Modulation von CD4+ T-Zellen durch Lebersinusendothelzellen · 2008, Takada and Jameson 2009,...

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Modulation von CD4 + T-Zellen durch Lebersinusendothelzellen vorgelegt von Dipl. Biol. Christine Rudolph geb. in Dresden von der Fakultät III – Prozesswissenschaften der Technische Universität Berlin zur Erlangung des akademischen Grades Doktorin der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) im Fach Medizinische Biotechnologie genehmigte Dissertation Promotionsausschuss: Vorsitzende: Prof. Dr. Claudia Fleck Gutachter: Prof. Dr. Roland Lauster Prof. Dr. Alexander Scheffold Prof. Dr. Jens Kurreck Datum der wissenschaftlichen Aussprache: 05.12.2014 Berlin 2015

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Modulation von CD4+ T-Zellen durch

Lebersinusendothelzellen

vorgelegt von

Dipl. Biol.

Christine Rudolph

geb. in Dresden

von der Fakultät III – Prozesswissenschaften der Technische Universität Berlin

zur Erlangung des akademischen Grades

Doktorin der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)

im Fach Medizinische Biotechnologie

genehmigte Dissertation

Promotionsausschuss:

Vorsitzende: Prof. Dr. Claudia Fleck

Gutachter: Prof. Dr. Roland Lauster

Prof. Dr. Alexander Scheffold

Prof. Dr. Jens Kurreck

Datum der wissenschaftlichen Aussprache: 05.12.2014

Berlin 2015

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Inhaltsverzeichnis

3

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung ..................................................................................................... 7

1.1 Grundzüge des Immunsystems .............................................................. 8

1.2 T-Zellen .................................................................................................. 9

1.2.1 T-Zell-Differenzierung im Thymus ............................................... 9

1.2.2 Antigenpräsentation und Aktivierung von T-Zellen .................... 10

1.2.3 T-Helfer Zellen .......................................................................... 11

1.2.4 Regulatorische T-Zellen ............................................................ 13

1.2.5 Gewebespezifische Migration von T-Zellen ............................... 15

1.3 Leber als immunologisches Organ ....................................................... 16

1.3.1 Aufbau der Leber ...................................................................... 16

1.3.2 Immunologische Funktionen der Leber ..................................... 18

1.4 Regulation von Immunantworten .......................................................... 19

1.4.1 Suppression durch regulatorische T-Zellen ............................... 20

1.4.2 Das immunsuppressive Zytokin IL-10........................................ 21

1.5 Notch-Signalweg .................................................................................. 23

1.5.1 Notch-Rezeptor und seine Liganden ......................................... 23

1.5.2 Einfluss des Notch-Signalweges auf die T-Zell-

Differenzierung .......................................................................... 24

2. Zielsetzung ................................................................................................ 26

3. Material und Methoden ............................................................................. 28

3.1 Versuchstiere ....................................................................................... 29

3.2 Reagenzien und Kits ............................................................................ 29

3.2.1 Reagenzien ............................................................................... 29

3.2.2 Vorgefertigte Systeme (Kits) ..................................................... 32

3.3 Materialien und Geräte ......................................................................... 33

3.3.1 Materialien ................................................................................ 33

3.3.2 Geräte ....................................................................................... 33

3.4 Primer .................................................................................................. 34

3.5 Antikörper ............................................................................................. 35

3.6 Medien und Puffer ................................................................................ 39

3.7 Isolation definierter Zellpopulationen .................................................... 40

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Inhaltsverzeichnis

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3.7.1 Zellzahlbestimmung .................................................................. 40

3.7.2 Prinzip der Isolation von Zellpopulationen durch magnetische

Zellseparation ........................................................................... 41

3.7.3 Isolation von nicht-parenchymatischen Zellen (NPC) der

Leber......................................................................................... 41

3.7.4 Isolation von Lymphozyten aus Milz und Lymphknoten ............. 43

3.7.5 Isolation von Lymphozyten aus der Lamina propria ................... 45

3.8 T-Zell-Stimulation und T-Zellkulturen .................................................... 46

3.8.1 T-Zell-Stimulation ...................................................................... 46

3.8.2 In Vitro Suppressionsassay ....................................................... 48

3.9 Restimulation und Fixierung ................................................................. 48

3.10 Durchflusszytometrie ................................................................. 49

3.10.1 Prinzip, Messung und Auswertung ............................................ 49

3.10.2 Fluoreszenzmarkierung von Oberflächenmolekülen .................. 49

3.10.3 Intrazelluläre Fluoreszenzmarkierung........................................ 50

3.10.4 Analyse der Proliferation von T-Zellen....................................... 51

3.11 Reverse Transkriptase-PCR ..................................................... 52

3.11.1 RNA Extraktion ......................................................................... 52

3.11.2 Reverse Transkription ............................................................... 52

3.12 Real-time PCR .......................................................................... 53

3.12.1 Prinzip, Messung und Auswertung ............................................ 53

3.12.2 Durchführung der SYBR Green real-time PCR .......................... 54

3.13 Cytometric Bead Assay ............................................................. 56

3.14 Tierexperimentelle Methoden .................................................... 56

3.14.1 Zelltransfer durch intravenöse Injektion ..................................... 56

3.14.2 In vivo Migration von CD4+ T-Zellen .......................................... 57

3.14.3 Transfercolitis ............................................................................ 57

3.14.4 Delayed type hypersensitivity-Model ......................................... 58

3.15 Histologie .................................................................................. 58

3.15.1 Immunfluoreszenz ..................................................................... 59

3.15.2 Immunpathologie ...................................................................... 59

3.16 Statistische Datenanalyse ......................................................... 60

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4. Ergebnisse ................................................................................................. 61

4.1 Modulation von CD4+ T-Zellen durch das Lebersinusendothel unter

homöostatischen Bedingungen ............................................................ 62

4.1.1 LSEC induzieren einen Darm-Homingphänotyp bei CD4+ T-

Zellen ........................................................................................ 62

4.1.2 LSEC induzieren kein pro-inflammatorisches Interferon-γ

und keine Apoptose bei CD4+ T-Zellen ..................................... 64

4.1.3 TLSEC supprimieren CD8+ T-Zellen in vitro.................................. 65

4.1.4 TLSEC supprimieren eine Colitis in vivo ....................................... 68

4.1.5 TLSEC exprimieren regulatorische Markerproteine ...................... 71

4.2 Modulation von CD4+ T-Zellen durch das Lebersinusendothel unter

entzündlichen Bedingungen ................................................................. 74

4.2.1 LSEC induzieren einen Darmhoming-Phänotyps bei Th1

Zellen ........................................................................................ 74

4.2.2 LSEC induzieren kein pro-inflammatorisches Interferon-γ

und keine Apoptose bei Reaktivierung exogen-aktivierter

Th1 Zellen ................................................................................. 77

4.2.3 LSEC induzieren die Expression des anti-inflammatorischen

IL-10 auf Th1 Zellen .................................................................. 78

4.2.4 Th1LSEC supprimieren eine DTH-Reaktion in vivo ...................... 80

4.2.5 ICOS-L und IL-27 spielen keine Rolle für die IL-10 Induktion

in Th1LSEC .................................................................................. 83

4.2.6 LSEC exprimieren alle vier Notch-Liganden .............................. 84

4.2.7 Die IL-10 Induktion in Th1LSEC ist abhängig vom Notch-

Signalweg ................................................................................. 86

5. Diskussion ................................................................................................. 93

5.1 Lebersinusendothelzellen induzieren Darmhoming-Phänotyp bei

CD4+ T-Zellen ....................................................................................... 94

5.2 LSEC hemmen die Expression von pro-inflammatorischen

Interferon-γ und induzieren keine Apoptose bei CD4+ T-Zellen............. 98

5.3 LSEC induzieren regulatorische CD4+ T-Zellen unter

homöostatischen und inflammatorischen Bedingungen ...................... 102

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Inhaltsverzeichnis

6

5.3.1 TLSEC supprimieren die Aktivierung von CD8+ T-Zellen und

die Pathogenese einer Colitis .................................................. 102

5.3.2 LSEC induzieren suppressive IL-10+ Th1 Zellen abhängig

vom Notchsignalweg ............................................................... 106

6. Zusammenfassung .................................................................................. 111

7. Summary .................................................................................................. 114

8. Literatur ................................................................................................... 117

9. Anhänge ........................................................................................................ I

9.1 Abkürzungsverzeichnis ........................................................................... II

9.2 Abbildungsverzeichnis ......................................................................... VII

9.3 Tabellenverzeichnis .............................................................................. IX

9.4 Erklärung ............................................................................................... X

9.5 Danksagung ......................................................................................... XI

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1. Einleitung

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Einleitung

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1.1 Grundzüge des Immunsystems

Im Zuge der Evolution haben höhere Wirbeltiere, insbesondere Säugetiere, komplexe

und äußerst effiziente Abwehrmechanismen gegen pathogene Mikroorganismen und

Parasiten entwickelt, die in ihrer Gesamtheit als Immunsystem bezeichnet werden. Die

Aufgaben des Immunsystems bestehen darin, intra- und extrazelluläre

Krankheitserreger abzuwehren sowie maligne und abgestorbene Zellen zu eliminieren.

Dabei unterscheidet man zwischen der angeborenen und adaptiven Immunität. Beide

Teile des Immunsystems sind nicht strikt voneinander zu trennen, da ihre

Komponenten interagieren müssen, um eine effiziente Immunabwehr zu generieren

(Übersicht in (Medzhitov 2001, Hoebe, Janssen et al. 2004)).

Das angeborene Immunsystem bietet schnellen und unspezifischen Schutz gegen

Pathogene und besteht aus drei Komponenten: mechanische Barrieren (Epithelien und

deren Sekrete), lösliche Komponenten (Akute-Phasen-Proteine, Komplementsystem)

und zelluläre Komponenten (Hämozyten, Natürliche Killer-Zellen (NK-Zellen),

Dendritische Zellen (DC)) (Übersicht in (Janeway and Medzhitov 2002, Levy 2007)).

Die Erkennung und Eliminierung der Pathogene wird durch sogenannte Pattern

Recognition Rezeptoren (PPR) vermittelt und basiert auf dem Vorhandensein hoch-

konservierter molekularer Strukturen (pathogen associated molecular patterns; PAMP)

in den Pathogenen. Neben der Phagozytose von Pathogenen ist die

Antigenpräsentation gegenüber Zellen des adaptiven Immunsystems eine der

Hauptaufgaben der angeborenen Immunabwehr (Übersicht in (Medzhitov 2001, Brown

2006)).

Das adaptive Immunsystem ist durch eine hohe Antigenspezifität, Rezeptordiversität

und –variabilität charakterisiert. Parallel dazu wird ein immunologisches Gedächtnis

ausgebildet, welches bei erneuter Infektion mit dem gleichen Pathogen eine schnellere

und effektivere Immunabwehr ermöglicht (Mackay 1991). Antigene werden dabei von

antigenpräsentierenden Zellen (APC) an B-Zellen und T-Zellen präsentiert und über

deren Rezeptoren (B-Zellrezeptor, BCR; T-Zellrezeptor, TCR) erkannt. Jede Zelle

besitzt nur eine einzige Spezifität ihres Rezeptors auf ihrer Zelloberfläche. Durch

komplexe Rekombinationsmechanismen können eine Vielzahl verschiedener

Rezeptorspezifitäten generiert werden. Nach der Erkennung ihres spezifischen

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Einleitung

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Antigens werden die Zellen aktiviert und durch klonale Selektion expandiert (Übersicht

in (Nemazee 2000)). Je nach Zytokinmileu differenzieren aktivierte T-Zellen zu

Effektorzellen oder Helferzellen. B-Zellen differenzieren nach der Aktivierung über ihren

BCR zu antikörpersekretierenden Plasmazellen. Diese Immunglobuline besitzen

dieselbe Spezifität, wie der oberflächengebundene BCR und zirkulieren im Körper um

dort die entsprechenden zellgebundenen Antigene erneut zu erkennen und für die Lyse

durch z.B. NK-Zellen zu markieren.

1.2 T-Zellen

1.2.1 T-Zell-Differenzierung im Thymus

Die Gesamtheit der reifen, naiven T-Zellen in der Peripherie wird ständig durch die

Auswanderung von Zellen aus dem Thymus erhalten (Übersicht in (Surh and Sprent

2008, Takada and Jameson 2009, Sprent and Surh 2011)). Die hauptsächliche

Ausbildung des T-Zell-Repertoires findet jedoch in der frühen Lebensphase statt und

nimmt mit zunehmendem Alter ab. Im Thymus erfolgt die Selektion der Vorläuferzellen,

die, entstehend aus pluripotenten hämatopoetischen Stammzellen, aus dem

Knochenmark einwandern (Akashi, Reya et al. 2000). In den zunächst für die T-Zell

Ko-Rezeptoren CD4- und CD8- (cluster of differentiation, CD) doppelnegativen T-Zellen

erfolgt die Rekombination der TCR-Gene. Ein kleiner Anteil der Zellen rekombiniert

ihre γδ-TCR Gene und entwickelt sich zu CD3+CD4-CD8- γδ-T-Zellen (Übersicht in

(Chien and Konigshofer 2007)), während der Großteil der Zellen eine Rekombination

der αβ-TCR Gene durchläuft und sich zu CD3+CD4+CD8+ αβ-T-Zellen entwickelt. Im

Anschluss durchlaufen die Zellen zwei wichtige Selektionprozesse (Übersicht in (Fink

and Bevan 1995, Kruisbeek and Amsen 1996)). Während der negativen Selektion

werden alle T-Zellen deletiert, die mit hoher Affinität körpereigene Peptide binden, die

über major histocompatibility complex (MHC) Moleküle präsentiert werden. Somit wird

verhindert, dass auto-reaktive T-Zellen den Thymus verlassen. Im zweiten Schritt

erfolgt die Ausbildung von CD4 bzw. CD8 einzelpositiven Zellen durch die Erkennung

von Antigen, das über MHCII bzw. MHCI Moleküle präsentiert wird. Die reifen T-Zellen

wandern im Anschluss in die Peripherie aus und zirkulieren im Körper solange bis sie

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Einleitung

10

ihr spezifisches Antigen über MHC Moleküle präsentiert bekommen und dadurch

aktiviert werden.

1.2.2 Antigenpräsentation und Aktivierung von T-Zellen

Für die Präsentation von Antigenen an T-Zellen ist die Expression von MHC Molekülen

durch Zellen notwendig. Intrazelluläre Antigene werden über MHC I Moleküle an CD8+

T-Zellen präsentiert und extrazelluläre Antigene über MHC II an CD4+ T-Zellen

(Übersicht in (Trombetta and Mellman 2005)). Einige APC sind in der Lage

extrazelluläre Antigene über MHCI Moleküle an CD8+ T-Zellen zu präsentieren. Dieser

Vorgang wird als Kreuzpräsentation bezeichnet und spielt in der Leber eine große

Rolle (Kurts, Heath et al. 1996, den Haan, Lehar et al. 2000, Limmer, Ohl et al. 2005).

Für die Aktivierung der T-Zellen ist zudem die Expression von kostimulatorischen

Molekülen wie CD80 und CD86 durch APC essentiell (Schweitzer, Borriello et al.

1997). Zusätzlich können Adhäsionsmoleküle wie intracellular adhesion molecule

(ICAM)-1, 2 oder vascular cell adhesion molecule (VCAM) kostimulatorische Signale

vermitteln (Van Seventer, Shimizu et al. 1990, Damle and Aruffo 1991). Das Fehlen

solcher Signale bewirkt hingegen Anergie oder eine Deletion der T-Zellen. MHC I

Moleküle werden von nahezu jeder Zelle des Körpers exprimiert und damit können

diese bei einer Infektion erfolgreich erkannt und lysiert werden. MHCII Moleküle

werden fast ausschließlich von professionellen antigenpräsentierenden Zellen des

hämatopoetischen Systems exprimiert, dazu gehören Makrophagen, DC und B-Zellen.

Beschrieben ist aber auch eine MHCII Expression durch nicht-hämatopoetische Zellen

wie Endothelzellen (Lohse, Knolle et al. 1996).

Die Aktivierung der T-Zellen bewirkt eine Expression des frühen Aktivierungsmarkers

CD69, der hochaffinen Kette des Interleukin (IL)-2 Rezeptors (CD25) und die Sekretion

von IL-2, welches wiederum autokrin auf die T-Zelle wirkt und die weitere Proliferation

und Differenzierung fördert (Smith 1988). Die aktivierten T-Zellen durchlaufen eine

klonale Expansion, was zu einer effektiven spezifischen Abwehrreaktion führt und in

einer Sekretion zahlreicher Zytokine resultiert (Bird, Brown et al. 1998). Neben kurz-

lebigen Effektor-T-Zellen entstehen auch langlebige Gedächtnis-T-Zellen, die bei

erneutem Antigenkontakt die gleichen Effektorzytokine wie zuvor produzieren und

damit schneller zur Bekämpfung einer erneuten Infektion betragen können.

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Einleitung

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CD8+ T-Zellen entwickeln sich nach der Aktivierung zu zytotoxischen T-Zellen, die

durch die Sekretion von Granzym und Perforin oder durch die Expression von

oberflächengebundenen Fas-L und TRAIL Apoptose in den Zielzellen induzieren

(Übersicht in (Atkinson and Bleackley 1995, Griffiths 1995)). Da die CD8+ T-Zellen

nach der Aktivierung eine Vielzahl an infizierten Zellen lysieren können, ist der Prozess

stark reguliert und bedarf der zusätzlichen Aktivierung durch T-Helfer-Zellen (Th

Zellen).

1.2.3 T-Helfer Zellen

Nach der Aktivierung von CD4+ T-Zellen können je nach Zytokinmileu verschiedene Th

Zellen entstehen, die wiederum selbst verschiedene charakteristische Zytokine

produzieren. Initial wurde ausschließlich zwischen Th1 und Th2 Zellen unterschieden

(Übersicht in (Mosmann and Coffman 1989, Murphy and Reiner 2002)). Mittlerweile

sind weitere eigenständige Th Zell-Populationen beschrieben, die zu einer deutlich

komplexeren Darstellung der Th Zellen führt (Übersicht in (Weaver, Hatton et al. 2007,

Geginat, Paroni et al. 2013))(Abbildung 1). Neuere Studien ermöglichen zudem eine

Unterscheidung der verschiedenen Th Zellpopulationen anhand der Expression

verschiedener oberflächengebundener Chemokinrezeptoren, zusätztlich zu den

sekretierten Zytokinen und Transkriptionsfaktoren.

Th1 Zellen gehören zu den wichtigsten Zellen, die durch die Sekretion von Zytokinen

eine Immunantwort steuern. Die Zytokine Interferon (IFN)γ und Tumor-Nekrose-Faktor

(TNF)α aktivieren eine große Zahl weiterer Zellen, z.B. aktivieren sie Makrophagen, die

intrazelluläre Bakterien und Viren zerstören, und sie fördern die IL-12 Produktion durch

DC (Dalton, Pitts-Meek et al. 1993, Huang, Hendriks et al. 1993). Th1 Zellen entstehen

in der Anwesenheit von IL-12, welches die Aktivierung von signal transducer and

activator of transcription (STAT)4 bewirkt. Daraufhin exprimieren die Zellen den

Transkriptionsfaktor Tbet (Szabo, Kim et al. 2000, Trinchieri, Pflanz et al. 2003). Durch

die Aktivierung der DC wird eine weitere Th1-Antwort potenziert. Tbet selbst bewirkt die

Expression von CXC-Chemokin-Rezeptor (CXCR)3, das den Th1 Zellen ermöglicht in

periphere Gewebe einzuwandern (Rivino, Messi et al. 2004, Lord, Rao et al. 2005).

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Einleitung

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Abbildung 1: Komplexität der Th Zellpopulationen und regulatorischen T-Zellen. Naive CD4

+ T-Zellen können nach Aktivierung im Kontext verschiedener Zytokine zu

zahlreichen Th Zell-Populationen differenzieren. Die Th Zellen sind durch die Expression von spezifischen Transkriptionsfaktoren, Chemokinrezeptoren und durch die Sekretion von Zytokinen gekennzeichnet. Abbildung aus Geginat et al. (Geginat, Paroni et al. 2013).

Während Th1 Zellen notwendig sind, um eine effektive Immunantwort gegen

intrazelluläre Bakterien und Viren zu generieren (Fietta and Delsante 2009), haben Th2

Zellen die Aufgabe eine Infektion durch extrazelluläre Parasiten zu bekämpfen. Th2

Zellen wird zudem eine entscheidende Rolle bei der Ausbildung von allergischen

Reaktionen, wie Asthma zugeschrieben (Übersicht in (Romagnani 1994)). Die

Aktivierung von naiven CD4+ T-Zellen in der Gegenwart von IL-4 führt zur Entstehung

von Th2 Zellen, die einerseits durch die Expression des Transkriptionsfaktors GATA-3

und durch die Sekretion von IL4, IL-5, IL-13 charakterisiert sind (Zheng and Flavell

1997, Lantelme, Mantovani et al. 2001). Zudem zeichnen sich humane Th2 Zellen

durch eine selektive Expression des Prostaglandin D2 Rezeptors (CRTh2) aus (Messi,

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Einleitung

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Giacchetto et al. 2003, De Fanis, Mori et al. 2007). Th17 Zellen entstehen durch die

Aktivierung von naiven CD4+ T-Zellen in der Anwesenheit von transforming growth

factor (TGF)-β und IL-6 (Veldhoen, Hocking et al. 2006), aber auch IL-1β, IL-21 und IL-

23 spielen eine Rolle bei der Th17 Zell-Differenzierung (Korn, Bettelli et al. 2007,

Shainheit, Smith et al. 2008). Th17 Zellen exprimieren den Transkriptionsfaktor RORC,

sekretieren IL-17 und sind durch Oberflächenrezeptoren CC-Chemokin-Rezeptor

(CCR)6, sowie teilweise durch CD161 und CCR4 gekennzeichnet (Maggi, Santarlasci

et al. 2010). Zusätzlich zu den Th1, Th2 und Th17 Zellen wurden weitere Th Zellen

identifiziert. Sie sind jedoch weit weniger umfangreich charakterisiert. So wurde im

Zusammenhang mit chronischen Entzündungen die Entstehung von Th1/17 Zellen

beschrieben, die gleichzeitig IFNγ und IL-17 produzieren (Cosmi, Cimaz et al. 2011,

Hirota, Duarte et al. 2011). Des Weiteren wurden Th Zellen untersucht, die selektiv die

Zytokine IL-22 (Th22) bzw. IL-9 (Th9) sekretieren (Veldhoen, Uyttenhove et al. 2008,

Trifari, Kaplan et al. 2009).

1.2.4 Regulatorische T-Zellen

Während die bereits beschriebenen Th Zellen die Entstehung einer

Entzündungsreaktion unterstützen, sind regulatorische T-Zellen (Treg) notwendig um

eine Entzündung zu beenden, bzw. deren Induktion zu verhindern. Zum einen können

Treg direkt im Thymus entstehen. Sie werden als Thymus-induzierte Treg (tTreg)

bezeichnet. Zum anderen sind weitere suppressive T-Zellen beschrieben, die erst nach

der Aktivierung in der Peripherie aus naiven CD4+ T-Zellen entstehen, dazu zählen Th3

Zellen, Typ 1 regulatorische (Tr1) Zellen und Peripherie-induzierte T-Zellen (pTreg)

(Übersicht in (Maloy and Powrie 2001, Read and Powrie 2001, Bopp, Jonuleit et al.

2007, Geginat, Paroni et al. 2013))(Abbildung 1).

Naive Treg aus dem Thymus können durch die Expression von CD45RA oder CD31

identifiziert werden, während bei Treg, die bereits Antigenkontakt hatten, nicht mehr

zwischen tTreg und pTreg unterschieden werden kann (Hoffmann, Eder et al. 2006,

Kohler and Thiel 2009, Miyara, Yoshioka et al. 2009). Die Expression des

Transkriptionsfaktors Helios wurde initial als Nachweis für tTreg beschrieben,

mittlerweile wird diese Zuordnung jedoch stark diskutiert (Thornton, Korty et al. 2010,

Himmel, MacDonald et al. 2013). Der aktuell meist verwendete Marker für Treg ist der

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Einleitung

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Transkriptionsfaktor Forkhead box P3 (FoxP3) (Fontenot, Gavin et al. 2003, Hori,

Nomura et al. 2003). Innerhalb des FoxP3 Genlokus existiert eine evolutionär sehr

stark konservierte Region, die Treg-specific demethylated region (TSDR). Die

Demethylierung der TSDR ist essentiell für eine stabile FoxP3 Expression und damit

für die suppressive Funktion der Treg (Baron, Floess et al. 2007, Polansky, Kretschmer

et al. 2008, Toker, Engelbert et al. 2013). Über die zelloberflächengebundenen

Rezeptoren CD25 und CD127 kann eine Anreicherung der Treg z.B. aus dem

peripheren Blut erfolgen (Sakaguchi, Sakaguchi et al. 1995, Sakaguchi, Sakaguchi et

al. 2001, Banham 2006). CD25 wird zwar auch von aktivierten Helfer- bzw. Gedächtnis

T-Zellen exprimiert, bei Treg hingegen ist das sonst hoch exprimierte CD127

herunterreguliert.

Tr1 Zellen sind im Gegensatz zu tTreg oder pTreg negativ für FoxP3. Ein Tr1-spezifischer

Transkriptionsfaktor ist bisher noch nicht identifiziert, sie zeichnen sich aber durch die

Sekretion von IL-10 und suppressive Funktion aus (Übersicht in (Battaglia, Gregori et

al. 2006)). Die Transkriptionsfaktoren cMaf (Apetoh, Quintana et al. 2010), Aryl-

Hydrocarbon-Rezeptor (AHR) (Gandhi, Kumar et al. 2010) und Blimp1 (Cretney, Xin et

al. 2011, Iwasaki, Fujio et al. 2013, Neumann, Heinrich et al. 2014) wurden im

Zusammenhang mit der Regulation der Il-10 Expression bei T-Zellen beschrieben. Die

Expression der Oberflächenmoleküle CD49b und Lag-3, sowie CD226 wurde auf

humanen und murinen Tr1 Zellen nachgewiesen (Okamura, Fujio et al. 2009, Magnani,

Alberigo et al. 2011, Gagliani, Magnani et al. 2013). Bei der Differenzierung von Tr1

Zellen spielt die Anwesenheit von Il-10 (Groux, O'Garra et al. 1997, Levings, Gregori et

al. 2005) oder IL-27 (Batten, Kljavin et al. 2008, Murugaiyan, Mittal et al. 2009) eine

Rolle.

Eine weitere Gruppe der regulatorischen T-Zellen stellen die Th3 Zellen dar (Wu,

Quintana et al. 2008). Sie produzieren hauptsächlich TGFβ und sind im Darm eine

relevante Quelle von TGFβ. Sie bilden inaktives TGFβ in Form von latency associated

peptide (LAP), welches über glycoprotein A repetitions predominant (GARP) an der

Zelloberfläche gebunden wird und schließlich von DC in aktives TGFβ umgewandelt

werden kann (Travis, Reizis et al. 2007, Tran, Andersson et al. 2009).

Page 15: Modulation von CD4+ T-Zellen durch Lebersinusendothelzellen · 2008, Takada and Jameson 2009, Sprent and Surh 2011)). Die hauptsächliche Ausbildung des T-Zell-Repertoires findet

Einleitung

15

1.2.5 Gewebespezifische Migration von T-Zellen

Abhängig von ihrem Aktivierungs- und Differenzierungsstatus durchlaufen T-Zellen eine

ständige Rezirkulation vom Blut ins Gewebe und über die Lymphflüssigkeit zurück in

den Blutkreislauf (Übersicht in (Gowans and Knight 1964, Gowans 1966, Sprent

1973)). Naive T-Zellen migrieren präferentiell in sekundäre lymphatische Organe, wo

sie nach antigenbeladenen DC suchen, die sie aktivieren. Anschließend unterstützen

sie B-Zellen dabei Antikörper zu produzieren (Übersicht in (Sallusto, Geginat et al.

2004, Geginat, Paroni et al. 2013)) oder wandern bei einer Entzündung in periphere

Gewebe ein bzw. halten sich permanent im Gewebe auf, um bei einer Reinfektion

sofort eine Immunreaktion zu initiieren (Übersicht in (Sheridan and Lefrancois 2011,

Shin and Iwasaki 2013)). Die Migrationseigenschaften der T-Zellen werden dabei durch

die Expression spezifischer Homingrezeptoren bestimmt, dazu zählen

Adhäsionsmoleküle und Chemokinrezeproren auf den T-Zellen und die

korrespondierenden Chemokine und Adhäsionsmoleküle auf den Endothel- bzw.

Epithelzellen der Zielgewebe (Übersicht in (Salmi and Jalkanen 1997, Butcher,

Williams et al. 1999))(Dudda, Lembo et al. 2005). Die Induktion von bestimmten

Homingrezeptoren wird dabei von den APC und den Umgebungsbedingungen

reguliert.

Die Einwanderung in sekundäre lymphatische Organe wird durch die

Homingrezeptoren CD62L und CCR7 bestimmt. Diese Oberflächenmoleküle werden

hauptsächlich von naiven T-Zellen exprimiert, es ist aber auch eine Expression durch

Subpopulationen von Gedächtnis- und regulatorischen T-Zellen bekannt (Sallusto,

Lenig et al. 1999, Huehn, Siegmund et al. 2004, Ermann, Hoffmann et al. 2005). Die

Hochendothelvenolen der lymphatischen Organe exprimieren die Moleküle peripheral

lymph node addressin (PNAd) und CC-Chemokin-Ligand (CCL)21, die die T-Zellen

über ihre exprimierten Rezeptoren erkennen (Stein, Rot et al. 2000).

Die Aktivierung von T-Zellen durch DC aus der Haut induziert die Expression von

Homingrezeptoren, die eine Einwanderung in Hautgewebe ermöglichen (Dudda,

Lembo et al. 2005, Mora, Cheng et al. 2005). Auf den T-Zellen werden dabei die

Oberflächenmoleküle E-Selektin-Ligand (E-Lig), P-Selektin-Ligand (P-Lig) (Picker,

Kishimoto et al. 1991, Tietz, Allemand et al. 1998), CCR4 bzw. CCR10 (Campbell,

Page 16: Modulation von CD4+ T-Zellen durch Lebersinusendothelzellen · 2008, Takada and Jameson 2009, Sprent and Surh 2011)). Die hauptsächliche Ausbildung des T-Zell-Repertoires findet

Einleitung

16

Haraldsen et al. 1999, Morales, Homey et al. 1999, Reiss, Proudfoot et al. 2001)

hochreguliert. In den postkapillären Venolen der Haut sind bei Entzündung die

entsprechenden Rezeptoren bzw. Liganden wie E-Selektin, P-Selektin (Weninger,

Ulfman et al. 2000), CCL17 (Campbell, Haraldsen et al. 1999) und CCL27 (Homey,

Alenius et al. 2002) exprimiert.

Dendritische Zellen aus den mesenterialen Lymphknoten (mLN) und Peyerschen

Plaques (PP) sind wiederum in der Lage, bei der Aktivierung von T-Zellen darm-

spezifische Homingrezeptoren zu induzieren, die eine entsprechende Migration der T-

Zellen in das Darmgewebe und das darmassoziierte lymphatische Gewebe (GALT)

ermöglichen (Stagg, Kamm et al. 2002, Mora, Bono et al. 2003). Auf den Darm DC-

aktivierten T-Zellen erfolgt die Hochregulation von α4β7-Intergrin und CCR9 (Hamann,

Andrew et al. 1994, Wagner, Lohler et al. 1996, Zabel, Agace et al. 1999, Papadakis,

Prehn et al. 2000). Die Expression der Oberflächenmoleküle mucosal addressin cell

adhesion molecule-1 (MAdCAM-1) und CCL25 durch die postkapillären Venolen der

Lamina propria und Dünndarmepithelzellen, sowie durch die Hochendothelvenolen der

mLN resultiert in einer Rekrutierung der entsprechenden T-Zellen (Nakache, Berg et

al. 1989, Briskin, Winsor-Hines et al. 1997, Kunkel, Campbell et al. 2000, Papadakis,

Prehn et al. 2000, Wurbel, Philippe et al. 2000). Für die Induktion von α4β7-Intergrin

und CCR9 ist die Anwesenheit von Retinolsäure (retinoic acid; RA) entscheidend

(Iwata, Hirakiyama et al. 2004, Svensson, Johansson-Lindbom et al. 2008). Die

Blockade von α4β7-Intergrin wiederum verhindert ein Einwandern der T-Zellen in den

Darm und somit auch die Entstehung einer Entzündung durch Effektor-T-Zellen

(Hamann, Andrew et al. 1994, Feagan, Greenberg et al. 2005, Sandborn, Colombel et

al. 2005).

1.3 Leber als immunologisches Organ

1.3.1 Aufbau der Leber

Die Leber ist eines der größten Organe des menschlichen Körpers und prozessiert

sowohl das nährstoffreiche Blut vom Verdauungstrakt kommend, als auch das arterielle

Blut, welches die Leber über die Leberarterie erreicht. Die Leber ist aus einer Vielzahl

Page 17: Modulation von CD4+ T-Zellen durch Lebersinusendothelzellen · 2008, Takada and Jameson 2009, Sprent and Surh 2011)). Die hauptsächliche Ausbildung des T-Zell-Repertoires findet

Einleitung

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von Lobuli aufgebaut. Diese Untereinheit ist hexagonal strukturiert und in den Ecken

befinden sich die sogenannten Portalfelder, in denen jeweils ein Gefäß der

Leberarterie, Pfortader und Gallengang mündet (Abbildung 2 A).

Abbildung 2: Schematischer Aufbau der Leber. Hexagonale Struktur des Leberlobulus mit der Zentralvene im Zentrum und den Portalfeldern in den Ecken (A). Arterielles und venöses Blut vereint sich in den Sinusoiden und mündet in der Zentralvene. Modifiziert nach Cunningham (Cunningham and Van Horn 2003). Längsschnitt eines Lebersinusoids mit angrenzendem Parenchym und enthaltenen Zellpopulationen (B). Modifiziert nach Lalor und Adams (Lalor and Adams 2002).

In den Mikrogefäßen, den Sinusoiden, mischt sich arterielles und venöses Blut. Daraus

resuliert ein niedriger Sauerstoffgehalt und eine niedgrige und irreguläre

Fließgeschwindigkeit des Blutstroms (Thomson and Knolle 2010, Benseler and Schlitt

2011). Das Blut in den Sinusoiden mündet über die Zentralvene in die Vena cava

inferior und schließlich wieder in den systemischen Kreislauf. Die Leber besteht

hauptsächlich aus plattenförmig angeordneten Hepatozyten, die zusammmen das

Parenchym bilden (Abbildung 2 B). Die Gefäße sind aus Lebersinusendothelzellen

Page 18: Modulation von CD4+ T-Zellen durch Lebersinusendothelzellen · 2008, Takada and Jameson 2009, Sprent and Surh 2011)). Die hauptsächliche Ausbildung des T-Zell-Repertoires findet

Einleitung

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(LSEC) aufgebaut und zeichnen sich weiterhin durch eine fehlende Basalmembran aus

(Fraser, Dobbs et al. 1995). Direkt unterhalb der LSEC befinden sich, im Disse´schen

Raum gelegen, die Sternzellen. Über die Fenestrae der LSEC können die Hepatozyten

und die Sternzellen über zelluläre Ausläufer und Moleküle im Austausch mit den Zellen

im Lumen des Gefäßes stehen. Innerhalb der Sinusoide, vor allem im Bereich der

Portalfelder, sind sessile Makrophagen der Leber, die Kupffer Zellen lokalisiert. Weitere

nicht parenchymatische Zellen sind die DC, NK-Zellen und Natürliche Killer-T (NKT)-

Zellen.

1.3.2 Immunologische Funktionen der Leber

Die Leber besitzt neben ihren metabolischen Aufgaben auch entscheidende

immunologische Funktionen (Übersicht in (Crispe 2009, Benseler and Schlitt 2011,

Protzer, Maini et al. 2012)). Für das angeborene Immunsystem spielt die Erkennung

von PAMP eine entscheidende Rolle. Die Leber ist zahlreichen Stimulanzien, z.B. von

Enterobakterien ausgesetzt, welche über die Pfortader in das Organ gelangen und

über PRR der Leberzellen erkannt werden. Über oberflächen- oder endosomal-

exprimierte Toll-like Rezeptoren (TLR) können Leberzellen ein breites Spektrum an

bakteriellen und viralen Molekülen erfassen und bakterielle Lipoproteine (TLR 1, 2),

Lipopolysaccharide (LPS; TLR 4), Flagellin (TLR 5), doppelsträngige RNA (TLR 3),

virale einzelsträngige RNA (TLR 7, 8) und bakterielle unmethylierte DNA (TLR 9)

erkennen und dadurch aktiviert werden. LSEC und Kupffer Zellen exprimieren TLR 4

und binden LPS, das in hohen Konzentrationen in der Leber vorliegt, und verhindern

so, dass es in die systemische Zirkulation gelangt (Catala, Anton et al. 1999). Weiterhin

nehmen die Zellen über Scavenger Rezeptoren und Mannose Rezeptoren Toxine und

Abbauprodukte aus dem sinusoidalen Blut auf und bauen diese ab (Übersicht in

(Thomson and Knolle 2010)). Kupffer Zellen produzieren zudem während einer

Entzündung Faktoren des Komplementsystems, Akute-Phase Proteine und

phagozytieren Mikroorganismen, apoptotische Zellen und Zelltrümmer (Naito,

Hasegawa et al. 2004). In der Leber akkumulierten aktivierte T-Zellen und werden

entweder moduliert oder deletiert (Mehal, Juedes et al. 1999, Mehal, Azzaroli et al.

2001, Crispe 2003, Crispe 2009). Unter homöostatischen Bedingungen sind Leber DC

und Kupffer Zellen tolerant und bewirken eine Inhibition der T-Zellaktivierung und der

Bildung pro-inflammatorischer Zytokine (Bissell, Wang et al. 1995, Xia, Guo et al.

Page 19: Modulation von CD4+ T-Zellen durch Lebersinusendothelzellen · 2008, Takada and Jameson 2009, Sprent and Surh 2011)). Die hauptsächliche Ausbildung des T-Zell-Repertoires findet

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2008). Die Frequenz von NK-Zellen und NKT-Zellen ist in der Leber im Vergleich zu

anderen Geweben stark erhöht (Norris, Collins et al. 1998, Crispe 2001, Tu,

Bozorgzadeh et al. 2007). NK-Zellen induzieren Apoptose in infizierten Zielzellen über

verschiedene Mechanismen, wie der Fas/Fas-L Weg, TRAIL/TRAIL-R Weg und

Granzym bzw. Perforin (Nakatani, Kaneda et al. 2004, Dunn, Brunetto et al. 2007).

NKT-Zellen ähneln den NK-Zellen, sie exprimieren jedoch zusätzlich einen invarianten

T-Zellrezeptor, der über CD1d präsentierte Glycolipidantigene erkennt. Werden NKT-

Zellen über ihre PAMPs oder TCR aktiviert, so werden sie hoch zytotoxisch und

sekretieren TNFα, IFNγ und IL-4 (Kaneko, Harada et al. 2000, Biburger and Tiegs

2005, Chen, Duan et al. 2012).

Eine weitere wichtige Aufgabe der Leber besteht darin, orale Toleranz gegen

Nahrungsantigene zu induzieren. Wird die venöse Blutzufuhr vom Darm unterbrochen,

resultiert dies in einer Aufhebung der Toleranz (Yang, Liu et al. 1994). Ausführlich

beschrieben ist auch die Vermittlung von peripherer Toleranz, also der Schutz vor

potentiell autoreaktiven T-Zellen. Lebertransplantate werden besser akzeptiert, als

andere Organe und die simultane Transplantation von Leber und einem weiteren

Organ vermindert dessen Risiko einer Abstoßung (Calne, Sells et al. 1969, Kamada,

Davies et al. 1981, Rasmussen, Davies et al. 1995). Als mögliche Mechanismen

werden sowohl die Suppression durch programmed death ligand (PD-L)1 und IL-10,

die Depletion allo-reaktiver T-Zellen, als auch die Präsenz von regulatorischen T-Zellen

in der Leber diskutiert (Li, Carper et al. 2006, Jinushi, Takehara et al. 2007, Tay, Lu et

al. 2013).

1.4 Regulation von Immunantworten

Im Rahmen einer effektiven Immunantwort gegen Pathogene ist es von entscheidender

Bedeutung, dass eine Entzündungsreaktion nach erfolgreicher Bekämpfung des

Pathogens beendet wird, um Gewebsschädigung und die Entstehung von

Autoimmunität zu verhindern. Andererseits ist es essentiell, dass die Zellen des

Immunsystems nicht gegen körpereigene und nicht-pathogene Antigene reagieren,

sondern stattdessen Toleranz gegenüber diesen Antigenen entwickeln.

Page 20: Modulation von CD4+ T-Zellen durch Lebersinusendothelzellen · 2008, Takada and Jameson 2009, Sprent and Surh 2011)). Die hauptsächliche Ausbildung des T-Zell-Repertoires findet

Einleitung

20

1.4.1 Suppression durch regulatorische T-Zellen

Regulatorische T-Zellen haben die Fähigkeit Immunreaktionen zu unterdrücken. So

konnte zum einen gezeigt werden, dass eine Depletion von Treg mit der Entstehung von

Autoimmunerkrankungen einhergeht (Sakaguchi, Sakaguchi et al. 1995, McHugh and

Shevach 2002). Defekte in der FoxP3 Expression von Treg sind im Menschen mit der

Ausbildung des immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, and X-linked

(IPEX) Syndroms verbunden und führen zur Ausbildung zahlreicher Autoimmun-

erkrankungen (Powell, Buist et al. 1982, Wildin, Ramsdell et al. 2001). Andererseits

wurde vielfach experimentell gezeigt, dass der adoptive Transfer von Treg

Autoimmunerkrankungen unterdrücken kann. Diese Ansätze wurden bereits in

klinischen Versuchen getestet (Marek-Trzonkowska, Mysliwiec et al. 2014, Martelli, Di

Ianni et al. 2014).

Die Suppression von Treg kann über verschiedene Effektormechanismen vermittelt

werden (Übersicht in (Sakaguchi 2004, Wing and Sakaguchi 2012). Treg exprimieren

cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4 (CTLA-4), das wichtig ist für deren

regulatorischen Eigenschaften (Wing, Onishi et al. 2008). CTLA-4 induziert die

Transzytose und den Abbau der kostimulatorischen Rezeptoren CD80 und CD86 auf

APC und reduziert damit die Fähigkeit dieser Zellen T-Zellen zu aktivieren (Qureshi,

Zheng et al. 2011).

Die Treg zeichnen sich durch eine hohe Oberflächenexpression des hochaffinen IL-2

Rezeptors (CD25) aus. IL-2 ist ein essenzieller Wachstumsfaktor für T-Zellen. Über

CD25 können Treg effektiv IL-2 aus der Umgebung binden und somit den Effektorzellen

entziehen und deren weitere Proliferation unterbinden (de la Rosa, Rutz et al. 2004,

Scheffold, Huhn et al. 2005).

Die Sekretion von IL-10 durch Treg spielt eine entscheidende Rolle bei der Kontrolle der

T-Zell-Homöostase (Annacker, Pimenta-Araujo et al. 2001) und bei der Regulation von

auto-reaktiven Erkrankungen (Uhlig, Coombes et al. 2006). Weiterhin sind die

Bereitstellung von TGFβ und die daraus resultierende Suppression von NK-Zellen und

DC durch Treg untersucht (Nakamura, Kitani et al. 2004, Ghiringhelli, Menard et al.

2005).

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Einleitung

21

Weitere Analysen zeigen, dass Treg durch die Sekretion von Granzym und Perforin

Apoptose in Zielzellen auslösen können (Grossman, Verbsky et al. 2004, Gondek, Lu

et al. 2005, Boissonnas, Scholer-Dahirel et al. 2010). Sie nehmen damit Eigenschaften

an, die charakteristisch für zytotoxische CD8+ T-Zellen und NK-Zellen sind. In diesem

Zusammenhang wird auch die Expression von Th spezifischen Markerproteinen durch

Treg beschrieben (Übersicht in (Wing and Sakaguchi 2012, Geginat, Paroni et al.

2013)). Treg exprimieren neben FoxP3 Th-spezifische Transkriptionsfaktoren, Zytokine

und damit auch die korrespondierenden Homingrezeptoren (Jankovic, Kullberg et al.

2007, Esplugues, Huber et al. 2011, Wang, Su et al. 2011). Es wird vermutet, dass die

Treg auf die gleichen differenzierenden Bedingungen reagieren, wie die Th Zellen und

dadurch die Fähigkeit besitzen, in die entsprechenden Gewebe einzuwandern, um dort

die Th Zellen zu supprimieren.

1.4.2 Das immunsuppressive Zytokin IL-10

IL-10 stellt das wichtigste anti-inflammatorische Zytokin dar, das pro-inflammatorische

Immunantworten sowohl des angeborenen als auch des adaptiven Immunsystems

unterdrücken kann (Übersicht in (Ouyang, Rutz et al. 2011, Shouval, Ouahed et al.

2014)). Die Rolle des Zytokins für die Aufrechterhaltung der peripheren Toleranz wird

dadurch untermauert, dass IL-10- bzw. IL-10 Rezeptor-Defizienz in Menschen und

Mäusen zur Entstehung schwerer intestinaler Entzündungen führt (Kuhn, Lohler et al.

1993, Glocker, Kotlarz et al. 2009, Kotlarz, Beier et al. 2012, Moran, Walters et al.

2013). Auch kann ein Mangel an endogenem IL-10 bei einer Infektion eine lethale

Immunpathologie auslösen (Gazzinelli, Wysocka et al. 1996). Wurde hingegen Mäusen

in einer Transfercolitis rekombinantes IL-10 injiziert, so konnten diese vor einer

Darmentzündung geschützt werden (Powrie, Leach et al. 1994).

IL-10 besteht aus 178 Aminosäuren und zwischen der humanen und murinen Form

besteht eine Sequenzhomologie von ca. 73 % (Windsor, Syto et al. 1993). Das Zytokin

wird über den IL-10 Rezeptor (IL-10R) gebunden, welcher aus zwei Untereinheiten,

dem IL-10Rα und IL-10Rβ, besteht (Yoon, Logsdon et al. 2006). Die suppressive

Funktionsweise von IL-10 beruht unter anderem auf der Inhibition der

Zytokinsekrektion sowie der Expression von MHCII und kostimulatorischen Rezeptoren

auf Makrophagen und DC (de Waal Malefyt, Abrams et al. 1991, Ding, Linsley et al.

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1993, Allavena, Piemonti et al. 1998). Weiterhin sind die Unterdrückung der Reifung

von DC aus Vorläuferzellen und eine direkte Wirkung auf T-Zellen beschrieben.

IL-10 verhindert T-Zell-vermittelte Immunreaktionen, die durch die Erkennung von

endogenen Bakterien durch APC im Darm ausgelöst werden und damit verbundene

Entzündungen und Gewebezerstörung. Im Darm wird IL-10 von CD11b+ myeloiden

Zellen (Murai, Turovskaya et al. 2009) und Makrophagen (Kamada, Hisamatsu et al.

2005) produziert. Interessanterweise tragen die Zellen damit auch zur Differenzierung

und Funktion von Treg bei (Murai, Turovskaya et al. 2009, Liu, Tonkonogy et al. 2011).

Reaktionen von Zellen des angeborenen Immunsystems im Darm sind hauptsächlich

gegen Enterobakterien gerichtet. Die Zellen erkennen die Pathogene über ihre PRR.

Werden Sie aktiviert, so wird das Signal über MyD88 weitergeleitet und die Expression

von pro-inflammatorischen Zytokinen wird induziert. Fehlt MyD88 in IL-10-defizienten

Mäusen, so kommt es nicht zu Ausbildung einer Darmentzündung (Rakoff-Nahoum,

Hao et al. 2006, Hoshi, Schenten et al. 2012).

Unter homöostatischen Bedingungen exprimieren Treg aus der Milz und den mLN nur

wenig IL-10, wohingegen Treg aus der Lamina propria zu einem hohen Anteil IL-10

exprimieren (Maloy, Salaun et al. 2003, Uhlig, Coombes et al. 2006, Tiittanen,

Westerholm-Ormio et al. 2008). Eine Deletion der IL-10 Expression in Treg unterstützt

die Ausbildung einer Colitis (Rubtsov, Rasmussen et al. 2008). Ursprünglich wurde IL-

10 in Th2 Zellen identifiziert (Fiorentino, Bond et al. 1989). Mittlerweile ist aber auch die

IL-10 Expression in Th1 und Th17 Zellen beschrieben wurden. IL-10 kann die

Proliferation dieser pro-inflammatorischen Th Zellen inhibieren und damit zu T-Zell

Homöostase beitragen (McGeachy, Bak-Jensen et al. 2007, Rutz, Janke et al. 2008,

Saraiva, Christensen et al. 2009). Die Expression von IL-10 in B-Zellen unter chronisch

entzündlichen Bedingungen induziert regulatorische Eigenschaften und supprimiert

Entzündungsreaktionen (DiLillo, Matsushita et al. 2010, Carter, Rosser et al. 2012).

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Einleitung

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1.5 Notch-Signalweg

1.5.1 Notch-Rezeptor und seine Liganden

Der Notch-Signalweg ist evolutionär hoch konserviert und spielt eine entscheidende

Rolle bei der Zelldifferenzierung in verschiedensten Geweben, während der

embryonalen und postnatalen Entwicklung (Übersicht in (Artavanis-Tsakonas, Rand et

al. 1999, Milner and Bigas 1999, Maillard, Fang et al. 2005). Entdeckt wurde Notch in

Drosophila melanogaster und hat dort einen Einfluss auf neuronale und epidermale

Zelldifferenzierungsprozesse (Weinmaster, Roberts et al. 1991).

Die Notch-Rezeptoren gehören zur Familie der Typ I Transmembranrezeptoren. In

Säugetieren sind vier Notch-Rezeptoren (Notch1, -2, -3, -4) und fünf -liganden bekannt,

die der Delta-like (Dll; Dll1, -3, -4)) bzw. Jagged (Jagged1, -2) Familie zuzuordnen sind

(Übersicht in (Radtke, Fasnacht et al. 2010, Radtke, MacDonald et al. 2013). Die

Signalweiterleitung scheint durch die hohe Zahl an Rezeptoren und Liganden eine

hohe Redundanz aufzuweisen, dennoch variiert die Interaktion spezifischer Ligand-

Rezeptor-Paarungen in verschiedenen Geweben (Shimizu, Chiba et al. 1999, Shimizu,

Chiba et al. 2000, Shimizu, Chiba et al. 2000). Besonders anschaulich wird die hohe

Relevanz der einzelnen Komponenten dadurch, dass eine Defizienz der Rezeptoren

Notch1 (Swiatek, Lindsell et al. 1994) und Notch2 (Hamada, Kadokawa et al. 1999), als

auch der Liganden Jagged1 (Xue, Gao et al. 1999), Jagged2 (Jiang, Lan et al. 1998)

und Dll1 (Hrabe de Angelis, McIntyre et al. 1997) embryonal oder perinatal lethal sind.

Bei Dll4 ist selbst ein heterozygoter Genotyp embryonal lethal (Gale, Dominguez et al.

2004). Notch und seine Liganden sind membrangebunde Proteine und eine Aktivierung

des Rezeptors findet bei direktem Zell-Zell-Kontakt benachbarter Zellen statt.

Untereinheiten des Notch-Rezeptors fungieren dabei als Transkriptionsfaktoren und

stellen somit eine sehr direkte Signalweiterleitung sicher (Übersicht in (Baron, Aslam et

al. 2002, Kopan 2002)). Die Bindung eines Liganden führt zunächst zur Abspaltung der

extrazellulären Notch Domäne durch ADAM Proteasen und anschließend zur

Abspaltung der intrazellulären Domäne von der Zellmemran durch γ-Sekretase (Kopan,

Schroeter et al. 1996, Schroeter, Kisslinger et al. 1998). Die Domäne kann mittels

zweier Kernlokalisationssequenzen direkt in den Zellkern wandern und dort mit DNA-

bindenden Proteinen (RBPJ) interagieren, die sonst als Transkriptionsrepressoren

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agieren. In der Folge wird aus dem Suppressorkomplex ein Transkriptionsaktivator und

die Expression mehrerer Notch-Zielgene wie hairy/enhancer of split (Hes)-1 und

Deltex-1 wird induziert (Bailey and Posakony 1995, Hori, Fostier et al. 2004).

1.5.2 Einfluss des Notch-Signalweges auf die T-Zell-Differenzierung

Dem Notch-Signalweg wird eine große Rolle während der T-Zell-Entwicklung

zugesprochen. (Radtke, Fasnacht et al. 2010, Radtke, MacDonald et al. 2013). So sind

dessen Rezeptoren und Liganden bei der Entwicklung von Vorläuferzellen im

Knochenmark, bei der Differenzierung von T-Zellen im Thymus und bei der

Entwicklung von Th- und Effektor-Zellen in der Peripherie von entscheidender

Bedeutung. Durch die Gruppe um R. Flavell wurde erstmals ein Zusammenhang

zwischen der Expression der einzelnen Notch-Liganden auf APC und der Entwicklung

von Th1 und Th2 Zellen hergestellt (Amsen, Blander et al. 2004). Weitere Sudien

untermauerten die Aussagen, dass die Bindung von Dll-Liganden die Entwicklung von

IFNγ-produzierenden Th1 Zellen fördert, während eine Bindung der Jagged-Liganden

die Entwicklung von Th2 und Treg Zellen unterstützt (Übersicht in (Amsen, Antov et al.

2009, Auderset, Coutaz et al. 2012)).

Die Rolle des Notch-Signalwegs für die Th1 Differenzierung wurde mittels Blockade der

γ-Sekretase durch γ-Sekretase-Inhibitor (GSI) in Th1-vermittelten Mausmodel der

Experimentellen Autoimmunencephalitis untersucht, wobei der Krankheitsverlauf

dadurch gemildert war (Minter, Turley et al. 2005, Jurynczyk, Jurewicz et al. 2008). Es

wurde zudem die Hypothese aufgestellt, dass Notch1 an eine RBPJ-Bindestelle im

Tbet Promotor bindet, die jedoch in folgenden Studien nicht belegt werden konnte.

RBPJ knockout (ko) in T-Zellen führte nicht zu einer verminderten Th1 Antwort (Fang,

Yashiro-Ohtani et al. 2007, Auderset, Schuster et al. 2012). Für die Th1 Differenzierung

scheint eine Bindung der intrazellulären Notch Domäne an RBPJ nicht notwendig zu

sein, alternativ sind Untereinheiten des NF-κB Transkriptionsfaktors involviert (Shin,

Minter et al. 2006).

Der Einfluss von Notch auf die Th2 Differenzierung wurde in zahlreichen

experimentellen Mausmodellen untersucht und ist, im Gegensatz zu Th1 Zellen,

abhängig von der Bindung an RBPJ (Tanaka, Tsukada et al. 2006, Amsen, Antov et al.

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Einleitung

25

2007). Weiterhin konnte gezeigt werden, dass sich RBPJ Bindestellen im IL-4

enhancer Element befinden und auf einen direkten Einfluss des Notch-Signalwegs für

die IL-4 Transkription schließen lassen. Zudem wurde nachgewiesen, dass Notch an

den Gata3 Promotor, den Haupttranskriptionsfaktor von Th2 Zellen, bindet (Zheng and

Flavell 1997).

Die Entwicklung von Treg im Thymus und in der Peripherie, sowie deren suppressive

Eigenschaften sind durch den Notch-Signalweg beeinflusst. Notch 3 fördert die

Entwicklung und suppressive Funktion von Treg durch Verstärkung der FoxP3

Expression (Campese, Grazioli et al. 2009, Barbarulo, Grazioli et al. 2011). Einen

positiven Einfluss von Notch auf die nachhaltige FoxP3 Expression in Treg wurde auch

in humanen Zellen bestätigt (Del Papa, Sportoletti et al. 2013). Die Expression von

Jagged2 auf hämatopoetischen Vorläuferzellen unterstützt die Treg Expansion und

supprimiert die Ausbildung einer Autoimmun-Diabetes in Mäusen (Kared, Adle-

Biassette et al. 2006). Entgegengesetzt dazu führte eine Blockade von Dll4 mittels

Antikörper während einer EAE zu einer Erhöhung der Treg Frequenz und einer

Milderung der Pathogenese (Bassil, Zhu et al. 2011). Die Dll4 Blockade in einem

Diabetes Maus-Model resultierte ebenfalls in erhöhten Treg Zahlen und einer

Suppression der Entzündung (Billiard, Lobry et al. 2012). Eine Überexpression von

Jagged 1 auf APC verstärkt die Treg Differenzierung in vitro und in vivo (Hoyne, Le

Roux et al. 2000, Vigouroux, Yvon et al. 2003). Die Expression des anti-

inflammatorischen Zyokins IL-10 kann durch GSI blockiert werden (Benson, Adamson

et al. 2005). Zudem sind in der Promotorregion des IL-10 Gens RBPJ Bindestellen

vorhanden. Frühere Studien unserer Arbeitsgruppe zeigten, dass durch Notch IL-10 auf

Th1 Zellen induziert werden kann und dass vorrangig die Bindung von Dll4 für die IL-10

Expression verantwortlich ist (Rutz, Janke et al. 2008, Kassner, Krueger et al. 2010).

Neben der Differenzierung von T-Zellen wird Notch auch im Zusammenhang mit

Aktivierung, Proliferation und Zytokinsekretion von T-Zellen diskutiert (Übersicht in

(Osborne and Minter 2007). Dies wird zum einen durch eine Unterstützung der CD25

Expression und zum anderen durch eine Suppression von pro-apototischen Molekülen

vermittelt und resultiert in einer hohen Lebensdauer der Notch-aktivierten T-Zellen

(Adler, Chiffoleau et al. 2003, Helbig, Gentek et al. 2012).

Page 26: Modulation von CD4+ T-Zellen durch Lebersinusendothelzellen · 2008, Takada and Jameson 2009, Sprent and Surh 2011)). Die hauptsächliche Ausbildung des T-Zell-Repertoires findet

26

2. Zielsetzung

Page 27: Modulation von CD4+ T-Zellen durch Lebersinusendothelzellen · 2008, Takada and Jameson 2009, Sprent and Surh 2011)). Die hauptsächliche Ausbildung des T-Zell-Repertoires findet

Zielsetzung

27

Die Induktion von systemischer Toleranz ist eine der wichtigsten immunologischen

Eigenschaften der Leber. Die Leber trägt auf der einen Seite dazu bei eine

Immunreaktion gegen harmlose Antigene zu verhindern und auf der anderen Seite

begrenzt sie eine bestehende Immunantwort durch Modulation der Effektorzellen oder

durch Induktion regulatorischer T-Zellen. Die zugrundeliegenden Mechanismen und

der Einfluss der leberresidenten Zellpopulationen sind noch nicht vollständig aufgeklärt.

Ziel dieser Arbeit war es einen Beitrag zum Verständnis der Toleranzinduktion durch

die Interaktion von CD4+ T-Zellen mit Lebersinusendothelzellen zu leisten. Folgende

Fragestellungen wurden dabei näher betrachtet:

(1) Wie beeinflusst die antigenspezifische Antivierung von CD4+ T-Zellen durch LSEC

die Migrationseigenschaften der T-Zellen? Inwieweit unterscheiden sich LSEC und

LSEC-negative Leber APC (LAPC) hinsichtlich ihrer Fähigkeit gewebespezifische

Homingrezeptoren zu induzieren?

(2) Welchen Einfluß haben die antigenpräsentierenden Zellen der Leber auf die

Induktion von Apoptose und pro-inflammatorischen Zytokinen bei CD4+ T-Zellen?

(3) Haben regulatorische TLSEC die Fähigkeit die Proliferation und Zytokinexpression

von CD8+ T-Zellen zu supprimieren? Besitzen TLSEC einen regulatorischen Einfluss auf

eine T-Zell-vermittelte Darmentzündung?

(4) Welchen Phänotyp nehmen CD4+ T-Zellen an, die unter entzündlichen

Bedingungen durch LSEC aktiviert werden? Wie werden die funktionellen

Eigenschaften der T-Zellen beeinflusst und welche molekularen Mechanismen liegen

dem zugrunde?

Page 28: Modulation von CD4+ T-Zellen durch Lebersinusendothelzellen · 2008, Takada and Jameson 2009, Sprent and Surh 2011)). Die hauptsächliche Ausbildung des T-Zell-Repertoires findet

28

3. Material und Methoden

Page 29: Modulation von CD4+ T-Zellen durch Lebersinusendothelzellen · 2008, Takada and Jameson 2009, Sprent and Surh 2011)). Die hauptsächliche Ausbildung des T-Zell-Repertoires findet

Material und Methoden

29

3.1 Versuchstiere

Der Wildtypmausstamm (WT) C57BL/6 wurde von den Forschungseinrichtungen für

experimentelle Medizin (Charité Universitätsmedizin Berlin) oder von Charles River

(Sulzfeld) erworben. Der OVA-TCR-transgene Stamm OT-IIxB6PL (H-2b) (Barnden,

Allison et al. 1998), dessen TCR das OVA323-339-Peptid im Kontext von IAb/IAd erkennt

(Robertson, Jensen et al. 2000) und dessen T-Zellen zusätzlich CD90.1 positiv sind,

wurde vom Deutschen Rheumaforschungszentrum Berlin bezogen. Der

Knockoutstamm Notch1/2flox xCD4Cre wurde von Prof. Dr. Derk Amsen (Sanquin Blood

Supply Foundation, Amsterdam, Niederlande) zu Verfügung gestellt. Der

Knockoutstamm ICOSkoxOT-II wurde von Dr. Andreas Hutloff (Deutsches

Rheumaforschungszentrum Berlin) zur Verfügung gestellt. Der Stamm B6.129S7-

Rag1tm1 Mom wurde von Prof. Dr. Thomas Blankenstein (Freie Universität Berlin) zur

Verfügung gestellt.

Alle Tiere wurden unter spezifisch pathogen freien Bedingungen entsprechend

nationaler Richtlinien gehalten. Die Tiere wurden durch Genickbruch getötet. Alle

Tiertötungen und Tierversuche waren vom Landesamt für Gesundheit und Soziales

(Berlin) unter der Tötungsnummer T 0183/07 und der Tierversuchsnummer G 0336/08

genehmigt.

3.2 Reagenzien und Kits

3.2.1 Reagenzien

anti-CD62L MicroBeads, murin Miltenyi Biotech, Bergisch

Gladbach

anti-CD90.2 MicroBeads, murin Miltenyi Biotech, Bergisch

Gladbach

anti-PE MicroBeads Miltenyi Biotech, Bergisch

Gladbach

β-Mercaptoenthanol Gibco über Life Technologies

Page 30: Modulation von CD4+ T-Zellen durch Lebersinusendothelzellen · 2008, Takada and Jameson 2009, Sprent and Surh 2011)). Die hauptsächliche Ausbildung des T-Zell-Repertoires findet

Material und Methoden

30

Bovines Serumalbumin Fraktion V (BSA) Sigma Aldrich Chemie, Steinheim

Calciumchlorid (CaCl2) Sigma Aldrich, Steinheim

5-,6-Carboxyfluorescein-diacetat-succinimidylester

(CFDA-SE)

Sigma Aldrich, Steinheim

Collagenase D Roche Pharma, Grenzach-Whylen

Collagenase Typ IV Sigma Aldrich, Steinheim

51Cr-Natriumchromat-Lösung (1-5 mCi / Gefäß) GE Healthcare, München

4-,6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) Roche Pharma, Grenzach-

Whyhlen

Dimethylsulfoxid (DMSO) Sigma Aldrich, Steinheim

DNAse I Calbiochem über Merck Millipore,

Darmstadt

Dulbecco´s Modified Eagle Medium (DMEM; mit 4,5 g/l

Glucose, L-Glutamin)

Invitrogen über Life Technologies,

Darmstadt

Eosin Y Lösung (0,5 %)

Sigma-Aldrich, Steinheim

Ethanol J.T.Baker, Mallinckrodt, NL

Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA; 0,5 M, pH 8,0) Promega, Mannheim

Fixable Viability Dye eFluor 780 eBioscience, Frankfurt a.M.

Formaldehyd-Lösung (37 %) Carl Roth, Karlsruhe

Fötales Kälberserum (FCS), hitze-inaktiviert 30 min, 56°C Linaris, Wertheim

γ-Sekretase-Inhibitor X (GSI) Calbiochem über Merk Millipore,

Darmstadt

Glyceringelantine Merck Millipore, Darmstadt

Hanks balanced salt solution (HBSS), mit Ca2+

- und Mg2+

-

Ionen

Biochrom, Berlin

Hydroxyethylpiperazin-Ethansulfonsäure-Puffer-Lösung Biochrom, Berlin

Page 31: Modulation von CD4+ T-Zellen durch Lebersinusendothelzellen · 2008, Takada and Jameson 2009, Sprent and Surh 2011)). Die hauptsächliche Ausbildung des T-Zell-Repertoires findet

Material und Methoden

31

(HEPES; 1M)

Ionomycin Sigma-Aldrich, Steinheim

Kaliumhydrogencarbonat (KHCO3) Sigma-Aldrich, Steinheim

LE 540 Wako, Richmond, VA, USA

L-Glutamin-Lösung (200 mM) Invitrogen über Life Technologies,

Darmstadt

Mayers Hämalaun-Lösung Merck Millipore, Darmstadt

Mitomycin C Sigma Aldrich, Steinheim

Monensin (1000x) Biolegend, Fell

Natriumchlorid (NaCl) Sigma Aldrich, Steinheim

Natriumpyruvat-Lösung (100 mM) Biochrom, Berlin

Nicht-essentielle Aminosäuren-Lösung (NEAA; 10 mM) Biochrom, Berlin

Nycodenz Axis Shield, Oslo, Norwegen

OVA-Peptid, Sequenz: 323

ISQAVHAAHAEINEAGR339

Institut für Biochemie, Humboldt

Universität zu Berlin

Paraffin Sigma-Aldrich, Steinheim

Paraformaldehyd (PFA) Merck Millipore, Darmstadt

PCR Wasser Bioline, Luckenwalde

Penicillin/Streptomycin-Lösung (10000 U / 10000 µg/ml) Biochrom, Berlin

Percoll GE-Healthcare

Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA) Sigma-Aldrich, Steinheim

Phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) ohne Ca2+

und

Mg2+

-Ionen

PAA Laboratories, Cölbe

Propidiumjodid Sigma-Aldrich, Steinheim

Rekombinante murine Zytokine: IFN-γ, IL-12, IL-2 R&D Systems, Wiesbaden

Rosewell Park Memorial Institute Medium

(RPMI 1640) mit GlutaMAXTM

, HEPES und Phenolrot

Invitrogen über Life Technologies,

Darmstadt

Page 32: Modulation von CD4+ T-Zellen durch Lebersinusendothelzellen · 2008, Takada and Jameson 2009, Sprent and Surh 2011)). Die hauptsächliche Ausbildung des T-Zell-Repertoires findet

Material und Methoden

32

Saponin Sigma Aldrich, Steinheim

SYBR Green PCR Master Mix Applied Biosystem über Life

Technologies, Darmstadt

Trypanblau-Lösung (0,4 %) Sigma Aldrich, Steinheim

3.2.2 Vorgefertigte Systeme (Kits)

Anti-APC-Multisort Kit Miltenyi Biotech, Bergisch

Gladbach

Anti-FITC-Multisort Kit Miltenyi Biotech, Bergisch

Gladbach

Cell Trace Violet Cell Proliferation Kit Molecular Probes über Life

Technologies, Darmstadt

Cytometric Bead Array Mouse Inflammation Kit BD, Heidelberg

Dako REAL™ Detection System LSAB+ AP/RED Dako, Hamburg

FoxP3 Staining Kit, murin eBioscience, Frankfurt a.M.

HemoCARE, Test zur Bestimmung von okkultem Blut im

Stuhl

CARE Diagnostika, Möllersdorf,

Österreich

High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Applied Biosystems über Life

Technologies, Darmstadt

Mouse Th1/Th2/Th17/Th22 13 plex Kit FlowCytomix eBioscience, Frankfurt a.M.

RNeasy Plus Mini Kit Qiagen, Hilden

Page 33: Modulation von CD4+ T-Zellen durch Lebersinusendothelzellen · 2008, Takada and Jameson 2009, Sprent and Surh 2011)). Die hauptsächliche Ausbildung des T-Zell-Repertoires findet

Material und Methoden

33

3.3 Materialien und Geräte

3.3.1 Materialien

Einmal-Spritzen und –Kanülen Braun, Melsungen

MACS-Säulen, -Magnete, -Ständer, Prä-Separationsfilter Miltenyi Biotech, Bergisch

Gladbach

MicroAmp ® Fast Reaction Tubes (8 Tube Strip) Applied Biosystems über Life

Technologies, Darmstadt

MicroAmp ® Optical 8-Cap Strip Applied Biosystems über Life

Technologies, Darmstadt

PCR Tube Strips with Domed Cap Strips Peqlab Biotechnologie Erlangen

Rundsiebe Carl Roth, Karlsruhe

QIAshredder-Säulen Qiagen, Hilden

Zellkulturplatten Corning Costar über Sigma

Aldrich, Steinheim

Zellsiebe (100 µm Porengröße) BD, Heidelberg

3.3.2 Geräte

CO2-Brutschrank Binder Tuttlingen

Durchflusszytometer FACSCanto II BD, Heidelberg

Gamma-Counter WIZARD® Wallac, Turku, Finnland

Kreisschüttler KS125 IKA Labortechnik, Staufen

Mikrotom Microm HM 325 Thermo Scientific, Schwerte

Mikroskop AxioImager Z1 Carl Zeiss MicroImaging, Inc.,

Jena

Neubauer Zählkammer Carl Roth, Karlsruhe

Oditest Dickemessgerät Kroeplin Längenmesstechnik,

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Material und Methoden

34

Schlüchtern

Phasenkontrastmikroskop für Zellkultur Axiovert 25 Carl Zeiss, Jena

Real-time PCR System StepOnePlusTM

Applied Biosystems über Life

Technologies

Rotlichtlampe Osram Theratherm Osram, München

Spektralphotometer NanoDrop Thermo Scientific, Schwerte

Sterilwerkbank Herasafe®

Thermo Scientific, Schwerte

Thermocycler T 3000 Biometra, Göttingen

Ultraviolet Sterilizing PCR Workstation Peqlab Biotechnologie, Erlangen

Zentrifugen: Multifuge X3R, Fresco-17 Thermo Scientific, Schwerte

3.4 Primer

Die verwendeten Primer wurden mit dem Programm Primer3 (Geneious, Auckland,

Neuseeland) entworfen und von der Firma TIB Molbiol (Berlin) synthetisiert. Die Tabelle

1 gibt die Sequenzen der forward (f) und reverse (r) Primer in 5‘ – 3‘ Richtung an.

Zielgen Sequenz Annealing-Temperatur

β-Aktin f: TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAA

r: TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCC

62°C

Deltex-1 f: GTGCCCTACATCATCGACCT

r: CTGGATGGTGATGCAGATGT

61°C

Dll1 f: GGATACACACAGCAAACGTGA

r: CGCTTCCATCTTACACCTCAG

62°C

Dll4 f: CCTCTCGAACTTGGACTTGC 61°C

Tabelle 1: Sequenzen der Primer und Annealing-Temperatur

Page 35: Modulation von CD4+ T-Zellen durch Lebersinusendothelzellen · 2008, Takada and Jameson 2009, Sprent and Surh 2011)). Die hauptsächliche Ausbildung des T-Zell-Repertoires findet

Material und Methoden

35

r: GCTCCTGCTTAATGCCAAAC

Gzmb f: TCGACCCTACATGGCCTTAC

r: TGGGGAATGCATTTTACCAT

61°C

Hes-1 f: GCGAAGGGCAAGAATAAATG

r: TGTCTGCCTTCTCTAGCTTGG

60°C

IL-10 f: ATCGATTTCTCCCCTGTGAA

r: TTCGGAGAGAGGTACAAACGA

60°C

IFN-γ f: CAACAACATAAGCGTCATT

r: ATTCAAATAGTGCTGGCAGA

60°C

Jagged1 f: CCCTGTCAGCAAACAATGAA

r: GGACGCCTCTGAACTCTGAC

60°C

Jagged2 f: GAGGCTGTCAGTGGGACTGT

r: ACAGCTATGGTAACCGCCATC

62°C

Prf f: GATGTGAACCCTAGGCCAGA

r: GGTTTTTGTACCAGGCGAAA

61°C

UBC f: AGCCCAGTGTTACCACCAAG

r: TCACACCCAAGAACAAGCAC

60°C

3.5 Antikörper

Fluorochrom Adsorption (nm) Emission (nm)

Alexa-Fluor (AF) 405 401 421

Alexa-Fluor (AF) 488 495 519

Tabelle 2: Fluorochrome und ihre Adsorptions- und Emissionsmaxima

Page 36: Modulation von CD4+ T-Zellen durch Lebersinusendothelzellen · 2008, Takada and Jameson 2009, Sprent and Surh 2011)). Die hauptsächliche Ausbildung des T-Zell-Repertoires findet

Material und Methoden

36

Alexa-Fluor (AF) 647 650 668

Allophycocyanin (APC) 650 660

BD Horizon V450 (V450) 404 448

Brilliant-Violet (BV) 510 405 510

e-Fluor (eF) 405 405 421

e-Fluor (eF) 780 633 780

Fluoresceinisothiocyanat (FITC) 495 520

R-Phycoerythrin (PE) 480/565 575

R-Phycoerythrin-Cychrome 7 (PE-Cy7) 480/565/743 767

Propidiumiodid (PI) 550 650

Spezifität Klon Isotyp Fluorochrom Herkunft

Annexin-V PE BD, Heidelberg

α4β7-Integrin DATK32 Ratte IgG2a PE BD, Heidelberg

CCR9 CW-1.2 Maus IgG2a AF 647 Biolegend, Fell

CD4 L3T4 Ratte IgG2a FITC BD, Heidelberg

GK1.5 Ratte IgG2b APC Biolegend, Fell

RM4-5 Ratte IgG2a BV510 BD, Heidelberg

CD8 53-6.7 Ratte IgG2a APC Biolegend, Fell

Tabelle 3: Antikörper für die Durchflusszytometrie, Spezies Maus

Page 37: Modulation von CD4+ T-Zellen durch Lebersinusendothelzellen · 2008, Takada and Jameson 2009, Sprent and Surh 2011)). Die hauptsächliche Ausbildung des T-Zell-Repertoires findet

Material und Methoden

37

CD25 PC61 Ratte IgG1 PE Biolegend, Fell

CD39 (ENTPD1) 24DMS1 Ratte IgG2b AF647 eBioscience,

Frankfurt a.M.

CD44 IM7 Ratte IgG2b PE BD, Heidelberg

CD62L MEL-14 Ratte IgG2a APC Biolegend, Fell

CD90.1 OX-7 Maus IgG1 AF488 Biolegend, Fell

V450 BD, Heidelberg

CD90.2 53-2.1 Ratte IgG2a eF450 BD, Heidelberg

CD146 ME-9F1 Ratte IgG2a FITC Biolegend, Fell

Dll1 HMD1-3 Arm.

Hamster IgG

APC Biolegend, Fell

Dll4 HMD4-1 Arm.

Hamster IgG

PE Biolegend, Fell

FoxP3 FJK-16S Ratte IgG2a PE eBioscience,

Frankfurt a.M.

Helios 22F6 Arm.

Hamster IgG

APC Biolegend, Fell

IFN-γ XMG1.2 Ratte IgG1 APC BD, Heidelberg

IL-2 JES5-

5H4

Ratte IgG2b PE BD, Heidelberg

IL-10 JES5-

16E3

Ratte IgG2b PE eBioscience,

Frankfurt a.M.

Jagged1 HMJ1-29 Arm. PE eBioscience,

Page 38: Modulation von CD4+ T-Zellen durch Lebersinusendothelzellen · 2008, Takada and Jameson 2009, Sprent and Surh 2011)). Die hauptsächliche Ausbildung des T-Zell-Repertoires findet

Material und Methoden

38

Hamster IgG Frankfurt a.M.

Jagged2 HMJ2-1 Arm.

Hamster IgG

PE Miltenyi Biotec,

Bergisch

Gladbach

MHCII M5/114.5 Ratte IgG APC Biolegend, Fell

PD-1 29F.1A12 Ratte IgG2a PE Biolegend, Fell

P-Selektin/ Mensch

IgG Fc Chimäre

BD, Heidelberg

TNF-α MP6-

XT22

Ratte IgG1 PE-Cy7 Biolegend, Fell

Mensch IgG, Fc-

Fragment

Affe PE BD, Heidelberg

Spezifität Klon Isotyp Markierung /

Fluoreszenz

Herkunft

Affe anti-Ratte AF488 Dianova,

Hamburg

anti-Maus CD4 4SM95 Ratte IgG eBioscience,

Frankfurt a.M.

anti-Maus CD146 ME-9F1 Ratte IgG2a Biolegend, Fell

anti-Maus Dll4 HMD4-1 Arm.

Hamster IgG

Biolegend, Fell

Kaninchen anti- Bio Dianova,

Tabelle 4: Antikörper für die Immunfluoreszenz und Immunpathologie

Page 39: Modulation von CD4+ T-Zellen durch Lebersinusendothelzellen · 2008, Takada and Jameson 2009, Sprent and Surh 2011)). Die hauptsächliche Ausbildung des T-Zell-Repertoires findet

Material und Methoden

39

Ratte Hamburg

Ziege anti-

Hamster

AF647 Dianova,

Hamburg

3.6 Medien und Puffer

17 % Nycodenz-Lösung 17 % (w/v) Nycodenz, 26 % (v/v) RPMI 1640, 10 %

(v/v) FCS in Aqua dest.

30 % Nycodenz-Lösung 30 % (w/v) Nycodenz in Aqua dest.

36 % Percoll-Lösung 40 % (v/v) 90 % Percoll in PBS

90 % Percoll-Lösung 90 % (v/v) Percoll, 10 % (v/v) 10x PBS

Spezifität Klon Herkunft

CD3 37.5 DRFZ, Berlin

CD16/CD32 93 Biolegend, Fell

CD28 145-2C11 DRFZ, Berlin

Dll1 HMD1-3 DRFZ, Berlin

Dll4 HMD1-4 Biolegend, Fell

IL-4 11B11 DRFZ, Berlin

IL-10 Rezeptor 1B1.2 DRFZ, Berlin

IL-27p28 MM27-7B1 Biolegend, Fell

IgG1 19E1 DRFZ, Berlin

Ratten IgG Jackson Immuno Research

Laboratories Inc., UK

Tabelle 5: Antikörper für die Aktivierung und Blockade, Spezies Maus

Page 40: Modulation von CD4+ T-Zellen durch Lebersinusendothelzellen · 2008, Takada and Jameson 2009, Sprent and Surh 2011)). Die hauptsächliche Ausbildung des T-Zell-Repertoires findet

Material und Methoden

40

Annexin V-Färbepuffer 2,5 mM CaCl2, 140 mM NaCl, 10 mM HEPES, pH 7,4

Erythrozyten-Lyse-Puffer 10 mM KHCO3, 155 mM NH4Cl, 0,1 mM EDTA, pH 7,5

HBSS/BSA Hanks balanced salt solution (HBSS), mit Ca2+- und

Mg2+-Ionen, 0,5 % (w/v) BSA

Kollagenasemedium 200 U/ml Collagenase D, 20 µg/ml DNAse I in cRPMI

Komplett DMEM (cDMEM) DMEM, 10 % (v/v) FCS, 1 % (v/v) Natriumpyruvat, 1 %

(v/v) Penicillin/Streptomycin, 25 mM HEPES, 1 % (v/v)

NEAA, 0,1 % (v/v) β-Mercaptoethanol

Komplett RPMI (cRPMI) RPMI 1640 mit GlutaMAXTM und HEPES, 10 % (v/v)

FCS, 1 % (v/v) Natriumpyruvat, 1 % (v/v)

Penicillin/Streptomycin, 0,1 % (v/v) β-Mercaptoethanol

Paraformaldehyd-Lösung 1x PBS, 0,5 % (w/v) PFA, pH 7

PBS/BSA 1x PBS, 0,5 % (w/v) BSA

PBS/BSA/EDTA 1x PBS, 0,5 % (w/v) BSA, 2 mM EDTA

PBS/EDTA 1x PBS, 5 mM EDTA

Saponin-Puffer 1x PBS, 0,5 % (w/v) Saponin

Th1-Medium

(antigenspezifisch)

cRPMI, 5 µg/ml OVA-Peptid, 10 ng/ml IL-2, 10 ng/ml

IL-12, 10 µg/ml anti-IL4 mAk

Th1-Medium

(polyklonal)

cRPMI, 1 µg/ml anti-CD3 mAk, 0,5 µg/ml anti-CD28

mAk, 10 ng/ml IL-2, 10 ng/ml IL-12, 10 µg/ml anti-IL4

mAk

Verdaumedium RPMI 1640 mit GlutaMAXTM und HEPES,5 % (v/v)

FCS, 0,05 % (w/v) Collagenase Typ IV

Waschmedium (wRPMI) wie cRPMI, mit 5 % (v/v) FCS

3.7 Isolation definierter Zellpopulationen

3.7.1 Zellzahlbestimmung

Für die Bestimmung der Zellzahl wurde eine Trypanblau-Lösung verwendet. Lebende

Zellen nehmen den Farbstoff nicht auf und erscheinen unter dem Mikroskop weiß vor

blauem Hintergrund. In tote Zellen dringt Trypanblau ein und färbt diese dunkelblau an.

Somit ermöglichte die Trypanblaufärbung eine Unterscheidung zwischen lebenden und

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Material und Methoden

41

toten Zellen. 10 μl der Zellsuspension wurden in einem angemessenen Volumen mit

0,4 % Trypanblaulösung (v/v in PBS) verdünnt. 10 μl dieser Verdünnung wurden in

eine Neubauer Zählkammer gegeben und die Zahl der lebenden (ungefärbten) Zellen

in den 4 großen Außenquadraten ermittelt. Die Zellzahl berechnet sich

folgendermaßen: Zellzahl/ml = (gezählte Zellen / 4) x Verdünnungsfaktor x 10.000.

3.7.2 Prinzip der Isolation von Zellpopulationen durch magnetische

Zellseparation

Die MACS-Technologie (MACS: magnetic activated cell sorting) erlaubt die Sortierung

von bestimmten Zellpopulationen aus einem Zellgemisch. Diese Methode basiert auf

superparamagnetischen Partikeln (MicroBeads), welche an Antikörper gekoppelt sind.

Die epitopspezifischen Antikörper können direkt mit MicroBeads konjugiert sein oder

ein Fluoreszenz-markierter Primärantikörper bindet epitopspezifisch an die Zelle und

mittels eines Sekundärantikörpers, der gegen das Fluorochrom gerichtet ist und mit

MicroBeads konjugiert ist, werden die Zellen aus der Suspension isoliert. Dazu wird die

Zellsuspension mit den entsprechenden Antikörpern inkubiert und in einem Magnetfeld

auf eine mit ferromagnetischer Matrix gefüllte Säule gegeben. Zellen, die mit

MicroBeads markiert sind, werden im magnetischen Feld zurückgehalten, und

unmarkierte Zellen passieren die Säule. Durch ein Entfernen der Säule aus dem

Magneten können auch die markierten Zellen gesammelt werden. Mit Hilfe dieser

Methode können Zellen aufgrund ihrer Oberflächenmoleküle positiv oder negativ aus

einem Zellgemisch selektiert werden (Miltenyi, Muller et al. 1990).

Bei allen Zellisolationen wurden die Zellsuspensionen in einer Zelldichte von 1x108/ml

PBS/BSA/EDTA mit Antikörpern für 10 min bei 4 °C inkubiert, während die Inkubation

mit MicroBeads in einer Zelldichte von 2x108/ml PBS/BSA/EDTA für 15 min bei 4 °C

erfolgte.

3.7.3 Isolation von nicht-parenchymatischen Zellen (NPC) der Leber

Die Mäuse wurden durch zervikale Dislokation getötet und das Peritoneum geöffnet.

Zur Isolation der NPC aus der Leber wurde diese über die Pfortader mit 5 ml

Verdaumedium gespült und nach der Entfernung der Gallenblase entnommen. Die

Page 42: Modulation von CD4+ T-Zellen durch Lebersinusendothelzellen · 2008, Takada and Jameson 2009, Sprent and Surh 2011)). Die hauptsächliche Ausbildung des T-Zell-Repertoires findet

Material und Methoden

42

Leber wurde im Verdaumedium mittels Schere und Pinzette zerkleinert und für ca. 15

min bei 37 °C inkubiert. Nach dem Verdauschritt wurde die Leber in Waschmedium

aufgenommen, durch ein feines Rundsieb aus Metall gerieben und anschließend durch

ein Zellsieb gedrückt. Die Zellsuspension wurde für 5 min bei 20 g und

Raumtemperatur (RT) zentrifugiert und damit die Einzelzellen von den restlichen

Gewebsbestandteilen getrennt. Die Einzelzellsuspension wurde erneut zentrifugiert (8

min, 600 g, RT), der Überstand verworfen und die pelettierten Zellen in Erythrozyten-

Lyse-Puffer aufgenommen, für 5 min auf Eis inkubiert und anschließend mit wRPMI

gewaschen. Um die Hepatozyten aus dem Zellgemisch abzutrennen, erfolgte eine

Dichtegradientenzentrifugation. Dazu wurden die Zellen in einer 26 % Nycodenz-

Lösung (6,5 ml 30 % Nycodenz, 1 ml Zellsuspension in wRPMI) aufgenommen, unter

wRPMI unterschichtet und zentrifugiert (20 min, 1200 g, RT). Die NPC befanden sich in

der Interphase, die abgenommen und mit PBS/BSA gewaschen wurde.

3.7.3.1 Isolation von Lebersinusendothelzellen

Zur Isolation der LSEC wurden die NPC mit einem anti-Fc-Rezeptor-Antikörper (anti-

CD16/CD32 mAk, 25 µg/ml) für 5 min bei 4 °C inkubiert, um unspezifische Bindung des

Fluoreszenz-markierten Antikörpers zu blockieren. Anschließend erfolgte die

Markierung mit einem anti-CD146 FITC Antikörper (0,7 µg/ml). Die Zellsuspension

wurde mit PBS/BSA gewaschen und mit anti-FITC MicroBeads inkubiert. CD146+

LSEC wurden mittels MACS mit einer Reinheit von maximal 98 % isoliert. Die LSEC

wurden entweder direkt zur durchflusszytometrischen Analyse verwendet oder für

Kokulturen, zur Adhäsion der Zellen, über Nacht bei 37 °C und 5 % CO2 in cDMEM

kultiviert. Die adhärierten LSEC wurden daraufhin mit wRPMI gründlich gespült und für

die Kokultur mit T-Zellen in dem entsprechenden Kulturmedium aufgenommen.

3.7.3.2 Isolation von antigenpräsentierenden Zellen aus der Leber

Zur Isolation von antigenpräsentierenden Zellen aus der Leber (LAPC), wurden die

LSEC negativen Zellen aus der LSEC MACS verwendet. Die Zellen wurden nochmals

von den verbleibenden LSEC depletiert. Daraufhin wurden die Zellen zunächst mit

einem anti-MHCII mAk (0,1 µg/ml) in APC markiert, in PBS/BSA gewaschen und

daraufhin mit anti-APC MicroBeads inkubiert. Die Sortierung von LSEC-negativen

MHCII-positiven Leberzellen erfolgte über zwei positive Sortierungsschritte. Die

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Material und Methoden

43

Reinheit betrug wenigstens 98 %. Die Zellpopulation setzte sich im Durchschnitt wie

folgt zusammen: 90 % B-Zellen, 6 % Kupffer Zellen, 4 % dendritische Zellen. Zur

Inhibition der Proliferation wurden die Zellen anschließend in cRPMI aufgenommen

und mit Mitomycin C in einer finalen Konzentration von 100 µg/ml für 30 min bei 37 °C

inkubiert und dreimal mit PBS gewaschen. Für die Zellen, die mit CD4+ T-Zellen für

eine Kokultur verwendet wurden, erfolgte eine Inkubation in cRPMI über Nacht bei 37

°C und 5 % CO2 im Brutschrank. Am darauffolgenden Tag wurden die Zellen in einer

Konzentration von 2x106/ml in dem entsprechenden Zellkulturmedium aufgenommen.

3.7.4 Isolation von Lymphozyten aus Milz und Lymphknoten

Die Mäuse wurden durch zervikale Dislokation getötet und die Milzen sowie

Lymphknoten (axilläre-, mandibuläre-, brachiale-, inguinale und mesenteriale

Lymphknoten) entnommen und von diesen Organen eine Einzelzellsuspension in

PBS/BSA/EDTA hergestellt. Anschließend wurden die Zellen abzentrifugiert (300 g, 8

min, 4 °C) und die enthaltenen Erythrozyten in 3 ml Erythrozyten-Lyse-Puffer pro Maus

lysiert. Nach einem Waschritt mit PBS/BSA/EDTA wurden die verbleibenden

Gewebsbestandteile mittels eines Zellsiebs mit einer Maschenweite von 100 µm

entfernt. Alle Schritte erfolgten auf Eis. Die Einzelzellsuspension wurde nun für die

weitere Zellisolation verwendet.

3.7.4.1 Isolation naiver CD4+ T-Zellen

Zur Isolation von naiven CD4+ T-Zellen wurde die Einzelzellsuspension von Milz und

Lymphozyten zunächst mit einem anti-CD16/CD32 mAk (25 µg/ml) für 5 min bei 4 °C

inkubiert um die Fc-Rezeptoren der Zellen zu blockieren und ein unspezifisches Binden

der folgenden Antikörper zu verhindern. Anschließend wurde direkt ein anti-CD4 APC

mAk (0,2 µg/ml) hinzugegeben und für 10 min bei 4 °C inkubiert. Nach einem Waschritt

mit PBS/BSA/EDTA wurden die Zellen mit anti-APC-Multisort MicroBeads in einem

Verhältnis von 1:20 markiert, gewaschen und die CD4+ T-Zellen über MACS isoliert.

Die Reinheit der CD4+ T-Zellen betrug wenigstens 97 %. Die Zellen wurden daraufhin

in einer Zelldichte von 2,7x107 / ml aufgenommen und mit 35 µl Release-Reagent pro

ml Zellsuspension zunächst für 10 min bei 4 °C, daraufhin 20 min bei RT inkubiert,

gewaschen und die von den MicroBeads getrennten Zellen über MACS depletiert.

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Material und Methoden

44

Naive CD4+ T-Zellen exprimieren im Gegensatz zu Effektor/Gedächtnis CD4+ T-Zellen

viel CD62L. Daher wurden naive CD4+ T-Zellen als CD4+CD62Lhigh T-Zellen definiert.

Die CD4+ T-Zellen wurden mit CD62L MicroBeads in einem Verhältnis von 1:60

inkubiert und über MACS positiv selektioniert. Die Reinheit der naiven CD4+ T-Zellen

betrug mindestens 98 %. Die Zellen wurden entweder direkt durchflusszytometrisch

analysiert oder für die Kultivierung in dem entsprechenden Zellkulturmedium

aufgenommen.

3.7.4.2 Isolation von regulatorischen CD4+ T-Zellen

Die Isolation von regulatorischen CD4+ T-Zellen (Treg) erfolgte wie im Abschnitt 3.7.4.1

beschrieben. Davon abweichend erfolgte die Markierung mit einem anti-CD4 FITC mAk

(1 µg/ml) und der Sortierung mit FITC-Multisort MicroBeads (1:20). Nachdem die

MicroBeads von den CD4+ T-Zellen abgetrennt wurden, erfolgte die Markierung mit

einem anti-CD25 PE mAk (0,5 µg/ml), anti-PE-MicroBeads (1:10) und einer

zweimaligen positiven Isolation. Die Reinheit der CD4+CD25+ T-Zellen betrug

wenigstens 95 %. Zusätzlich wurde der Anteil der FoxP3 positiven Zellen bestimmt; er

betrug im Durchschnitt 80 %. Die Zellen wurden entweder direkt durchfluss-

zytometrisch analysiert oder für die Kultivierung in dem entsprechenden Zell-

kulturmedium aufgenommen.

3.7.4.3 Isolation von naiven CD8+ T-Zellen

Zur Isolation von naiven CD8+ T-Zellen wurde die Einzelzellsuspension von Milz und

Lymphozyten zunächst mit einem anti-CD16/CD32 mAk (25 µg/ml) für 5 min bei 4 °C

inkubiert. Anschließend wurde direkt ein anti-CD8 APC mAk (0,2 µg/ml) hinzugegeben

und für 10 min bei 4 °C inkubiert. Nach einem Waschritt mit PBS/BSA/EDTA wurden

die Zellen mit anti-APC-Multisort MicroBeads in einem Verhältnis von 1:20 markiert,

gewaschen und die CD8+ T-Zellen über MACS isoliert. Die Reinheit der CD8+ T-Zellen

betrug wenigstens 97 %. Die Zellen wurden daraufhin in einer Zelldichte von 2,7x107 /

ml aufgenommen und mit 35 µl Release-Reagent pro ml Zellsuspension zunächst für

10 min bei 4 °C, daraufhin 20 min bei RT inkubiert, gewaschen und die von den

MicroBeads getrennten Zellen über MACS depletiert. Naive CD8+ T-Zellen exprimieren

im Gegensatz zu Effektor/Gedächtnis CD8+ T-Zellen wenig CD44. Daher wurden naive

CD8+ T-Zellen als CD8+CD44low T-Zellen definiert. Die CD8+ T-Zellen wurden mit einem

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Material und Methoden

45

anti-CD44 PE mAk (0,4 µg/ml) und anti-PE MicroBeads in einem Verhältnis von 1:10

inkubiert und über MACS negativ selektioniert. Die Reinheit der naiven CD8+CD44low T-

Zellen betrug wenigstens 97 %. Die Zellen wurden entweder direkt durchflussz-

ytometrisch analysiert oder für die Kultivierung in dem entsprechenden

Zellkulturmedium aufgenommen.

3.7.4.4 Isolation antigenpräsentierender Zellen

Zur Isolation der antigenpräsentierenden Zellen aus der Milz (spleen-derived antigen

presenting cells, SAPC) wurde die Einzelzellsuspension aus der Milz zunächst mit

einem anti-CD16/CD32 mAk (25 µg/ml) für 5 min bei 4 °C und anschließend mit anti-

CD90.2 MicroBeads für 15 min bei 4 °C inkubiert, gewaschen und über MACS isoliert.

Die CD90.2 negativen Milzzellen wurden als SAPC definiert. Zur Inhibition der

Proliferation wurden die Zellen anschließend in cRPMI aufgenommen und mit

Mitomycin C in einer finalen Konzentration von 100 µg/ml für 30 min bei 37 °C inkubiert

und nach dreimaligen Wachen mit PBS in dem entsprechenden Zellkulturmedium

aufgenommen.

3.7.5 Isolation von Lymphozyten aus der Lamina propria

Im Rahmen der Colitis-Versuche erfolgte eine Analyse der infiltrierten Lymphozyten der

Lamina propria (LPL) des Colons. Die in dem folgenden Protokoll angegebenen

Volumen beziehen sich auf die LPL Isolation pro Maus. Dazu wurde ein zuvor

vermessener Abschnitt des Colons mit PBS gespült, zerkleinert, in 20 ml PBS/EDTA

aufgenommen und für 15 min, RT, 500 U/Min auf einem Kreisschüttler inkubiert. Die

Gewebsbestandteile wurden abzentrifugiert (1 min, 300 g), der Überstand verworfen

und das Pellet erneut in PBS/EDTA aufgenommen und nochmals, wie zuvor

beschrieben, inkubiert. Nach dem die Gewebsstücke abzentrifugiert worden waren und

der Überstand verworfen worden war, erfolgten zwei Waschschritte in cRPMI. Die

Colonstücke wurden zum Verdau des Gewebeverbandes in 10 ml Kollagenasemedium

aufgenommen und für 90 min, bei 37 °C und 500 U/min inkubiert. Die Gewebslösung

wurde anschließend durch mehrmaliges Aufziehen in eine 30 ml Spritze zerkleinert, mit

Hilfe eine Spritzenkolbens durch ein 100 µm Zellsieb gerieben und mit cRPMI gespült.

Nach einem Zentrifugationsschritt (10 min, 240 g, RT) wurden die vereinzelten Zellen

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Material und Methoden

46

in 5 ml 36 % Percoll-Lösung aufgenommen und auf 5 ml 90 % Percoll-Lösung

überschichtet. Die Zentrifugation für 25 min bei RT erfolgte bei 1200 g und deaktivierter

Bremse. Die Lymphozyten, welche sich in der Interphase befanden, wurden geerntet

und zweimal mit cRPMI gewaschen (5 min, 370 g, RT). Die Zellen wurden in PBS/BSA

aufgenommen und die Zellzahl bestimmt. Die Zellzahl wurde ins Verhältnis zu der

Länge des Colonstückes gesetzt.

3.8 T-Zell-Stimulation und T-Zellkulturen

3.8.1 T-Zell-Stimulation

Die Aktivierung von naiven CD4+ T-Zellen unter homöostatischen Bedingungen, d.h.

ohne polarisierende Zytokine, durch LSEC, LAPC bzw. SAPC erfolgte

antigenspezifisch. Dazu wurden die antigenpräsentierenden Zellen aus WT Mäusen

und die naiven CD4+ T-Zellen aus OTIIxB6PL Mäusen isoliert. Die Kultivierung von

1x106/ml APC und 5x105/ml naiven CD4+ T-Zellen erfolgte in cRPMI unter der Zugabe

von 5 µg/ml OVA-Peptid für 6 Tage bei 37°C und 5 % CO2. Am Tag 3 wurde bei den

Kulturen mit LSEC 1/3 des ursprünglichen Kulturvolumens an cRPMI hinzu pipettiert;

die Kulturen mit LAPC bzw. SAPC wurden hingegen 1:3 gesplittet. Die so aktivierten T-

Zellen wurden als TLSEC, TLAPC bzw. TSAPC bezeichnet.

Die Aktivierung von naiven CD4+ T-Zellen unter entzündlichen Bedingungen, d.h. unter

der Zugabe von Th1 polarisierenden Zytokinen (IL-12, IL-2, anti-IL-4 mAk) durch LSEC

bzw. SAPC erfolgte entweder antigenspezifisch oder polyklonal. Für die

antigenspezifische Stimulation wurden die antigenpräsentierenden Zellen aus WT

Mäusen und die naiven CD4+ T-Zellen aus OTIIxB6PL Mäusen isoliert. Die Kultivierung

von 1x106/ml APC und 5x105/ml naiven CD4+ T-Zellen erfolgte unter der Zugabe von 5

µg/ml OVA-Peptid in Th1-Medium für 4 Tage bei 37°C und 5 % CO2. Für die

polyklonale Stimulation wurden die antigenpräsentierenden Zellen und die naiven CD4+

T-Zellen aus WT Mäusen isoliert. Die Kultivierung der Zellen erfolgte wie oben

beschrieben, nur wurde anstelle des OVA-Peptids mit 1 µg/ml anti-CD3 und 0,5 µg/ml

anti-CD28 mAk stimuliert. Die so aktivierten Th1-Zellen wurden als Th1LSEC bzw.

Th1SAPC bezeichnet.

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Material und Methoden

47

Für die Reaktivierung von Th1-Zellen durch LSEC, LAPC bzw. SAPC wurden zunächst

5x105/ml naive CD4+ T-Zellen antigenspezifisch unter entzündlichen Bedingungen, d.h.

der Zugabe von Th1 polarisierenden Zytokinen (IL-12, IL-2, anti-IL-4 mAk) in Th1-

Medium mit 1x106/ml SAPC in cRPMI für 6 Tage bei 37 °C bei 5 % CO2 kultiviert. Die

toten Zellen wurden mittels Dichtegradientenzentrifugation abgetrennt und 5x105/ml

vitale Th1 Zellen mit 1x106/ml LSEC, LAPC bzw. SAPC und OVA-Peptid in cRPMI für

3d bei 37 °C und 5 % CO2 reaktiviert. Die so reaktivierten Th1-Zellen wurden als

Th1LSEC, Th1LAPC bzw. Th1SAPC bezeichnet.

Am Ende der Kultur wurden die Zellen geerntet, in PBS/BSA gewaschen und direkt zur

durchflusszytometrischen Analyse verwendet. Die Zellen für in vivo Experimente

wurden zunächst mit Hilfe einer Dichtegradientenzentrifugation von den toten Zellen

abgetrennt. Dazu wurden die Zellen in PBS/BSA aufgenommen, auf eine 17 %

Nycodenz-Lösung überschichtet und zentrifugiert (10 min, 840 g, ohne Bremse, RT).

Die Interphase mit den lebenden Zellen wurde geerntet, zweimal mit PBS gewaschen,

in PBS aufgenommen und bis zur weiteren Verwendung bei 4 °C aufbewahrt.

Um den Einfluss von Retinolsäure auf die Expression der Homingrezeptoren zu

untersuchen, erfolgte die Kultivierung der Zellen zusätzlich in der Anwesenheit von 1

µM Retinolsäurerezeptorantagonist LE540 (Iwata, Hirakiyama et al. 2004).

Um den Einfluss von IL-27 zu analysieren, wurden die Kulturen in der Anwesenheit von

anti-IL-27p28 Antikörper durchgeführt.

Um einen Einfluss von ICOS-ICOS-Ligand Interaktionen beobachten zu können,

erfolgte eine Kultivierung mit naiven CD4+ T-Zellen, welche aus ICOSkoxOTII Mäusen

isoliert wurden.

Um den Einfluss von Notch-Rezeptor-Signalen zu analysieren, wurden die Zellen unter

der Zugabe von γ-Sekretase Inhibitor X oder Dimethylsulfoxid (DMSO) als

Lösungsmittelkontrolle, anti-Dll1 mAk und anti-Dll4 mAk in den angegebenen

Konzentrationen kultiviert. In diesem Kontext erfolgte alternativ eine Kultivierung mit

naiven CD4+ T-Zellen, welche aus Notch1/2 Rezeptor knockout Mäusen isoliert

wurden.

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Material und Methoden

48

3.8.2 In Vitro Suppressionsassay

Für die Analyse der suppressiven Kapazität von T-Zellen wurden in vitro Suppressions-

assays durchgeführt. Dabei wurden 1x106/ml CFDA-SE-markierte naive CD8+ T-Zellen

als responder-Zellen mit 4x105/ml SAPC kokultiviert und polyklonal mit 2 µg/ml anti-

CD3 mAk stimuliert. Als suppressorische Effektorzellen wurden entweder ex vivo

isolierte Treg als Positivkontrolle, in vitro generierte TLSEC oder naive CD4+ T-Zellen als

Negativkontrolle in einer Zellkonzentration von 1x106/ml, im Verhältnis 1:1 zu den CD8+

T-Zellen eingesetzt. Die Kultivierung der Zellen erfolgte für 3 Tage bei 37 °C und 5 %

CO2. Am Ende der Kultur wurden die Zellen geerntet, in PBS/BSA gewaschen und

direkt zur durchflusszytometrischen Analyse verwendet. Die Analyse des

Zellkulturüberstandes erfolgte ohne vorherige Restimulation der Zellen.

3.9 Restimulation und Fixierung

Die Zellkulturen wurden mit PMA (10 ng/ml) und Ionomycin (1 µg/ml) in cRPMI in einer

Konzentration von max. 4x106 Zellen /ml für 6 h im Brutschrank inkubiert. Nach 1 h

wurden die Sekretionshemmer Brefeldin A (5 µg/ml) und Monensin (1x) zugegeben.

Nach der verbleibenden Stimulationszeit wurden die Zellen zweimal in PBS gewaschen

und in einer Konzentration von 5x106 Zellen /ml mit 0,5 µl/ml PBS eines fixierbaren

Lebend/Tot-Farbstoffes (Fixable Viability Dye eFluor 780) für 30 min bei 4 °C markiert.

Tote Zellen binden verstärkt den Farbstoff auf der Zelloberfläche und erlauben bei der

durchflusszytometrischen Messung der Zellen, auch nach der Fixierung und

Permeabilisierung, eine Diskriminierung zwischen ursprünglich lebenden und toten

Zellen. Nach der Markierung wurden die Zellen mit PBS/BSA gewaschen (300 g, 8 min,

4 °C), in PBS/BSA aufgenommen und zusätzlich mit dem einfachen Volumen einer 4 %

PFA-Lösung versetzt und für 30 min bei 4 °C fixiert. Die Zellen wurden anschließend

zweimal mit PBS/BSA gewaschen, resuspendiert und bis zur intrazellulären Färbung

bei 4 °C gelagert.

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Material und Methoden

49

3.10 Durchflusszytometrie

3.10.1 Prinzip, Messung und Auswertung

Zellen lassen sich aufgrund ihrer physikalischen Eigenschaften, wie Granularität und

Größe, durch Markierung mit fluorochromgekoppelten Antikörpern in Abhängigkeit der

Expression von intrazellulären Proteinen oder Oberflächenmolekülen und durch die

Expression von fluoreszenten Proteinen mit Hilfe eines Durchflusszytometers

(fluorescence activated cell sorting, FACS) charakterisieren. Eine ausführliche

Beschreibung der zugrunde liegenden Prinzipien erfolgte anderweitig (Radbruch 2000).

Die durchflusszytometrische Analyse der Zellen in dieser Arbeit erfolgte am

FACSCanto II (BD, Heidelberg). Das Gerät ermöglicht die gleichzeitige Analyse von

Vorwärtstreulicht (FSC; Größe), Seitwärtsstreulicht (SSC; Granularität) und acht

Fluoreszenzparametern und besitzt dafür drei Laser zur Anregung von Fluorochromen

(Violett: 405 nm, Blau: 488 nm, Rot: 633 nm). Die Auswertung erfolgte mit Hilfe der

Software FlowJo (Tree Star Inc.). Zur Kontrolle wurden Proben gemessen, die alle

Fluorochrome bis auf das zu analysierende Fluorochrom enthielten und dadurch unter

Berücksichtigung des spektralen Hintergrunds der anderen Fluoreszenzen die korrekte

Setzung eines Analysefensters (Gate) für Zellen ermöglichte. Zelltrümmer, tote Zellen

und Dubletten wurden über FSC und SSC und Propidiumiodid- bzw. Fixable Viability

Dye-Analysefenster ausgeschlossen. Die Ergebnisse der Datenanalyse wurden

entweder als geometrischer Mittelwert der Fluoreszenzintensität (gMean) oder als

prozentualer Anteil der positiven Zellen für den untersuchten Parameter im Histogramm

oder im Dot Plot dargestellt.

3.10.2 Fluoreszenzmarkierung von Oberflächenmolekülen

Die durchflusszytometrische Analyse von Oberflächenmolekülen basiert auf der

Expression von spezifischen, mit Fluorochrom-markierten Antikörpern detektierbaren

Molekülen auf der Zelloberfläche. Der Antikörper bindet spezifisch an das zu messende

Molekül. Für die Markierung wurden ca. 1x106 Zellen in 100 µl PBS/BSA aufgenommen

und mit einem anti-CD16/CD32 mAk (25 µg/ml) , sowie weiteren Antikörpern in vorher

austitrierter Konzentration für 10 min bei 4 °C inkubiert. Für die Markierung von P-Lig

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Material und Methoden

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wurde eine Maus P-Selektin/Mensch-IgG Fc-Chimäre eingesetzt. Die Bindung des

Liganden-Konstrukts erfolgte Calcium- und Magnesiumabhängig und wurde in

HBSS/BSA durchgeführt. Über einen PE-markierten anti-Mensch IgG Antikörper

erfolgte anschließend die Fluoreszenzmarkierung der Zellen. Zur Detektion von

apoptotischen Zellen wurde eine Zellsuspension mit Annexin V markiert, welches an

Phosphadidylserin auf der Zelloberfläche von apoptotischen Zellen bindet. Die Bindung

von Annexin V ist ebenfalls Calcium abhängig und wurde in Annexin V-Färbepuffer

durchgeführt. Die Zellen wurden dazu für 15 min bei RT inkubiert.

Ungebundene Antikörper/Konjugate wurden durch Waschen in PBS/BSA, HBSS/PBS

bzw. Annexin V-Färbepuffer entfernt (300 g, 8 min, 4 °C) und die Zellen anschließend

in dem entsprechenden Puffer aufgenommen und bis zur Analyse im

Durchflusszytometer bei 4 °C aufbewahrt. Unmittelbar vor der Messung wurde für die

Diskriminierung zwischen lebenden und toten Zellen der Nukleinsäure-spezifische

Farbstoff Propidiumiodid hinzugegeben. Da dieses Molekül spezifisch tote Zellen

anfärbt, können diese später von der weiteren Analyse ausgeschlossen werden. Tote

und nekrotische Zellen binden unspezifisch Antikörper und können dadurch ein falsch-

positives Signal liefern.

3.10.3 Intrazelluläre Fluoreszenzmarkierung

Die Analyse von intrazellulären Molekülen erfolgt nachdem die Zellen mit dem

Emergenz Saponin permeabilisiert worden sind, um das Eindringen der Antikörper in

die Zelle zu ermöglichen.

Um Zytokine in T-Zellen anfärben zu können, müssen diese zunächst restimuliert und

fixiert werden (siehe Abschnitt 3.9). Die Zellen wurden anschließend in einem Saponin-

Färbepuffer aufgenommen und 5 min bei RT inkubiert und durch Zentrifugation

pelletiert. Die Zellen wurden gelöst und mit den Fluorochrom-markierten Antikörpern,

verdünnt in Saponin-Färbepuffer, für 15 min bei 4°C markiert. Die Blockade von

unspezifischen Antikörperbindungen erfolgte durch Zugabe von Ratten IgG (1 µg/ml).

Die Zellen wurden zweimal in Saponin-Färbepuffer gewaschen, in PBS/BSA

aufgenommen und bis zur Analyse im Durchflusszytometer bei 4 °C aufbewahrt.

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Material und Methoden

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Die Fixierung, Permeabilisierung und Markierung der Transkriptionsfaktoren FoxP3 und

Helios erfolgte in einen entsprechenden Puffer-System (FoxP3 Staining Kit,

eBioscience) nach Herstellerangaben. Die Zellen wurden für 30 min bei RT mit den

entsprechenden Antikörperlösungen inkubiert, gewaschen, in PBS/BSA aufgenommen

und bis zur Analyse im Durchflusszytometer bei 4 °C aufbewahrt

3.10.4 Analyse der Proliferation von T-Zellen

Die Proliferation von T-Zellen lässt sich durch Markierung mit 5-,6-Carboxyfluorescein-

diacetat-succinimidylester (CFDA-SE) oder CellTrace Violet bestimmen. CFDA-SE ist

eine farblose Substanz, von der nach passiver Aufnahme in die Zelle im Zytoplasma

durch zelleigene Esterasen die Azetatgruppen abgespalten werden. Dadurch entsteht

grün fluoreszierender Carboxyfluorescein succinimidylester (CFSE), dessen

Estergruppen mit intrazellulären Aminen reagieren und der somit in der Zelle

zurückbehalten wird. Bei der Zellteilung wird der Farbstoff zu gleichen Teilen auf die

Tochterzellen verteilt. Dadurch lässt sich die Proliferation der Zellen durch Analyse im

Durchflusszytometer beobachten. Für die Markierung wurden die Zellen in einer

Konzentration von 1x107 Zellen /ml PBS aufgenommen und mit CFDA-SE gelöst in

DMSO in einer finalen Konzentration von 1,6 µM für 2 min bei RT inkubiert. Die

Reaktion wurde durch Zugaben von cRPMI abgestoppt, die Zellen zweimal mit cRPMI

gewaschen und für die weiteren Experimente in dem entsprechenden Zellkulturmedium

aufgenommen.

Die Markierung mit CellTrace Violet basiert auf der kovalenten Bindung eines

fluoreszierenden Farbstoffes an alle freien Aminogruppen auf der Zelloberfläche und

des Zellinneren. Bei jeder Zellteilung wird der Farbstoff zu gleichen Teilen auf die

Tochterzellen verteilt. Die Analyse erfolgt wie bei CFDA-SE im Durchflusszytometer.

Zur Markierung wurden 1x106 Zellen in 1 ml PBS aufgenommen und mit 1 µl/ml der

Farbstofflösung für 20 min bei RT inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von

cRPMI abgestoppt, die Zellen zweimal mit cRPMI gewaschen und für die weiteren

Experimente in dem entsprechenden Zellkulturmedium aufgenommen.

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Material und Methoden

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3.11 Reverse Transkriptase-PCR

3.11.1 RNA Extraktion

Die Isolation der RNA erfolgte mit Hilfe des RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen). Dazu

wurden max. 1x107 Zellen abzentrifugiert (300 g, 4°C, 8 min) und in 350 µl

Zelllysepuffer aufgenommen. Die lysierten Zellen wurden entweder direkt zur Isolation

der RNA weiter verwendet oder bei -20°C gelagert. Die Suspension wurde

anschließend über eine QIAshredder Säule gegeben und damit die Zellen zerkleinert

und die Lösung von Zelltrümmern befreit. Die weiterfolgende Aufarbeitung erfolgte

gemäß dem Protokoll des Herstellers. Die abschließende Elution der mRNA von der

Säule erfolgte mit RNase-freiem PCR-Wasser (Bioline). Die RNA-Konzentration der

Lösung wurde am Spektralphotometer NanoDrop gemessen und diese direkt mittels

des High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit in cDNA transkribiert oder bei -80°C

gelagert.

3.11.2 Reverse Transkription

Die reverse Transkription von RNA in complementary DNA (cDNA) wurde mit Hilfe des

High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit unter der Zugabe von RNase Inhibitor

durchgeführt. Die Zusammensetzung des Ansatzes ist der Tabelle 6 entnehmen. Die

Reaktion erfolgte nach dem in Tabelle 7 aufgeführten Programm im Thermocycler T

3000 (Biometra).

Tabelle 6: Pipettieransatz reverse Transkription

Volumen (40 µl total) Reagenz

4 µl 10x RT Puffer

4 µl 10x RT Random Primer

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Material und Methoden

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Dauer Temperatur

10 min 25 °C

120 min 37 °C

5 min 85 °C

∞ 4 °C

3.12 Real-time PCR

3.12.1 Prinzip, Messung und Auswertung

Die Quantifizierung einer definierten RNA kann nach cDNA Synthese innerhalb einer

real-time Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter der Verwendung von spezifischen

Primern erfolgen. Dabei wird mit Hilfe eines Fluoreszenzfarbstoffes, der mit der

doppelsträngigen DNA des Produktes interkaliert, die Zunahme der Fluoreszenz über

einen Zeitraum erfasst (Higuchi, Fockler et al. 1993, Gibson, Heid et al. 1996). Die

Messung der Fluoreszenz erfolgt jeweils am Ende eines Zyklus, während der

Elongation. Der Anstieg der gemessenen Fluoreszenzintensität mit jedem neuen PCR-

Zyklus steht im direkten Verhältnis zur PCR-Produkt-Akkumulation. Über die Software

wird die gemessene Fluoreszenz gegen die Zyklenzahl dargestellt. In Abhängigkeit von

1,6 µl 25x dNTP Mix

2 µl Multiscribe TM Reverse Transcriptase

2 µl RNase Inhibitor

6,4 µl RNase-freies Wasser

20 µl RNA

Tabelle 7: Programm reverse Transkriptase PCR

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Material und Methoden

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der vorhandenen Menge an Ziel-DNA unterscheiden sich in der exponentiellen Phase

der PCR die Fluoreszenzsignale signifikant von den Hintergrundsignalen. Diese

Schwelle wird von der Software als CT-Wert definiert und für die relative

Quantifizierung verwendet. Der CT-Wert ist dabei umso kleiner, je höher die Menge an

Ziel-DNA in der Probe ist.

Die Spezifität der Amplifikation wird gewährleistet, indem im Anschluss eine

Schmelzkurvenanalyse durchgeführt wird, dabei wird die DNA durch kontinuierliche

Temperaturerhöhung aufgeschmolzen. Abhängig von der Länge und

Nukleinsäuresequenz des spezifischen Produktes denaturiert der Doppelstrang bei

einer spezifischen Temperatur in zwei Einzelstränge und der Fluoreszenzfarbstoff wird

freigesetzt.

In dieser Arbeit erfolgte die real-time PCR mit Hilfe des SYBR Green

Fluoreszenzfarbstoffes. Die Messung wurde am Real-time PCR System StepOnePlus

TM (beides Applied Biosystems) durchgeführt und die Auswertung erfolgte mittels der

Geräte-spezifischen Software.

Als Referenzgen wurde bei allen Versuchen entweder UbcH5B (ubiquitin-conjugating

enzyme E2D2, UBC) oder β-Aktin gemessen. Die Berechnung der relativen Expression

erfolgte nach der folgenden Formel:

Relative Expression = 2^(CT Referenzgen – CT Zielgen).

3.12.2 Durchführung der SYBR Green real-time PCR

Für die real-time PCR wurde der SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems)

verwendet. Die Zusammensetzung des PCR-Ansatzes ist in Tabelle 8 aufgeführt. Die

Messung erfolgte im StepOnePlus TM nach dem in Tabelle 9 aufgelisteten Programm.

Volumen (12,5 µl total) Reagenz

6,25 µl SYBR Green PCR Master Mix 2x

Tabelle 8: Pipettieransatz real-time PCR

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Material und Methoden

55

0,5 µl forward Primer

0,5 µl reverse Primer

3,25 µl PCR Wasser

2 µl cDNA

Zyklus Zeit / Temperatur /

Temperaturanstieg

Anzahl

Denaturierung 95 °C; 10 min; max. 1

Amplifikation 95 °C, 15 s; max.

60-62 °C *, 15 s, max.

72 °C, 30 s, max.

einzelne Messung

40

Schmelzkurve 95 °C, 15 s, max.

60 °C, 1 min, max.

95 °C, 15 s, 0,3 °C/s

Kontinuierliche Messung

1

Abkühlen 25 °C, ∞, max. 1

* Annealing-Temperatur ist Primer-spezifisch (siehe Tabelle 1)

Tabelle 9: Programm real-time PCR

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Material und Methoden

56

3.13 Cytometric Bead Assay

Für die Quantifizierung von Zytokinen im Zellkulturüberstand wurde der Cytometric

Bead Assay (CBA) verwendet. Das Prinzip dieser Methode basiert auf Partikeln, mit

unterschiedlicher Eigenfluoreszenz, die mit einem spezifischen, gegen das Zytokin

gerichteten Antikörper markiert sind. Wenn man nun Zytokine mit den Partikeln

inkubiert, binden die Antikörper das im Überstand vorhandene Zytokin auf ihrer

Oberfläche. Im nächsten Schritt erfolgt die Zugabe eines Fluoreszenz-markierten

Antikörpers, der erneut gegen das Zytokin gerichtet ist. Die Intensität des zweiten

Fluoreszenzsignals steht in Korrelation zu der Konzentration des zu messenden

Zytokins. Für die exakte Quantifizierung wird eine Standardreihe mit definierter

Konzentration für das einzelne Zytokin durchgeführt. Anhand der Eichkurve kann nun

die Konzentration des Zytokins im gemessenen Zellüberstand berechnet werden. Die

Messung der Partikel erfolgte im Durchflusszytometer FACSCantoII (BD) und die

Auswertung erfolgte mit der Software FCAP Array TM Software (BD) bzw. FlowCytomix

Pro (eBioscience).

In dieser Arbeit wurden das Cytometric Bead Array Mouse Inflammation Kit (BD) und

das Mouse Th1/Th2/Th17/Th22 13 plex Kit FlowCytomix (eBioscience) verwendet. Die

Durchführung des Tests erfolgte gemäß dem jeweiligen Protokoll des Herstellers.

3.14 Tierexperimentelle Methoden

3.14.1 Zelltransfer durch intravenöse Injektion

Zur Erweiterung der Gefäße wurden die Mäuse zunächst unter einer Infrarotlampe

erwärmt und dann in einer abgedunkelten Vorrichtung fixiert. Die Zellinjektion erfolgte

mit einer 1 ml Spritze und einer 30G Kanüle intravenös (i.v.) in eine der

Schwanzvenen. Pro Tier wurden maximal 200 µl einer Zellsuspension (Zellen in PBS)

bzw. Antikörperlösung gespritzt.

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Material und Methoden

57

3.14.2 In vivo Migration von CD4+ T-Zellen

Um die Migration von CD4+ T-Zellen in vivo zu untersuchen, wurden Homingassays

durchgeführt. Dazu wurden die Zellen in einer Zelldichte von 2x107/ml cRPMI mit

51Chrom (20 μCi/ml) für 1 h bei 37 °C radioaktiv markiert. Nach zweimaligem Waschen

mit cRPMI wurden die Zellen für 1 h bei 37 °C und 5% CO2 inkubiert und anschließend

die toten Zellen mittels eines 17 % Nycodenzgradienten entfernt.

Die radioaktiv markierten Zellen wurden in einer Zelldichte von 1x106/200 μl PBS i.v. in

die Mäuse gespritzt. Mit Hilfe eines WIZARD® Gamma-Counters wurde die in

bestimmten Organen, Blut und dem Restkörper enthaltene Radioaktivität gemessen.

Der angegebende Prozentsatz organspezifischer Radioaktivität, im Verhältnis zur

gesamten detektierten Radioaktivität, stellt den prozentualen Anteil von CD4+ T-Zellen

dar, die in das entsprechende Organ migriert waren.

3.14.3 Transfercolitis

Der Mausstamm B6.129S7-Rag1tm1 Mom besitzt keine reifen B- und T-Zellen. Für die

Induktion der Colitis wurden 1x106 naive CD4+ T-Zellen (CD4+CD62Lhigh; WT) in ca. 12

Wochen alte Empfängertiere dieses Mausstammes i.v. injiziert. Um das

inflammatorische Potential von TLSEC zu testen, wurden alternativ 1x106 TLSEC

transferiert bzw. zur Analyse der suppressiven Kapazität der TLSEC Zellen, wurden

zusätzlich zu den naiven CD4+ T-Zellen 1x106 TLSEC ko-transferiert. Der

Gesundheitszustand der Tiere wurde regelmäßig überprüft. Erste Anzeichen einer

Colitis zeigten sich durch Gewichtsabnahme, Veränderung der Stuhlbeschaffenheit

bzw. Detektierbarkeit von Blut im Stuhl. Zur Analyse des Krankheitsverlaufs wurde die

durchschnittliche Gewichtsänderung gegenüber dem Ausgangswert aufgetragen.

Zusätzlich wurde der durchschnittliche klinische Score ermittelt, der sich aus den oben

genannten Parametern zusammensetzt und sich, wie in Tabelle 10 aufgeführt,

errechnet.

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Material und Methoden

58

Punkte Gewichtsverlust Stuhlbeschaffenheit Rektale Blutung

0 0 % Geformt Negativer HemoCARE

1 < 5 %

2 5 – 9,9 % Breiig Positiver HemoCARE

3 10 – 20 %

4 > 20 % Flüssig Negativer HemoCARE

3.14.4 Delayed type hypersensitivity-Model

Die Hypersensitivitätsreaktion vom verzögerten Typ (DTH, delayed type

hypersensitivity) ist ein Entzündungsmodell, welches durch Th1 Zellen vermittelt wird.

Dazu wurden 5x105 OVA-TCR transgene in vitro differenzierte Th1 Zellen i.v. in WT

Empfängertiere transferiert. Nach 24 h wurde die DTH durch die subkutane (s.c.)

Injektion von 250 ng OVA-Peptid in inkompletten Freund´schen Adjuvants (IFA; IFA 1:1

mit PBS) in eine Fußsohle ausgelöst. In den Kontrollfuß wurde ausschließlich PBS in

IFA injiziert. Um die suppressive Kapazität der Th1LSEC Zellen zu testen, wurden jeweils

5x105 Th1 Zellen zusammen mit 5x105 Th1LSEC bzw. Th1SAPC ko-transferiert. Um das

von den T-Zellen sezernierte IL-10 zu blockieren, wurde einigen Tieren zeitgleich mit

dem Zelltransfer 1 mg eines anti-IL-10 Rezeptor Antikörpers bzw. entsprechenden

Kontrollantikörpers (Ratten IgG1k) i.v. gespritzt. Die DTH wurde anhand der

Fußsohlenschwellung detektiert und über einen Zeitraum von 7 Tagen verfolgt. Die

Fußsohlenschwellung wurde mit einem Oditest Dickenmesser bestimmt.

3.15 Histologie

In Kooperation mit dem Serviceprojekt Z1 des SFB633 unter Leitung von Dr. Anja Kühl

wurden die immunhistologischen und -pathologischen Analysen dieser Arbeit durch die

Arbeitsgruppe von Dr. Anja Kühl durchgeführt.

Tabelle 10: Scoringübersicht Klinischer Score der Colitis

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Material und Methoden

59

3.15.1 Immunfluoreszenz

Zur Analyse der Expression des Notch-Liganden Dll4 wurden von kryokonserviertem

Lebergewebe am Microtom (Microm HM 325) 5 µm Schnitte angefertigt, mit Aceton

fixiert, mit einem Ratte-anti-Maus CD146 Antikörper (Biolegend) und anschließend mit

einem AF488-markierten Affe anti-Ratte Sekundärantikörper (Dianova) inkubiert.

Daraufhin wurden die Schnitte mit einem Hamster anti-Maus Dll4 Antikörper

(Biolegend) und nachfolgend mit einem AF647 –markierten Ziege anti-Hamster

Sekundäranikörper (Dianova) inkubiert. Vor der Markierung mit den

Sekundärantikörpern erfolgte eine Blockierung mit 10% Affen- bzw. Ziegenserum

(Dianvova). Die Zellkerne wurden mit DAPI (Roche) angefärbt, die Schnitte mit

Fluoromount (Biozol) überzogen und mit Hilfe des AxioImager Z1 Mikroskop (Carl

Zeiss MicroImaging, Inc., Jena) analysiert.

3.15.2 Immunpathologie

Zur Bewertung des Grades der Entzündung des Colons bei der Colitis wurden

histologische Analysen durchgeführt. Dazu wurden ca. 1 cm lange Colonabschnitte mit

PBS gespült und in 4 % PFA über Nacht fixiert und in Paraffin eingebettet. Am

Microtom wurden 2 μm Paraffinschnitte angefertigt. Diese Schnitte wurden daraufhin

durch Xylol entparaffiniert, durch eine absteigende Alkoholreihe rehydriert und mit

Hämatoxylin-Eosin gefärbt. Die Bilder wurden mittels eines AxioImager Z1 Mikroskop

generiert sowie mit der Axiovision Software prozessiert. Die Bewertung der Bilder

erfolgte geblindet wie durch die Gruppe Kühl beschrieben (Erben, Loddenkemper et al.

2014).

Zur Quantifizierung der T-Zellinfiltrate wurden die entparaffinierten Schnitte gekocht

und damit die bei der Fixierung entstehenden Quervernetzungen zwischen

verschiedenen Gewebeantigenen entfernt und die Antigene für Antikörper wieder

zugänglich gemacht. Die Schnitte wurden zunächst mit einen anti-Maus CD4 mAk

(eBioscience) und anschließend mit einem biotinylierten Kaninchen anti-Ratte

Antikörper (Dianova) markiert. Zur Detektion wurde das Kit Dako REAL™ Detection

System LSAB+ AP/RED (Dako) verwendet. Die Zellkerne wurden mit Hämatoxylin

angefärbt und die Schnitte mit Glyceringelatine-Lösung (Merck Millipore) überzogen.

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Material und Methoden

60

Als Negativkontrolle wurden Schnitte wie oben beschrieben behandelt, nur ohne

Primärantikörper. Es wurden alle CD4+ Zellen pro Gesichtsfeld (high power field, HPF,

0.237 mm2) und 10 HPF pro Colonprobe geblindet ausgezählt. Der Mittelwert wurde als

CD4+/HPF angegeben.

3.16 Statistische Datenanalyse

Die Auswertung der Daten erfolgte mit den Programmen Excel (Microsoft) und Prism

(GraphPad Software, Inc.). Für die statistische Analyse wurde ein Mann-Whitney-Test

durchgeführt. Die Berechnung erfolgte mit Hilfe der Software Prism.

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4. Ergebnisse

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Ergebnisse

62

4.1 Modulation von CD4+ T-Zellen durch das Lebersinusendothel unter

homöostatischen Bedingungen

Über den Blutstrom zirkulierende CD4+ T-Zellen können langanhaltend und wiederholt

mit den Endothelzellen des Lebersinusoids interagieren (Carambia, Frenzel et al.

2013). Die LSEC als nicht-klassische antigenpräsentierende Zellen exprimieren MHCII

Moleküle und können CD4+ T-Zellen aktivieren (Kruse, Neumann et al. 2009). Nun

stellte sich die Frage in wieweit LSEC die funktionellen Eigenschaften der aktivierten

CD4+ T-Zellen beeinflussen können.

4.1.1 LSEC induzieren einen Darm-Homingphänotyp bei CD4+ T-Zellen

Neben der Aktivierung von CD4+ T-Zellen können APC bestimmte Homingrezeptoren

auf den T-Zellen induzieren, die die Migration der Zellen in distinkte Gewebe oder den

Ort einer Entzündung ermöglichen (Dudda, Lembo et al. 2005, Huehn and Hamann

2005). Hier wurde untersucht, ob LSEC im Vergleich zu den anderen APC in der Leber

(LAPC) und Milz (SAPC) ein spezifisches Muster an Homingrezeptoren auf den T-

Zellen induzieren. Dazu wurden naive antigenspezifische CD4+ T-Zellen mit den

verschiedenen APC und OVA-Peptid, ohne die Zugabe von polarisierenden Zytokinen,

kultiviert. Anschließend wurde auf den CD4+ T-Zellen die Expression der

darmspezifischen Homingrezeptoren α4β7-Integrin und CCR9, des für die

Einwanderung in die Lymphknoten benötigten Homingrezeptors CD62L und des für die

Migration in die Haut und entzündete Gewebe notwendigen Rezeptorliganden P-Lig

durchflusszytometrisch bestimmt.

Naive CD4+ T-Zellen waren vor dem Start der Kokultur hochpositiv für CD62L und

exprimierten kein α4β7-Integrin und CCR9, sowie kein P-Lig (Abbildung 3). Die

Kokultur der naiven CD4+ T-Zellen mit LSEC (TLSEC) bewirkte auf den T-Zellen eine

hohe Expression von α4β7-Integrin, während LAPC (TLAPC) und SAPC (TSAPC) eine

signifikant geringere Expression dieses Rezeptors induzierten (Abbildung 3 A). Eine

ähnliche Verteilung der Expression, wenn auch in geringerem Ausmaß, konnte für

CCR9 ermittelt werden (Abbildung 3 B).

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Ergebnisse

63

Abbildung 3: Expression gewebespezifischer Homingrezeptoren auf CD4

+ T-Zellen.

CD4+CD62L

high T-Zellen aus OT-IIxB6PL Mäusen wurden für 6 d mit LSEC, LAPC oder SAPC

aus C57BL/6-Mäusen in Anwesenheit von OVA-Peptids kokultiviert. Naive bzw. aktivierte CD4+

T-Zellen wurden mit einem anti-α4β7-Integrin (A), anti-CCR9 (B) oder anti-CD62L Antikörper (C) markiert. Zur Ermittlung der P-Lig-Expression wurden die Zellen mit einem anti-Maus P-Selektin/Mensch-IgG Fc-Chimärenprotein und einem anti-Mensch IgG Fc gefärbt (D). Die Zellen wurden am Durchflusszytometer analysiert. Es sind repräsentative Histogramme aus 4 unabhängigen Experimenten dargestellt. Ausgefüllte Kurve, unmarkierte Zellen; verstärkte Linie, Antikörperfärbung. Prozentuale Anteile α4β7-Integrin

+, CCR9

+, P-Lig

+ und CD62L

+ CD4

+ T-

Zellen sind angegeben. Das Gate liegt auf CD4+ T-Zellen. * = p < 0,05; ** = p < 0,01 Mann-

Whitney-Test.

Page 64: Modulation von CD4+ T-Zellen durch Lebersinusendothelzellen · 2008, Takada and Jameson 2009, Sprent and Surh 2011)). Die hauptsächliche Ausbildung des T-Zell-Repertoires findet

Ergebnisse

64

Die Expression von CD62L blieb bei den TLSEC auf einem sehr hohen Niveau, während

bei den TLAPC und TSAPC eine sehr geringe Expression beobachtet wurde (Abbildung 3

C). Entgegengesetzt dazu wurde auf den TLSEC eine niedrige Expression von P-Lig

detektiert, wobei die TLAPC und TSAPC eine sehr hohe Expression des Rezeptors zeigten

(Abbildung 3 D).

Die Ergebnisse belegen, dass von LSEC aktivierte CD4+ T-Zellen, im Gegensatz zu

TLAPC und TSAPC, die darmspezifischen Homingrezeptoren α4β7-Integrin und CCR9

exprimierten. LAPC und SAPC hingegen induzierten auf CD4+ T-Zellen viel P-Lig.

4.1.2 LSEC induzieren kein pro-inflammatorisches Interferon-γ und

keine Apoptose bei CD4+ T-Zellen

Nach der Untersuchung der Homingrezeptoren auf CD4+ T-Zellen, welche durch

verschiedene APC Populationen aktiviert wurden, sollte die Expression

entzündungsspezifischer Zytokine ermittelt werden. Dazu wurden Kokulturen von

naiven antigenspezifischen CD4+ T-Zellen und den verschiedenen APC ohne die

Zugabe von polarisierenden Zytokinen durchgeführt und analysiert ob die CD4+ T-

Zellen das pro-inflammatorische IFNγ exprimieren.

TLSEC exprimierten kein IFNγ, während bei TLAPC und TSAPC hohe Frequenzen IFNγ+

CD4+ T-Zellen gemessen wurden (Abbildung 4 A). Interessanterweise war ein Großteil

der TLAPC und TSAPC apoptotisch, was sich in einem hohen gMean für Annexin-V

Bindung wiederspiegelte (Abbildung 4 B). In Kulturen mit LSEC traten kaum

apototische TLSEC auf.

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Ergebnisse

65

Abbildung 4: Expression von IFNγ und Induktion von Apoptose bei CD4+ T-Zellen.

CD4+CD62L

high T-Zellen aus OT-IIxB6PL Mäusen wurden für 6 d mit LSEC, LAPC oder SAPC

aus C57BL/6-Mäusen in Anwesenheit von OVA-Peptid kokultiviert. Naive bzw. aktivierte CD4+

T-Zellen wurden für 4 h mit PMA/Iono/BrefA restimuliert, fixiert, permeabilisiert und mit einem anti-IFNγ Antikörper (A) markiert. Zur Ermittlung der apoptotischen Zellen wurden die Zellen mit einem Annexin-V Konjugat markiert (B). Die Zellen wurden am Durchflusszytometer analysiert. Es sind repräsentative Histogramme aus 4 unabhängigen Experimenten dargestellt. Ausgefüllte Kurve, unmarkierte Zellen; verstärkte Linie, Antikörperfärbung. Prozentuale Anteile IFNγ

+ T-

Zellen sind angegeben. Für Annexin-V ist der gMean angegeben. Das Gate liegt auf CD4+ T-

Zellen. * = p < 0,05; ** = p < 0,01 Mann-Whitney-Test.

4.1.3 TLSEC supprimieren CD8+ T-Zellen in vitro

Die Aktivierung von CD4+ T-Zellen durch LSEC führt nicht zur Expression des pro-

inflammatorischen Zytokins IFNγ. Demzufolge wurde untersucht, ob die TLSEC evtl. anti-

inflammatorische bzw. suppressive Eigenschaften besitzen und diese mit der Kapazität

von ex vivo isolierten regulatorischen T-Zellen (Treg) verglichen. Kollegen aus unserer

Arbeitsgruppe zeigten bereits, dass TLSEC die Proliferation von CD4+ T-Zellen in vitro

supprimierten (Kruse, Neumann et al. 2009). Hier sollte nun die Suppression von CD8+

T-Zellen untersucht werden. Dazu wurden CFDA-SE markierte naive CD8+ T-Zellen in

der Anwesenheit von TLSEC bzw. Treg durch SAPC und anti-CD3 mAk für 3 d aktiviert

und anschließend hinsichtlich ihrer Proliferation und Expression von Effektorzytokinen

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Ergebnisse

66

analysiert. CD8+ T-Zellen benötigen für ihre Differenzierung in zytotoxische

Effektorzellen die Hilfe durch CD4+ T-Zellen. Dafür wurden die Kokulturen als

zusätzlichen Kontrollansatz in der Gegenwart von naiven CD4+ T-Zellen durchgeführt.

Die in der Anwesenheit von naiven CD4+ T-Zellen aktivierten CD8+ T-Zellen

proliferierten am stärksten, erkennbar am niedrigsten gMean von CFSE (Abbildung 5

A). Bei den Kokulturen mit TLSEC und Treg wurde hingegen eine signifikant geringere

Proliferation der CD8+ T-Zellen beobachtet (Abbildung 5 B). Bei den Kulturen mit

naiven CD4+ T-Zellen hatten die CD8+ T-Zellen die höchsten Frequenzen an den

Zytokinen IL-2, IFNγ und TNFα (Abbildung 5 B-D). Waren hingegen TLSEC oder Treg in

der Kokultur anwesend, war der prozentuale Anteil an Zytokin-positiven Zellen

signifikant reduziert. Bei der Analyse der Zellkulturüberstände wurden in der

Anwesenheit der naiven CD4+ T-Zellen die höchsten Konzentrationen an IFNγ und

TNFα gemessen (Abbildung 5 E, F). Diese waren reduziert, sobald TLSEC bzw. Treg in

den Kulturen präsent waren.

Zusammenfassend wurde hier gezeigt , dass CD8+ T-Zellen, die durch anti-CD3 mAk

und SAPC aktiviert worden waren, in der Gegenwart von naiven CD4+ T-Zellen stark

proliferierten und eine hohe Expression von pro-inflammatorischen Zytokinen

aufwiesen. Die Anwesenheit von TLSEC bzw. Treg in den Kokulturen resultierte in einer

signifikant verringerten Proliferation und Expression der Effektorzytokine IL-2, IFNγ und

TNFα der CD8+ T-Zellen. Ein Unterschied zwischen den TLSEC und Treg in den Kulturen

und bei den analysierten Parametern wurde nicht ermittelt, sie wirkten gleichermaßen

suppressiv.

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Ergebnisse

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Ergebnisse

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Abbildung 5: In vitro Suppression von CD8+ T-Zellen durch TLSEC.

CFDA-SE markierte CD8+CD44

- T-Zellen als responder-Zellen wurden mit SAPC für 3 d ko-

kultiviert und polyklonal mit 2 µg/ml anti-CD3 mAk stimuliert. Als suppressorische Effektorzellen wurden entweder ex vivo isolierte Treg, in vitro generierte TLSEC oder naive CD4

+ T-Zellen als

Negativkontrolle im Verhältnis 1:1 zu den CD8+ T-Zellen eingesetzt. T-Zellen wurden für 4 h mit

PMA/Iono/BrefA restimuliert, fixiert, permeabilisiert, mit einem anti-IL-2 (B), anti-IFNγ (C) bzw. anti-TNFα (D) Antikörper markiert und durchflusszytometrisch analysiert. Die Zellüberstände wurden abgenommen und mittels CBA analysiert (E, F). Prozentuale Anteile Zytokin-positiver CD8

+ T-Zellen sind angegeben. Für die Proliferation CD8

+ T-Zellen ist der gMean der CFSE

Markierung angegeben (A). Das Gate liegt auf CD8+ T-Zellen. * = p < 0,05; ** = p < 0,01 Mann-

Whitney-Test.

4.1.4 TLSEC supprimieren eine Colitis in vivo

In den vorhergehenden Experimenten konnte gezeigt werden, dass in vitro generierte

TLSEC sowohl darmspezifische Homingrezeptoren exprimieren, als auch in der Lage

sind die Aktivierung und Ausbildung von Effektorzytokinen von T-Zellen zu inhibieren.

Nun stellte sich die Frage, ob TLSEC in vivo die Fähigkeit besitzen, eine durch T-Zellen

vermittelte Entzündung im Darm zu supprimieren. Dazu wurde das Transfercolitismodel

verwendet (Powrie, Leach et al. 1993). Rag1-/- Mäuse besitzen keine reifen B- und T-

Zellen. Werden nun naive CD4+ T-Zellen (CD4+CD62Lhigh) i.v. in diese Tiere injiziert, so

findet zum einen eine Autoproliferation der transferierten Zellen statt um das leere

Kompartiment aufzufüllen und zum anderen eine Aktivierung durch Antigene

endogener Bakterien (Übersicht in (Izcue, Coombes et al. 2009)). Beide Faktoren

zusammen bewirken die Ausprägung einer Darmentzündung, die sich durch

Gewichtsverlust, Verkürzung des Colons und massive Infiltration von mononukleären

Zellen in die Lamina propria äußert.

Zum einen wurden naive CD4+ T-Zellen allein in Rag1-/- Rezipienten injiziert - bei

diesen Mäusen sollte die stärkste Ausprägung des Krankheitsverlaufs beobachtet

werden können. Um zu analysieren welchen Einfluss TLSEC auf den Krankheitsverlauf

haben, wurden bei einer Gruppe zusätzlich zu den naiven CD4+ T-Zellen TLSEC ko-

transferiert. Des Weiteren wurden einer Gruppe an Mäusen TLSEC allein injiziert. In

diesen Tieren sollte beobachtet werden, ob die Eigenschaften der TLSEC stabil sind oder

die Zellen eine Darmentzündung auslösen. Zum Vergleich wurden Mäuse beobachtet,

die keine Zellen erhalten hatten. In diesem Kontext wurde ein initialer Versuch mit je

fünf Mäusen pro Gruppe durchgeführt.

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Ergebnisse

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Ergebnisse

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Abbildung 6: In Vivo Suppression einer Transfercolitis durch TLSEC. CD4

+CD62L

high T-Zellen aus C57BL/6 Mäusen wurden i.v. in Rag1

-/- Mäuse transferiert.

Alternativ bzw. zusätzlich wurden in vitro generierte TLSEC transferiert. Die Gewichtsabnahme wurde in Relation zum Ausgangsgewicht aufgetragen (A). Der klinische Score errechnete sich aus Gewichtsabnahme, Stuhlbeschaffenheit und dem Nachweis von okkultem Blut im Stuhl (B). Nach Versuchsende wurde die Colonlänge bestimmt (C) und der Entzündungsgrad im Colon (D) immunpathologisch ermittelt. Die Lymphozyten der Lamina propria wurden isoliert (E). Die Bestimmung der Anzahl der entzündungsauslösenden CD4 Zellen erfolgte mittels Immunpathologie (F, G). Dargestellt ist ein Experiment mit 5 Tieren pro Gruppe. Statistischer Vergleich in (A) und (B) erfolgte zwischen den Gruppen naive CD4

+ T-Zellen und Ko-Transfer

Naive CD4+ T-Zellen + TLSEC. * = p<0,05; ** = p<0,01; Mann-Whitney-Test.

Der größte Gewichtsverlust trat bei den Mäusen auf, die nur naive CD4+ T-Zellen

erhielten (Abbildung 6 A). Beim Ko-Transfer von naiven CD4+ T-Zellen und TLSEC war

der Gewichtsverlust partiell signifikant geringer ausgeprägt. Sowohl die unbehandelten

Tiere, als auch die Tiere, die nur TLSEC erhalten hatten, zeigten keine Veränderung des

Körpergewichtes. Bei den Tieren mit naiven CD4+ T-Zellen wurde der höchste klinische

Score im Vergleich zu allen anderen Gruppen ermittelt (Abbildung 6 B). Vergleichend

dazu zeigte die Gruppe, bei der TLSEC zusammen mit naiven CD4+ T-Zellen ko-

transferiert wurden, teilweise eine signifikante Reduktion des klinischen Scores. Für die

Gruppen mit den unbehandelten Tieren und dem alleinigen Transfer von TLSEC wurde

der niedrigste klinische Score ermittelt. Die Colonlänge bei Mäusen mit nCD4+ T-Zellen

allein und im Ko-Transfer mit TLSEC war am stärksten verkürzt (Abbildung 6 C). Wurden

TLSEC allein transferiert, so waren die Colonlängen vergleichbar zu den unbehandelten

Tieren. Bei der Analyse des histo-pathologischen Scores im Colon wurden für die

Gruppen mit CD4+ T-Zellen allein oder zusammen mit TLSEC die höchsten Werte

bestimmt (Abbildung 6 D). Die zusätzliche Applikation von TLSEC zu naiven CD4+ T-

Zellen resultierte in keiner Veränderung des Score-Wertes. Die Gruppe der

unbehandelten Mäuse zeigte keine pathologische Veränderung des Colons, während

in den Dickdärmen der TLSEC-Gruppe größtenteils geringe Zellinfiltrate beobachtet

wurden, die mit einem Score-Wert von 1 gewertet wurden. Die Anzahl der isolierten

Lymphozyten aus der Lamina propria (LPL) war bei der Gruppe der nCD4 am höchsten

(Abbildung 6 E). Der Ko-transfer von TLSEC resultierte hier in einer signifikanten

Verringerung der LPL Zahl. Die unbehandelten Mäuse und die Tiere mit TLSEC allein

zeigten die geringsten Zellzahlen an LPL. Bei der Quantifizierung von CD4+ Zellen im

Colongewebe wurden bei den Tieren mit nCD4 die höchste Zahl an CD4+ Zellen

detektiert (Abbildung 6 F, G). Der Ko-Transfer von TLSEC und naiven CD4+ T-Zellen

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Ergebnisse

71

resultierte in einer hoch signifikanten Verringerung der Zahl CD4+ Zellen in der Lamina

propria. Für die unbehandelte Gruppe und TLSEC allein konnten nahezu keine CD4+

Zellen im Gewebe gemessen werden.

Zusammengefasst zeigte die Gruppe, die nur naive CD4+ T-Zellen erhalten hatte, den

schwersten Krankheitsverlauf der Dickdarmentzündung. Bei den untersuchten

Parametern Gewichtsverlauf, klinischer Score, LPL Zahl und Anzahl CD4 Zellen im

Gewebe führte der Transfer von TLSEC zusätzlich zu den nCD4 zu einer teilweise

signifikanten Milderung der Pathogenese. Die Colonlänge und der histopathologische

Score waren durch den Ko-transfer der TLSEC nicht verändert. Der Transfer von

ausschließlich TLSEC in Rag1-/- Mäuse löste keine Colitis aus. Die Mäuse dieser Gruppe

verhielten sich weitestgehend wie die unbehandelte Kontrollgruppe.

4.1.5 TLSEC exprimieren regulatorische Markerproteine

Die Suppression unerwünschter Immunantworten durch regulatorische T-Zellen wird

sowohl durch zellgebundene als auch durch lösliche Faktoren vermittelt. Durch die

Expression verschiedener Markerproteine ist zudem eine Zuordnung von

regulatorischen Zellen zu beschriebenen, regulatorisch wirkenden T-Zellpopulationen

möglich. TLSEC konnten CD8+ T-Zellen supprimieren und die Pathogenese einer Colitis

reduzieren. In diesem Zusammenhang sollte jetzt untersucht werden, ob TLSEC

charakteristische Marker exprimieren, die im Kontext von regulatorischen T-Zellen

beschrieben sind. Dazu wurden naive CD4+ T-Zellen antigenspezifisch durch LSEC

oder SAPC ohne die Zugabe von polarisierenden Zytokinen in vitro aktiviert und

hinsichtlich der Expression der entsprechenden Proteine durchflusszytometrisch oder

über realtime PCR untersucht.

Die Expression der Transkriptionsfaktoren FoxP3 und Helios durch Treg ist ausführlich

beschrieben (Sakaguchi 2005, Sakaguchi, Yamaguchi et al. 2008, Getnet, Grosso et al.

2010). TLSEC exprimierten im Gegensatz zu TSAPC zu einem hohen Anteil Helios

(Abbildung 7 A). Bei TLSEC war zudem ein kleiner Anteil an FoxP3-positiven Zellen

nachweisbar. Die TSAPC Kultur enthielt nahezu keine FoxP3+ Zellen.

Page 72: Modulation von CD4+ T-Zellen durch Lebersinusendothelzellen · 2008, Takada and Jameson 2009, Sprent and Surh 2011)). Die hauptsächliche Ausbildung des T-Zell-Repertoires findet

Ergebnisse

72

ENTPD1 (CD39) ist im Zusammenhang von regulatorischen T-Zellen und

Immunosuppression durch Leukozyten beschrieben worden (Bynoe and Viret 2008,

Hyman, Petrovic-Djergovic et al. 2009). Auf TLSEC wurde eine höhere Expression von

CD39 nachgewiesen, als bei TSAPC (Abbildung 7 B).

Durch die Sekretion von Granzym und Perforin induzieren regulatorische T-Zellen

Apoptose in Zielzellen (Grossman, Verbsky et al. 2004, Gondek, Lu et al. 2005,

Boissonnas, Scholer-Dahirel et al. 2010). Über realtime PCR wurde die relative

Expression von Granzym B und Perforin-1 von naiven CD4+ T-Zellen vor und nach der

antigenspezifischen Aktivierung durch LSEC bzw. SAPC bestimmt und ins Verhältnis

zueinander gesetzt. Bei TLSEC wurde eine signifikant höhere Induktion sowohl der

Granzym B als auch der Perforin-1 mRNA ermittelt, als bei TSAPC (Abbildung 7 C, D).

Die Ergebnisse belegen, dass auf TLSEC die Expression Helios und einem sehr

geringen Anteil von FoxP3 nachzuweisen ist. Ebenso konnte gezeigt werden, dass

TLSEC die Effektormoleküle ENTPD1, Granzym und Perforin in einem größeren Umfang

exprimierten, als TSAPC.

Page 73: Modulation von CD4+ T-Zellen durch Lebersinusendothelzellen · 2008, Takada and Jameson 2009, Sprent and Surh 2011)). Die hauptsächliche Ausbildung des T-Zell-Repertoires findet

Ergebnisse

73

Abbildung 7: Charakterisierung der suppressiven Eigenschaften der TLSEC. CD4

+CD62L

high T-Zellen aus OT-IIxB6PL Mäusen wurden für 6 d mit LSEC oder SAPC aus

C57BL/6 Mäusen in Anwesenheit von OVA-Peptid kokultiviert. Aktivierte CD4+ T-Zellen wurden

mit einem anti-ENTPD1 Antikörper (B) markiert, bzw. fixiert, permeabilisiert und mit einem anti-Helios und anti-FoxP3 Antikörper (A) markiert und durchflusszytometrisch analysiert. Die mRNA der T-Zellen wurde isoliert und die Expression von Granzym B (C) und Perforin-1 (D) über realtime PCR bestimmt. Es sind repräsentative Histogramme bzw. Graphen aus 3 unabhängigen Experimenten dargestellt. Ausgefüllte Kurve, unmarkierte Zellen; verstärkte Linie, Antikörperfärbung. Das Gate liegt auf CD4

+ T-Zellen. * = p < 0,05 Mann-Whitney-Test.

Page 74: Modulation von CD4+ T-Zellen durch Lebersinusendothelzellen · 2008, Takada and Jameson 2009, Sprent and Surh 2011)). Die hauptsächliche Ausbildung des T-Zell-Repertoires findet

Ergebnisse

74

4.2 Modulation von CD4+ T-Zellen durch das Lebersinusendothel unter

entzündlichen Bedingungen

Für aktivierte und Effektor/Gedächtnis T-Zellen wurde beschrieben, dass sie vorrangig

in die Leber migrieren um dort moduliert oder deletiert zu werden (Mehal, Juedes et al.

1999, Klugewitz, Blumenthal-Barby et al. 2002, Limmer, Ohl et al. 2005). Hier sollte

nun untersucht werden ob die Modulation von Th1 Zellen durch Lebersinus-

endothelzellen die migratorischen und inflammatorischen Eigenschaften der T-Zellen

beeinflusst.

4.2.1 LSEC induzieren einen Darmhoming-Phänotyps bei Th1 Zellen

Im ersten Teil dieser Arbeit konnte bereits gezeigt werden, dass CD4+ T-Zellen, die

unter homöostatischen Bedingungen mit dem Lebersinusendothel interagieren,

darmspezifische Homingrezeptoren hochregulieren. Im folgenden Teil sollte untersucht

werden, welchen Einfluss LSEC auf die Migrationseigenschaften von CD4+

Effektorzellen haben. Dazu wurden in vitro naive CD4+ T-Zellen antigenspezifisch unter

Th1 polarisierendem Bedingungen (IL-12, IL-2, anti-IL-4 mAK) für sechs Tage durch

SAPC aktiviert und dann auf LSEC, LAPC bzw. SAPC antigenspezifisch für drei Tage

reaktiviert, ohne dass erneut Zytokine hinzugegeben worden waren. Die Expression

des darmspezifischen Homingrezeptors α4β7-Integrin und des Liganden P-Lig, der für

eine Einwanderung in die Haut und entzündetes Gewebe notwendig ist, wurde nach

Markierung mit den entsprechenden Antikörpern durchflusszytometrisch analysiert.

Die Reaktivierung von Th1 Zellen durch LSEC (Th1LSEC) bewirkte eine sehr starke

Induktion von α4β7-Integrin. Die Kokultur von Th1 Zellen mit LAPC (Th1LAPC) als auch

mit SAPC (Th1SAPC) resultierte hingegen in einer signifikant geringeren Expression von

α4β7-Integrin auf den T-Zellen (Abbildung 8 A). Entgegengesetzt dazu führte die

Rekultur von Th1 Zellen auf LSEC zu einer verringerten P-Lig Expression der T-Zellen,

während bei LAPC und SAPC eine hohe P-Lig Expression detektiert wurde (Abbildung

8 B).

Page 75: Modulation von CD4+ T-Zellen durch Lebersinusendothelzellen · 2008, Takada and Jameson 2009, Sprent and Surh 2011)). Die hauptsächliche Ausbildung des T-Zell-Repertoires findet

Ergebnisse

75

Abbildung 8: Expression gewebespezifischer Homingrezeptoren auf Th1 Zellen. In vitro generierte Th1 Zellen aus OT-IIxB6PL Mäusen für 3 d mit LSEC, LAPC oder SAPC aus C57BL/6 Mäusen in der Anwesenheit von OVA-Peptid reaktiviert. Die Reaktivierung der Th1

Page 76: Modulation von CD4+ T-Zellen durch Lebersinusendothelzellen · 2008, Takada and Jameson 2009, Sprent and Surh 2011)). Die hauptsächliche Ausbildung des T-Zell-Repertoires findet

Ergebnisse

76

durch LSEC erfolgte zusätzlich in der An- und Abwesenheit von LE-540 (C, D). Th1 bzw. reaktivierte Th1 wurden mit einem anti-α4β7-Integrin (A, C) Antikörper markiert. Zur Ermittlung der P-Lig-Expression wurden die Zellen mit einem anti-Maus P-Selektin/Mensch-IgG Fc-Chimärenprotein und einem anti-Mensch IgG Fc gefärbt (B, D). Die Zellen wurden am Durchflusszytometer analysiert. Es sind repräsentative Histogramme aus 4 unabhängigen Experimenten dargestellt. Ausgefüllte Kurve, unmarkierte Zellen; verstärkte Linie, Antikörperfärbung. Prozentuale Anteile α4β7-Integrin

+ und P-Lig

+ T-Zellen sind angegeben. Das

Gate liegt auf CD4+ T-Zellen. In vitro re-aktivierte Th1LSEC bzw. Th1SAPC wurden radioaktiv-markiert und i.v. in C57BL/6 Mäuse transferiert (E). Radioaktivität der einzelnen Organe wurde am Wizard Gamma Counter vermessen und ins Verhältnis zu gesamten Radioaktivität des Körpers gesetzt. Es sind zwei unabhängige Experimente mit je 5 Tieren pro Gruppe dargestellt. * = p < 0,05; ** = p < 0,01 Mann-Whitney-Test.

Es ist beschrieben worden, dass das Vitamin A Metabolit Retinolsäure (RA) ein

wichtiger Faktor für die Induktion von α4β7-Integrin auf T-Zellen ist (Iwata, Hirakiyama

et al. 2004). Vorhergehende Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe zeigten, dass

LSEC RA zur Verfügung stellen können (Neumann, Kruse et al. 2012). Um zu

Untersuchen, ob die Induktion von α4β7-Integrin auf Th1 Zellen von Retinolsäure

abhängig ist, wurden die oben beschriebenen Kulturen in der Anwesenheit des

Retinolsäurerezeptorinhibitors LE-540 durchgeführt. Dies bewirkte eine verringerte

Expression von α4β7-Integrin (Abbildung 8 C) und eine verstärkte Expression von P-

Lig (Abbildung 8 D) und zeigte die Notwendigkeit des Vorhandenseins von

Retinolsäure für die Ausbildung des darmspezifischen Homingrezeptors α4β7-Integrin

auf Th1LSEC.

Im Anschluss sollte untersucht werden, ob die differentielle Expression der

Homingrezeptoren auf Th1LSEC und Th1SAPC einen Einfluss auf deren

Homingeigenschaften hat. Dazu wurden radioaktiv-markierte Th1LSEC bzw. Th1SAPC i.v.

in WT Mäuse transferiert und nach 24 h die verbleibende Radioaktivität in den Organen

im Verhältnis zur gesamten Radioaktivität des Körpers betrachtet. Th1LSEC wanderten

signifikant stärker in mLN, PP, Dünn- und Dickdarmgewebe und Milz ein als Th1SAPC

(Abbildung 8 E). Für die Leber wurde ein vergleichbarer Anteil an eingewanderten

Th1SAPC und Th1LSEC ermittelt.

Die Daten, die in diesem Zusammenhang erhoben wurden, belegen, dass LSEC die

Expression des darmspezifischen Homingrezeptors α4β7-Integrin auf Th1 Zellen in

Abhängigkeit von Retinolsäure induzierten. Die Th1LSEC migrierten daraufhin verstärkt

in das Darmgewebe und das GALT.

Page 77: Modulation von CD4+ T-Zellen durch Lebersinusendothelzellen · 2008, Takada and Jameson 2009, Sprent and Surh 2011)). Die hauptsächliche Ausbildung des T-Zell-Repertoires findet

Ergebnisse

77

4.2.2 LSEC induzieren kein pro-inflammatorisches Interferon-γ und

keine Apoptose bei Reaktivierung exogen-aktivierter Th1 Zellen

Die Expression des pro-inflammatorischen IFNγ durch Th1 Zellen gilt als

entscheidendes Effektormolekül bei der Entstehung und dem Verlauf einer

Entzündungsreaktion (Übersicht in (Young and Hardy 1995, Boehm, Klamp et al.

1997)). Hier sollte untersucht werden, welchen Einfluss die verschiedenen

antigenpräsentierenden Zellen der Leber und der Milz auf die Aufrechterhaltung der

IFNγ Expression bei Th1 Zellen haben. Des Weiteren wurde analysiert, ob die

Reaktivierung von Th1 Zellen durch die entsprechenden APC zur Induktion von

Apotose in den T-Zellen führt. Dazu wurden in vitro naive CD4+ T-Zellen

antigenspezifisch unter Th1 polarisierendem Bedingungen (IL-12, IL-2, anti-IL-4 mAK)

für sechs Tage durch SAPC aktiviert und dann auf LSEC, LAPC bzw. SAPC

antigenspezifisch für drei Tage reaktiviert, ohne dass erneut Zytokine hinzugegeben

worden waren. Die IFNγ Expression in Th1 Zellen wurde durchflusszytometrisch

bestimmt. Durch Bindung von Annexin-V auf der Zelloberfläche erfolgte der Nachweis

von Phosphatidylserin, welches auf pro-apoptotischen Zellen von der zytosolischen

Membranseite auf die Zelloberfläche transportiert wird.

Bei Th1 Zellen, die durch LSEC reaktiviert wurden (Th1LSEC) waren die Frequenzen an

IFNγ Produzenten signifikant gegenüber Th1LAPC und Th1SAPC verringert (Abbildung 9

A). Deren IFNγ Frequenzen unterschieden sich nicht von dem prozentualen Anteil der

IFNγ positiven Zellen vor dem Start der Kokultur. Die Reaktivierung von Th1 Zellen

durch LAPC bewirkte die höchste Intensität der Annexin-V-Markierung und somit die

höchste Dichte von proapoptotischen Phosphadidylserin auf der Zelloberfläche

(Abbildung 9 B). Die Th1LSEC zeigten hingegen die geringste Fluoreszenzintensität

dieser Markierung.

Die Reaktivierung von Th1 Zellen durch LSEC resultiert in einer Verringerung der IFNγ

Expression und in der geringsten Induktion von Apoptose.

Page 78: Modulation von CD4+ T-Zellen durch Lebersinusendothelzellen · 2008, Takada and Jameson 2009, Sprent and Surh 2011)). Die hauptsächliche Ausbildung des T-Zell-Repertoires findet

Ergebnisse

78

Abbildung 9: Expression von IFNγ und Induktion von Apoptose auf Th1 Zellen. In vitro generierte Th1 Zellen aus OT-IIxB6PL Mäusen für 6 d mit LSEC, LAPC oder SAPC aus C57BL/6 Mäusen in der Anwesenheit von OVA-Peptid reaktiviert. Th1 bzw. reaktivierte Th1 wurden für 4 h mit PMA/Iono/BrefA restimuliert, fixiert, permeabilisiert, mit einem anti-IFNγ (A) Antikörper markiert. Zur Ermittlung der apoptotischen Zellen wurden die Zellen mit einem Annexin-V Konjugat markiert (B). Die Zellen wurden am Durchflusszytometer analysiert. Ausgefüllte Kurve, unmarkierte Zellen; verstärkte Linie, Antikörperfärbung. Prozentuale Anteile IFNγ

+ Zellen sind angegeben. Für Annexin-V ist der gMean der Zellen angegeben. Das Gate

liegt auf CD4+ T-Zellen. Es sind repräsentative Histogramme aus 4 unabhängigen

Experimenten dargestellt.* = p < 0,05; ** = p < 0,01 Mann-Whitney-Test.

4.2.3 LSEC induzieren die Expression des anti-inflammatorischen IL-10

auf Th1 Zellen

Wurden naive CD4+ T-Zellen durch LSEC ohne die Zugabe von polarisierenden

Zytokinen aktiviert, so exprimierten die entstandenen TLSEC kein IFNγ. Wenn Th1

Zellen, die durch APC der Milz aktiviert worden waren, unter homöostatischen

Bedingungen durch LSEC reaktiviert worden, dann erfolgte eine Verringerung der IFNγ

Expression der Th1 Zellen. Nun stellte sich die Frage, wie CD4+ T-Zellen durch LSEC

moduliert werden, wenn in der Leber selbst eine Entzündung vorliegt. Für die

Entstehung von Th1 Zellen aus naiven CD4+ T-Zellen stellt IL-12 einen entscheidenden

Faktor dar (Trinchieri 1995, O'Garra 1998). Lebersinusendothelzellen exprimieren

Page 79: Modulation von CD4+ T-Zellen durch Lebersinusendothelzellen · 2008, Takada and Jameson 2009, Sprent and Surh 2011)). Die hauptsächliche Ausbildung des T-Zell-Repertoires findet

Ergebnisse

79

selbst kein IL-12 (Knolle, Schmitt et al. 1999), dennoch kann dieses Zytokin von den

myeloiden dendritischen Zellen in der Leber exprimiert werden und so für die

Modulation von Th1 Zellen durch LSEC im Gewebe zur Verfügung stehen (O'Connell,

Son et al. 2003). Um den Einfluss von LSEC auf die Entstehung von Th1 Zellen zu

analysieren, wurden die Kokulturen in der Anwesenheit von exogenen IL-12

durchgeführt und so ein pro-inflammatorisches Milieu simuliert. Um eine

Immunpathologie als Folge von übertriebenen Entzündungsreaktionen zu vermeiden

müssen Immunantworten begrenzt werden. Das anti-inflammatorische Zytokin IL-10 ist

in der Lage die pro-inflammatorische Wirkung von Th1 Zellen wirkungsvoll zu

beschränken. IL-10 selbst kann durch Th1 Zellen exprimiert werden und auto-regulativ

auf Th1 Zellen wirken (Jankovic, Kullberg et al. 2007, Trinchieri 2007). Um zu

untersuchen, ob LSEC in Th1 Zellen IL-10 induzieren, wurden naive CD4+ T-Zellen

antigenspezifisch durch LSEC bzw. SAPC unter der Zugabe von IL-12 aktiviert. Die

Th1SAPC und Th1LSEC wurden hinsichtlich der Expression von IFNγ und IL-10 mittels

Durchflusszytometrie, CBA und realtime PCR analysiert.

Abbildung 10: Induktion von IL-10 auf Th1 Zellen durch LSEC Naive CD4

+CD62L

high Zellen aus OT-IIxB6PL Mäusen wurden in vitro für 4 d mit LSEC oder

SAPC aus C57BL/6 Mäusen in der Anwesenheit von OVA-Peptid und IL-12 aktiviert. Th1LSEC und Th1SAPC wurden für 6 h mit PMA/Iono/BrefA/Monensin restimuliert, fixiert, permeabilisiert,

Page 80: Modulation von CD4+ T-Zellen durch Lebersinusendothelzellen · 2008, Takada and Jameson 2009, Sprent and Surh 2011)). Die hauptsächliche Ausbildung des T-Zell-Repertoires findet

Ergebnisse

80

Der prozentuale Anteil der IFNγ-positiven Zellen bei Th1 Zellen, die durch LSEC bzw.

SAPC aktiviert wurden, lag auf einem vergleichbar hohen Niveau (Abbildung 10 A, B).

Durch die exogene Zugabe von IL-12 war die IFNγ Expression der Th1LSEC nicht

reduziert (siehe Kapitel 4.2.2). Interessanterweise exprimierten die IFNγ-positiven

Zellen der Th1LSEC zu einem hohen Anteil das anti-inflammatorische Zytokin IL-10,

während die Th1SAPC nur einen geringen Anteil IL-10-positiver Zellen beinhalteten. Die

Konzentrationen von IFNγ im Zellkulturüberstand waren bei beiden APC-Populationen

vergleichbar, während die IL-10-Konzentration bei den LSEC-Kulturen im Vergleich zu

den SAPC signifikant erhöht war (Abbildung 10 C). Die IFNγ mRNA Expression der

Th1LSEC und Th1SAPC unterschied sich nicht signifikant, während für die Th1LSEC eine

signifikant höhere IL-10 Expression detektiert werden konnte (Abbildung 10 D).

Obwohl sich Th1LSEC und Th1SAPC in der IFNγ Epression nicht unterschieden,

exprimierten Th1LSEC zu einem sehr hohen Anteil das anti-inflammatorische Zytokin IL-

10, Th1SAPC hingegen nicht.

4.2.4 Th1LSEC supprimieren eine DTH-Reaktion in vivo

CD4+ T-Zellen, die unter inflammatorischen Bedingungen in vitro durch LSEC aktiviert

wurden exprimieren neben dem pro-inflammatorischen Zytokin IFNγ das anti-

inflammatorische IL-10. Um zu analysieren, ob die Th1LSEC während einer Entzündung

in vivo pro- oder anti-inflammatorische Eigenschaften besitzen, wurde das delayed

type hypersensitivity-Model (DTH) verwendet. Dazu wurden OVA-spezifische Th1LSEC

i.v. in WT Mäuse injiziert und 24 Stunden später durch die s.c. Applikation von OVA-

Peptid in inkompletten Freund´s Adjuvant (IFA) in die Fußsohle eine DTH-Reaktion

ausgelöst. Als Kontrolle wurden SAPC-aktivierte Th1 Zellen verwendet.

mit einem anti-IFNγ und anti-IL-10 Antikörper markiert (A, B). Die Zellen wurden am Durchflusszytometer analysiert. Die Zellüberstände wurden mittels CBA auf IL-10 und IFNγ Gehalt analysiert (C). Relative IL-10 und IFNγ mRNA Expression wurde mittels quantitativer realtime PCR ermittelt (D). Prozentuale Anteile IL-10

+IFNγ

+ bzw. IFNγ

+ Zellen sind angegeben.

Das Gate liegt auf CD4+ T-Zellen. Es sind repräsentative Dotplots aus 4 unabhängigen

Experimenten dargestellt.* = p < 0,05; Mann-Whitney-Test.

Page 81: Modulation von CD4+ T-Zellen durch Lebersinusendothelzellen · 2008, Takada and Jameson 2009, Sprent and Surh 2011)). Die hauptsächliche Ausbildung des T-Zell-Repertoires findet

Ergebnisse

81

Die Th1SAPC lösten am Tag 1 nach Antigengabe eine starke Schwellung der Fußsohle

aus, die sich an den folgenden Tagen langsam reduzierte (Abbildung 11 A). Als

Kontrolle für die Basalschwellung aufgrund einer leichten Entzündung, die durch die

Injektion durch IFA ausgelöst wird, erhielten einige Mäuse anstelle des OVA-Peptids

PBS. Bei diesen Tieren wurde eine geringe Schwellung der Fußsohle auf ca. das

halbe Niveau der OVA-immunisierten Füße ermittelt. Die Th1LSEC lösten eine signifikant

niedrigere Fußschwellung im Vergleich zu den Th1SAPC nach Antigengabe aus. Die

Fußschwellung der Th1LSEC Gruppe lag auf dem Niveau der PBS Kontrolle.

Um zu untersuchen, ob Th1LSEC aktiv die Entstehung einer DTH-Reaktion unterdrücken

können, wurden sie zusammen mit den entzündungsauslösenden Th1SAPC im

Verhältnis 1:1 ko-transferiert. Als Kontrolle wurden wiederum Th1SAPC verwendet. Der

Transfer der zweifachen Anzahl an Th1SAPC führte zu einer größeren Schwellung der

Fußsohle, als der Transfer der einfachen Zahl an Th1SAPC, was sich durch die erhöhte

Gesamtzellzahl erklärt (Abbildung 11 B). Der Ko-transfer von Th1SAPC und Th1LSEC

bewirkte hingegen bereits am ersten Tag eine signifikante Reduktion der

Fußsohlenschwellung und an den darauffolgenden Tagen zusätzlich eine stärke und

schnellere Abnahme der Fußsohlenschwellung.

Durch die Gabe eines blockierenden anti-IL-10 Rezeptor Antikörpers zusätzlich zu dem

Ko-transfer von Th1SAPC + Th1LSEC bzw. Th1SAPC + Th1SAPC sollte analysiert werden, ob

die Reduktion der Entzündungsreaktion durch die Th1LSEC von deren IL-10 Expression

abhängig ist. Als Kontrolle wurde alternativ ein Antikörper des entsprechenden

Isotypsappliziert. Die Blockade des IL-10 Rezeptors bewirkte, dass die Suppression

der Th1LSEC aufgehoben wurde und die Fußsohlenschwellung auf der Höhe des

zweifachen Transfers von Th1SAPC lag (Abbildung 11 C). Die Applikation des

Kontrollantikörpers hatte keinen Einfluss auf die supprimierende Wirkung der Th1LSEC.

Aus diesen Ergebnissen kann geschlossen werden, dass LSEC-aktivierte Th1 Zellen in

vivo keine Entzündungsreaktion auslösen, sondern sogar die Fähigkeit besitzen, durch

ihr sezerniertes IL-10, eine Th1-induzierte Inflammation zu unterdrücken.

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Ergebnisse

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Abbildung 11: In vivo Suppression einer DTH-Reaktion durch Th1LSEC. In vitro generierte LSEC-stimulierte (Th1LSEC) oder SAPC-stimulierte (Th1SAPC) Th1 Zellen wurden allein (A) oder zusammen mit Th1SAPC (B) i.v. in C57BL/6 Mäuse transferiert, jeweils 1x10

6 Zellen. Die DTH-Reaktion wurde 24 h nach Zelltransfer durch s.c. Injektion von OVA-

Peptid in IFA in die Fußsohle der Mäuse ausgelöst (geschlossenes Symbol; ●) und der Verlauf der Fußsohlenschwellung in den folgenden 6 d gemessen. Alternativ wurde PBS in IFA appliziert (offenes Symbol; ○). Zusätzlich zum Zelltransfer erfolge die Gabe eines anti-IL-10 Rezeptor Antikörpers bzw. entsprechender Isotypkontrolle (C). Es wurden jeweils zwei unabhängige Versuche mit je 5 Tieren pro Gruppe durchgeführt. Statistische Analyse in (A, B) erfolgte zwischen den OVA-immunisierten Tieren, in (C) zwischen Th1SAPC + Th1LSEC mit anti-IL10R mAk und IgG1. * = p < 0,05; ** = p < 0,01; *** = p < 0,001; Mann-Whitney-Test.

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Ergebnisse

83

4.2.5 ICOS-L und IL-27 spielen keine Rolle für die IL-10 Induktion in

Th1LSEC

IL-10 Expression der T-Zellen kann über zahlreiche Mechanismen, wie Zytokine oder

Rezeptoren auf der Zelloberfläche induziert werden. Ein entscheidender Faktor für die

IL-10 Expression bei Th1 vermittelten Immunreaktionen ist IL-27 (Fitzgerald, Zhang et

al. 2007, Freitas do Rosario, Lamb et al. 2012).

In den Überständen von über Nacht kultivierten LSEC war IL-27 Protein mittels CBA

nachweisbar (Abbildung 12 A). Allerdings hatte ein neutralisierender IL-27p28

Antikörper in der Kokultur von CD4+ T-Zellen und LSEC keinen Einfluss auf die

Frequenz der IL-10 positiven Th1 Zellen (Abbildung 12 B).

Abbildung 12: Einfluss von IL-27 und ICOS auf die IL-10 Expression von Th1LSEC. Ex vivo isolierte LSEC aus C57BL/6 Mäusen wurden über Nacht kultiviert und der Zellüberstand mittels CBA auf IL-27 Proteingehalt analysiert (A). Naive CD4

+CD62L

high Zellen

aus OT-IIxB6PL Mäusen wurden in vitro für 4 d durch LSEC aus C57BL/6 Mäusen in der Anwesenheit von OVA-Peptid, IL-12 und eines anti-IL-27p28 Antikörpers bzw. entsprechende Isotypkontrolle aktiviert (B). Naive CD4

+CD62L

high Zellen aus OT-IIxICOSko bzw. WT Mäusen

wurden in vitro für 4 d durch LSEC in der Anwesenheit von OVA-Peptid und IL-12 aktiviert (C) Th1LSEC wurden für 6 h mit PMA/Iono/BrefA/Monensin restimuliert, fixiert, permeabilisiert, mit einem anti-IFNγ und anti-IL-10 Antikörper markiert (B, C). Die Zellen wurden am Durchflusszytometer analysiert. Prozentuale Anteile IL-10

+IFNγ

+ angegeben. Das Gate liegt auf

CD4+ T-Zellen. Es sind Ergebnisse aus mind. 2 unabhängigen Experimenten dargestellt.

Alternativ können antigenpräsentierende Zellen IL-10 auf T-Zellen über inducible co-

stimulator ligand (ICOS-L) induzieren. Weiterhin ist bekannt, dass Endothelzellen

ICOS-L exprimieren (Kroczek, Mages et al. 2004). Um zu analysieren, ob die

Interaktion zwischen ICOS und ICOS-L für die IL-10 Expression auf Th1LSEC

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Ergebnisse

84

verantwortlich ist, wurden Kokulturen mit naiven CD4+ T-Zellen aus ICOSkoxOT-II

Mäusen durchgeführt. Die ko Mäuse hatten im Vergleich zu den WT Mäusen keine

veränderten Frequenzen der IL-10-positiven Th1 Zellen (Abbildung 12 C).

Zusammengefasst demonstrieren die Ergebnisse, dass sowohl IL-27, als auch ICOS-L

keine Rolle bei der Induktion von IL-10 in Th1LSEC spielen.

4.2.6 LSEC exprimieren alle vier Notch-Liganden

Durch unsere Arbeitsgruppe wurde unlängst ein weiterer Signalweg zur Induktion von

IL-10 beschrieben - der Notch-Signalweg. Durch die Interaktion von Notch mit dessen

Liganden, die z.B. auf plasmazytoiden DC exprimiert sind, wird IL-10 in Th1 Zellen

hochreguliert (Rutz, Janke et al. 2008, Kassner, Krueger et al. 2010). Es stellte sich

also die Frage ob auf LSEC die Expression von Notch-Liganden nachweisbar ist. Dazu

wurde ex vivo isolierte nichtparenchymatische Zellen (NPC) mit einem LSEC-

spezifischen anti-CD146 Antikörper und anti-Dll1, anti-Dll4, anti-Jagged1 bzw. anti-

Jagged2 Antikörper markiert und im Durchflusszytometer analysiert. Des Weiteren

wurde die relative Expression der Notchliganden von der mRNA frisch isolierter LSEC

mittels realtime PCR bestimmt. Die Expression der Notch-Liganden wurde dazu ins

Verhältnis zur β-Actin Expression gesetzt. Um die Expression von Dll4 im

Lebergewebe zu untersuchen, wurden kryokonservierte Leberschnitte mit einem anti-

CD146 und anti-Dll4 Antikörper markiert und mikroskopisch analysiert.

Die durchflusszytometrische Analyse der nichtparenchymatischen Zellen zeigte, dass

eine Expression der Notch-Liganden nur auf LSEC nachweisbar war. LSEC wiesen

eine mittelstarke Expression der Liganden Dll1 und Dll4 auf, während die Liganden

Jagged1 und Jagged2 sehr hoch exprimiert waren (Abbildung 13 A). Die mRNA-

Analyse der LSEC ergab, dass Dll4 am höchsten exprimiert war (Abbildung 13 B). Die

Expression von Dll1 war ungefähr zehnfach geringer als die Expression von Dll4. Das

Expressionsniveau der Notchliganden Jagged1 und Jagged2 war deutlich niedriger als

das der Dll Familie. Durch die Analyse der Leberschnitte konnte demnach eine Ko-

Lokalisation von CD146 und Dll4 im Lebergewebe ermittelt werden (Abbildung 13 C).

Page 85: Modulation von CD4+ T-Zellen durch Lebersinusendothelzellen · 2008, Takada and Jameson 2009, Sprent and Surh 2011)). Die hauptsächliche Ausbildung des T-Zell-Repertoires findet

Ergebnisse

85

Mit verschiedenen Methoden wurde die Expression der Notchliganden auf LSEC

nachgewiesen.

Abbildung 13: Expression der Notchliganden Dll1, Dll4, Jagged1 und Jagged2 durch LSEC. Frisch isolierte nicht-parenchymatische Zellen aus C57BL/6 Mäusen wurde mit einem LSEC-spezifischen anti-CD146 Antikörper und anti-Dll1, anti-Dll4, anti-Jagged1 bzw. anti-Jagged2 Antikörper markiert und durchflusszytometrisch analysiert (A). Die relative mRNA Expression von Dll1, Dll4, Jagged1 und Jagged2 wurde mittels quantitativer realtime PCR von frisch isolierten LSEC ermittelt (B). Kryo-konservierte Leberschnitte von WT Mäusen wurden mit einem anti-CD146 (grün) und anti-Dll4 (rot) Antikörper markiert und mikroskopisch analysiert Die Zellkerne wurde mit DAPI (blau) gegengefärbt. Es sind Ergebnisse von mind. 4 unabhängigen Experimenten dargestellt. Das Gate liegt auf lebenden Zellen.

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Ergebnisse

86

4.2.7 Die IL-10 Induktion in Th1LSEC ist abhängig vom Notch-

Signalweg

4.2.7.1 Blockade von Dll1 und Dll4 führt nur zu einer teilweisen

Reduktion der IL-10 Expression in Th1LSEC

Frühere Studien unserer Arbeitsgruppe ergaben, dass vorrangig die Liganden der Dll

Familie dazu in der Lage sind IL-10 auf Th1 Zellen zu induzieren (Rutz, Janke et al.

2008). In diesem Zusammenhang wurde nun untersucht, ob eine Blockade von Dll1

bzw. Dll4 einen Einfluss auf die IL-10 Expression der Th1LSEC hat. Dazu wurden naive

CD4+ T-Zellen antigenspezifisch, unter der Zugabe von IL-12 durch LSEC aktiviert. Die

Kultur erfolgte zusätzlich unter der Zugabe eines blockierenden anti-Dll1 bzw. anti-Dll4

Antikörpers, bzw. der Kombination aus beiden Antikörpern. Die Zellen wurden auf die

Expression von IL-10 und IFNγ durchflusszytometrisch und mittels realtime PCR

analysiert. Zudem erfolgte eine Analyse der Zellkulturüberstände auf den Proteingehalt

an IL-10 und IFNγ.

Die Blockade von Dll1 reduzierte den Anteil der IL-10 positiven T-Zellen um ca. 30 %

(Abbildung 14 A). Wurde Dll4 in der Kultur der Th1LSEC blockiert, verringerte sich der

Anteil der IL-10 positiven T-Zellen um ca. 25 %. Bei einer gleichzeitigen Blockade von

Dll1 und Dll4 konnte kein weiterer Rückgang der IL-10 Expression im Vergleich zur

alleinigen Blockade von Dll1 beobachtet werden. Der IL-10 Proteingehalt und die IL-10

mRNA Expression war im gleichen Umfang reduziert, wie der Anteil der IL-10+ Th1

Zellen (Abbildung 13 B, C).

Die Ergebnisse zeigen, dass die Blockade der Dll Liganden zu einer teilweisen, aber

nicht vollständigen Inhibition der IL-10 Expression aus Th1LSEC führt.

Page 87: Modulation von CD4+ T-Zellen durch Lebersinusendothelzellen · 2008, Takada and Jameson 2009, Sprent and Surh 2011)). Die hauptsächliche Ausbildung des T-Zell-Repertoires findet

Ergebnisse

87

Abbildung 14: Einfluss der Blockade von Dll1 und Dll4 auf die IL-10 Expression von Th1LSEC. Naive CD4

+CD62L

high Zellen aus OT-IIxB6PL Mäusen wurden in vitro für 4 d durch LSEC aus

C57BL/6 Mäusen in der Anwesenheit von OVA-Peptid, IL-12 und eines anti-Dll1, anti-Dll4 Antikörpers bzw. entsprechender Isotypkontrolle (je 50 µg/ml) aktiviert. Th1LSEC wurden für 6 h mit PMA/Iono/BrefA/Monensin restimuliert, fixiert, permeabilisiert, mit einem anti-IFNγ und anti-IL-10 Antikörper markiert (A). Die Zellen wurden am Durchflusszytometer analysiert. Die Zellüberstände wurden mittels CBA auf IL-10 Proteingehalt analysiert (B). Relative IL-10 mRNA Expression wurde mittels quantitativer realtime PCR ermittelt (C).Das Gate liegt auf CD4

+ T-

Zellen. Es sind beispielhafte Dotplots aus 3 unabhängigen Experimenten dargestellt.

4.2.7.2 Blockade des Notch-Signalweges mittels γ-Sekretaseinhibitor

reduziert IL-10 Expression in Th1LSEC

Die Blockade der Liganden der Dll Familie führte nur zu einer teilweisen Reduktion der

IL-10 Expression auf Th1LSEC. Auf den LSEC selbst konnte jedoch auch eine sehr hohe

Expression der Liganden der Jagged Familie nachgewiesen werden. Um den Einfluss

aller Notch-Liganden zu untersuchen, wurde der Notch-Signalweg vollständig durch

den γ-Sekretaseinhibitor (GSI) blockiert. Der GSI verhindert in der T-Zelle die

Abspaltung der intrazellulären Domäne des Notch-Rezeptors nach Bindung des

Liganden und führt zu einer Inhibition der Expression der Notch-Zielgene Hes-1 und

Deltex-1 (Schroeter, Kisslinger et al. 1998, Seiffert, Bradley et al. 2000). In den

folgenden Experimenten wurden naive CD4+ T-Zellen antigenspezifisch unter Zugabe

Page 88: Modulation von CD4+ T-Zellen durch Lebersinusendothelzellen · 2008, Takada and Jameson 2009, Sprent and Surh 2011)). Die hauptsächliche Ausbildung des T-Zell-Repertoires findet

Ergebnisse

88

von IL-12 durch LSEC aktiviert. Zu den Kulturen wurden ansteigende Konzentrationen

von GSI bzw. des Lösungsmittels DMSO hinzugegeben. Die Th1LSEC wurden

hinsichtlich der Expression von IFNγ und IL-10 mittels Durchflusszytometrie, CBA und

realtime PCR analysiert. Zusätzlich erfolgte die Messung der Expression der Notch-

Zielgene Hes-1 und Deltex-1 durch realtime PCR. Die Expression der genannten Gene

wurde ins Verhältnis zur UBC Expression gesetzt.

Die Frequenz der IL-10 produzierenden Zellen wurde durch GSI drastisch gegenüber

unbehandelten und DMSO behandelten Zellen reduziert, was sich auch in der

verringerten IL-10 Konzentration im Zellüberstand und der niedrigeren Expression von

IL-10 mRNA widerspiegelte (Abbildung 15 A, B, C, F). Die Reduktion der IL-10

Produktion durch GSI war abhängig von der Konzentration des Inhibitors, was auf

dessen spezifische Wirkung hindeutet. Unerwarteterweise reduzierte auch DMSO, das

Lösungsmittel des GSI, die IL-10 Expression, allerdings signifikant schwächer als GSI

(Abbildung 15 A, D, E). Auch die IFNγ Konzentration im Zellüberstand wurde durch

DMSO beeinflusst. GSI reduzierte die Frequenzen an IFNγ+ T-Zellen nicht, aber die

Konzentration an IFNγ im Zellüberstand. Die Expression der Notch-Zielgene Hes-1 und

Deltex-1 war durch GSI spezifisch reduziert, was auf eine vollständige Blockade des

Notchsignalwegs hindeutet (Abbildung 15 G, H).

Zusammengefassend lässt sich sagen, dass die Inhibition des Notch-Signalweges

mittels GSI in den Th1LSEC Kulturen zu einer spezifischen Reduktion der IL-10

Expression führte. Des Weiteren konnte eine signifikant geringere Expression der

Notch-Zielgene Hes-1 und Deltex-1 beobachtet werden. Dennoch gab es einen

geringen Einfluß des Inhibitors auf die IFNγ Sekretion, aber nicht auf die Anzahl an

Zellen, die in der Lage waren IFNγ zu produzieren.

Page 89: Modulation von CD4+ T-Zellen durch Lebersinusendothelzellen · 2008, Takada and Jameson 2009, Sprent and Surh 2011)). Die hauptsächliche Ausbildung des T-Zell-Repertoires findet

Ergebnisse

89

Abbildung 15: Inhibition der IL-10 Expression auf Th1LSEC durch γ-Sekretaseinhibitor. Naive CD4

+CD62L

high Zellen aus OT-IIxB6PL Mäusen wurden in vitro für 4 d durch LSEC aus

C57BL/6 Mäusen in der Anwesenheit von OVA-Peptid und IL-12 aktiviert. Zusätzlich wurden die Zellen mit einem γ-Sekretase-Inhibitor (0,63 – 5 mM) bzw. dessen Lösungsmittel DMSO (0,63 – 5 µl/ml) versetzt. Th1LSEC wurden für 6 h mit PMA/Iono/BrefA/Monensin restimuliert, fixiert, permeabilisiert, mit einem anti-IFNγ und anti-IL-10 Antikörper markiert (A, B, C). Die Zellen wurden am Durchflusszytometer analysiert. Die Zellüberstände wurden mittels CBA auf IL-10 und IFNγ Gehalt analysiert (C, E). Relative IL-10, Deltex-1 und Hes-1 mRNA Expression wurde

Page 90: Modulation von CD4+ T-Zellen durch Lebersinusendothelzellen · 2008, Takada and Jameson 2009, Sprent and Surh 2011)). Die hauptsächliche Ausbildung des T-Zell-Repertoires findet

Ergebnisse

90

mittels quantitativer realtime PCR ermittelt (F, G, H). Prozentuale Anteile IL-10+IFNγ

+ Zellen

sind angegeben. Das Gate liegt auf CD4+ T-Zellen. Es sind repräsentative Dotplots und

Ergebnisse aus 4 unabhängigen Experimenten dargestellt.* = p < 0,05; ** = p < 0,01; *** = p < 0,001; Mann-Whitney-Test.

4.2.7.3 Die IL-10 Expression ist in Notch-defizienten Th1LSEC inhibiert

Die Verwendung eines γ-Sekretaseinhibitors zur Blockade des Notch-Signalweges

resultierte in einer spezifischen Reduktion der IL-10 Expression bei Th1LSEC. Um die

spezifischen Effekte zu validieren, wurden Notch-defiziente T-Zellen für die Kokultur mit

LSEC verwendet. Auf naiven CD4+ T-Zellen sind vorrangig Notch-1 und -2 exprimiert

(Ohishi, Varnum-Finney et al. 2000, Amsen, Blander et al. 2004). Für die folgenden

Experimente wurden naive CD4+ T-Zellen aus Mäusen verwendet, die auf CD4 Zellen

einen knockout für Notch-1 und -2 besitzen (Notch-1/2floxxCD4Cre+, N1/2ko; Notch-

1/2floxxCD4Cre-, N1/2wt; (Helbig, Gentek et al. 2012)). Diese wurden durch LSEC unter

der Zugabe von anti-CD3, und anti-CD28 mAk und IL-12 aktiviert. Die Th1LSEC wurden

hinsichtlich der Expression von IFNγ, IL-10 und TNFα mittels Durchflusszytometrie,

CBA und realtime PCR analysiert. Zusätzlich erfolgte die Messung der Expression der

Notch-Zielgene Hes-1 und Deltex-1 durch realtime PCR. Die Expression der

genannten Gene wurde ins Verhältnis zur UBC Expression gesetzt.

Die Th1LSEC aus den N1/2ko Mäusen hatten im Vergleich zu den N1/2wt einen

signifikant niedrigeren Anteil an IL-10+IFNγ+ T-Zellen, während der Anteil der IFNγ+

und TNFα+ T-Zellen unverändert blieb (Abbildung 16 A, B, C, D). Äquivalent dazu war

die IL-10 Konzentration im Zellüberstand bei den N1/2ko Zellen signifikant reduziert,

während der Gehalt an IFNγ Protein auf einem vergleichbaren Niveau blieb (Abbildung

16 E, F). Die Analyse der mRNA Expression der Th1LSEC aus N1/2ko Mäusen zeigte

eine Reduktion der IL-10 Expression, IFNγ blieb unverändert (Abbildung 16 G, H). Die

Expression der Notch-Signalweg Zielgene Hes-1 und Deltex-1 war in den N1/2ko fast

vollständig aufgehoben, was ein komplettes Fehlen des Notch-Signals in den Th1

Zellen bestätigt und das Signal über andere Notch-Moleküle ausschließt (Abbildung 16

I, J).

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Ergebnisse

91

Abbildung 16: Inhibition der IL-10 Expression auf Th1LSEC aus Notch-Rezeptor-defizienten Mäusen. Naive CD4

+CD62L

high Zellen aus Notch1/2ko (CD4 Cre

+) bzw. Notch1/2wt (CD4 Cre

-) Mäusen

wurden in vitro für 4 d mit anti-CD3 mAk und IL-12 durch LSEC aus C57BL/6 Mäusen aktiviert. Th1LSEC wurden für 6 h mit PMA/Iono/BrefA/Monensin restimuliert, fixiert, permeabilisiert, mit einem anti-IL-10, anti-IFNγ, anti-TNFα Antikörper markiert (A, B, C, D). Die Zellen wurden am Durchflusszytometer analysiert. Die Zellüberstände wurden mittels CBA auf IL-10 und IFNγ Gehalt analysiert (E, F). Relative IL-10, IFNγ, Deltex-1 und Hes-1 mRNA Expression wurde mittels quantitativer realtime PCR ermittelt (G, H, I, J). % Anteile IL-10

+IFNγ

+, IFNγ

+ bzw.

TNFα+ Zellen sind angegeben. Das Gate liegt auf CD4

+ T-Zellen. Repräsentative Dotplots und

Ergebnisse aus 2 unabhäng. Exp. mit je 4 Mäusen dargestellt.* = p<0,05; Mann-Whitney-Test.

Page 92: Modulation von CD4+ T-Zellen durch Lebersinusendothelzellen · 2008, Takada and Jameson 2009, Sprent and Surh 2011)). Die hauptsächliche Ausbildung des T-Zell-Repertoires findet

Ergebnisse

92

Die Ergebnisse zeigen, dass LSEC bei CD4+ T-Zellen aus N1/2ko Mäusen nicht in der

Lage sind, IL-10 zu induzieren. Die Expression der Th1 Zytokine IFNγ und TNFα war

hingegen nicht beeinträchtigt. Darum kann man davon ausgehen, dass LSEC in Th1

Zellen über den Notch-Signalweg IL-10 induzieren.

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93

5. Diskussion

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Diskussion

94

5.1 Lebersinusendothelzellen induzieren Darmhoming-Phänotyp bei

CD4+ T-Zellen

Das klassische Konzept des Homing beschreibt die Migration von antigenerfahrenen

Effektor/Gedächtnis T-Zellen vorrangig in das Gewebe, in dessen assoziierten

sekundären lymphatischen Organen sie initial durch ihr spezifisches Antigen aktiviert

wurden (Cahill, Poskitt et al. 1977, Campbell and Butcher 2002, Agace 2006).

Entgegengesetzt dazu findet aber auch eine Migration der T-Zellen in Gewebe statt,

die unabhängig sind von der erstmaligen T-Zell-Aktivierung. So wurden Th17 Zellen in

der Leber von Patienten lokalisiert, die an verschiedenen Autoimmunerkrankungen der

Leber leiden (Oo, Banz et al. 2012). Th17 Zellen werden vornehmlich im Darm, als

Antwort auf eine bakterielle Infektion, induziert (Nutsch and Hsieh 2012). Im Darm

aktivierte CD4+ T-Zellen induzieren in IL-10 defizienten Mäusen eine Hepatitis,

nachdem diese mit Trichinella spiralis infiziert wurden (Douglas, Beiting et al. 2010).

Diese Analysen zeigen beispielhaft, dass im Darm- bzw. in der Leber-aktivierte T-

Zellen, auch einen Einfluss auf die Pathologie einer Erkrankung im jeweils anderen

Organ haben (Übersicht in (Grant, Lalor et al. 2002)). Die Induktion von spezifischen

Homingrezeptoren auf Lymphozyten ist also zum einem durch den Ort der

Antigenpräsentation, als auch durch die Umgebungsbedingungen bestimmt.

Vorhergehende Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe zeigten, dass naive CD4+ T-

Zellen, die unter nicht-polarisierenden Bedingungen durch LSEC aktiviert werden

(TLSEC), präferentiell in den Darm und mesenteriale Lymphknoten migrierten, im

Gegensatz zu CD4+ T-Zellen, welche durch Milz APC (TSAPC) aktiviert wurden (Kruse,

Neumann et al. 2009). Die TSAPC wanderten verstärkt in die Leber ein. Weiterführende

Arbeiten demonstrierten die Induktion der darmspezifischen Homingrezeptoren α4β7-

Integrin und CCR9 auf TLSEC und nur eine geringe Expression des hautspezifischen

Homingrezeptors P-Lig. TSAPC exprimierten nur geringfügig α4β7-Integrin und kein

CCR9, sowie viel P-Lig (Neumann, Kruse et al. 2012). Bisher war unklar, ob LSEC die

einzige Zellpopulation in der Leber darstellt, die in der Lage ist, einen Darmhoming-

Phänotyp bei T-Zellen zu induzieren. Zudem war es von großem Interesse, ob auch die

migratorischen Eigenschaften von Effektor/Gedächtnis T-Zellen durch LSEC moduliert

werden können.

Page 95: Modulation von CD4+ T-Zellen durch Lebersinusendothelzellen · 2008, Takada and Jameson 2009, Sprent and Surh 2011)). Die hauptsächliche Ausbildung des T-Zell-Repertoires findet

Diskussion

95

In vitro Studien der hier vorliegenden Arbeit zeigten, dass LSEC in der Leber allein die

Fähigkeit besitzen darmspezifische Homingrezeptoren auf CD4+ T-Zellen (TLSEC) zu

induzieren, während eine Zellpräparation bestehend aus B-Zellen, DC und Kupffer

Zellen der Leber dazu nicht in der Lage war. Weiterführend wurde hier erstmals

gezeigt, dass durch LSEC reaktivierte Th1 (Th1LSEC) Zellen in vivo stärker in das

Darmgewebe und das GALT migrierten, was durch die signifikant erhöhte Expression

der darmspezifischen Homingrezeptoren α4β7-Integrin und CCR9 ermöglicht wurde.

Th1 Zellen, die durch LSEC-negative Leber APC (Th1LAPC) aktiviert wurden, wiesen

hingegen eine signifikant geringere Expression des Homingrezeptors α4β7-Integrin

und eine höhere Expression des Hauthoming-Rezeptors P-Lig auf. Der Phänotyp der

Th1LAPC entsprach dem Homingphänotyp von Th1 Zellen, welche durch Milz APC

(Th1SAPC) reaktiviert worden waren. Th1SAPC migrierten demzufolge in vivo zu einem

signifikant geringeren Anteil in das Darmgewebe und GALT als Th1LSEC, aber

vergleichbar hoch in die Leber. Somit ist nicht nur die Mikroumgebung in einem Organ

entscheidend für die migratorischen Eigenschaften der aktivierten T-Zellen, besonders

die antigenpräsentierende Zelle selbst spielt eine entscheidende Rolle. Allerdings ist

hier und bei den folgenden Ergebnissen zu berücksichtigen, dass die LAPC eine

gemischte Zellpopulation von APC der Leber darstellen. In weiterführenden Studien

sollte eine Betrachtung von einzelnen APC der Leber stattfinden.

Die Induktion der darmspezifischen Homingrezeptoren wurde, unabhängig von den

Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe zur Leber, bisher nur für spezialisierte DC im

Darm gezeigt. Diese sind zum einen in den Peyer´schen Plaques lokalisiert oder

wandern von der Lamina propria in die mLN um dort auf T-Zellen die Hochregulation

von α4β7-Integrin und CCR9 zu induzieren (Mora, Bono et al. 2003, Agace 2010). Die

Rezeptoren α4β7-Integrin und CCR9 zusammen mit deren Liganden MAdCAM-1 und

CCL25, exprimiert auf Epithel- und Endothelzellen im Darmgewebe, bilden die Basis

für eine Zellmigration in den Darm. Interessanterweise werden die Liganden MAdCAM-

1 und CCL25 bei einer Primär Sklerosierenden Cholangitis (PSC), einer

hochenzündlichen Lebererkrankung, in der Leber selbst hochreguliert und α4β7-

Integrin- und CCR9-positive T-Zellen in die Leber rekrutiert (Grant, Lalor et al. 2001,

Eksteen, Grant et al. 2004). Eine Reaktivierung von im Darmgewebe bzw. GALT

aktivierten CD8+ T-Zellen durch Leber DC und Sternzellen resultierte nicht in einer

Page 96: Modulation von CD4+ T-Zellen durch Lebersinusendothelzellen · 2008, Takada and Jameson 2009, Sprent and Surh 2011)). Die hauptsächliche Ausbildung des T-Zell-Repertoires findet

Diskussion

96

Hochregulation von α4β7-Integrin und CCR9 auf den T-Zellen (Eksteen, Mora et al.

2009). Diese Ergebnisse bestätigen indirekt die exklusive Fähigkeit der LSEC in der

Leber einen Darmhoming-Phänotyp bei T-Zellen zu induzieren, wobei die LSEC selbst

nicht Bestandteil der Analysen waren. Die antigenspezifische Aktivierung von CD8+ T-

Zellen in der Leber und Darm unter homöostatischen Bedingungen wurde erst kürzlich

durch die Arbeitsgruppe von E. Schott untersucht (Eickmeier, Seidel et al. 2014). So

migrierten OVA-spezifische CD8+ T-Zellen (OT-I) nach Aktivierung durch ihr Antigen,

welches im Darm exprimiert wurde, erneut in den Darm und das GALT, sowie in das

Lebergewebe. Wurden OT-I Zellen hingegen in der Leber durch ihr Antigen aktiviert, so

erfolgte keine Akkumulation der CD8+ T-Zellen im Darm. Das Antigen OVA wurde

allerdings in der Leber durch Hepatozyten exprimiert. Eigene Voruntersuchungen

deuten darauf hin, dass LSEC in vitro auch bei CD8+ T-Zellen die darmspezifischen

Homingrezeptoren α4β7-Integrin und CCR9 hochregulieren können (Daten nicht

gezeigt).

Die Regulation der Migration der CD8+ T-Zellen in die Leber war nicht Bestandteil der

Analysen von Eickmeier et al.. Die Expression von MAdCAM-1 und CCL25 in der

Leber wurde nicht untersucht. Es ist anzunehmen, dass diese Liganden unter

homöostatischen Bedingungen nicht verstärkt exprimiert werden. Spezifische

Homingrezeptoren, die eine Migration von T-Zellen in die Leber unter homöstatischen

Bedingungen ermöglichen, sind bisher nur ansatzweise untersucht. Möglicherweise

spielt das von humanen LSEC exprimierte VAP-1 eine Rolle, indem es die Adhäsion

und Transmigration von Lymphozyten durch das Lebersinusendothel fördert (McNab,

Reeves et al. 1996, Lalor, Edwards et al. 2002). Für dessen erst kürzlich identifizierte

Liganden Siglec-9 und-10 sind noch keine funktionellen Analysen durchgeführt worden

(Kivi, Elima et al. 2009, Aalto, Autio et al. 2011). Zusätzlich zu VAP-1 könnte die

Bindung von CXCR3 und CXCR6 bzw. von ICAM-1 und VCAM-1 die Migration in die

Leber unterstützen, deren Bedeutung für die Einwanderung in die entzündete Leber ist

bereits bekannt (Lalor and Adams 2002, Tuncer, Oo et al. 2013).

Für die Induktion der darmspezifischen Homingrezeptoren ist Retinolsäure notwendig

(Iwata, Hirakiyama et al. 2004). In der hier vorliegenden Arbeit wurde erstmalig gezeigt,

dass das Vitamin A Metabolit Retinolsäure für die Hochregulation des Homingrezeptors

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Diskussion

97

α4β7-Integrin auf Th1 Zellen durch LSEC verantwortlich ist. Wurde der

Retinolsäurerezeptor auf T-Zellen während der Reaktivierung auf LSEC mittels LE-540

blockiert, erfolgte keine Expression von α4β7-Integrin, aber dafür die Hochregulation

von P-Lig, ein Homingrezeptor, welcher die Einwanderung in die Haut und entzündete

Gewebe ermöglicht. Der Phänotyp dieser LE-540 behandelten Zellen entsprach dem

Phänotyp von Th1 Zellen, die durch andere Leber APC bzw. APC der Milz reaktiviert

wurden. In der Leber, als das größte Speicherorgan für Vitamin A, wird dieses von den

Sternzellen gespeichert und über den Disse´schen Raum an die Leberzellen

abgegeben (Blomhoff and Wake 1991, Friedman 1996). Eksteen et al. untersuchte die

Fähigkeit der leberresidenten DC und Sternzellen die darmspezifischen

Homingrezeptoren α4β7-Integrin und CCR9 auf CD8+ T-Zellen zu induzieren (Eksteen,

Mora et al. 2009). Wie oben bereits erwähnt, konnten beide Zellpopulationen kein

α4β7-Integrin und CCR9 auf CD8+ T-Zellen hochregulieren. Obwohl Sternzellen

Vitamin A speichern, sind sie anscheinend nicht in der Lage mittels zelleigener

Retinaldehydrogenasen Retinolsäure zu metabolisieren, LSEC hingegen besitzen die

dazu notwendigen Enzyme und können Retinolsäure aus Vitamin A umsetzen

(Neumann, Kruse et al. 2012). In dieser Eigenschaft sind LSEC vergleichbar mit DC

aus dem GALT (Iwata, Hirakiyama et al. 2004).

Der Zusammenhang zwischen hepatischen und intestinalen Erkrankungen, sowie die

Analysen über die migratorischen Eigenschaften von in der Leber- bzw. Darm-

aktivierten T-Zellen resultierten in einem Modell des enterohepatischen Kreislaufs

(Grant, Lalor et al. 2002). Das Model beschreibt die Migration von darmaktivierten T-

Zellen in den Darm selbst und in die Leber. Des Weiteren wird die Wanderung von

leberaktivierten T-Zellen in die Leber und in den Darm postuliert. Die Darm-Leber-

Achse ist ausführlich beschrieben und akzeptiert. Die Leber-Darm-Achse hingegen

wird kontrovers diskutiert. In diesem Zusammenhang muss jedoch angemerkt werden,

dass Untersuchungen zu der Induktion von Darmhoming-Rezeptoren nur einzelne

Leber APC eingeschlossen hatten. Weiterführende Analysen sollten nicht nur alle

bisher beschriebenen Leber APC einbinden, sondern sowohl die Wirkung auf CD8+ als

auch auf CD4+ T-Zellen betrachten.

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Diskussion

98

Die Daten der vorliegenden Arbeit zeigen, dass Induktion von Darmhoming-Rezeptoren

auf CD4+ T-Zellen in der Leber eine spezifische Eigenschaft der Lebersinusendothel-

zellen ist. LSEC-aktivierte T-Zellen exprimieren verstärkt die darmspezifischen

Homingrezeptoren α4β7-Integrin und teilweise CCR9 und migrieren präferentiell in den

Darm. Die Induktion der Darmhoming-Rezeptoren ist abhänging von Retinolsäure,

welche von LSEC zur Verfügung gestellt wird. Die vorliegenden Ergebnisse bestätigen

die Existenz der Leber-Darm-Achse und schließen den enterohepatischen Kreislauf.

5.2 LSEC hemmen die Expression von pro-inflammatorischen

Interferon-γ und induzieren keine Apoptose bei CD4+ T-Zellen

Die Mechanismen der Toleranzinduktion in der Leber stehen im Fokus der aktuellen

Forschung. In der hier vorliegenden Arbeit war es von großem Interesse, ob die

verschiedenen Leber APC unterschiedliche Funktionen bei der Modulation der

Effektorfunktion von CD4+ T-Zellen übernehmen. In dieser Studie wurde gezeigt, dass

unter homöostatischen Bedingungen LSEC-negative Leber APC (LAPC; TLAPC) in vitro

das Th1-spezifische pro-inflammatorische Zytokin IFNγ in CD4+ T-Zellen im gleichen

Umfang induzierten, wie APC der Milz (SAPC; TSAPC). Im Gegensatz dazu war in

LSEC-aktivierten CD4+ T-Zellen (TLSEC) keine IFNγ Expression detektierbar. Wurden

durch Milz APC aktivierte Th1 Zellen auf LSEC reaktiviert, so erfolgte eine

Verringerung des Anteils IFNγ+ T-Zellen, während in der Kokultur auf LAPC und SAPC

der Anteil IFNγ+ T-Zellen gleich blieb. Während der Aktivierung von naiven CD4+ T-

Zellen und Th1 Zellen durch LSEC waren die niedrigsten Frequenzen apoptotischer T-

Zellen detektierbar, wohingegen deren Anteil bei der Kokultur mit LAPC signifikant

erhöht war.

Für die Differenzierung von Th1 Zellen ist das durch APC produzierte IL-12 notwendig

(Trinchieri 1995, O'Garra 1998). Die Gruppe um P. Knolle zeigte erstmals, dass LSEC

bei CD4+ T-Zellen kein IFNγ induzieren können, die Daten aus dieser Arbeit stimmen

mit deren Ergebnissen überein (Knolle, Schmitt et al. 1999). Auch eine Aktivierung der

LSEC über den TLR4 mittels LPS induzierte keine Th1 Zellen. Später wurde zwar

festgestellt, dass LPS bei LSEC eher zu Anergie führt, als eine Aktivierung zu

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Diskussion

99

bewirken, dennoch wurde vermutet, dass LSEC kein IL-12 produzieren. Bei eigenen

Untersuchungen von LSEC konnte ebenso keine Expression der IL-12 spezifischen

Kette IL-12p40 nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt). Die Induktion von IFNγ in

TLAPC könnte durch IL-12 der myeloiden und plasmazytoiden DC der Leber vermittelt

werden (O'Connell, Son et al. 2003, Bosma, Metselaar et al. 2006). Gleichzeitig ist zu

vermuten, dass dadurch auch die IFNγ Expression der Th1 Zellen während der Re-

aktivierung durch LAPC stabil gehalten werden konnte.

Die Reduktion der IFNγ Expression bei Th1 Zellen durch LSEC könnte hingegen zwei

Gründe haben. Zum einen könnte ein Mangel an IL-12 keine neue Expression des

Transkriptionsfaktors Tbet induzieren und demzufolge auch kein IFNγ. Zum anderen

könnten LSEC die IFNγ Expression aktiv supprimieren. Die Gruppe um J. Herkel

untersuchte den Einfluss von LSEC auf die Aktivierung von CD4+ T-Zellen durch DC

und konstatierte, dass LSEC die Sekretion sowohl von IFNγ als auch von IL-17 in Th

Zellen supprimierten (Carambia, Frenzel et al. 2013). Für die Inhibition der IFNγ

Expression wurden das von LSEC sezernierte IL-10 bzw. zellgebundenes PD-L1

identifiziert. Über LSEC-exprimiertes PD-L1 wird ebenso bei CD8+ T-Zellen eine

Reduktion der Effektorfunktion vermittelt (Diehl, Schurich et al. 2008). Für den Mangel

an IL-12 und die daraus resultierende fehlende Neuinduktion würde sprechen, dass bei

exogener Zugabe von IL-12 kein Unterschied der IFNγ Expression bei Th1LSEC und

Th1SAPC detektiert wurde. Allerdings ist für die Induktion von IFNγ in T-Zellen auch eine

ausreichende Kostimulation über CD28 notwendig (Chapoval, Ni et al. 2001, Kane,

Andres et al. 2001). Erfolgte bei TLSEC Kulturen eine zusätzliche Kostimulation mittels

anti-CD28 mAk, dann wurde eine geringe Expression von IFNγ in TLSEC detektiert

(persönliche Mitteilung von Ruth Seikowski). Die geringe Expression von

kostimulatorischen Rezeptoren und die vergleichsweise hohe Expression von

koinhibitorischen Molekülen auf LSEC könnten den Einfluss auf die IFNγ Expression

erklären. Die von LSEC produzierte Retinolsäure könnte ebenso die IFNγ Expression

regulieren. Studien mit Endothelzellen aus der Nabelschnur zeigten eine inhibitorische

Wirkung der Retinolsäure auf die IFNγ Expression von Th1 Zellen, die über den CD28

Signalweg vermittelt wurde (Cantorna, Nashold et al. 1996).

Page 100: Modulation von CD4+ T-Zellen durch Lebersinusendothelzellen · 2008, Takada and Jameson 2009, Sprent and Surh 2011)). Die hauptsächliche Ausbildung des T-Zell-Repertoires findet

Diskussion

100

T-Zell Apoptose ist wichtig für die Homöostase des Immunsystems. Im Speziellen ist

die Deletion von antigen-spezifischen T-Zellen einer der essentiellen Mechanismen der

Toleranzinduktion (Lenardo, Chan et al. 1999). Aktivierte T-Zellen migrieren

präferentiell in die Leber um dort deletiert oder moduliert zu werden (Mehal, Juedes et

al. 1999, Crispe, Dao et al. 2000). Es ist von großem Interesse, ob die in der Leber

residenten Zellen dabei unterschiedliche Aufgaben übernehmen. Die Ergebnisse der

hier durchgeführten Studie deuten darauf hin, dass LSEC-negative Leber APC,

bestehend aus B-Zellen, DC und Kupffer Zellen, höhere Level an Apoptose bei CD4+ T-

Zellen induzierten, als LSEC. Übereinstimmend mit diesen Daten zeigten Mehal et al.,

dass in einem Knochenmarkchimärenmodell, bei dem Antigen nur über

hämatopoetische Zellen präsentiert wurde, in der Leber höhere Frequenzen an

apoptotischen CD8+ T-Zellen ermittelt wurden, als bei der Antigenpräsentation über

nicht hämatopoetische Zellen, wie LSEC (Mehal, Azzaroli et al. 2001).

Entgegengesetzt dazu wurde die Induktion von Apoptose bei CD3+ T-Zellen auch

durch LSEC beschrieben (Karrar, Broome et al. 2007). Allerdings ist hier anzumerken,

dass LSEC mit Endothelzellen der Aorta verglichen wurden und eine Betrachtung

anderer Leber APC nicht erfolgte. In der hier vorliegenden Arbeit induzierten LAPC

höhere Level an Apoptose bei CD4+ T-Zellen als SAPC. Diese Daten stimmen mit den

Untersuchungen von Tokita et. al. überein, in denen Leber DC bei einer allogenen

Stimulation höhere Frquenzen apoptotischer CD4+ T-Zellen induzierten, als Milz DC

(Tokita, Sumpter et al. 2008). Wurden bei Tokita et al. allerdings die Treg aus den CD4+

T-Zellen depletiert, war die Differenz zwischen den DC aus Milz und Leber

aufgehoben. In den hier verwendeten Th1 Zellen waren hingegen keine FoxP3+ Treg

detektierbar (Daten nicht gezeigt). Demzufolge ist der Unterschied zwischen LAPC und

SAPC in der Fähigkeit Apoptose zu induzieren in den hier gezeigten Daten nicht auf

die Präsenz von Treg zurückzuführen und hat vermutlich andere Gründe. Der

Unterschied zwischen LSEC und LAPC bzw. SAPC könnte in der stärkeren Aktivierung

der T-Zellen durch die professionellen APC und der damit verbundenen Induktion von

activation-induced cell death (AICD) in den T-Zellen begründet sein (Arakaki, Yamada

et al. 2014). Im Kontext der antigenspezifischen Stimulation von T-Zellen mittels

Nahrungsantigenen ist es für Leber DC anerkannt, dass diese Zellen Apoptose

induzieren (Crispe 2003, Thomson and Knolle 2010).

Page 101: Modulation von CD4+ T-Zellen durch Lebersinusendothelzellen · 2008, Takada and Jameson 2009, Sprent and Surh 2011)). Die hauptsächliche Ausbildung des T-Zell-Repertoires findet

Diskussion

101

Apoptose wird in T-Zellen über zahlreiche Signalwege induziert, z.B. über den

extrinsischen Signalweg vermittelt über zelloberflächengebundene Rezeptoren oder

über den intrinsischen Signalweg, ausgelöst durch Hypoxie oder Mangel an

Wachstumsfaktoren (Lavrik 2010). Der extrinsische Signalweg beinhaltet u.a. den Fas-

Signalweg und den Tumor Nekrose Faktor Rezeptor-1 (TNFR1). Die Bindung der

Liganden bewirkt die Aktivierung der Caspase 8, die zuvor mittels einer Fas-Associated

via Death Domain (FADD) als inaktive Procaspase 8 gebunden wird. Die Caspase 8

kann wiederum mehrere weitere Caspasen aktivieren und resultiert letztendlich in einer

Fragmentierung der DNA und dem damit verbundenen Zelltod. Der intrinsische

Signalweg induziert die Freisetzung von Cytochrom C in das Zytosol und die

Aktivierung von Caspase 9. Diese wiederum aktiviert Caspase 3 und führt auch zur

Aktivierung von Molekülen mit Dnase Aktivität. In weiterführenden Studien könnte

Induktion der Apoptose durch die Aktivität verschiedener Caspasen in in vitro Studien

untersucht werden. Zudem könnte eine selektive Blockade von Caspasen Aufschluß

über den Signalweg geben.

Im Lebergewebe selbst wird die Deletion von T-Zellen und die Lyse von pro-

apoptotischen T-Zellen zu einem signifikanten Anteil durch Hepatozyten vermittelt, eine

Zellpopulation, die in der hier vorliegenden Arbeit nicht einbezogen wurde.

Hepatozyten nehmen z.B. autoreaktive CD8+ T-Zellen in Vesikeln auf und führen sie

dem lysosomalen Abbau zu (Benseler, Warren et al. 2011). Dabei scheint das Niveau

an apoptotischen Zellen direkt mit der Menge an hepatozytenpräsentiertem Antigen zu

korrelieren (Tay, Wong et al. 2014). Für CD8+ T-Zellen ist weiterhin beschrieben, dass

sie in der Leber abhängig von B7-H1 deletiert oder anergisiert werden, auf die Zahl der

CD4+ T-Zellen hatte eine Deletion von B7-H1 jedoch keinen Einfluss (Dong, Zhu et al.

2004).

Die Ergebnisse, die im Kontext der Regulation von IFNγ und der Induktion von

Apoptose durch die verschiedenen Leber APC bei CD4+ T-Zellen erhoben wurden,

deuten darauf hin, dass LSEC die Expression von Effektorzytokinen verhindern,

während die LAPC vorrangig Apoptose induzieren. Sowohl die nicht-hämatopoetischen

LSEC, als auch hämatopoetische Leber APC tragen demnach gemeinsam zur

Page 102: Modulation von CD4+ T-Zellen durch Lebersinusendothelzellen · 2008, Takada and Jameson 2009, Sprent and Surh 2011)). Die hauptsächliche Ausbildung des T-Zell-Repertoires findet

Diskussion

102

Induktion von Toleranz in der Leber bei und übernehmen dabei unterschiedliche

Funktionen.

5.3 LSEC induzieren regulatorische CD4+ T-Zellen unter

homöostatischen und inflammatorischen Bedingungen

5.3.1 TLSEC supprimieren die Aktivierung von CD8+ T-Zellen und die

Pathogenese einer Colitis

Die Aktivierung von CD4+ T-Zellen durch LSEC unter nicht-polarisierenden

Bedingungen führte zur Induktion von regulatorischen T-Zellen, die die Proliferation

von CD4+ T-Zellen supprimieren können (Kruse, Neumann et al. 2009). Bisher war

unklar, ob auch die Aktivierung von zytotoxischen CD8+ T-Zellen durch TLSEC beeinflußt

werden kann. In der hier vorliegenden Arbeit wurde erstmalig die suppressorische

Funktion von TLSEC auf CD8+ T-Zellen demonstriert. In einem in vitro Suppressions-

assay waren die Proliferation und die Expression von Effektorzytokinen von CD8+ T-

Zellen in der Anwesenheit von TLSEC im Vergleich zu naiven CD4+ T-Zellen signifikant

reduziert. Die TLSEC wirkten gleichermaßen suppressiv wie ex vivo isolierte Treg. In

dieser Arbeit wurde zudem die selektive Fähigkeit der LSEC in der Leber demonstriert,

die darmspezifischen Homingrezeptoren auf TLSEC zu induzieren. Demzufolge war es

von großem Interesse, ob TLSEC in der Lage sind die Ausbildung einer T-Zell-

vermittelten Entzündung im Darm zu inhibieren. Wurden TLSEC mit den

entzündungsauslösenden naiven CD4+ T-Zellen in Rag1-/- Mäuse transferiert, wurde

eine teilweise signifikante Milderung der Pathogenese der Colitis beobachtet. Der

alleinige Transfer von TLSEC führte nicht zur Entstehung einer Darmentzündung und

demonstriert, dass TLSEC nicht in pro-inflammatorische T-Zellen differenzieren.

Regulatorische T-Zellen sind durch die Expression zahlreicher Markerproteine

gekennzeichnet, die im Zusammenhang mit deren regulatorischen Eigenschaften

stehen. Eine Analyse der TLSEC ergab, dass die Zellen zu einem hohen Anteil Helios

exprimierten, ein Transkriptionsfaktor spezifisch für Treg (Thornton, Korty et al. 2010,

Himmel, MacDonald et al. 2013). Des Weiteren wurde für TLSEC eine verstärkte

Page 103: Modulation von CD4+ T-Zellen durch Lebersinusendothelzellen · 2008, Takada and Jameson 2009, Sprent and Surh 2011)). Die hauptsächliche Ausbildung des T-Zell-Repertoires findet

Diskussion

103

Expression von ENTPD-1, sowie der zytolytisch-wirkenden Moleküle Granzym B und

Perforin ermittelt.

Regulatorische T-Zellen supprimieren die Aktivierung und Proliferation von naiven T-

Zellen, können aber auch pro-inflammatorische CD4+ T-Zellen und zytotoxische CD8+

T-Zellen regulieren (Levings, Sangregorio et al. 2001, Suvas, Kumaraguru et al. 2003).

In der hier vorliegenden Arbeit wurde erstmals die Suppression der Effektorfunktion

CD8+ T-Zellen durch TLSEC demonstriert. Die Suppression von CD8+ T-Zellen durch

leberaktivierte regulatorische T-Zellen könnte eine große Bedeutung für die

Pathogenese einer Autoimmunhepatitis haben, wie durch vorangegangene Studien

unserer Arbeitsgruppe bereits gezeigt wurde (Kruse, Neumann et al. 2009). Für die

Suppression von Th Zellen durch Treg wurde gezeigt, dass die Treg Th-spezifische

Transkriptionsfaktoren exprimieren um die entsprechenden Th Zellen zu supprimieren

(Chaudhry, Rudra et al. 2009, Koch, Tucker-Heard et al. 2009, Zheng, Chaudhry et al.

2009). Für CD8+ T-Zellen ist eine transkriptionelle Anpassung von Treg nicht

beschrieben. Es kann spekuliert werden, ob evtl. das Organ der Entzündung relevant

ist für die Suppression der CD8+ T-Zellen und demzufolge nur durch Treg erfolgen kann

die in dem entsprechenden Organ aktiviert worden sind. Die Pathogenese einer

Autoimmunhepatitis ist bisher nur unzureichend aufgeklärt. Es wird vermutet, dass die

Enzündung durch eine mangelnde Regulation von autoreaktiven Zellen des adaptiven

Immunsystems entsteht (Oo, Hubscher et al. 2010). Demzufolge könnte man in

weiterführenden Studien zum einen die Zytotoxizität der TLSEC inhibierten CD8+ T-

Zellen analysieren und die Entstehung von leberaktivierten regulatorischen T-Zellen in

vivo untersuchen.

Für die Aufrechterhaltung der Homöostase im Darm sind regulatorische T-Zellen enorm

wichtig (Barnes and Powrie 2009). Dies wird besonders deutlich, wenn eine Mutation

im FoxP3 Gen die Ausbildung von funktionellen Treg verhindert, wie beim IPEX-

Syndrom, und zur Ausbildung von schweren intestinalen Entzündungen führt (Powell,

Buist et al. 1982). In zahlreichen murinen Krankheitsmodellen für Darmentzündung

wurde gezeigt, dass der adoptive Transfer von Treg den Verlauf einer Colitis mildern

kann (Mottet, Uhlig et al. 2003, Hadis, Wahl et al. 2011). In der hier durchgeführten

Studie zeigte der Ko-Transfer von TLSEC zusätzlich zu den naiven CD4+ T-Zellen eine

Page 104: Modulation von CD4+ T-Zellen durch Lebersinusendothelzellen · 2008, Takada and Jameson 2009, Sprent and Surh 2011)). Die hauptsächliche Ausbildung des T-Zell-Repertoires findet

Diskussion

104

signifikante Reduktion eines Großteils der analysierten Krankheitsparameter. Den

größten Einfluss hatten die TLSEC beim Ko-Transfer mit naiven CD4+ T-Zellen auf die

Anzahl der Lymphozyten der Lamina propria, die aus dem Colon isoliert wurden und

auf die Frequenz der CD4+ Zellen im Colongewebe selbst. Die Daten deuten darauf

hin, dass entweder die Einwanderung oder die Proliferation der CD4+ T-Zellen, bzw.

eine Kombination aus beiden Faktoren unterdrückt wurde. Eine Suppression der

Sekretion pro-inflammatorischer Zytokine der CD4+ T-Zellen durch TLSEC könnte

weiterführend durch in vitro Suppressionsassays bzw. ex vivo über die Quantifizierung

von Zytokinen in Kulturüberständen entzündeter Colonabschnitte erfolgen. Die

Ergebnisse dieser Arbeit zeigten aber auch, dass durch den Ko-Transfer von TLSEC

zusätzlich zu naiven CD4+ T-Zellen die Colonlänge und der histopathologische Score

nicht verändert wurde. Diese Beobachtung könnte in einer zeitlichen Versetzung

zwischen Zellinfiltration und Gewebeschädigung bzw. -reparatur begründet sein.

Weiterführende Studien sollten demzufolge Analysen mehrerer Zeitpunkte der

Erkrankung einschließen. Für Treg ist beschrieben, dass die Suppression von

Effektorzellen erst relativ spät staffindet, um zuvor eine ausreichende Proliferation der

Treg zu gewährleisten (Klein, Khazaie et al. 2003). Diese Daten würden den Schluss

zulassen, dass die pro-inflammatorischen Th Zellen bereits einen großen

Gewebeschaden verursacht haben, bevor eine Regulation durch TLSEC stattfindet und

eine mögliche Erklärung für die Diskrepanz zwischen den unterschiedlich regulierten

Krankheitsparametern liefen. In dem hier durchgeführten Versuch führte der alleinige

Transfer von naiven CD4+ T-Zellen zu einem schwereren Krankheitsverlauf, als für das

Modell beschrieben ist (Griseri, Asquith et al. 2010). Das Mausmodell der

Transfercolitis ist stark von den hygienischen Bedingungen der Tierhaltung und der

damit verbundenen Zusammensetzung der Mikrobiota im Darm abhängig. Die sehr

starke Entzündung und der schnellere Krankheitsverlauf muss bei der Suppression

durch TLSEC berücksichtigt werden. Um die Stärke der suppressiven Kapazität der TLSEC

einzuordnen, könnte man parallel FoxP3+ Treg applizieren und die regulatorischen T-

Zellen miteinander vergleichen. Wenn für die Treg eine vergleichbare Suppression der

Darmentzündung ermittelt würde, dann wäre auch die inhibitorische Kapazität der TLSEC

als besonders hoch einzuschätzen.

Page 105: Modulation von CD4+ T-Zellen durch Lebersinusendothelzellen · 2008, Takada and Jameson 2009, Sprent and Surh 2011)). Die hauptsächliche Ausbildung des T-Zell-Repertoires findet

Diskussion

105

Die suppressive Fähigkeit regulatorischer T-Zellen kann sowohl durch lösliche, als

auch durch zellgebundene Effektormoleküle vermittelt werden (Übersicht in (Wing and

Sakaguchi 2012)). Die inhibitorischen Moleküle wirken zum einen direkt auf die zu

supprimierende Zellpopulation, bzw indirekt, in dem z.B. die T-Zell-Aktivierung durch

antigenpräsentierende Zellen unterdrückt wird. In Vitro Studien dieser Arbeit zeigten

erstmals, dass LSEC aktivierte CD4+ T-Zellen (TLSEC) zu einem Großteil den

Transkriptionsfaktor Helios exprimieren. Somit könnten die TLSEC, erweitert zu den

vorhergehenden Untersuchungen, als CD25-FoxP3-Helios+ bezeichnet werden. In der

hier vorliegenden Arbeit erfolgte erstmals eine Analyse der Expression von ENTPD-1,

Granzym und Perforin. Es wurde gezeigt, dass TLSEC diese Moleküle stärker

exprimieren als TSAPC. Die Mechanismen über die TLSEC suppressiv wirken sind bisher

noch nicht identifiziert. Frühere Studien zeigten bereits, dass für die Suppression durch

TLSEC Zell-Zell-Kontakt notwendig ist, da eine Trennung der TLSEC von den Responder

Zellen mittels Transwell in vitro eine Aufhebung der Inhibition bewirkte (Kruse,

Neumann et al. 2009). Für die Relevanz der analysierten Moleküle würde sprechen,

dass die Wirkung dieser Effektormoleküle direkten Zell-Zell-Kontakt erfordert. Mittels

spezifischer Inhibitoren könnte man weiterführend die Induktion von Apotose durch

Granzym und Perforin verhindern und deren Notwendigkeit für die TLSEC bestätigen

(Trapani and Smyth 2002). Zusätzlich sollte man die Relevanz der detektierten

Effektormoleküle mittels knockout Mäusen bestätigen.

Die Ergebnisse der hier vorliegenden Arbeit können zur Aufklärung der Mechanismen

der Regulation einer Autoimmunhepatitis beitragen, und zeigen, dass auch in der Leber

selbst induzierte TLSEC einen Einfluss auf die Pathogegese eine T-Zell-vermittelten

Hepatitis haben könnten. Für die Therapie einer Autoimmunhepatitis müssen zunächst

die Ursachen für die mangelnde Regulation der auto-reaktiven T-Zellen aufgeklärt

werden um anschließend z.B. eine Induktion von regulatorischen T-Zellen zu fördern

bzw. deren Funktionalität zu unterstützen. Die Migration von leberaktivierten

regulatorischen CD4+ T-Zellen in den Darm und das GALT demonstriert, dass nicht nur

im Darm selbst generierte Treg wichtig für die Aufrechterhaltung der intestinalen

Homöostase sind, sondern, verbunden über den enterohepatischen Kreislauf, auch Treg

der Leber notwendig sind. Dennoch sind weitere Analysen der Entstehung und

Wirkweise der TLSEC für das Verständnis der Toleranzentstehung essentiell.

Page 106: Modulation von CD4+ T-Zellen durch Lebersinusendothelzellen · 2008, Takada and Jameson 2009, Sprent and Surh 2011)). Die hauptsächliche Ausbildung des T-Zell-Repertoires findet

Diskussion

106

5.3.2 LSEC induzieren suppressive IL-10+ Th1 Zellen abhängig vom

Notchsignalweg

Im vorangegangenen Kapitel wurde die suppressive Kapazität von CD4+ T-Zellen

beschrieben, die unter homöstatischen Bedingungen durch LSEC aktiviert wurden. Für

diese Arbeit war es auch von großem Interesse, welchen Einfluss LSEC auf die

Aktivierung von CD4+ T-Zellen haben, wenn in der Leber selbst bereits eine

Entzündung vorliegt. Demzufolge wurden CD4+ T-Zellen analysiert, die unter Th1-

polarisierenden Bedingungen, d.h. in Gegenwart von IL-12, durch LSEC aktiviert

wurden. Die Limitierung von Th1-vermittelten Entzündungsreaktionen ist notwendig um

Gewebeschädigung und die Entstehung von Autoimmunität zu verhindern. Das anti-

inflammatorische Zytokin IL-10 kann die Proliferation dieser pro-inflammatorischen Th

Zellen inhibieren und damit zu T-Zell Homöostase beitragen. Interessanterweise wird

IL-10 durch Th1 Zellen selbst exprimiert und trägt damit zur Autoregulation von Th1-

vermittelten Entzündungreaktionen während einer Vielzahl von infektiösen

Erkrankungen bei (Anderson, Oukka et al. 2007, Jankovic, Kullberg et al. 2007, Sun,

Madan et al. 2009). In dieser Arbeit wurde erstmals gezeigt, dass LSEC auf Th1 Zellen

(Th1LSEC) verstärkt das anti-inflammatorische Zytokin IL-10 hochregulieren, während

SAPC (Th1SAPC) dazu nur in geringem Umfang in der Lage waren. Die Expression von

IFNγ war hingegen bei Th1SAPC und Th1LSEC vergleichbar.

In einem DTH Model entwickelten adoptiv transferierte und in vivo re-aktivierte Th1LSEC

keine Entzündungsreaktion, sondern supprimierten sogar eine Th1-induzierte

Inflammation. Die Blockade des IL-10 Signals mittels anti-IL-10 Rezeptor Antikörper

resultierte in der Aufhebung der Suppression durch Th1LSEC. Die suppressive Wirkung

von IL-10 beruht unter anderem auf der Inhibition der Zytokinsekrektion sowie der

Expression von MHCII und ko-stimulatorischen Rezeptoren auf Makrophagen und DC

(de Waal Malefyt, Abrams et al. 1991, Ding, Linsley et al. 1993, Allavena, Piemonti et

al. 1998). Demzufolge kann vermutet werden, dass die Th1LSEC durch ihr sekretiertes

IL-10 die in vivo Re-aktivierung der entzündungsauslösenden Th1SAPC unterdrückten

und somit die Entstehung der DTH-Reaktion verhinderten.

Page 107: Modulation von CD4+ T-Zellen durch Lebersinusendothelzellen · 2008, Takada and Jameson 2009, Sprent and Surh 2011)). Die hauptsächliche Ausbildung des T-Zell-Repertoires findet

Diskussion

107

Die Analyse der Mechanismen, die für die Hochregulation der IL-10 Expression in

Th1LSEC verantwortlich sein könnten, ergab, dass IL-27 und ICOS hier keine Rolle

spielten, obwohl für beide Molküle eine Relevanz für die Induktion von IL-10 in einem

anderen Kontext belegt ist (Witsch, Peiser et al. 2002, Kroczek, Mages et al. 2004,

Fitzgerald, Zhang et al. 2007). Arbeitsgruppeneigene Studien belegten bereits den

Einfluss des Notch-Signalweges auf die IL-10 Expression von Th1 Zellen (Rutz, Janke

et al. 2008, Kassner, Krueger et al. 2010, Neumann, Heinrich et al. 2014). In der hier

durchgeführten Studie wurde ex vivo und tw. in situ gezeigt, dass LSEC konstitutiv die

vier Notch-Liganden Dll1, Dll4, Jagged1 und Jagged2 exprimieren. In

vorangegangenen Studien bewirkte der Signalweg über die Liganden Dll1 und Dll4 die

höchste IL-10 Expression auf Th1 Zellen, während die Liganden der Jagged Familie

nur beschränkt dazu in der Lage waren (Rutz, Janke et al. 2008, Kassner, Krueger et

al. 2010). Dementsprechend erfolgte zunächst eine Blockade von Dll1 und Dll4 in den

Th1LSEC Kulturen, doch dies resultierte nur in einer teilweisen Inhibition der IL-10

Expression. Die Ergebnisse könnten zum einen in einer nicht vollständigen Blockade

der Dll Liganden durch die Antikörper begründet sein, oder zum anderen den Schluss

zulassen, dass die Jagged Liganden den Mangel an Dll teilweise kompensieren

können und folglich auch eine Rolle für die hohe IL-10 Expression in Th1LSEC spielen.

Übereinstimmend mit dieser Schlußfolgerung demonstrierten Burghardt et al, dass

Hepatozyten über Jagged1 IL-10 in Th1 Zellen hochregulieren (Burghardt, Erhardt et

al. 2013). Eine vollständige Blockade des Notch-Signalweges, und damit des Signals

über alle Liganden, in Th1LSEC Kulturen mittels γ-Sekretaseinhibitor, inhibierte selektiv

die Expression von IL-10. Bestätigt wurden diese Ergebnisse durch die Verwendung

von Notch1/2ko CD4+ T-Zellen für die Ko-Kultur mit LSEC, bei denen die

Hochregulation der IL-10 Expression im Vergleich zu den Notch1/2wt T-Zellen

aufgehoben war. Demzufolge erfolgte die Induktion von IL-10 über die Notchmoleküle 1

und 2, andere Notch-Rezeptoren konnten die Notch1/2 Defizienz nicht kompensieren.

Die Ergebnisse lassen den Schluß zu, dass die IL-10 Expression in Th1LSEC über den

Notch-Signalweg vermittelt wird.

Welche Notchliganden auf den LSEC im Einzelnen für die IL-10 Hochregulation in T-

Zellen notwendig sind, könnte man fortführend mit einer selektiven Deletion einzelner

Liganden auf Endothelzellen in vivo analysieren. Als funktionelle Analyse könnte man

Page 108: Modulation von CD4+ T-Zellen durch Lebersinusendothelzellen · 2008, Takada and Jameson 2009, Sprent and Surh 2011)). Die hauptsächliche Ausbildung des T-Zell-Repertoires findet

Diskussion

108

daraufhin eine Infektion mit Toxoplasma gondii durchführen, ein Mausmodel, bei dem

IL-10 einen regulierenden Einfluss auf die entstehende Leberentzündung hat

(Jankovic, Kullberg et al. 2007, Neumann, Heinrich et al. 2014). Mittels

Intravitalmikroskopie der Leber und die Verwendung von Notch-Reporter Mäusen, die

bei einem Notch-Signal Luciferase exprimieren und bei systemisch vorliegenden

Luciferin daraufhin ein Lichtsignal generieren, könnte die Interaktion von T-Zellen mit

LSEC über Notch nachgewiesen werden.

Weiterhin stellt sich die Frage, welche Signale für die Hochregulation von IL-10 auf T-

Zellen durch LSEC notwendig sind und ob diese gleichzeitig oder unabhängig

voneinander erfolgen können. Studien unserer Arbeitsgruppe zeigten die Abhängigkeit

der IL-10 Expression in Notch-modulierten T-Zellen von einem STAT4 Signal, wie es

IL-12 und IL-27 induzieren (Rutz, Janke et al. 2008). Übereinstimmend mit diesen

Daten, konnte ohne die Zugabe von IL-12 kein IL-10 in T-Zell-LSEC Kokulturen

induziert werden. Auch das von LSEC sezernierte IL-27 war nicht ausreichend, um ein

starkes STAT4 Signal zu generieren und damit sowohl IFNγ und IL-10 hochregulieren

zu können. Während einer Leberentzündung wird IL-12 allerdings von Leber DC

exprimiert und würde demnach auch in den Sinusoiden bzw. dem Parenchym vorliegen

(O'Connell, Son et al. 2003, Bosma, Metselaar et al. 2006). Zusätzlich zu IL-12 ist ein

gleichzeiges Signal über den T-Zell-Rezeptor und Notch notwendig (persönliche

Mitteilung von Jonas Ahlers und Derk Amsen). Das bedeutet, dass für die Entstehung

von IL-10+ Th1LSEC das Antigen in der Leber vorliegen muss, um durch die LSEC

präsentiert zu werden. Über die Visualisierung der immunologischen Synapsenbildung

bei der Aktivierung einer T-Zelle, könnte man überprüfen, ob beide Rezeptoren ko-

lokalisieren.

Unabhängig von den Zellen des Immunsystems ist der Notch-Signalweg für

Endothelzellen hauptsächlich im Rahmen der Regulation der Angiogenese beschrieben

(Hellstrom, Phng et al. 2007, Lobov, Renard et al. 2007, Suchting, Freitas et al. 2007).

Die Leber besitzt eine außergewöhnliche Regenerationsfähigkeit. Die Notwendigkeit

der Expression von Notch1 und Jagged1 wurde während der Leberregeneration in

Ratten analysiert (Kohler, Bell et al. 2004). Kohler et al. demonstrierten, dass bereits

kurze Zeit nach partieller Hepatektomie beide Moleküle stark hochreguliert werden und

Page 109: Modulation von CD4+ T-Zellen durch Lebersinusendothelzellen · 2008, Takada and Jameson 2009, Sprent and Surh 2011)). Die hauptsächliche Ausbildung des T-Zell-Repertoires findet

Diskussion

109

damit zur Zelldifferenzierung und –wachstum beitragen könnten. Eine Deletion von

Notch 1 führte hingegen zu einer spontanen Hyperplasie von Gefäßzellen (Dill,

Rothweiler et al. 2012), während eine Überexpression von Dll4 in Endothelzellen eine

diffuse Gefäßneubildung veranlasst (Izumi, Helker et al. 2012). In der überwiegenden

Zahl, der an dem Alagille Syndrom erkrankten Patienten, wird eine Mutation von

Jagged-1 detektiert. Eine Erkrankung, die unter anderem durch eine chronische

Leberentzündung gekennzeichnet ist (Krantz, Piccoli et al. 1999). Möglicherweise wird

diese Entzündung durch eine mangelnde Regulation durch leberaktivierte

regulatorische T-Zellen begünstigt.

Die Ergebnisse dieser Arbeit demonstrieren erstmals die Modulation von CD4+ T-Zellen

durch LSEC über den Notch-Signalweg. Die Daten lassen den Schluß zu, dass die

Notch-abhängige Induktion von IL-10+ Th1 Zellen durch LSEC einen weiteren

Mechanismus zur Entstehung von Toleranz in der Leber darstellt und dazu beitragen

könnte, T-Zell-vermittelte Entzündungen in der Leber zu begrenzen (Abbildung 17).

Erst kürzlich wurde die Jagged1-abhängige IL-10 Induktion in Th1 Zellen durch

Hepatozyten beschrieben (Burghardt, Erhardt et al. 2013). Auch pDC, die in der Leber

in einer höheren Frequenz vorliegen, als in anderen Organen, sind in der Lage über

Dll4 die IL-10 Expression in Th1 Zellen hochzuregulieren (Kassner, Krueger et al.

2010). Die Daten belegen, dass die Hochregulation von IL-10 auf Th1 Zellen eine

Eigenschaft mehrerer Leber APC ist und davon abhängt, durch welche APC die T-Zell-

Aktivierung stattfindet. Unter der Berücksichtigung der hier ermittelten Ergebnisse zur

spezifischen Migration von Th1LSEC Zellen in Darm und GALT, ermöglicht durch die

hohe Retimolsäure-abhängige Expression des darmspezifischen Homingrezeptors

α4β7-Integrin, ist es sehr wahrscheinlich, dass die suppressorischen Th1LSEC auch zur

T-Zell-Homöostase im Darm beitragen. Die Kombination der migratorischen und

suppressorischen Eigenschaften der Th1LSEC verdeutlicht die herausragende Stellung

der Lebersinusendothelzellen in der Leber bei der Induktion von Toleranz.

Page 110: Modulation von CD4+ T-Zellen durch Lebersinusendothelzellen · 2008, Takada and Jameson 2009, Sprent and Surh 2011)). Die hauptsächliche Ausbildung des T-Zell-Repertoires findet

Diskussion

110

Abbildung 17: Schematische Darstellung der Differenzierung und suppressorischen Eigenschaften von Th1LSEC in der Leber und Darm. Naive CD4

+ T-Zellen oder pro-inflammatorische Th1 Zellen immigrieren in die Leber, trans-

migrieren bei einer Leberentzündung verstärkt durch das Endothel in das Parenchym. Die antigenspezifische Reaktivierung durch Lebersinusendothelzellen (LSEC) und der Bindung von Notch-Liganden Dll und Jagged in der Präsenz von IL-12 induziert die verstärkte Expression des anti-inflammatorischen Zytokins IL-10 in LSEC-aktivierten Th1 Zellen (Th1LSEC). Über Retinolsäure (RA) der LSEC wird die Hochregulation des darmspezifischen Homingrezeptors α4β7-Integrin in Th1LSEC induziert und ermöglicht eine Migration der T-Zellen in den Darm und GALT. Die Th1LSEC wirken durch IL-10 suppressorisch und könnten so einen regulatorischen Einfluss auf die Entstehung und Verlauf von Entzündungsreaktionen in Leber und Darm haben.

Page 111: Modulation von CD4+ T-Zellen durch Lebersinusendothelzellen · 2008, Takada and Jameson 2009, Sprent and Surh 2011)). Die hauptsächliche Ausbildung des T-Zell-Repertoires findet

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6. Zusammenfassung

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Zusammenfassung

112

Die Leber verfügt über einzigartige immunregulatorische Funktionen, die eher zur

Induktion von Toleranz führen, als eine Immunantwort auszulösen. Durch die

Expression von von koinhibitorischen Rezeptoren und immunsupprimierenden

Mediatoren übt die Leber einen entscheidenden Einfluss auf die Homöostase des

gesamten Organismus aus. Das spezielle Milieu der Leber wird durch die

Zusammensetzung und charakteristischen Eigenschaften der Zellpopulationen in den

Sinusoiden und dem Parenchym bestimmt. Durch den geringen Durchmesser der

Sinusoide haben passierende T-Zellen aus dem Blutstrom intensiven Kontakt mit den

Lebersinusendothelzellen (LSEC), Kupffer Zellen und dendritischen Zellen der Leber.

LSEC und die anderen leberresidenten antigenpräsentierenden Zellen (LAPC) nehmen

Antigen aus dem Blutstrom auf und präsentieren diese über MHC Moleküle an T-

Zellen. In dieser Arbeit wurde der Frage nachgegangen, auf welche Art und Weise eine

Antigenpräsentation durch LSEC an CD4+ T-Zellen zur Induktion von Toleranz beiträgt

und inwieweit sich die LSEC dabei von den anderen Leber APC unterscheiden.

Der tolerogene Einfluss der Leber ist nicht nur auf das Organ selbst beschränkt,

sondern spielt auch eine Rolle in peripheren Geweben. Damit T-Zellen lokal wirken

können, müssen sie in die entsprechenden Gewebe migrieren. In dieser Arbeit wurde

gezeigt, dass LSEC bei einer antigenspezifischen Aktivierung von naiven CD4+ T-

Zellen und Th1 Zellen in vitro die darmspezifischen Homingrezeptoren α4β7-Integrin

und z.T. CCR9 auf den T-Zellen hochregulierten, während die LAPC nicht dazu in der

Lage waren. Die Induktion der Darmhoming-Repetoren war abhängig von LSEC-

eigener Retinolsäure. In in vivo Homingassays wurde für LSEC-re-aktivierte Th1 Zellen

eine präferentielle Einwanderung in den Darm und das darmassoziierte lymphatische

Gewebe (GALT) nachgewiesen.

Die Modulation der Effektorfunktion von T-Zellen bzw. die Induktion von Apoptose sind

wichtige Mechanismen der Toleranzentstehung in der Leber. In vitro Kokulturen von

LSEC bzw. LAPC mit naiven CD4+ T-Zellen bzw. Th1 Zellen zeigten, dass LSEC die

Induktion bzw. Expression des pro-inflammatorischen Zytokins Interferon-γ

verringerten, während die LAPC vorrangig Apotose induzierten.

Page 113: Modulation von CD4+ T-Zellen durch Lebersinusendothelzellen · 2008, Takada and Jameson 2009, Sprent and Surh 2011)). Die hauptsächliche Ausbildung des T-Zell-Repertoires findet

Zusammenfassung

113

Die Aktivierung von CD4+ T-Zellen durch LSEC unter homöostatischen Bedingungen

führt zur Induktion von FoxP3-Helios+ regulatorischen T-Zellen (TLSEC). Mittels in vitro

Suppressionsassays wurde die Suppression der Proliferation und Expression von

Effektorzytokinen von CD8+ T-Zellen analysiert. TLSEC waren gleichermaßen suppressiv,

wie ex vivo-isolierte regulatorische T-Zellen. Im Zusammenhang mit den darm-

spezifischen Migrationseigenschaften wurde in einem Transfercolitismodel in vivo die

regulatorische Kapazität der TLSEC auf die Entstehung einer Darmentzündung

untersucht und ansatzweise bestätigt.

Wurden CD4+ T-Zellen unter Th1-polarisierenden Bedingungen durch LSEC in vitro

aktiviert, dann entstanden Th1 Zellen, die neben dem pro-inflammatorischen IFNγ

zusätzlich das anti-inflammatorische Zytokin IL-10 exprimierten. Diese Th1LSEC wirkten

nicht mehr pro-inflammatorisch, sondern supprimierten sogar eine Th1-vermittelte

Entzündung in vivo. Die Induktion von IL-10+ Th1 Zellen durch den Notch-Signalweg ist

beschrieben. Hier wurde gezeigt, dass LSEC die Notch-Liganden der Dll- und Jagged-

Familie auf einem hohen Niveau exprimierten. Die Blockade des Notch-Signalwegs

mittels eines γ-Sekretaseinhibitors bzw. die Verwendung von Notch-defizienten CD4+

T-Zellen resultierten in einer spezifischen Inhibition der IL-10 Expression in Th1LSEC.

Aus den Ergebnissen folgt, dass LSEC, abhängig vom Notch-Signalweg, suppressive

IL-10+ Th1 Zellen induzieren.

Zusammenfassend wurde in der hier vorliegenden Arbeit gezeigt, dass LSEC in vitro

sowohl unter homöostatischen, als auch unter inflammatorischen Bedingungen

regulatorische CD4+ T-Zellen induzieren. Zusätzlich haben LSEC in der Leber die

einzigartige Fähigkeit, durch die Hochregulation von darmspezifischen Homing-

rezeptoren auf CD4+ T-Zellen, nicht nur zur Immunregulation in der Leber selbst,

sondern auch im Darm beizutragen.

Schlagwörter: Lebersinusendothezellen, CD4+ T-Zellen, Th1 Zellen, IL-10, Notch,

gewebespezifische Migration, Toleranz

Page 114: Modulation von CD4+ T-Zellen durch Lebersinusendothelzellen · 2008, Takada and Jameson 2009, Sprent and Surh 2011)). Die hauptsächliche Ausbildung des T-Zell-Repertoires findet

114

7. Summary

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Summary

115

The liver has unique immune regulatory poperties that results in the induction of

tolerance rather than inflammatory responses to antigens. By the expression of

coinhibitory molecules and immunosuppressive mediators the liver plays an important

role for systemic homeostasis. The unique microenvironment and the cellular

constitution of the sinusoids and the parenchyma determine the outcome of hepatic

immune responses. Due to the small diameter of the blood vessels, passing T cells can

intensively interact with the liver sinusoidal endothelial cells (LSEC), Kupffer cells and

dendritic cells. Nutrient- and hepatotrophic antigens are taken up by various liver

antigen presenting cells (APC) and are presented via major histocompatibility complex

class II molecules to CD4+ T cells. The present study addressed the question how the

antigen-specific activation of CD4+ T cells by LSEC contributes to tolerance induction

and analyzed the differences between LSEC and other liver APC during this

interaction.

The tolerogenic capacity of the liver is not restricted to the organ itself, but has rather

systemic relevance. To affect the local immune response, T cells have to migrate into

the respective tissues. Antigen-specific activation of naive CD4+ T cells and Th1 cells

by LSEC in vitro induced expression of the gut-specific homing receptors α4β7-integrin

and partially CCR9 on CD4+ T cells, whereas activation by LSEC-negative liver APC

(LAPC) failed to increase receptor expression. Induction of gut homing receptors

depended on retinoic acid, provided by LSEC. Consequently, LSEC-modulated Th1

cells migrated preferentially into the gut and gut-associated lymphoid tissue (GALT), as

confirmed by homing assays in vivo.

Both, the induction of apoptosis and the modulation of effector cell properties are

possible underlying mechanisms contributing to hepatic tolerance. By in-vitro-culture

systems, the capacity of LSEC to prevent or even inhibit expression of interferon (IFN)-

γ in CD4+ T cells was demonstrated. In contrast, LAPC induced or maintained IFNγ

expression in CD4+ T cells and promoted T cell apoptosis, in addition.

The antigen-specific activation of naive CD4+ T cells by LSEC under steady state

conditions induced the generation of regulatory FoxP3-Helios+CD4+ T cells (TLSEC).

Page 116: Modulation von CD4+ T-Zellen durch Lebersinusendothelzellen · 2008, Takada and Jameson 2009, Sprent and Surh 2011)). Die hauptsächliche Ausbildung des T-Zell-Repertoires findet

Summary

116

TLSEC were able to suppress proliferation and cytokine secretion of CD8+ T cells in vitro,

to the same extent as ex vivo isolated regulatory T cells.

According to their gut-specific migratory capacities, TLSEC even suppress the

pathogenesis of a T cell-mediated intestinal inflammation in a transfer colitis model in

vivo.

When CD4+ T cells are primed by LSEC under Th1-polarizing conditions in vitro, IL-10+

Th1 cells were generated. Due to the expression of the anti-inflammatory cytokine IL-

10 LSEC-activated Th1 cells (Th1LSEC) failed to promote a delayed type hypersensitivity

(DTH) response, but rather suppressed a Th1-mediated inflammation in vivo. IL-10

expression in Th1 cells facilitates self-limitation of immune responses and prevents Th1

cell-induced pathology. IL-10+ Th1 cells can be induced via the Notch pathway.

Interestingly, LSEC express high levels of Notch ligands of the Dll and Jagged family.

When Notch signaling was blocked by γ-secretase inhibitor or by the usage of Notch-

deficient CD4+ T cells in vitro IL-10 induction by LSEC was selectively impaired. In

conclusion, LSEC induce IL-10+ Th1 cells via the Notch pathway.

In the present study the induction of regulatory CD4+ T cells by LSEC under steady

state and inflammatory conditions was demonstrated. In addition, LSEC have the

outstanding capacity in the liver to induce gut-specific homing receptors on T cells and

thereby not only contributing to the immune regulation of the liver, but also to intestinal

homeostasis.

Keywords: liver sinusoidal endothelial cells, CD4+ T cells, Th1 cells, IL-10, Notch,

tissue-specific migration, tolerance

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117

8. Literatur

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I

9. Anhänge

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Anhänge

II

9.1 Abkürzungsverzeichnis

AHR Ahryl-Hydrocarbon-Rezeptor

AICD activation-induced cell death

APC antigenpräsentierende Zelle

BCR B-Zellrezeptor

BSA bovines Serumalbumin

CBA cytometric bead assay

CCL CC-Chemokinligand

CCR CC-Chemokinrezeptor

CD cluster of differentiation

CXCR CXC-Chemokinrezeptor

cDMEM Komplett-DMEM

CFDA-SE 5-,6-Carboxyfluorescein-diacetat-succinimidylester

CFSE Carboxyfluorescein-succinimidylester

cRPMI Komplett-RPMI

CRTh2 Prostaglandin D2-Rezeptor

CTLA-4 cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4

DAPI 4-,6-Diamidin-2-phenylindol

DC dendritische Zelle

Dll Delta-like

DMEM Dulbecco´s Modified Eagle Medium

DMSO Dimethylsulfoxid

DRFZ Deutsches Rheuma-Forschungszentrum

DTH delayed type hypersensitivity

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III

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

FACS fluorescence activated cell sorting

FCS Fötales Kälberserum

FEM Forschungseinrichtung für experimentelle Medizin

der Charité

FITC Fluoresceinisothiocyanat

FoxP3 Forkhead Box P3

FSC Vorwärtsstreulicht

GALT darmassoziiertes lymphatisches Gewebe

GARP glycoprotein A repetititions predominant

gMean geometrischer Mittelwert der Fluoreszenzintensität

GSI γ-Sekretase-Inhibitor

HBSS Hank´s balanced salt solution

HEPES Hydroxyethylpiperazin-Ethansulfonsäure-Puffer

Hes-1 hairly/enhancer of split-1

HPF high power field; hochauflösendes Gesichtsfeld

ICAM intercellular adhesion molecule

ICOS-L inducible co-stimulator ligand

IFA Inkomplettes Freund´sches Adjuvant

IFN Interferon

IgG Immunglobulin G

IL Interleukin

IL-R Interleukin-Rezeptor

IPEX immune dysregulation, polyendocrinopathy, and X-

linked

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IV

i.v. intravenös

ko knockout

LAP latency associated peptide

LAPC LSEC-negative Leber APC

LPL Lymphozyten der Lamina propria

LPS Lipopolysaccharid

LSEC Lebersinusendothelzellen

MACS magnetic activated cell sorting

MAdCAM-1 Mucosal Addressin Cell Adhesion Molecule-1

mAk monoklonaler Antikörper

MHC major histocompatibility complex;

Haupthistokompatibilitätskomplex

MHCI MHC-Moleküle der Klasse I

MHCII MHC-Moleküle der Klasse II

mLN mesenteriale Lymphknoten

N1/2ko Notch1/2floxxCD4Cre+

N1/2wt Notch1/2floxxCD4Cre-

NEAA nicht-essentielle Aminosäuren

NK-Zelle Natürliche Killer-Zelle

NKT-Zelle Natürliche-Killer-T-Zelle

ns nicht signifikant

NPC nicht-parenchymatische Zellen

OT-I OVA-spezifische CD8+ T-Zellen

OT-II OVA-spezifische CD4+ T-Zellen

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V

OVA Ovalbumin

OVA-Peptid Peptid mit der Sequenz: ISQAVHAAHAEINEAGR

PAMP pathogen associated molecular patterns

PBS Phosphatgepufferte Salzlösung

PCR polymerase chain reaction;

Polymerasekettenreaktion

PD-1 prgrammed death 1

PD-L1 programmed death ligand 1

PE Phycoerythrin

PFA Paraformaldehyd

PI Propidiumiodid

P-Lig P-Selektin-Ligand

pLN periphere Lymphknoten

PMA Phorbol- 12-Myristat-13-Acetat

PNAd peripheral lymph node adressin

PP Peyer`sche Plaques

PPR pattern recognition Rezeptor

pTreg Peripherie-induzierte Treg

RA retinoic acid; Retinolsäure

RALDH Retinaldehydrogenasen

RPMI Roswell Park Memorial Institute Medium

RT Raumtemperatur

SAPC spleen derived antigen presenting cells; APC aus

Milz und Lymphknoten

s.c. subkutan

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VI

SSC Seitwärtsstreulicht

STAT signal transducer and activator of transcription

TCR T-Zellrezeptor

TGFβ transfrorming growth factor-β; transformierender

Wachstumsfaktor

Th T-Helfer

Th1LAPC LAPC-aktivierte Th1 Zellen

Th1LSEC LSEC-aktivierte Th1 Zellen

Th1SAPC SAPC-aktivierte Th1 Zellen

TLAPC LAPC-aktivierte CD4+ T-Zellen

TLR Toll-like Rezeptor

TLSEC LSEC-aktivierte CD4+ T-Zellen

tTreg Thymus-induzierte Treg

Treg regulatorische T-Zellen

TSAPC SAPC-aktivierte CD4+ T-Zellen

TSDR Treg-specific demethylated region

TNF Tumor-Nekrose-Faktor

VCAM vascular cell adhesion molecule

WT Wildtyp

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VII

9.2 Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Komplexität der Th Zellpopulationen und regulatorischen T-

Zellen. ......................................................................................................................... 12

Abbildung 2: Schematischer Aufbau der Leber............................................................ 17

Abbildung 3: Expression gewebespezifischer Homingrezeptoren auf CD4+

T-Zellen. ..................................................................................................................... 63

Abbildung 4: Expression von IFNγ und Induktion von Apoptose bei CD4+ T-

Zellen. ......................................................................................................................... 65

Abbildung 5: In vitro Suppression von CD8+ T-Zellen durch TLSEC. .............................. 68

Abbildung 6: In Vivo Suppression einer Transfercolitis durch TLSEC. ............................ 70

Abbildung 7: Charakterisierung der suppressiven Eigenschaften der TLSEC. ................ 73

Abbildung 8: Expression gewebespezifischer Homingrezeptoren auf Th1

Zellen. ......................................................................................................................... 75

Abbildung 9: Expression von IFNγ und Induktion von Apoptose auf Th1

Zellen. ......................................................................................................................... 78

Abbildung 10: Induktion von IL-10 auf Th1 Zellen durch LSEC ................................... 79

Abbildung 11: In vivo Suppression einer DTH-Reaktion durch Th1LSEC. ...................... 82

Abbildung 12: Einfluss von IL-27 und ICOS auf die IL-10 Expression von

Th1LSEC. ...................................................................................................................... 83

Abbildung 13: Expression der Notchliganden Dll1, Dll4, Jagged1 und

Jagged2 durch LSEC. ................................................................................................. 85

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Anhänge

VIII

Abbildung 14: Einfluss der Blockade von Dll1 und Dll4 auf die IL-10

Expression von Th1LSEC. ............................................................................................. 87

Abbildung 15: Inhibition der IL-10 Expression auf Th1LSEC durch γ-

Sekretaseinhibitor. ...................................................................................................... 89

Abbildung 16: Inhibition der IL-10 Expression auf Th1LSEC aus Notch-

Rezeptor-defizienten Mäusen. .................................................................................... 91

Abbildung 17: Schematische Darstellung der Differenzierung und

suppressorischen Eigenschaften von Th1LSEC in der Leber und Darm. ...................... 110

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IX

9.3 Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Sequenzen der Primer und Annealing-Temperatur ..................................... 34

Tabelle 2: Fluorochrome und ihre Adsorptions- und Emissionsmaxima ....................... 35

Tabelle 3: Antikörper für die Durchflusszytometrie, Spezies Maus .............................. 36

Tabelle 4: Antikörper für die Immunfluoreszenz und Immunpathologie ........................ 38

Tabelle 5: Antikörper für die Aktivierung und Blockade, Spezies Maus ........................ 39

Tabelle 6: Pipettieransatz reverse Transkription .......................................................... 52

Tabelle 7: Programm reverse Transkriptase PCR ....................................................... 53

Tabelle 8: Pipettieransatz real-time PCR ..................................................................... 54

Tabelle 9: Programm real-time PCR ............................................................................ 55

Tabelle 10: Scoringübersicht Klinischer Score der Colitis ............................................ 58

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X

9.4 Erklärung

Hiermit erkläre ich, Christine Rudolph, geboren am 08.11.1981 in Dresden, die

vorliegende Dissertation selbstständig und ohne unerlaubte Hilfe angefertigt zu haben

und alle verwendeten Hilfsmittel und Inhalte aus anderen Quellen als solche kenntlich

gemacht zu haben. Des Weiteren versichere ich, dass die vorliegende Arbeit nie in

dieser oder anderer Form Gegenstand eines früheren Promotionsverfahrens war. Die

dem angestrebten Promotionsverfahren an der Fakultät III der Technischen Universität

Berlin zugrunde liegende Promotionsordnung ist mir bekannt.

Berlin, 28.10.2014

Christine Rudolph

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XI

9.5 Danksagung

An dieser Stelle möchte ich den Personen danken, ohne deren vielfältige

Unterstützung diese Arbeit nicht möglich gewesen wäre.

Katja Klugewitz danke ich für die Zurverfügungstellung des Promotionsthemas.

Mein besonderer Dank gilt Alexander Scheffold, Britta Siegmund und dem SFB 633,

die es mir ermöglicht haben, meine Dissertation auch nach dem Ausscheiden von Katja

Klugewitz fortzuführen.

Alexander Scheffold danke ich sehr für die thematische Neuausrichtung meines

Projektes, die sehr gute Betreuung und die zahlreichen anregenden Diskussionen

während meiner Arbeit in seiner Gruppe.

Britta Siegmund, Gerd Burmester und Andreas Radbruch danke ich, dass Sie mir die

Möglichkeit gaben dieses Projekt an ihren Kliniken bzw. Institut durchführen zu können.

Roland Lauster und Jens Kurreck danke ich für die Begutachtung meiner Dissertation

von Seiten der Technischen Universität Berlin und für die konstruktive Unterstützung

während des Promotionsverfahrens, besonders durch Roland Lauster.

Katrin Neumann, Marko Janke und Christian Neumann möchte ich für Ihre

Unterstützung während der tierexperimentellen Arbeiten danken.

Anja Kühl und Simone Spiekermann danke ich für die Durchführung der immun-

histologischen und –pathologischen Untersuchungen dieser Arbeit.

Ute Hoffmann bin ich sehr dankbar für das akribische Korrekturlesen der

Dissertationsschrift und für die tolle Zusammenarbeit mit ihr und der AG Hamann im

Rahmen verschiedenster Anlässe. Ebenso danke ich Marko Janke für die Korrektur der

Dissertation.

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Anhänge

XII

Allen jetzigen und früheren Mitarbeitern der AG Scheffold und der ehemaligen AG

Klugewitz möchte ich ganz herzlich für die freundliche und konstruktive Atmosphäre

innerhalb und außerhalb des Labors danken.

Ich bedanke mich bei allen Mitarbeitern der Gastroenterologie des CBF in Steglitz. Die

überaus freundliche und fruchtbare Zusammenarbeit aller Arbeitsgruppen auf der

dritten Etage des Karl-Landsteiner-Haus wird mir immer in Erinnerung bleiben.

Allen Kollegen des DRFZ und des RFL danke ich für den offenen und herzlichen

Umgang miteinander.

Mein tief empfundener Dank gilt meinem Mann für sein Vertrauen und seine Geduld.

Ich danke ihm sehr dafür, dass er mich dabei unterstützt hat meine Dissertation, fern

unserer Heimatstadt Radebeul, in Berlin durchzuführen.