Möglichkeiten moderner

mikrobiologischer Diagnostik

Univ. Prof. Dr. Andrea Grisold, MBA

Institut für Hygiene, Mikrobiologie und Umweltmedizin

Mikrobiologie

2

Bakteriologie Bakteriologie

Mykologie

Virologie Klass. Virologie

Serologie

Molekulare Erregerdiagnostik

Parasitologie Ektoparasiten

Endoparasiten

Mikrobiom

Mikrobiologie

3

Neu Klassisch

Diagnostik Automatisation

MaldiTOF

Multiplex PCRs

Whole genome sequencing

NGS (Next Generation Sequencing)

CIDTs (Culture independent diagnostic kits)

Kultureller Nachweis

PFGE

MLST

Diversilab

Erreger MRSA x 3

3 MRGN/ 4 MRGN

MDR Variants

ESBL

VRE

PRP

Themen MDR und Patient

MDR und Umwelt

Mikrobiom

4 http://www.who.int/mediacentre/news/releases/2017/bacteria-

antibiotics-needed/en/

5 http://www.who.int/mediacentre/news/releases/2017/bacteria-

antibiotics-needed/en/

6

7 http://edition.cnn.com/2016/01/19/travel/international-

tourists-2015/

8

Distribution of areas by type of Zika virus transmission, worldwide,

as of 27 March 2017

UK

IT

FR

B

G

RO

D

E o

ther

s

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000 1

99

8

19

99

2

00

0

20

01

2

00

2

20

03

2

00

4

20

05

20

06

20

07

20

08

20

09

20

10

20

11

20

12

20

13

20

14

20

15

20

16

Nu

mb

er

of

case

s

UK IT FR BG RO DE others

Measles cases by month of reporting in selected EU/EEA Member States, Jan 1998- Oct 2016

Italy: > 30,000 Cases

3 Deaths

Wales: > 1,200 Cases

1 Death

Bulgaria : > 24,300 Cases

24 Deaths

France: >20,000 Cases 10 Deaths

Netherlands: Bible belt >2,700 Cases 1 Death

Germany: >2,300 Cases 1 Death

Romania: >2,300 Cases 15 Deaths

Source: ECDC, TESSy

10

Measles: Occurence of different genotypes

Anzucht und Identifizierung von Mikroorganismen bisher

Einfache Testsysteme

Gramfärbung

Oxidase Reaktion

Katalase Reaktion

Coagulase Reaktion

Einsatz von verschiedenen Medien (Chromagar)

Vermehrung für weitere Reaktionen

Diverse biochemische Tests wie API oder Vitek II

Je nach Keimgruppe Auswahl der richtigen Methode

Kombination aus verschiedenen phänotypischen

Methoden sowie Erfahrungswerten

Gramfärbung

NH-Api

Vitek II

Anzucht und Identifizierung von Mikroorganismen bisher

Nachteile der herkömmlichen v.a. biochemische Methoden

Teilweise viel Koloniematerial für weitere Testungen notwendig

Je nach Test dauern Identifizierungen ca. 6 - 48 h

Manche Mikroorganismen lassen sich sehr schwer nach Morphologie und

Stoffwechselleistungen einteilen

13

Automatisation in der klin. Mikrobiologie- warum so spät?

14

Anforderungen

Vereinheitlichung der Probenmaterialien bzw. Einsendung

mit Universal Flüssigkeitsmedien (z.B. Eswab)

15

Identifizierung von Mikroorganismen

Neue Methode zur Identifizierung von Mikroorganismen

Kommt aus dem Bereich der Proteomik

Das Massenspektrum einer Molekülverbindung kommt durch Ionisation der

(neutralen) Moleküle und nachfolgender Bestimmung der Molekülmasse der

beim Ionisationsprozeß gebildeten primären Ionen und deren Zerfallsprodukten

im Hochvakuum zustande.

Dr. Markus Wunderlin

Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation-

Time Of Flight

MassenSpektromety (MALDI-TOF MS)

1. Probe auftragen

2. Matrix dazugeben

3. Massenspektrum aufnehmen

4. Datenbankvergleich

Arbeitsablauf

Positive Aspekte durch MALDI-TOF

Genaue, schnelle Identifizierung von vielen Mikroorganismen

Staphylokokken auf Spezies-Ebene

Schnellere Teilbefunde möglich

Haemophilus influenzae

Moraxella catarrhalis

Schnellere Endbefund-Ergebnisse durch schnellere Anaerobier Diagnostik

Bacteriodes spp. , Prevotella spp., Propionibacterium spp., am Tag der Erst-Befundung der Anaerobier

Schneller relevante Befunde möglich

Campylobacter fetus im Kniegelenkspunktat

Corynebacterium diphtheriae im Rachenabstrich

Verbesserte Diagnostikansätze

Actinobaculum schaalii im Harn bei chron. rez. HWI

MALDI-TOF: Weiterentwicklungen (?)

Identifikation der Keime direkt aus Urin

Identifikation direkt ab gewachsener Blutkultur

Stammtypisierung

Bestimmung bestimmter Resistenzgene:

PB2a für MRSA

Carbapenemasen bei MRGN

Bestimmung bestimmter Virulenzfaktoren (z.B. Toxine)

20

Limitation Keimzahl

Limitation polymikrobiell

Limitation Gender (?)

21

22

Keywords: MRSA, Phage amplification, Antibiotic resistance, MALDI

Aures Bericht 2015

+ 5 Stunden

23

PCR`s

24

PCR`s- „automatisiert“

25

PCR`s- „automatisiert“

658 Tests

97.6% übereinstimmende Ergebnisse

16 Fälle, die überprüft werden mussten

26

PCR`s- „automatisiert“

27

PCR`s- „automatisiert“

28

PCR`s- „automatisiert“

Toxin-EIAs

Enzym – Immunoassays in unterschiedlichen Formaten

Assay muss Toxin B detektieren, da auch Toxin A neg./Toxin B pos. Stämme pathogen sind

GDH-EIAs

Glutamat-Dehydrogenase

Alle CD – auch nicht toxigene und auch C. sporogenes etc. reagieren hier

Weist nur Erreger - nicht Toxin nach

PCR

Weisen die Gene für das Toxin oder deren Regulation nach (tcdB, tcdA, tcdC)

C. difficile

In der Diagnostik sollte ein 2 Stufen Verfahren angewendet werden

Erster Test sollte einen hohen Negativen

Vorhersagewert haben EIA auf GDH, EIA Toxine A&B, PCR tcdB

Zweiter Test sollte die Positivität bestätigen

FilmArray Gastrointestinal (GI) Panel for the simultaneous

detection of 22 different enteric pathogens directly from stool

specimens.

Panel`s

Panel`s

Respiratory panel: 20 targets

GI- panel: 22 targets

MP- panel: 14 targets

33

„Bacteria isolated in culture but not included in the panel were

C. diverus, Klebsiella pneumoniae und P. stuartii, as well as S. epidermidis, S. haemolyticus

and S. warneri.“

34

35

36

Whole genome sequencing (WGS)

37

Whole genome sequencing (WGS)

38

39

40

41

KEY WORDS: viral microbiome • next-generation sequencing • viral dark matter • bacteriophages

42

Mikrobiomanalysen- auch aus

„Mischkulturen“ möglich

Keine Spezies, aber Gattung bzw. Phylum-

Hinweis auf die Vielfalt

43

44

45

46

….We need to proceed with elucidation of the role

of mycobiota in healthy LRT and LRT diseases to

hopefully improve patient care.

“Recently the paradigm that the healthy lung is sterile

was challenged and it is now believed that the lungs

harbor a diverse microbiota also contributing to the

pathogenesis of various diseases.”

47

48

49

CIDT`s: Culture independent diagnostic testing

50

CIDT`s: Culture independent diagnostic testing

51

CIDT`s: Culture independent diagnostic testing

52

SF: 125+ (26.6%) und 98/120 potential pathogens

BC: 71+ (15.1%) und 63/120 potential pathogens

False negative rate of SF: 3.7%

53

Zusammenfassung

Neu Klassisch

Diagnostik Automatisation

MaldiTOF

Multiplex PCRs

Whole genome sequencing

NGS (Next Generation Sequencing)

CIDTs (Culture independent diagnostic kits)

Kultureller Nachweis

PFGE

MLST

Ergebnisse Schneller, umfangreicher, ???

Interpretation „..further studies have to be

conducted“

Herzlichen Dank für ihre Aufmerksamkeit!