Molekulare Diagnostik beimMultiplen Myelom

Dr. Dirk HoseSektion Multiples Myelom

Leiter Labor für Myelomforschung4th Heidelberg Myeloma Workshop

27.04.2013

if you know your enemies and know yourself, you will not be imperiled in a hundred battles;

if you do not know your enemies but do know yourself, you will win one and lose one;

if you do not know your enemies nor yourself, you will be imperiled in every single battle.

Sun Tzu et al., 6. Jh v. Chr.

1. Einleitung: Molekulare Diagnostik

2. Interphase Fluoreszenz‐in‐situ‐Hybridisierung

3. Genexpressionsanalysen & Report (GEP‐R)

4. Molekulare Diagnostik & Therapie‐Paradigmen

Übersicht

1. Einleitung

aCGH

mRNA

GEP

DNA

iFISH

Zellen miRNA

miRNomeWGS

DNA

KM‐Aspirat

MNCMNC

Ficoll

RNADNA

WBM

NH4‐Lyse

Zellkultur (BMSCs)KM Serum

KM Ausstrich

MNCFACS 

CD14

MMC

CD15

TC

MACS MMC

OC

CompoundExposition

MSC

OB

27.04.2013n = 3991

Molekulare-Diagnostik – Wie & Was?Knochenmarkpunktion beim Multiplen Myelom•60‐80 ml Knochenmark aus Beckenkamm •Knochenmarkausstriche (Diagnose MM, CR) •Aspirat für Aufreinigung

Myelomzellaufreinigung (CD138‐Sortierung)  „80%“

Molekulare Diagnostik (in klinischer „Routine“)•Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) Veränderung einzelner chromosomaler Regionen

•Genexpressionsanalysen („Gene expression profiling“, GEP) Veränderung der Expression „aller“ (ca. 30.000) Gene in Myelomzellen

Molekulare Diagnostik (in klinischen Studien):•Minimale Resterkrankung (MRD) Kombi FLC/FACS/ASO‐PCR•miRNA‐Profiling Veränderung regulatorischer RNAs•array‐CHG Veränderungen der Kopienzahl

Molekulare Diagnostik (einzelne Patienten):•DNA‐Sequenzierung (WGS,WES)  Punktmutationen, Kopien, TL•RNA‐Sequenzierung alle Transkripte, Fusionstranskripte

Molekulare-Diagnostik – Warum?

Prognose•iFISH (t(4;14), del17p, 1q21, [t(14;16)])•Globale Genexpressionsanalysen „GEP“ (Microarrays)

‐ Proliferation (Genexpressions‐basiert)‐ Risiko‐Score (UAMS, IFM)‐ prognostisch relevante Gene (Aurora‐kinase, IGF1R)

Klinische Konsequenz•iFISH: ‐ t(4;14)  Chemotherapie + Bortezomib

‐ del17p  längere Bortezomib‐Gabe (Erhaltung)•GEP: UAMS‐Niedrigrisiko und del17p  TT3 (Einzelfall)•risikoadaptierte Therapie (Zukunft)•personalisierte Therapie z.B. Aurora‐Kinase (Zukunft)

Wissenschaftliche Fragestellungen•Pathogenese des Myeloms •Neue therapeutische Zielstrukturen

Plasmazellaufreinigungen in der MM5‐Studie

n = 504

in %

6,55 %

2. Interphase Fluoreszenz in situ Hybridisierung

Interphase Fluoreszenz in situ Hybridisierung

5‘

3‘

5‘

3‘

Einzelstrang DNA

DNA ‐ SondeFluoreszenz‐Farbstoff

• (Myelom‐) Zellen auf einen Objektträger spinnen

• In situ (= auf dem Objektträger):

• Denaturierung  (Aufspaltung)  der  doppelsträngigen  DNA  in einzelsträngige DNA ermöglicht:

• Hybridisierung  der  interessierenden  Region  mit  einer  für  diese spezifischen  „DNA‐Sonde“,  die  mit  einem  Fluoreszenz‐Farbstoff gekoppelt ist. 

• Detektion: Fluoreszenz‐Mikroskopie

t(4;14) und Bortezomib: HD4‐Studie

Sonneveld et al., JCO 2012

del17p13: schlechte Prognose z.T. durch längere Bortezomib-Gabe aufgehoben

del17p13 und Bortezomib: HD4‐Studie

Neben et al., Blood 2012

93,8 %

n = 461

iFISH in der MM5‐Studie

3. Genexpressionsanalysen (GEP)

Affymetrix

GEP‐Hochrisiko‐Scores / Proliferation & Prognose

Hose et al., Haematologica 2011

P=.03IFM‐HRkein HR

P=.001

IFM‐HRkein HR

P=.009

UAMS‐HRkein HR

P=.008UAMS‐HRkein HR

P=.002

GPIhigh

GPImedium

GPIlow

P=.002

GPIhigh

GPImedium

GPIlow

Ereignisfreies Überleben

Gesamt‐überleben

Expression therapeutischer Zielgene

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Months

Sur

viva

l Pro

babi

lity

129 105 89 69 57 47 38 29 18 11 5 1 0

39 32 20 14 9 5 3 2 1 1 1 1

0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66

AURKA absentAURKA present

P=.003

Aurora-A absentAurora-A present

Ereignisfreies Überleben

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Months

Sur

viva

l Pro

babi

lity

0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72

129 122 113 102 92 85 73 60 44 30 13 5 1 0

39 35 29 21 18 12 7 6 4 2 1 1

AURKA absentAURKA present

P=.03

Aurora-A absentAurora-A present

Gesamtüberleben

Hose et al., Blood 2009

Aurora-Kinase A

1. therapeutisches Ziel2. prognostischer Faktor

Genexpressionsanalysen in der MM5‐Studie

Stand: 11.10.2012

n = 471

83 %

Gene‐Expression Report (GEP‐R)

Meißner et al., Clin Cancer Res 2011

Beispiel

Patient: *1968

• Shaughnessy‐Score (UAMS): Hochrisiko

• Decaux‐Score (IFM): Niedrigrisiko

• GPI: mittleres Risiko

• ISS‐Stadium: 1

• Translokation t(4;14):  ja

Vielzahl prognostischer  Faktoren macht es  im  klinischen Alltag schwierig, eine  zusammenfassende prognostische Einschätzung abzugeben:

Integration  validierter  genexpressionsbasierter  und  klinisch prognostischer Faktoren in einem prognostischen Score:

• UAMS‐Hochrisiko‐Score (Shaughnessy et al.) 

• IFM‐Hochrisiko‐Score (Decaux et al.)

• GPI (Hose et al.)

• ISS‐Stadium

• Translokation t(4;14)

• AURKA und IGF1R

HM‐Metascore

Meißner et al., Clin Cancer Res 2011

P<0.001

low riskmedium risk high risk

19 %

61 %

89 %

Gesamtüberleben

4. Therapie‐Paradigmen

Reexposition

Keats et al., Blood 2012

ZusammenfassungPrognose:• iFISH (t(4;14), del17p, 1q21, [t(14;16)]), [aCGH]• GEP (Microarrays) [miRNA]

‐ Proliferation (Geneexpressions‐basiert)‐ Risiko‐Scores (UAMS, IFM)‐ Prognostisch relevante Gene (Aurora‐kinase A, IGF1R…)

Personalisierte Therapie – therapeutische Konsequenzen:•iFISH: ‐ t(4;14)  Chemotherapie + Bortezomib

‐ del17p  längere Bortezomib‐Gabe (Erhaltung)• GEP: UAMS‐Niedrigrisiko und del17p  TT3 (Einzelfall)

Therapieparadigmen – therapeutische Konsequenzen:•Reexposition im 2. Rezidiv nach Primärtherapie denkbare Option

In Zukunft?• iFISH & aCGH• GEP•MRD •Sequenzierung

Vielen Dank

• Anja Seckinger

• Tobias Meißner

• Edith Daum

• Maria Dörner

• Katrin Heimlich

• Gabriele Hoock

• Ewelina Nickel

• Thorsten Oberle

• Sibylle Seyfried

• Hartmut Goldschmidt

• Thomas Hielscher

• Axel Benner

• Uta Bertsch

• Jana Schlenzka

• Barbara Hügle‐Dörr

• Véronique Pantesco

• Bernard Klein

• Michaela Brough

• Anna Jauch

iFISH • W. Huber

• J. Gehring

• J. Zimmermann

• V. Benes

• Hanno Glimm