polymer (POP6) mit

8% Harnstoff aufgetrennt. Die Elektrophorese erfolgte in einer unbeschichteten Kapillare

(Ø 51 µm) bei 12,5 kV und einer Temperatur von 50°C für ca. 135 min. Eine genaue

Beschreibung der hierfür erforderlichen Computer-Software ist dem User Bulletin ABI Prism

310 Genetic Analyser (PE Applies Biosystems, 1997) zu entnehmen.

Terminator-premix: 1,58 µM A-DyeDesoxy94,74 µM T-DyeDesoxy

0,42 µM G-DyeDesoxy78,95 µM C-DyeDesoxy78,95 µM DITP15,79 µM DDTP15,79 µM DTTP15,79 µM DATP

169,42 mM Tris/HCl pH 9,04,21 mM (NH4)2SO4

42,10 mM MgCl2

0,42 U/µl AmpliTaq-Polymerase

2.3 Eukaryontische Zellen und deren Kultivierung

2.3.1 Kulturmedien

PBS: NaCl 200 mMKCl 2,5 mMNa2HPO4 8 mMKH2PO4 1,5 mM

Hygromycin: 50 mg/ml, bei 4°C gelagert,

Boehringer Mannheim, Penzberg

Neomycin: 125 mg/ml PBS steril, bei -20°C gelagert,

Sigma, Deisenhofen

Puromycin: 0,5 mg/ml in H2O, sterilfiltriert, bei -20°C gelagert,

Sigma, Deisenhofen

s. auch 2.1.2


2.3.2 Verwendete permanente Zell-Linien

COS-7 adhärent wachsende Affennieren-Zell-Linie (ATCC, CRL1651);

Kultivierung in DMEM

HepG2 adhärent wachsende humane Hepatomzell-Linie (ATCC, HB8058);

Kultivierung in DMEM/NUT-Mix-F12

Ba/F3 nicht adhärent wachsende IL-3-abhängige murine Prä-B-Zell-Linie

(DSM, ACC300)

Kultivierung in DMEM plus 5% BPV-Überstand

X63Ag8-653 BPV-mIL-3

nicht adhärent wachsende murine Myelomzell-Linie, die murines IL-3

sezerniert,

Kultivierung in DMEM

2.3.2.1 Janus-Kinasen defiziente Zell-Linien

Hierbei handelt es sich um diverse Abkömmlinge einer Fibrosarkom-Zell-Linie, die nicht

mehr in der Lage sind, jeweils eine der drei Janus-Kinasen zu exprimieren. Sie wurden

freundlicherweise von Herrn Ian Kerr, Imperial Cancer Research Fund, London, Groß-

britannien, zur Verfügung gestellt.

Ausgangspunkt für die Herstellung dieser Zell-Linien ist eine humane Fibrosarkom-Zell-

Linie, HT1080. Ein Abkömmling dieser Zell-Linie, HPRT–, besitzt einen Defekt im Salvage

Pathway, der zur Bereitstellung von Purinnukleotiden dient. Sie besitzen keine Hypoxanthin-

Phosphoribosyltransferase und können deshalb nicht im sogenanten HAT-(Hypoxanthin-

Aminopterin-Thymidin)-Medium überleben, da der Folsäure-Antagonist Aminopterin die

de novo-Synthese der Purine hemmt, und Hypoxanthin nicht mehr zu Purin umgesetzt werden

kann. Gleichzeitig werden diese Zellen jedoch gegen die toxische Wirkung des Guanin-Ana-

logons 6-Thioguanin (6-TG) resistent.

Die Transfektion eines IFN-α regulierten Gens, das für das bakterielle Enzym Guanosin-

Phosphoribosyltransferase kodiert, stellt IFN-α-abhängig den salvage pathway wieder her.

Derart transfizierte Zellen, 2fTGH-Zellen, überleben in einem IFN-α-haltigen HAT-Medium

und sterben in der Gegenwart von 6-TG. Behandelte man diese Zellen nun mit einem frame-

shift-Mutagen und züchtete sie in einem 6-TG- und IFN-α-haltigen normalen Medium an, so


überlebten diejenigen Zellen, bei denen der IFN-α-Signalweg zerstört ist. Entstehende Klone

untersuchte man auf ihren Defekt.

Da Jak2 keine Rolle im IFN-α-Signalweg zu spielen scheint, mußte man zur Deletion dieses

Proteins eine andere Strategie wählen. Man transfizierte ein IFN-γ-abhängig exprimiertes

Oberflächen-Protein, CD2, in HT-1080 und wählte die positiven Klone, 2C4, im FACS aus.

Nach Mutagen-Einwirkung wurden hierbei diejenigen Zellen selektiert, die auf IFN-γ nicht

mehr mit Expression des CD2 reagieren. Anschließend suchte man nach dem Defekt [16].

Die so gefundenen Jak-defizienten Zellen wurden im Anschluß durch Transfektion der ent-

sprechenden cDNA rekonstituiert. Es handelt sich dabei im Einzelnen um folgende Zell-

Linien:

2fTGH parentale Zell-Linie

Kultivierung in DMEM-Medium plus Hygromycin

U1A Tyk2-defiziente Zell-Linie


U1A/Tyk2 Tyk2-defiziente Zell-Linie stabil transfiziert mit Tyk2-cDNA

Kultivierung in DMEM-Medium plus Hygromycin und Neomycin

U4A exprimiert eine verkürzte nicht aktive Form von Jak1


U4A/Jak1 U4A stabil transfiziert mit Jak1-cDNA

Kultivierung in DMEM-Medium plus Hygromycin und Neomycin

γ2A Jak2-defiziente Zellen

Kultivierung in DMEM-Medium plus Neomycin

γ2A/Jak2 Jak2-defiziente Zellen stabil transfiziert mit Jak2-cDNA

Kultivierung in DMEM-Medium plus Neomycin und Puromycin

U4A/Jak1(K→E) U4A stabil transfiziert mit katalytisch inaktiver Jak1-cDNA

2.3.3 Kultivierung von Zell-Linien

Die Zellen aller Linien wurden bei 37°C in wasserdampfgesättigter Atmosphäre mit einem

CO2-Gehalt von 5% kultiviert. Die Medien enthielten, sofern nicht anders angegeben, 10%

fetales Kälberserum, 60 mg/ml Penicillin und 100 mg/ml Streptomycin.


2.3.3.1 Passagierung von Zellen

Zur Weiterkultivierung mußten adhärente Zellen von einer konfluent bewachsenen Petrischale

mit Trypsin/EDTA abgelöst werden. Nach Aufnahme in frischem Kulturmedium entspre-

chender Menge wurden die Zellen auf mehrere neue Schalen in einer Verdünnung 1:2 bis

1:20 verteilt. Nicht adhärente Zellen wurden direkt mit frischem Medium verdünnt und auf

neue Schalen verteilt.

2.3.3.2 Langzeitaufbewahrung

Für die Langzeitaufbewahrung wurden die Zellen einer Platte gegebenenfalls nach Trypsini-

sierung bei 900 UpM abzentrifugiert, in 1 ml Medium mit 10% DMSO aufgenommen und in

Kryoröhrchen aliquotiert. Zur langsamen Abkühlung erfolgte eine Lagerung bei -80°C für ca.

24 Stunden. Anschließend wurden sie in flüssigen Stickstoff überführt. Zum Auftauen mußten

die Kryoampullen möglichst schnell bei 37°C aufgetaut und das DMSO-haltige Medium mit

10 ml kaltem Medium verdünnt werden. Die Zellen wurden dann bei 900 UpM und 4°C ab-

zentrifugiert, in neuem Medium aufgenommen und auf einer Petrischale ausgesät.

2.3.4 Transiente Transfektion

2.3.4.1 Elektroporation

Eine konfluent bewachsene Kulturschale (Ø10cm) wurde zweimal mit 5 ml PBS gewaschen

und 5 min mit 1 ml Trypsin/EDTAösung inkubiert. Die Aktivität des Trypsins stoppte man

durch Zugabe von 4 ml DMEM. Anschließend wurden die Zellen bei 900 UpM

abzentrifugiert und in 1,6 ml DMEM resuspendiert. 800 µl dieser Zellsuspension überführte

man zu der vorgelegten Plasmid-DNA (20-30 µg Plasmid-DNA pro Versuchsansatz) in eine

mit PBS gespülte Elektroporationsküvette. Die Elektroporation erfolgte im Modell T820 der

Firma BTX, USA, mit einem Puls bei einer Spannung von 1,5 kV und einer Pulsdauer von

99 µs. Nach 2-3 Tagen konnten die Zellen weiter verarbeitet werden.

2.3.4.2 Calcium-Phosphat-Präzipitation

Die Zellen einer konfluent bewachsenen Schale wurden am Vortag sorgfältig vereinzelt und

1:8 verdünnt wieder ausgesät. Vor der Transfektion wusch man die Zellen zweimal mit PBS

und inkubierte sie mindestens eine Stunde in DMEM ohne F12. Maximal 30 µg Plasmid-


DNA wurden in einem sterilen Falcongefäß vorgelegt, mit 125 µl 1M CaCl2 versetzt und ad

500 µl mit Wasser aufgefüllt. Anschließend gab man 500 µl 2xHBS tropfenweise in das vor-

texende Röhrchen. Nach einer Inkubationszeit von mindestens einer halben Stunde wurde die

Lösung auf die Zellen pipettiert und für 5-15 h dort belassen. Nach Ablauf dieser Zeitspanne

wurden die Zellen in geeignetem Kulturmedium weitergezogen.

2x HBS: HEPES 5 g 40 mMNaCl 8 g 274 mMKCl 0,37 g 1 mMNa2HPO4•2H2O 0,125 g 1,4 mMGlukose 1 gH20 ad 500 ml

den pH exakt auf 7,05 mit NaOH eingestellt, sterilfiltriert

2.3.5 Stabile Transfektion von Ba/F3-Zellen

Die stabile Transfektion von Ba/F3-Zellen mit membranständigen gp130-Proteinen erfolgte

durch Elektroporation. Dazu wurden 3,5 x 106 Zellen mit insgesamt 30 µg DNA gemischt und

mit einem 70 msec langen Puls von 200 V elektroporiert. Zur Selektion transfizierter Zellen

wurden 2 µg des Plasmids pSV2 Neo, das für eine Neomycinresistenz kodiert, kotransfiziert.

Nach der Elektroporation wurden die Ba/F3-Zellen zunächst für 24 h ohne Selektionsdruck in

DMEM/IL-3 kultiviert. Anschließend wurden sie in 50 ml Medium mit 1 mg/ml Geneticin

(G418) aufgenommen und in zwei 24-Loch-Zellkulturplatten ausgesät. 16-28 Tage später

wurden erste G418-resistente Klone erkennbar, die in frischen G418-haltigen Medium aufge-

nommen und amplifiziert wurden. Die Expressionskontrolle bzw. -Quantifizierung der gp130-

Proteine erfolgte in der Durchflußzytometrie mit Hilfe eines gegen die extrazelluläre Domäne

des gp130 gerichteten Antiköpers (s. 2.4.11).

2.4 Biochemische Methoden

2.4.1 Herstellung zytosolischer Extrakte

Alle Lösungen wurden eisgekühlt eingesetzt, und alle Arbeitsschritte nach Möglichkeit auf

Eis oder bei 4°C durchgeführt. Die zu lysierenden Zellen wurden zunächst zweimal mit

PBS/Vanadat gewaschen und in 1 ml PBS/Vanadat mit einem Gummischaber von der Schale

gelöst. Danach zentrifugierte man sie ab und resuspendierte sie in 500 µl Lysispuffer. Nach


einer Inkubation von 30 min auf Eis wurde das Lysat 10 min bei maximaler Rotation

zentrifugiert. Anschließend überführte man der Überstand in ein neues Eppendorf-

Reaktionsgefäß.

Lysis-Puffer: 50 mM HEPES pH 7,5 Vor Gebrauch frisch hinzufügen:150 mM NaCl NaVanadat 1 mM

1 % Triton X-100 NaF 1 mM10 % Glycerol PMSF 0,2 mM

1 mM EGTA Aprotinin 10 ng/ml1,5 mM MgCl2 Leupeptin 10 ng/ml

Pepstatin 10 ng/ml

Für Co-Immunpräzipitationen wurde dem Lysispuffer nur 0,1% Triton X-100 hinzugefügt.

2.4.2 Immunpräzipitation

Zu den Zell-Lysaten wurden je nach Versuch zwischen 1-6 µg Antikörper gegeben. Zeitgleich

wurden 3,5-4 mg Protein A-Sepharose, Pharmacia, Freiburg, in 100 µl Lysispuffer pro Ansatz

aufgenommen, bei Bedarf mit einem Kaninchen-anti-Maus-Antiserum, Dako, Dänemark,

abgesättigt und quellen gelassen. Anschließend erfolgte eine Inkubation in einem Über-Kopf-

Schüttler bei 4°C für mindestens 8 Stunden. Danach gab man je 100 µl gequollene Protein A-

Sepharose zu den Proben und ließ sie für eine weitere Stunde schütteln. Die Sepharose wurde

durch Zentrifugation sedimentiert, dreimal in Lysispuffer gewaschen und schließlich in 30 µl

Lämmli-Probenpuffer mit 5% β-Mercaptoethanol aufgenommen. Den Ansatz kochte man

5 min lang bei 95°C auf, zentrifugierte ihn erneut und trug den Überstand auf ein SDS-

Polyacrylamidgel auf.

2.4.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)

Die Auftrennung von Proteinen erfolgte in einer diskontinuierlichen 7%-igen SDS-Polyacryl-

amid-Gelelektrophorese nach Lämmli [49].

Laufpuffer 5x: 30,25 g Tris-Base144 g Glycin

10 g SDSad 2 l H2O


Trenngel: 7,34 ml H2O3,36 ml Acrylamidlösung: 29% Acrylamid, 0,8% Bisacrylamid3,80 ml 1,5 M Tris/HCl, pH 8,8

75 µl 10% SDS15 µl TEMED75 µl 20% APS

Sammelgel: 4 ml H2O635 µl Acrylamidlösung: 29% Acrylamid, 0,8% Bisacrylamid313 µl 2 M Tris/HCl pH 6,8

25 µl 10% SDS5 µl TEMED

40 µl 20% APS

2x Lämmli-Probenpuffer 20 % Glycerin4 % SDS

125 mM Tris/HCl0,002 % Bromphenolblau

2.4.4 Western Blot

Durch das Western Blot-semidry-Verfahren [34] können Proteine auf eine Membran über-

tragen und mit Hilfe Enzym markierter Antikörper schnell und spezifisch nachgewiesen wer-

den. Die durch SDS-PAGE (2.4.3) aufgetrennten Proteine wurden durch einen Western Blot

auf eine Polyvinylidenfluorid-Membran (PVDF) übertragen. Hierfür benetzte man die

Membran zuerst 5 sec mit Methanol, anschließend wässerte man sie und legte sie in

Anodenpuffer II. Das Gel wurde 5 min lang im Kathodenpuffer äquilibriert. 15 Whatman-

Papierfilter wurden auf Gelgröße zurechtgeschnitten und mit verschiedenen Puffern getränkt

(siehe Blotaufbau).

Der Blotvorgang dauerte 1 h und wurde bei 0,8 mA/cm2 Membran durchgeführt. Der Western

Blot konnte sofort zur Detektion mit spezifischen Antikörpern verwendet oder bei Bedarf in

TBS-N-Puffer (2.4.5) bei 4°C gelagert werden.

Anodenpuffer I 0,3 M Tris-Base 20 % Methanol

pH 10,4

Anodenpuffer II 0,025 M Tris-Base 20 % Methanol

pH 10,4

Kathodenpuffer 0,04 M ε-Aminocarponsäure 20 % Methanol

pH 9,4


Abb.4: Western Blot-Aufbau

2.4.5 Detektion von Proteinen mittels verstärkter Lichtemission

Mit der Enhanced Chemiluminescence (ECL) bzw. der Enhanced Chemiluminescence plus

(ECL+) der Firma Amersham, Braunschweig können Proteine, die zuvor mit einem

spezifischen Primärantikörper markiert worden sind, mit Hilfe eines gegen diesen Primäranti-

körper gerichteten Meerrettich-Peroxidase konjungierten Zweitantikörper nachgewiesen

werden. Das Prinzip dieser Methode beruht darauf, daß Peroxidasen in Gegenwart von

Wasserstoffperoxid Diacylhydrazide, z.B. Luminol, oxidieren können. Neben freiem

Stickstoff entsteht dadurch ein aktiviertes Intermediat, das unter Abgabe von Lichtquanten in

seinen Grundzustand zurückfällt. Dieses Licht ist in der Lage, einen Röntgenfilm zu

schwärzen.

Für die Detektion der Proteine wurde die PVDF-Membran (2.4.4) zuerst 30 min in 10%-iger

BSA-Lösung inkubiert, um unspezifische Bindungsstellen abzusättigen. Anschließend wusch

man die Membran 15 min in TBS-N-Puffer und inkubierte dann eine Stunde bei RT mit einer

1:1000 Verdünnung eines Protein-spezifischen Antikörpers in TBS-N. Danach wurde erneut

gewaschen, um ungebundene Antikörper zu entfernen. Es folgte die Inkubation mit dem

Peroxidase-konjugierten spezies-spezifischen Antikörper in einer Verdünnung von 1:2000 für

ca. 30 min. Der so markierte Western Blot wurde mindestens 30 min gewaschen, wobei die

Spüllösung 5-6x gewechselt werden mußte. Die anschließende ECL-Reaktion erfolgt nach

Vorschrift des Herstellers.

Für eine erneute Detektion müssen die Antikörper entfernt werden. Hierzu wurde die Mem-

bran 30 min bei 70°C in einem stripping-Puffer inkubiert und anschließend in TBS-N ge-

waschen.


TBS-N-Puffer 20 mM Tris/HCl pH 7,6140 mM NaCl

0,01 % Nonidet-P40

stripping-Puffer 100 mM 2-Mercaptoethanol2 % SDS

62,5 mM Tris/HCl, pH6,7

2.4.6 Herstellung von Kernextrakten

Die zu fraktionierenden Zellen wurden nach eventueller Transfektion und Stimulation zwei-

mal mit gekühlten PBS mit 100 µM Na-Vanadat gewaschen und anschließend mit einem

Gummischaber von ihren Schalen gelöst. Die eigentliche Kernextraktion erfolgte wie bei

Andrews und Faller beschrieben [5]: Die Zellen wurden in ein Reaktionsgefäß überführt und

zehn Sekunden lang bei 14000 UpM abzentrifugiert. Das Zellsediment wurde in 400 µl des

hypotonen Puffers A aufgenommen und zehn Minuten auf Eis inkubiert, was zur Schwellung

der Zellen führte. Durch zehn-sekündiges Vortexen erfolgte die Aufschließung der Zellen.

Nach erneutem Zentrifugieren wurde das erhaltene Sediment in 100 µl Puffer C auf-

genommen und 20 min auf Eis inkubiert. Zum Schluß zentrifugierte man die Suspension ein

letztes Mal für 2 min. Der resultierende Überstand, der die Kernproteine der eingesetzten

Zellen enthielt, wurde in ein neues Gefäß überführt und bei -80°C eingefroren. Der Protein-

gehalt konnte mit dem BioRad Protein-Assay (2.4.7) bestimmt werden.

Puffer A: Puffer C:10,0 mM HEPES/KOH, pH 7,8 20,0 mM HEPES/KOH, pH 7,8

1,5 mM MgCl2 1,5 mM MgCl210,0 mM KCl 420,0 mM NaCl

0,5 mM DTT 0,2 mM EDTA0,2 mM PMSF 25 % Glycerin

0,5 mM DTT0,2 mM PMSF1,0 mM Na-Vanadat

2.4.7 Proteinbestimmung nach Bradford

Zum quantitativen Nachweis gelöster Proteine wurde ein Test der Firma BioRad (München)

verwendet. Das Prinzip der Bestimmung basiert auf einer von Bradford [13] beschriebenen

Methode und ermöglicht anhand einer aus 1-12 µg/µl BSA in Wasser erstellten Eichgerade

einen schnelle Quantifizierung der Proteinmenge.


5 µl der zu untersuchenden Probe wurden mit Wasser auf 800 µl Gesamtvolumen verdünnt

und mit 200 µl BioRad Gebrauchslösung vermischt. Nach fünfminütiger Inkubation erfolgte

die photometrische Bestimmung bei einer Wellenlänge von 595 nm.

2.4.8 Radioaktive Markierung doppelsträngiger DNA

Doppelsträngige DNA mit überhängenden 5’-Enden kann durch den Einbau radioaktiver

Nukleotide (α[32P]-dATP) mit Hilfe des Klenow-Enzyms markiert werden. Die Markierungs-

dauer betrug 30 min bei RT. Die Trennung der radioaktiv markierten DNA von den noch

freien Nukleotiden erfolgte mit dem QIAquick Nucleotide Removal Kit der Firma Qiagen,

Hilden.

Reaktionsansatz: 2,5 pmol DNA(2,5 pmol/µl)6,0 µl 10x Puffer M (Boehringer Mannheim)1,0 µl dCTP (0,5 mM)1,0 µl dGTP (0,5 mM)1,0 µl dTTP (0,5 mM)

45,5 µl H2O2,0 µl [α32P]dATP2,5 µl Klenow-Enzym (5U)

In allen Reaktionen wurde das doppelsträngige „m67SIE“-Oligonukleotid eingesetzt. Diese

Sequenz enthält das sis-induzierbare-Element des humanen c-fos Promotors, welches so ver-

ändert worden ist, daß es die Transkriptionfaktoren STAT1 und STAT3 mit gleich hoher

Affinität bindet [86].

„SIE“ 5’-GATTGACGGGAACTG-3’

„m67SIE“ 5’-GATCCGGGAGGGATTTACGGGAAATGCTG -3’

3’-GCCCTCCCTAAATGCCCTTTACGACTTAA-5’

2.4.9 Elektrophoretischer-Mobilitäts-Shift Assay (EMSA)

Mit Hilfe des EMSA ist es möglich, Wechselwirkungen zwischen Transkriptionsfaktoren und

radioaktiv markierten Oligonukleotiden durch Autoradiographie sichtbar zu machen.

5 µg des Kernextraktes wurden in einem speziellen Reaktionspuffer (eingestellt auf 5000 cpm

pro µl) mit 1 µl einer radioaktiv markierten Sonde (2.4.8) inkubiert. Nach fünfminütiger Inku-

bation bei RT erfolgte der Auftrag des Ansatz auf ein 4%-iges natives Polyacrylamidgel


aufgetragen mit nachfolgender Elektrophorese (bei einer Gellänge von 20 cm: 4 h bei 200V in

0,25x TBE). Der Laufpuffer wurde dabei solange durch eine Pumpe umgewälzt, bis eine

Laufstrecke von 12 cm erreicht worden ist. Um zu vermeiden, daß freie radioaktive

Oligonukleotide ins obere Pufferreservoir – und damit wieder ins Gel – gelangen, erfolgte die

weitere Auftrennung bis zu einer Laufstrecke von 15,5 cm ohne Umwälzung. Im Anschluß an

die Elektrophorese fixierte man das Gel für 30 min in 10% Methanol /10% Eis-essig, nahm es

dann auf ein 3 mm dickes Whatman-Papier auf, trocknete und autoradiographierte es.

5x Gelshift-Puffer: 50 mM HEPES/KOH, pH 7,85 mM EDTA

25 mM MgCl2

50 % Glycerin

Reaktionsansatz: 5,0 µg Kernextrakt4,0 µl 5x Gelshift-Puffer0,1 µl 1M DTT0,2 µl 200mM PMSF1,0 µl Poly(dI-dC), 1mg/ml2,0 µl BSA, 10 mg/ml

ad 20,0 µl H20Bromphenolblau / Xylencyanol

4-%iges PAA: 6,0 ml Acrylamidlösung 40%4,5 ml Glycerol (Endkonzentration 7,5%)3,0 ml TBE 5x

46,2 ml H2O40 µl TEMED

200 µl APS 20%

2.4.10 Immunfluoreszenz-Analysen eukaryonter Zellen

Transfizierte Zellen wurden auf Deckgläschen, die sich in 24-Loch-Zellkulturplatten befin-

den, ausgesät. Nach drei Tagen, wenn eine Zelldichte von 104-105 Zellen pro Loch erreicht

worden war, wurden die Zellen zweimal mit PBS++ gewaschen und 20 min in 2% Paraformal-

dehyd fixiert. Um die Plasmamembran zu permeabilisieren, enthielten alle folgenden Puffer

0,1% Triton X-100. Zur Unterdrückung einer möglichen Eigenfluoreszenz des Paraformalde-

hyds folgte die Inkubation mit 50 mM NH4Cl in PBS++. Die unspezifischen Antikörperbin-

dungsstellen wurden dann mit 1% BSA in PBS++ blockiert. Anschließend erfolgte die

Inkubation der Zellen mit 1-10 ng spezifischen Antikörper für mindestens 30 min. Nach drei

Waschschritten mit PBS++ + 0,2% BSA erfolgte die Detektion der gebundenen Antikörper mit


einem FITC-konjugierten speziesspezifischen Immunglobulin in einer 1:200-Verdünnung für

mindestens 30 min. Nach erneuten dreimaligen Waschen wurden die Deckgläschen in

Mowiol, Calbiochem, USA, eingebettet und unter dem Immunfluoreszenzmikroskop analy-

siert [30].

PBS++: 1 mM MgCl2

0,1 mM CaCl 2 in PBS

2.4.11 FACS-Analysen von eukaryonten Zellen

Die Durchflußzytometrie wurde verwendet, um die Oberflächenexpression von gp130-

Mutanten in transfizierten BaF/3-Zellen zu überprüfen.

Dazu erntete man die Zellen, wusch und resuspendierte sie in kaltem FACS-Waschpuffer.

Anschließend erfolgte eine Inkubation mit einem extrazellulären gp130-Antikörper auf Eis für

30 min, Nach Entfernung der überschüssigen Aks erfolgte zur Detektion der gebundenen

spezifischen Immunglobuline eine Inkubation mit 2 µl eines Phycoerythrin-gekoppelten anti-

Maus-IgG-Antikörpers für 20 min im Dunkeln. Die Zellen wurden anschließend erneut

gewaschen und in 400 µl FACS-Waschpuffer resuspendiert. 104 Zellen wurden durch-

flußzytometrisch im FACScalibur der Firma Beckton Dickinson mit einem 488 nm Argonla-

ser analysiert. Die Messung erfolgte nach Herstellerangaben der Firma Beckton Dickinson,

Heidelberg.

FACS-Waschpuffer: 5% FCS in PBS

2.4.12 Reportergen-Assays

Promotoren eines Gens können untersucht werden, indem man sie vor das Gen eines leicht

nachweisbaren Enzyms, z.B die Leuchtkäferluciferase, kloniert. Wird ein solches Konstrukt

in eine eukaryonte Zelle eingebracht, kann die Aktivität dieses Enzyms als ein Maß für die

Menge dieses Enzyms in der Zelle gelten, also als Maß für die Transkriptionsrate seines

Genes. Dies wiederum bedeutet, daß man eine Aussage über die Aktivität des vorgeschalteten

Promotors machen kann. Um die einzelnen Werte einer Versuchsreihe untereinander verglei-

chen zu können, muß man die Transfektionseffizienz kontrollieren. Dies geschieht durch Co-

Transfektion z.B. des β-Galaktosidase-Gens, welches stimulationsunabhängig transkribiert

wird.


2.4.12.1 Luciferase-Assay

Die Luciferase-Assays wurden mit Hilfe des Luciferase Assay System With Reporter Lysis

Buffer-Kits der Firma Promega, USA, durchgeführt. Zunächst wurden die zu untersuchenden

Zellen einen Tag nach der Transfektion über 20 h stimuliert und dann unter Benutzung des

Reporter Lysis Buffer gemäß den Vorschriften des Herstellers geerntet. 20 µl des erhaltenen

Zell-Lysats wurden in einer lichtundurchlässigen 96-iger Multiwellplatte mit 100 µl Assay

Reagent des Kits versetzt und damit die von der Luciferase katalysierte Licht-emittierende

Reaktion gestartet. Die Lumineszenz maß man über 10 sec im Microlumat 96 P der Firma

EG&G Berthold, Bad Wildbad. Außerdem wurde der Proteingehalt der Zell-Lysate nach

Bradford bestimmt (s. 2.4.7).

2.4.12.2 ββββ-Galaktosidase-Assay

Zum Abgleich der Transfektionseffizienz im β-Galaktosidase-Assay wurden 100 µg Protein

mit 500 µl β-Gal-Mix und 100 µl ONPG, ein chromogenes Substrat der β-Galaktosidase, bei

37°C inkubiert. Sobald eine leichte Gelbfärbung der Proben festzustellen war, wurde die Re-

aktion mit 250 µl 1M Na2CO3, pH 8, gestoppt und die dafür benötigte Zeit festgestellt. Dann

maß man die optische Dichte der Proben bei einer Wellenlänge von 420 nm. Die Aktivität des

Enzyms berechnete sich wie folgt:

Aktivität (U/µg) = (OD420 x 6000) / (Inkubationszeit [min] x 100 µg Protein)

β-Gal-Mix: 60 mM Na2HPO4

40 mM NaH2PO4

1 mM KCl1 mM MgCl2

+ 36,8 µl β-Mercapto-Ethanol / 100 ml Lösung

ONPG (1mg/ml in H2O),

2.4.12.3 Auswertung

X = Luciferase-Wert / β-Gal-Aktivität

2,5 Konstruktion der ErG-Mutanten

Hierbei handelt es sich um gp130 -Mutanten, bei denen die extrazelluläre Domäne durch den

extrazellulären Teil des Epo-R ersetzt worden ist. Im gp130-Anteil bieten neueingefügte Re-


striktionsschittstellen die Möglichkeit, jeweils eines oder auch mehrere der sechs vorhandenen

Tyrosine gegen Phenylalanine auszutauschen. Diese Phenylalanine erhält man durch gleich-

zeitige Konstruktion einer 6F-Mutante, bei der neben der Einfügung der neuen Schnittstellen

auch alle Tyrosine in Phenylalanine umgewandelt worden sind. So besitzt man zwei

Konstrukte mit identischen Schnittstellen, bei denen man nun einzelne Fragmente beliebig

austauschen kann.

Die ErG-Konstrukte wurden mit Hilfe der PCR bzw. Fusions-PCR-Technik in mehreren

Schritten hergestellt. Die Mutationen wurden über synthetische sense- und antisense-Primer

eingeführt, die die ausgetauschten Basen enthielten. Über den als Matrize dienenden Vektor

pSVL-EG [28, 36] wurden mit den Primerpaaren P1/P3, P4/P6, P7/P9, P10/P12, P2/P3,

P5/P6, P8/P9, P11/P12 acht Fragmente hergestellt. In einem nächsten Schritt wurden über

eine Fusions-PCR jeweils zwei aufeinanderfolgende Fragmente in äquimolaren Verhältnissen

als Matrize eingesetzt. Als Primer verwandte man die äußeren flankierenden Oligonukleotide

(P1/P6, P2/P6, P7/P12, P8/P12). Schließlich wurde in einer zweite Fusion-PCR-Runde die

gesamte Länge des zu verändernden Teiles ligiert (P1/P12, P2/P12). Diese Fragmente wurden

über die Restriktionsschnittstellen EcoRI und BamHI in den Expressionsvektor pSVL-EG

einkloniert (Abb. 5).

Alle so hergestellten Kostrukte wurden durch Sequenzierungen auf ihre Richtigkeit überprüft

und mit Immunfluoreszenzen und EMSA auf ihre Expression und Funktionalität analysiert.

2.6 Konstruktion der GrG-myc-Mutanten

Für die ErG-X-myc-Konstrukte wurde der Bereich zwischen den Restriktionsschnittstellen

Rsr II und BamHI durch synthetische Oligonukleotide (P19/P20 für die Y-Variante, P21/P22

für die F-Variante) ersetzt, die für das c-myc-Epitop fusioniert an das letzte Tyrosinmotiv

kodieren. Als Linker zwischen Rezeptormutante und c-myc-Epitop dienen zwei Glycine.

Für die Reportergen-Assays wurden diese Konstrukte über den Vektor pBS-SK- in den

Expressionvektor pRC/CMV umkloniert.

Mit Hilfe der Restriktionsstellen EcoRI und BamHI kann man den transmembranen bzw. in-

trazellulären Teil der ErG-X-myc-Konstrukte in den Vektor pSVL human gp130 ∆ EcoRI

[40‘] einklonieren. Man erhält so die native cDNA für gp130 einschließlich der eingefügten

Restriktionsstellen und des c-myc-Epitops.


Abb. 5: PCR-Schema zur Konstruktion der ErG-Mutanten


Beispielhaft für die rG-Mutanten findet sich die Aminosäuresequenz der cDNA des

GrG YYYYYYmyc-Konstruktes im Anhang.

2.7 Konstruktion der SHP2-Mutanten

Die SHP2-Mutanten wurden über SHP2- Green-Fluorescent Protein (gfp) Fusionsproteine

kloniert, die für die hier erwähnten Versuche allerdings nicht benötigt wurden. Ausgangpunkt

für die Herstellung dieser Fusionsgene war eine PCR über den SHP2-Anteil des Vektors

pRK1D mit den Primern S1/S2 mit anschließenden Restriktionsverdau an den neueingefügten

Schnittstellen Nae I (5’- Ende) und EcoRI (3’-Ende). Das gfp-Gen wurde aus dem Vektor

pMBC1-Bgfp mit Hilfe der Schnittstellen Nae I und Not I isoliert. Beide Fragmente wurden

in den mit Hilfe der Enzyme Not I und EcoRI geöffneten Vektor pSBC1 einkloniert (pSBC1

sypigfp). Hierbei handelt es sich um einen bicistronischen Expressionsvektor mit SV40-Pro-

motor [19]. Dank des Einklonierens einer Hind III-Restriktionsstelle in alle GFP-Fusionsgene

konnte man den gfp-Anteil mittels eines Hind III-Verdaus deletieren. Daraus resultierten

SHP2-Protein-Varianten, die zwei zusätzliche Aminosäuren (Lysin und Alanin) am C-termi-

nalen Ende besaßen.

Es handelt sich im einzelnen um folgende Mutanten:

pSBC1 sypi

Mit obiger Versuchbeschreibung erhielt man ein Plasmid, welches die cDNA für die

Spleißvariante der SHP2 beinhaltet. Diese enthält im Gegensatz zu der erstveröffentlichen

Variante vier zusätzliche Aminosäuren an Position aa 408 (ALLQ) [84].

pSBC1 syp

Bei diesem Konstrukt wurde ausgehend vom obigen pSBC1 sypi das vier Aminosäuren lange

Insert entfernt. Damit entspricht es der erstveröffentlichten Variante der SHP2.

Es wurde mit Hilfe der PCR- und PCR-Fusions-Technik in mehreren Schritten hergestellt.

Als Matrize diente wiederum der Vektor pRK1D. Mit den Primerpaaren S17/S1 wurde ein C-

terminales, mit S8/S18 ein N-terminales Fragment hergestellt und in einer erneuten (jetzt

Fusions-) PCR mit den Primern S1/S8 verbunden. Mit Hilfe der Restriktionsstellen Ban II und

Bgl II konnte das PCR-Produkt in den Vektor pSBC1sypigfp einkloniert werden.

Anschließend erfolgte die die Deletion des gfp-Anteils wie oben beschrieben.


pSBC1 sypC459S

Durch einen Aminosäurenaustausch an Position 459, wobei das Cystein in ein Serin

gewechselt wurde, erhält man eine katalytisch inaktive Phosphatase [2].

Zur Herstellung dieser Mutante wurde mit den Primer-Paaren S3/S1 und S8/S4 über den Vek-

tor pRK1D eine PCR-Reaktion durchgeführt und die beiden erhaltenen Fragmente in einer

Fusion-PCR mit den Primern S1/S8 verknüpft. Über die Restriktionsschnittstellen Ban II und

Bgl II wurde das letztere PCR-Produkt in den Vektor pSBC1sypigfp einkloniert und der gfp-

Anteil deletiert.

pSBC1 sypmyc, pSBC1 sypimyc, pSBC1 sypC459Smyc

Bei diesen Konstrukten handelt es sich um SHP2-Varianten, an denen ein c-myc-Epitop

(EQKLISEEDL) fusioniert wurde. Man erhielt sie durch Einfügen eines synthetischen, für das

Epitop kodierenden Oligonukleotids (S20, S21) in die C-terminal gelegene Hind III-

Schnittstelle des Proteins.

Um auch in HepG2 arbeiten zu können, wurden die Konstrukte in Folge in den Vektor

pCBC1 umkloniert. Dieser enthält einen CMV-Promotor, entspricht ansonsten aber dem

pSBC1.

Alle Konstrukte wurden mittels Sequenzierungen auf ihre Richtigkeit überprüft. Die Expres-

sion wurde in Western Blots und Immunfluoreszenz-Analysen überprüft.

Beispielhaft für die hier erwähnten Sequenzen ist die cDNA von sypimyc im Anhang wieder-

gegeben.

Ergebnisse 41

3. Ergebnisse

3.1 Konstruktion und Expression der ErG-Mutanten

Die Signaltransduktion des IL-6 wurde bereits vielfältig untersucht. So ist zum Beispiel be-

schrieben worden, daß IL-6-Zugabe zu einer Tyrosinphosphorylierung des gp130 führt [32].

Es ist jedoch nicht bekannt, welche der vorhandenen sechs Tyrosine phosphoryliert werden

können, bzw. welche bei IL-6-Stimulation tatsächlich phosphoryliert werden. Dies und weite-

re Fragestellungen können mit Hilfe verschiedener Rezeptormutanten untersucht werden, bei

denen nur noch jeweils eines der sechs intrazellulären Tyrosine erhalten ist.

Bei diesen sogenannten ErG-Mutanten handelt es sich um gp130-Chimäre, bei denen die ex-

trazelluläre Domäne des gp130 durch den extrazellulären Teil des Erythropoetin (Epo)-R er-

setzt worden ist. Durch diesen Kunstgriff ist es möglich, in einer Zell-Linie, die endogenes

gp130 besitzt, einen gp130-abhängigen Signalweg nachzuempfinden. Der intrazelluläre und

transmembranäre Teil dieser Chimären beinhaltet die entsprechende cDNA des gp 130. Er ist

so konzipiert, daß die einzelnen Mutanten an den Tyrosinmotiven eine beliebige Kombination

an Y→F-Austauschen besitzen.

Abb. 6: Konstruktion der ErG-MutantenBei den ErG-Mutanten handelt es sich um chimäre Rezeptoren, die extrazellulär die extrazelluläreDomäne des Epo-R besitzen. Der transmembranäre und intrazelluläre Teil sind dem gp130 entnom-men. Mittels PCR-Technik sind auf DNA-Ebene zwischen den einzelnen Tyrosinen neue Erken-nungssequenzen für Restriktionsendonukleasen eingefügt worden. Desweiteren ist eine Mutante ge-neriert worden, in der neben diesen neuen Schnittstellen alle Tyrosine in Phenylalanine umgewan-delt worden sind. So besitzt man nun je sechs Tyrosin- bzw. Phenylalanin-Blöcke, die beliebig aus-getauscht werden können.

42 Ergebnisse

Ausgangsvektor für die Klonierarbeiten war das Konstrukt pSVL EG [28, 36]. Mittels PCR-

bzw. Fusions-PCR-Techniken wurden auf DNA-Ebene zwischen den einzelnen Tyrosinen

über stille Mutationen neue Restriktionsstellen eingefügt. Ebenso wurde eine Mutante kon-

struiert, bei der neben diesen neuen Schnittstellen auch alle Tyrosine in Phenylalanine umge-

wandelt worden waren. So erhielt man zwei Konstrukte mit identischen Schnittstellen, bei

denen nun einzelne Fragmente beliebig austauschbar sind (Abb. 6).

Für die hier vorliegende Arbeit war neben dem ErG YYYYYY-Konstrukt, welches dem in-

trazellulären Wildtyp-gp130 entspricht, vor allem das Konstrukt ErG YFYYYY, bei dem das

zweite Tyrosin, Y759, zu Phenylalanin ausgetauscht worden war (= Y759F), von besonderem

Interesse. Die Expression dieser beiden Konstrukte wurde in Western Blots verifiziert. Dazu

wurden COS7-Zellen transient mit der cDNA der beiden Mutanten transfiziert, nach drei Ta-

gen lysiert und die Zell-Lysate in einem SDS-PA-Gel aufgetrennt. Anschließend wurde mit

einem gegen den intrazellulären Bereich des gp130 gerichteten Antikörper in einem Immuno-

blot detektiert (Abb. 7).

Sowohl die Wildtyp- als auch die Y759F-Mutante ließen sich im Western Blot nachweisen.

Abb. 7: Nachweis der Expression der ErG YYYYYY- und ErG YFYYYY-Rezeptorchimären72 h nach Transfektion von COS7-Zellen mit den Vektoren pSVL-Leervektor (Spur 1), pSVL ErGYYYYYY (Spur 2) und pSVL ErG YFYYYY (Spur 3) wurden die Zellen lysiert. Die Zell-Lysatewurden in einer SDS-PAGE aufgetrennt und im Western Blot analysiert. Die Detektion erfolgtenach Inkubation mit einem polyklonalen Antikörper, der gegen den zytoplasmatischen Teil desgp130 gerichtet ist und einem Peroxidase-gekoppelten Zweitantikörper mit der ECL-Reaktion.

3.2 Die SHP2-Tyrosinphosphorylierung

Nachweis der SHP2-Tyrosinphosphorylierung

Die Tyrosinphosphorylierung der SHP2 nach Aktivierung des gp130 durch IL-6, aber auch

IL-11, wurde bereits in einigen Zell-Linien gezeigt, teilweise jedoch unter Verwendung chi-

Ergebnisse 43

märer Rezeptoren [24, 77]. Im ersten Abschnitt dieser Arbeit wurden die Eigenschaften dieser

Aktivierung in den Zell-Systemen HepG2, COS-7 und Ba/F3 genauer untersucht.

Dazu wurden zuerst COS7-Zellen, eine Affennieren-Zell-Linie, mit IL-6/sIL-6R stimuliert

und nach anti-SHP2-Immunopräzipitation im Phosphotyrosin-Western Blot analysiert. Die

Auftragskontrolle erfolgte ebenfalls im Immunoblot mit dem SHP2-Antikörper. Es wurden

mehrere käuflich erwerbliche Phosphotyrosin-Antikörper ausgetestet. Eine sichtbare Reaktion

gab es jedoch nur mit dem 4G10-anti-Phosphotyrosin-Antikörper (Abb. 8).

Abb. 8: Nachweis der SHP2-Tyrosinphosphorylierung in COS7-ZellenCOS7-Zellen wurden 7 min mit 200 U/ml IL-6 und 1 µg/ml sIL-6R stimuliert. Aus den hergestelltenZell-Lysaten aus stimulierten und nicht stimulierten Zellen wurde das SHP2-Protein mittels einesspezifischen anti-SHP2-Antikörpers präzipitiert. Die Auftrennung der präzipitierten Proteine er-folgte in einer SDS-PAGE, ihre anschließende Detektion nach Transfer auf eine PVDF-Membran ineiner ECL-Reaktion. Als spezifische Antikörper wurden der anti-Phosphotyrosin-Antikörper 4G10(Blot: PY) bzw. ein anti-SHP2-Antikörper (Blot: SHP2) verwendet.

Bei etwa 66-70 kDa war im α-PY-Blot eine deutliche Bande zu sehen. Bei der Gegenfärbung

mit einem SHP2-spezifischen Antikörper erhielt man scharfe Banden, die sich jedoch nur

partiell mit der Phosphotyrosin-Bande überdeckten. Je nach Menge an vorhandenem Protein

bzw. je nach Auftrennlänge und Konzentration des SDS-PA-Geles zeigte sich in der anti-

SHP2-Gegenfärbung eine Doppelbande, wobei sich die obere der beiden Banden als dek-

kungsgleich mit der entsprechenden anti-Phosphotyrosin-Bande herausstellte. Weitere Kon-

trollversuche an Ba/F3-Zellen verdeutlichten dies besser. Ba/F3-Zellen stammen von einer

murinen Prä-B-Zell-Linie ab, die kein endogenes gp130 besitzen. Diese Zellen wurden stabil

mit gp130 transfiziert (vgl. Kap. 3.3).

Diese transfizierten Ba/F3-Zellen und nicht transfizierte Kontroll-Zellen wurden mit IL-6/sIL-

6R stimuliert, mit einem SHP2-Antikörper immunpräzipitiert und schließlich im Phosphoty-

44 Ergebnisse

rosin-Blot analysiert. Die Ansätze wurden teilweise mit der Calf Intestine Phosphatase de-

phosphoryliert. Die Ladungskontrolle erfolgte mit einem anti-SHP2-Antikörper (Abb. 9).

Im α-PY-Blot zeigte sich bei gp130 positiven stimulierten Zellen (Spur 2) im Gegensatz zu

nicht stimulierten Zellen (Spur 1) eine scharfe Bande, die im α-SHP2-Blot als Doppelbande

erscheint. Die Phosphotyrosin-Bande des α-PY-Blots liegt genau auf der Höhe der oberen

Doppelbande im SHP2-Blot.

Daß es sich bei der oberen Doppelbande in Spur 2 tatsächlich um tyrosinphosphorylierte

SHP2 handelt, belegt der Versuch in Spur 3. Hier wurde ein zu Spur 2 identischer Ansatz vor

dem Auftrag auf das Gel mit alkalischer Phosphatase inkubiert. Im Phosphotyrosin-Blot

zeigte sich nur noch eine schwache Rest-Phosphorylierung der SHP2, im SHP2-Blot färbte

sich nur eine, nämlich die untere Bande an.

Verzicht auf SHP2-Antikörper (Spuren 4 und 5) führte erwartungsgemäß auch zu keiner

SHP2-Anfärbung, weder im Phosphotyrosin- noch im SHP2-Blot. Eine signifikante Tyrosin-

phosphorylierung der SHP2 blieb auch bei Stimulation nicht transfizierter Kontroll-Zellen

(Spuren 6 und 7) aus.

Abb. 9: Kontrolle der SHP2-Tyrosinphophorylierung in Ba/F3-ZellenStabil mit gp130 transfizierte Ba/F3-Zellen und nicht transfizierte Kontroll-Zellen (Spuren 6 und 7)wurden mit 200 U/ml IL-6 und 1 µg/ml sIL-6R stimuliert. Die Zellen wurden geerntet, lysiert undmit einem α–SHP2-Ak präzipitiert. Zur Kontrolle der Spezifität dieses Antikörpers wurde zu 2 An-sätzen (Spuren 4 und 5) kein Antikörper hinzugefügt. Ein Ansatz (Spur 3) wurde nach Präzipitation1 h mit alkalischer Phosphatase inkubiert. Es erfolgte die Auftrennung in einer SDS-Polyacrylamid-Gel-Elekrophorese, Transfer auf eine PVDF-Membran und die Detektion mit Hilfe des 4G10- bzw.des anti-SHP2-Antikörpers in einer ECL-Reaktion. CIP = Calf Intestine Phosphatase

Ergebnisse 45

Dosisabhängigkeit der IL-6-induzierten SHP2-Tyrosinphosphorylierung in HepG2-

Zellen

Um eine optimale Stimulationsdosis zu ermitteln, wurden Zellen der humanen Hepatom-Zell-

Linie HepG2 mit rekombinantem IL-6 in steigenden Konzentrationen stimuliert. Das SHP2-

Protein wurde mittels Immunopräzipitation aufgereinigt und im anti-Phosphotyrosin-Western

Blot analysiert (Abb. 10).

Mindestens 100 Einheiten IL-6/ml wurden benötigt, um eine Phosphorylierung der SHP2

sichtbar zu machen. Die maximale SHP2-Phosphorylierung war mit 200 Einheiten IL-6/ml

erreicht. Weitere Dosiserhöhungen führten keiner Steigerung der Antwort.

Abb: 10: Dosisabhängigkeit der SHP2-TyrosinphosphorylierungHepG2-Zellen wurden mit steigenden Konzentrationen IL-6 für 10 min stimuliert. Nach Zell-Ernteund -Lyse erfolgte eine Aufreinigung der SHP2-Proteine in einer SHP2-spezifischen Immunopräzi-pitation. Anschließend wurden die Proteine in einer SDS-PAGE aufgetrennt und in einem WesternBlot mittels des 4G10-Ak auf Tyrosinphosphorylierung untersucht. Die Ladungskontrolle erfolgtemit einem anti-SHP2-Western Blot.

Zeitabhängigkeit der IL-6-induzierten SHP2-Tyrosinphosphorylierung entspricht der-

jenigen des gp130 in HepG2-Zellen

Die Zeitabhängigkeit der SHP2-Tyrosinphosphorylierung wurde ebenfalls in HepG2 unter-

sucht. Die Zellen wurden zu verschiedenen Zeiten nach unterschiedlicher Stimulationsdauer

geerntet (Abb. 11). Nach α-SHP2-Immunopräzipitation zeigte sich im Western Blot eine tran-

siente Tyrosinphosphorylierung der SHP2. Fünf Minuten nach Stimulation war bereits eine

SHP2-Phosphorylierung erkennbar, die nach 40 min nicht mehr nachweisbar war.

In einem Parallelansatz unter gleichen Bedingungen wurde gp130 mit Hilfe eines gegen die

extrazelluläre Domäne dieses Proteins gerichteten Antikörpers präzipitiert und ebenfalls im α-

PY-Blot untersucht (Abb. 12). Die Kinetik der gp130-Phosphorylierung wies große Ähnlich-

46 Ergebnisse

keiten mit derjenigen der SHP2 auf. Analog der Kinetik der SHP2-Phosphorylierung konnte

fünf Minuten nach Stimulation eine transiente gp130-Phosphorylierung nachgewiesen wer-

den, die nach 40 min nicht mehr belegbar war. Um eine eventelle Komplex-Bildung aufzuzei-

gen, wurde mit einem SHP2-Antikörper gegengefärbt. Eine Co-Präzipitation von SHP2 und

gp130 konnte korrespondierend zu der Kinetik der Tyrosinphosphorylierung beider Proteine

nachgewiesen werden.

Abb. 11: Zeitabhängigkeit der SHP2-TyrosinphosphorylierungHepG2-Zellen wurden mit 200 U/ml IL-6 für die angegebenen Zeiten stimuliert. Die Weiterbe-handlung der Zellen erfolgte wie in Abb. 10.

Abb. 12: Zeitabhängigkeit der gp130-TyrosinphosphorylierungHepG2-Zellen wurden mit 200 U/ml IL-6 für die angegebenen Zeiten stimuliert. Anschließend wur-den Zell-Lysate für eine Immunpräzipitation mit einem spezifischen gp130-Antikörper, BT12, her-gestellt. Die gebundenen Proteine wurden in einer Gelelektrophorese aufgetrennt und nach Übertragauf eine PVDF-Membran mit 4G10- (Blot: PY), BP4- gegen gp130 (Blot: gp130) und SHP2-Antikörper (Blot: SHP2) detektiert.

Ergebnisse 47

3.3 Die IL-6-induzierte Tyrosinphosphorylierung der SHP2 benötigt dasY759 in gp130

Um zu zeigen, daß die SHP2-Tyrosinphosphorylierung nach IL-6-Stimulation tatsächlich über

gp130 induziert wird, wurden COS7-Zellen transient mit dem Expressionskonstrukt der Epo-

R/gp130-Chimäre ErG YYYYYY (s. Kap. 3.1) transfiziert. Gleichzeitig wurde in einem Par-

allelansatz das ErG YFYYYY-Konstrukt exprimiert, um die bereits von mehreren Autoren

beschriebene Abhängigkeit der SHP2-Phosphorylierung vom Tyrosin 759 im COS7-System

nachzuvollziehen [26, 78]. Nach Stimulation mit Epo wurde das SHP2-Protein mittels eines

spezifischen Antikörpers immunpräzipitiert, in einem Gel aufgetrennt und auf eine PVDF-

Membran transferiert. In darauf folgenden Phosphotyrosin-Immun-Blots konnte jedoch weder

bei der „Wildtyp“-Mutante YYYYYY noch bei der Y759F-Mutante, YFYYYY, eine SHP2-

Tyrosinphosphorylierung festgestellt werden, obwohl die transiente Expression der Rezep-

tormutanten – wie in Abb. 7 dargestellt – im Western Blot bereits nachgewiesen werden

konnte. Auch besitzen COS7-Zellen wie oben gezeigt (Abb. 8) prinzipiell das Vermögen, auf

Zytokin-Einwirkung mit einer SHP2-Phosphorylierung zu antworten, was die sichtbare Tyro-

sinphosphorylierung der SHP2 nach IL-6-Stimulation des endogenen gp130 belegte.

Ein Grund für das Mißlingen dieses Experimentes könnte in der transienten Transfektion lie-

gen. Ein Nachteil der transienten Transfektion ist häufig eine geringe Transfektionseffizienz.

Immunfluoreszenzen der ErG-Mutanten in COS7-Zellen zeigten, daß nur wenige Zellen die

transfizierten Rezeptoren exprimierten [73]. Wenn jedoch nur eine geringe Menge von Zellen

die Rezeptoren besitzen, kann auch nur dieser Anteil stimuliert werden. Dadurch wird nur ein

Bruchteil der insgesamt vorhandenen SHP2-Menge tyrosinphosphoryliert: zu wenig, als daß

es der anti-Phosphotyrosin-Antikörper 4G10 nachweisen könnte. Um den prozentualen Anteil

der transfizierten Zellen zu erhöhen, wurden stabil gp130 exprimierende Ba/F3-Zellen herge-

stellt. Ba/F3-Zellen, eine murine Prä-B-Zell-Linie, besitzen kein endogenes gp130, was den

Vorteil bietet, sie nicht mit chimären Rezeptoren transfizieren zu müssen, sondern mit nativer

gp130-cDNA transfizieren zu können. Dazu wurde der extrazelluläre Teil der ErG-Mutanten

durch den entsprechenden nativen Teil des gp130 ersetzt. Man erhält so gp130-Mutanten,

GrG, die im intrazellulären Bereich statt der Tyrosine wahlweise Phenylalanine enthalten

können (vgl. Kap. 2.7). GrG YFYYYY ist also analog der Chimäre ErG YFYYYY eine

gp130-Mutante, bei der das Tyrosin 759 zu Phenylalanin ausgetauscht worden ist (= GrG

Y759F). Die „Mutante“ GrG YYYYYY entspricht dem Wildtyp. Die Expression wurde

48 Ergebnisse

durchflußzytometrisch überprüft (Abb. 13). Es zeigte sich eine Verschiebung zu höherer Fluo-

reszenintensität, wenn transfizierte Zellen eingefärbt worden waren.

Abb: 13: Durchflußzytometrischer Nachweis der Expression von GrG YYYYYY und GrG YFYYYY instabil mit gp130 transfizierten Ba/F3-Zellen105 stabil transfizierte Ba/F3-Zellen wurden mit dem gp130-Antikörper BP4 inkubiert. Der Nach-weis gebundener Antikörper erfolgte anschließend durch die Inkubation mit einem R-Phycoerythrin-konjugierten anti-Maus-IgG. Dargestellt sind die (dunklen) Histogramme ungefärbter Zellen, die mitden (hellen) Histogrammen Antikörper-gefärbter Zellen überlagert sind.

Die SHP2-Tyrosinphosphorylierung wurde entsprechend den obigen Versuchen untersucht.

Sowohl Zellen, die den Wildtyp-Rezeptor tragen, als auch diejenigen, die die GrG Y759F-

Mutante exprimieren, wurden nach Stimulation und SHP2-Immunpräzipitation in einem We-

stern Blot bezüglich der Tyrosinphosphorylierung analysiert (Abb. 14). Eine stimulationsab-

hängige SHP2-Phosphorylierung konnte nur bei den Wildtyp-gp130 tragenden Zellen nach-

gewiesen werden. Sowohl die mit der Mutante tranfizierten als auch untransfizierte Kontroll-

Zellen zeigten keine Phosphorylierung der SHP2. Zur Kontrolle wurde die stimulationsab-

hängige Aktivierung des gp130, welche der Tyrosinphosphorylierung dieses Proteins ent-

spricht, ebenfalls nach entsprechender Immunpräzipitation in einem Western Blot überprüft.

Eine IL-6 abhängige Tyrosinphosphorylierung des gp130 zeigte sich sowohl in den Wildtyp-

Rezeptor tragenden Zellen als auch in denen, die die GrG Y759F-Mutante exprimierten

(Abb. 15). Auffällig dabei war jedoch, daß die GrG YFYYYY-Bande im Phosphotyrosin-Blot

sehr schwach ausgeprägt war, obwohl die Gegenfärbung mit einem gp130-Antikörper ein

deutliches Signal trug, was für eine große Menge präzipitierten Rezeptors spricht.

Ergebnisse 49

Abb. 14: Die SHP2-Tyrosinphosphorylierung benötigt das Tyr759 im gp130Stabil mit Wildtyp-gp130, GrG YYYYYY, transfizierte Ba/F3-Zellen (Spuren 1 und 2) bzw. Zellen,die stabil die Y759F-Mutante tragen (GrG YFYYYY, Spuren 3 und 4), sowie nicht transfizierteKontroll-Zellen (Spuren 5 und 6) wurden mit 200 U/ml IL-6 und 1 µg/ml sIL-6R für 15 min stimu-liert. Unstimulierte Zellen dienten als Kontrolle. Die Zellen aller Versuchsansätze wurden geerntetund lysiert. Nach Immunpräzipitation mit einem SHP2 spezifischen Antikörper wurden die gebun-denen Proteine in einer SDS-PAGE aufgetrennt und auf eine PVDF-Membran transferiert. Im an-schließenden Western Blot wurde der Phosphotyrosin-Antikörper 4G10 verwendet (Blot: PY). DieLadungskontrolle erfolgte mit einem SHP2-Antikörper (Blot: SHP2).

Abb. 15: Nachweis der gp130-Tyrosinphosphorylierung in den stabil transfizierten Ba/F3-ZellenUntransfizierte Kontroll-Zellen (Spuren 1 und 2) und stabil mit GrG YYYYYY bzw. GrGYFYYYY transfizierte Ba/F3-Zellen (Spuren 3 und 4, bzw. Spuren 5 und 6) wurden für 15 min mit200 U/ml IL-6 und 1µg/ml sIL-6R stimuliert. Nach Zell-Ernte und -Lyse erfolgte eine Aufreinigungder gp130-Proteine in einer spezifischen Immunopräzipitation mit einem gp130-Antikörper, der ge-gen die extrazelluläre Region dieses Proteins gerichtet ist. Anschließend wurden die Proteine in ei-ner SDS-PAGE aufgetrennt und in einem Western Blot mittels des 4G10-Antikörpers auf Tyrosin-phosphorylierung untersucht. Die Ladungskontrolle erfolgte mit einem gp130-Antikörper ebenfallsin einem Western Blot.

50 Ergebnisse

3.4 Einfluß der SHP2-Phosphorylierung auf die STAT-Aktivierung

Da man durch gp130-Stimulation über die YFYYYY-Mutante selektiv die SHP2-

Phosphorylierung ausschalten kann, eignet sich dieses System zu ersten Untersuchungen der

biologischen Funktion dieser Phosphorylierung. Dazu wurde die Zeitabhängigkeit der

STAT3- bzw. STAT1-Phosphorylierung in den stabil transfizierten Ba/F3-Zellen analysiert

(Abb. 16). Aus Kernextraktion gewonnenes Material wurde in einer SDS-Polyacrylamid-Gel-

Elektrophorese aufgetrennt und sowohl mit einem spezifischen anti-Phospho-STAT3-

Antikörper als auch einem anti-STAT1-Phosphotyrosin-Antikörper im Western Blot unter-

sucht.

vAbb. 16: Einfluß der SHP2-Phosphorylierung auf die STAT-Aktivierung(A) Stabil mit gp130 transfizierte Ba/F3-Zellen (GrG YYYYYY) und mit GrG YFYYYY transfi-zierte sowie untransfizierte Ba/F3-Zellen wurden mit 200 U/ml IL-6 und 1 µg/ml sIL-6R für die an-gegebenen Zeiten stimuliert. 50 µg Gesamtprotein aus anschließend hergestellten Kernextraktenwurden in einer SDS-PAGE aufgetrennt und im Western Blot mittels spezifischer anti-Phospho-STAT3- bzw. anti-Phospho-STAT1-Antikörper untersucht.(B) 5 µg der in (A) vorgestellten Kernextrakte wurden mit einer radioaktiven m67SIE-Sonde inku-biert. Anschließend erfolgte die Analyse der Protein-DNA-Komplexe im EMSA.

Ergebnisse 51

Während nicht transfizierte Kontroll-Zellen und nicht stimulierte Zellen keine STAT3-

Phosphorylierung zeigten, konnte eine transiente STAT3-Phosphorylierung sowohl beim

Wildtyp als auch bei der YFYYYY-Mutante nachgewiesen werden. Interessanterweise führte

die Stimulation der Y759F-Mutante zu einer gesteigerten Antwort. Die Gegenfärbung mit

dem anti-STAT1-Antikörper zeigte dies noch deutlicher. Stimulation der YFYYYY-Mutante

führte zu einer stärkeren und verlängerten STAT1-Phosphorylierung (Abb. 16A).

Diese Beobachtungen konnten sich in anschließenden DNA-Bindungs-Experimenten bestäti-

gen. Kernextrakte aus den Wildtyp bzw. Mutante exprimierenden Ba/F3-Zellen wurden mit

einer STAT1- und STAT3- bindungsspezifischen DNA-Probe vermischt und in einem EMSA

analysiert (Abb. 16B).

In Ba/F3-Zellen, die den Wildtyp gp130-Rezeptor oder die YFYYYY-Mutante exprimierten,

konnte stimulationsabhängig ein DNA/Proteinkomplex aus STAT3-, STAT1-Homodimeren

und STAT1/STAT3-Heterodimeren aufgezeigt werden, nicht transfizierte Kontroll-Zellen

hingegen wiesen dies nicht auf. Die Menge des sichtbaren STAT/DNA-Komplexes war bei

den Zellen, die die Mutante exprimierten, signifikant erhöht und länger nachweisbar.

3.5 Rolle der Janus-Kinasen für die SHP2-Phosphorylierung

Wie oben beschrieben wird die SHP2 in der IL-6-Signaltransduktion tyrosinphosphoryliert.

Auch für die Janus-Kinasen Jak1, Jak2 und Tyk2 wurde eine Tyrosinphosphorylierung und

damit Aktivierung nach IL-6 beschrieben [54, 76]. Im folgenden wurde untersucht, ob und

welche dieser konstitutiv an gp130 assozierten Jaks für die SHP2-Phosphorylierung notwen-

dig sind. Dies wurde mit einer Reihe Jak-defizienter Zell-Linien (vgl. Kap. 2.3.2.1) erarbeitet,

die Abkömmlinge einer humane Fibrosarkom-Zell-Linie sind. Bei diesen ist jeweils eine der

drei Kinasen inaktiviert, bzw. im Anschluß daran retransfiziert worden [16].

Zum Aufbau eines funktionierenden Assays wurde zuerst die parentale Zell-Linie 2fTGH

analysiert. Die Zellen wurden mit IL-6 und sIL-6R stimuliert und anschließend lysiert. Das

SHP2-Protein wurde sodann in einer Immunpräzipitation mit einem SHP2-spezifischen Anti-

körper aufgereinigt und in einem Phosphotyrosin Western Blot analysiert. Als Ladungskon-

trolle diente die Gegenfärbung mit einem SHP2-spezifischen Antikörper (Abb. 17).

Es zeigte sich eine stimulationabhängige SHP2-Phosphorylierung. Interessanterweise war im

Gegensatz zu den anderen untersuchten Zell-Linien bei den Fibrosarkom-Abkömmlingen

zwar ein deutliches, jedoch schwächeres Signal im Western Blot zu verzeichnen.

52 Ergebnisse

Abb. 17: Tyrosinphosphorylierung der SHP2 in 2fTGH-Zellen2fTGH-Zellen wurden mit den angegebenen Mengen IL-6 und 1 µg/ml sIL-6R für 15 min stimuliert.Nach Zell-Ernte und -Lyse wurde mit Hilfe eines spezifischen SHP2-Antikörpers das SHP2-Proteinaus den Zell-Lysaten präzipitiert, und die gebundenen Proteine in einer Gelelektrophorese aufge-trennt. Nach Transfer auf eine PVDF-Membran wurde in einem Western Blot mittels des anti-Phosphotyrosin-Antikörpers 4G10 die SHP2-Tyrosinphosphorylierung analysiert (Blot: PY). DieLadungskontrolle erfolgte mit einem spezifischen SHP2-Antikörper (Blot: SHP2).

Um nun zu erfahren, ob Jak2 eine wesentliche Funktion in der IL-6 induzierten Signaltrans-

duktion spielt, wurden γ2A-Zellen, denen das Jak2-Protein fehlt, stimuliert, mit dem anti-

SHP2-Antikörper immunopäzipitiert und im Western Blot analysiert. Als Kontroll-Zellen

dienten γ2A/Jak2-Transfektanten, die stabil Jak2 exprimieren (Abb. 18A).

In beiden Zell-Linien konnte eine von der IL-6-Stimulation abhängige Tyrosinphosphorylie-

rung der SHP2 beobachtet werden.

Analoge Experimente wurden mit den Zell-Linien U1A bzw. U1A/Tyk2 durchgeführt. U1A-

Zellen sind nicht mehr in der Lage, Tyk2 zu exprimieren, U1A/Tyk2 sind die entsprechenden

mit der Tyk2-cDNA rekonstitutierten Kontroll-Zellen (Abb. 18B).

Wie bei den γ2A bzw. γ2A/Jak2-Zellen zeigte sich eine stimulationsabhängige SHP2-

Tyrosinphosphorylierung sowohl bei den Tyk2-defizienten, als auch bei den retransfizierten

Kontroll-Zellen. Interessanterweise führte eine Überexpression von Jak2 und Tyk2 in den

Kontroll-Zellen nicht zu einer gesteigerten SHP2-Tyrosinphosphorylierung.

Die Funktion der Jak1 wurde in den Zell-Linien U4A und U4A/Jak1 untersucht. Entspre-

chend zu den oben genannten Zell-Linien handelt es sich hierbei um Jak1 defiziente Zellen,

U4A. Zum Vergleich dienten mit Jak1-cDNA stabil retransfizierte Kontroll-Zellen, U4A/Jak1

(Abb. 18C).

Während sich in den U4A-Zellen keine SHP2-Tyrosinphosphorylierung nach IL-6-

Stimulation zeigte, konnte sie in den U4A/Jak1-Transfektanten nachgewiesen werden.

Ergebnisse 53

Abb. 18: Rolle der gp130 assoziierten Janus-Kinasen in der IL-6-abhängigen Tyrosinphosphorylierungder SHP2(A) γ2A-Zellen, denen Jak2 fehlt (Spuren 1 und 2) und γ2A/Jak2-Zellen, die stabil mit der Jak2-cDNA transfiziert worden sind (Spuren 3 und 4), wurden mit 200 U/ml IL-6 und 1 µg/ml sIL-6R für15 min stimuliert. Die Weiterbehandlung der Zellen erfolgte wie in Abb. 17 beschrieben.(B) U1A-Zellen, die nicht mehr in der Lage sind, Tyk2 zu exprimieren (Spuren 1 und 2), bzw. ent-sprechende Zellen mit retransfizierter Tyk2-cDNA (Spuren 3 und 4) wurden ebenfalls mit 200 U/mlIL-6 und 1 µg/ml sIL-6R für 15 min stimuliert. Die Fortführung des Experimentes erfolgte analogder Beschreibung in Abb. 17.(C) U4A-Zellen sind Zellen, denen Jak1 fehlt. Diese Zellen (Spuren 1 und 2) und entsprechende mitJak1-cDNA retransfizierte Kontroll-Zellen (Spuren 3 und 4) wurden ebenfalls mit 200 U/ml IL-6und 1 µg/ml sIL-6R für 15 min stimuliert. Zusätzlich wurde eine weitere Zellinie, U4A-/Jak1K→E,die eine Kinase-inaktive Mutante der Jak1 enthält, untersucht (Spuren 5 und 6). Der Nachweis derSHP2-Phosphorylierung verlief analog der Beschreibung in Abb. 17.

54 Ergebnisse

Dies läßt darauf schließen, daß nur Jak1, nicht aber Jak2 oder Tyk2, essentiell für die SHP2-

Tyrosinphosphorylierung zu sein scheint. Um nun zu überprüfen, ob die Abwesenheit des

Jak1-Proteins an sich oder nur das Fehlen der Kinase-Aktivität dieses Enzyms die defiziente

SHP2-Phosphorylierung bewirkte, wurde die Tyrosinphosphorylierung der SHP2 in U4A-

Zellen untersucht, die stabil mit einer Kinase-inaktiven Jak1-Mutante transfiziert worden wa-

ren (Abb. 18C, Spuren 5 und 6).

Auch die Transfektanten dieser Jak1-Mutante, U4A/Jak1K→E, waren nicht in der Lage, die

SHP2-Phosphorylierung wiederherzustellen, was zeigt, daß nicht nur das Protein Jak1, son-

dern vielmehr seine enzymatische Aktivität für die SHP2-Tyrosinphosphorylierung essentiell

ist.

3.6 Assoziation der SHP2 mit den Janus-Kinasen

Die gesonderte Funktion der Jak1 könnte über eine bevorzugte Komplexbildung der SHP2

mit dieser Kinase erklärt werden. Es wäre möglich, daß SHP2 und Jak1 in vivo eine direkte

Bindung eingehen, wie es für Jak2 bereits in 3T3-L1 Maus-Präadipozyten beschrieben wor-

den ist [24]. Deshalb wurde versucht, eine Co-Immunopräzipitation der einzelnen Kinasen mit

SHP2 nachzuweisen. Dafür wurde die SHP2 nach Stimulation aus den Zellen der verschiede-

nen Fibrosarkom-Zell-Linien mittels eines spezifischen Antikörpers präzipitiert, in einer SDS-

PAGE aufgetrennt und im Western Blot durch Immunoblotting mit den einzelnen Jak-

Antikörpern bezüglich der Co-Präzipitation mit den einzelnen Kinasen untersucht (Abb. 19).

In den U4A-Zellen, die das Jak1-Gen nicht exprimieren, konnte wie erwartet keine Assozia-

tion von SHP2 und Jak1 nachgewiesen werden. Sie dienten lediglich als zusätzliche Kontrolle

für die Spezifität der Jak1-Bande, welche in den U4A/Jak1-Präzipitaten beobachtet wurde. Da

beide Zell-Linien sich nur durch die Existenz dieses einen Proteins unterscheiden, mußte es

sich bei dieser Bande um Jak1 handeln. Interessanterweise zeigte sich die Komplexbildung in

den U4A/Jak1-Zellen sowohl bei stimulierten als auch bei unstimulierten Zellen.

Die Co-Immunopräzipitation zwischen SHP2 und Jak2 bzw. Tyk2 wurde ähnlich getestet. Die

Zell-Linien γ2A und γ2A/Jak2 gaben Aufschluß über die Situation bei Jak2. Genau wie bei

den Jak1-Versuchen zeigte sich bei den Ausgangszellen, γ2A, keine Co-Immunopräzipitation;

bei den γ2A/Jak2-Zellen, die stabil Jak2 exprimieren, konnte eine stimulationsunabhängige

Assoziation von Jak2 und SHP2 nachgewiesen werden. Ähnliches gilt für Tyk2: fehlende

Komplexbildung bei den Tyk-negativen U1A-Zellen, stimulationsunabhängige Co-Immuno-

Ergebnisse 55

Abb. 19: Assoziation der SHP2 mit den gp130 assoziierten Janus-Kinasen(A) U4A-Zellen, die nicht mehr fähig sind, Jak1 zu bilden bzw. U4A/Jak1-Zellen, die stabil mit derJak1-cDNA transfiziert worden sind, wurden mit 200 U/ml IL-6 und 1 µg/ml sIL-6R für 15 min in-kubiert. Die Zellen wurden geerntet, lysiert und mit einem α–SHP2-Ak präzipitiert. Die gebundenenProteine wurden in einer SDS-PAGE aufgetrennt und auf eine PVDF-Membran transferiert. DerNachweis der Co-Präzipitation erfolgte im Western Blot mit einem Jak1 spezifischen Antikörper.Zur Ladungskontrolle wurde mit einem SHP2-Antikörper detektiert.(B) γ2A-Zellen, denen Jak2 fehlt, und die mit der Jak2-cDNA rekonstituierten γ2A/Jak2-Zellenwurden ebenfalls mit 200 U/ml IL-6 und 1 µg7ml sIL-6R für 15 min stimuliert. Die Behandlung derZellen erfolgte wie in (A) beschrieben. Detektiert wurde mit einem Jak2-Antiserum.(C) Ferner wurden Tyk2-defiziente U1A-Zellen bzw. rekonstituierte U1A/Tyk2-Zellen wie unter(A) beschrieben stimuliert und behandelt. Die Detektion im Western Blot erfolgte hier mit einemspezifischen Tyk2-Antikörper.

56 Ergebnisse

präzipitation bei mit dem Tyk2-Gen rekonstituierten Zell-Linie, U1A/Tyk2. Auch hier konnte

der negative Befund bei den Kinase-defizienten Zellen als Beleg der Spezifität der Banden bei

den retransfizierten Zellen herangezogen werden.

Die konstitutive Assoziation wirft die Frage nach der Spezifität der Versuche auf. Um nach-

zuweisen, daß die Kinasen nicht unspezfisch mit der Protein A-Sepharose präzipitieren oder

mit sonstigen Ingredentien interagieren, wurde in einem Kontrollversuch ohne SHP2-

Antikörper „präzipitiert“. Hier ließ sich die Co-Immunopräzipitation nicht nachweisen, was

für die Spezifität der Interaktion spricht (Abb. 20).

Zusammenfassend läßt sich sagen, SHP2 und Jak1, Jak2 und Tyk2 bilden konstitutiv einen

Komplex, obwohl nur Jak1 essentiell für die Tyrosinphosphorylierung der SHP2 nach Stimu-

lation mit IL-6 ist.

Abb. 20: Kontrolle der Assoziation der SHP2 mit den Jak-KinasenAls Kontrolle unspezifischer Bindungen der Jak-Kinasen an Protein A-Sepharose oder anderen In-haltsstoffen des Versuchsansatzes wurden die Co-Immunpräzipitationen in Abwesenheit der SHP2-Antikörper durchgeführt. Zell-Lysate der Zell-Linien U4A/ Jak1, 2A/Jak2 und U1A/Tyk2 wurdenmit oder ohne SHP2-Antikörper inkubiert. Nach Präzipitation mit Protein A-Sepharose wurden diegebundenen Proteine in einer SDS-PAGE aufgetrennt, auf eine PVDF-Membran transferiert und mitJak-spezifischen Antikörpern analysiert. Die Präzipitationskontrolle erfolgte mit einem anti-SHP2-Antikörper. (offene Pfeilspitzen: Jak, schwarze Pfeilspitze: SHP2)

3.7 Rolle der SHP2 in der Akute-Phase-Protein-Gen-Induktion

IL-6 ist der Hauptinduktor der Akute-Phase-Protein-Expression in der Leber. Der Mechanis-

mus, der zur Expression dieser Proteine führt, ist gut untersucht und involviert die Aktivie-

rung des Jak-STAT-Signalweges. Interessant ist es nun zu wissen, welche Funktion die SHP2,

deren Nicht-Phosphorylierung mit einer gesteigerten STAT3-Aktivierung einhergeht, in der

Akute-Phase-Reaktion hat.

Ergebnisse 57

Die Akute-Phase-Protein-Gen-Induktion wurde mit Hilfe von Reporter-Gen-Assays unter-

sucht. Dazu wurde ein an den α2-Makroglobulin-Promotor gekoppeltes Luciferase-Gen in

HepG2-Zellen exprimiert. Bindung aktivierter STAT-Faktoren an diesen Promotor bewirkt

eine Aktivierung der Transkription des Luciferase-Gens, dessen Menge an exprimiertem Pro-

tein über seine Enzymaktivität in einer Chemilumineszenz-Reaktion quantifiziert werden

kann. Die Reporter-Gen-Assays wurden in HepG2-Zellen, einer humanen Leberkrebs-Zell-

Linie, ausgearbeitet, da die Akute-Phase-Protein-Synthese physiologischerweise in der Leber

stattfindet.

Im ersten Versuch wurde der Einfluß der SHP2-Tyrosinphosphorylierung getestet. Hierbei

machte man sich zu nutze, daß die SHP2-Phosphorylierung mit der Y759F-Mutante selektiv

ausschaltet werden kann. Wir entkoppelten sozusagen die STAT- von der SHP2-Aktivierung.

Da HepG2-Zellen endogenes gp130 besitzen, wurde auf Co-Transfektion der Epo-R/gp130-

Chimären (s. Kap. 3.1), ErG YYYYYY und ErG YFYYYY, zurückgegriffen (Abb. 21).

Abb. 21: Einfluß der SHP2-Tyrosinphosphorylierung auf die IL-6-stimulierte Akute-Phase-Protein-Gen-InduktionHepG2-Zellen wurden transfiziert mit 4 µg eines α2-Makroglobulin-Promotor/ Luciferase Reporter-gen-Konstruktes (pGL2α2M-215Luc), 3 µg pCR(TM) 3lacZ (enthält bakterielles β–Galaktosidase-Gen) und 4 µg von entweder Leervektor (Spuren 1+2), pRC/CMV ErG YYYYYY (Spuren 3+4)oder pRC/CMV ErG YFYYYY (Spuren 5+6). Nach Stimulation mit 7 U/ml Epo für 20 h wurdendie Zellen lysiert und die Luciferase-Aktivität bestimmt. Die erhaltenen Werte wurden auf die β–Galaktosidaseaktivität normiert, um die unterschiedlichen Transfektionseffizienzen zu korrigieren.Die rel. Luciferase-Aktivität des ErG YYYYYY-Konstruktes wurde gleich 100 gesetzt. DieExpression der Rezeptor-Konstrukte in den HepG2-Zellen wurde in einem Western Blot kontrolliertund im Insert dargestellt: Spur a: mit Leervektor (pRC/CMV) transfizierte Kontrollzellen; Spur b:Zellen die mit dem Wildtyp-Konstrukt ErG YYYYYY transfiziert wurden; Spur c: mit ErGYFYYYY transfizierte Zellen. Für den Western Blot wurde ein gegen den intrazellulären Bereichdes gp130 gerichteter Antikörper verwendet.

58 Ergebnisse

Es zeigte sich eine deutliche stimulationsabhängige Induzierbarkeit, wenn die Zellen über das

ErG YYYYYY-Konstrukt stimuliert wurden. Diese Induktion wurde noch prägnanter, wenn

die zu untersuchenden Zellen die Y759F-Mutante exprimierten: Sie verdoppelte sich. Nicht

mit dem Rezeptor transfizierte sowie nicht stimulierte Kontroll-Zellen zeigten lediglich eine

Basis-Aktivität. Die Expression der Rezeptor-Konstrukte wurde in einem Western Blot kon-

trolliert (Abb. 21 insert).

Diese Daten sprechen für eine über das Tyrosin 759 vermittelte inhibitorische Aktivität. Da

die SHP2 bei Fehlen dieses Tyrosins nicht phosphoryliert wird, kann vermutet werden, daß

die SHP2 ebenfalls hieran involviert ist. Um eine direkte Beteiligung der SHP2 nachzuwei-

sen, wurde in einem weiteren Experiment der Einfluß einer dominant negativen SHP2, also

eines Phosphatase-inaktiven Proteins, auf die Akute-Phase Gen-Induktion untersucht. Die

Phosphatase-Aktivität wurde durch Mutation des Cysteins 459 im katalytischen Zentrum zu

einem Serin unterbunden (SHP2 C459S) [59].

Abb. 22: Einfluß der SHP2-Phosphatase-Aktivität auf die IL-6-stimulierte Akute-Phase-Protein-Gen-InduktionHepG2-Zellen wurden transfiziert mit 4 µg eines α2-Makroglobulin-Promotor/ Luciferase Reporter-gen-Konstruktes, 3 µg pCR(TM) 3lacZ, 3 µg pRC/CMV ErG YYYYYY und 8 µg von entwederLeervektor, pCBC1, (Spur 1), pCBC1 syp (Spur 2) oder pCBC1sypC459S (Spur 3). Die Weiter-behandlung der Zellen erfolgte wie in Abb. 21 beschrieben. Die rel. Luciferase-Aktivität des Leer-vektor-Konstruktes wurde gleich 100 gesetzt. Im Insert ist die Expression der SHP2-Mutanten dar-gestellt. Dazu wurden pCBC1 (Spur a), pCBC1 syp (Spur b) und pCBC1 sypC459S (Spur c) in denHepG2-Zellen transfiziert und in einem Western Blot mit einem anti-SHP2-Antikörper detektiert.

Ergebnisse 59

Dazu wurde in HepG2, die mit dem Epo-R/gp130-Konstrukt ErG YYYYYY und zusätzlich

entweder mit der Wildtyp-SHP2- oder der SHP2 C459S-cDNA transfiziert wurden, die Akti-

vierung der Transkription des ebenfalls transfizierten Reportergens gemessen (Abb. 22). Die

Expression der SHP2-Varianten wurde in einem Western Blot kontrolliert (Abb. 22 insert).

Kontroll-Zellen, die nur mit den ErG YYYYYY-Konstrukten transfiziert wurden, zeigten die

bereits oben gezeigte Induktion nach Epo-Stimulation. Eine zusätzliche SHP2-Transfektion

erhöhte die Induktion nicht wesentlich, obwohl in einem Kontroll-Western Blot eine größere

Menge an SHP2-Protein nachweisbar war. Wenn jedoch SHP2 C459S- cDNA co-tranfiziert

wurde konnte eine geringe, jedoch signifikant gesteigerte Geninduktion beobachtet werden.

Diese Ergebnisse legen nahe, daß die enzymatische Aktivität der SHP2 und nicht nur das

Protein an sich als Adapter für die Funktion dieses Enzyms in der Akute-Phase Gen-Induktion

wichtig ist.

Diskussion 61

4. Diskussion

Über Struktur und Funktion der SHP2 wurde in den letzten Jahren viel diskutiert. Im Gegen-

satz zur hämatopoetischen Variante SHP1, für die sich relativ schnell eine negative regulatori-

sche Funktion herausstellte [21], ist die Rolle der SHP2 in der Signaltransduktion noch

weiterhin umstritten. Die hier vorliegenden Ergebnisse deuten eher auf eine ebenfalls negative

regulatorische Funktion der SHP2 hin. Diese Erkenntnisse und weitere Hypothesen und Ge-

dankenansätze zur Rolle der SHP2 in der IL-6-abhängigen Signaltransduktion sollen im Fol-

genden vorgestellt und erarbeitet werden.

Die IL-6-abhängige SHP2-Tyrosinphosphorylierung

Die Tyrosinphosphorylierung der SHP2 ist nach Stimulation der verschiedensten Zytokin-

Rezeptoren beobachtet worden. Zuerst beschrieben als stimulationsabhängiger Interaktions-

partner der Rezeptor-Tyrosin-Kinasen wie EGF-R, PDGF-R oder Insulin-R [47, 84] stellte

sich schnell heraus, daß die SHP2 auch im Kontext anderer Rezeptor-Aktivierungen phospho-

ryliert werden kann, so z.B. nach Stimulation mit Epo oder zahlreichen Interleukinen

[12, 64, 82]. Aber auch die Aktivierung von 7TM-Rezeptoren wie der Angiotensin-R führen

zu einer Tyrosinphosphorylierung der SHP2 [4]. Interessanterweise wurde eine SHP2-

Phosphorylierung auch in Zellen beobachtet, die veränderten physikalischen Bedingungen

wie Hyperosmolarität des Mediums ausgesetzt waren [56]. Die SHP2 scheint somit ein fast

„universell“ eingesetztes Werkzeug in der Signaltransduktion zu sein. Dies ist vielleicht der

Grund, weshalb dieses Protein in so einer Vielfalt von Zellen in großer Menge exprimiert

wird.

In der vorliegenden Arbeit erfolgte nun die Untersuchung der SHP2-Tyrosinphosphorylierung

in der IL-6-abhängigen Signaltransduktion im Western Blot. Bei genauer Betrachtung eines

anti-Phosphotyrosin Blots und der entsprechenden anti-SHP2-Gegenfärbung wird deutlich,

daß die jeweiligen Banden nicht absolut deckungsgleich übereinander liegen. Durch „un“-

geschickte Wahl der Auftragsmenge oder SDS-PA-Gelkonzentration bzw. -lauflänge lassen

sich im α–SHP2 Blot sogar Doppelbanden sichtbar machen, von denen die obere kongruent

mit der entsprechenden Bande im anti-Phosphotyrosin Blot ist. Dies spricht dafür, daß die

tyrosinphosphorylierte SHP2 in der Elektrophorese langsamer läuft. Ein Grund hierfür könnte

62 Diskussion

in der Ladungsverschiebung der aktivierten SHP2 liegen, da sie dann vermehrt negative La-

dungen besitzt. Ob eine so deutliche Aufwärtsverschiebung der SHP2 bedeutet, daß sie in der

IL-6-abhängigen Signaltransduktion an mutiplen Tyrosinen phosphoryliert wird bzw. an wel-

chen Tyrosinen sie tatsächlich phosphoryliert wird, bleibt weiter zu untersuchen.

Auch die Zeitabhängigkeit der SHP2-Tyrosinphosphorylierung ist untersucht worden. Fünf

Minuten nach Stimulation ist eine deutliche Phosphorylierung im anti-Phosphotyrosin We-

stern Blot nachweisbar. Nach Stimulation über den PDGF-R soll eine entsprechende Reaktion

sogar schon 1 Minute post stimulationem nachweisbar sein [20]. Wenn auch die Funktion der

SHP2 noch nicht geklärt sein mag, die rasche Phosphorylierung dieser Phosphatase spricht für

eine schnelle Aktivierung und damit für ein unverzügliches Eingreifen in die Signaltransduk-

tion.

Die Dauer der SHP2-Tyrosinphosphorylierung scheint ebenfalls gut reguliert zu sein. Bereits

40 min nach Stimulation ist keine Tyrosinphosphorylierung mehr nachweisbar. Interessanter-

weise stimmen diese Zeiten genau mit der Kinetik der Phosphorylierung des gp130 überein,

was für eine gemeinsame Regulation beider Proteine sprechen könnte.

Abhängigkeit der IL-6-induzierten SHP2-Tyrosinphosphorylierung vomTyrosin 759 des gp130

Bindungsstudien mit synthetisch hergestellten Phosphotyrosin-Peptiden ergaben für die N-

terminale SH2-Domäne der SHP2 ein spezifisches Bindungsmotiv, pY-X-X-V [14]. Auch

gp130 besitzt an Position 759-762 mit der Aminosäuresequenz YSTV ein solches Motiv. Dies

legt die Vermutung nahe, daß auch gp130 in der Lage ist, SHP2 zu rekrutieren und zu aktivie-

ren. Mehreren Autoren ist es bereits gelungen, die Abhängigkeit der SHP2-Phosphorylierung

vom Tyrosin 759 des gp130 nachzuweisen. Hierfür wurden jedoch stets verkürzte oder chimä-

re Rezeptoren benutzt [26, 77]. Dank der stabil gp130 exprimierenden Ba/F3-Mutanten

konnte nun erstmals die Abhängigkeit der SHP2-Tyrosinphosphorylierung von Y759 des

gp130 an einem kompletten, nativen gp130-Molekül gezeigt werden. Die vorbeschriebenen

Ergebnisse bestätigten sich. Obwohl Wildtyp-Rezeptoren und Y759F-Mutanten tragende

Zellen etwa die gleiche Anzahl an Rezeptoren exprimierten, konnte nur beim Wild-Typ eine

stimulationsabhängige SHP2-Tyrosinphosphorylierung nachgewiesen werden. Mutation des

Tyrosins 759 zu Phenylalanin führt zu einer kompletten Auslöschung der Phosphorylierung.

Als Kontrolle dieses Experimentes ist es wichtig, neben dem Nachweis einer äquivalenten

Diskussion 63

Expression der Mutanten auch deren erhaltene Reaktionsfähigkeit zu überprüfen, besonders

bei der in ihrer Aminosäuresequenz veränderten GrG YFYYYY-Mutante. Trotz des fehlenden

Tyrosins an Position 759 in der Mutante werden beide Konstrukte weiterhin stimulationsab-

hängig phosphoryliert und scheinen damit prinzipiell fähig zu sein, ihre Funktion in der Si-

gnaltransduktion wahrnehmen zu können.

Interessanterweise ließ sich die SHP2-Tyrosinphosphorylierung nicht in Zellen nachweisen,

die nur transient mit den Epo-R/gp130-Mutanten transfiziert worden sind, obwohl deren Ex-

pression sowohl in Western Blots, in Immunfluoreszenzen [73] als auch nach Abschluß dieser

Arbeit in FACS-Analysen gezeigt werden konnte. Gleichermaßen zeigen EMSA-Studien mit

transient transfizierten gp130-Mutanten in COS7-Zellen die biologische Funktionalität der

Rezeptoren [73]. Das Problem des Nachweises der SHP2-Tyrosinphosphorylierung bei Sti-

mulation über die transient transfizierten Rezeptoren scheint ein ungünstiges Mengenverhält-

nis zwischen phosphorylierter bzw. nicht phosphorylierter SHP2 zu sein. Auf der einen Seite

existiert eine große Menge an SHP2 in den Zellen, auf der anderen wird bei Stimulation über

die heterolog exprimierten Rezeptoren nur eine geringe Menge dieser SHP2 tyrosinphospho-

ryliert, nämlich der Anteil, der aus den Zellen stammt, die die Rezeptoren tragen. Der pro-

zentuale Anteil phosphorylierter SHP2 in einem Zell-Lysat ist also gering. Bei der

nachfolgenden Immunpräzipitation gewinnt man entsprechend zu wenig phosphoryliertes

Protein, als daß man es nachweisen könnte. Bei den stabilen gp130 exprimierenden Ba/F3-

Zellen hingegen sollte jede Zelle die Rezeptoren tragen. Es wird entsprechend ein größerer

Anteil der SHP2 phosphoryliert, der dann nachweisbar ist. Ein weiterer Lösungsansatz dieses

Problems war die zusätzliche transiente Expression einer mit dem c-myc-Epitop markierten

SHP2. In der Annahme, daß jede Zelle, die die cDNA für die Rezeptor-Mutanten erhalten

habe, auch das SHP2-myc-Konstrukt trage, ließe sich mit einer Präzipitation über das c-myc-

Epitop gezielt der Anteil der SHP2 präzipitieren, der aus transfizierten Zellen stammt. Da-

durch würde man den Hintergrund, also SHP2-Moleküle aus nicht transfizierten Zellen, redu-

zieren. Leider war auch hier die Transfektionseffizienz gering und die Präzipitationsfähigkeit

des myc-Antikörpers so schwach, daß zu wenig SHP2-myc präzipitiert wurde, um eine Tyro-

sinphosphorylierung der SHP2 nachzuweisen.

64 Diskussion

Funktion der SHP2-Tyrosinphosphorylierung

Bis jetzt wurden die Eigenschaften und Rahmenbedingungen der SHP2-Tyrosinphosphory-

lierung genauer betrachtet. Wichtiger und interessanter ist jedoch die Funktion der SHP2 in

der IL-6-abhängigen Signaltransduktion.

Bisherige Veröffentlichungen zu diesem Thema sind widersprüchlich. Häufig wurde die

SHP2 nur als Adapterprotein beschrieben, das in der Lage ist, das ankommende Signal auf

mehreren Signalwegen weiterzuleiten. Mit ihren SH2-Domänen interagiert sie mit dem je-

weiligen aktivierenden Rezeptor und leitet über Bindung an Grb2 die Signalkette weiter zur

Ras/Raf/MAPK-Kaskade. Die Enzymaktivität der Phosphatase scheint für diese Funktion der

SHP2 nur von untergeordneter Rolle zu sein. Pazdrak et al. [64] fanden, daß die SHP2 an der

gemeinsamen IL-5-β-Kette aktiviert wird, und daß diese Aktivierung zu einem verlängertem

Überleben von eosinophilen Granulozyten führt. Dies entspricht einer positiven Regulations-

funktion der SHP2. Fukada et al. [26] konnten belegen, daß die stabile Expression von gp130

in Ba/F3-Zellen zu einem IL-6- abhängigen Wachstum dieser Zellen führt. Auch konnten sie

in weiterführenden Untersuchungen an diesem System zeigen, daß SHP2 bzw. ihre Rekrutie-

rung an den Rezeptor entscheidend an der Auslösung des mitogenen Signals in diesen Zellen

beteiligt ist, während die STAT3-Aktivierung das anti-apoptotische Signal auslöst. Auch dies

entspricht einer positiven Regulationsfunktion durch die SHP2.

Die hier vorliegenden Ergebnisse legen eine eher negative Regulation der IL-6-

Signaltransduktion durch die SHP2 nahe. Mutation des Tyrosins 759 zu Phenylalanin führt

zu einer verstärkten und verlängerten STAT-Phosphorylierung bzw. -Aktivierung, die sowohl

in Western Blots als auch in EMSA-Experimenten nachweisbar ist. Da der Austausch des

Tyrosins 759 zu Phenylalanin zudem die Nicht-Phosphorylierung der SHP2 zur Folge hat,

liegt der Schluß nahe, die SHP2 selbst bzw. ihre Tyrosinphosphorylierung beeinflusse die

STAT-Aktivierung, und zwar in einer negativ regulierenden, beschränkenden Weise. Wie

STAT-Faktoren und SHP2 miteinander interagieren können, und ob es vielleicht sogar eine

Enzym-Substrat-Beziehung zwischen SHP2 und STAT-Faktoren gibt, ist bisher noch nicht

erfolgreich untersucht worden. Termination der STAT-Phosphorylierung durch die SHP2-

Phosphatase wäre die schnellste und eine durchaus attraktive Deutung dieser Ergebnisse. Sie

ist jedoch nicht notwendigerweise impliziert. Es wäre ebenfalls denkbar, daß die SHP2 als

Adapterprotein weitere Phosphatasen an den Rezeptorkomplex rekrutieren könnte, oder daß

Diskussion 65

sie durch Dephosphorylierung anderer Signaltransduktionsteilnehmer eine verlängerte STAT-

Aktivierung verhindert. Aber auch andere – noch unbekannte – Y759-abhängige Reaktionen,

die zu einer Verkürzung der STAT-Phosphorylierung führen, sind vorstellbar.

Aussagen über die SHP2-Enzymaktivität und deren Funktion in der Signaltransduktion ge-

stalten sich bisher noch schwierig. Es gibt zu diesem Thema schon etliche Veröffentlichun-

gen, die jedoch noch kein schlüssiges Bild liefern und sich zum Teil widersprechen. Dies liegt

mit Sicherheit auch an der Tatsache, daß bisher noch keine Einigkeit über potentielle Sub-

strate der SHP2 herrscht. Ein Beispiel dafür ist der PDGF-Rezeptor. Vogel et al. [84] meinen

nachweisen zu können, daß die SHP2 zwar durch diesen Rezeptor aktiviert wird, jedoch kei-

nen Einfluß auf seinen Phosphorylierungszustand habe. Dechert et al. [18] schildern hingegen

eben diese Dephosphorylierung des Rezeptors durch die SHP2. Wenn die SHP2 nun wirklich

in der Lage ist, den sie aktivierenden PDGF-R zu dephosphorylieren, käme dies einer negati-

ven regulatorischen Funktion der SHP2 gleich. Die SHP2 würde das Signal terminieren. Eine

weitere Möglichkeit der SHP2, regulierend in die Signaltransduktion einzugreifen, zeigen

Stein-Gerlach et al. [78]. Diese Autoren weisen nach, daß die SHP2 imstande ist, ihren eige-

nen C-Terminus zu dephosphorylieren. Dies bedeutet, daß die SHP2 ihren eigenen Phospho-

rylierungsstatus beeinflußt und so an der Regulation des Signals mitwirkt.

In der hier vorliegenden Arbeit konnte nachgewiesen werden, daß Nicht-Phosphorylierung

der SHP2 mit einer gesteigerten und verlängerten STAT-Aktivierung einhergeht. Im folgen-

den wurde untersucht, ob und welchen Einfluß diese Nicht-Phosphorylierung der SHP2

auf STAT-abhängige Funktionen wie die Akute-Phase-Protein-Gen-Induktion hat.

Es konnte gezeigt werden, daß Stimulation über die Y759F-Mutante und damit die Aus-

schaltung der SHP2-Tyrosinphosphorylierung mit einer erhöhten Aktivierung eines Reporter-

genes einhergeht, welches den STAT1- bzw. STAT3-responsiven α2-Makroglobulin-Pro-

motor besitzt. Dies bedeutet, daß die SHP2 negativ regulierend in die IL-6-abhängige Signal-

transduktion eingreift. Inwiefern an diesem Ergebnis das Protein SHP2 an sich oder seine

Enzymaktivität wichtig sind (und nicht vielleicht eine andere Tyrosin 759-abhängige Reakti-

on), kann durch diesen Versuch noch nicht eindeutig geklärt werden. Um dies zu ergründen,

wurde eine Phosphatase-inaktive, dominant negativ wirkende SHP2-Mutante, SHP2 C459S,

in den Versuchszellen überexprimiert. In den folgenden Reportergen-Assays zeigte sich so-

dann eine gesteigerte Geninduktion. Es liegt also nahe, den beobachteten inhibitorischen Ef-

66 Diskussion

fekt der SHP2-Phosphatase-Aktivität zuzuschreiben und nicht dem einfachen Vorhandensein

eines phosphorylierten Proteins, welches als Adapterprotein bzw. als Andockstelle für weitere

Komponenten der Signaltransduktion dient. Diese Versuche schließen allerdings keineswegs

aus, daß die SHP2 nicht auch als Adapterprotein fungieren kann. Es wird lediglich bewiesen,

daß die Enzymaktivität an der Funktion der SHP2 in der IL-6- abhängigen Signaltransduktion

beteiligt ist.

Diese Ergebnisse decken sich mit denen, die Symes et al. [79] in ähnlichen Versuchen erhal-

ten haben. Diese Autoren finden eine gesteigerte Geninduktion bei Überexpression der SHP2-

SH2-Domänen, welche sie als dominant negativ beschreiben. Diese Bruchstücke, bei denen

fast zwei Drittel des Proteins – inklusive der Phosphatase-Domäne – fehlen, als dominant

negativ, also als nur seiner Enzymaktivität beraubt, zu bezeichnen, ist jedoch sehr gewagt.

Hier ist nicht eindeutig, ob die Gen-Induktion aufgrund fehlender Andockstellen für Adapter-

proteine, die sich ebenfalls in der Phosphatase-Domäne befinden, gesteigert ist oder durch die

fehlende Phosphatase-Aktivität. In den hier vorliegenden Versuchen konzentrierte man sich

vollkommen auf die Enzymaktivität der SHP2. Das Protein wurde in nur einer Aminosäure

verändert. Damit sind alle Bindungsstellen für andockende Proteine erhalten geblieben und

nur die fehlende Phosphatase-Aktivität kann für die Induktion verantwortlich sein.

Zusammenfassend bedeutet dies also, daß die Enzym-Aktivität der SHP2 – im Gegensatz zu

der weitläufigen Meinung, die SHP2 wäre nur eine Adapterprotein – für die IL-6-abhängige

Signaltransduktion durchaus eine wichtige Rolle spielt. Sie wirkt hemmend auf die Akute-

Phase-Protein-Gen-Induktion.

Notwendigkeit der Janus-Kinasen für die SHP2-Tyrosinphosphorylierung

Sowohl IL-6 als auch die anderen IL-6-Typ-Zytokine führen zu einer Aktivierung der Janus-

Kinasen Jak1, Jak2 und Tyk2. Eine besondere Rolle in der IL-6-abhängigen Signaltransduk-

tion kommt dabei Jak1 zu, da die Eliminierung der Jak1-Expression zu einer Ausschaltung

der stimulationsabhängigen Tyrosinphosphorylierung von gp130 und den STAT-Faktoren

führt [30]. Die hier vorliegenden Ergebnisse zur Rolle der Janus-Kinasen in der SHP2-

Phosphorylierung sprechen ebenfalls Jak1 eine entscheidene Rolle zu. In U4A-Zellen, denen

Jak1 fehlt, findet man eine nur noch residuale Tyrosinphosphorylierung der SHP2. Stabile Re-

Transfektion einer Jak1-cDNA in diese Zellen stellt die vollständige Reaktionsfähigkeit der

SHP2 auf IL-6-Stimulation wieder her. Bei Jak2- bzw. Tyk2-defizienten Zellen und den Ki-

Diskussion 67

nase-retransfizierten Kontroll-Zellen ist die stimulationsabhängige SHP2-Tyrosinphospho-

rylierung jedoch nachweisbar.

Die hervorgehobene Rolle der Jak1 muß nicht bedeuten, daß diese Kinase die SHP2 direkt

phosphoryliert, welches die einfachste Erklärung für diese Resultate darstellen würde. Jak1

könnte durch Phosphorylierung von gp130, insbesondere des Tyrosins 759, einfach nur die

Voraussetzungen schaffen, daß die SHP2 stimulationsabhängig an den Rezeptor rekrutiert

werden kann. Eine weitere – noch nicht näher identifizierte – Kinase könnte so die SHP2

phosphorylieren.

Eine andere mögliche Erklärung wäre die direkte Aktivierung einer zweiten Kinase durch

Jak1. Für die Rolle dieser zweiten Kinase kommen verschiedene Kandidaten in Frage. So ist

z.B. nach gp130-Stimulierung in einigen Zell-Linien die Aktivierung der Tyrosinkinasen Hck,

Fes, Btk und Tec beschrieben worden [57]. Aber auch Jak2 bzw. Tyk2 sind in Erwägung zu

ziehen. Die Tatsache, daß weder die Auschaltung der Jak2- noch der Tyk2-Expression die

SHP2-Tyrosinphosphorylierung antastet, muß nicht als Widerspruch zu dieser Interpretation

gelten. Die mangelnde Beeinflußbarkeit der SHP2-Phosphorylierung durch diese Kinasen

könnte mit der Annahme erklärt werden, daß beide Kinasen sich in ihrer Funktion gegenseitig

ersetzen können. Wer die SHP2 letzten Endes phosphoryliert, ist also noch nicht geklärt.

Die Expression einer Kinase-inaktiven Mutante, Jak1K→E, in die Jak1 defizienten U4A-

Zellen ist nicht in der Lage, die insuffiziente SHP2-Tyrosinphosphorylierung in den U4A-

Zellen wiederherzustellen. Dies verdeutlicht, daß nicht das Jak1-Protein an sich, sondern sei-

ne Enzymaktivität für die Signalweiterleitung wichtig ist. Die oben gestellte Frage nach einer

weiteren Kinase bleibt davon jedoch unbeantwortet.

Assoziation der SHP2 mit den Janus-Kinasen

Über die Assoziation von SHP2 mit Kinasen der Jak-Familie ist schon einiges berichtet wor-

den. Fuhrer et al. [24] konnten eine konstitutive Verbindung zwischen SHP2 und Jak2 in

3T3-L1 Maus-Präadipozyten nachweisen, die sich nach IL-11-Stimulation weiter induzieren

läßt. In einer nachfolgenden Veröffentlichung [93] zeigten SHP2/ Jak-Co-Transfektions-

experimente in COS1-Zellen, daß SHP2 mit Jak1 und Jak2, nicht aber mit Jak3 assoziiert.

Nachteil bei diesen Experimenten war allerdings, daß die Überexpression der Janus-Kinasen

dazu führte, daß diese konstitutiv zahlreiche Proteine inklusive sich selbst phosphorylierten.

68 Diskussion

Eine Aussage über die Stimulationsabhängigkeit bzw. den notwendigen Phosphorylierungs-

status der Proteine für diese Assoziation ist somit nicht möglich. Ziel sollte es also sein, in

stimulationsfähigen Zellsystemen zu arbeiten.

Die hier vorgestellten Versuche wurden in den bereits mehrfach erwähnten Fibrosarkom-Zell-

Linien durchgeführt, deren IL-6-abhängige Reaktionsfähigkeit bereits an anderer Stelle nach-

gewiesen wurde [32]. Zudem bieten diese Zellen den Vorteil, mit endogener SHP2 arbeiten zu

können. Es konnte gezeigt werden, daß SHP2 konstitutiv mit Jak1, Jak2 und Tyk2 interagiert.

Stimulation mit IL-6/sIL-6R beeinflusste die Protein-Protein-Interaktion nicht.

Diese Assoziation wird um so vielschichtiger, wenn man berücksichtigt, daß gp130 ebenfalls

als Interaktionspartner von SHP2 und den Janus-Kinasen wirkt. Es stellt sich die Frage, wie,

wann und wo in der Zelle diese drei Faktoren miteinander in Verbindung stehen.

Es ist gezeigt worden, daß gp130 konstitutiv mit den Janus-Kinasen assoziiert ist [53, 76].

Gleichzeitig konnte nachgewiesen werden, daß gp130 und SHP2 ebenfalls in Verbindung

stehen. Diese Assoziation ist jedoch stimulationsabhängig. Kombiniert man diese beiden Be-

funde, kommt man zu dem Schluß, daß SHP2 und die Janus-Kinasen nur im Falle einer Sti-

mulation mit IL-6 im IL-6-Rezeptor-Komplex miteinander interagieren dürften. Als

Verbindungsstück fungiert dann das gp130-Molekül. Dies steht jedoch im Widerspruch zu

den hier vorgestellten Ergebnissen. Hier wurde gezeigt, daß SHP2 und Janus-Kinasen stimu-

lationsunabhängig assoziieren. Beide Daten können nur so in Einklang gebracht werden,

wenn man einen zweiten, nicht an gp130 assoziierten Pool an Janus-Kinasen definiert. Dieser

vermutlich im Cytosol liegende Teil ist in der Lage, die SHP2 direkt, also gp130-unabhängig

zu binden. Gestützt wird diese Interpretation durch die Versuche von Fuhrer et al. [24]. Diese

Autoren zeigten, daß phosphorylierte YSTV-Peptide in der Lage sind, die SHP2-gp130-

Assoziation zu kompetitieren. Die Interaktion von Jak2 und SHP2 blieb davon unbeeinflußt.

Dort sind durch Versuche mit Deletionsmutanten auch mögliche Interaktionsstellen in den

verschiedene Molekülen eingegrenzt worden. In der SHP2 konnte der Bereich zwischen den

Aminosäuren 232-272, der vor der Phosphatase-Domäne liegt, als für die Assoziation mit

Jak2 essentiell herausgestellt werden. Die entsprechende Bindungsstelle im Jak-Molekül liegt

im N-terminalen Bereich. Zusammenfassend bedeutet dies, daß die Janus-Kinasen entweder

mit gp130 an der Zellmembran oder mit der SHP2 im Cytosol assoziiert sind (Abb. 23).

Die Frage nach dem Sinn dieser Komplexbildung, welche eine Assoziation zweier gegensätz-

lich wirkender Enzyme, Kinase ↔ Phosphatase, darstellt, kann nicht befriedigend beantwortet

werden: Mögliche regulatorische Funktion? Rekrutierung der SHP2 an gp130 durch die Ja-

Diskussion 69

nus-Kinasen? Auch eine eventuell bestehende Substrat-Enzym-Beziehung zwischen den Part-

nern ist zur Zeit noch unklar, ebenso wie eine Verbindung beider Proteine im IL-6-Rezeptor-

Komplex. In dieser Arbeit wurde nachgewiesen, daß weder Jak2 noch Tyk2 in der Lage sind,

eine durch Fehlen von Jak1 entstandene mangelhafte SHP2-Phosphorylierung zu rekonstituie-

ren. Auf der anderen Seite sind aber alle drei Kinasen in der Lage, die SHP2 konstitutiv zu

binden, jedoch ohne Auswirkung auf den Phosphorylierungsstatus der SHP2.

Abb. 23: Komplexbildung von gp130, Janus-Kinasen und SHP2 und deren mögliche Lokalisation in derZelleDie Janus-Kinasen sind konstitutiv mit gp130 assoziiert. Ebenso binden sie stimulationsunabhängigan die SHP2. Diese Bindung ist gp130-unabhängig. Im IL-6-Rezeptor-Komplex interagieren alledrei Partner miteinander. Verbindungsglied zwischen SHP2 und Janus-Kinasen ist gp130.

4.1 Ausblick:

Der Rezeptor-Tyrosinmotiv-Baukasten

Durch Einfügen neuer Restriktionsschnittstellen als stille Mutationen in den zytoplasmati-

schen Teil des gp130 bzw. durch gleichzeitigen Austausch aller Tyrosine gegen Phenylalani-

ne bei einer der Mutanten wurde eine Art Baukasten geschaffen. Mit Hilfe dieses Baukastens

ist es relativ leicht möglich, beliebige Kombinationen von Y→F-Mutanten herzustellen und in

weiterführenden Experimenten zu untersuchen. Zum Beispiel ließe sich durch jeweiliges Re-

70 Diskussion

vertieren eines einzelnen Tyrosins in der Phenylalanin-Mutante ermitteln, welche der sechs

Tyrosinmotive bei der Aktivierung des gp130 tatsächlich phosphoryliert werden. Dazu müß-

ten die Rezeptor-Mutanten stabil in Ba/F3-Zellen exprimiert werden und könnten anschlie-

ßend in Phosphotyrosin Blots analysiert werden. Man könnte auch mit Hilfe dieser Mutanten

untersuchen, ob diejenigen Tyrosinmotive im gp130, die teilweise das Potential haben,

STAT-Faktoren zu aktivieren, sich synergistisch auf die STAT-Aktivierung auswirken. Dies

wäre leicht in Reporter-Gen-Assays und EMSAs zu prüfen. Auch der extrazelluläre Teil der

Mutanten ist durch gleiche Restriktionsschnittstellen einfach austauschbar. Es stehen mehrere

extrazelluläre Domänen zur Verfügung: Die des Epo-R, IL-5-R und Wildtyp-gp130. Mit Hilfe

einer unterschiedlichen Kombination von Y→F-Tyrosinmotiven im Zellinneren und ver-

schiedener extrazellulärer Domänen könnte man untersuchen, ob die verschiedenen Signal-

transduktionsschritte (STAT-Aktivierung zum einen, SHP2-Tyrosinphoshorylierung auf der

anderen Seite) an einen einzigen Rezeptorkomplex gebunden sind oder ob es ausreicht, diese

Proteine an unterschiedlichen Chimären aktiviert zur Verfügung zu stellen.

Sind beide Tyrosine 759 im IL-6-Rezeptor-Komplex für die Tyrosinphosphorylierung

der SHP2 notwendig?

In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, daß das Y759 des gp130 essentiell für die

Tyrosinphosphorylierung der SHP2 in der IL-6- abhängigen Signaltransduktion ist. Es ist be-

kannt, daß zwei gp130-Moleküle nach IL-6-Stimulation homodimerisieren. In einem Rezep-

torkomplex befinden sich demnach zwei Tyrosine 759. Interessant wäre nun herauszufinden,

ob wirklich beide Tyrosine für die SHP2-Aktivierung notwendig sind oder ob ein einziges

ausreicht. Dies kann man mit dem hier aufgebauten Assay zur Untersuchung der SHP2-

Tyrosinphosphorylierung gut untersuchen, wenn man den intrazellulär gelegenen Teil der

dargestellten ErG-Mutanten mit einem System mit hetero-oligomeren extrazellulären Anteil

verbindet, z.B. dem IL-5-R-System bestehend aus einem IL-5α-R und einer „common β

chain“.

Weitere Fragen, die sich in diesem Zusammenhang stellen, sind z.B. Fragen nach einer mög-

lichen Regulation der SHP2 durch ihre SH2-Domänen, oder anders formuliert: Bedeutet die

Belegung beider SH2-Domänen eine andere (verstärkte?, verlängerte?) Aktivierung der SHP2

als die Besetzung einer einzelnen SH2-Domäne? Wenn ja, wie muß diese zweite SH2-

Domänen-Bindungsstelle beschaffen sein? Muß sie der Konsensussequenz pY X X V folgen

oder reicht ein anderes vorhandenes Tyrosinmotiv? Zwei Lösungsansätze sind hier vorstell-

Diskussion 71

bar. Entweder brauchen beide Domänen ein Tyrosinmotiv analog des Y759 des gp130. Dann

sind für eine maximal aktivierte SHP2 zwei gp130-Moleküle notwendig. Oder die anderen

Tyrosinmotive im gp130 besitzen ebenfalls das Vermögen, durch Interaktion mit der C-

terminalen SH2-Domäne die Aktivierung der SHP2 im gp130-Kontext zu regulieren. Dies

würde bedeuten, daß für eine maximale Stimulation der SHP2 nur ein gp130 mit mindestens

zwei Tyrosinmotiven nötig ist. Dies könnte man mit Hilfe des hier etablierten Assays durch

den direkten Vergleich der SHP2-Aktivierung an verschiedenen Mutanten im IL-5-R-Sytem

untersuchen, in dem man mit Hilfe des Rezeptor-Tyrosinmotiv-Baukastens entsprechende

Mutanten (z.B. 5α/βrG FYFFFF und 5αrG FYYFFF) herstellt und im Phosphotyrosin Blot

überprüft.

Welche Tyrosine der SHP2 werden im IL-6-Kontext tyrosinphosphoryliert?

Es ist bereits beschrieben, daß die SHP2 je nach stimulierendem Zytokin an unterschiedlichen

Tyrosinen innerhalb des Proteins phosphoryliert werden kann. Durch Mutation sämtlicher

Tyrosine zu Phenylalanin und anschließender Reversion eines einzelnen Tyrosins könnte nach

entsprechender Expression in eukaryonten Zellen eine eventuelle stimulationsabhängige

Phosphorylierung im anti-Phosphotyrosin-Western Blot ausbleiben. Dies wäre ein Beleg da-

für, daß dieses Tyrosin im IL-6-Kontext phosphoryliert würde. Auch könnte man mit diesen

Mutanten untersuchen, ob eventuelle Phosphotyrosin-abhängige Andockstellen für andere

Proteine zerstört werden, was die Adapterfunktion der SHP2 erhellen würde.

Bedeutet Phosphorylierung der SHP2 Aktivierung der Enzymaktivität?

Es ist nicht selbstverständlich anzunehmen, daß die Phosphorylierung der SHP2 gleichzeitig

bedeutet, daß dieses Enzym dadurch tatsächlich aktiviert wird. Man könnte untersuchen, wie

Tyrosinphosphorylierung und Aktivierung des Enzyms zusammenhängen. Dies könnte zum

Beispiel durch Modifikation von bereits beschriebenen Phosphatase-Assays geschehen. Wie

hier gezeigt, kann man mit Hilfe der Stimulation über die Y759F-Mutante selektiv die SHP2-

Tyrosinphosphorylierung ausschalten. Interessant wäre zu untersuchen, ob und wie sich die

Enzymaktivität der SHP2 verändert, wenn sie über die Mutante aktiviert bzw. nicht aktiviert

wird.

Zusammenfassung 73

5. Zusammenfassung

Im Jahre 1993 wurde eine Protein-Tyrosinphosphatase, die SH2 domain containing protein-

tyrosine-phosphatase 2 (SHP2), entdeckt, die in einer Vielzahl von verschiedenen Signal-

transduktionen eine Rolle zu spielen scheint. Ziel der hier vorliegenden Arbeit war es, die Be-

deutung der Tyrosinphosphorylierung dieses Enzyms in der IL-6-abhängigen Signaltransduk-

tion genauer zu analysieren.

Nach Stimulation mit IL-6 konnte eine transiente Tyrosinphosphorylierung der SHP2 nach-

gewiesen werden. Zudem zeigte sich eine Komplexbildung dieses Proteins mit dem ebenfalls

tyrosinphosphorylierten Signaltransduktor gp130. Interessanterweise wiesen beide Phospho-

rylierungen den gleichen zeitlichen Verlauf auf, was für eine gemeinsame Regulation der

Proteine spricht.

Um die Abhängigkeit dieser SHP2-Tyrosinphosphorylierung von gp130 genauer zu untersu-

chen, wurde eine Reihe von gp130-Rezeptor-Mutanten hergestellt. Auf DNA-Ebene sind die-

se Mutanten so gestaltet, daß aufgrund neu eingefügter Restriktions-Endonukleasen-

Schnittstellen an jedem der sechs intrazellulär vorhandenen Tyrosinmotive ein Y→F-

Austausch möglich ist. Mittels dieser Mutanten, die stabil in Ba/F3-Zellen transfiziert wurden,

ist erstmals die Abhängigkeit der SHP2-Tyrosinphosphorylierung vom Y759 des gp130 an

einem nativen, ungekürzten Rezeptormolekül nachgewiesen worden.

Mit Hilfe von Fibrosarkom-Zellen, die nicht mehr in der Lage sind, jeweils eine der drei an

gp130 assoziierten Janus-Kinasen, Jak1, Jak2 bzw. Tyk2, zu exprimieren, wurde untersucht,

welche Bedeutung die drei obengenannten Kinasen bei der Tyrosinphosphorylierung der

SHP2 haben. Es stellte sich heraus, daß Jak1 essentiell für die IL-6-abhängige SHP2-

Tyrosinphosphorylierung ist. Die Elimination der Expression dieser Kinase führt zu einer le-

diglich residualen Tyrosinphosphorylierung der SHP2. Die beiden anderen Kinasen, Jak2 und

Tyk2, scheinen eine nur untergeordnete bzw. austauschbare Funktion zu haben, obwohl

nachweislich alle drei Kinasen konstitutiv mit SHP2 assoziieren.

Bei der Herausarbeitung möglicher Wirkungen der SHP2 auf die IL-6-abhängige Signaltrans-

duktion wurde beobachtet, daß der Austausch des Tyrosins 759 zu Phenylalanin, und damit

das Ausbleiben der SHP2-Tyrosinphosphorylierung, zu einer verstärkten und verlängerten

STAT-Aktivierung führt. Zudem geht die Stimulation über die Y759F-Mutante mit einer er-

höhten Aktivität eines IL-6-abhängigen Akute-Phase-Protein-Promotors einher. Die hier vor-

74 Zusammenfassung

liegenden Ergebnisse deuten auf eine negative Regulation der Signaltransduktion durch die

SHP2.

Die SHP2 wird häufig als Adapterprotein beschrieben, dessen Enzymaktivität von unterge-

ordneter Rolle zu sein scheint. Reportergen-Assays mit einer dominant negativ wirkenden

SHP2 zeigen jedoch, daß die Enzymaktivität der SHP2 durchaus eine wichtige Rolle in der

IL-6-abhängigen Signaltransduktion spielt. Ihre Ausschaltung geht mit einer erhöhten Indu-

zierbarkeit der untersuchten Promotoren einher.

Anhang 75

6.1 Literaturverzeichnis

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Anhang 85

6.2 Abkürzungsverzeichnis

α anti-A Alaninaa AminosäurenAbb AbbildungAPS AmmoniumperoxidsulfatATP Adenosintriphosphatβ-Gal β-GalaktosidaseBSA bovine serum albuminBSF B-cell stimulating factorC CysteincDNA complementary DNACIP calf intestine phosphatasec-kit receptor of stem cell factorCMV ZytomegalievirusCNTF ciliary neurotrophic factorcpm counts per minuteCRP C-reaktives ProteinCT-1 Cardiotrophin-1DMEM Dulbecco’s modified Eagle MediumDMSO DimethylsulfatDNA DesoxyribonukleinsäureECL enhanced chemiluminiscenceEDTA EthylendiamintetraacetatEGF epidermal growth factorEMSA Elektrophoretischer Mobilitätshift AssayEpo ErythropoetinF PhenylalaninFACS fluorescence activated cell sortingFCS fetal calf serumFGF fibroblast growth factorG-CSF granulocyte colony-stimulating factorgfp green-fluorescent proteinGH growth hormoneGM-CSF granulocyte/macrophage colony-stimulating factorgp Glykoproteingrb growth factor receptor bound proteinh StundeHBS HEPES buffered salineHEPES N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N‘-2-ethanolsulfonsäureHRP horse radish peroxidaseIFN InterferonIg ImmunglobulinIB ImmunblotIL InterleukinIP Immunpräzipitation

86 Anhang

IR Insulin-RezeptorIRF interferon regulatory factorIRS insulin receptor substrateJak Janus-KinaseK LysinkDA KilodaltonL LeucinLB-Medium Luria Bertani-MediumLIF leukemia inhibitory factorM MolarMAPK mitogen activated protein kinaseMEK MAPK-Kinasemin MinuteMpl myeloproliferative leukemia receptorOD optische DichteONPG o-NitrophenylgalaktosidOSM Oncostatin MPBS phosphate buffered salinePDGF platelet derived growth factorPCR Polymerase-KettenreaktionPEG PolyethylenglykolPLC Phospholipase CPMSF PhenylmethylsulfonylfluoridPRL ProlaktinPVDF PolyvinylidenfluoridPY Phospho-TyrosinQ GlutaminR RezeptorRNA RibonukleinsäureRT Raumtemperaturs soluble, löslichS SerinSDS SodiumdodecylsulfatSDS-PAGE SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophoresesec SekundeSH src-HomologiedomäneSHP2 SH2-domain containing protein-tyrosine-phosphataseSTAT signal transducer and activator of transcriptionSV40 (Affenvirus)Tab TabelleTEMED N, N, N‘, N‘-TetramethylendiaminTF tissue factorTris Tris(hydroxy)aminomethanU unit, EinheitUpM Umdrehungen pro MinuteUV ultraviolettW TryptophanY Tyrosin

Anhang 87

6.3 Sequenzen

6.3.1 Sequenz der GrG YYYYYYmyc-cDNA

M L T L Q T W V V Q A L F I F L T T E ]------------------------------------------------------------- ATGTTGA CGTTGCAGAC TTGGGTAGTG CAAGCCTTGT TTATTTTCCT CACCACTGAA TACAACT GCAACGTCTG AACCCATCAC GTTCGGAACA AATAAAAGGA GTGGTGACTT

20 S T G E L L D P C G Y I S P E S P V V Q ----------------------------------------------------------------- 58 TCTACAGGTG AACTTCTAGA TCCATGTGGT TATATCAGTC CTGAATCTCC AGTTGTACAA AGATGTCCAC TTGAAGATCT AGGTACACCA ATATAGTCAG GACTTAGAGG TCAACATGTT

40 L H S N F T A V C V L K E K C M D Y F H ----------------------------------------------------------------- 118 CTTCATTCTA ATTTCACTGC AGTTTGTGTG CTAAAGGAAA AATGTATGGA TTATTTTCAT GAAGTAAGAT TAAAGTGACG TCAAACACAC GATTTCCTTT TTACATACCT AATAAAAGTA

60 V N A N Y I V W K T N H F T I P K E Q Y ----------------------------------------------------------------- 178 GTAAATGCTA ATTACATTGT CTGGAAAACA AACCATTTTA CTATTCCTAA GGAGCAATAT CATTTACGAT TAATGTAACA GACCTTTTGT TTGGTAAAAT GATAAGGATT CCTCGTTATA

80 T I I N R T A S S V T F T D I A S L N I ----------------------------------------------------------------- 238 ACTATCATAA ACAGAACAGC ATCCAGTGTC ACCTTTACAG ATATAGCTTC ATTAAATATT TGATAGTATT TGTCTTGTCG TAGGTCACAG TGGAAATGTC TATATCGAAG TAATTTATAA

100 Q L T C N I L T F G Q L E Q N V Y G I T ----------------------------------------------------------------- 298 CAGCTCACTT GCAACATTCT TACATTCGGA CAGCTTGAAC AGAATGTTTA TGGAATCACA GTCGAGTGAA CGTTGTAAGA ATGTAAGCCT GTCGAACTTG TCTTACAAAT ACCTTAGTGT

120 I I S G L P P E K P K N L S C I V N E G ----------------------------------------------------------------- 358 ATAATTTCAG GCTTGCCTCC AGAAAAACCT AAAAATTTGA GTTGCATTGT GAACGAGGGG TATTAAAGTC CGAACGGAGG TCTTTTTGGA TTTTTAAACT CAACGTAACA CTTGCTCCCC

140 K K M R C E W D G G R E T H L E T N F T ---------------------------------------------------------------- 418 AAGAAAATGA GGTGTGAGTG GGATGGTGGA AGGGAAACAC ACTTGGAGAC AAACTTCACT TTCTTTTACT CCACACTCAC CCTACCACCT TCCCTTTGTG TGAACCTCTG TTTGAAGTGA

160 L K S E W A T H K F A D C K A K R D T P ----------------------------------------------------------------- 478 TTAAAATCTG AATGGGCAAC ACACAAGTTT GCTGATTGCA AAGCAAAACG TGACACCCCC AATTTTAGAC TTACCCGTTG TGTGTTCAAA CGACTAACGT TTCGTTTTGC ACTGTGGGGG

88 Anhang

180 T S C T V D Y S T V Y F V N I E V W V E ----------------------------------------------------------------- 538 ACCTCATGCA CTGTTGATTA TTCTACTGTG TATTTTGTCA ACATTGAAGT CTGGGTAGAA TGGAGTACGT GACAACTAAT AAGATGACAC ATAAAACAGT TGTAACTTCA GACCCATCTT

200 A E N A L G K V T S D H I N F D P V Y K ----------------------------------------------------------------- 598 GCAGAGAATG CCCTTGGGAA GGTTACATCA GATCATATCA ATTTTGATCC TGTATATAAA CGTCTCTTAC GGGAACCCTT CCAATGTAGT CTAGTATAGT TAAAACTAGG ACATATATTT

220 V K P N P P H N L S V I N S E E L S S I ----------------------------------------------------------------- 658 GTGAAGCCCA ATCCGCCACA TAATTTATCA GTGATCAACT CAGAGGAACT GTCTAGTATC CACTTCGGGT TAGGCGGTGT ATTAAATAGT CACTAGTTGA GTCTCCTTGA CAGATCATAG

240 L K L T W T N P S I K S V I I L K Y N I ----------------------------------------------------------------- 718 TTAAAATTGA CATGGACCAA CCCAAGTATT AAGAGTGTTA TAATACTAAA ATATAACATT AATTTTAACT GTACCTGGTT GGGTTCATAA TTCTCACAAT ATTATGATTT TATATTGTAA

260 Q Y R T K D A S T W S Q I P P E D T A S ----------------------------------------------------------------- 778 CAATATAGGA CCAAAGATGC CTCAACTTGG AGCCAGATTC CTCCTGAAGA CACAGCATCC GTTATATCCT GGTTTCTACG GAGTTGAACC TCGGTCTAAG GAGGACTTCT GTGTCGTAGG

280 T R S S F T V Q D L K P F T E Y V F R I ----------------------------------------------------------------- 838 ACCCGATCTT CATTCACTGT CCAAGACCTT AAACCTTTTA CAGAATATGT GTTTAGGATT TGGGCTAGAA GTAAGTGACA GGTTCTGGAA TTTGGAAAAT GTCTTATACA CAAATCCTAA

300 R C M K E D G K G Y W S D W S E E A S G ----------------------------------------------------------------- 898 CGCTGTATGA AGGAAGATGG TAAGGGATAC TGGAGTGACT GGAGTGAAGA AGCAAGTGGG GCGACATACT TCCTTCTACC ATTCCCTATG ACCTCACTGA CCTCACTTCT TCGTTCACCC

320 I T Y E D R P S K A P S F W Y K I D P S ----------------------------------------------------------------- 958 ATCACCTATG AAGATAGACC ATCTAAAGCA CCAAGTTTCT GGTATAAAAT AGATCCATCC TAGTGGATAC TTCTATCTGG TAGATTTCGT GGTTCAAAGA CCATATTTTA TCTAGGTAGG

340 H T Q G Y R T V Q L V W K T L P P F E A ----------------------------------------------------------------- 1018 CATACTCAAG GCTACAGAAC TGTACAACTC GTGTGGAAGA CATTGCCTCC TTTTGAAGCC GTATGAGTTC CGATGTCTTG ACATGTTGAG CACACCTTCT GTAACGGAGG AAAACTTCGG

360 N G K I L D Y E V T L T R W K S H L Q N ----------------------------------------------------------------- 1078 AATGGAAAAA TCTTGGATTA TGAAGTGACT CTCACAAGAT GGAAATCACA TTTACAAAAT TTACCTTTTT AGAACCTAAT ACTTCACTGA GAGTGTTCTA CCTTTAGTGT AAATGTTTTA

380 Y T V N A T K L T V N L T N D R Y L A T ----------------------------------------------------------------- 1138 TACACAGTTA ATGCCACAAA ACTGACAGTA AATCTCACAA ATGATCGCTA TCTAGCAACC ATGTGTCAAT TACGGTGTTT TGACTGTCAT TTAGAGTGTT TACTAGCGAT AGATCGTTGG

Anhang 89

400 L T V R N L V G K S D A A V L T I P A C ----------------------------------------------------------------- 1198 CTAACAGTAA GAAATCTTGT TGGCAAATCA GATGCAGCTG TTTTAACTAT CCCTGCCTGT GATTGTCATT CTTTAGAACA ACCGTTTAGT CTACGTCGAC AAAATTGATA GGGACGGACA

420 D F Q A T H P V M D L K A F P K D N M L ----------------------------------------------------------------- 1258 GACTTTCAAG CTACTCACCC TGTAATGGAT CTTAAAGCAT TCCCCAAAGA TAACATGCTT CTGAAAGTTC GATGAGTGGG ACATTACCTA GAATTTCGTA AGGGGTTTCT ATTGTACGAA

440 W V E W T T P R E S V K K Y I L E W C V ----------------------------------------------------------------- 1318 TGGGTGGAAT GGACTACTCC AAGGGAATCT GTAAAGAAAT ATATACTTGA GTGGTGTGTG ACCCACCTTA CCTGATGAGG TTCCCTTAGA CATTTCTTTA TATATGAACT CACCACACAC

460 L S D K A P C I T D W Q Q E D G T V H R ----------------------------------------------------------------- 1378 TTATCAGATA AAGCACCCTG TATCACAGAC TGGCAACAAG AAGATGGTAC CGTGCATCGC AATAGTCTAT TTCGTGGGAC ATAGTGTCTG ACCGTTGTTC TTCTACCATG GCACGTAGCG

480 T Y L R G N L A E S K C Y L I T V T P V ----------------------------------------------------------------- 1438 ACCTATTTAA GAGGGAACTT AGCAGAGAGC AAATGCTATT TGATAACAGT TACTCCAGTA TGGATAAATT CTCCCTTGAA TCGTCTCTCG TTTACGATAA ACTATTGTCA ATGAGGTCAT

500 Y A D G P G S P E S I K A Y L K Q A P P ----------------------------------------------------------------- 1498 TATGCTGATG GACCAGGAAG CCCTGAATCC ATAAAGGCAT ACCTTAAACA AGCTCCACCT ATACGACTAC CTGGTCCTTC GGGACTTAGG TATTTCCGTA TGGAATTTGT TCGAGGTGGA

520 S K G P T V R T K K V G K N E A V L E W ----------------------------------------------------------------- 1558 TCCAAAGGAC CTACTGTTCG GACAAAAAAA GTAGGGAAAA ACGAAGCTGT CTTAGAGTGG AGGTTTCCTG GATGACAAGC CTGTTTTTTT CATCCCTTTT TGCTTCGACA GAATCTCACC

540 D Q L P V D V Q N G F I R N Y T I F Y R ----------------------------------------------------------------- 1618 GACCAACTTC CTGTTGATGT TCAGAATGGA TTTATCAGAA ATTATACTAT ATTTTATAGA CTGGTTGAAG GACAACTACA AGTCTTACCT AAATAGTCTT TAATATGATA TAAAATATCT

560 T I I G N E T A V N V D S S H T E Y T L ----------------------------------------------------------------- 1678 ACCATCATTG GAAATGAAAC TGCTGTGAAT GTGGATTCTT CCCACACAGA ATATACATTG TGGTAGTAAC CTTTACTTTG ACGACACTTA CACCTAAGAA GGGTGTGTCT TATATGTAAC

580 S S L T S D T L Y M V R M A A Y T D E G ----------------------------------------------------------------- 1738 TCCTCTTTGA CTAGTGACAC ATTGTACATG GTACGAATGG CAGCATACAC AGATGAAGGT AGGAGAAACT GATCACTGTG TAACATGTAC CATGCTTACC GTCGTATGTG TCTACTTCCA

600 G K D G P E F T F T T P K F A Q G E I E ----------------------------------------------------------------- 1798 GGGAAGGATG GTCCAGAATT CACTTTTACT ACCCCAAAGT TTGCTCAAGG AGAAATTGAA CCCTTCCTAC CAGGTCTTAA GTGAAAATGA TGGGGTTTCA AACGAGTTCC TCTTTAACTT EcoRI

90 Anhang

620 A I V V P V C L A F L L T T L L G V L F ----------------------------------------------------------------- 1858 GCCATAGTCG TGCCTGTTTG CTTAGCATTC CTATTGACAA CTCTTCTGGG AGTGCTGTTC CGGTATCAGC ACGGACAAAC GAATCGTAAG GATAACTGTT GAGAAGACCC TCACGACAAG

640 C F N K R D L I K K H I W P N V P D P S ----------------------------------------------------------------- 1918 TGCTTTAATA AGCGAGACCT AATTAAAAAA CACATCTGGC CTAATGTTCC AGATCCTTCA ACGAAATTAT TCGCTCTGGA TTAATTTTTT GTGTAGACCG GATTACAAGG TCTAGGAAGT

660 K S H I A Q W S P H T P P R H N F N S K ----------------------------------------------------------------- 1978 AAGAGTCATA TTGCCCAGTG GTCACCTCAC ACTCCTCCAA GGCACAATTT TAATTCAAAA TTCTCAGTAT AACGGGTCAC CAGTGGAGTG TGAGGAGGTT CCGTGTTAAA ATTAAGTTTT BstEII 680 D Q M Y S D G N F T D V S V V E I E A N ----------------------------------------------------------------- 2038 GATCAAATGT ATTCAGATGG CAATTTCACT GATGTAAGTG TTGTGGAAAT AGAAGCAAAT CTAGTTTACA TAAGTCTACC GTTAAAGTGA CTACATTCAC AACACCTTTA TCTTCGTTTA

700 D K K P F P E D L K L L D L F K K E K I ----------------------------------------------------------------- 2098 GACAAAAAGC CTTTTCCAGA AGATCTGAAA TTATTGGACC TGTTCAAAAA GGAAAAAATT CTGTTTTTCG GAAAAGGTCT TCTAGACTTT AATAACCTGG ACAAGTTTTT CCTTTTTTAA

720 N T E G H S S G I G G S S C M S S S R P ----------------------------------------------------------------- 2158 AATACTGAAG GACACAGCAG TGGTATTGGG GGGTCTTCAT GCATGTCATC TTCTAGGCCA TTATGACTTC CTGTGTCGTC ACCATAACCC CCCAGAAGTA CGTACAGTAG AAGATCCGGT

740 S I S S S D E N E S S Q N T S S T V Q Y ----------------------------------------------------------------- 2218 AGCATTTCTA GCAGTGATGA AAATGAATCT TCACAAAACA CGAGCTCCAC TGTCCAGTAT TCGTAAAGAT CGTCACTACT TTTACTTAGA AGTGTTTTGT GCTCGAGGTG ACAGGTCATA SacI 760 S T V V H S G Y R H Q V P S V Q V F S R ----------------------------------------------------------------- 2278 TCTACCGTGG TACACTCCGG ATACAGACAC CAAGTTCCGT CAGTCCAAGT CTTCTCAAGA AGATGGCACC ATGTGAGGCC TATGTCTGTG GTTCAAGGCA GTCAGGTTCA GAAGAGTTCT BspEI 780 S E S T Q P L L D S E E R P E D L Q L V ----------------------------------------------------------------- 2338 TCCGAGTCTA CCCAGCCCTT GTTAGATTCA GAGGAGCGGC CAGAAGATCT ACAATTAGTA AGGCTCAGAT GGGTCGGGAA CAATCTAAGT CTCCTCGCCG GTCTTCTAGA TGTTAATCAT

800 D H V D G G D G I L P R Q Q Y F K Q N C ----------------------------------------------------------------- 2398 GACCATGTCG ATGGCGGTGA TGGTATTTTG CCCAGGCAAC AGTACTTCAA ACAGAACTGC CTGGTACAGC TACCGCCACT ACCATAAAAC GGGTCCGTTG TCATGAAGTT TGTCTTGACG AspI 820 S Q H E S S P D I S H F E R S K Q V S S ----------------------------------------------------------------- 2458 AGTCAGCATG AATCCAGTCC AGATATTTCA CATTTTGAAA GGTCAAAGCA AGTTTCATCA TCAGTCGTAC TTAGGTCAGG TCTATAAAGT GTAAAACTTT CCAGTTTCGT TCAAAGTAGT

Anhang 91

840 V N E E D F V R L K Q Q I S D H I S Q S ----------------------------------------------------------------- 2518 GTCAATGAGG AAGATTTTGT TAGACTTAAA CAGCAGATTT CAGATCATAT TTCACAATCC CAGTTACTCC TTCTAAAACA ATCTGAATTT GTCGTCTAAA GTCTAGTATA AAGTGTTAGG

860 C G S G Q M K M F Q E V S A A D A F G P ----------------------------------------------------------------- 2578 TGTGGATCTG GGCAAATGAA AATGTTTCAG GAAGTTTCTG CAGCAGATGC TTTTGGTCCA ACACCTAGAC CCGTTTACTT TTACAAAGTC CTTCAAAGAC GTCGTCTACG AAAACCAGGT

880 G T E G Q V E R F E T V G M E A A T D E ----------------------------------------------------------------- 2638 GGTACTGAGG GACAAGTAGA AAGATTCGAA ACAGTTGGCA TGGAGGCTGC GACTGATGAA CCATGACTCC CTGTTCATCT TTCTAAGCTT TGTCAACCGT ACCTCCGACG CTGACTACTT Bsp119I 900 G M P K S Y L P Q T V R Q G G Y M P Q G ----------------------------------------------------------------- 2698 GGCATGCCTA AAAGTTACTT ACCACAGACG GTCCGGCAAG GCGGCTACAT GCCTCAGGGC CCGTACGGAT TTTCAATGAA TGGTGTCTGC CAGGCCGTTC CGCCGATGTA CGGAGTCCCG RsrII 920 G E Q K L I S E E D L * ---)~~~~~~c-myc-Epitop~~~~~~~~~~~~> 2758 GGCGAGCAGA AGCTGATATC GGAGGAAGAT CTGTGA CCGCTCGTCT TCGACTATAG CCTCCTTCTA GACACT

6.3.2 Sequenz der sypimyc-cDNA

M T S R R W F H P N ]--------------------------------- GTCCCGGAAT TCCCGGGTCT AGAGTCACCA TGACATCGCG GAGATGGTTT CACCCAAATA CAGGGCCTTA AGGGCCCAGA TCTCAGTGGT ACTGTAGCGC CTCTACCAAA GTGGGTTTAT EcoRI 11 I T G V E A E N L L L T R G V D G S F L ----------------------------------------------------------------- 61 TCACTGGTGT GGAGGCAGAA AACCTACTGT TGACAAGAGG AGTTGATGGC AGTTTTTTGG AGTGACCACA CCTCCGTCTT TTGGATGACA ACTGTTCTCC TCAACTACCG TCAAAAAACC

31 A R P S K S N P G D F T L S V R R N G A ----------------------------------------------------------------- 121 CAAGGCCTAG TAAAAGTAAC CCTGGAGACT TCACACTTTC CGTTAGAAGA AATGGAGCTG GTTCCGGATC ATTTTCATTG GGACCTCTGA AGTGTGAAAG GCAATCTTCT TTACCTCGAC

51 V T H I K I Q N T G D Y Y D L Y G G E K ----------------------------------------------------------------- 181 TCACCCACAT CAAGATTCAG AACACTGGTG ATTACTATGA CCTGTATGGA GGGGAGAAAT AGTGGGTGTA GTTCTAAGTC TTGTGACCAC TAATGATACT GGACATACCT CCCCTCTTTA

71 F A T L A E L V Q Y Y M E H H G Q L K E ----------------------------------------------------------------- 241 TTGCCACTTT GGCTGAGTTG GTCCAGTATT ACATGGAACA TCACGGGCAA TTAAAAGAGA AACGGTGAAA CCGACTCAAC CAGGTCATAA TGTACCTTGT AGTGCCCGTT AATTTTCTCT

92 Anhang

91 K N G D V I E L K Y P L N C A D P T S E ----------------------------------------------------------------- 301 AGAATGGAGA TGTCATTGAG CTTAAATATC CTCTGAACTG TGCAGATCCT ACCTCTGAAA TCTTACCTCT ACAGTAACTC GAATTTATAG GAGACTTGAC ACGTCTAGGA TGGAGACTTT

111 R W F H G H L S G K E A E K L L T E K G ----------------------------------------------------------------- 361 GGTGGTTTCA TGGACATCTC TCTGGGAAAG AAGCAGAGAA ATTATTAACT GAAAAAGGAA CCACCAAAGT ACCTGTAGAG AGACCCTTTC TTCGTCTCTT TAATAATTGA CTTTTTCCTT

131 K H G S F L V R E S Q S H P G D F V L S ----------------------------------------------------------------- 421 AACATGGTAG TTTTCTTGTA CGAGAGAGCC AGAGCCACCC TGGAGATTTT GTTCTTTCTG TTGTACCATC AAAAGAACAT GCTCTCTCGG TCTCGGTGGG ACCTCTAAAA CAAGAAAGAC

151 V R T G D D K G E S N D G K S K V T H V ----------------------------------------------------------------- 481 TGCGCACTGG TGATGACAAA GGGGAGAGCA ATGACGGCAA GTCTAAAGTG ACCCATGTTA ACGCGTGACC ACTACTGTTT CCCCTCTCGT TACTGCCGTT CAGATTTCAC TGGGTACAAT

171 M I R C Q E L K Y D V G G G E R F D S L ----------------------------------------------------------------- 541 TGATTCGCTG TCAGGAACTG AAATACGACG TTGGTGGAGG AGAACGGTTT GATTCTTTGA ACTAAGCGAC AGTCCTTGAC TTTATGCTGC AACCACCTCC TCTTGCCAAA CTAAGAAACT

191 T D L V E H Y K K N P M V E T L G T V L ----------------------------------------------------------------- 601 CAGATCTTGT GGAACATTAT AAGAAGAATC CTATGGTGGA AACATTGGGT ACAGTACTAC GTCTAGAACA CCTTGTAATA TTCTTCTTAG GATACCACCT TTGTAACCCA TGTCATGATG

211 Q L K Q P L N T T R I N A A E I E S R V ----------------------------------------------------------------- 661 AACTCAAGCA GCCCCTTAAC ACGACTCGTA TAAATGCTGC TGAAATAGAA AGCAGAGTTC TTGAGTTCGT CGGGGAATTG TGCTGAGCAT ATTTACGACG ACTTTATCTT TCGTCTCAAG

231 R E L S K L A E T T D K V K Q G F W E E ----------------------------------------------------------------- 721 GAGAACTAAG CAAATTAGCT GAGACCACAG ATAAAGTCAA ACAAGGCTTT TGGGAAGAAT CTCTTGATTC GTTTAATCGA CTCTGGTGTC TATTTCAGTT TGTTCCGAAA ACCCTTCTTA

251 F E T L Q Q Q E C K L L Y S R K E G Q R ----------------------------------------------------------------- 781 TTGAGACACT ACAACAACAG GAGTGCAAAC TTCTCTACAG CCGAAAAGAG GGTCAAAGGC AACTCTGTGA TGTTGTTGTC CTCACGTTTG AAGAGATGTC GGCTTTTCTC CCAGTTTCCG

271 Q E N K N K N R Y K N I L P F D H T R V ----------------------------------------------------------------- 841 AAGAAAACAA AAACAAAAAT AGATATAAAA ACATCCTGCC CTTTGATCAT ACCAGGGTTG TTCTTTTGTT TTTGTTTTTA TCTATATTTT TGTAGGACGG GAAACTAGTA TGGTCCCAAC

291 V L H D G D P N E P V S D Y I N A N I I ----------------------------------------------------------------- 901 TCCTACACGA TGGTGATCCC AATGAGCCTG TTTCAGATTA CATCAATGCA AATATCATCA AGGATGTGCT ACCACTAGGG TTACTCGGAC AAAGTCTAAT GTAGTTACGT TTATAGTAGT

Anhang 93

311 M P E F E T K C N N S K P K K S Y I A T ----------------------------------------------------------------- 961 TGCCTGAATT TGAAACCAAG TGCAACAATT CAAAGCCCAA AAAGAGTTAC ATTGCCACAC ACGGACTTAA ACTTTGGTTC ACGTTGTTAA GTTTCGGGTT TTTCTCAATG TAACGGTGTG

331 Q G C L Q N T V N D F W R M V F Q E N S ----------------------------------------------------------------- 1021 AAGGCTGCCT GCAAAACACG GTGAATGACT TTTGGCGGAT GGTGTTCCAA GAAAACTCCC TTCCGACGGA CGTTTTGTGC CACTTACTGA AAACCGCCTA CCACAAGGTT CTTTTGAGGG

351 R V I V M T T K E V E R G K S K C V K Y ----------------------------------------------------------------- 1081 GAGTGATTGT CATGACAACG AAAGAAGTGG AGAGAGGAAA GAGTAAATGT GTCAAATACT CTCACTAACA GTACTGTTGC TTTCTTCACC TCTCTCCTTT CTCATTTACA CAGTTTATGA

371 W P D E Y A L K E Y G V M R V R N V K E ----------------------------------------------------------------- 1141 GGCCTGATGA GTATGCTCTA AAAGAATATG GCGTCATGCG TGTTAGGAAC GTCAAAGAAA CCGGACTACT CATACGAGAT TTTCTTATAC CGCAGTACGC ACAATCCTTG CAGTTTCTTT Insert 391 S A A H D Y T L R E L K L S K V G Q A L ----------------------------------------------------------------- 1201 GCGCCGCTCA TGACTATACG CTAAGAGAAC TTAAACTTTC AAAGGTTGGA CAAGCTCTAC CGCGGCGAGT ACTGATATGC GATTCTCTTG AATTTGAAAG TTTCCAACCT GTTCGAGATG

411 L Q G N T E R T V W Q Y H F R T W P D H ----------------------------------------------------------------- 1261 TCCAGGGGAA TACGGAGAGA ACGGTCTGGC AATACCACTT TCGGACCTGG CCGGACCACG AGGTCCCCTT ATGCCTCTCT TGCCAGACCG TTATGGTGAA AGCCTGGACC GGCCTGGTGC

431 G V P S D P G G V L D F L E E V H H K Q ----------------------------------------------------------------- 1321 GCGTGCCCAG CGACCCTGGG GGCGTGCTGG ACTTCCTGGA GGAGGTGCAC CATAAGCAGG CGCACGGGTC GCTGGGACCC CCGCACGACC TGAAGGACCT CCTCCACGTG GTATTCGTCC Katalytisches Zentrum 451 E S I M D A G P V V V H C S A G I G R T ----------------------------------------------------------------- 1381 AGAGCATCAT GGATGCAGGG CCGGTCGTGG TGCACTGCAG TGCTGGAATT GGCCGGACAG TCTCGTAGTA CCTACGTCCC GGCCAGCACC ACGTGACGTC ACGACCTTAA CCGGCCTGTC

471 G T F I V I D I L I D I I R E K G V D C ----------------------------------------------------------------- 1441 GGACGTTCAT TGTGATTGAT ATTCTTATTG ACATCATCAG AGAGAAAGGT GTTGACTGCG CCTGCAAGTA ACACTAACTA TAAGAATAAC TGTAGTAGTC TCTCTTTCCA CAACTGACGC

491 D I D V P K T I Q M V R S Q R S G M V Q ----------------------------------------------------------------- 1501 ATATTGACGT TCCCAAAACC ATCCAGATGG TGCGGTCTCA GAGGTCAGGG ATGGTCCAGA TATAACTGCA AGGGTTTTGG TAGGTCTACC ACGCCAGAGT CTCCAGTCCC TACCAGGTCT

511 T E A Q Y R F I Y M A V Q H Y I E T L Q ----------------------------------------------------------------- 1561 CAGAAGCACA GTACCGATTT ATCTATATGG CGGTCCAGCA TTATATTGAA ACACTACAGC GTCTTCGTGT CATGGCTAAA TAGATATACC GCCAGGTCGT AATATAACTT TGTGATGTCG

94 Anhang

531 R R I E E E Q K S K R K G H E Y T N I K ----------------------------------------------------------------- 1621 GCAGGATTGA AGAAGAGCAG AAAAGCAAGA GGAAAGGGCA CGAATATACA AATATTAAGT CGTCCTAACT TCTTCTCGTC TTTTCGTTCT CCTTTCCCGT GCTTATATGT TTATAATTCA

551 Y S L A D Q T S G D Q S P L P P C T P T ----------------------------------------------------------------- 1681 ATTCTCTAGC GGACCAGACG AGTGGAGATC AGAGCCCTCT CCCGCCTTGT ACTCCAACGC TAAGAGATCG CCTGGTCTGC TCACCTCTAG TCTCGGGAGA GGGCGGAACA TGAGGTTGCG

571 P P C A E M R E D S A R V Y E N V G L M ----------------------------------------------------------------- 1741 CACCCTGTGC AGAAATGAGA GAAGACAGTG CTAGAGTCTA TGAAAACGTG GGCCTGATGC GTGGGACACG TCTTTACTCT CTTCTGTCAC GATCTCAGAT ACTTTTGCAC CCGGACTACG

591 Q Q Q K S F R K A L E Q K L I S E E D L -------------------------------)~~~~~~~~~c-myc-Epitop~~~~~~~~~~~~ 1801 AACAGCAGAA AAGTTTCAGA AAAGCTTTAG AGCAGAAGCT GATATCGGAG GAAGATCTGG TTGTCGTCTT TTCAAAGTCT TTTCGAAATC TCGTCTTCGA CTATAGCCTC CTTCTAGACC HindIII 611 E A * ~~~~> 1861 AAGCTTAA TTCGAATT HindIII

Danksagung

Ohne die Mithilfe einer ganzen Reihe von Personen wäre die Erstellung dieser Doktorarbeit

nicht möglich gewesen. Ihnen möchte ich an dieser Stelle meine Anerkennung aussprechen.

Ich bedanke mich

bei Herrn Prof. Heinrich für die freundliche Aufnahme in seinen Arbeitskreis, sowie für die

Ermöglichung dieser Arbeit und die darüber hinaus in jeder Hinsicht gewährte Unterstützung,

auch bei der Erstellung von Zeugnissen und Bescheinigungen.

bei Herrn Dr. Fred Schaper, der diese Arbeit maßgeblich betreut hat, für das wissenschaftliche

Arbeiten, welches er mir bei gebracht hat, ganz zu schweigen von den kleinen Tricks, die das

Leben im Labor erleichtern. Davon profitiere ich noch heute.

bei Herrn Jochen Schmitz, Frau Monika Eck, Herrn Carsten Grimm und Herrn Dirk Anhuf für

die erfahrene Unterstützung, besonders in der Endphase dieser Arbeit.

bei Frau Andrea Graf für die Aufarbeitung unendlicher Liter E.coli-Lösungen und die

Bereitstellung ebenso großer Mengen an Puffer und Lösungen; bei Frau Christa Gerlach für

den Nachschub an COS-7-Zellen und deren Bekannten; bei Herrn Marcel Robbertz für die

Photoarbeiten und schließlich bei Frau Hildegard Schmitz-Van de Leur und Frau Andrea

Küster für die Geduld und Mühe, die sie sich mit den Sequenzierungen machten.

bei allen übrigen Mitarbeitern des Institutes für das angenehme Arbeitsklima und die

erfahrene Hilfsbereitschaft, besonders bei Herrn Dr. Elmar Siewert – in Gedanken an alte

Labor 3-Zeiten.

Schließlich möchte ich noch meinen Eltern und Marc danken, die mir nicht nur die

Möglichkeit gegeben haben, Medizin zu studieren, sondern mich immer wieder aufgebaut

haben, wenn es mal wieder eher drunter als drüber ging.

Lebenslauf

Cornelia Henke-Gendo geb. Gendo

Geburtsdatum: 21. Oktober 1973 in Bad Soden am Taunus

Schulbildung: 1980-1984: Katholische Grundschule Geilenkirchen

1984-1993: Bischöfliches Gymnasium St. Ursula, Geilenkirchen

Abschluß: Allgemeine Hochschulreife

Studium: ab WS 1993/94: Studium der Medizin an der RWTH Aachen

1995: ärztliche Vorprüfung

1996: 1. Staatsexamen

1996-1997: Promotion am Institut für Biochemie,

Abt. Prof. Heinrich

10.1998-01.1999: Auslandssemester an der

Rijksuniversiteit Limburg in Maastricht (NL)


1999-2000: Praktisches Jahr am

Elisabeth-Krankenhaus Mönchengladbach-Rheydt,

Kliniken Maria Hilf GmbH, Wahlfach: Neurologie


seit 01.2001: Ärztin im Praktikum in der

Neurologischen Klinik der MH Hannover

Modulation der IL-6-abhängigen Signaltransduktion durch...

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