Molekulare Diagnostik Immunoassays -...

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Molekulare Diagnostik 1 Institute for Genomcs and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Andreas Prokesch Immunoassays http://www.sumanasinc.com/webcontent/anisamples/molecularbiology/ELISA.html Fanden erstmal in den 50er Jahren Verwendung Zuerst nur radioaktive Markierungen für Immunoassays Ab den 70er Jahren auch nicht-radioaktive Assays Klassifizierung der Immunoassays wie folgt: RIA (RadioImmunoAssay) FIA (FloureszentImmunoAssay) IRMA (ImmunoRadioMetricAssay) ILMA (ImmunoLuminoMetricAssay) ELISA (EnzymeLinkedImmunoSorbentAssay) Immuno-PCR

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Molekulare Diagnostik

1Institute for Genomcs and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Andreas Prokesch

Immunoassayshttp://www.sumanasinc.com/webcontent/anisamples/molecularbiology/ELISA.html

• Fanden erstmal in den 50er Jahren Verwendung• Zuerst nur radioaktive Markierungen für Immunoassays• Ab den 70er Jahren auch nicht-radioaktive Assays

• Klassifizierung der Immunoassays wie folgt:

RIA (RadioImmunoAssay)FIA (FloureszentImmunoAssay)IRMA (ImmunoRadioMetricAssay)ILMA (ImmunoLuminoMetricAssay)ELISA (EnzymeLinkedImmunoSorbentAssay)Immuno-PCR

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Definition

• Antigen– vom Körper als fremd erkannter Stoff, der

eine Reaktion des Immunsystems auslöst• Antikörper

– die von B-Lymphozyten u. Plasmazellen als Reaktion auf ein Antigen gebildeten Immunglobuline

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Antigen-Antikörper Interaktion

Bindungen:• Wasserstoffbdgen• Ionisch• Hydrophobe Interaktionen• Van der Waals Kräfte

Viele schwache Bindungen ergeben starke Bindung bei hoher Komplimentarität

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Festphasenkopplung

• Feste Phase: Boden einer Microtiterplatte

• Flüssige Phase enthält Analyt

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RIA (RadioImmunoAssay)Markiertes Antigen tritt in Kompetition mit unmarkiertem Antigen (zu analysierende Probe)um Bindungsstelle am Antikörper. Signal ist indirekt proportional der Konzentration vom unmarkierten Antigen.

FIA (FloureszentImmunoAssay)Analog RIA, aber floureszenzmarkiert.

Analog RIA, aber enzymmarkiert.

EIA (EnzymeImmunoAssay)

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IRMA (ImmunoRadioMetricAssay)Markierte Antikörper binden an Antigen, Signal ist damit direkt proportional der Konzentration von Antigen in der zu analysierenden Probe.

ILMA (ImmunoLuminoMetricAssay)Analog IRMA, aber luminiszenzmarkiert.

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ELISA(EmzymeLinkedImmunoSorbentAssay)

Dient dem Nachweis vonAntigenen

AntikörpernHaptenen

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ELISA: Prinzip Sandwich

• Festphasen-gekoppelter AK (erster AK)• Nachzuweisendes Antigen bindet an diesen 1. AK • Antigen wird mittels Enzym markiertem AK (2. AK) nachgewiesen• Als Enzyme dienen

HRP (HorseRadishPeroxidase)Alkalische Phosphatase

• Gebundene Enzymaktivität wird über Substratumsatz vermessen • Substrat wird gemeinsam mit löslichem Chromogen angeboten (dieses

ist anfänglich farblos und wird durch den Substrat-umsatz zu int. gefärbter, spektroskop. auswertbarer Form)

• Direkte Proportionalität zw. unbekannter Probe und Farbumsatz

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Elisa-Sandwich-Testprinzip

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Elisa-Sandwich-Testprinzip

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Kompetitiver ELISA• Hauptsächlich zum Nachweis von Haptenen wie Steroidhormonen (sind

zu klein um zwei AK zu binden)

Feste Phase wird/ist mit AK beschichtetZugabe von Tracer und Hapten (unbekannte Probe)

-Tracer = enzymmarkiertes Hapten, wird zu jeder Probe in gleicher Menge beigegeben.-Umso mehr nachzuweisendes Hapten in der Probe ist, umso weniger Tracer wird an die Festphase gebunden (Kompetition).

SubstratzugabeTracer setzt Substrat zu Farbstoff um. Umso weniger Tracer umso weniger Farbumsatz, umso mehr Hapten ist in der Probe.

• Farbe und Probenmenge sind indirekt proportional!!!!• Nachteil: Überschuß an Tracer wirkt sich negativ auf Empfindlichkeit aus!!

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Kompetitiver ELISA

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Immuno-PCR• Verbindet Spezifität von Immunoassays mit Sensivität

von PCR• 100-10.000-fach sensitiver als ELISA• Detektionslimit: fg/ml• Für „low-copy-viruses“• Noch nicht im

klinischen Einsatz

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Beispiele• Blut:

HIV1 und HIV2 (Anwesenheit von Anti-HIV Antikörper)Hepatitis C (Anwesenheit von Antikörpern)Hepatitis B (Nachweis von Antikörper und viralem Antigen)

• Hormone:SchwangerschaftshormonLH (Bestimmung des Eisprungs)TSH, T3 und T4 (Thyroidfunktion)Anabol. Steroide, Sportler: Doping Test

• InfektionsdetektionSexuell übertragbare Erreger (HIV, Syphilis, Chlamydien)Hepatitis B und CToxoplasmose

• Allergene in Lebensmittel und Hausstaub• Rheumatische Faktoren (Autoimmunantikörper)• Toxine im Essen• Drogen: Kokain, Opiate, Marihuana (9-Tetrahydrocannabinol)