Molekularbiologische Arbeitstechniken Ergebnisbericht A von Kim Ortmeier.

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Molekularbiologisc he Arbeitstechniken Ergebnisbericht A von Kim Ortmeier

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Molekularbiologische Arbeitstechniken

Ergebnisbericht A

von Kim Ortmeier

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Gliederung

Vorstellung der Experimente Ziel der Experimente Theorie Gesamtergebnisse des Kurses Diskussion

Alle Versuche werden nach den Anweisungen im Skript durchgeführt, Abweichungen werden im Folgenden beschrieben.

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Expression und Reinigung

Aus den Bakterien werden die Proteine extrahiert und aufgereiniget:

Durch Quarzsand werden die Zellen mechanisch aufgeschlossen

Durch kochen denaturieren die Proteine

Waschen und eluieren

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Expression und Reinigung

Versuchsdurchführung

Abweichungen vom Skript: Aufschluss 100 ml Kultur ּפ, Pellet waschen (mit 100 ml Waschpuffer), ּפ Pellet in 3 ml Aufschlusspuffer

resuspendieren Aufschlußpuffer enthielt bei den Gruppen 4-6

zusätzlich noch 5mM Imidazol In Ribotube überführen 3) ּפx 30 sec; 6,5 ms;

da zwischen jeweils 1 min auf Eis) 45 min, 4°C, 14000 rpm ּפ, Überstand in Eppi

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Expression und Reinigung

Versuchsdurchführung

Abweichungen vom Skript: B) Wasch I: 5 mM => 0,2 ml C) Wasch II: 10 mM => 0,4 ml D) Eluat III: 50 mM => 2 ml E) Eluat IV: 150 mM => 6 ml F) Eluat V: 250 mM => 10 ml

Auf je 10 ml mit Aufschlußpuffer auffüllen

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Expression und Reinigung

Versuchsdurchführung

Abweichungen vom Skript: Es werden verschiedene Mengen an Protein

auf die Säule gegeben

Gruppe 1 + 4 -> 4 mg Protein

Gruppe 2 + 5 -> 6 mg Protein

Gruppe 3 + 6 -> 8 mg Protein

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Bradford- Test

Colorimetrische Methode zur Quantifizierung von Proteinen

Coomassie Brillant Blue bindet an Proteine

Menge des Farbstoffes wird im Photometer bei OD595 gemessen

Konzentration wird mit Formel berechnet:

c = (MeßwertOD595 x Verdünnung x 16,2)/ Meßvolumen [µg/µl]

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Bradford- Test

Versuchsdurchführung

Abweichungen vom Skript: Verdünnungsreihe der Kultur:

1:40 -> 25 µl Kultur + 975 µl Waschpuffer 1:50 -> 20 µl der 1:40 Verd. + 980 µl Waschpuffer

(1:200 Verdünnung)

Je 2x 200 µl BioRAD + 800 µl der 1:50 (1:2000) Verdünnung

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Bradford- Test

Gruppenergebnisse

Gruppe Proteingehalt [µg/µl]

1 10,886

2 10,805

3 7,744

4 7,03

5 7,468

6 7,35

Es wurden je 2 Proben gemessen -> Mittelwertbildung = Messwert

Mittelwert des Proteingehaltes aller Gruppen = 8,547 µg/µl

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SDS- Polyacrylamidgelelektrophorese Gelelektrophorese von Proteinen ->

ausschließlich Polyacrylamid als Träger Separierung der einzelnen Substanzen hängt

ab von: ihrer unterschiedlichen Ladungen Porengröße des Gels Größe/ Gestalt der Moleküle pH- Wert, Temperatur, Ionenstärke des Puffers Elektrische Feldstärke

Diskontinuierliches Verfahren

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SDS- Polyacrylamidgelelektrophorese

Versuchsdurchführung

Abweichungen vom Skript: Zusammensetzung für 1 Trenngel (12,5 %):

1,88 Tris pH 8,8 -> 1,2 ml

0,5 % SDS -> 1,2 ml

H2O -> 1,1 ml

Bisacrylamid -> 2,5 ml

TEMED -> 5 µl

APS -> 30 µl

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SDS- Polyacrylamidgelelektrophorese

Versuchsdurchführung

Abweichungen vom Skript: Zusammensetzung für 1 Sammelgel (5 %):

0,625 Tris/ HCl pH 6,8 -> 0,4 ml

0,5 % SDS -> 0,4 ml

H2O -> 0,87 ml

Bisacrylamid -> 0,33 ml

TEMED -> 2 µl

APS -> 10 µl

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SDS- Polyacrylamidgelelektrophorese

Versuchsdurchführung

Abweichungen vom Skript: Zusammen führen der Fraktionen mit Puffer:

Roh-Protein: 8 µg/µl + 3 µl Puffer Bindung Wasch I + II Eluat III – V

Ca. 5 min Kochen der Proben bei 100°C Abkühlen, zentrifugieren und beladen der

Taschen im Gel mit den Proben

je 12 µl + 3 µl Puffer

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Coomassie- Blue- Färbungdes Gels Proteinbanden im Gel werden durch

Coomassie- Blue sichtbar gemacht

Coomassie- Blue in sauer Umgebung als Anion mit den Aminogruppen der Proteine

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SDS- Polyacrylamidgelelektrophorese, Coomassie- Blue Färbung

GruppenergebnisseVergleich der Gele der 1.+ 2. Gruppe

E5M R E4E3W2W1B

M= Marker, R= Rohextrakt, B= Bindung, W1+2= Wasch 1 +2, E 3-5= Eluat 3-5

E5E4W2W1BR M E3

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Gruppenergebnisse

Vergleich der Gele der 3.+ 4. Gruppe

E4E4 W2W2W1 W1B B MM E3E3

M= Marker, R= Rohextrakt, B= Bindung, W1+2= Wasch 1 +2, E 3-5= Eluat 3-5

E5E5 RR

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SDS- Polyacrylamidgelelektrophorese, Coomassie- Blue Färbung

Gruppenergebnisse

Vergleich der Gele der 5.+ 6. Gruppe

E4E4 W2W2W1 W1BB MM E3 E3

M= Marker, R= Rohextrakt, B= Bindung, W1+2= Wasch 1 +2, E 3-5= Eluat 3-5

E5E5 RR

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1., 2. und 3. Gruppe

4., 5. und 6. GruppeM

MM M

M M

M= Marker

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Diskussion

Es ist gut sichtbar, dass die Reinigung relativ gut geklappt hat und dass metY in einer Bande in der Reihe E5 konzentriert vorliegt.

Man kann aber keine deutlichen Unterschiede zwischen den Gelen mit verschieden aufgetragenen Proteinmengen erkennen.

Unterschiede wären vielleicht zu erkennen gewesen, wenn nicht die gleichen Volumina, sondern die gleichen Molekulargewichte aufgetragen worden wären.

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SDS- Polyacrylamidgelelektrophorese, Coomassie- Blue Färbung

Diskussion

Außerdem lässt sich keine starke Verbesserung in Bezug auf die Reinheit der Eluatreihen, durch die Zugabe von 5 mM Imidiazol (Gruppen 4-6) feststellen.

Eine größere Menge an Imidiazol würde vielleicht einen Unterschied erkennen lassen.

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Danke,das war´s!