Molekulare Mechanismen der Kontaktinhibition ... Molekulare Mechanismen der Kontaktinhibition:...

download Molekulare Mechanismen der Kontaktinhibition ... Molekulare Mechanismen der Kontaktinhibition: Identifizierung

of 160

  • date post

    08-Oct-2018
  • Category

    Documents

  • view

    214
  • download

    0

Embed Size (px)

Transcript of Molekulare Mechanismen der Kontaktinhibition ... Molekulare Mechanismen der Kontaktinhibition:...

  • Molekulare Mechanismen der Kontaktinhibition:

    Identifizierung neuer Tumorsuppressorgene

    Dissertation zur Erlangung des Grades

    Doktor der Naturwissenschaften

    am Fachbereich Pharmazie

    der Johannes Gutenberg-Universitt Mainz

    Monika Kppers

    geboren in Pforzheim

    Mainz, 2007

  • 2

    Dekan:

    1. Berichterstatter:

    2. Berichterstatter:

    Tag der mndlichen Prfung: 13. Mai 2008

  • 3

    Inhaltsverzeichnis

    Abkrzungsverzeichnis.................................................................................... 6

    Reagenzien und Chemikalien .......................................................................... 9

    Gerte und Materialien ................................................................................... 12

    1. Einleitung .................................................................................................... 14

    Zellzyklus ............................................................................................................... 16 MAPK...................................................................................................................... 19

    2. Zielsetzung der Arbeit ................................................................................ 21

    3. Material und Methoden............................................................................... 22

    3.1. Zellkultur ......................................................................................................... 22 3.1.1. Verwendete Zelllinie................................................................................... 22 3.1.2. Medium...................................................................................................... 22 3.1.3. Kultivieren der Zellen ................................................................................. 25 3.1.4. Zellzahlbestimmung ................................................................................... 26 3.1.5. Untersuchung auf Mykoplasmenkontamination .......................................... 27

    A) DAPI-Frbung ............................................................................................. 27 B) PCR ............................................................................................................ 29

    3.1.6. Kryokonservierung ..................................................................................... 30 3.2. Proteingewinnung........................................................................................... 31

    3.2.1. Gesamtextrakt............................................................................................ 31 3.2.2. Chloroform-Methanol-Fllung..................................................................... 32 3.2.3. Proteinquantifizierung mittels BCA-Test ..................................................... 33

    3.3. Gelelektrophorese .......................................................................................... 35 3.3.1. SDS-PAGE ................................................................................................ 36

    3.3.1.1. Gieen der Gele.................................................................................. 36 3.3.1.2. Proben vorbereiten.............................................................................. 38 3.3.1.3. Durchfhren der Elektrophorese.......................................................... 39

    3.3.2. Agarose-Gelelektrophorese ....................................................................... 39 3.3.2.1. Gieen der Gele.................................................................................. 40 3.3.2.2. Elektrophorese und Detektion ............................................................. 41

    3.3.3. Standard-Marker fr die Elektrophorese..................................................... 41 A) Western Blot................................................................................................ 42

    1 Bluemarker (Prestained SDS-Molecular Weight Standard Mixture).....................42 2 ECL-Marker (Biotinylated Protein Ladder Detection Pack)...................................42

    B) Agarosegele ................................................................................................ 43

  • 4

    3.4. Western Blot.................................................................................................... 43 3.4.1. Proteindetektion nach Transfer auf Blot-Membran ..................................... 45

    A) Unspezifische Detektion mittels Coomassie-Frbung .................................. 45 B) Spezifische Detektion mittels Antikrpern.................................................... 46

    - Detektion mittels Chemilumineszenz........................................................................46 - Detektion mittels Alkalischer Phosphatase...............................................................50

    3.4.2. Strippen der Blotmembran ......................................................................... 51 3.5. PCR.................................................................................................................. 52

    3.5.1. RNA-Isolierung........................................................................................... 52 A) RNA-Isolierung mittels RNAWiz................................................................... 53 B) RNA-Isolierung mittels High Pure RNA Isolation Kit..................................... 54

    3.5.2. Bestimmung der RNA-Konzentration ......................................................... 54 3.5.3. Qualittskontrolle ....................................................................................... 55

    A) Photometrisch ............................................................................................. 55 B) Agarosegel .................................................................................................. 55

    3.5.4. cDNA-Synthese ......................................................................................... 56 3.5.5. PCR-Primer und Bedingungen................................................................... 57

    3.6. Microarrays ..................................................................................................... 61 3.7. Durchflusszytometrie / FACS......................................................................... 64 3.8. Proliferationstest ............................................................................................ 65 3.9. Differential Display (DD)................................................................................. 67

    3.9.1. Probengewinnung ...................................................................................... 68 3.9.2. DD-PCR..................................................................................................... 69 3.9.3. DD-Gelelektrophorese ............................................................................... 70

    3.9.3.1. Vorbereiten der Platten ....................................................................... 70 3.9.3.2. Gieen der Gele.................................................................................. 71 3.9.3.3. DD-Elektrophorese.............................................................................. 72 3.9.3.4. Standardmarker fr die DD-Elektrophorese......................................... 73 3.9.3.5. Detektion / Silberfrbung..................................................................... 74

    3.9.4. Aufarbeiten differentiell exprimierter Banden.............................................. 75 3.9.4.1. Isolieren differentiell exprimierter Banden aus dem Gel....................... 75 3.9.4.2. Erneute Amplifikation der ausgeschnittenen Fragmente...................... 77

  • 5

    4. Ergebnisse................................................................................................... 78

    4.1. Optimieren der Versuchsbedingungen ......................................................... 78 4.2. Differential Display ......................................................................................... 79 4.3. Microarray-Analysen ...................................................................................... 82

    Zellzyklus............................................................................................................. 82 Tsc-22.................................................................................................................. 94 Notch-Signalweg.................................................................................................. 95

    4.4. Regulation der MAP Kinasen ......................................................................... 96 Duale Phosphatasen............................................................................................ 96 MAPK-Kinasen (MKKs)........................................................................................ 97 MAP Kinase p38 .................................................................................................. 99 MAP Kinase ERK............................................................................................... 100

    5. Diskussion................................................................................................. 106

    5.1. Microarrays ................................................................................................... 106 Replikation......................................................................................................... 106 Zellzyklus........................................................................................................... 107 Tsc-22................................................................................................................ 110 NCAM....