Molekulare Biologie IIA - univie.ac.at · 2O steril filtrieren, nicht autoklavieren!! Wird mit...

Praktikum

Wintersemester 2007/08

Markus Teige

Max F. Perutz Laboratories

Department für Biochemie,

Universität Wien

Molekulare Biologie IIA

„Hefe als Modellorganismus

für die Signaltransduktion in

eukaryotischen Zellen“

Skript zum Praktikum Molekulare Biologie IIIA

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Inhaltsübersicht: Seite

Experimentelle Einteilung (Übersicht) 3

Theoretische Grundlagen 8

Einleitung 8

1.1. Das Prinzip des Two-Hybrid Assays 9

1.2. Funktionelle Komplementation von Hefe-Mutanten 10

1.3. Der Hog-Pathway in S. cerevisiae 12

Material und Methoden 13

Hefestämme 13

Lösungen und Medien 14

Methoden 15

Hefetransformation 15

Präparativer Verdau der STE11 Kassette 16

Agarosegelelektrophorese 16

PCR (Polymerase Chain Reaction) 18

Verdünnungsreihen von Hefekulturen 19

Genomische DNA aus Hefe 19

Protein-Extrakte aus Hefe 20

Proteinbestimmungen 20

ß-Galaktosidase Assays 21

Experimente 23

1. Disruption des STE11 Gens in S. cerevisiae 23

2. Two-Hybrid Assays mit A. thaliana MAP kinasen 24

3. Funktionelle Komplementation von Hefemutanten 26

Diskussionspunkte / Infos 28

Literatur 29


3

Experimentelle Einteilung

Experiment 1 Gendisruption in Hefe

a) Vorbereitung der Disruptions-Kassette (PCR und Restriktionsverdau)

b) Hefe-Transformation (Disruption)

c) Verifikation der Disruption am korrekten

genetischen Locus

Experiment 2 Hefe Two-Hybrid System

a) Transformation des Two-Hybrid Stammes

mit den zu testenden Konstrukten

b) Ansetzen der Kulturen, Präparation der Zell-

extrakte und Messung der β-Gal Aktivität

c) Proteinbestimmung in den Extrakten und

Berechnung der spez. Aktivitäten

Experiment 3 Komplementation von Hefemutanten

a) Transformation der Hefemutanten mit heterologen

cDNA Konstrukten

b) Ansetzen der Kulturen, Verdünnungsreihe und Aus-

plattieren auf verschiedenen Medien

c) Analyse der Komplementation des Wachstumsdefektes

und Aussage über Funktion

Es ist zu beachten, dass positive Klone erst 2-3 Tage nach einer Hefe-

Transformation erscheinen, ebenso Ergebnisse von Verdünnungsreihen !


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Zur Arbeit im Labor

• Am ersten Tag Laborplatz einrichten ! - Namensschild am Platz anbringen

- Impföse, Spritzflasche, Eppis, Spitzen

- Zahnstocher, Eisbox, Mistkübel

- Drigalski Spatel + Petrischale

• Am Abend Gas zudrehen, Platz aufräumen, mit Ethanol

abwischen, Mistkübel ausleeren (in Autoklaviersack!),

Pipetten bei Tutoren abgeben!

• Spitzen und Eppis selbstständig wieder auffüllen !

• Schmutziges Laborgeschirr: Beschriftung mit EtOH entfernen,

ausspülen (falls Bakterien od Hefe mit EtOH), und in die Wanne

(Laborgeschirr zum Waschen) geben

• Flüssigkeiten wie Hefe- oder Bakterienkulturen in den Liquid-

Waste Kolben zum autoklavieren!

• Beschriftungen: ALLES wird beschriftet (schwarz auf Autoklav-

Band), z.B. bei YP-Medium nach Zugabe von Glucose + D

dazuschreiben!

• STERILES ARBEITEN: Medien und Stocklösungen (Aminosäure

Mix, Glucose...) werden nur neben der Flamme geöffnet! Medien

werden in kleineren Aliquots autoklaviert (weniger Schaden bei

Kontaminationen)

• Laminar vor und nach dem Benutzen mit EtOH putzen

• Waagen nach dem Benutzen putzen!

• Schüttler immer auf 0 min ! → (endlos) und wieder einschalten!


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Material und Geräte Flaschen

• 1 L 10 Stück (haupts. für Medien/Platten!) • 500 10 Stück • 250 ml 10 Stück • 100 ml 30 Stück (für YP, Glucose, ster. H2O)

Bechergläser

• 2 od 3 L 5 Stück • 1 L 15 Stück (auch zum autokl. Von Eppis) • 500 ml 5 Stück • 300 ml 10 Stück • 150 ml 10 Stck

Erlenmeyer-Kolben

• 2L 5 Stück • 300 ml 5 Stück • 100 ml 15 Stück (stril! Für Hefe ü.N. Vorkuluren)

Meßzylinder (Medien müssen nicht im Zylinder aufgefüllt werden)

• 1L 2 Stück • 500 ml 5 Stück • 250 ml 5 Stück • 100 ml 5 Stück

Weitere Geräte - Material

• 10 Plastik Spritzflaschen (5 x H2O; 5x EtOH), 10 Mistkübel • 250 Eprouvetten, 1x 10 ml Pipetten, 1 x 5ml Pipetten • 4 Peleusbälle, 15 Rührfische, 10 Bunsenbrenner • 12 x Inokulation Loop, 12 x Drigalski Spatel • 12 x 1ml Gilson, 12 x 200µl Gilson, 12x 20µl Gilson, 5x 10µl Gilson • 15x Blaue Spitzenbox, 15 x Gelbe Spitzenbox, 5x weiße Box • 4 Thermomixer, 5 Vortexer, 3 Magnetrührer • 10 Racks für Eppendorf, 10 Racks für Eprouvetten, 5 Racks für 50ml • 2 Electrophoresis + Power supply, Sigma Rotor für Eppd.-Zfg. • 5 Pulvertrichter, 10 Spatel/Löffel, Handschuhe (autoklav)


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Lösungen, Medien und Puffer

Spitzen, Eppendorff tubes (8 1,5 ml; 2x2 ml in 1L Bechergläsern) und 100 ml Kolben autoklavieren!

10 x 100 ml dest. Wasser autoklavieren.

Mengen werden immer aktueller Kursgröße angepasst!

Lösungen 500mM NaEDTA, pH 8.0 250 ml mit 5M NaOH einstellen (wenn acid zum lösen NaOH dazu!)

1M Tris-HCl, pH 7.5 250 ml

70%EtOH in 50 ml Falcon -20°C

100%EtOH in 50 ml Falcon -20°C

10% SDS 100 ml VORSICHT beim Einwiegen; sehr feiner, ungesunder Staub

10xTE aus vorhandenen Lsgen zusammenpipettieren; 50ml Falcon (100mM Tris, 10mM EDTA)

1x TE aus 10xTE in Falcon, aliquotieren à 5ml/ Gruppe

2M LiOAc 50 ml mit Spritze sterilfiltrieren und aliquotieren à 5ml/ Gruppe, Rest für 1M

LiOAc verwenden

1M LiOAc aus sterilem 2M LiOAc 20ml in Falcon herstellen, aliquotieren à 1,5ml/ Gruppe

(Eppi)

1M MgCl2 100 ml

1M Na2CO3 100 ml (NICHT autoklavieren!)

1M NH4Ac 50 ml mit Spritze sterilfiltrieren und aliquotieren à 5ml/ Gruppe

30% PEG 6000 150 ml sterilfiltrieren, aliquotieren à 5ml/Gruppe

50% PEG3600 150 ml sterilfiltrieren, aliquotieren à 15ml/ Gruppe

50x TAE 250 ml (pro Liter: 242g Tris, 100ml 0,5M EDTA, 57,1ml Eisessig)

1x TAE bei Bedarf 500 ml herstellen

5M KOAc 100 ml

5M NaCl 250 ml

5M NaOH 100 ml

Chrom. DNA Lysis Buffer: 50mM Tris (pH 7,5) 20mM EDTA, 1% SDS, in 50ml Falcon,

aus vorhandenen Lösungen mischen und aliquotieren à 5ml/ Gruppe -20°C

Enzym-Lysis-Buffer: 25 mM Tris (pH 7,5) 20 mM NaCl, 8 mM MgCl2, 5 mM DTT, 0,1% NP-40

aus vorh. Lösungen mischen (50ml Falcon) und aliquotieren à 5ml /Gruppe -20°C

Z-Puffer: 500 ml 16.1 g/l Na2HPO4 . 7 H2O, 5.5g/l NaH2PO4.H2O, 0.75 g/l KCl

0.246 g/l MgSO4. 7 H2O steril filtrieren, nicht autoklavieren!!

Wird mit Pumpe filtriert (Tutor)


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Medien (brauchen nicht mit Messzylinder aufgefüllt werden!!),

Rezepte siehe S. 14 im Skript!! (hier: A= Ade, U=Ura, T= Tyr!)

Flüssigmedien YP 3 L, aliquot à 2 x 1L, 4 x 500ml od 2 x 500 ml Flaschen vor dem Autoklavieren!!!

YNB +A+U+T 2 L (später für SD-leu-trp im Y2H)

YNB +A+T 2x 500ml (später für SD-ura, bzw. SD-leu-ura für complement)

Für Platten für min. 30 Platten/Liter Medium!!!

Rührfische nicht vergessen!!!!!

ACHTUNG: Hier Aminosäuren nur in einfacher, nicht in 100facher Konzentration einwiegen

(also Ade und Ura – nur wenn nötig- und Tyrosin jew. 40 mg/1L)

SD -Ade 1 L, als YNB +Tyr+Ura mit 30g Agar/l einwiegen und auch so beschriften!!!

SD –Leu-Trp 2,5 L, als YNB+A+U+T mit 30g Agar/l einwiegen und auch so beschriften!!!

SD –Leu-Ura 1,5 L, als YNB+A+T mit 30g Agar/l einwiegen und auch so beschriften!!!

SD -Ura 1,5 L, als YNB+A+T mit 30g Agar/l einwiegen und auch so beschriften!!!

SD –Leu-Ura+0,3 M NaCl 300ml, als YNB +A+T mit Agar und Salz einwiegen und auch so

beschriften!!! muß mind. 10 Platten ergeben

SD -Ura+0,3 M NaCl 300ml, als YNB +A+T mit Agar und Salz einwiegen und auch so

beschriften!!! muß mind. 10 Platten ergeben

Glucose 40% Glucose 1L 2x 500ml Direkt in Flasche einwiegen, löst sich erst nach Autoklavieren

Aminosäuren Zum lösen erwärmen auf 60-70°C, dann steril filtrieren! 100x AA –Ade, -Ura, -Tyr, -Leu, -Trp, - His (400ml)

100x Leu

100x Trp je 200ml

100x His

Vor dem Autoklavieren alle Flaschen mit schw. Edding auf Autoklav-Band

Beschriften und Deckel ¼ Drehung zurück drehen! Flaschen nach dem

Plattengießen gleich säubern, Rühfische zurückgeben!

}


8

Einleitung

Die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae wird als einzelliger Eukaryot schon seit

Jahren als Modellorganismus zur Untersuchung wichtiger physiologischer

Vorgänge in der Zelle genutzt. Die Vorteile dieses Organismus bestehen in seiner

kurzen Generationszeit (ca. 1.5 bis 2 Stunden) sowie in seiner einfachen

Handhabung, was sowohl die Wachstums- als auch die Versuchsbedingungen

betrifft. Ein weiterer Vorteil von Hefe ist die Möglichkeit der einfachen und

gezielten genetischen Manipulation. Die Integration von DNA ins Genom erfolgt

ausschließlich mittels homologer Rekombination. Dadurch ist ein spezifisches

Ersetzen von Genen durch andere Sequenzen möglich und die Herstellung von

Mutanten relativ einfach.

Ein weiterer Vorteil von Hefe besteht darin, daß Hefe sowohl in haploider als

auch diploider Phase wachsen kann. Dadurch kann auch der Phänotyp rezessiver

Mutationen untersucht werden.

Zusätzlich zeichnet sich Hefe durch gute Transformierbarkeit und durch eine

Vielzahl von Auxotrophie–Markern aus, die sowohl für die Herstellung von

Mutanten als auch für das Einführen von Fremd–DNA essentiell sind.

Die Vorteile dieses Modellorganismus beschränken sich jedoch nicht nur auf die

Untersuchung und das Verständnis von physiologischen Vorgängen. Auch für

das Studium anderer Organismen ist Hefe als Modellorganismus und Werkzeug

gut geeignet. Einerseits können mittels YACs (Yeast Artificial Chromosomes)

große DNA–Stücke kloniert und vermehrt werden, andererseits kann Hefe auch

zur Expression heterologer Proteine genutzt werden. Als dritte und sehr wichtige

Anwendung ist das Two–Hybrid-System zu nennen, mit dessen Hilfe Protein –

Protein Interaktionen nachgewiesen werden können (Sherman, 1998).


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Das Prinzip des Two-Hybrid Assays

Das Two–Hybrid–System ermöglicht die Detektion von Protein–Protein

Interaktionen zwischen zwei (fast) beliebigen Proteinen in Hefe. Es kann in einem

Screen von DNA-Bibliotheken nach Interaktionspartnern für ein bestimmtes

Protein, zur Kartierung der interagierenden Regionen in Proteinen oder auch zum

Nachweis von Interaktionen zwischen Proteinen, die durch andere Daten

impliziert werden, verwendet werden. Durch die Sensitivität des Systems können

auch relativ schwache Interaktionen detektiert werden

Das Prinzip des Two–Hybrid–Systems beruht auf einem genetischen „Trick“: Ein

Transkriptionsfaktor wird in zwei Domänen zerlegt, mit denen die zu

untersuchenden Proteine fusioniert werden. Detektiert wird dann die

transkriptionelle Aktivierung von Reportergenen, die nur dann erfolgt, wenn die

beiden fusionierten Proteine miteinander interagieren (Fields et al., 1994).

Abb. 1: Prinzip des Two–

Hybrid Systems:

A Keine Aktivierung der

Transkription der Reporter-

gene. B Aktivierung der

Transkription durch die

Interaktion der Proteine.

Es werden dabei die Eigenschaften von bestimmten eukaryotischen

Transkriptionsfaktoren ausgenützt. Transkriptionsfaktoren bestehen aus einer

DNA-bindenden und einer auf den Transkriptionsapparat aktivierend wirkenden

Domäne. Für das Two-Hybrid-System werden diese beiden Domänen, die im

Normalfall eine zusammenhängende Polypeptidkette bilden getrennt und als

Fusionsproteine mit den Proteinen X und Y zur Expression gebracht. Interagieren

die beiden Proteine X und Y, so erfolgt die Expression der Reportergene.


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Das am häufigsten verwendete System dieser Art besteht aus der DNA-

bindenden und der aktivierenden Domäne des Gal4p Transkriptionsfaktors von

Saccharomyces cerevisiae, wobei beide Domänen auf unterschiedlichen Plasmiden

mit unterschiedlichen selektierbaren Markern liegen und als Fusionsproteine

exprimiert werden.

Alternativ zur Gal4p DNA-bindenden Domäne kann die lexA DNA-bindende

Domäne verwendet werden. Die lexA DNA-bindende Domäne stammt aus dem

lexA Repressor Protein und bindet an die lexA Operator Sequenz von E.coli.

Anstatt der Gal4p aktivierenden Domäne kann die VP16 Aktivierungsdomäne

von Herpes Virus eingesetzt werden.

Zur Vermeidung von falsch positiven Klonen bei der Durchführung von Screens

mit DNA Bibliotheken werden zusätzlich zum lacZ Reportergen auch noch das

HIS3 Reportergen und in anderen Systemen auch die LEU2 und ADE2

Reportergene zur Selektion eingesetzt. Es hat sich als vorteilhaft erwiesen,

zunächst auf das HIS3 Reportergen zu selektieren und danach auf die Expression

des lacZ Gens. In den für das Two-Hybrid-System geeigneten Hefestämmen ist

den Reportergenen die GAL1-GAL10 Region bzw. die lexA Operator Sequenz

vorgeschaltet, um die Expression der Reportergene zu ermöglichen (Sherman,

1998). Bei der Verwendung von HIS3 als Reportergen ist zu beachten, dass die

Expression dieses Reportergens nie völlig abgeschaltet wird und dadurch falsch

positive Klone entstehen können. Um dieses Problem zu verringern, wird der

Inhibitor 3-Aminotriazol in das Medium zugegeben. Die dabei verwendeten

Konzentrationen müssen für jeden Screen neu bestimmt werden.

Funktionelle Komplementation von Hefe-Mutanten

Hefemutanten, die einen offensichtlichen Phänotyp haben wie z.B.

Veränderungen im Wachstumsverhalten (Hitze- oder Osmosensitivität) können

mit heterologen cDNA-Bibliotheken (funktionell-) komplementiert werden, um

gezielt Gene mit einer bestimmten Funktion zu isolieren. Die Komplementation

von Hefe-Mutanten mit cDNA von Arabidopsis thaliana wurde z.B. mit Erfolg an

Auxotrophie-Mutanten durchgeführt (Minet et al. 1992).


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Voraussetzung für die Durchführung dieses Ansatzes ist jedoch immer eine

geeignete Selektion, wie sie im Fall der Auxotrophie-Mutanten durch das Fehlen

bestimmter Nährstoffe gegeben ist.

Abb. 2: Prinzip der funktionellen Komplementation von Hefe-Mutanten.

Im Rahmen dieses Praktikums sollen Hefemutanten verwendet werden, in denen

Komponenten der HOG1-MAP-Kinase-Kaskade (HOG=High Osmolarity

Glycerol) disruptiert wurden. Dadurch sind diese Stämme osmosensitiv, was eine

Selektion auf salzhaltigen Medien erlaubt. Die optimalen Bedingungen für einen

solchen Screen müssen daher vorher ermittelt werden, indem der entsprechende

Stamm zusammen mit Kontrollen (z.B. Wildtyp W303) auf Platten mit

unterschiedlicher NaCl-Konzentration in einer Verdünnungsreihe ausplattiert

wird:

Abb. 3: Bestimmung der NaCl-Konzentration.

cDNA-library

stress response gene

W 303

pbs2∆ MATa

pbs2∆ MATα

ohne NaCl 0.2M NaCl 0.4M NaCl 0.6M NaCl


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Der Kontrollstamm W303 wächst wie erwartet auf allen getesteten NaCl-

Konzentrationen. Der pbs2∆ Stamm (die MAPKK des HOG-pathway ist

disruptiert) wird mit zunehmender NaCl-Konzentration am Wachstum gehemmt.

Für die Durchführung der funktionellen Komplementation werden also Platten

mit einer NaCl-Konzentration von 400mM gewählt.

Der HOG-Pathway in S.cerevisiae

Wenn Hefezellen einer plötzlichen Änderung der Osmolarität des Mediums

ausgesetzt sind, können sie ihren Stoffwechsel relativ schnell anpassen. Unter

hyperosmotischen Bedingungen kommt es durch eine „Umleitung“ der Glykolyse

in Richtung Glycerol-Produktion und Schließen von Kanälen in der Zellmembran

zu einer intrazellulären Akkumulation von Glycerol. Dieser Prozess wird durch

den sog. HOG-Pathway vermittelt. Er besteht aus den typischen Elementen einer

MAP Kinase-Kaskade: Drei hintereinander agierende Kinasen, die durch zwei

von einander unabhängigen Membransensoren, Sho1p und Sln1p aktiviert

werden können (Wurgler-Murphy et al., 1997).

Die Aktivierung über Sln1p

gleicht der Signalübertragung in

bakteriellen Zwei-Komponenten

Systemen. Sln1p ist ein negativer

Regulator von Ypd1p und Ssk1p.

Erst beim Ausbleiben der

Phosphorylierung an Ssk1p

kommt es zu einer Interaktion

von Ssk1p mit Ssk2p/Ssk22p und

damit zur Aktivierung von Pbs2p

und Hog1p.

Abb. 4: Aktivierung des HOG-pathway


13

Auf der nächsten Ebene dieser Kaskade, der MAPKK Pbs2p, fließt der alternative

Aktivierungsweg über den Osmosensor Sho1p ein. Sho1p aktiviert Pbs2p über

Ste11p. Pbs2 aktiviert schließlich Hog1p durch Phosphorylierung am

konservierten TGY-Motiv und löst damit die Translokation von Hog1p in den

Kern aus (Hohmann, 1997). Mutanten dieses HOG Signaltransduktionsweges

sind osmosensitiv, sie können z.B. auf Medien mit 0.4M NaCl nicht mehr

wachsen. Dies ermöglicht eine einfache Selektion für eine funktionelle

Komplementation.

In Pflanzen sind die MAPKKKs bisher sehr wenig erforscht, die meisten

entsprechen jedoch dem STE11-Typ. In diesem Praktikum soll nun die Rolle der

Aktivierung über die STE11 Seite näher untersucht werden. Eine pbs2∆ Mutante

wurde verwendet, um Homologe MAPKKs aus Arabidopsis thaliana zu isolieren.

Dabei wurde die MAPKK MKK2 isoliert.

Material und Methoden

Stämme und Wachstumsbedingungen W 303: MATa ade2-1 can1-100 his3-11,15 leu2-3.122 trp1-1 ura3-1 (wildtyp Stamm)

L 40: MATα his∆200 trp1-900 leu2-3.112ade2 LYS2 :: (lexA op)4HIS3 URA3 :: (lexA op)8 lacZ

Gal4 gal 80 (Two-Hybrid Stamm)

pbs2∆: MATα ade2-1 can1-100 his3-11,15 leu2-3.122 trp1-1 ura3-1 pbs2 :: HIS3

pbs2, hog1∆: MATα ade2-1 can1-100 his3-11,15 leu2-3.122 trp1-1 ura3-1 pbs2 :: HIS3

hog1::TRP1

ste11, pbs2∆: MATa ade2-1 can1-100 his3-11,15 leu2-3.122 trp1-1 ura3-1 pbs2 :: HIS3

ste11::ADE2

ssk2, ssk22, pbs2∆: MATa ade2-1 can1-100 his3-11,15 leu2-3.122 trp1-1 ura3-1

ssk2 :: LEU2 ssk22 :: LEU2 pbs2 ::HIS3

Die Hefestämme werden bei 30°C am Schüttler (Flüssigkulturen) oder im Inkubator (auf

Agarplatten) kultiviert. Es werden wahlweise Voll- (YP-D) oder Selektivmedien (z.B. SD-ura)

verwendet. ACHTUNG: Schüttler immer auf 0 min, also endlos und nach Entnahme der Proben

wieder einschalten!


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Lösungen und Medien Alle Lösungen, Medien und Platten sollten am ersten Tag hergestellt werden!

Ethidiumbromid-Stammlösung: 5mg/ml in H2O (wird gestellt)

1 x TAE: 40 mM Tris acetate; 1mM EDTA (224g Tris + 100 ml 0.5M EDTA + 57 ml Eisessig)

1 x TE: 10 mM Tris; 1mM EDTA; pH 8 (aus vorhandenen Lösungen!)

5 x DNA Probenpuffer: 100mM Tris pH 8.0, 50% Glycerol, Bromphenolblau, Xylencyan (wird

gestellt)

Medien Alle Medien werden zunächst ohne Kohlenstoffquelle (z.B. Glucose) hergestellt und für 20

Minuten bei 120°C autoklaviert. Die Kohlenstoffquelle, hier z.B. 40% Glucose, wird separat

autoklaviert (Vorsicht bei Galactose für Induktion des GAL-Promotors, niemals autoklavieren!)

und später dazugegeben: Endkonzentration 2%. Für die Herstellung von Agarplatten werden die

Medien wie beschrieben hergestellt und zusätzlich 3% Agar (und ein Rührkern!) vor dem

Autoklavieren zugefügt. Antibiotika und Aminosäurelösungen (Ausnahmen: Adenin, Uracil und

Tyrosin können in YNB autoklaviert werden) werden als Stammlösungen nach dem

Autoklavieren zugegeben.

YP: 2% Pepton, 1% Hefeextrakt (also 20g Pepton, 10g Hefeextrakt /1L) – Vorsicht Staub!!.

YNB: 4,6g/L YNB (Yeast nitrogen base) wo Aminosäuren, ggf. jew, 40mg/L Ade, Ura, Tyrosin

einwiegen, lösen und autoklav. Aminosäuren und Glucose werden als Stammlösungen nach dem

Autoklavieren zugegeben. ACHTUNG: genau überlegen, was weggelassen wird (Ade, Ura)

100 x Aminosäure Stammlösung: Aminosäure /Base Gramm / Liter

Arginin 3

(Histidin) 2

Isoleucin 2

(Leucin) 8

Lysin 4

Methionin 2

Phenylalanin 6

Threonin 15

(Tryptophan) 4

(Tyrosin) 4

(Uracil) 4

(Adenin) 4

Valin 6.5

Aspartat 10

YNB + Aminosäuren + Glucose SD Medium (synthetic dropout), Selektivmedium!

YP + Glucose YPD, Vollmedium, nicht selektiv!


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Achtung: Beim Einwiegen von YNB mit Aminosäuren immer nur die einfache Konzentration (das

sind 40 mg/L) und nicht die 100-fache !!!!

40 % Glucose-Stammlösung: 200g Glucose direkt in 500 ml Flasche einwiegen und auf 500 ml auff.

Wir brauchen den Aminosäure-Stock – Ade, - Leu, - Trp, -Tyr, – Ura und -His! Die entsprechenden

Aminosäuren werden extra als 100 x Stock (Leu, Trp, His) angesetzt und später zu den jeweiligen

Medien zugesetzt.

Methoden

Hefetransformation (Quick Trafo)

• Trafo-Mix: 800µl 50% PEG (3.300)

100µl 2M Lithiumacetat

100µl 1M Dithiotreitol (wird gestellt)

10µl bakterielle RNA als Carrier (wird gestellt) mischen,

pro Transformation 120-150µl davon verwenden.

• Zu dem Transformationsmix 2µl DNA (1µg/µl) und frisch ausgestrichene Hefezellen von

einer Agarplatte mit Zahnstocher dazugeben und gut mischen (Hefe deutlich sichtbar).

• 20 Minuten bei 30°C , 20 Minuten bei 44°C inkubieren.

• 1ml H2O zusetzen und gut mischen.

• Kurz abzentrifugieren und das Zellpellet in 100µl H2O lösen.

• Auf geeignetem Medium (SD-…) ausplattieren.

Diese Methode wird üblicherweise verwendet, um Plasmide schnell in bestimmte Hefestämme zu

transformieren. Die Effizienz dieser Methode ist allerdings recht niedrig. Daher muss in Fällen, bei

denen es auf eine hohe Transformationseffizienz ankommt (z.B. Screen oder Gendisruption), eine

andere Methode verwendet werden, bei der die Zellen vorher in einen kompetenten

physiologischen Zustand gebracht werden.

Hefetransformation (high efficiency) für Disruption oder Screens

• am Vorabend 2-3 ml Vorkultur inokulieren (Medium YP-D oder SD-…)

• am nächsten Morgen auf eine OD600 von 0.25 in YPD verdünnen (50 ml pro Trafo)

• Zellen bis zu einer OD600 von 0.8 wachsen lassen (ca. 4 h)

• abzentrifugieren in 50 ml Falcon tube; 3 min, 1.800 rpm


16

• Pellet in YPD mit 100 mM LiAc (ca 25 ml) resuspendieren und 30 min bei 30°C am

Schüttler inkubieren (Falcon).

• Zellen abzentrifugieren; 3min, 1.800 rpm

• Pellet mit Trafo-Mix überschichten:

3.4 ml 50% PEG (3.300)

540 µl 1M LiAc

50 µl bact RNA

10-80 µl DNA, PCR od. library DNA (nach Kontrolle auf Gel!)

50 µl 1M DTT

950 µl H2O (wenn 10 µl DNA verw)

zus. 5 ml

• gründlich resuspendieren (vortex) und 25 min bei 30° am Schüttler inkubieren

• heat shock: 25 min bei 42°

• auf ca 30ml mit YPD auffüllen

• Zellen abzentrifugieren, 3 min, 1.800 rpm

• in 40 ml YPD im Falcon (Greiner) auffüllen, bei 30° 1-4 h schütteln (recovery period)

• Zellen abzentrifugieren, in 08,-1 ml H2O resuspendieren und auf Selektivmedium

ausplattieren (1 x 80 µl; 1x 260 µl)

Achtung: Positive Klone erscheinen nach 2-3 Tagen Inkubation bei 30°!

Präparativer Verdau der STE11::ADE2 Kassette Alternativ zur PCR soll die Disruptionskassette mittels Restriktionsverdau aus einem Plasmid

ausgeschnitten werden. Das richtige Fragment (ca 2.8 kb, untere Bande) wird dann aus dem Gel

eluiert und genauso wie das PCR-Fragment transformiert (high efficiency Methode).

Restriktions-Ansatz:

• 22 µl H2O

• 12 µl Plasmid (#456)

• 4 µl Puffer B (Boehringer)

• 1 µl BamH I

• 1 µl Xho I

zus 40 µl

Verdau über Nacht bei Raumtemperatur, Gelelution mittels Kit unter Anleitung der Tutoren.

Agarosegelelektrophorese DNA-Fragmente werden entsprechend ihrer Größe auf Agarosegelen mit einer Konzentration

zwischen 0.8 und 1.5 % aufgetrennt. Zum Lösen der Agarose wird 1 x TAE Puffer verwendet. Um

die DNA-Fragmente unter UV-Licht sichtbar zu machen werden 5µl einer Ethidiumbromid-


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Stammlösung/100ml Agarosegel zugefügt. Laufbedingungen: 120V, 80mA. Marker: λ BstE II

Verdau (0.1µg/µl; 5µl), 100bp Leiter (0.1µg/µl; 5µl) (NEB).

λ BstE II 100 bp Leiter

Gelelution von Fragmenten Die gewünschten Fragmente nach dem Restriktionsverdau (Bande bei ca. 2.7 kb) werden auf

einem UV-Tisch mit Skalpell herausgeschnitten und in ein Eppendorfgefäß gegeben. Dann wird

die Agarose in einem chaotropen Puffer aufgeschmolzen und die DNA an eine Silikamatrix

gebunden, gewaschen und mit einem Puffer mit niedriger Ionenstärke eluiert.

Arbeitsvorschrift (Batchprozedur):

• Gelstück + 400µl Puffer I

• Bei 60°C aufschmelzen

• + 8 µl Silica-Resin

• 5 min binden lassen (bei RT)

• abzentrifug., 1 x waschen mit Puffer I

• 1 x waschen mit 400 µl Puffer 2 (EtOH?)

• kurz trocknen, dann eluieren in 20-50µl TE (nicht TAE!)


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PCR (Polymerase Chain Reaction)

Die Disruptions-Kassette für das STE11 Gen (STE11::ADE2) wird mittels PCR von genomischer

DNA eines Hefestammes, in dem diese Disruption bereits bestätigt wurde, bzw. von einem

Plasmid amplifiziert. Falls es einen solchen Stamm noch nicht gibt (was der Normalfall ist), wird

eine entsprechende Kassette mit Primern amplifiziert, die an ihren Enden 60-70 bp haben, die

komplementär zu den flankierenden Regionen des entsprechenden Gens sind.

• Die PCR-Reaktion wird mit Taq -Polymerase durchgeführt.

2 µl genom. DNA oder Plasmid DNA (100 ng) PCR-Bedingungen:

1 µl Primer I (10pm/µl) 35 Zyklen

1 µl Primer II (10pm/µl) 0.45“ 95°C

10 µl 5 x Puffer 1 Minute 53°C

1 µl dNTP Mix (je 25mM) 4 Minuten 72°C

0,2 µl Polymerase

X µl H2O

_________________________________

50 µl, Ansatz mit Mineralöl überschichten.

• 5µl PCR-Ansatz werden nach der Reaktion auf einem Agarosegel geeigneter Konzentration

auf ein Produkt überprüft.

• Der restliche Ansatz wird zur Fällung des Produkts mit 10µl 1M Ammoniumacetat versetzt

und mit 2.7 Volumen 100% Ethanol gefällt (30 Minuten, -20°C; 30 Minuten, 14000rpm, 4°C)

• Das Pellet wird mit 70% Ethanol gewaschen und getrocknet und je nach Produktmenge in

40 – 80µl 0.5 x TE gelöst und dann so zur Transformation verwendet.

Kontroll-PCRs von genomischer DNA der Disruptionsstämme:

Für die PCR werden 100 ng DNA (ges. Menge pro Reaktion!) verwendet

DNA-Messung: Verd. 1:200 in dest H2O (2.5 µl/500µl Q-Küvette!)

A260 und A280 messen, A260=1.0 entspricht 50µg/ml

Primerkombinationen für PCR:

1) Ste11 k.o. + Ade2-2 2) ste11∆2 + Ade2-2


19

Verdünnungsreihen von Hefekulturen

• 2ml Übernachtkultur in geeignetem Selektivmedium animpfen – Kontrollen ! Achtung:

Kulturen sollten leichte, aber deutlich sichtbare Trübung haben! Nicht zu viel !!

• Kulturen in 2ml Medium auf OD600 0.25 verdünnen und bis zu einer OD600 von 1.0 wachsen

lassen.

• Kulturen in Medium auf OD600 0.1 verdünnen. Von dieser Verdünnung wird eine 1:10

Verdünnung gemacht, davon eine weitere 1:10 Verdünnung.

• Von jeder der 3 Verdünnungen werden je 5µl auf eine Agarplatte getropft und bei 30°C

inkubiert.

• Achtung: Ergebnis nach 2-3 Tagen!

Isolation von genomischer DNA aus Hefe chrom. DNA Lysis-Puffer: 50 mM Tris-HCl, pH 7.5; 20 mM EDTA; 1% SDS

• Hefekolonie in ca. 4ml YP-D inokulieren und 10h (ü.N.) bei 30° unter Schütteln inkubieren

• 3ml (2 x 1.5 ml) davon in 1.5ml Eppendorf Gefäss und Zellen pelletieren (30s)

• Zellen 1 x mit Wasser waschen, dann in 500 µl chrom. DNA Lysis-Puffer resuspendieren

und 200 µl glass-beads zugeben

• 10min vortexen bei 4° und anschließend 10min zentrifugieren (14.000 rpm; 4°)

• Überstand sauber in neues Eppendorfgefäß überführen

• evtl. nochmals zentrifugieren, anschließend 10 min auf 70°C (Loch in Eppi wg. Druck!)

• + 200 µl 5M KOAc und 150 µl 5M NaCl

• kurz vortexen und 20 min auf Eis inkubieren

• 15 min zentrifugieren (4°. 14.000 rpm)

• 750µl Überstand vorsichtig und sauber abheben und + 250µl PEG 6000 (30%)

• 20 min auf Eis, dann zentrifugieren (15 min, 4°, 14.000 rpm)

• Überstand verwerfen und Pellet in noch 1 x mit 70% EtOH (-20°C!) waschen (400 µl)

• gewaschenes Pellet 50 µl 1 x TE Puffer lösen


20

Protein-Extrakte aus Hefe Enzym-Lysis Puffer: 25 mM Tris-HCl pH 7.5, 20 mM NaCl, 8 mM MgCl2,

5 mM DTT, 0.1% NP-40

• Pro Hefekolonie werden 3ml Übernachtkultur in SD-Medium inokuliert

• 2ml Zellen werden abzentrifugiert (2ml Eppendorf-Gefäß) eindeutig Beschriften !

• Zellen in 200µl Enzym-Lysis Puffer resuspendieren

• sofort in fl. Stickstoff einfrieren (Prozedur kann hier gut unterbrochen werden)

• während des Auftauens 200µl glass-beads zusetzen

• bei 4° 20 min vortexen

• Zelldebris abzentrifugieren (10 min; 14.000 rpm; bei 4°)

• Überstand in neues Eppendorfgefäß überführen Protein-Extrakt !! auf EIS !!

Protein-Bestimmung Eine schnelle Abschätzung des Proteingehaltes der Proben erhält man, indem man die Absorption

des Extraktes (evtl. 1:100 Verdünnung in Wasser) bei 260 und 280 nm bestimmt (Methode nach

Warburg und Christian). Der Proteingehalt ergibt sich dann aus folgender empirischer Formel:

mg/ml Protein = 1.56 x E 280 – 0.76 x E 260 (Verdünnung berücksichtigen!)

Für genauere Bestimmungen wird hier die Methode von Bradford verwendet. Sie beruht auf der

Bildung eines Protein-Farbstoff Komplexes in saurer Lösung

Achtung: Protein-Extrakte vorher verdünnen (1:20)

• Bradford-Reagenz verdünnen:

10ml Bio-Rad Protein Assay (Coomassie Brilliant Blue G-250 in Ethanol/Wasser mit 15%

Phosphorsäure) werden mit 40ml Wasser verdünnt (2 Wochen bei RT haltbar)

• Protein Standards einwiegen: 14mg Rinderserumalbumin (BSA) in 7ml

50mMTris-HCl pH7,5 ⇒ 2 mg/ml und davon folgende Verdünnungen erstellen:

0.4, 0.2, 0.1, 0.05, 0,025 mg/ml

• Messung:

950 µl Reagenz + 50 µl Probe (2-80 µg Protein) gut mischen,

zwei Leerwerte mit 50 µl Puffer nicht vergessen!

nach 15-60 min Inkubation bei Raumtemperatur Extinktion bei 595 nm messen,

mit Hilfe der Standards die Proteinkonzentration ermitteln


21

β-Galaktosidase-Assay

Die Enzymaktivität der β-Galaktosidase wird in photometrischen Assays mit Ortho-nitrophenyl-

β-D Galactopyranoside(ONPG) als artifiziellem Substrat bestimmt. ONPG ist farblos, das

Reaktionsprodukt ortho-Nitrophenol (ONP), dagegen gelb (λmax = 420 nm). Gemessen wird in

einer Endpunktbestimmung bei 420nm in Plastikkuvetten.

• Reaktionsansatz:

650 µl Z-Puffer (!!! noch mit 0.25% β-Mercapto-EtOH ergänzen GIFTG!)

100 µl ONPG-Lösung (4 mg/ml in H2O, wird gestellt, Vorsicht GIFTIG!)

• Die Reaktion wird mit 50 µl Protein-Extrakt (unverdünnt!) gestartet (Zeit notieren!)

2 Blindwerte mit Z-Puffer nicht vergessen !

• Bei sichtbarer Gelbfärbung Reaktion mit 400 µl 1M Na2CO3 Lösung stoppen (<10min!)

• Extinktion bei 420nm gegen Blindwerte messen, bei Werten über 0.9 besser verdünnt

(mit Z-Puffer) messen

Dies ermöglicht eine quantitative Aussage über die Enzymaktivität und somit auch über die

gebildete Enzymmenge. Mit Hilfe der gemessenen Proteinkonzentration wird anschließend die

spezifische Aktivität (U pro mg Protein) berechnet:

E420 x 24 x 1000 Aktivität : _________________________________________________ = U β-Galaktosidase / mg Protein 45 x Minuten x Protein (mg/ml)


22

β-Galaktosidase Filter-lift Assay

Alternativ kann die Enzymaktivität der β-Galaktosidase auch durch eine X-Gal Färbung der Hefe

Kolonien sichtbar gemacht werden. Dafür müssen die Hefezellen zunächst auf einen Membran

(z.B. Nitrozellulose) übertragen werden. Dies kann entweder passieren, indem die Membran

direkt auf die (feuchte) Platte gelegt und (nachdem die Position markiert wurde) wieder

abgezogen wird (daher der Name Filter-lift) und die Zellen so an der membran kleben bleiben;

oder, indem eine Hefesuspension dierkt auf die Membran gespottet wird.

So wir es nun im Praktikum gemacht:

• Hefe von Platte in 30 µl ster. H2O resuspendieren (mögl. Konzentriert)

• Membran auf Whatman Paper legen und Hefe langsam spotten

• Es sollen möglichst kleine Spots entstehen!

• Membran trocknen, dann in fl. N2 (Schtuzbrille!) schockgefrieren

• In Petrischale auf Filter legen, der mit 1 ml Substrat-Lösung getränkt ist

• Inkubieren (dunkel) bis Blaufärbung erkennbar (5-30 min)

• Ergebnis dokumentieren

Vorbereitung der X-Gal Substratlösung :

10 ml Z-Puffer (+ 100 µl 1 M DTT)

150 µl X-Gal (20 mg/ml in DMF)

Auftrags-Schema zum spotten der Hefezellen:

Nicht vergessen, zu notieren, welcher Stamm wo gespottet ist!

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ....


23

1. Disruption des STE11 Gens

Zunächst wird eine Kassette für die gezielte Disruption des STE11 Gens in S.

cerevisiae mittels PCR Reaktion amplifiziert bzw. aus einem Plasmid

ausgeschnitten (S 16). Der Erfolg dieses Schrittes wird danach mit einer Agarose

Gelelektrophorese überprüft (S 16). Das PCR-Produkt wird nach Ethanolfällung

direkt in Hefe transformiert, wo es an der entsprechenden Stelle im Genom durch

homologe Rekombination integriert wird. Da dies in der Praxis natürlich nur mit

einer geringen Wahrscheinlichkeit erfolgt, muss die Transformation sehr effizient

sein (Methode 2 auf S 15). Außerdem erfordert dies natürlich einige Zellteilungen.

Erst danach (recovery period) kann man mit der Selektion auf den

entsprechenden Medien beginnen.

Von verschiedenen positiven Klonen wird dann genomische DNA präpariert

(Methode siehe S 19), um die korrekte Insertion der Disruptions-Kassette mittels

PCR mit spezifischen Primern am richtigen Locus nachzuweisen. Durch den

Vergleich mit DNA des parentalen Wildtyp-Stammes kann so die erfolgreiche

Disruption bestätigt werden.

Die PCR wird dabei mit Primern durchgeführt, die upstream vom Start Codon

(STE11∆-1) und downstream vom Stop Codon (STE11∆-2) binden. Somit muss

man in jedem Fall ein PCR-Produkt erhalten !

Das setzt allerdings voraus, dass sich die Größe des Gens und der Kassette

deutlich unterscheiden. Der Unterschied ergibt sich dann aus der Größe In

unserem Fall ist die Disuptionskasette jedoch so konstruiert, daß die PCR-

Produkte des Wildtypstammes und des Knock-out-Stammes die gleiche Größe

haben. Daher verwenden wir einen Primer, der innerhalb der Disruptions-

Kassette bindet (Ade2-2) und kombinieren diesen mit einem der downstream,

außerhalb der Kassette bindet (Ste11-KO). In diesem Fall sollte man nur bei

Insertionen am richtigen genomischen Locus ein PCR Produkt bekommen. Der

Ste11-KO-Primer bindet ca. 500bp downstream vom Stop-Codon des STE11-Gens.


24

Größe der Disruptionskasette: 2.780bp

Mit internen ADE2 Oligos: STE11-KO + ADE 2-2: 1000bp;

STE11∆-2 + ADE 2-2: 780bp;

2. Two-Hybrid Assays

Alle Konstrukte für Two-Hybrid Experimente und Komplementationen

werden zur Verfügung gestellt!

In diesen Experimenten sollen die Interaktionen zwischen verschiedenen

Komponenten einer Arabidopsis thaliana MAP-Kinase Kaskade untersucht werden.

Als Beispiel dient hier die stressaktivierte MAP-Kinase MPK6 und die

aktivierende MAPKK MKK2. Da einige Konstrukte jedoch bereits in der Fusion

mit dem entsprechenden Teil des Transkriptionsfaktors (vor allem mit der DNA

binding domain) eine Aktivierung der Transkription der Reportergene bewirken

können, ist es essentiell, die entsprechenden Kontrollen (jew. Konstrukt + leerer

Vector) mitlaufen zu lassen!


25

Das man das Two-Hybrid System auch gut verwenden kann, um Interaktions-

Domänen in verschieden Proteinen zu bestimmen, soll anhand von einigen

Proteinvarianten gezeigt werden, die Punktmutationen innerhalb dieser

„docking“-Domänen haben. Das sind bei den MAP-Kinasen Aspartat- bzw.

Glutamat-Reste im C-Terminus (D/N-, bzw. E/Q-Mutationen), und bei der

MAPKK sind es Lysin-Reste im N-Terminus (K/A-Mutante).

Die Interaktionen folgender Komponenten soll nun getestet werden:

• MPK6-wt (#270) + MKK2-wt (#215) leerer pGAD #37

• MPK6-D/N (#271) + MKK2-wt

• MPK6-E/Q (#337) + MKK2-wt

• MPK6-∆C (#339) + MKK2-wt

• MPK6-wt + MKK2-K/A (#216)

• MPK6-wt + MKK2-∆N (#233)

Dabei liegen die MPK-Konstrukte alle als AD-Fusionen vor (in pGAD 425) und

die MPKK-Konstrukte als BD-Fusionen (in pBTM 117). Der verwendete

Hefestamm ist L-40.

Zunächst müssen also die entsprechenden Konstrukte in den Two-Hybrid Stamm

L-40 co-transformiert werden (Quick Method, S. 15).

Dann werden jeweils zwei positive Kolonien ausgewählt, von denen jeweils 3 ml

Vorkultur (über Nacht) inokuliert werden. Von diesen Zellen wird am nächsten

Tag ein Protein-Extrakt präpariert (S. 20) und die spezifische β-

Galaktosidaseaktivität ermittelt (S. 21). Für eine untersuchte Kombination wird

der Mittelwert aus den drei Messungen berechnet.

Die Auswertung erfolgt durch grafische Darstellung in Form von

Balkendiagrammen.


26

3. Funktionelle Komplementation von Hefemutanten

Wie auf Seite 11 bereits gezeigt, ist ein Hefestamm, in dem das PBS2 Gen

disruptiert ist, osmosensitiv. Die homologe Arabidopsis thaliana MAPKK MKK2

kann diesen Phenotyp komplementieren. Dieses Prinzip kann man nun weiter

ausnutzen, um Komponenten der Hefe MAP-Kinase Kaskade (dem HOG-

pathway) mit homologen Arabidopsis Kinasen zu ersetzen. In diesem Praktikum

sollen zwei verschiedene Anwendungen gezeigt werden (gruppenweise Aufteilung

A oder B!).

In Experiment A werden die Ergebnisse aus den Two-Hybrid Assays mit einem

funktionellen Ansatz überprüft. Dabei wird ein Hefestamm verwendet, in dem

die MAPKK PBS2 und die MAPK HOG1 disruptiert sind. Diese beiden

Komponenten des Hefe Signaltransduktionsweges werden durch funktionell

homologe Arabidopsis Kinasen ersetzt, die in Hefe-Expressionsvektoren kloniert

sind. Die Gene werden dabei unter der Kontrolle von (starken) konstitutiven

Promotoren (ADH in pRS und PGK in pFL) exprimiert.

Wie bereits bei den Two-Hybrid Experimenten, ist auch hier zu beachten, dass

entsprechende Kontrollen (z.B. nur eine Komponente) durchgeführt werden.

Achtung: Wie werden die einzelnen Komponenten in die Zellen gebracht -wie

wird selektiert, was muss man also mit den Wildtyp-Stämmen für die Kontrolle

machen ?

Getestet werden nun folgende Kombinationen im pbs2∆ hog1∆ Stamm:

• MPK6-wt (#181) + MKK2-wt (#211)

• MPK6-wt + MKK2-K/A (#212)

• MPK6-wt + MKK2-∆N (#236)

Dabei sind die MPKs in pFL61 (Ura) und die MPKKs in pRS315 (Leu) kloniert.


27

Obige Kombinationen werden also transformiert (Kontrollen beachten!) und

positiven Kolonien werden in eine Verdünnungsreihe (S 19) auf Osmosensitivität

(SD-Leu-Ura + 0.3 M NaCl) getestet. Ladekontrolle SD-L-U nicht vergessen

In Experiment B wird die Aktivierung der Arabidopsis MAPKK MKK2 in Hefe

untersucht. Dafür werden Stämme verwendet, in denen die endogenen

MAPKKKs des HOG-Pathways (welche waren das doch gleich?) und die MAPKK

PBS2 disruptiert sind. In diese Stämme wird dann die Arabidopsis MAPKK MKK2

transformiert und positive Klone werden wie in Experiment A in einer

Verdünnungsreihe auf Osmosensitivität getestet.

Durchzuführende Hefetransformationen:

• MKK2-pRS316 (#237) mit ADH prom. in pbs2∆

• MKK2 in ste11, pbs2∆

• MKK2 in ssk2, ssk22, pbs2∆

• entsprechende Kontrollen !


28

Diskussionspunkte

Im Rahmen dieses Praktikums wurden einige grundlegenden Techniken und

Methoden vorgestellt, die zeigen, wie man Hefe einerseits als Tool – z.B. zur

Isolation von Genen oder Bestimmung von Protein-Interaktionen einsetzen kann.

Andererseits sollte auch klar werden, wie man mit Hilfe von Modelorganismen

grundlegende Fragen in der Biologie untersuchen kann, wie beispielsweise die

Prinzipien der Signaltransduktion in eukaryotischen Zellen.

Abschließend hier noch einige Punkte, die diskutiert werden sollen:

• Warum verwendet man Hefe als Modellorganismus, warum nicht

z.B. E. coli ?

• Vergleich: funktionelle Komplementation zur two-Hybrid Methode

• was sind die Grundvoraussetzungen?

• was sind limitierende Faktoren?

• welche Methode entspricht eher der realen Situation in der Zelle?

• welche Aussage kann man über die untersuchten A. thaliana

Proteine machen?

• was kann man aber über den Signaltransduktionsweg nicht

aussagen ?

• Wie könnte die weitere Untersuchung der isolierten Komponenten

aussehen ?

Weitere gute Informations-Quellen zur Arbeit mit Hefe:

Fred Sherman: An introduction to the Genetics and Molecular Biology

of the Yeast Saccharomyces cerevisiae. Zu finden unter:

www.urmc.rochester.edu/smd/biochem/yeast

Sowie Informationen über Hefegene in der Comprehensive Yeast Genome

Database (CYGD), unter:

http://mips.gsf.de/proj/yeast/CYGD/db/index.html

http://www.urmc.rochester.edu/smd/biochem/yeast

http://mips.gsf.de/proj/yeast/CYGD/db/index.html


29

Literatur Zu den Experimenten im Praktikum: Teige, M., Scheikl, E., Eulgem, T., Doczi, R., Ichimura, K., Shinozaki, K., Dangl,

J.L., and Hirt, H. (2004). The MKK2 pathway mediates cold and salt stress

signaling in Arabidopsis. Mol Cell. 2, 141-52.

weitere Literatur:

Fields, S.; Sternglanz, R. (1994). The two-hybrid system: an assay for protein-

protein interactions. TIG 10, 286-292.

Hohmann, S. (1997). Shaping up: The Responses of Yeast to Osmotic Stress. In:

Hohmann, S. and Mager, W. H. (Editors), Yeast Stress Responses. Springer. Seiten

101 bis145.

Minet, M.; Dufour, M.-E.; Lacroute, F. (1992). Complementation of Saccharomyces

cerevisiae auxotrophic mutants by Arabidopsis thaliana cDNAs. The Plant Journal 2,

417- 422.

Mizoguchi, T.; Irie, K.; Hirayama, T.; Hayashida, N; Yamaguchi-Shinozaki, K;

Matsumoto, K.; Shinozaki, K. (1996). A gene encoding a mitogen activated

protein kinase-kinase-kinase is induced simultaneaously with genes for a mitogen

activated protein kinase by touch, cold, and water stress in Arabidopsis thaliana.

Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 765-769.

Sherman, F. (1998). An Introduction to the Genetics and Molecular Biology of

theYeast Saccharomyces cerevisiae . Modified from: Meyers, R. A. (Herausgeber).

(1997), The Encyclopedia of Molecular Biology and Molecular Medicine. VCH

Pub. Seiten 302 bis 325.

Wurgler - Murphy, S. M.; Saito, H. (1997). Two component signal transducers

and MAPK cascades. TIBS 22, 172 - 177.

Molekulare Biologie IIA - univie.ac.at · 2O steril filtrieren, nicht autoklavieren!! Wird mit...

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