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Universität Hohenheim

Institut für Physiologie und Biotechnologie der Pflanzen

Prof. Dr. Andreas Schaller

Molekulare Charakterisierung von IDE-defizienten Tomatenpflanzen

Ihre Reaktion auf Verwundung und ihre Interaktion m it

Manduca sexta

Diplomarbeit

vorgelegt von

Silke Karojet

betreut von Dr. Yoann Huet

Hohenheim, Mai 2006

für Yannic

Inhaltsverzeichnis

I

Inhaltsverzeichnis

Zusammenfassung IV

1. Einleitung

1.1 Verteidigung im Pflanzenbereich 1

1.2 Der Oktadekanoidweg und Systemin in Tomatenpflanzen 3

1.3 Das Insulin-degradierende Enzym (IDE) 8

1.4 Die Hypothese 11

1.5 Manduca sexta 12

2. Materialien und Methoden

2.1 Materialien 14

2.1.1 Chemikalien und Lösungen 14

2.1.2 Kits 20

2.1.3 Enzyme und Antikörper 20

2.1.4 Nucleotide und Nucleinsäuren 21

2.1.5 Organismen 21

2.1.5.1 Pflanzliches Material 21

2.1.5.2 Insekten 23

2.1.6 Sonstiges 24

2.2 Methoden 24

2.2.1 Western-Analyse 24

2.2.1.1 Proteinextraktion und SDS-Polyacrylamidgel-

elektrophorese (SDS-PAGE) 24

2.2.1.2 Proteintransfer auf eine Nitrocellulose-Membran 25

2.2.1.3 Immunodedektion mit Hilfe des IDE-Antiserums 25

2.2.2 Southern-Analyse 26

2.2.2.1 CTAB-Extraktion 26

2.2.2.2 Restriktionsverdau der genomischen DNA 27

Inhaltsverzeichnis

II

2.2.2.3 Auftrennung der DNA-Fragmente und Transfer

auf eine Nitrocellulose-Membran 27

2.2.3 Northern Blot Analyse 28

2.2.3.1 RNA-Extraktion 28

2.2.3.2 Auftrennung der RNA und Transfer auf eine

Nitrocellulose-Membran 28

2.2.4 Sonderherstellung und Hybridisierung 29

2.2.5 Strippen von Blots 30

2.2.5 Reverse Transkription 30

2.2.7 PCR (Polymerase Chain Reaction) 30

2.2.8 Verwundung der Tomatenpflanzen 31

2.2.9 Manduca sexta-Zucht 31

2.2.10 Experimente mit Manduca sexta 32

3. Ergebnisse 36

3.1 Identifizierung unabhängiger Linien 36

3.1.1 Identifizireung der IDE-defizienten Linien mittels Western-

Analyse 36

3.1.2 Analyse der IDE-defizienten Linien mittels Southern-

Analyse 38

3.2 Untersuchung der Abwehrreaktion 44

3.2.1 Induktion des Proteinaseinhibtors II nach mechanischer

Verwundung 44

3.2.2 Induktion des Proteinaseinhibtors II nach Frass von

Manduca sexta 46

3.3 Einfluss des DIE-Silencing auf die Entwicklung von

Manduca sexta 47

3.4 Einfluss des DIE-Silencing auf das Ovipositions-Verhalten

von Manduca sexta 49

3.5 Untersuchung der Expression von HPL und AOS 51

4. Diskussion 54

5. Literatur 61

Inhaltsverzeichnis

III

Abkürzungen 71

Eidesstattliche Erklärung 73

Dank 74

IV

Zusammenfassung

Das Insulin-degradierende Enzym (IDE) aus Tieren ist einer Metallo-Endopeptidase,

die in vitro mehrere nicht-miteinender verwandte Peptide spaltet, und in vivo an der

Proteolyse von Insulin beteiligt ist. Obwohl das Hormon Insulin nicht in Pflanzen vor-

kommt, besitzen Pflanzen homologe Sequenzen des IDE-Gens. Aufgrund ihres kon-

servierten H-x-x-E-H-Motives der katalytischen Domäne gehört IDE zur Familie der

Inverzinkin-Metalloproteasen, deren charakteristische Domäne das inverse Motiv

anderer Zink-abhäniger Metalloproteasen darstellt. In vorausgegangene Arbeiten

konnte IDE als Systemin-abbauende Protease identifiziert werden. In Tomaten

aktiviert Systemin, ein aus 18 Aminosäureresten bestehendes Peptid, den Okta-

dekanoidweg und führt so zur Induktion von Genen die an der Abwehr von herbivoren

Insekten beteiligt sind.

Im Rahmen dieser Arbeit wurde aus bereits transformierten Tomatenpflanzen der T1-

Generation, in denen die Expression von LeIDE mittels der RNAi-Technik unterdrückt

worden war, 2 unabhängig-transformierte Linien mit Hilfe der Southern- und Western-

Analyse bestimmt. Um zu untersuchen, ob IDE auch Systemin in planta spaltet,

wurden verschiedene Verwundungs- und Insekten-Versuche durchgeführt. Als

molekularer Marker der Verwundungs- und Abwehrreaktion gegen herbivore Insekten

wurde der Proteinaseinhibitor II benutzt, und dessen Induktionskinetik auf trans-

lationaler Ebene betrachtet. Weder mechanische Verwundung, noch Fraß von

Manduca sexta, führt zu einer Veränderung der Kinetik der PI-II-Induktion in IDE-

defizienten Pflanzen. Dies deutet darauf hin, dass IDE keinen Einfluss auf die Abwehr-

reaktion von Tomatenpflanzen hat, und dass IDE wahrscheinlich auch nicht Systemin

in planta degradiert.

Die Bioessays mit Manduca sexta, liefern aufgrund der zögerten Verpuppung und des

veränderten Ovipositions-Verhaltens der Insekten, die als Larven auf IDE-defizienten

Pflanzen aufgezogen wurden, einen Hinweis darauf, dass die Unterdrückung der IDE-

Expression zu einer Veränderung im Primär- oder Sekundär-Stoffwechsel führen

könnte.

1 Einleitung

1

1 Einleitung

1.1 Verteidigung im Pflanzenreich

Im Laufe der ebenso langen wie faszinierenden Geschichte der Evolution, ausgehend

von der Zusammenlagerung von Atomen zu Molekülen, über einfachste Ur-Zellen bis

hin zu hoch kompliziert organisierten Organismen, haben fast alle höheren Pflanzen

eine sessile Lebensweise entwickelt. Die Anpassung an die Lebensräume an Land

führte bei den Pflanzen zum Verlust der Mobilität, was zur Folge hat, dass Pflanzen,

bei sich verschlechternden abiotischen oder biotischen Umweltbedingungen, sich nicht

durch Flucht entziehen können.

Um sich bei einem Befall durch Pathogene oder Herbivore zu schützen, haben Pflan-

zen deshalb eine Vielzahl von Verteidigungsstrategien entwickelt. Zum Schutz vor

pflanzenfressenden Insekten oder anderen Tieren wurden neben strukturellen Ab-

wehrmechanismen, wie zum Beispiel Trichomen oder Dornen, die unter anderem die

Fortbewegung der Insekten auf den Pflanzen beeinträchtigen oder andere Tiere vom

Fraß abschrecken, auch biochemische Abwehrmechanismen entwickelt. Die Produk-

tion von Toxinen und Stoffen, die die Nahrungsaufnahme oder Entwicklung beein-

trächtigen gehören zu den biochemischen Resistenzfaktoren gegen Herbivore.

Diese Faktoren sind besonders gut untersucht bei den Solanaceen, einer Pflanzen-

Familie, zu der auch landwirtschaftlich und pharmazeutisch wichtige Arten wie Kar-

toffel (Solanum tuberosum), Tomate (Lycopersicon esculentum), Tabak (Nicotiana

tabacum) oder Bilsenkraut (Hyoscyamus niger) und Tollkirsche (Atropa bella-donna)

gehören. Die toxisch wirkenden Alkaloide, die in diesen Pflanzen synthetisiert werden,

dienen der Abwehr von Fressfeinden. So ist zum Beispiel das Nikotin der Tabakpflan-

zen stark toxisch für herbivore Insekten, und eines der ältesten und effektivsten Pflan-

zenschutzmittel, gegen das sich bis heute kaum Resistenzen bei den Insekten ausge-

bildet haben.

Neben toxischen Sekundärmetaboliten, spielt aber auch eine Gruppe von Proteinen

eine wichtige Rolle bei der Abwehr von herbivoren Insekten, die nach Insektenbefall

oder auch allein nach mechanischer Verwundung gebildet werden (Bergey und

andere, 1996). Dazu gehören unter anderem auch Proteinaseinhibitoren, die in den

Blättern der Pflanzen akkumuliert werden (Green und Ryan, 1972), und im Verdauung-

1 Einleitung

2

strakt der Insekten die Umsetzung der in der Nahrung enthaltenen Proteine behindern.

So blockiert zum Beispiel der Proteinaseinhibitor II die Enzyme Trypsin und Chymo-

trypsin (Plunkett und andere, 1982). Daneben ist auch eine Polyphenol-Oxidase von

Bedeutung, durch die Phenole in ihre entsprechende Chinonform überführt werden

(Felton und andere, 1989). Chinone, als stark elektrophile Moleküle, können kovalent

an Proteine binden, wodurch komplexe Aggregate aus Proteinen entstehen, die

schwer verdaulich sind.

All dies führt zu einer Verringerung der Nährstoffaufnahme, und so zu einem verzö-

gertem Wachstum der Insekten (Duffey, 1996; Karban und andere 1997). Allgemein ist

für das Wachstum von Tieren vor allem der Energie- und dem Proteingehalt der Nahr-

ung von Bedeutung. Während sich der Energiegehalt von pflanzlicher und tierischer

Biomasse kaum unterscheidet, weisen Pflanzen deutlich geringere Gehalte an Stick-

stoff auf (Mattson, 1980). Deshalb ist für das Wachstum der herbivoren Insekten vor

allem der Stickstoffgehalt ihrer Nahrung und dessen Verwertbarkeit entscheidend. Die

Verteidigungsstrategie der Pflanzen, den Verdau der Proteine zu behindern wirkt sich

also direkt auf die Wachstumsrate der Insekten aus.

Für die Pflanzen bedeutet das verzögerte Wachstum der Insekten, dass in der selben

Zeiteinheit weniger Blattfläche verloren geht, und so der Pflanze mehr Zeit und photo-

synthetische Energie für die Bildung von reproduktiven Organen zur Verfügung steht

(Zavala und Baldwin, 2004). Darüberhinaus könnte die Wachstumsverzögerung bei In-

sekten, die während einer Vegetationsperiode mehrere Lebenszyklen durchlaufen,

eventuell zu einer verringerten Zyklenzahl führen. Durch die Wachstumsverzögerung

der Insekten verlängert sich auch die Zeit, die diese auf den Pflanzen verweilen müs-

sen bis zum erreichen des nächsten Entwicklungsstadiums, was zur Folge hat, dass

die Insekten selbst auch in verstärktem Maße Fressfeinden ausgesetzt sind (Hägg-

ström und Larsson, 1995; Benrey und Denno; 1997). Beides könnte sich vorteilhaft für

die Pflanze auswirken.

Neben diesen pflanzlichen Resistenzfaktoren, die sich direkt auf Herbivore auswirken,

kennt man auch noch Verteidigungsmechanismen, die indirekt wirken. Durch che-

mische Signale, die von den Pflanzen in Form von flüchtigen organischen Verbin-

dungen (volatile organic compounds, VOCs) produziert, und an die Umwelt abgege-

ben werden, können Pflanzen andere Organismen beeinflussen. So werden zum Bei-

spiel von Maispflanzen nach Befall durch die Larven von Spodoptera exigua (Zucker-

1 Einleitung

3

rübeneule) diese flüchtigen Verbindungen in einer bestimmten Zusammensetzung

freigesetzt, was dazu führt, das Weibchen der parasitoiden Schlupfwespe Cotesia

marginiventris angelockt werden (Turlings, 1990). Durch die in die Insekten-Larven ab-

gelegten Eier der Schlupfwespe, und die Entwicklung von Cotesia in der Larve kommt

es zu einer starken Schädigung des Herbivors, die letztendlich zu Tod des Wirts-In-

sekts führt. Ein solcher Mechanismus ist in der Zwischenzeit für viele verschiedene

Pflanzenarten beschrieben (Dicke, 1999).

Terpenoide, aromatische Verbindungen und Derivate von Fettsäuren zählen zu den

flüchtigen organischen Verbindungen, die aufgrund ihres hohen Partialdrucks, aus be-

schädigten oder intaktem Pflanzengewebe freigesetzt werden können (Review:

Arimura und andere, 2005). Jede Pflanzenart bildet daraus ein für sie charakteristi-

sches Duftprofil, dass bedingt durch verschiedene biotische oder abiotische Faktoren

verändert sein kann. So können Insekten, auf der Suche nach einer passenden Wirts-

pflanze anhand des spezifischen Profils der abgegebenen Duftstoffe die Identität und

Qualität der Wirtspflanzen für ihre Ernährung und Eiablage (De Moraes und andere,

2001; Eigenbrode und andere, 2002) erkennen, oder ob bereits herbivore Konkur-

renten auf den Pflanzen anwesend sind (Schoonhoven, 1990).

VOCs spielen aber nicht nur eine Rolle in der Interaktion zwischen Pflanze und

Parasitoiden oder herbivoren Insekten, sondern es gibt in letzter Zeit auch vermehrt

Hinweise darauf, dass Pflanzen untereinander mit Hilfe dieser Stoffe kommunizieren

können. So haben die von Wüstensalbei nach Verwundung abgegebenen VOCs auf

benachbarte Tabakpflanzen den Effekt, dass bei Insektenbefall hier eine verstärkte

bzw. beschleunigte Produktion von Abwehrsubstanzen (z.B. von Proteinaseinhibi-

toren) einsetzt (Kessler und andere, 2006).

1.2 Der Oktadekanoidweg und Systemin in Tomatenpfla nzen

Die Expression von Genen, wie PI-II und PPO die an der Reaktion auf Insektenfraß

und Verwundung beteiligt sind, wird in Tomatenpflanzen, wie auch in vielen anderen

Arten, über Jasmonate reguliert (Farmer und andere, 1992; Review: Reymond und

Farmer, 1998; Howe 2005). Jasmonate stellen eine eigene Klasse von Phytohor-

monen dar, die durch eine pentacyclische Ringstruktur gekennzeichtnet sind. Die

namengebende Sturktur ist - (-) Jas-monsäure (JA, jasmonic acid) (s. Abb. 1-1). Zu

1 Einleitung

4

den Jasmonaten zählen auch methylierte, glucosylierte oder hydroxylierte Derivate der

Jasmonsäure wie z.B. Methyljasmonat, oder biosynthetische Vorstufen wie 12-OPDA

(12-oxo-Phytodien-säure) (Review: Schaller und andere, 2005). Neben der Beteiligung

an der Ausbildung von Abwehrmechanismen gegen Herbivore, und der Resistenz

gegen Pathogene (Thaler und Bostock, 2004) regulieren Jasmonate in Tomatenpflan-

zen auch Prozesse wie die Entwicklung von glandulären Trichomen auf der Frucht-

oberfläche, die Fertilität des weiblichen Gametophyten und die Samenreifung (Li und

andere 2004), ebenso wie die Fruchtreifung (Fan und andere,1998).

Die Biosynthese der Jasmonsäure selbst erfolgt über den Oktadekanoidweg der erst-

mals 1984 von Vick und Zimmermann beschrieben wurde. Die Forschungsergebnisse

der letzten Jahre wurden von Schaller und anderen (2005) zusammengefasst. Dem-

nach ist der Syntheseweg (Abb.1-2) ist in zwei Abschnitte unterteilt, die in verschie-

denen Zellkompartimenten stattfinden. Zunächst wird im Chloroplast Linolensäure

(18:3) durch das Enzym Lipoxigenase (LOX) zu 13-(S)-hydroperoxy-Linolensäure (13-

HPOT) oxidiert. Linolensäure als Ausgangssubstrat wird hierfür durch eine Lipase aus

der Chloroplastenmembran freigesetzt. Durch zwei nachfolgende Reaktionsschritte

wird 13-HPOT zu 12-oxo-Phytodiensäure (OPDA) zyklisiert. Diese Schritte werden

durch die beiden Enzyme Allenoxid-Synthease (AOS) und Allenoxid-Cyclase (AOC)

katalysiert. OPDA wird dann über einen noch nicht bekannten Mechanismus in das

Peroxisom transportiert. Hier erfolgt eine Reduktion des Ringsystems durch das En-

zym (OPR3) und Cyclopentanon (OPC8:0, 3-oxo-2(2´(Z)-Pentenyl)-Cyclopentan-1-

Oktansäure) entsteht. Anschließend daran folgen 3 Zyklen ß- Oxidation, was zu einer

Verkürzung der Seitenkette und so zu (+)-7-iso-Jasmonsäure führt. Schließlisch iso-

merisiert (+)-7-iso-Jasmonsäure zu (-)-Jasmonsäure, welche die am häufigsten im

Pflanzengewebe vorkommende Form ist. Jasmonsäure gelangt dann aus dem

Peroxisom ins Cytosol, dort können weitere Modifikationen stattfinden.

Abb. 1-1 Struktur der (-)-Jasmonsäure

1 Einleitung

5

Der genaue Mechanismus, der schließlich im Zellkern zur Expression der Gene die an

den Abwehrmechanismen beteiligt sind führt, ist bis jetzt noch nicht aufgeklärt.

Gesichert ist aber, dass hieran in Tomaten JAI1(jasmonic acid insensitiv 1) mit beteiligt

ist. Neben anderen Effekten können jai1-Tomatenpflanzen nach Verwundung keine

Proteinaseinhibitoren akkumulieren. Pfropfungsexperimente, zeigten, dass jai1-Pflan-

zen zwar nach Verwundung das systemische Signal für die Ausbildung der Abwehr-

reaktion produzieren können, dieses von den Pflanzen selbst aber nicht erkannt und

umgesetzt wird (Li und andere, 2002). Die Tatsache, dass bei jai1-Pflanzen die Gen-

Expression der

Abwehrgene

Per

oxis

om

Zel

lker

nn

Chl

orop

last

α-Linolensäure

Allenoxid

cis - (+)-OPDA

13-HPOT

cis - (+)-OPDA

OPC8:0

(+)-7-iso-JA (-)-JA

Abb. 1 -2 Die Jasmonsäure -Bio -

synthese ist in zwei Abschnitte

unterteilt. Im Chloroplasten erfolgt

die Umsetzung von Linolensäure zu

cis - (+)-OPDA, aus der dann im

Peroxisom Jasmonsäure entsteht.

Über welche Mechanismen OPDA in

das Peroxisom gelangt und Jasmon-

säure im Zellkern die Genexpression

reguliert ist noch nicht geklärt.

Abkürzungen der Stoffwechsel-Zwi-

schenprodukte und der beteiligten

Enzyme siehe Text.

3 Zyklen β-Oxidation

α-Linolensäure

1 Einleitung

6

expression der Proteinaseinhibitoren auch durch Methyl-Jasmonsäure nicht induziert

werden kann deutet darauf hin, das die Signalkaskade „downstream“ von JA blockiert

sein muss.

Das JAI1-Protein ist homolog zu COI1 (coronatine insensitive 1) aus Arabidopsis tha-

liana. Beide Proteinen besitzen ein konserviertes N-terminales F-Box-Motiv (Li und

andere, 2004). F-Box-Proteine sind mit an der Bildung von E3-Ubiquitin-Ligase-Kom-

plexen beteiligt, die mit an der Ubiquitinylierung von Proteinen beteiligt sind. Durch

diese Markierung werden Proteine der Proteolyse durch das 26S-Proteasom zuge-

führt. Über diesen Mechanismus könnten auch negative Regulatoren der durch Jas-

monsäure induzierten Gene abgebaut werden (Xu und andere, 2002; Pauw und

Memelink, 2005).

Die Pfropfungsexperimente mit jai1- und spr2-Pflanzen, einer Mutante, mit einem De-

fekt in der Jasmonsäure-Biosynthese ließen darauf zurück schließen, dass Jasmon-

säure oder verwandte Verbindungen das systemische Signal für die Wundantwort ist

(Li und andere, 2002).

Die Ausbildung der Abwehrmechanismen ist für die Pflanze mit hohen Kosten an ele-

mentaren Ressourcen wie Energie, Kohlenstoff und Stickstoff verbunden (Zavala,

Baldwin 2004), deshalb sind viele dieser Abwehrmechanismen, wie die Synthese der

Proteinaseinhibitoren, induziert.

In Tomatenpflanzen wird der Oktadekanoidweg durch Systemin ausgelöst. Systemin

ist ein Oligopeptid, dass aus 18 Aminosäureresten besteht und von Pearce und Ryan

1991 identifiziert werden konnte. Mit Systemin wurde somit das erste Peptid mit hor-

monaler Wirkung in Pflanzen erkannt. Wie Peptidhormone bei Tieren, geht auch

Systemin aus seinem Vorläufermolekül, dem 200 Aminosäureresten großen Pro-

systemin, hervor. Die Transkription der Prosystemin-mRNA ist auf tiefem Niveau kon-

stitutiv und wird durch Verwundung systemisch deutlich erhöht (McGurl et al., 1992).

Der Systemin-Rezeptor SR160 ist in der Plasmamembran lokalisiert und wird aufgrund

seiner Struktur der Familie der LLR-Rezeptor-Kinasen (LLR: leucin rich repeat) zuge-

rechnet (Scheer und Ryan, 1999 und 2002).

Nach dem gängigen Modell wird Systemin nach Verwundung oder Insektenfraß wahr-

scheinlich durch proteolytische Spaltung aus Prosystemin freigesetzt (s. Abb. 1-3), und

durch Bindung an seinen Rezeptor wird eine komplexe Signaltransduktionskette in

Gang gesetzt, die zur Aktivierung des Oktadekanoidweges, und somit auch zur Ex-

1 Einleitung

7

pression der Abwehrproteine, einschließlich des Proteinaseinhibitors II, führt. Re-

zeptorbindung von Systemin an die extrazelluläre LRR-Domäne führt zu einer Akti-

vierung der intrazellulären Kinase des Rezeptors. Daraufhin kommt es zu einer De-

polarisierung der Plasmamembran, durch Einstrom von Protonen und Ausstrom von

K+- und Cl-- Ionen aus die Zelle (Frasson and Schaller, 2001). Zudem ist eine Anstieg

der cytoplasmatischen Ca2+-Konzentration zu beobachten (Bergey und Ryan, 1999;

Moyen und andere, 1998), und die Aktivierung einer MAP-Kinase (mitogen activated

protein kinase) (Stratmann und Rayn, 1997; Holley und andere, 2003). Eines oder

mehrere dieser Ereignisse führt dann schließlich zur Aktivierung einer Phospholipase,

die dann die Freisetzung der Linolensäure, das Ausgangssubstrat für den Oktadeka-

noidweg, aus der Plasmamembran katalysiert.

Systemin

Plasmamembran

Prosystemin

Cytosol

Apoplast

MAPK

K+ Cl+

H+ Ca+

SR 160

Systemin

Plasmamembran

Prosystemin

Cytosol

Apoplast

MAPK

K+ Cl+

H+ Ca+

SR 160

Lipase

Linolensäure

Lipoxygenase Allenoxid-Synthase Allenoxid-Cyclase

OPDA

OPDA

OPDA Reduktase 3 x β-Oxidation

JA

Expression der Abwehrgene

Abb. 1 -3 Modell der Signal -

transduktion zur Aktivierung

des Oktadekanoidwegs.

Durch Verwundung oder Insek-

tenfraß wird Systemin aus Pro-

systemin freigesetzt. Nach Bin-

dung von Systemin an die ex-

trazelluläre LLR-Domäne sei-

nes Rezeptors kommt es zu

einer Depolarisierung der Zell-

membran durch Ausstrom von

K+- und Cl-- Ionen und Ein-

strom von H+ . Die cytoplasma-

tischen Ca2+-Konzentration er-

höht sich und eine MAP-Kin-

ase wird aktiviert. Dies führt zur

Aktivierung einer Phospholip-

ase, die die Freisetzung der

Linolensäure katalysiert, dem

Ausgangssubstrat für den Ok-

tadekanoidweg.

1 Einleitung

8

Damit dieser Induktionsmechanismus funktioniert, sind Proteasen nötig, die zum

einen, das Signalpeptid Systemin aus seinem Vorläufermolekül, Prosystemin, freisetzt.

Und zum anderen eine weitere Protease, die Systemin wieder inaktiviert, und so dazu

führt, dass die Synthese von Jasmonsäure wieder eingestellt wird. Proteasen mit

einer solchen Funktion konnten bis jetzt nicht identifiziert werden.

1.3 Das Insulin-degradierende Enzym (IDE)

Auf der Suche nach einem Enzym das Prosystemin prozessiert oder Systemin degra-

diert um die Aktivierung des Oktadekanoidweges zu beenden, wurden Versuche

durchgeführt, die auf einem Two-Hybrid-System basierten (Jochen Strassner, ETH-

Diss. 13833). Hiermit konnte die partielle cDNA von verschiedenen Proteasen kloniert,

und sequenziert werden. Eine dieser Proteasen war von besonderer Bedeutung, da

sie Systemin zwischen dem vierzehnten und fünfzehnten Aminosäurerest (Lys14,

Met15, und Abb. 1-4) schneidet. Vorherige Arbeiten mit Systemin-Analoga und

Systemin-Fragmenten hatten gezeigt, das eine Spaltung an dieser Stelle zur Einbuße

der biologischen Aktivität führten (Schaller, 1998; Meindl und andere, 1998). Nach

diesen Versuchen binden die ersten N-terminalen Aminosäurereste (syst1-14) von

Systemin an seinen Rezeptor, aber auch das C-termininale Tetra-Peptid MQTD

(syst15-18) wird ebenso für die Aktivierung des Oktadekanoidweges benötigt.

Die von Strassner identifizierte Protease, die Systemin zwischen Lys14 und Met15

schneidet, ist nach Sequenz-Analyse homologisch zu dem humanen Insulin-degra-

dierenden Enzym (HsIDE), das bei Säugetieren am Abbau von Insulin mit beteiligt ist.

Abb. 1 -4 Systemin. Die N-terminalen Amino-

säurereste (syst1-14) sind für die Bindung von

Systemin an seinen Rezeptor verantwortlich.

Das C-terminale Tetra-Peptid MQTD bewirkt sie

Induktion des Oktadekanoidweges. Die Schnitt-

stelle von IDE die zur inaktivierung von

Systemin führt ist durch den roten Pfeil gekenn-

zeichnet.

AVQSKPPSKRDPPK MQTDAVQSKPPSKRDPPK MQTDAVQSKPPSKRDPPK MQTDAVQSKPPSKRDPPK MQTD

Rezeptor-Bindung Induktion

1 Einleitung

9

Da hier Insulin, aufgrund seiner Bedeutung für die Entstehung von Diabetes melitus,

eines der am besten untersuchten Signalpeptide ist, ist auch IDE bereits biochemisch ,

gut charakterisiert. Allerdings zeigte IDE, nach seiner Klonierung als cDNA (Affholter

und andere, 1988), keinerlei Ähnlichkeit mit bis dahin bekannten Protease-Familien.

IDE wurde schließlich mit anderen Proteasen, aufgrund ihres konservierten H-x-x-E-H-

Motives der katalytischen Domäne (Rawlings und Barret, 1991) in die neue Familie

M16 der Inverzinkin-Metalloproteasen eingeordnet (http://merops.sanger.ac.uk;

Rawlings und andere, 2004) . Das, für diese Familie charakteristische, konservierte

H-x-x-E-H-Motiv, stellt das inverse Motiv anderer Zink-abhäniger Metalloproteasen

dar. Das H-x-x-E-H-Motiv ist, als Teil der katalytischen Domäne, mit verantwortlich für

enzymatische Aktivität von IDE. An die beiden Histidine binden Zink-Ionen und Glut-

amat ist für die katalytische Aktivität nötig (Perlman und andere, 1993). Abbildung 1-5

zeigt die Anordnung der verschiedenen Domänen innerhalb des IDE-Proteins.

Am N-Terminus ist die katalytische Domäne lokalisiert, und mit nur geringem Abstand

(24 Aminosäurereste) folgt eine M16-C-Domäne. M16-C stellt ebenfalls eine konser-

vierte Sequenz der Primärstruktur innerhalb der Inverzinkin-Metalloproteasen dar, und

ist für die Substratbindung und / oder für die Interaktion mit anderen Proteinen nötig

(Taylor und andere, 2001). Am C-terminalen Ende befindet sich eine weitere M16-C-

Domäne, von der erst vor kurzem gezeigt werden konnte, dass diese an der Oligo-

merisierung von IDE beteiligt ist (Pengyun und andere, 2006).

In vitro degradiert IDE nicht nur Insulin, sondern auch andere Polypeptide, wie zum

Beispiel die Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktoren I und II (Roth und andere,1984), das

atriale natriuretische Hormon (Muller und andere, 1991), oder ß-Endorphin (Safavi und

andere, 1996) oder das ß-Amyloid Peptid (Qui und andere, 1998; Vekrellis und

andere, 2000). Im Gegensatz zu vielen anderen Proteasen werden die Schnittstellen

der verschiedenen Substrate von IDE nicht durch die Abfolge der Aminosäurereste in

HXX EH M16-CM16-CHXX EH M16-CM16-C

Abb 1 -5 Schematische Anordnung der verschiedenen Domänen von IDE. Das konservierte

H-x-x-E-H-Motiv der katalytischen Domäne entspricht dem inversem Motiv anderer Zink- ab-

hängiger Metalloproteasen. Die M16-C-Domäne ist mit an der Substratbindung beteiligt.

1 Einleitung

10

der Primärstruktur bestimmt, sondern IDE scheint andere, strukturelle Elemente zu er-

kennen. Durch seine Beteiligung am Abbau von Insulin und ß-Amyloid ist IDE mit ver-

antwortlich für die Entstehung der verbreiteten und schwerwiegenden Krankheiten

Diabetis melitus und der Alzheimer-Krankheit.

Neben dem direkten Abbau von Polypeptiden reguliert IDE aber auch die Aktivität des

Proteasoms (Bennett und andere, 1994; Duckworth und andere, 1994; Hamel und

andere, 1998; Bennett und andere, 2000). Auf der anderen Seite wirkt Ubiquitin aber

auch als kompetitiver Inhibitor von IDE (Saric und andere, 2003). Weitere Inhibitoren

von IDE in vitro sind langkettige Fettsäuren (C16-C20) und ATP (Hamel et al., 2003;

Camberos et al., 2001).

Ebenso vielfältig wie die Aufgaben von IDE ist auch seine Lokalisation. IDE konnte aus

vielen verschiedenen Geweben Säugetieren isoliert werden (Shii und andere 1986;

Ogawa und andere 1992), auch in solchen in denen Insulin keine Reaktion hervorruft.

IDE von Säugetieren und Insekten besitzt eine Signalsequenz für den Transport in das

Peroxisom (Authier und andere, 1995), dennoch liegt der größte Anteil des IDE-Pools

im Cytosol. IDE konnte aber auch in Endosomen (Hamel und andere, 1991) und as-

soziiert mit der Plasmamembran (Duckworth, 1978 und 1979; Yokono und andere,

1979 und 1982; Goldfine und andere, 1984; Vekrellis und andere, 2000) nachgewie-

sen werden, und ebenso in sekretierter Form im Überstand von Zellkulturen und in der

cerebrospinalen Flüssigkeit (Qui und andere, 1998), obwohl IDE keine bekannte

Signalsequenz für die Sekretion enthält.

Während das IDE aus Säugetieren bereits relativ gut charakterisiert ist, ist über die

Aufgabe von IDE in Pflanzen bis jetzt nur wenig bekannt. Die einzigen Daten die über

dieses Enzym in Pflanzen vorliegen stammen aus der Dissertation von Yoann Huet

(ETH-Diss. 15732). Demnach kodiert das IDE-Gen in Tomaten für ein Protein mit einer

Größe von 971 Aminosäureresten und mit einer errechneten Größe von 112 kDa. Eine

bekannte Transport-Signalsequenz liegt nicht vor. Mit Hilfe von Northern- und

Western-Analysen konnte die mRNA von IDE bzw. IDE selbst in den Kotyledonen,

Blättern, Wurzeln, Blüten, grünen Früchten und in Zellen aus Zellsuspensionskulturen

nachgewiesen werden. Im Genom von Tomatenpflanzen konnte bis jetzt nur ein Gen

für IDE nachgewiesen werden, bei Arabidopsis thaliana sind hingegen zwei IDE-Gene

vorhanden. Von IDE-Mutanten von Arabidopsis thaliana liegen auch Daten bezüglich

der Keimung vor. So ist die Keimung ohne Stratifikation bei ide2 um mehr als 24 Stun-

den verzögert gegenüber ide1 und Wildtyp, ebenso tritt bei dieser Mutante eine Verzö-

1 Einleitung

11

gerung der Keimung auf nach Behandlung der stratifizierten Samen mit Abscisinsäure.

Bei einer Keimung auf Medium mit hohen Saccharose-Konzentrationen zeigt wieder-

rum diese Mutante Störungen in der Keimlings-Entwicklung und der Chlorophyll-

bildung. Unter normalen Gewächshaus- oder Laborbedingungen zeigen die Arabi-

dopsis-Mutanten allerdings keine sichtbaren phänotypischen Veränderungen. Ebenso

verläuft ihr Wachstum und ihre Entwicklung ohne Auffälligkeiten. Diese Situation ist

überraschend, unter dem Blickwinkel, dass IDE ein stark konserviertes Gen ist, für

das, neben dem Vorkommen in Säugetieren und Pflanzen, auch homologe Sequenzen

in Bakterien, Hefe und Insekten existieren. Allerdings entwickeln sich auch IDE-defi-

ziente Mäuse unter Laborbedingungen normal. So konnte bis jetzt nur durch die detail-

lierte und gezielte Analyse der Krankheiten Diabetes und Alzheimer beim Menschen

der mutante Phänotyp aufgedeckt werden, einschließlich der erhöhten Insulinkon-

zentration im Blut, Glucose-Intoleranz und der Anreicherung des β-Amyloid-Peptides

im Liquor (Farris und andere, 2003). Diese Forschung dauert seit über 50 Jahren an,

wohingegen die oben erwähnten Arabidopsis knock-out-Mutanten die ersten Ansätze

sind, um die Funktion von IDE in Pflanzen aufzuklären

1.4 Die Hypothese

Die Hypothese für diese Arbeit baut auf dem von Ryan und Pearce (2003) beschrie-

benem Modell der Induktion des Oktadekanoidweges auf. Demnach führt die Inter-

aktion des im Apolasten lokalisierten Systemin mit seinem, sich an der Zelloberfläche

befindenden Rezeptor, zur Produktion von Jasmonsäure, und so zur Produktion der

Abwehrproteine, zu denen auch der Proteinaseinhibitor II gehört. Eine einfache Erklär-

ung für eine Beendigung dieses Signals wäre der proteolytische Abbau von Systemin.

Wie bereits in vitro gezeigt wurde, spaltet IDE Systemin (Yoann Huet, ETH-Diss.

15732). Wäre dies tatsächlich auch in planta die Aufgabe von IDE, so müsste dies bei

IDE-defizienten Pflanzen dazu führen, dass nach Verwundung oder Insektenfraß,

durch eine erhöhte Systemin-Konzentration, die Bildung des Proteinaseinhibitors II

länger anhaltend oder auch verstärkt stattfindet. Der Effekt einer solchen Mutation, auf

herbivore Insekten, die durch die nicht stattfindende Degradation von Systemin zu

einer erhöhter PI-II-Konzentration im Blattmaterial führt, müsste mit einer Situation

vergleichbar sein, bei der es zu einer verstärkten Systemin-Produktion zu einer

Anreicherung des PI-II kommt. Wie vorrausgegangene Arbeiten bereits gezeigt haben

1 Einleitung

12

weisen genetisch veränderte Tomatenpflanzen, die Prosystemin unter Einfluss des

CaMV35S-Promotors überexprimieren, eine konstitutive Bildung des Proteinaseinhi-

bitors II auf (McGurl und andere, 1994).

Die Rolle von lDE in planta im Zusammenhang mit der Produktion von Abwehr-Pro-

teinen und dem Einfluss auf herbivore Insekten wurde bis jetzt noch nicht unter-sucht.

Im Rahmen dieser Arbeit, sollte also anhand von Tomatenpflanzen deren Ex-pression

des IDE-Gens durch RNAi-Technik unterdrückt wurde, der Einfluss dieser Protease

auf die Veränderung der Systemin-Konzentration, die indirekt über die Kinetik der PI-II-

Expression geschätzt werden kann, untersucht werden.

Um die Produktion des Proteinaseinhibitors hervorzurufen, wurden die Pflanzen

entweder mechanisch verwundet, oder Larven von Manduca sexta verwendet.

1.5 Manduca sexta

Um die Induktion des Oktadekanoidweges durch herbivore Insekten in den Tomaten-

pflanzen auszulösen, wurde Manduca sexta (Tabakschwärmer) ausgewählt. Zum

einen ist Manduca sexta eine der am besten untersuchten Insekten-Arten, zum an-

deren wurde mit diesem Insekt schon oft gearbeitet um die Abwehrreaktionen in

Tomaten und Kartoffeln zu testen. So konnte zum Beispiel an Prosystemin-defizienten

Tomatenpflanzen gezeigt werden, dass deren Resistenz gegenüber Manduca sexta

stark vermindert ist (Orozco-Cardenas und andere; 1993). Dies führte bei diesen

Pflanzen dazu, dass im Gegensatz zu den Kontroll-Pflanzen, die Blattfläche deutlicher

dezimiert wurde, und bei den Insekten die sich von diesen Pflanzen ernährten, ein

wesentlich höheres Gewicht aufwiesen (s. Abb. 1-6).

Abb. 1 -6 Ergebnisse eines Versuchs mit Prosystemin -defizienten Tomatenpflanzen und

Manduca sexta (Orozco-Cardenas und andere; 1993). Nach 14 Tagen war die Blattflächer der

Pflan-zen bei denen die Prosystemin-Expression unterdrückt war eine deutlich dezimierte Blatt-

fläche im Vergleich zu den Wildtyp-Pflanzen. Wohingegen die Larven, die auf diesen Prosystemin-

defizienten Pflanzen frassen eine erhöhte Körpermasse aufweisen im Vergleich zur Kontrollgruppe.

1 Einleitung

13

Manduca sexta gehört zur Familie der Sphingidae

(Ordnung: Lepidoptera), ist auf die Pflanzenfamilie der

Solanaceen spezialisiert, und ist in Süd- und Mittelameri-

ka, bis hoch in die südlichen Staaten Nordamerikas behei-

matet. Manduca sexta ist ein holo-metaboles Insekt, was

bedeutet, dass mehrere Larvenstadien durchlaufen wer-

den, und dann eine vollständige Metamorphose stattfindet.

Zwischen jedem Larvenstadium erfolgt eine Ruhephase

von ungefähr 24 Stunden, an deren Ende eine Häutung er-

folgt. Unter normalen Beding-ungen hat Manduca sexta 5

Larvenstadien, und der ge-samte Entwicklungszyklus folgt

einem zeitlich stark stringentem Ablauf. Die Dauer der Lar-

venzeit beträgt ungefähr 20Tage. Nach dem Schlüpfen

verbleiben die Larven die gesamte Zeit auf der Pflanze zur

Nahrungsaufnahme. Am Ende des 5. Stadium, verlassen

die Larven jedoch die Pflanzen, um sich im Boden ein-

zugraben und sich dort zu Verpuppen. Diese Phase, zwi-

schen Verlassen der Wirtspflanze und dem Eingraben im

Untergrund, ist durch ein auffälliges Umherlaufen der Lar-

ven gekennzeichnet, und wird als „wandering“-Stadium be-

zeichnet. Nach dem Schlüpfen als Imago beträgt die

Lebenszeit nur noch 5 bis sieben Tage. Währen dieser

Zeit legen die weiblichen Tiere ungefähr 200 Eier. Allge-

mein werden die Wirtspflanzen für die Oviposition auf-

grund der Form der Pflanze, ihres charakteristischen Ge-

ruchs, der durch flüchtige volatile Verbindungen (VOCs)

bestimmt wird, und durch die Oberflächenbeschaffenheit

der Pflanze beeinflusst. Dabei können diese Signale ent-

weder eine anziehende oder abstoßende Wirkung haben.

Abb.1 -7 Manduca sexta

entwickelt sich über 5

Larvenstadien und einem

Puppenstadim zum be-

flügeltem Imago.

(1) frisch geschlüpfte

Larve, L1 (2) Larve im 5.

Larvenstadium, L5

(3) Puppe (4) Imago

1

2

4

3

3 Ergebnisse

14

2 Materialien und Methoden

2.1 Materialien

2.1.1 Chemikalien und Lösungen

Soweit nicht anders vermerkt, stammen alle Chemikalien von Roth, Karlsruhe und

Merck, Darmstadt. Alle Stammlösungen wurden nach der Herstellung autoklaviert.

Acrylamid-Stammlösung rotiphorese® Gel40

Agarose Life Technologies, Eggenstein

Anoden-Puffer 1 0,3 M Tris/HCl pH 10,4

20 % (v/v) Methanol

wurde nicht autoklaviert

Anoden-Puffer 2 25 mM Tris/HCl pH 10,4

20 % (v/v) Methanol


APS 10 % (w/v)

Blockierungs-Lösung 6 % (w/v) Magermilchpulver in 1x TBS/Tween

Bradford-Reagenz Roti®-Quant

Bromphenolblau Serva, Heidelberg

Chloroform

CI-Lösung Chloroform:Isoamylalkohol 48:2

3 Ergebnisse

15

CTAB-Extraktions -Puffer 2 % (w/v) CTAB

100 mM Tris/HCl pH 8,0

20 mM EDTA pH 8,0

1.4 M NaCl

2 % β-Mercaptoethanol

CTAB-Fällungs-Puffer 1% (w/v) CTAB


10 mM EDTA pH 8,0

CTAB-NaCl-Puffer 10% CTAB in 0,7 M NaCl

Denaturierungs-Lösung 1,5 M NaCl

0,5 M NaOH

50x Denhardt’s Reagenz 5 g Ficoll 400

5 g Polyvinylpyrrolidon (PVP)

5 g BSA Fraktion V

mit ddH2O auf 500 ml aufgefüllt, sterilfiltrirt

DEPC-Wasser 10 µl DEPC / 100 ml ddH2O

ECL-Lösung A 100 mM Tris/HCl pH 8,5

200 mM Cumarinsäure

1,25 mM Luminol (3-Aminophtalhydrazid)

ECL-Lösung B 3 % H2O2

Ethanol, absolut

Formaldehyd, 37%

Formamid, deionisiert

3 Ergebnisse

16

HCl, 0,25 N

high-salt-TE 10 mM Tris/HCl pH 8,0

0.1 mM EDTA pH 8,0

1 M NaCl

Hybridisierungs-Lösung 50 % Formamid

5x SSC

50 mM KPP pH 7,0

0,5 % SDS

2x Denhardt’s Reagenz

Lachssperma-DNA, partiell hydrolysiert,

denaturiert, 100 µg/ml

Natriumhypochlorid, 12 %

Kathoden-Puffer 40 mM 6-Aminohexansäure

20 % (v/v) Methanol


1 M KPP-Puffer, pH 7,0 1 M K2HPO4

1 M KH2PO4

pH durch mischen der beiden Lösungen

eingestellt

10x Ladepuffer 50% Glycerin

1 mM EDTA

0,03% Bromphenolblau

10x Ladepuffer zur Auftrennung

kleiner Fragmente

50% Glycerin

1% Xylenxyanol

LiCl 10 M

Magermilchpulver Regilait, Saint Martin Belle Roche

3 Ergebnisse

17

MS-Medium 2,2 g/l MS incl. Vitamins, Duchefa

30 g/l Saccharose

6 g/l Agar

pH 5,8 mit KOH eingestellt

NaAc 3 M, pH 4,8

NaCl 5 M

Neutralisierungs-Lösung 1,5 M NaCl

0,5 M Tris/HCl pH 7.2

1 mM EDTA

NH4OAc 10 M

PCl-Phenol-Lösung Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol 50:24:1

PCl-Lösung Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol 50:48:2

5x PCR-Puffer 15 mM MgCl2

100 mM (NH4)2 SO4

0,08 % Triton X-100

20 % DMSO

250 mM KCl


Phenol Roti®-Phenol

Ponceau-Lösung (10 x) 2 g Ponceau S, (Sigma-Aldrich, Steinheim)

30 g Trichloressigsäure

30 g Sulfosalicylsäure

mit ddH2O auf 100 ml auffüllen

3 Ergebnisse

18

Protein-Extraktions-Puffer (5x) 500 mM NaCl


2,5 % (v/v) Triton X-100

50 mM β-Mercaptoethanol

10 µl/ml Protease-Inhibitor-Cocktail (Sigma-Aldrich, Steinheim)

RNA-Extraktions-Puffer 75 mM NaCl

25 mM Tris-HCl, pH 8,0

25 mM EDTA

1 % SDS

1 M ß-Mercaptoethanol (Serva, Heidelberg)

10x RNA-Gelpuffer 0,4 M MOPS

100 mM Natriumacetat

10 mM EDTA

pH 7,0 mit NaOH einstellen

Sammelgel-Puffer (4x) 0,5 M Tris/HCl pH 6,8

0,4 % (w/v) SDS

20 % SDS

SDS-PAGE-Puffer (Laufpuffer) 50 mM Tris/HCl pH 8,3

384 mM Glycin

0,1 % (w/v) SDS

SDS-Probenpuffer 200 mM Tris/HCl pH 6,8

400 mM DTT

8 % (w/v) SDS

40% (v/v) Glycerin

0,4 % (w/v) Bromphenolblau

20x SSC 175,3 g NaCl

100,5 g Na3Citrat • 2 H2O

mit ddH2O auf 1 l aufgefüllt

3 Ergebnisse

19

50x TAE-Puffer 2 M Tris

1 M Essigsäure

0,5 M EDTA pH 8,0

14 µg/l Ethidiumbromid

20x TBS, pH 7,4 3 M NaCl

200 mM Tris

TBS/Tween 0,1 % (v/v) Tween®20 in 1x TBS

TEMED

TE-Puffer 10 mM Tris/HCl pH 8,0

1 mM EDTA

TNP, 15 % (w/v)

Trenngel-Puffer (4x) 1,5 M Tris/HCl pH 8,8

0,4 % (w/v) SDS

Waschlösung 1 1x SSC

0,5 % SDS

Waschlösung 2 0,2x SSC

0,5 % SDS

Waschlösung zum Strippen 0,04x SSC

0,04 % SDS

3 Ergebnisse

20

2.1.2 Kits

RadPrime, Labelling System Invitrogen, CA

→ Sondenmarkierung

RevertAid™ First Strand cDNA Synthesis Kit Fermentas, St.Leon-Rot

→ Reverse Transkription

2.1.3 Enzyme und Antikörper

Alle Enzyme stammen von Fermentas, St.Leon-Rot, außer es wurde anders vermerkt.

Die Restriktionsenzyme wurden mit den entsprechenden vom Hersteller vertriebenen

Puffern verwendet und hatten eine Aktivität von 10 U / µl, außer es wurde anders

vermerkt.

EcoR I

Hind III

Ssp I 25 U/µl New England BioLabs, Frankfurt a. M

Xba I

Xho I

RNAse RibonucleaseA, Stock: 10 mg/ml in TE

Roth, Karlsruhe

Taq-DNA-Polymerase Peqlab, Erlangen

Reverse Transkriptase RevertAID™ M-MuLV, s. 2.1.2

LeIDE-Antiserum (Rabbit) polyklonal

Eurogentech, Herstal, Belgium

gerichtet gegen ein rekombinante IDE-Peptid, das

die 119 N-terminalen Aminossäurereste und ein

GST-tag enthält

sekundärer Antikörper Anti-Rabbit IgG, Heavy and Light Chain (Goat)

Peroxidase Conjugate

Calbiochem, Darmstadt

3 Ergebnisse

21

2.1.4 Nucleotide und Nucleinsäuren

[α-32P]-dCTP, 10 µCi / µl MP Biomedicals, Eschwege

dNTP-Mix, 10 mM Bioline, Luckenwalde

GeneRuler™ 1kb DNA Ladder Fermentas, St.Leon-Rot

Primer Sequenz (5’ → 3’-Orientierung)

LeAktin F TGTGG GAGAT GAAGC TCAAT CG, n = 22

LeAktin R TCAAA CTATC AGTGA GGTCA CG, n = 22

LeAOS2 F CGAAA ACTCA ACTTC AGTTC TTGAT, n = 25

LeAOS2 R TGTTA TTTAT CGATG CGTTT TCAGT, n = 25

LeHPL F TTGGT GGCTT CTCCA TTTTC, n = 20

LeHPL R CAAAC AAGCA ATGTG CTGCT, n = 20

nptII F TATGA CTGGG CACAA CAGAC, n = 20

nptII R AAGAA GGCGA TAGAA GGCGA T, n = 21

LePI-II F

LePI-II R

LeUBQ F

LeUBQ R

oligoT(18)

Alle verwendeten Primer wurden von Operon Biotechnologies (Köln) hergestellt.

2.1.5 Organismen

2.1.5.1 Pflanzliches Material

Alle hier verwendeten Tomatenpflanzen (Lycopersicon esculentum Mill) waren vom

Kultivar UC82B. Die Samen wurden von ROYAL SLUIS (Niederlande) bezogen.

Mittels der RNA-anti-sense-Technik erzeugte Elke Sieferer die LeIDE-defizienten

Pflanzen (unveröffentlicht). Dafür wurde die benötigte cDNA für die Herstellung des

IDE-anti-sense-Konstruktes aus L. esculentum cv. Castlemart II kloniert. Die im anti-

sense-Kontrukt enthaltenen „inverted repeats“ bestehen aus den ersten 400 bp der

3 Ergebnisse

22

codierenden Sequenz und 20 bp der 3´-UTR von IDE, und sind durch eine Spacer-

Sequenz getrennt. Das fertige anti-sense-Konstrukt wurde mit Hilfe des Restriktions-

enzyms NotI in den Transformations-Vektor pART27 geschnitten, und explantierte

Kotyledonen von UC82B damit transformiert (s. Abb. 3-2).

Es standen Samen der T1-Generation von insgesamt 9 Kanamycin-resistenten Linien

zur Verfügung, nämlich InsHP1, InsHP2, InsHP3, InsHP4, InsHP6, InsHP7, InsHP9,

InsHP10 und InsHP11.

Für die Präselektion der transformierten Linien mittels Western Blot-Analyse wurden

die Linien InsHP1, InsHP2, InsHP3, InsHP6, InsHP7, InsHP10 verwendet. Diese

Pflanzen wuchsen im Gewächshaus auf Erde und waren 6 Wochen alt.

Die Linien InsHP2, InsHP3, InsHP6, InsHP7 wurden auch für die Southern Blot-Ana-

lyse verwendet, sowie die Linien InsHP4, InsHP9, InsHP11 und Wildtyp-Pflanzen.

Letztere waren 4,5 Wochen alt und wurden im Kulturraum mit einer Photoperiode von

12 h bei 100 µmol · m-2 · s-1 und bei einer Temperatur von 22°C auf MS-Medium an-

gezogen.

Für die verschiedenen Verwundungs- und Manduca-Experimente wurde die Linie

InsHP7 verwendet. Diese Pflanzen hatten verschiedene Wachstumsbedingungen und

waren unterschiedlich alt (s. Tab. 2-1).

Tab. 2-1 Alter und Wachstumsbedinungen der Pflanzen für die Verwundungs-

und Manduca-Experimente

Pflanzenalter 1)

Wachstumsbedingungen

Verwundungs-Experiment 1:

2 Gewächshaus 2)

Verwundungs-Experiment 2:

2 Lichtthermostatschrank 3)

Manduca-Experiment 1:

4 Gewächshaus 2)


8 Gewächshaus 2)


8 Gewächshaus 2)


2 Gewächshaus 4)

1) in Wochen, zu Beginn des Experiments 2) Temperatur: 25° C ± 2° C, Lichtintensität: ~ 200 µmol · m-2 · s-1 3) Temperatur: 28° C, Lichtintensität: 250 µmol · m-2 · s-1 4) Temperatur: 28° C ± 2° C, Lichtintensität: 250 µmol · m-2 · s-1

3 Ergebnisse

23

Alle Pflanzen wuchsen bei einem Tag- / Nachtzyklus von 16 h / 8 h. Während der

Dunkelperiode fiel die Temperatur auf ungefähr 20° C ab. Gedüngt wurde einmal pro

Woche im Gießverfahren mit einem NKP-Dünger (GABI Plus® 12-8-11, 2 ml / 100 l

Gießwasser). Chemische und biologische Pflanzenschutzmaßnahmen wurden vor

oder während der Experimente nicht durchgeführt. Auch wurde darauf verzichtet die

Pflanzen auszugeizen.

Die 2 Wochen alten Pflanzen, die für die Verwundungs-Experimente und das Man-

duca-Experiment 4 verwendet wurden, befanden sich in einem Entwicklungsstadium,

in dem Blatt 1 und 2 vollentwickelt waren und Blatt 3 und 4 nachschoben.

Stratifikation:

Die verwendeten Samen waren entweder älter als ein halbes Jahr, oder wurden vor

der Aussaat für 2 Tage bei 4° C stratifiziert.

Samensterilisation:

Wurden Pflanzen auf MS-Medium angezogen, erfolgte eine Oberflächen-Sterilisation

mit Hypochlorid. Dazu wurden die Samen zunächst 3 min in 70% Ethanol inkubiert,

und anschließend für 10 min in 1,5 % Hypochlorid mit 5 Tropfen Tween20 / 100 ml. Es

folgte eine 4-malige Waschung mit sterilem ddH20.

Um eine Virusinfektion zu vermeiden wurden die Pflanzen für das Manduca-Experi-

ment 4 zusätzlich mit TNP sterilisiert. Diese Samen wurden für 15 min in 15% TNP

eingeweicht, und anschließend vier mal in einem großen Volumen sterilem ddH20

gespült.

2.1.5.2 Insekten

Die Eier von Manduca sexta, Johanson (Lepidoptera: Sphingidae) wurden vom

„Manduca Project“ der University of Tuscon, Arizona bezogen. Die für die Experimente

verwendeten Insekten stammten dann aus eigener Zucht.

Das Kunstfutter, das für die Aufzucht der Larven verwendet wurde, wurde ebenfalls

von „Manduca Project“ bezogen. Die Zusammensetzung ist auf der Internetseite

www.manducaprojetct.com aufgelistet.

3 Ergebnisse

24

2.1.6 Sonstiges

Blotting-Papier Schleicher & Schuell, Dassel

Elektrophorese-Kammer für Proteine

Mini-PROTEAN® 3 Cell, BioRad, München

Nitrocellulose-Membran PROTEAN® nitrocellulose transfer membrane, Schleicher & Schuell, Dassel

NPK-Dünger GABI Plus® 12-8-11, Gabi-Biochemie, Bad Salzuflen

Photometer Eppendorf bioPhotometer 6131, Hamburg

Röntgenfilm Hyperfilm™ MP, Amersham Bioscience, Freiburg

Säule zur Sondenaufreinigung Bio-Spin-Column, BioRad, München

„semi-dry“ Blotting-Apperatur Nova Blot, Amersham Biosciences, Freiburg

UV Stratalinker® 1800 Stratagene, La Jolla, CA

Plastikverbrauchsmaterial wie Pipettenspitzen, Reaktionsgefäße und Petrischalen

wurden von der Firma Sarstedt, Nümbrecht bezogen.

2.2 Methoden

2.2.1 Western-Analyse

2.2.1.1 Proteinextraktion und SDS-Polyacrylamidgele lektrophorese

(SDS-PAGE)

Ungefähr 75 mg gefrorenes Blattmaterial wurden in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß mit

einem Plastik-Pistill homogenisiert. Sofort wurden 300 µl Protein-Extraktions-puffer

zugesetzt, und der Ansatz dann zentrifugiert (15000 x g, 2 min bei 4° C). Die Konzen-

tration des, in ein neues Reaktionsgefäß überführten, Überstandes wurde bestimmt.

Dazu wurde die Bradford-Lösung mit 10 µl des Protein-Extraktes versetzt, 10 min bei

RT inkubiert und die Absorption am Photometer bei einer Wellenlänge von 595 nm ge-

messen. Alle Schritte der Extraktion wurden auf Eis durchgefürt.

5 µg des Extraktes wurden mit ddH2O auf ein Volumen von 22,5 µl verdünnt, mit 7,5 µl

SDS-Probenpuffer versetzt, für 5 min auf 95° C erhitzt und anschließend über Poly-

acrylamid-Gele in SDS-PAGE-Puffer bei 100 V aufgetrennt. Die Sammelgele (Stärke:

3 Ergebnisse

25

1,5 mm) hatten eine Acrylamid-Konzentration von 4,5 % ( 0,375 ml Acrylamid-Stamm-

lösung, 0,85 ml Sammelgel-Puffer, 2,125 ml ddH2O, 10 µl APS 10 %, 6,0 µl TEMED),

und die Trenngele eine Konzentration von 6,5 % (1,45 ml Acrylamid-Stammlösung,

2,25 ml Trenngelpuffer, 5,3 ml ddH2O, 30 µl APS 10%, 6,75 µl TEMED). Als Größen-

standard wurden 3 µl „PageRulerTM Prestained Protein Ladder“ (Fermentas) aufge-

tragen.

2.2.1.2 Proteintransfer auf eine Nitrocellulose-Mem bran

Anschließend wurden die durch die SDS-Page getrennten Proteine auf Nitrocellulose-

Membran übertragen. Hierfür wurde das Blotting-Papier mit den entsprechenden Puf-

fern getränkt (drei Papiere in Anoden-Puffer 1, sechs Papiere in Anoden-Puffer 2,

sechs Papiere in Kathoden-Puffer), die Membran kurz in Wasser, und dann in Anoden-

Puffer 1, inkubiert, und Blotting-Apperatur entsprechend Abb. 2-1 luftblasenfrei aufge-

baut. Der elektrophoretische Transfer erfolgte für 1h30min bei 100 mA / Gel.

Abb. 2-1 Aufbau der Apperatur beim Western Blot

2.2.1.3 Immunodedektion mit Hilfe des IDE-Antiserum s

Zur Absättigung der Membran wurde diese für mindestens eine Stunde mit Blockier-

ungs-Lösung inkubiert. Danach folgte eine 12stündige Inkubation mit dem LeIDE-Anti-

serum. Das Antiserum war 1:3000 mit frischer Blockierungs-Lösung verdünnt. Die

Membran wurde dann drei mal für 5min mit TBS/Tween gewaschen, und für 1h mit

dem Peroxidase-konjugiertem sekundären Antikörper (1:10000 verdünnt in Blockier-

ungs-Lösung) inkubiert. Die Membran wurde wieder drei mal für 5min mit TBS/Tween

gewaschen und mit der ECL-Lösung entwickelt. Dazu wurde die ECL-Lösung durch

mischen der Lösung A und B (3 µl / ml Lösung A) frisch angesetzt, und die Mem-

Kathode

6 Lagen Blotting-Papier, getränkt mit Katoden-Puffer

Polyacrylamidgel

Nitrocellulose-Membran

3 Lagen Blotting-Papier , getränkt mit Anoden-Puffer1

6 Lagen Blotting-Papier , getränkt mit Anoden-Puffer2

Anode

3 Ergebnisse

26

branen damit für 5 min im Dunklem inkubiert. Nach Abtropfen der Membran wurde

diese zwischen zwei Plastikfolien gelegt, und das Signal mit Hilfe eines lichtempfind-

lichen Röntgenfilm dedektiert. Nach einem Waschschritt wurde zum Vergleich der au-

getragenen Proteinmenge eine Ponceau-Färbung durchgeführt.

Alle Schritte wurden bei Raumtemperatur durchgeführt. Und die Membranen wurden in

kleinen Plastikboxen unter leichtem Schwenken inkubiert.

2.2.2 Southern-Analyse

2.2.2.1 CTAB-DNA-Extraktion

Es wurden 6 g Blattmaterial von Tomatenpflanzen verwendet, die zuvor für 24 h, zur

Verringerung des Stärkegehaltes, abgedunkelt waren. Das Pflanzengewebe wurde in

flüssigen Stickstoff zu Pulver gemörsert, mit CTAB-Extraktionspuffer (5 ml / g FG) ver-

setzt, und für 30 min bei 65° C inkubiert. Es wurde 1x V ol. Chloroform zugesetzt, und

für 5 min bei 5000 x g zentrifugiert. Die wässrige Phase wurde abgenommen und mit 1/10 x Vol. CTAB-NaCl-Puffer und 1x Vol. Chloroform versetzt, und erneut für 5 min bei

5000 x g zentrifugiert. Die DNA in der wässrigen Phase wurde dann durch Zugabe von

1x Vol. Präzipitationspuffer und während einer Inkubation von 30 min bei 65° C gefällt.

Der Ansatz wurde 5 min bei 500 x g zentrifugiert, die DNA in high-salt-TE (1 ml / g FG)

aufgenommen und erneut für 30 min bei 65° C inkubier t. Nach Zugabe on 0,6 x Vol.

Isopropanol fiel ein wolkenartig die langkettigen DNA-Moleküle aus. Der Ansatz wurde

weiter über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Mit einer sterilen Glasnadel wurde

die entstandene DNA-„Wolke“ dann in ein neues Gefäß mit 5 ml 80 % Ethanol über-

führt und 10 min bei 10000 x g (4° C) zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenom-

men, das DNA-Pellet getrocknet und anschließend in TE (0,5 µl / g FG) resuspendiert.

Es folgte ein RNase-Verdau, für den 10 µg / ml des Enzyms zugesetzt wurden, und

der Ansatz für 30 min bei 37° C inkubiert wurde. Dana ch wurde die DNA mit ⅓ x Vol.

10 M NH4OAc und 2,5 x Vol. Ethanol für 30 min auf Eis gefällt, und anschließend 15

min bei 7500 x g (4° C) abzentrifugiert. Das Pellet w urde erneut mit 80 % gewaschen,

getrocknet und in 0,5 ml TE aufgenommen. Der Ansatz wurde nochmals kurz zentri-

fugiert, das Extrakt abgenommen und konnte dann bei –20° C gelagert werden.

Die Konzentration der DNA wurde in TAE-Agarosegelen (1 % Agarose, 0,1 µg / ml

(w/v) Ethidiumbromid) geschätzt. Hierfür wurde die extrahierte DNA 1:10 verdünnt,

3 Ergebnisse

27

und davon jeweils 2,5 µl, 5 µl, 10 µl und 2 µl unverdünntes DNA-Extrakt aufgetragen.

Die Proben wurden vor dem Auftragen mit 2 µl Ladepuffer versetzt und mit TE-Puffer

auf ein Endvolumen von 20 µl gebracht. Als Größenstandart wurden 2 µl und 6 µl

DNA-Ladder aufgetragen. Die Elektrophorese wurde in 1 x TAE-Puffer bei 90 V für 1,5

h durchgeführt und die Gele danach unter UV-Licht fotografiert. Auf diese Weise

konnte auch gleichzeitig die Qualität der DNA kontrolliert werden.

2.2.2.2 Restriktionsverdau der genomischen DNA

Zur Fragmentierung der genomischen DNA wurden zwischen 5 und 10 µg DNA mit je

50 U (außer SspI : 125 U) des Restriktionsenzyms und dem entsprechenden Puffer in

einem Endvolumen zwischen 200 und 350 µl über Nacht inkubiert. Am folgenden Tag

wurden nochmals 20 U des gleichen Enzyms zugesetzt, und für weitere 2 h inkubiert.

Es folgte eine Phenol-Chloroform-Reinigung und eine Ethanol-Fällung. Die verdaute

DNA wurden dann in 20 µl TE-Puffer aufgenommen.

2.2.2.3 Auftrennung der DNA-Fragmente und Transfer auf eine Nitrocellulose-

Membran

Die durch den Restriktionsverdau erhaltenen DNA-Fragmente wurden in einem 0,8

%igen TAE-Agarosegel in Anwesenheit von Ethidiumbromid aufgetrennt. Vor dem Auf-

tragen der Ansätze wurden diese mit Ladepuffer versetzt. Die Gele liefen über Nacht

bei 30 V in TAE-Puffer. Nach dem Lauf wurden die Gele unter UV-Licht fotografiert

und für 20 min in 0,25 N HCl inkubiert. Anschließend folgten weitere Inkubationen für

30 min in Denaturierungs-Lösung und zwei Mal für 15 min in Neutralisierungs-Lösung.

Für den Blot-Aufbau wurde das Blotting-Papier mit 20x SSC angefeuchtet, die Nitro-

cellulose-Membran gewässert und dann kurz in 20x SSC inkubiert. Der Blot wurde

nach Abb. 2-2 luftblasenfrei aufgebaut. Nach erfolgten Transfer über Nacht in 20x

SSC, wurde die Nitrocellulose-Membran kurz in 2x SSC gespült und anschließend

durch UV-Strahlung auf der Membran fixiert (Stratalinker, 120 mJ).

Die Markierung der Sonde und die Hybridisierung der Membran zum Nachweis von

gesuchten DNA-Fragmente ist unter 2.2.4 beschrieben.

3 Ergebnisse

28

Abb. 2-2 Aufbau der Apperatur für Southern und Nort hern Blots

2.2.3 Northern Blot Analyse

2.2.3.1 RNA-Extraktion

Für die RNA-Extraktion wurden ungefähr 100 mg Blattmaterial verwendet, das zuvor in

flüssigem Stickstoff gemörsert wurde. Es wurden 750 µl Extaktionspuffer und 750 µl

PCI-Phenol-Lösung zugegeben und für 10 min bei 10000 x g zentrifugiert. Die wäs-

srige Phase wurde mit 750 µl PCI-Lösung für 5 min unter Schütteln extrahiert und er-

neut für 10 min bei 10000 x g zentrifugiert. Dieser Extraktionsschritt wurde wiederholt,

und es folgte ein nochmals ein Extraktionsschritt mit CI-Lösung. Die wässrige Phase

wurde dann mit ¼ x Vol. 10M LiCl versetzt und über Nacht auf Eis gefällt. Der Ansatz

wurde dann bei 4° C für 20 min bei 10000 x g zentrif ugiert, das Pellet mit 70% Ethanol

gewaschen, und in 100 µl DEPC-Wasser resuspendiert. Es folgte eine weitere Fällung

mit 1/10 x Vol. 3 M NaAc und 2,5 x Vol. Ethanol. Anschließend wurde das Pellet mit 70

% Ethanol gewaschen, getrocknet und in 50 µl DEPC-Wasser resuspendiert.

Die Konzentrationsbestimmung der RNA erfolgte am Photometer (Eppendorf

bioPhotometer 6131) bei einer Wellenlänge von 260 nm in UV-Küvetten.

2.2.3.2 Aufrennung der RNA und Transfer auf eine Ni trocellulose-Membran

Zur Analyse der Gen-Expression wurden je 5,5 µg der Gesamt-RNA in einem form-

aldehydhaltigen 1,2%igen Agarose-Gel (1,5 g Agarose, 12,5 ml 10x RNA-Gelpuffer,

22,5 ml Formaldehyd, 90 ml H2O) elektrophoretisch aufgetrennt. Die Proben wurden

mit 1 µl 10x RNA-Gelpuffer, 3,5 µl Formaldehyd, 10 µl Formamid und 2µl RNA-Lade-

Papiertücher 3 Lagen Blotting-Papier Nitrocellulose-Membran 3 Lagen Blotting-Papier Brücke aus Blotting-Papier

Gel

3 Ergebnisse

29

puffer versetzt und 15min bei 65°C inkubiert. Die Gel e liefen entweder bei 60 V für 5-6

h oder bei 20 V über Nacht. Nach der Elektrophorese wurden die Gele unter UV-Licht

fotografiert, anschließend für zwei Mal 15 min in H2O, und dann für 15 min in 10x SSC

inkubiert. Die Nitrocellulose-Membran wurde gewässert, und dann kurz in 10x SSC in-

kubiert. Das Blotting-Papier wurde ebenfalls mit 10x SSC ange-feuchtet und der Blot

nach nach Abb. 2-x luftblasenfrei aufgebaut. Nach erfolgtem Transfer über Nacht in

10x SSC, wurde die Nitrocellulose-Membran kurz in 2x SSC gespült und anschließend

durch UV-Strahlung auf der Membran fixiert (Stratalinker, 120 mJ).

Für die Analyse des Verwundungs-Experiments 2 und des Manduca-Experiments 4

wurde für eine erhöhte Präzision ein Blotting-Gel ohne Ethidiumbromid gegosssen,

und eines mit Ethidiumbromid für die Kontrolle der aufgetragenen RNA-Menge. Das

Gel für die EtBr-Färbung wurde nach zweimaligen Waschen mit H2O für 30 min in

Wasser mit 1 µg/ml EtBr inkubiert und dann über Nacht in großem Volumen Wasser

entfärbt und anschließend unter UV Licht photographieren.

2.2.4 Sondenherstellung und Hybridisierung

Die hier verwendeten Sonden für das Kanamycin-Resistenzgen (nptII), den Proteinase

Inhibitor II (LePI-II) und Ubiquitin (LeUBQ) wurden aus klonierter cDNA gewonnen. Mit

Hilfe der PCR und den genspezifischen Primern (s. 2.1.4) wurden die entsprechenden

Sequenzen amplifiziert und anschließend durch eine Ethanol-Fällung aufgereinigt. Die

Markierung der Sonde erfolgte mit dem RadPrime-Kit nach Protokoll des Herstellers.

Hierfür wurden 25 ng template-DNA und 32P markierte dCTP-Nucleotide verwendet.

Die radioaktiv markierte Sonde wurde auf einer Säule (Bio-Spin-Column) unter Zentri-

fugieren bei 1000x g aufgereinigt, und anschließend die Aktivität der Sonde bestimmt.

Für die Hybridisierung wurden die Nitrocellulose-Membranen mit ddH2O angefeuchtet,

kurz in 5x SSC inkubiert und dann in eine Hybridisierungs-Röhre mit 20 ml Hybridisier-

ungs-Lösung überführt. Eine Prähybridisierung erfolgte für mindestens 2h bei 42° C.

Die Hybridisierungslösung wurde erneuert, die für 5min auf 95° C erhitzte und dann

auf Eis abgeschreckte Sonde zugesetzt und über Nacht bei 42° C inkubiert. Zur Ent-

fernung der unspezifisch gebundenen Sonde erfolgten je ein Waschschritt für 30

Minuten bei 60° C mit Waschlösung 1 und 2. Zur Signald etektierung wurde ein Rönt-

genfilm mit der in Saran-Folie eingepackten Membran exponiert.

3 Ergebnisse

30

2.2.5 Strippen von Blots

Die Waschlösung wurde in der Mikrowelle bis zum Siedepunkt erhitzt, der Blot dann in

die heiße Waschlösung überführt und für weitere 2 min in der Mikrowelle am Siede-

punkt gehalten. Anschließend wurde die Waschlösung mit der Membran für 20 min

unter Schütteln abgekühlt. Dieser Waschvorgang wurde noch zweimal wiederholt.

2.2.6 Reverse Transkription

1,5 µg RNA wurde mit Hilfe der Reversen Transkriptase „RevertAID™ M-MuLV“ nach

Protokoll des Herstellers in cDNA umgeschrieben.

2.2.7 PCR (Polymerase Chain Reaction)

Die PCR-Ansätze enthielten neben unterschiedlichen Mengen an Template-DNA 1 µl

Taq-Polymerase, 5 µl 5 x Puffer, 0,5 µl Primer „Forward“ (10 µM), 0,5 µl Primer

„Reverse“ (10 µM), 0,5 µl 10 mM dNTPs (10 mM). Mit ddH2O wurde ein Endvolumen

von 25 µl eingestellt. Die verwendeten Primer sind unter 2.1.4 aufgelistet.

Für die Herstellung von Sonden wurde 1 µl cDNA verwendet. Diese wurde zuvor durch

eine Plasmid-Minipräperation gewonnen und im Verhältnis 1:100 verdünnt, was einer

Konzentration von ungefähr 1 ng / µl entsprach.

Wurde die PCR benutzt um cDNA, nach erfolgter Reverser Transkription, zu ampli-

fizieren, dienten zunächst 2 µl cDNA als Template und es erfolgte eine erste PCR mit

LeAktin-Primern. Anhand eines Testgels wurden dann die Template-Mengen ange-

glichen und erneut eine PCR mit LeAktin-Primern durchgeführt. Führte dies zu gleich

starken Actin-Banden im Gel, wurden die angelichenen Template-Mengen der zweiten

„Aktin-PCR“ auch für die PCR mit den LeHPL- oder LeAOS-Primern benutzt. Auf die

Gele wurden jeweil 8 µl des PCR-Produktes aufgetragen.

Die „annealing“-Temperatur wurde in Abhängigkeit des GC-Gehaltes der Primer ge-

wählt. Es wurden folgende PCR-Programme verwendet:

3 Ergebnisse

31

PCR-Programm 1: PCR-Programm 2:

(Amplifikation von Sonden) (RT-PCR)

94 °C / 2 min 94 °C / 2 min

94 °C / 30 s 94 ° C / 30 s

60 °C / 30 s 30 x 56 °C / 30 s 28 x (Aktin) / 27 x (HPL, AOS)

72 °C / 45 s 72 ° C / 30 s

72 °C / 7 min 72 °C / 7 min

2.2.8 Verwundung der Tomatenpflanzen

Die Blätter wurden mit einer ca. 3 mm breiten, gezahnten Fläche einer Pinzette ver-

wundet. Zu diesem Zweck wurde das 2. Blatt mit der Pinzette quer zur Mittelrippe, und

über diese hinweg gequetscht (s. Abb. 2-3). Nach

einer Stunde folgte eine 2. Verwundung in einem

Abstand von ungefähr 0,5 cm neben der 1. Ver-

wundung.

2.2.9 Manduca sexta-Zucht

Die Insekteneier wurden nicht sterilisiert und verblieben bis zum Schlüpfen in Petri-

schschalen (92x16mm, ØxHöhe) bei einer Raumtemperatur von 25° C. Um zu vermei-

den, das die empfindlichen, frisch geschlüpften Larven vertrocken oder verhungern,

enthielten die Petrischalen, sofern nicht anders vermerkt, bereits mehrere Würfel aus

Kunstfutter. Die Petrischalen wurden täglich auf geschlüpfte Larven kontrolliert, und

das Kunstfutter ersetzt. Bis zum Aufsetzten auf die Versuchspflanzen verblieben diese

auf Kunstfutter und wurden, zur Vermeidung von Infektionen, täglich auf frisches Futter

umgesetzt. Bis zum vierten Larvenstadium konnten zur Aufbewahrung Petrischalen

Abb. 2 -3 Schematische Darstellung

der Verwundung eines Tomaten-

blattes durch eine Pinzette.

1. Verwundung

2. Verwundung

3 Ergebnisse

32

verwendet werden (s. Abb. 2-4), danach

wurden leere Pipettenspitzen-Boxen benutzt.

Beim Umsetzen erwiesen sich auch abge-

flachte Pinzetten als nicht besonders hilfreich.

L1-Larven und kleine L2-Larven wurden mit

einem, mit Wasser angefeuchteten, dünnen

Pinsel umgesetzt, größere von Hand.

Zur Etablierung einer eigenen Zucht wurden

die Larven nach Erreichen des „wandering“-

Stadiums in Papierhandtücher gewickelt und

in Plastikboxen mit Luftlöchern im Dunkeln

bei 25° C aufbewahrt. Nach erfolgter Verpuppung wurd en die verschmutzten Papier-

tücher gewechselt und das Geschlecht der Insekten bestimmt. Die Falter konnten in

Flugkäfigen schlüpfen die im Gewächshaus aufgestellt waren. Bei den Flugkäfigen

handelte es sich um ein Holzgestell (B/H/T: 120/110/80) das mit Tüll bespannt, und an

einer Seite komplett zu öffnen war (s. Abb. 2-5). Neben zwei, ca. 80 cm hohen Toma-

tenpflanzen auf denen die Manduca-

Weibchen die Eier frei ablegen konnten,

enthielten die Käfige auch eine oder

mehrere Holzstangen. Diese dienten

den frischgeschlüpften Faltern um daran

enmpor zu klettern und dort dann ihre

Flügel zu entfalten. Die frisch gelegten

Eier wurden einmal täglich abgesam-

melt und, um gleich alte Larven für die

Experimente zu erhalten, nach Ablege-

Datum getrennt aufbewahrt.

2.2.10 Experimente mit Manduca sexta


Auf vier Wochen alte Tomatenpflanzen (s. 2.1.4.1), die frei im Gewächshaus aufge-

stellt waren, wurden je vier Manduca sexta-Larven aufgesetzt und verblieben dort für

14 Tage. Es wurden nur Larven ausgewählt, die einen Tag nach der Häutung zum 2.

Abb 2 -5 Flugkäfig zur Oviposition mit WT- und

ide-Pflanze.

Abb. 2 -4 Frisch gehäutete L4 -Larven

auf Kunstfutter.

3 Ergebnisse

33

Larvenstadium standen, die gleiche Größe hatten und vital waren. Für jeden Pflanzen-

Genotyp (WT und InsHP7) wurde eine Gruppe von sechs Pflanzen verwendet. Nach 7

Tagen wurde das Gewicht der Larven bestimmt und zur Beurteilung der gefressenen

Blattmenge die Pflanzen nach 7 und nach 14 Tagen fotografiert. Larven, die während

des Experiments von den Pflanzen gefallen waren oder die Pflanze verlassen hatten,

wurden nicht wieder aufgesetzt.


Auf acht Wochen alte Tomatenpflanzen (s. 2.1.4.1), die frei im Gewächshaus aufge-

stellt waren, wurden je vier Manduca sexta-Larven aufgesetzt und verblieben dort bis

zum Erreichen des „wandering“-Stadiums. Es wurden frisch geschlüpfte Larven aufge-

setzt, ohne dass diese zuvor Kunstfutter gefressen hatten. Alle Larven hatten die

gleiche Größe und waren vital. Für jeden Pflanzen-Genotyp (WT und InsHP7) wurde

eine Gruppe von 18 Pflanzen verwendet. Larven, die während des Experiments von

den Pflanzen gefallen waren oder die Pflanze verlassen hatten, wurden nicht wieder

aufgesetzt.

Bei Erreichen des „wandering“-Stadiums wurde das Gewicht bestimmt. Ausserdem

wurde die Zeit bis zum Erreichen des „wandering“-Stadiums, die Verpuppungs-Rate,

das Geschlecht der Puppen (s. Abb 2-6) sowie die Schlüpf-Rate der Imagines be-

stimmt.


Zur Untersuchung, ob die Falter bei der Eiablage zwischen den verschiedenen Pflan-

zen-Genotypen unterscheiden, wurde in den oben beschdriebenen Flugkäfigen je eine

acht Wochen alte Wildtyp- und eine InsHP7-Pflanze aufgestellt. Die Pflanzen waren so

♀ ♂ Abb. 2 -6 Das Geschlecht

der von Manduca sexta

kann anhand der Puppen

bestimmt werden. Bei den

weiblichen Tieren befindet

sich der Genitalporus auf

dem 4., bei den männlichen

auf dem 5. Abdominalseg-

ment befindet.

3 Ergebnisse

34

aufgestellt, dass immer abwechselnd eine Wild-

typ- und eine InsHP7-Pflanze nebeneinander

standen (s. Abb 2-7). In jeden Käfig wurden

zwei weibliche und männliche Puppen gege-

ben, die sich zur selben Zeit verpuppt hatten.

Die dort geschlüpften Falter konnten ihre Eier

auf den Tomatenpflanzen ablegen und verblie-

ben im Flugkäfig bis zu Ende der Ovipositions-

Periode (~ 1 Woche). Es wurden zwei Gruppen

von Faltern verwendet, bei denen die Larven

entweder auf Wildtyp- oder auf InsHP7 Pflan-

zen aufgezogen wurden. Die auf den Pflanzen

abgelegten Eier wurden jeden Tag gezählt, die

Pflanzen durch neue ersetzt und derern Position

gewechselt.


Für diesen Versuch, bei dem die Larven eine genau definierte Blattmenge fressen

sollten, wurde eine einfache, aber effiziente Ver-

suchsanordnung entwickelt. Um die Expression des

PI-II-Gens mit der Expression bei den Verwundungs-

Experimenten vergleichen zu können, waren die

Tomatenpflanzen auch hier 2 Wochen alt. Bei Vor-

versuchen, bei denen Larven direkt auf die Pflanzen

aufgesetzt wurden, stellte sich heraus dass Larven,

die noch nicht das 5. Larvenstadium erreicht hatten,

nicht konstant an den Pflanzen frassen. Dies führte

dazu, dass auch innerhalb von einer Stunde, oder bei

mehreren aufgesetzten oder ausgewechselten Lar-

ven, keine vergleichbaren Ergebnisse an sechs

Pflanzen hinsichtlich der gefressenen Blattmenge er-

zielt werden konnten. Andererseits waren auch junge

L5-Larven zu gross und zu schwer für die kleinen

Pflanzen. Ausserdem entstanden beim Abnehmen

der Larven, durch deren Haftorgane, oft zusätzliche

Abb. 2 -8 Versuchsanordnung für das Manduca-Experiment 4

HP7

WT

WT

WT

WT

WT

WT

HP7

HP7

HP7

HP7

HP7 N

Abb. 2 -7 Anordnung der Pflanzen beim Ovipositions-Experiment

3 Ergebnisse

35

Verletzungen an den Pflanzen. Durch Aufsetzen von jungen L5-Larven auf dünne

Holzstäbe, die dann in die Pflanzentöpfe gesteckt wurden (s. Abb. 2-8) konnte dieses

Problem gelöst werden. Vor dem Versuch hatten die Larven für 12 h kein Nahrungs-

quelle. Die Larven frassen für 5-10 min an den Pflanzen, und nochmals nach einer

Stunde, bis eine Blattfläche von ungefähr 1,0-1,5 cm2 mit eine Frasskantenlänge von

1,5-2,0 cm von den Larven gefressen worden war.

3 Ergebnisse

36

3 Ergebnisse

3.1 Identifizierung unabhängiger Linien

Die Grundlage für diese Arbeit waren Samen der T1-Generation von Pflanzen, in

denen die Expression des Gens für IDE mittels der RNAi-Technik unterdrückt worden

war (E. Sieferer, unveröffent-licht). Aus insgesamt 9 Kanamycin-resistenten „RNAi-

Linien“ wurden zunächst die Linien mittels Western-Analyse identifiziert in denen die

IDE-Expression vermindert war, um dann mit Hilfe der Southern-Analyse unabhängig-

transformierten Linien zu bestimmen.

3.1.1 Identifizierung der IDE-defizienten Linien mit tels Western-Analyse

Da die mRNA von IDE nur sehr schwach exprimiert wird, wurde zur Überprüfung des

„Silencing-Effektes“, statt der Northern- die Western-Analyse verwendet. Bei Linien,

die das „hairpin“-Konstrukt enthalten, und bei denen der „Silencing“-Mechanismus

wirksam ist, sollte LeIDE nicht nachweisbar sein.

Zunächst wurden die Linien InsHP1, InsHP2, InsHP3, InsHP6, InsHP7 und InsHP10

ausgewählt und über SDS-Page und Western Blot analysiert. Das für den LeIDE-

Nachweis verwendete polyklonale Antiserum war spezifisch für die 119 N-terminalen

Aminosäuren, einschließlich des H-x-x-E-H-Motivs, das mitverantwortlich ist für die

Bindung von Metall-Ionen und für die katalytische Aktivität der Proteinase.

Abbildung 3-1 zeigt die Western-Blots der einzelnen Kanamycin-resistenten Linien, für

die jeweils Proben mit den gleichen Gesamt-Proteingehalt von Extrakten aus vollent-

wickelten Blättern von sechs Einzelpflanzen aufgetragen wurden. Als Positiv-Kontrolle

dienten die Blattextrakte von 3 einzelnen Wildtyp-Pflanzen. Außerdem wird als Kon-

trolle der aufgetragenen Proteinmenge das Rubisco-Protein dargestellt, das nach Fär-

bung der Membran mit Ponceau-Lösung, die stärkste Bande zeigte.

Durch das polyklonale Antiserum werden in den Positiv-Kontrollen der Wildtyp-Protein-

extrakte zwei Proteine mit einer Größe von ungefähr 120 und 100 kDa detektiert. In

den Linien InsHP2, InsHP6 und InsHP7 ist das Protein mit der molekulare Masse von

~120 kDa, was der errechneten Größe von 112 kDa für IDE entspricht, nicht nach-

3 Ergebnisse

37

weisbar. Die Linien InsHP1 und InsHP10 zeigen beiden Banden. Demnach entspre-

chen die Linien InsHP1 und InsHP10 dem Wildtyp, in den Linien InsHP2, InsHP6 und

InsHP7 ist aber die Expression des IDE-Gens unterdrückt.

Positiv-Kontrolle

1 2 3 4 5 6

InsHP1:

InsHP2:

InsHP3:

InsHP6:

InsHP7:

InsHP10:

120 100

Abb. 3 -1 Western -Analyse zur

Identi-fikation der IDE-defizien-

ten Linien

Von den Linien InsHP2, InsHP3,

InsHP6, InsHP7 und InsHP10

wurden die Proteinextrakte aus

Blättern von sechs Einzelpflanzen

(Nr. 1-6) durch SDS-PAGE aufge-

trennt und auf Nitrocellulose-

Membran geblottet. Das polyklo-

nale Antiserum, das gegen das

N-terminale Ende von LeIDE ge-

richtet ist, detektiert in Wildtyp-

Extrakten (Positiv-Kontrolle) zwei

Banden. In den IDE-defizienten

Pflanzen kann die 120 kDa-Ban-

de nicht nachgewiesen werden.

Als Kontrolle der aufgetragen

Proteinmenge wird Rubisco (R)

nach Anfärbung mit Ponceau-

Lösung gezeigt.

120 100

120 100

120 100

120 100

120 100

kDa

R

R

R

R

R

R

3 Ergebnisse

38

Bei der Linie InsHP3 ist bei den Einzelpflanzen Nr.1 und Nr.4 eine IDE-Bande nach-

weisbar, bei den anderen Pflanzen hingegen nicht. Dies könnte zum einem darauf zu-

rückzuführen sein, dass die insertierte T-DNA segregiert oder der „Silencing“-Mecha-

nismus bei den Nachkommen der transformierten Pflanzen nicht mehr effektiv wirksam

ist.

Auf Höhe der 120 kDa-Bande ist bei manchen Pflanzen, bei denen die IDE-Expression

unterdrückt ist (v.a. Linie InsHP3 und InsHP7), noch eine sehr schwache Bande sicht-

bar, diese sind wahrscheinlich darauf zurückzuführen, dass der „Silencing“-Effekt sich

hier nicht vollständig auf die Expression von IDE auswirkt.

Bei der, bei allen untersuchten Pflanzen deutlich erkennbaren, 100 kDa-Bande handelt

es sich wahrscheinlich nicht um ein IDE-ähnliches Protein, da sowohl der „Silencing“-

Mechanismus als auch das polyklonale Antiserum gegen die konservierte katalytische

Domäne von IDE gerichtet ist. Würde es sich hier um ein IDE-ähnliches Protein han-

deln, das also auch die typische katalytische Domäne enthält, würde dieses ebenso

wie IDE dem Silencing-Mechanismus unterworfen werden. Es ist also wahrschein-

licher, dass es sich hier um eine Kreuzreaktion handelt, die auf die Verwendung des

polyklonalen Antiserums zurückzuführen ist.

3.1.2 Analyse der IDE-defizienten Linien mittels Sou thern-Analyse

Nachdem die Linien identifiziert waren, deren IDE-Expression unterdrückt war, sollte

nun mit der Southern-Analyse die unabhängien-transformierten Linien ermittelt wer-

den. Die genomische DNA der einzelnen Linien wurde mit verschiedenen Restriktions-

enzymen verdaut, und anhand der unterschiedlichen Bandenmuster sollten die unab-

hängigen Linien unterschieden werden können. Die Sonde war spezifisch für das

Kanamycin-Resistenzgen nptII der T-DNA und hatte eine Größe von 717 Basen. Die

Restriktionsenzyme waren so gewählt, dass diese nicht innerhalb des nptII-Gens

schneiden (s. Abb. 3-2 und Abb. 3-3).

Alle vier Southern Blots zeigen für den Verdau mit EcoRI, HindIII und SspI jeweils nur

eine Bande (s. Abb. 3-4). Wurde die genomische DNA mit XbaI geschnitten, ist bei

den Linien InsHP2 und InsHP3 deutlich eine Bande mit einer Größe von ungefähr 3,5

kb zu erkennen, und wesentlich schwächer zwei weitere mit einer Größe von ungefähr

3 Ergebnisse

39

5 kb und 6 kb. Auch bei der Linie InsHP6 sind diese beiden Banden vorhanden, aller-dings fehlt hier die 3,5 kb-Bande.

Abb. 3 -2 Schematischer Aufbau des Transformations -Konstruktes der RNAi -Pflanzen

Gezeigt sind die möglichen Schnittselllen im Transformation-Konstrukt. Die violetten Pfeile stellen

das „invertet repeat“ für die RNA-anti-sense-Technik dar, das ursprünglich mit NotI an die multiple

cloning site eingefügt wurde, und entspricht 20 bp der 5´ UTR und den anschließenden 400 bp der

codierenden Sequenz des IDE-Gens. HXXEX: konserviertes Motiv der katalytische Domäne von

IDE; CT: CaMV35S Promotor; OT: Ocs-Terminator; nptII: Kanamycin-Resistenz-Gen; NP: Nos-Pro-

motor; NT: Nos-Terminator; LB, RB: left, right border.

Abb. 3 -3 Restriktions -Verdau des Transformations -

Vektors pART27 der genomischen DNA mit den En-

zymen EcoRI (2); HindIII (3); SspI (4); XbaI (5); BamHI

(6); SalI (7). Für jeden Verdau-Ansatz wurden ca. 2 µg

Plasmid-DNA verwendet, der mit 5 U des jeweiligen En-

zyms versetzt wurde. (1): Ladder, 1kb; (8): pART27, un-

verdaut.

-20 bp 400bp 400bp -20 bp Sonde

I I I I I I

SalI

NotI / Sac

I

NotI / Spe

I / Eco

RV /

SfiI / A

paI

NheI

Bam

HI

SalI

HXXEX

XEXXH

LB

RB

NT

CT

OT

NP

npt II

1 2 3 4 5 6 7 8

3 Ergebnisse

40

Da aufgrund der ähnlichen Bandenmuster die Transformationsergebnisse in den

Linien InsHP2, InsHP3, InsHP6 und InsHP7 nicht als unabhängig identifiziert werden

konnten, wurden außerdem die Linien InsHP4, InsHP9 und InsHP11untersucht (s.

Abb. 3-5). Zusätzlich wurde auch die Wildtyp-DNA mit den gleichen Restriktionsen-

zymen verdaut und mit der nptII-Fragment hybridisiert, um die Spezifität der Sonde zu

überprüfen.

Der WT-Blot zeigte, dass die verwendete Sonde spezifisch das Kanamycin-Resistenz-

gen erkennt. Auch erwies sich die Linie InsHP4 als nicht transformiert. Die Linien

InsHP 9 und 11 zeigten wieder ein ähnliches Bandenmuster, dass sich aber doch von

dem der Linien InsHP2, InsHP3, InsHP6 und InsHP7 unterschied. Diesmal konnte für

den Verdau mit SspI zwei Banden nachgewiesen werden. Auffällig ist auch, dass bei

allen sechs transformierten Linien nach Verdau mit XbaI von der Sonde mehrere Ban-

den erkannt werden.

InsHP2 InsHP3 InsHP6 InsHP7

Abb. 3 -4 Southern Blots der Linien InsHP2, InsHP3, InsHP6 und InsHP7

10 µg (InsHP2 und 3) bzw. 5 µg (InsHP6 und 7)genomischer DNA wurden mit den Enzymen EcoRI,

HindIII, SspI und XbaI geschnitten und mit der radioaktiv markierten Sonde für das nptII-Gen

hybridisiert.

Eco

RI

Hin

dIII

Xb

aI

Ssp

I

Eco

RI

Hin

dIII

Xb

aI

Ssp

I

Eco

RI

Hin

dIII

Ssp

I

Xb

aI

Eco

RI

Hin

dIII

Ssp

I

I I I I I I I I

10,0 kb

6,0 kb

4,0 kb 3,5 kb 3,0 kb 2,5 kb

2,0 kb 1,5 kb

3 Ergebnisse

41

Diese Southern-Analysen zeigten, dass den untersuchten Linien zwei unabhängige

Transformationsergebnisse zugrunde liegen. Zu der einen Gruppe gehören die Linien

InsHP2 und 3, zur anderen die Linien InsHP 9 und 11. Die Linie InsHP6 ähnelt stark

den Linien InsHP2 und 3, lediglich beim Verdau mit XbaI ist ein Unterschied zu be-

merken (Fehlen der Bande bei 3,5 kb).

Da der Vergleich der verschieden Blots untereinander bei diesen ähnlichen Mustern

nicht zu einem wirklich eindeutigem Ergebniss führen konnte, wurde eine weitere

Southern-Analyse durchgeführt bei der diesmal die verschiedenen Linien auf die selbe

Membran geblottet wurden. Bei dem Verdau mit XbaI entstanden immer Muster mit

mehreren Banden, deshalb wurde hier dieses Enzym gewählt, um die genomische

DNA der verschiedenen Linien nochmals zu schneiden. Um die Auflösung zu verbes-

sern liefen beide Gele jetzt ungefähr 16 Stunden (s. Abb. 3-6 A).

Hier erkennt man jetzt bei starkem Kontrast für die Linien InsHP2, InsHP3 und InsHP6

jeweils zwei Banden mit einer ungefähren Größe von 4 kb und 3,5 kb (s. Abb. 3-6 A

und C). Beide Banden sind auch bei den Linien InsHP9 und InsHP11 vorhanden. Hin-

Abb. 3 -5 Southern Blots der Linien InsHP4, InsHP9, InsHP11 und von WT

10 µg genomischer DNA wurden mit den Enzymen EcoRI, HindIII, SspI und XbaI geschnitten und

mit der radioaktiv markierten Sonde für das nptII-Gen hybridisiert.

Eco

RI

Hin

dIII

Ssp

I

Xb

aI

InsHP9

Eco

RI

Hin

dIII

Ssp

I

Xb

aI

Eco

RI

Hin

dIII

Ssp

I

Xb

aI

Eco

RI

Hin

dIII

Ssp

I

Xb

aI

WT InsHP11 InsHP4 I I I I I I I I

10,0 kb

6,0 kb 4,0 kb 3,5 kb 3,0 kb 2,5 kb 2,0 kb 1,5 kb

3 Ergebnisse

42

zu kommen aber bei diesen beiden Linien weitere 4 Banden mit einer Größe zwischen

ungefähr 5 und 7 kb, die bei der Linie InsHP11 deutlich erkennbar sind. Obwohl er-

kennbar ist, das auf das Gel für die Linie InsHP9 etwas mehr DNA aufgetragen wurde

(Abb. 3-6 B), fällt die Bindung der Sonde auf dem Blot schwächer aus. Trotzdem sind

die drei Banden mit einer Größe zwischen ungefähr 3,5 kb und 5 kb und die Bande

kurz ober-halb der 6 kb-Bande noch schwach erkennbar (Abb. 3-6 C).

Um sicher zu gehen, dass bei den Linien InsHP9 und 11 die Vielzahl der Bande nicht

auf einen unvollständigen Restriktionsverdau zurückzuführen ist, wurde dieser letzte

Blot nochmals mit einer Sonde für das IDE-Gen hybridisiert (Abb. 3-7). Für alle Linien

konnten hier zwei Banden mit jeweils der selben Größe detektiert werden. Dies zeigt

zum einen, dass die sechs Banden der Linien InsHP9 und 11 auf eine mehrfache In-

sertion der T-DNA zurückzuführen ist, und weist zum anderen, auf das Vorhanden-

sein eines zweiten IDE-Gens hin.

Aufgrund dieses Southerns mit XbaI konnten die Ergebnisse der vorausgegangenen

Blots bestätigt werden. Die 9 Kanamycin-resistenten Linien bestehen also nur aus 2

Abb. 3 -6 Southe rn Blot der Linien InsHP2, InsHP3, InsHP6, InsHP9 u nd InsHP11 nach Verdau mit XbaI

A 7,5 µg genomischer DNA wurden mit dem Enzym XbaI geschnitten und mit der radioaktiv markierten

Sonde für das nptII-Gen hybridisiert. B Entsprechendes Gel, mit Ethidium-bromid angefärbt. C Der selbe Blot,

stark kontrastiert.

XbaI

InsHP

2 3 9 11 6

I I I I I I I I

10,0 kb

6,0 kb

4,0 kb

3,5 kb

3,0 kb

2,5 kb

2,0 kb

1,5 kb

B C A

3 Ergebnisse

43

Gruppen von unabhängigen Linien. Zu der einen Gruppe gehören die Linien InsHp2, 3

und 6, zu der anderen die Linien InsHP 9 und 11. InsHP7 wird wegen des gleichen

Bandenmuster der Southern-Analysen in Abb. 3-4 der ersten Gruppe zugeordnet.

In Tabelle 3-1 werden die Ergebnisse der Western- und Southern-Analyse nochmals

veranschaulicht.

Alle weiteren Experimente wurden mit der Linie InsHp7 durchgeführt.

1 InsHP 2 9 7 6 3 4 10 11

Tab. 3-1 Ergebnisse der Southern - und Western -Analyse n der verschidenen Kanamycin -

resistenten Linien. Die hell- oder dunkelviolett unterlegten Linien kennzeichnet die

Zugehörigkeit zu einer der beiden unabhängigen Linien. (1) Unter den Nachkommen der Linie

InsHp3 sind auch Individuen, die nicht gesilenced sind. Nicht-gesilencte Linien sind mit grün

unterlegt.

Abb. 3 -7 Southern Blot der Linien InsHP2, InsHP3, InsHP6, I nsHP9

und InsHP11 nach Verdau mit XbaI. 7,5 µg genomischer DNA wurden

mit dem Enzym XbaI geschnitten und mit der radioaktiv markierten Sonde

für das IDE-Gen hybridisiert.

gesilenced

1

nicht gesilenced

InsHP

x x

x

2 9 7 6 3 4 10 11

x

x

x

x x(1)

x

3 Ergebnisse

44

3.2 Untersuchung der Abwehrreaktion

Um die Hypothese zu bestätigen, dass das Fehlen des IDE zu einer verstärkten und

länger anhaltenden Abwehrreaktion führt, wurde als stellvertretendes Gen die Induk-

tion des Proteinaseinhibitors II (PI-II) auf translationaler Ebene bei IDE-defizienten und

bei Wildtyp-Pflanzen untersucht. Von den verwundeten bzw. von Manduca sexta-

Larven angefressenen Blättern wurden, über einen Zeitraum von bis zu vier Tagen,

Sammelproben von sechs oder fünf Pflanzen genommen. Die Transkriptmenge zu den

verschiedenen Zeitpunkten wurde durch Northern-Analyse unter Verwendung der

LePI-II-Sonde untersucht. Zur Kontrolle der aufgetragenen Gesamt-RNA-Menge

wurden die Blotts gestrippt, und erneut mit einer Ubiquitin-Sonde hybridisiert, oder die

mit Ethidiumbromid gefärbten Gele wurden zur Kontrolle unter UV-Licht fotografiert.

3.2.1 Induktion des Proteinaseinhibtors II nach mec hanischer Verwundung

Abbildung 3-7 A zeigt die zeitabhängige Expression des Proteinaseinhibitors II nach

mechanischer Verwundung. Bei Wildtyp-Pflanzen liegt der Höhepunkt der Induktion

zwischen acht und zwölf Stunden, bei IDE-defizienten Pflanzen bei zwölf Stunden.

Auch erscheint die Induktion bei InsHP7 stärker als als bei Wildtyp-Pflanzen. Um die

gleichmäßige Beladung des Gels zu kontrollieren, wurden die Blots zusätzlich mit

einer Ubiquitin-Sonde hybridisiert. Beim Vergleich der Stärke der Signale von PI-II und

UBQ relativiert sich allerdings der obige Eindruck, sowohl hinsichtlich des Maximums

der Induktion, als auch hinsichtlich der Stärke.

Aufgrund des bestehendes Verdachtes einer Infektion mit dem Tomaten-Mosaikvirus

wurde dieser Versuch wiederholt (Abb. 3-7 B), die Samen dafür vor der Aussaat mit

Hypochlorid und TNP sterilisiert, und die extrahierte RNA mit RT-PCR und Primern,

spezifisch für die RNA der Hüllproteine des Virus, untersucht. Dieser Test fiel negativ

aus, die Ergebisse werden hier nicht gezeigt. Der Ausschluß einer Virus-Infektion war

nötig, da bei einer solchen Infektion die Expression der Salicylsäure hoch reguliert,

und unter deren Einfluß die Expression der Jasmonsäure herunter reguliert wird, was

sich negativ auf die produzierte Menge an PI-II auswirken würde.

Da die Transkriptmenge am Tag 3 und 4 nach der Verwundung nicht mehr als rele-

vant erachtet wurde, um eine Aussage bezüglich der Unterschiede in der Induktion

zwischen Wildtyp und ide zu können, wurden diese beiden Zeitpunkte nicht mehr

untersucht. Als zusätzlicher Zeitpunkt wurde aber die Transkriptmenge nach 0,5

Stunden untersucht, um die Induktion nach Verwundung besser mit der nach Insekten-

3 Ergebnisse

45

Fraß vergleichen zu können, gefressen hatten, da hier erwartet wurde, dass die Induk-

tion früher einsetzt.

Hier zeigen dann Wildtyp- und ide-Pflanzen eine maximale Transkriptmenge bei 8

Stunden, und der Unterschied hinsichtlich der Stärke der Transkription ist auch hier

wieder nur sehr geringfügig.

Das Fehlen von IDE scheint also keinen, oder wenn dann nur einen geringfügigen Ein-

fluß auf die Kinetik der Induktion des Proteinaseinhibitors II zu haben.

WT InsHP7

0 2 4 8 12 24 48 72 96 0 2 4 8 12 24 48 72 96

Abb. 3 -7 Zeitlicher Verlauf der PI -II-Induktion nach mechanischer Verwundung bei WT- und ide-

Pflanzen A Blätter von jungen (2 Wochen alt) Tomatenpflanzen wurden verwundet, und die Proben nach

der angegebenen Zeit genommen (5 Pflanzen pro Zeitpunkt). Die Transkriptmenge des Proteinase-

inhibitors II (PI-II) wurde mit einer radioaktiv-markierten Sonde dedektiert. Als Kontrolle der aufgetragenen

RNA-Menge wurde der gestrippte Blot erneut mit einer Sonde für Ubiquitin (UBQ) hybridisiert. B

Wiederholung des Experimentes mit virus-frei getesteten Pflanzen

UBQ

PI-II

A

B

0 0,5 2 4 8 12 24 48 0 0,5 2 4 8 12 24 48

PI-II

WT InsHP7

Zeit [h], nach Verwundung

Zeit [h], nach Verwundung

3 Ergebnisse

46

3.2.2 Induktion des Proteinaseinhibtors II nach Fra ss von Manduca sexta

In Tabakpflanzen können die Gehalte an Jasmonsäure (McCloud und Baldwin, 1997),

wie auch die Transkription von Proteinaseinhibitoren nach Frass von Mandca sexta

deutlich erhöht sein (Roda und andere, 2004; Wu und andere, 2006) gegenüber

mechanischer Verwundung. Deshalb wurde auch bei IDE-defizienten Pflanzen unter-

sucht, ob es zu einer Änderung der Expression des Proteinaseinhibitors II kommt,

bedingt ist durch den Frass von Manduca sexta Larven.

Der Versuch wurde wie unter 2.2.10 (Experiment 4) beschrieben durchgeführt. Auch

hier wurden Proben über einen Zeitraum von 2 Tagen genommen.

Beide Genotypen zeigen das Maximum der Induktion des Proteinaseinhibitors II nach

12 Stunden (s. Abb.3-8), auch hinsichtlich der gebildeten PI-II-mRNA besteht kein

Unterschied. Genauso fällt auch die Transkriptmenge bei beiden Genotypen innerhalb

von zwei Tagen wieder auf das Ausgangsniveau zurück.

Weder mechanische Verwundung, noch Frass von Manduca sexta, führt zu einer Ver-

änderung der Kinetik der PI-II-Induktion in IDE-defizienten Pflanzen. Dies deutet da-

rauf hin, dass IDE keinen Einfluß auf die Abwehrreaktin von Tomatenpflanzen hat, und

dass Systemin wahrscheinlich auch nicht von IDE in planta degradiert wird.

Abb. 3 -8 Zeitlicher Verlauf der PI -II-Induktion bei WT - und ide-Pflanzen nachdem Manduca -

Larven an den Blättern gefressen hatten. An den Blättern von 2 Wochen alten Tomatenpflanzen

hatten Larven von Manduca sexta (frühes 5. Larvenstadium) gefressen. Nach der angegebenen Zeit

wurden dann Proben entnommen (5 Pflan-zen pro Zeitpunkt). Die Transkriptmenge des Proteinase-

inhibitors II (PI-II) wurde mit einer radioaktiv-markierten Sonde dedektiert. Als Kontrolle der aufge-

tragenen RNA-Menge wird das mit Ethidiumbromid angefärbte Gel gezeigt.

0 0,5 2 4 8 12 24 48 0 0,5 2 4 8 12 24 48

WT InsHP7

PI-II

Zeit [h], nach Insektenfraß

3 Ergebnisse

47

3.3 Einfluß des IDE-Silencing auf die Entwicklung von Manduca sexta

Neben dem Nachweis von der veränderten Transkription von bestimmten Genen, stellt

ein Bioassay mit Insekten eine weitere Möglichkeit dar, um eine Vorstellung davon zu

bekommen, welchen Einfluß IDE auf die Abwehrreaktion von Tomatenpflanzen haben

könnte.


Bei diesem Experiment wurde untersucht, ob es unter Einfluß des gesilenceten IDE-

Gens zu einer Akkumulation von Substanzen kommt, wie zum Beispiel dem Protein-

aseinhibitors-II, die die Nahrungsaufnahme und Wachstum der Manduca-Larven be-

einträchtigen. Substanzen, die mit der Induktion des Jasmonsäureweg assoziert sind

müssten zu einer verringerten Gewichtszunahme der Larven führen, und sich somit

auch auf die von ihnen gefressene Pflanzenmenge auswirken.

Wie Abb 3-9 zeigt, konnte, nachdem die Manduca-Larven 7 Tage auf den verschie-

denen Tomatenpflanzen gefressen hatten, kein signifikanter Unterschied betreffend

des Gewichtes zwischen den beiden Insekten-Gruppen festgestellt werden. Zu

diesem Zeitpunkt hatten alle das 4. Larvenstadium erreicht. Auch hinsichtlich der ge-

fressenen Blattmenge konnte kein deutlicher Unterschied erkannt werden (Abb 3-10),

weshalb dieser Parameter auch weiter nicht genauer untersucht wurde.

Abb. 3 -9 Gewicht der Manduca-Larven

nach 7 Tagen auf WT- und ide-Pflanzen.

Zu Beginn des Versuchs waren die

Pflanzen 4 Wochen alt. Auf jede Pflanze

wurden 4 Larven, kurz nach der Häutung

zum 2. Larvenstadium (L2) aufgesetzt.

Für jeden Genotyp wurde eine Gruppe

von 6 Pflanzen verwendet.

Anzahl der Larven auf WT-Pflanzen: n =

20 und auf ide-Pflanzen: n = 21 G

ewic

ht d

er L

arve

n in

g

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

1 WT ide

3 Ergebnisse

48


Hier wurde der komplette Lebenszyklus von Manduca sexta untersucht. Dafür wurden

frisch geschlüpfte Larven auf die Pflanzen aufgesetzt und verblieben dort bis zum Ver-

lassen der Pflanzen, was während der 2. Hälfte des 5. Larvenstadiums stattfindet. Hin-

sichtlich des Gewichts beim Erreichen des „wandering“-Stadiums konnten bei Larven,

die entweder auf Wildtyp- oder aud ide-Pflanzen aufgezogen wurden, auch hier kein

signifikanter Unterschied festgestellt werden (s. Abb 3-11). Allerdings benötigten die

Larven auf den IDE-defizienten Pflanzen rund 3 Tage länger, bis alle Larven dieser

Gruppe das „wandering“-Stadium erreicht hatten (s. Abb 3-12). Dieser Unterschied

machte sich allerdings nur bemerkbar in Bezug auf Erreichen des „wandering“-

Stadiums und nicht beim Wechsel von einem Larvenstadium zum nächsten (Daten

hier nicht gezeigt).

WT

Abb. 3 -10 Status der WT- und ide-Pflanzen an denen 7 Tage Manduca sexta-Larven gefressen hatten.

ide

Abb. 3 -11 Gewicht der Manduca-Larven

bei Erreichen des „wandering“-Stadiums.

Zu Beginn des Versuchs waren die

Pflanzen 8 Wochen alt. Auf jede Pflanze

wurden 4 frisch geschlüpfte Larven (L1)

aufgesetzt. Für jeden Genotyp wurde eine

Gruppe von 18 Pflanzen verwendet.

Anzahl der Larven auf WT-Pflanzen: n =

24 und auf ide-Pflanzen: n = 25

5,00

6,00

7,00

8,00

9,00

10,00

Gew

icht

der

Lar

ven

in g

WT ide

3 Ergebnisse

49

Zusätzlich wurde nach der Verpuppung bei beiden Manduca-Gruppen das Geschlech-

terverhältniss bestimmt. Bezüglich des Geschlechterverhältnisses sowie der Anzahl

der geschlüpften Imagines konnten keine Unterschiede zwischen den beiden Gruppen

festgestellt werden (Daten hier nicht gezeigt).

Um die Fitness der beiden Manduca-Gruppen beurteilen zu können wurde außerdem

das unter 3.3 aufgeführte Ovipositions-Experiment durchgeführt.

3.4 Einfluß des IDE-Silencing auf das Ovipositions-Verhaltens von Manduca

sexta


Um die Auswirkungen auf die Fitness von Manduca sexta zu testen, wenn diese im

Larvenstadium IDE-defizienten Tomatenpflanzen als Nahrung konsumierten, wurde

ein Ovipositions-Experiment entworfen. Unter Darwinscher Fitness versteht man den

Erfolg der Fortpflanzung eines Genotyps, der an der Anzahl der Nachkommen gemes-

sen wird, und ist stark von den Umweltbedingungen, und so auch von der Nahrung,

abhängig. Es wurde mit zwei verschiedenen Gruppen von Faltern gearbeitet, die ent-

weder auf Wildtyp- oder auf ide-Pflanzen herangezogen wurden. Für die Oviposition

standen den Faltern Wildtyp- und ide-Pflanzen zur Auswahl. Die Bereitstellung der

beiden Pflanzengenotypen, zwischen denen die weiblichen Falter für die Oviposition

0%

25%

50%

75%

100%

125%%

der

Lar

ven,

die

das

„w

ande

ring“

-Sta

dium

err

eich

t ha

ben

Abb. 3 -12 Prozentualer Anteil (kumulativ) der Manduca-Larven, die das „wandering“-

Stadium erreicht hatten in Abhängigkeit des Larvenalters. Anzahl der Larven auf WT-

Pflanzen: n = 20 und auf ide-Pflanzen: n = 21. WT ide

16 20 23 26 Tage nach Schlüpfen

3 Ergebnisse

50

wählen konnten, sollte auch Aufschluss darüber geben, ob das „Silencing“ des IDE-

Gens zu einer veränderten Zusammensetzung der Sekundärmetabolite, einschließlich

der flüchtigen organischen Verbindungen, oder der Oberflächenbeschaffenheit der

Pflanzen geführt hat.

Zwei weibliche Falter, die als Larven auf WT-Pflanzen herangezogen wurden, haben

zusammen in einem Käfig im Schnitt 383 ± 72 (n = 3, Anzahl der Wiederholungen des

Experiments) Eier gelegt, und zwei Manduca Weibchen, die auf ide-Pflanzen aufge-

zogen wurden, 334 ± 89. Es konnte also kein signifikanter Unterschied hinsichtlich der

Anzahl der gelegten Eier festgestellt werden. Betrachtet man allerdings das Oviposi-

tions-Verhalten der beiden Gruppen in Bezug auf die ihnen zur Verfügung gestellten

unterschiedlichen Pflanzen-Genotypen, so fällt auf, dass Falter, die über ihre kom-

plette Larvenzeit auf ide-Pflanzen gefressen hatten, ide-Pflanzen für die Oviposition

mieden (Abb.3-13 B). Die Weibchen legten hier nur 120 ± 49 Eier auf IDE-defiziente

Pfanzen, aber 214 ± 42 Eier auf WT-Pflanzen. Wohingegen Falter von Larven, die auf

WT-Pflanzen aufgezogen wurden zwischen den beiden Genotypen bei der Wahl ihrer

Wirtspflanzen für die Oviposition nicht unterschieden (Abb.3-13 A). Diese Falter legten

210 ± 30 Eier auf ide-Pflanzen und 172 ± 73 Eier auf WT-Pflanzen ab.

Abb. 3 -13 Oviposition von Manduca sexta Weibchen, die als Larven auf A WT-Pflanzen oder

B IDE-defizienten Pflanzen aufgezogen wurden. In den Diagrammen zeigen die mit grün

unterlegten Balken die Anzahl der Eier an, die auf Wildtyp-Pflanzen gelegt wurden und die

mit violett unterlegten Balken die Anzahl der Eier auf IDE-defizienten Pflanzen.

0

50

100

150

200

250

300

0

50

100

150

200

250

300

1

A B WT ide WT ide

Anz

ahl d

er g

eleg

ten

Eie

r

Anz

ahl d

er g

eleg

ten

Eie

r

3 Ergebnisse

51

3.5 Untersuchung der Expression von HPL und AOS

Das Ovipositions-Verhalten von Manduca sexta wird auch beeinflusst durch flüchtigen

organischen Verbindungen (VOCs, volatile organic compounds) die von den Pflanzen

produziert werden (Schoonhoven,2005) und als chemische Signale fungieren. Die Er-

gebnisses des Ovipositions-Versuchs, könnten darauf hin deuten, dass das „Silencing“

des IDE-Gens zu einer Veränderung in der Zusammensetzung dieser flüchtigen Subs-

tanzen führt. Mehrere Klassen von chemischen Verbindungen gehören zu den VOCs.

Hierzu zählen auch kurzkettige Aldehyde und die korrespondierenden reduzierten Al-

kohole, sowie Derivate der Jasmonsäure. HPL und AOS sind beides Enzyme, die

erste Schritte der Biosynthese dieser flüchtigen Verbindungen katalysieren (Howe und

andere, 2000).

Das Substrat für beide Enzyme ist 13-hydroperoxy-Oktadecatriensäure (13-HPOT),

das mit Hilfe der LOX aus Linolensäure synthetisiert wird. AOS führt durch die Bildung

von Allenoxid in den Oktadecanoidweg und so letztendlich zur Bildung von Jasmon-

säure. HPL hingegen spaltet 13-HPOT in 3-Hexanal, ein C6-Aldehyde, und 12-oxo-(Z)-

9-Dodecensäure, die weiter zu Traumatin (12-oxo-(E)-10-Dodecensäure) umgesetzt

wird.

3-Hexanal, und das daraus hervorgehnde 2-Hexanal, gehören mit in die Gruppe der

flüchtigen volatilen Verbindungen, die von Tabakpflanzen nachts, nach Befall durch

herbivore Insekten verstärkt abgegeben werden. Die Eiablage von Heliothis virescens

(Tabakeule) ist auf solchen Tabakpflanzen veringert gegenüber nicht-befallenen

Pflanzen (De Moraes und andere, 2001). Eventuell könnte eine veränderte Expression

von HPL in den IDE-defizenten Tomatenpflanzen eine Erklärung für das Ovipositions-

verhalten von Manduca sexta liefern. Da 13-HPOT das Substrat für HPL und AOS ist,

und AOS ein Enzym des Oktadekanoidwegs, und somit zur Synthese von Jasmon-

säure und derern fllüchtigen Derivat Methyl-Jasmonsäure führt, wurde auch die Ex-

pression von AOS untersucht.

Die Induktion der beiden Enzyme wurde hier mit Hilfe der RT-PCR-Technik überprüft.

Es wurde die selbe RNA benutzt, die bereits schon für die Untersuchung der Induktion

des PI-II nach Frass durch Manduca sexta (s. 3.2.1) extrahiert wurde. Diese wurde mit

Hilfe von Reverser Transkriptase in cDNA umgeschrieben, und mit den Gen-spezi-

fischen Primern partiell amplifiziert. Zur Kontrolle der eingesetzten Menge an cDNA

wurde eine PCR mit Actin-Primern durchgeführt, da Actin konstitutiv exprimiert wird.

Die Primer wurden anhand der veröffentlichten Sequenzen (AOS: AJ271093; HPL:

AF230372) des Tomaten Genoms hergestellt. Die partielle cDNA von HPL sollte eine

3 Ergebnisse

52

Länge von 455 bp, die von AOS von 394 bp aufweisen. Um eine Verunreinigung mit

genomischer DNA ausschließen zu können wurden jeweils auch Ansätze ohne

Reverse Transkriptase als Negativ-Kontrolle hergestellt.

hpl

Wie Abbildung 3-14 zeigt, ist bei der Induktion von HPL sowohl für WT wie auch ide

bereits nach einer halben Stunde eine ungefähr doppelt so große Transkriptmenge

nachweisbar, die weiter ansteigt bis 8 Stunden nachdem die Manduca-Larven an den

Pflanzen gefressen hatten, und dann wieder auf das Ausgangsniveau abfällt. Zieht

man Größe der Aktin-Banden mit in Betracht, so kann weder hinsichtlich der Stärke

und des Verlaufs der Induktion, noch der Transkriptmenge zum Zeitpunkt t0 zwischen

Abb. 3 -14 Expression von HPL und AOS nach Frass von Manduc a sexta über einen Zeit-raum von 48 Stunden. Als Kontrolle der verwendeten Transkriptmenge werden auch die Aktin-Fragmente gezeigt, und als Negativ-Kontrolle jeweils die Ansätze ohne Reverse Transkriptase.

I

I 500 bp

250 bp

HPL:

AOS:

Aktin:

I

I

I

I

500 bp 250 bp

500 bp

250 bp

WT L InsHP7

0 0,5 2 4 8 12 24 48 0 0,5 2 4 8 12 24 48

Zeit nach Frass von M.s.:

I

I

I

I

I I

500 bp 250 bp

500 bp 250 bp

500 bp 250 bp

3 Ergebnisse

53

WT und ide ein eindeutiger Unterschied festgestellt werden. Für die Induktion von

AOS verhält es sich ähnlich, außer, dass das Maximum der Induktion bereits nach 4

Stunden erreicht ist.

Auch durch das Bioassey mit Manduca sexta konnte hinsichtlich der Gewichtszu-

nahme keine Veränderung der Abwehrreaktion erkannt werden. Offen bleibt, worauf

die Verzögerung der Verpuppung im 5. Larvenstadium zurückzuführen ist, bei den Lar-

ven, die auf IDE-defizienten Pflanzen aufgezogen wurden, und warum die Imagines

dieser Larven die ide-Pflanzen für die Oviposition meiden.

4 Diskussion

54

4 Diskussion

Das Insulin-degradierende Enzym (IDE) aus Tieren ist einer Metallo-Endopeptidase,

die in vitro mehrere nicht-miteinander verwandte Peptide spaltet, und in vivo an der

Proteolyse von Insulin beteiligt ist. Obwohl das Hormon Insulin nicht in Pflanzen vor-

kommt, besitzen Pflanzen homologe Sequenzen des IDE-Gens. In vitro konnte bereits

auch gezeigt werden, dass das IDE der Tomatenpflanze Systemin degradiert Huet

(ETH-Diss. 15732). Systemin wirkt in Tomatenpflanzen als Signalpeptid, das den

Oktadekanoidweg auslöst und so die Produktion von Abwehrproteine induziert. Ob

IDE auch hiermit in planta im Zusammenhang steht wurde anhand von Verwundungs-

Experimenten und in Bioassays mit Hilfe des herbivoren Insekts Manduca sexta unter-

sucht. Hierfür standen bereits 9 Kanamycin-resistente Linien zur Verfügung, deren

IDE-Defizienz durch RNAi-Technik erzeugt wurde, und bei denen die Effektivität des

Silencings und die Unabhängigkeit der Linien noch durch Western- und Southern-

Analyse überprüft werden musste.

Über den Nachweis des IDE-Protein durch Western-Analyse konnten mehrere IDE-

defiziente Linien identifiziert werden. Auffällig war hier die Linie InsHP3. Diese zeigte

nicht bei allen Proben der Einzelpflanzen ein einheitliches Vorhandensein der IDE-

Banden. Dies könnte zum einem bedeuten, das lediglich ein hairpin-Konstrukt bei der

Agrobakterien-Transformation insertiert wurde und das heterozygot vorliegenden Kon-

strukt bereits segregiert, und ein Teil der Nachkommen der T1-Generation wieder dem

Wildtyp entspricht. Außerdem könnte hier eventuell auch der Fall vorliegen, dass im

Bezug auf die Aus-prägung des „Siliencing“-Effektes, durch zufällige epigenische

Veränderungen der T-DNA eine heterogene Population der Nachkommen entsteht

(Meza et al. ,2001). Bei den Linien InsHP3 und InsHP7 sind auf der Höhe der 120

kDa-Bande noch sehr schwache und unscharfe Banden zu erkennen, was eventuell

damit im Zusammenhang steht, dass bei dem partiellen Silencing der Effekt nicht

vollständig zum tragen kommt. Ebenso kann es sich hier aber um eine Kreuzreaktion

mit einem anderen Protein handeln, die auf die Verwendung des polyklonalen

Antiserums zurückzuführen ist.

In der Zwischenzeit konnte der „Silencing“-Effekt auch auf der Transkript-Ebene, an-

hand des Northern Blots für das „Manduca-Experiment 4“ (s. 3.2.2) durch erneute Hy-

4 Diskussion

55

bridisierung mit einer IDE-Sonde bestätigt werden. Es wurden nur beim Wildtyp das

IDE-Transkript detektiert, nicht aber in der, für Versuche verwendeten Linie InsHP7.

Durch die Southern-Analyse, unter Verwendung der nptII-Sonde, konnten zwei Grup-

pen von unabhängigen Linien gebildet werden. Die eine beinhaltet die Linien InsHP2,

InsHP3, InsHP6 und InsHP7, die andere die beiden Linien InsHP9 und InsHP11.

Beide Linien weisen ein komplexes Bandenmuster auf, was wahrscheinlich auf

mehrere insertierte T-DNA-Konstrukte zurückzuführen ist.

Die nachfolgende Hybridisierung mit einer Sonde für das IDE-Gen könnte auf das Vor-

handensein eines zweiten Gens für IDE in Tomaten hin, wie dies auch bei Arabidop-

sis thaliana der Fall ist. Allerdings enthält das Arabidopsis-Genom auch ein IDE-ähn-

liche Sequenz, die aber mehrere Exons, einschließlich der katalytischen Domäne, am

5´-Terminus nicht aufweist. Würde auch das Tomaten-Genom ein IDE-ähnliches Gen

aufweisen, so könnte die hier verwendete IDE-Sonde, spezifisch für die 3´-terminale

Sequenz, sowohl diese oder auch ein eventuell vorhandenes 2. IDE-Gen nachweisen.

Die Detektion des für die Transformation verwendeten „hairpin“-Konstruktes kann hin-

gegen ausgeschlossen werden, da dieses die 5´-terminale Sequenz für die kata-

lytische Domäne enthält.

Die zur Überprüfung der Arbeitshypothese durchgeführten Verwundungs-Experimente

zeigten die IDE-defizienten Pflanzen keine oder nur sehr geringfügige Unterschiede in

der Expression des Proteinaseinhibitors II im Vergleich zur Wildtyp-Kontrollgruppe.

Die Reaktion der Pflanzen auf Verwundung ist nicht die selbe nach Insektenfraß. So

kann zum Beispiel bei Tabakpflanzen die Gehalte des Proteinaseinhibitors nach Insek-

tenfraß im Vergleich zu mechanischer Verwundung deutlich erhöht sein , (Lou und

Baldwin, 2003) und bei Kartoffelpflanzen wird das Maximum der Proteinaseinhibitor-

Gehalte nach Fraß von Manduca sexta bereits nach 12 Stunden erreicht (Korth und

Dixon,1997), im Gegensatz zum Maximum nach 24 Stunden bei mechanischer Ver-

wundung. Deshalb wurde auch hier ein „Fress“-Versuche mit Manduca sexta durch-

geführt, der ebenso wie die durchgeführten Verwundungseperimente, keine Unter-

schiede zwischen den Reaktion der IDE-defizienten Pflanzen und der des Wildtyp

zeigen konnte.

Durch diese Ergebnisse konnte die Arbeitshypothese, dass IDE durch den Abbau des

Signalpeptide Systemin zu einer Beendigung der Induktion des Oktadakanoidweges

4 Diskussion

56

verantwortlich ist, nicht bestätigt werden. Wäre allerdings IDE nicht die einzigste Prote-

ase, die Systemin degradiert, so könnte der Ausfall nur eines abbauenden Enzyms

durch die anderen beteiligten Proteasen wieder aufgehoben werden, und eine Änder-

ung der Proteinaseinhibitor-Expression wäre unter diesen Bedingungen nicht zu be-

obachten. So zeigt auch die Subtilase SBT3 aus Tomaten, deren Spaltungsmuster von

Systemin mit der Maldi-TOF-Massenspektrometrie untersucht wurde, eine Schnittstel-

len in Systemin (Huttenlocher, unveröffentlicht). SBT3 konnte im Gegensatz zu IDE

auch bereits im Apoplasten nachgewiesen werden.

Da der Nachweis eines in den Apoplast sezernierten IDEs in Pflanzen noch aussteht,

könnte IDE auch intrazellulär Systemin degradieren. Dieser Mechanismus ist von Pep-

tid- und Proteinhormonen bekannt. So wird zum Beispiel Insulin sowohl extrazellulär

direkt am Rezeptor als auch intrazellulär nach Endocytose des Insulinrezeptors, ein-

schließlich des daran gebundenem Insulin abgebaut. Wobei der Abbau durch IDE

hauptsächlich in Endosomen stattfindet (Duckworth und andere, 1998). Eine eben-

solche Funktion, des intrazellulären Systemin-Degradation von Systemin durch IDE,

wäre mit den Ergebnissen der PI-II-Transkript-Analysen nach Verwundung oder Insek-

tenfraß, sowie auch mit den in vitro Degradierungs-Versuchen von IDE und Systemin

vereinbar.

Obwohl die Versuche mit Manduca sexta im Hinblick auf die Induktion des Oktadeka-

noidweges nicht die erwarteten Ergebnisse liefern konnte, ergaben sich doch durch

die Bioessays interessante Hinweise auf mögliche biologische Prozesse, an denen

LeIDE mitbeteiligt sein könnte.

Die auffällige Verzögerung der Verpuppung von Larven die auf IDE-defizienten Pflan-

zen gefressen hatten, kann aufgrund der oben erwähnten Ergebnisse nicht auf einen

erhöhten Proteinaseinhibitor-Gehalt nicht auf zurückgeführt werden.

Bei holometabolen Insekten wird die Verpuppung durch das Zusammenspiel von

Ecdyson, ein Steroidhormon, und dem Juvenilhormon, das eine isoprenoide Struktur

aufweist gesteuert. Während der Ecdyson-Titer während jedem Larvenstadium an-

steigt, findet eine Verpuppung nur dann statt, wenn der Juvenilhormon-Titer, nachdem

die Larven ein kritisches Gewicht erreicht haben, unter eine bestimmte Schwellen-

grenze absinkt (Nijhout und Williams, 1974). Da die äußeren Bedingungen, wie Tem-

peratur oder Länge der Photoperiode, die auch den Hormonhaushalt der Insekten be-

einflussen können, für alle Versuchstiere gleich waren, muss der Effekt der verzöger-

4 Diskussion

57

ten Verpuppung doch durch die Nahrungsqualität der Wirtspflanzen bedingt sein.

Durch das Silencing könnte es zu einer veränderten Nährstoff-Zusammensetzung

gekommen sein, was sich negativ auf die Wachstumsrate auswirken kann (Li P und

andere, 2003), oder zu einer Anhäufung eines Stoffwechselproduktes das sich auf die

Nahrungsverwertung oder auf den Hormonhaushalt der Insekten auswirken kann.

Auf die Wachstumsrate von Manduca sexta-Larven wirkt sich aber auch ein geringer

Wassergehalt ihrer Nahrung negativ aus (Martin und Van´t Hof, 1988; Woods und

Harrison, 2001). Für das Wachstum der Insekten-Larven ist eine positive Bilanz von

ausgeschiedenem und, fast ausschließlich über die Nahrung, aufgenommenem Was-

ser nötig (Hadley, 1994). Die Menge des ausgeschiedenen Wassers, wird im Darm

durch Entzug von Wasser aus den Exkrement-Pelltets reguliert (Reynolds and

Bellward, 1989), und bei Manduca sexta durch das diuretische Hormon (Mas-DH)

gesteuert (Kataoko und andere, 1989; Audsley und andere, 1993) gesteuert. Wäh-

rend der Durchführung der Versuche mit Manduca sexta im Gewächshaus, wurden

Beobachtungen gemachten, dass die von den auf IDE-defizienten Pflanzen fres-

senden Insekten abgebebenen Ekremente teilweise von deutlich trockenerer Beschaf-

fenheit waren, im Vergleich zu denen von Insekten, die sich von Wildtyp-Pflanzen er-

nährten. Dies könnte eventuell ein Hinweis darauf sein, dass IDE mit an der Regula-

tion des Wasserhaushaltes der Pflanzen beteiligt ist.

Um einen Einblick in die biologische Funktion von LeIDE zu erhalten, wurde nicht nur

die Larvenentwicklung überprüft, sondern auch der gesamte Entwicklungszyklus von

Manduca sexta untersucht. Die Überprüfung von eventuellen Auswirkungen auf die er-

folgreiche Verpuppung, die Geschlechterverteilung, und die Anzahl der abgelegten

Eiern auf Wildtypflanzen führte zu signifikanten Unterschieden zwichen den beiden In-

sektengruppen, die auf Wijldtyp- oder IDE-defizienten Pflanzen gehalten wurden.

Überraschenderweise, zeigten aber weibliche Imagines, die während ihrer kompletten

Larvenzeit von IDE-defizienten Pflanzen gefressen hatten in ihrem Ovipositions-

verhalten eine deutliche Präferenz für Wildtyp-Pflanzen.

Welcher Mechanismus hier zugrunde liegen kann ist unklar. Allerdings ist bekannt,

dass die Larven hinsichtlich der Auswahl ihrer Futterpflanzen eine Art „Prägung“ er-

fahren können. Die Larven von Manduca sexta sind oligophag und auf Arten der Gat-

tung Solanaceae spezialisiert. Frisch geschlüpfte Larven, können sich aber auch von

Pflanzen anderer Gattungen ernähren. Haben die Larven aber einmal von Solana-

ceen-Arten gefressen, werden diese Pflanzenarten in Nahrungs-Auswahlversuchen

4 Diskussion

58

bevorzugt (Jermy und andere, 1967; Schoonhoven, 1967). Diese induzierte Präferenz

geht auch nach mehreren Häutungen der Larven nicht verloren (Jeremy und andere,

1967) und ist auf Indiosid D zurückzuführen, ein Glycosid mit steridorialem Grund-

gerüst, das nur in Solanaceen-Arten vorkommt (del Campo und andere, 2001; del

Campo und Miles 2003). Durch Kontakt mit diesem Stoff findet eine Normierung der

Geschmacks-Rezeptoren statt, die daraufhin verstärkt auf Indiosid D reagieren.

Allerdings vermeiden aber die Imagines eben diese Pflanzen zur Oviposition, auf

denen sie als Larven gefressen hatten.

Bei Manduca sexta gliedert sich der Prozess der Auswahl einer Wirtspflanze zur Ovi-

position in zwei Abschnitte. Zunächst wird aus der Ferne über visuelle und olfak-

torische Reize eine mögliche Wirtspflanze für die Oviposition erkannt und angeflogen.

Nach Kontakt mit der Pflanzenoberfläche wird anhand der Oberflächenstruktur und

des Geschmacks entschieden ob die Pflanze zur Eiablage akzeptiert wird (Schoon-

hoven, 2005).

Das IDE-defizienten Pflanzen für die Oviposition vermieden werden könnte also auf

ein flüchtige organische Verbindungen (VOCs) oder auf Substanzen, die auf der Blatt-

oberfläche vorhanden sind zurückzuführen sein. Substanzen der Blattoberfläche kön-

nen Primärmetabolite, wie Zucker oder Aminosäuren sein, oder Sekundärmetabolite,

die auf weiblichen Insekten eine abstoßende oder anziehende Wirkung zeigen

(Schoonhoven, 2005).

HPL und AOS sind beides Enzyme, die mit an der Synthese von verschiedenen

Substanz-Klassen der VOCs beteiligt. AOS ist ein Enzym des Oktadekanoidweges

und führt zur Synthese von Jasmonaten, zu denen auch die flüchtigen Verbindungen

Methyl-Jasmonsäure oder cis-Jasmon gehören. Ausgehend von der selben Vorstufe

wie AOS, leitet HPL in die Synthese der flüchtigen C6-Aldehyde ein. Eine veränderte

Expression der Gene müsste zu einem veränderten von der Pflanze abgegebenen

Duftprofils führen, und könnte so das Ovipositions-Verhalten der Insekten erklären.

Der Vergleich der Transkriptmengen von HPL und AOS in unverwundeten und ver-

wundeten ide- und Wildtyp-Pflanzen lieferte keinen eindeutigen Unterschied zwischen

den beiden Genotypen. Die unveränderte Expression von HPL in den IDE-defizienten

Pflanzen deutet darauf hin, dass über diesen Weg kurzkettige Aldehyde nicht ver-

stärkt synthetisiert und freigesetzt werden, und somit auch nicht das unterschiedliche

Ovipositionsverhalten der weiblichen Imagines beeinflussen. Allerdings wurde mit HPL

4 Diskussion

59

nur ein mögliches Enzym von vielen untersucht, die für die Synthese von flüchtigen or-

ganischen Verbindungen verantwortlich sind.

Die vergleichbaren Transkriptmengen von AOS bei WT- und ide-Pflanzen, einem En-

zym des Oktadekanoidweges, bestätigen die Ergebnisse der Untersuchung der Ex-

pression des Proteinaseinhibitors, dass IDE nicht an spezifischen Degradation von

Systemin beteiligt ist, und so auch nicht die Syntheserate von Jasmonsäure ver-

ändert.

Die genaue Funktion von LeIDE in planta ist also weiterhin unklar. Ein generelles Bild

von der Auswirkung eines Silencings dieses Gens zu bekommen, könnte eine Micro-

array-Analyse hilfreich sein, die Aufschluss darüber geben würde, in wie weit das

„Silencing“ des IDE-Gens die Regulation anderer Gene beeinflusst. Genauso interes-

sant wie Analyse der differentiellen Genexpression zwischen IDE-defizienten Toma-

tenpflanzen und Wildtyp, wäre hier auch der Vergleich mit Pflanzen die von herbivoren

Insekten befallen sind. Aufgrund von Beobachtungen während der Durchführung der

Versuche mit Manduca sexta, dass IDE-defiziente Pflanzen Probleme mit der Regula-

tion ihres Wasserhaushaltes haben könnten, wäre hier auch die Transkriptom-Analyse

von IDE-defizienten Pflanzen, die unter Trockenstress stehen interessant.

Aufgrund der Ovipositions-Versuche mit Manduca sexta sollte eine Analyse der Zu-

sammensetzung der Substanzen der Blattoberfläche und eine Analyse der flüchtigen

organischen Verbindungen mittels Gas-Chromatographie durchgeführt werden, um

aufzuklären welche Veränderung im Profil der Substanzen zu dem veränderten Ovipo-

sitionsverhalten auf IDE-defizienten Tomatenpflanzen führen. Da die Imagines von

Manduca sexta nacht-aktiv sind und von den Pflanzen während der Licht- oder Dun-

kelphase die flüchtigen volatilen Verbindungen in unterschiedlichen Zusammen-

setzungen abgegeben werden, muss darauf geachtet werden, das die Probennahmen

während der Dunkelphase erfolgt.

Da alle Versuche mit Manduca sexta bis jetzt nur mit einer IDE-defizienten Linie durch-

geführt werden konnten, müssen diese mit einer zweiten, unabhängigen Linie wieder-

holt werden.

Für die Beantwortung der Fragestellung welche Aufgabe IDE in der Pflanze erfüllt,

wäre auch die Analyse von Tomatenpflanzen interessant, die LeIDE überexprimieren.

4 Diskussion

60

Auch das Vorhandensein des möglichen 2. IDE Gens könnte nochmals durch Verwen-

dung einer 5´-terminalen Sonde überprüft werden, und dieses dann gegebenenfalls

sequenziert werden. Und für den Fall, dass mehrere verschiedene Proteasen an der

Steuerung des Oktadekanoidweges durch die Inaktivierung von Systemin beteiligt

sind, könnte die Herstellung von z..B einer ide/sbt3-Doppelmutante und deren Charak-

terisierung interessant sein.

5 Literatur

61

5 Literatur

Affholter JA, Fried VA, Roth RA. (1988) Human insulin-degrading enzyme shares

structural and functional homologies with E. coli protease III. Science 242: 1415-1418.

Arimura G, Kost C, Boland W. (2005) Herbivore-induced, indirect plant defences.

Biochim Biophys Acta 1734(2):91-111.

Audsley N, Coast GM, and Schooley DA. (1993) The effects of Manduca sexta

diuretic hormone on fluid transport by the Malphghian tubules and cryptonephric

complex of Manduxa sexta. J Exp Bio 178: 231-243.

Authier F, Bergeron JJ, Ou WJ. Rachubinski RA, Posn er BI, Walton PA. (1995)

Degradation of the cleaved leader peptide of thiolase by a peroxisomal proteinase.

PNAS 92: 3859-3863.

Bennett RG, Hamel FG, Duckworth WC. (1994) Identification and isolation of a

cytosolic proteolytic complex containing insulin-degrading enzyme and the

multicatalytic proteinase. Biochem Biophys Res Commun 202: 1047-1053.

Bennett RG, Hamel FG, Duckworth WC. (2000) Insulin inhibits the ubiquitin

dependent degrading activity of the 26S proteasome. Endocrinology 141: 2508-2517.

Bergey DR, Howe G & Ryan CA. (1996) Polypeptide signaling for plant defensive

genes exhibits analogies to defense signaling in animals. PNAS: 12053–12058.

Benrey B, Denno RF. (1997) The slow-growth-high-mortality hypothesis: a test using

the cabbage butterfly. Ecology 78:987-999.

Bell E . (2002) Impact of phyto-oxylipins in plant defense. Trends Plant Sci 7(7):315-

22. Review.

5 Literatur

62

Bergey DR, Ryan CA. (1999). Wound and systemin-inducible calmodulin gene

expression in tomato leaves. Plant Mol Biol 40: 815-823.

Camberos MC, Pérez AA, Udrisar DP, Wanderley MI, Cr esto JC. (2001) ATP

inhibits insulin-degrading enzyme activity. Exp Biol Med 226: 334-341.

del Campo ML, Miles CI, Schroeder FC, Mueller C, Bo oker R, Renwick JA. (2001)

Host recognition by the tobacco hornworm is mediated by a host plant compound.

Nature 411: 186-189.

del Campo ML, Miles CI. (2003) Chemosensory tuning to a host recognition cue in

the facultative specialist larvae of the moth Manduca sexta. J Exp Biol 206: 3979-90.

De Moraes CM, Mescher MC, Tumilson JH. (2001) Caterpillar-induced nocturnal

plant volatiles repel conspecific females. Nature 410: 577-580.

Dicke, M. (1999) Evolution of induced indirect defence of plants. In: R. Tollrian & C.D.

Harvell (eds.) The Ecology and Evolution of Inducible Defenses, pp. 62-88. Princeton

University Press.

Duckworth WC. (1978) Insulin and glucagon binding and degradation by the kidney

cell membrane. Endocrinology 102: 1766-1774.

Duckworth WC. (1979) Insulin degradation by liver cell membranes. Endocrinology

104: 1758-1764.

Duckworth WC. Bennett RG, Hamel FG. (1994) A direct inhibitory effect of insulin

ona cytosolic proteolytic complex containing insulin-degrading enzyme and multi-

catalytic proteinase. J Biol Chem 269: 24575-24580.

Duckworth WC, Bennett R, Hamel FG. (1998) Insulin degradation: Progress and

potential. Endocr Rev 19: 608-624.

Duffey SS, Stout MJ. (1996) Antinutritive and toxic components of plant defense

against insects. Arch Insect Biochem Physiol 32: 3-37.

5 Literatur

63

Eigenbrode SD, Ding H, Shiel P, Berger PH. (2002) Volatiles from potato plants

infected with potato leafroll virus attract and arrest the virus vector, Myzus persicae

(Homoptera: Aphididae). Proc. R. Soc.London 269:455-460.

Fan X, Mattheis JP, Fellman JK. (1998) A role for jasmonates in climacteric fruit

ripening. Planta 204: 444-449

Farris W, Mansourian S, Chang Y, Lindsley L, Eckman EA., Frosch MP, Eckman

CB, Tanzi RE, Selkoe DJ, Guénette S. (2003) Insulin-degrading enzyme regulates

the levels of insulin, amyloid β-protein, and the β-amyloid precursor protein intracellular

domain in vivo. PNAS 100: 4162-4167.

Felton GW, Donato KK, Del Vecchio RJ, Duffey SS. (1989) Activation of foliar

oxidases by insect feeding reduces nutritive quality of dietary protein of foliage for

noctuid herbivores. J Chem Ecol 15: 2667–2693.

Frasson D, Schaller A. (2001) Induction of wound response gene expression by

ionophores. Planta 212: 431-435.

Goldfine ID, Williams JA, Bailey AC, Wong KY, Iwamo to Y, Yokono K, Baba S,

Roth RA. (1984) Degradation of insulin by isolated mouse pancreatic acini. Evidence

for cell surface protease activity. Diabetes 33: 64-72.

Green TR, Ryan CA. (1972) Wound-induced proteinase inhibitor in plant leaves: a

possible defense mechanism against insects. Science 175: 776-777.

Gustafson G, & Ryan C. (1976) Specificity of protein turnover in tomato leaves.

Accumulation of proteinase inhibitors, induced with the wound hormone, PIIF.

J Biol Chem 251(22):7004-10.

Häggström H, Larsson S. (1995) Slow larval growth on a suboptimal willow results in

high predation mortality in the leaf beetle Galerucella lineola. Oecologia 104:308-315

Hamel FG, Mahoney MJ, Duckworth WC. (1991) Degradation of intraendosomal

insulin by insulin-degrading enzyme without acidification. Diabetes 40, 436-443.

5 Literatur

64

Hamel FG, Bennett RG, Duckworth WC. (1998) Regulation of the multicatalytic

enzyme activity by insulin and the insulin-degrading enzyme. Endocrinology 139:

4061-4066.

Hamel FG, Upward JL, Bennett RG. (2003) In vitro inhibition of insulin-degrading

enzyme by long chain fatty acids and their coenzyme A thioesters. Endocrinology

144:2404-2408.

Holley SH, Yalamanchili RD, Moura DS, Ryan CA, Stra tmann JW. (2003)

Convergence of Signaling Pathways Induced by Systemin, Oligosaccharide Elicitors,

and Ultra-violet-B Radiation at the Level of Mitogen-Activated Protein Kinases in

Lycopersicon peruvianum Suspension-Cultured Cells. Plant Physiol. 132: 1728–1738.

Howe GG, Lee GI, Itoh A, Li L, DeRocher EA. (2000) Cytochrome P450-Dependent

Metabolism of Oxylipins in Tomato. Cloning and Expression of Allene Oxide Synthase

and Fatty Acid Hydroperoxide Lyase. Plant Physiol 123: 711-724

Howe G. (2005) Jasmonates as Signals in the Wound Response. J Plant Growth

Regul. 23:223-237.

Huet Y. (2004) Functional Analysis of Insulin-Degrading Enzyme in Higher Plants

Diss. ETH N° 15732.

Jermy T, Hanson EF, Dethier VC (1968) Induction of specific food preference in

lepidopterous larvae Entomol Exp Appl 11 1570-7458 (Online)

Karban R, Agrawal AA, & Mangel M. (1997). The benefits of induced defenses

against herbivores. Ecology 78:1351 - 1355.

Kataoka H, Troetschler RG, Li JP, Kramer SJ, Carney RL and SchooleyDA . (1989)

Isolation and identification of a diuretic hormone from the tobacco hornworm, Manduca

sexta. PNAS 86: 2976-2980.

A. Kessler, R. Halitschke, C. Diezel, I. T. Baldwin. (2006) Priming of plant defense

responses in nature by airborne signaling between Artemisia tridentata and Nicotiana

attenuata. Oecologia, 1-13.

5 Literatur

65

Korth K, Dixon RA . (1997) Evidence for Chewing Insect-Specific Molecular Events

Distinct from a General Wound Response in Leaves. Plant Physiology 115: 1299-

1305.

Lei Li, Chuanyou Li, Gyu In Lee, Gregg A. Howe (2002) Distinct roles for jasmonate

synthesis and action in the systemic wound response of tomato. PNAS 99: 6416–

6421.

Li L, Zhao Y, McCaig BC, Wingerd BA, Wang J, Whalon ME, Pichersky E, Howe

GA (2004)The Tomato Homolog of CORONATINE-INSENSITIVE1 Is Required for the

Maternal Control of Seed Maturation, Jasmonate-Signaled Defense Responses, and

Glandular Trichome Development. Plant Cell 2004 16: 126–143.

Li P und andere , (2003) Effects of dietary variation on growth, composition, and

maturation of Manduca sexta (Sphingidae: Lepidoptera).

J Insect Physiol 49:293-306.

Lou Y, Baldwin IT. (2003) Manduca sexta recognition and resistance among

allopolyploid Nicotiana host plants PNAS 100:14581–14586.

McCloud ES, Baldwin IT. (1997) Herbivory and caterpillar regurgitants amplify the

wound-induced increases in jasmonic acid but not nicotine in Nicotiana sylvestris.

Planta 203: 430-435.

McGurl B, Pearce G, Orozco-Cárdenas ML, Ryan CA. (1992) Structure, expression,

and antisense inhibition of the systemin precursor gene. Science 225: 1570-1573.

McGurl B, Orozco-Cardenas M, Pearce G, Ryan CA. (1994) Overexpression of the

prosystemin gene in transgenic tomato plants generates a systemic signal that

constitutively induces proteinase inhibitors synthesis. PNAS 91: 9799-9802.

Martin, Van´t Hof (1988) The cause of reduced growth of Manduca sexta larvae on a

low-water diet: increased metabolic processing costs or nutrient limitation. Journal of

Insect Physiology 34:515-525.

5 Literatur

66

Mattson, W. J. (1980. Herbivory in relation to plant nitrogen content. Ann Rev Ecol

Syst 11: 119-161.

T Meindl, T Boller, and G Felix. (1998). The plant wound hormone systemin binds

with the N-terminal part to its receptor but needs the C-terminal part to activate it. Plant

Cell 10(9): 1561–1570.

Pauw B, Memelink J. (2005) Jasmonate-responsive gene expression J Plant Growth

Regul 23: 200-210

Meza TJ, Kamfjord D, Hakelien AM, Evans I, Godager L H, Mandal A, Jakobsen

KS, Aalen RB . (2001) The frequency of silencing in Arabidopsis thaliana varies highly

between progeny of siblings and can be influenced by environmental factors.

Transgenic Res. 10(1):53-67.

Moyen C, Hammond-Kosack KE, Jones J, Knight, MR, Jo hannes E. (1998)

Systemin triggers an increase of cytoplasmic calcium in tomato mesophyll cells: Ca2+

mobilization from intra- and extracellular compartments. Plant Cell Envir. 21: 1101-

1111.

Muller., Baumeister H, Buck F, Richter D. (1991) Atrial natriuretic peptide (ANP) is a

high-affinity substrate for rat insulin-degrading enzyme. Eur J Biochem 202: 285-292.

Narvaez-Vasquez J, Florin-Christensen J, Ryan CA . (1999) Positional specificity of

a phospholipase A2 activity induced by wounding, systemin, and oligosaccharide

elicitors in tomato leaves. Plant Cell 11:2249–2260.

Nijhout F, Williams CM. (1974) Control of Moulting and Metamorphosis in the

tabacco hornworm (L.): cessation of juvenile hormone secretion as a trigger for

pupation. J. Exp. Biol., 6: 493-501

Ogawa W, Shii K, Yonazawa K, Baba S, Yokono K. (1992) Affinity purification of

insulin-degrading enzyme and its endogenous inhibitor from rat liver. J Biol Chem

267:1310-1316.

5 Literatur

67

Orozco-Cardenas M, McGurl B, Ryan CA. (1993) Expression of an antisense

prosystemin gene in tomato plants reduces resistance toward Manduca sexta larvae.

Proc Natl Acad Sci USA 90, 8273-8376.

Pearce G, Stydom D, Johnson S, Ryan CA . (1991) A polypeptide from tomato

leaves induces wound-inducible proteinase inhibitor proteins. Science 253: 895-898.

Pengyun L, Wen-Liang K, Mohammed Y, Rosner MR, Wei- Jen Tang WJ. (2006)

The C-terminal domain of human insulin degrading enzyme is required for dimerization

and substrate recognition . Biochem Biophys Res Commun 343 1032–1037.

Perlman RK, Gehm BD, Kuo WL, Rosner MR. (1993) Functional analysis of

conserved residues in the active site of insulin-degrading enzyme. J Biol Chem 29,

21538-21544.

Plunkett G, Senear D, Zuroske G, Ryan C. (1982) Proteinase inhibitors I and II from

leaves of wounded tomato plants: purification and properties. Arch. Biochem. Biophys.

213, 456-462.

Qui WQ, Walsh DM, Ye Z, Vekrellis K., Zhang J, Podl isny M.B, Rosner MR, Safavi

A, Hersh LB, Selkoe DJ. (1998) Insulin-degrading enzyme regulates extracellular

levels of amyloid β-protein by degradation. J Biol Chem 273, 32730-32738.

Rawlings ND, Barrett AJ. (1991) Homologues of insulinase, a new superfamily of

metalloendopeptidases. Biochem J 275, 389-391.

Rawlings ND, Tolle DP, Barrett AJ (2004) MEROPS: the peptidase database.

Nucleic

Acids Res 1, Database issue: D160-4

Reymond P. (1998) Farmer EEJasmonate and salicylate as global signals for

defense gene expression. Curr Opin Plant Biol. 1(5):404-11. Review.

Reynolds SE, Bellward K. (1989) Water Balance in Manduca sexta caterpillars water

recycling from the rectum. J. exp. Biol. 141, 33-45.

5 Literatur

68

Roda A, Halitschke R, Steppuhn A, Baldwin IT. (2004) Individual variability in

herbivore-specific elicitors from the plant's perspective. Mol Ecol 13(8):2421-33.

Roth RA, Mesirow ML, Yokono K, Baba S. (1984) Degradation of insulin-like growth

factors I and II by a human insulin degrading enzyme. Endocr Res 10, 101-112.

Safavi A, Miller BC, Cottam L, Hersh LB. (1996) Identification of γ-

endorphingenerating

enzyme as insulin-degrading enzyme. Biochemistry 35, 14318-14325.

Saric T, Muller D, Seitz HJ, Pavelic K. (2003) Non-covalent interaction of ubiquitin

with insulin-degrading enzyme. Mol Cell Endocrinol 204, 11-20.

Schaller A. (1998) Action of proteolysis resistant systemin analogues in wound-

signalling. Phytochemistry 47: 605-612.

Schaller F, Schaller A, Stintzi A. (2005) Biosynthesis and Metabolism of

Jasmonates. J Plant Growth Regul. 23: 179-199.

JM Scheer, CA Ryan. (1999) A 160-kD systemin receptor on the surface of

lycopersicon peruvianum suspension-cultured cells. Plant Cell 11(8): 1525–1536.

Scheer JM, Ryan CA jr. (2002) The systemin receptor SR160 from Lycopersicon

peruvianum is a member of the LRR receptor kinase family.*Proc Natl Acad Sci U S A.

99(14): 9585–9590.

Schoonhoven LM (1990) Host-marking pheromones in Lepidoptera, with special

reference to two Pieris spp. Journal of Chemical Ecology 16: 3043–3052:

Shii K, Yokono K, Baba S, Roth RA. (1986a) Purification and characterization of the

insulin-degrading enzyme from human erythrocytes. Diabetes 35, 675-683:

Schoonhoven LM. (1967) Loss of hostplant specificity by Manduca sexta after rearing

on an artificial diet. Entomol Exp Appl 10: 270-272

5 Literatur

69

Schoonhoven LM, van Loon JJA, and Dicke M . (2005) Insect-Plant Biology, Second

Edition Oxford University Press USA

Strassner J. (2000) Identifizierung Systemin-spaltender Proteasen und Charakteri-

sierung der 12-Oxo-Phytodiensäure Reduktase aus Lycopersicon esculentum. ETH

Diss. 13833

Stratmann JW, Ryan CA (1997) Myelin basic protein kinase activity in tomato leaves

is induced systemically by wounding and increases in response to systemin and oligo-

saccharide elicitors. Proc Natl Acad Sci USA 94: 11085–11089

Taylor AB, Smith BS., Kitada S, Kojima K, Miyaura H , Otwinowski Z, Ito A,

Deisen-hofer J. (2001) Crystal structures of mitochondrial processing peptidase

reveal the mode for specific cleavage of import signal sequences. Structure 9, 615-625

Thaler JS, Fidantsef AL, Bostock RM. (2002) Antagonism between jasmonate- and

salicylate-mediated induced plant resistance: effects of concentration and timing of

elicitation on defense-related proteins, herbivore, and pathogen performance in

tomato. J Chem Ecol 28(6):1131-59.

Vekrellis K, Ye Z, Qiu WQ, Walsh D, Hartley D, Ches neau V, Rosner MR, Selkoe

DJ (2000) Neurons regulate extracellular levels of amyloid β- protein via proteolysis by

insulin-degrading enzyme. J Neurosci 20, 1657-1665

Vick BA, Zimmermann DC . (1984) Biosynthesis of jasmonic acid by several plant

spicies. Plant Physiol. 75:458-461.

Woods HA, Harrison JF .(2001)The beneficial acclimation hypothesis versus

acclimation of specific traits: physiological change in water-stressed Manduca sexta

caterpillars. Physiol Biochem Zool 74(1):32-44.

Wu J; Hettenhausen C; Baldwin IT . (2006) Evolution of proteinase inhibitor defenses

in North American allopolyploid species of Nicotiana. Planta 1432-2048 (Online)

5 Literatur

70

Xu LH, Liu FQ, Lechner E, Genschik P, Crosby WL, Ma H, Peng W, Huang DF, Xie

DX. (2002). The SCFCOI1 ubiquitin-ligase complexes are required for jasmonate

response in Arabidopsis. Plant Cell 14:1919–1935.

Yokono K, Imamura Y, Sakai H, Baba S . (1979) Insulin-degrading activity of plasma

membranes from rat skeletal muscle: its isolation, characterization, and biologic

significance. Diabetes 28, 810-817

Zavala JA, Baldwin IT . (2004) Fitness benefits of trypsin proteinase inhibitor

expression in Nicotiana attenuata are greater than their costs when plants are

attacked. BMC Ecol. 4: 11.

Abkürzungen

71

Abkürzungen

Abb. Abbildung

AOS Allenoxidsynthase

AOC Allenoxidcyclase

bp Basenpaare

BSE Bovine Spongiform Encephalopathy

°C Grad Celsius

cDNA komplementäre DNA

CTAB Cetyltrimethylammoniumbromid

ddH2O doppelt destilliertes H2O

DEPC Diethylpyrocarbonat

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Desoxyribonukleinsäure

dNTP Desoxynukleotidtriphosphat

DTT Dithiothreit

ECL Enhanced Chemiluminescence

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

g Gramm

h Stunde

IDE Insulin-degradierendes Enzym (Syn.: Insulinase)

InsHP Insulinase „hairpin“-Konstrukt

kDa Kilo Dalton

l Liter

LB Left Border

LOX Lipoxygenase

Le Lycopersicon esculentum

µ mikro (10-6)

m milli (10-3)

M molar

min Minute

ml Milliliter

mRNA Messenger-RNA

Abkürzungen

72

nptII Gen für die Neomycin-Phosphotransferase

OPDS Oxophytodiensäure

MS Murashige & Skoog Medium incl. Vitamins

PCR Polymerase Chain Reaction

PVP Polyvinylpyrrolidon

RB Right Border

RNA Ribnukleinsäure

RNase Ribonuclease

rpm rounds per minute

RT Raumtemperatur

RT-PCR Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction

SDS Natriumdodecylsulfat

Tab. Tabelle

TAE Triacetat-EDTA

TNP tri-Nartriumphosphat

TBS Tris-Buffered Saline

TEMED Tetramethyläthylendiamin

Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan

Tween20 Polyoxyethylensorbitanmonolaurat

U Einheit

WT Wildtyp

74

Mein Dank gilt ...

... Herrn Professor Dr. Andreas Schaller für die Vergabe dieses faszinierenden

Themas

... Herrn Professor Dr. Nicolaus von Wirén für die Zweitkorrektur

... ganz besonders Dr. Yoann Huet für die intensive Betreuung und die Weitergabe

seines Wissens

... allen im Labor für das angenehme Arbeitsklima und die praktische Unterstützung

... allen Mitarbeitern des Gewächshauses für die Pflege meiner Pflanzen und die

Tolerierung meiner Insekten

... meinen Eltern, Anni und Peter, die mir dieses Studium überhaupt ermöglicht haben

... meinem guten Freund Mark Schätzle, der mir bei Computerproblemen aller Art und

auch sonst zur Seite stand

… Uli Merkel für die Durchhalteparolen am Telefon

… und Yannic, ohne dessen „Lehrstunden“ in „Makro“-Biologie ich mein Interresse für

Biologie auf molekularer Ebene nie entdeckt hätte. Und natürlich für die selbstge-

machte Nudelsuppe!

74

Eidesstattliche Erklärung

Ich versichere hiermit, dass ich die vorliegende Diplomarbeit selbständig angefertigt,

keine anderen als die angegebenen Hilfsmittel benutzt und sowohl wörtliche, als auch

sinngemäß entlehnte Stellen als solche kenntlich gemacht habe.

Die Arbeit wurde in gleicher oder ähnlicher Form noch keiner anderen Prüfungsbe-

hörde vorgelegt und auch nicht veröffentlicht.

Hohenheim, 30.05.2006

Molekulare Charakterisierung von IDE- defizienten ... · Universität Hohenheim Institut für...

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