Molekulare Identifizierung und Charakterisierung der ... Allen voran danke ich meinem Doktorvater...

download Molekulare Identifizierung und Charakterisierung der ... Allen voran danke ich meinem Doktorvater Prof

of 127

  • date post

    02-May-2020
  • Category

    Documents

  • view

    0
  • download

    0

Embed Size (px)

Transcript of Molekulare Identifizierung und Charakterisierung der ... Allen voran danke ich meinem Doktorvater...

  • Molekulare Identifizierung und Charakterisierung

    der Flavin-abhängigen Monooxygenasen in

    verschiedenen Pyrrolizidin-Alkaloid-adaptierten

    Insekten

    Dissertation

    zur Erlangung des Doktorgrades

    an der

    Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät

    der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel

    vorgelegt von

    LINZHU WANG

    Kiel, 2012

  • Gutachter: Professor Dr. Dietrich Ober

    Prüfer: Professor Dr. Axel J. Scheidig

    Prüfer: Professor Dr. Wolfgang Bilger

    Tag der mündlichen Prüfung: 05. Februar 2013

    Zum Druck genehmigt: 05. Februar 2013

  • I

    Vorveröffentlichungen der Dissertation

    Teilergebnisse aus dieser Arbeit wurden mit Genehmigung der Mathematisch-

    Naturwissenschaftlichen Fakultät, vertreten durch den Mentor der Arbeit, in

    folgenden Beiträgen vorab veröffentlicht:

    Publikationen

    Sven Sehlmeyer, Linzhu Wang, Dorothee Langel, David G. Heckel, Hoda

    Mohagheghi, Georg Petschenka, Dietrich Ober (2010). Flavin-Dependent

    Monooxygenases as a Detoxification Mechanism in Insects: New Insights from

    the Arctiids (Lepidoptera). PLoS ONE 5(5): e10435.

    Linzhu Wang, Till Beuerle, James Timbilla, Dietrich Ober (2012).

    Independent recruitment of a flavin-dependent monooxygenase for safe

    accumulation of sequestered pyrrolizidine alkaloids in grasshoppers and moths.

    PLoS ONE 7(2): e31796.

    Tagungsbeiträge

    Linzhu Wang, Dietriech Ober: Anpassungsstrategie der afrikanischen Harlekin-

    Heuschrecke (Zonocerus variegatus) an toxische Pyrrolizidin-Alkaloide;

    „Aktuelle Entwicklungen in der Naturstoff-Forschung“ - 20. Irseer Naturstofftage

    der DECHEMA e.V.- 20-22 Feb. 2008, Irsee.

    Linzhu Wang, Dietriech Ober: The complex relationship between specialized

    insects and plants containing pyrrolizidine alkaloids; BT07-125 years Deutsche

    Botanische Gesellschaft – Botanical Congress, 03-07 Sep. 2007, Hamburg.

  • II

    Linzhu Wang, Dietriech Ober: Molecular evolutionary adaption of insects to

    pyrrolizidine alkaloid containing plants; SIP13-13th Symposium on Insect-Plant

    Relationships, 29 July-02 August 2007, Uppsala Sweden.

    Linzhu Wang, Dietriech Ober: Molecular evolution of Senecionine-N-Oxygenase

    of insects adapted to plants containing pyrrolizidine alkaloids; 23rd ISCE Annual

    Meeting of the International Society of Chemical Ecology, 22-26 July 2007,

    Jena.

    Linzhu Wang, Dietriech Ober: Klonierung und Expression eines für die

    Detoxifizierung von Pyrrolizidin-Alkaloiden (PA) verantwortlichen Enzyms aus

    PA-adaptierten Insekten; Sektion pflanzliche Naturstoffe der Deutschen

    Botanischen Geseschaft, 1-3 Okt. 2006, Kaub.

  • DANKSAGUNG

    III

    DANKSAGUNG

    Allen voran danke ich meinem Doktorvater Prof. Dr. Dietrich Ober ganz herzlich

    für die Unterstützung während der gesamten Doktorarbeit, für die Bereitstellung

    des spannenden Themas, die Diskussionen und die konstruktiven Ideen sowie

    für das mir entgegengebrachte Vertrauen.

    Insbesondere danke ich Claudine Theuring im Institut für Pharmazeutische

    Biologie an der TU Braunschweig für die Hilfe bei der Herstellung der

    Pyrrolizidin-Alkaloide und Radio-markierten Substrate aus Pflanzen.

    Dr. Till Beuerle im Institut für Pharmazeutische Biologie danke ich herzlich für

    die freundliche Zusammenarbeit und Hilfsbereitschaft sowie für den

    erfolgreichen Nachweis von Alkaloiden und oxidierten Produkten aus Insekten.

    Meinem Vorgänger Sven Sehlmeyer danke ich für die Einarbeitung und die

    schon fertigen Materialien.

    Besonders bedanke ich mich bei Frau Margret Doose für die große Hilfe bei der

    Fütterung der Heuschrecken.

    Mein Dank gilt auch Herrn Klaas Vrieling für seine Gastfreundschaft und

    Hilfsbereitschaft bei meinem Aufenthalt in Leiden/Niederlande.

    Den Kooperationspartnern, insbesondere Herrn George Petschenka in der

    Abteilung Molekulare Evolotionsbiologie an der Universität Hamburg, möchte

    ich meinen Dank aussprechen für die Schenkung der Schmettlingsraupe und

    für die Kultivierungsmethode.

    Des Weiteren bedanke ich mich bei allen Laborkollegen und Mitarbeitern in der

    Abteilung für Biochemische Ökologie und Molekulare Evolution für die

    angenehme Arbeitsatmosphäre und die Hilfsbreitschaft. Hierbei danke ich

    insbesondere Frau Brigitte Schemmerling, Frau Dr. Dorothee Langel, Frau Dr.

    Dagmar Enß, Frau Dr. Elisabeth Kaltenegger und Frau Dr. Carmen Michalski.

    Bei allen Freunden in Braunschweig und in Kiel bedanke ich mich für ihre

    Begleitung und Freundschaft. Mit euch ist mein Leben schöner geworden.

  • DANKSAGUNG

    IV

    Ein herzlicher Dank geht an meinen Mann, meine Eltern, meine kleine

    Schwester und ihren Mann, die in allen Situationen hinter mir stehen sowie ihre

    liebevolle Unterstützung und Verständnis, die bei der Fertigstellung dieser

    Arbeit von großem Wert waren.

  • INHALTSVERZEICHNIS

    V

    INHALTSVERZEICHNIS

    ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ............................. ....................................... VIII

    1 EINLEITUNG ................................................................................................1

    1.1 Typische Sekundärstoffe: Pyrrolizidin-Alkaloide (PAs) ....................2

    1.2 Biosynthese der Pyrrolizidin-Alkaloide ........ ......................................6

    1.3 Toxizität der Pyrrolizidin-Alkaloide .......... ...........................................9

    1.4 An Pyrrolizidin-Alkaloide adaptierte Insekten . ................................. 12

    1.4.1 Anpassungsstrategien der an PAs adaptierten Insekten .............................. 12

    1.4.2 Adaptionsmechanismen von spezialisierten Lepidoptera und Orthoptera . 16

    1.5 Zielsetzung ................................... ....................................................... 18

    2 PROJEKTTEIL I ................................... ...................................................... 20

    2.1 Etablierung eines Expressionssystems für eine F lavin-abhängigen

    Monooxygenase ..................................... ................................................... 20

    2.2 Charakterisierung der Flavin-abhängigen Monooxy genasen in

    Arctiiden (Lepidoptera) ........................... ................................................. 24

    3 PROJEKTTEIL II .................................. ...................................................... 35

    Identifizierung und Charakterisierung der Flavin-ab hängigen

    Monooxygenasen in der afrikanischen Heuschrecke Zonocerus

    variegatus .................................................................................................. 35

    4 PROJEKTTEIL III ................................. ...................................................... 44

    Induktion und Lokalisation der FMOs in Arctiiden und Orthoptera ..... 44

    4.1 Einleitung .................................... ........................................................ 44

    4.2 Material und Methoden ......................... .............................................. 47

    4.2.1 Herkunft und Haltung der Insekten ................................................................... 47

    4.2.2 Reverse-Transkription-(RT)-PCR ..................................................................... 48

    4.3 Ergebnisse .................................... ...................................................... 52

    4.3.1 Induktion der PNO in Insekten .......................................................................... 52

    4.3.1.1 Induktion der PNO in A. caja (Arctiiden) ................................................... 52

    4.3.1.2 Induktion der PNO in Z. variegatus (Orthoptera) .................................... 54

  • INHALTSVERZEICHNIS

    VI

    4.3.2 Lokalisation der SNO in Insekten ...................................................................... 56

    4.3.2.1 Gewebespezifische Expression der SNO in T. jacobaeae .................... 56

    4.3.2.2 Gewebespezifische Expression der FMOs in Z. variegatus .................. 58

    4.4 Diskussion .................................... ....................................................... 64

    5 PROJEKTTEIL IV .................................. ..................................................... 66

    Identifizierung und Klonierung der FMOs aus Danaus plexippus ........ 66

    5.1 Einleitung .................................... ........................................................ 66

    5.2 Material und Methoden ......................... .............................................. 68

    5.2.1 Herkunft und Haltung der Insekten ................................................................... 68

    5.2.2 Gesamt-RNA-Isolierung ..................................................................................... 68

    5.2.3 Quantifizierung von RNA und DNA .................................................................. 68

    5.2.4 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ...........................