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Institut für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover Morphologische Charakterisierung und molekulare Pathogenese Perillaketon-induzierter Lungenveränderungen beim Pferd als Modell für die interstitielle Pneumonie These Zur Erlangung des Grades eines Philosophical Doctor - Ph.D. – im Fachgebiet Pathologie an der Tierärztlichen Hochschule Hannover von Stefan Schmidbauer aus Cham Hannover 2003

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Institut für Pathologie

der Tierärztlichen Hochschule Hannover

Morphologische Charakterisierung und molekulare

Pathogenese Perillaketon-induzierter

Lungenveränderungen beim Pferd als Modell für die

interstitielle Pneumonie

These

Zur Erlangung des Grades eines

Philosophical Doctor

- Ph.D. –

im Fachgebiet Pathologie

an der Tierärztlichen Hochschule Hannover

von Stefan Schmidbauer

aus Cham

Hannover 2003

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Supervisor: Univ.-Prof. Dr. Dr. h.c. mult. W. Drommer

Betreuungsgruppe: 1. Univ.-Prof. Dr. R. Pabst

2. Univ.-Prof. Dr. W. Löscher

Erstgutachter: 1. Univ.-Prof. Dr. Dr. h.c. mult. W. Drommer, Institut für

Pathologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover

2. Univ.-Prof. Dr. R. Pabst, Institut für Anatomie der

Medizinischen Hochschule Hannover

3. Univ.-Prof. Dr. W. Löscher, Institut für Pharmakologie,

Toxikologie und Pharmazie der Tierärztlichen Hochschule

Hannover

Zweitgutachter: Priv.-Doz. Dr. S. Rittinghausen, Abteilung für Toxikologie und

Umwelthygiene, Fraunhoferinstitut für Toxikologie und

Aerosolforschung Hannover

Tag der mündlichen Prüfung:20.11.03

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3

Meinen Eltern

als Dank und zur Freude

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Teile dieser Arbeit wurden bei folgendem wissenschaftlichem Kongress

vorgetragen:

SCHMIDBAUER, S.-M., A. D. GRUBER, M. VENNER und W. DROMMER (2003):

Kompensierte Überexpression der Kollagensynthese nach experimenteller Induktion eines

akuten Alveolarschadens durch Perillaketon (1-(3-furyl) 4-Methylpentaton) beim Pferd.

46. Tagung der Fachgruppe Pathologie in der Deutschen Veterinärmedizinischen

Gesellschaft, Bamberg, 10. Juni 2003

Folgende Teile dieser Arbeit wurden zur Publikation eingereicht:

SCHMIDBAUER, S.-M., M. VENNER, G. VON SAMSON-HIMMELSTJERNA, W.

DROMMER and A.D. GRUBER (2003):

Compensated overexpression of procollagens a1(I) and a1(III) after experimental perilla mint

ketone-induced acute pulmonary damage in horses.

J. Comp. Pathol. (submitted)

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Inhaltsverzeichnis

1. EINLEITUNG UND ZIELE DER ARBEIT S. 11

2. LITERATURÜBERSICHT S. 13

2.1 Die Normalstruktur der Lunge S. 13

2.1.1 Histologie, UItrastruktur und Funktion S. 13

2.2 Interstitielle Pneumonie und Diffuse Alveolar Damage (DAD) S. 25

2.3 Zelltod: Nekrose und Apoptose S. 28

2.3.1 Morphologische und biochemische Kriterien von

Apoptose und Nekrose S. 28

2.3.2 Die Rolle von Apoptose bei diffusem Alveolarschaden S. 29

2.4 Ki-67 als Proliferationsmarker S. 31

2.5 Struktur, Verteilung und Stoffwechsel von Kollagen in der Lunge S. 32

2.5.1 Kollagen Typ I und Typ III S. 33

2.5.2 Regulation des Kollagenstoffwechsels S. 34

2.5.3 Die Bedeutung von Kollagen Typ I und Typ III

bei diffusem Alveolarschaden S. 37

2.6 Transforming Growth Factor-β (TGF-β ) S. 39

2.6.1 Struktur, Regulation und Signalbildung S. 39

2.6.2 Allgemeine Funktion S. 40

2.6.3 Einfluss von TGF-β auf den Kollagenstoffwechsel S. 42

2.6.4 Die Rolle von TGF-β im Entzündungsgeschehen S. 44

2.6.5 Rolle von TGF-β bei akutem Alveolarschaden S. 46

2.6.6 Bedeutung von TGF-β bei Regeneration und Reparation

nach akutem Alveolarschaden S. 48

2.7 Interleukin-1ß (IL-1ß) S. 50

2.7.1 Allgemein S. 50

2.7.2 Regulation der Genexpression und Proteinsynthese

von IL-1ß S. 51

2.7.3 Interleukin-1 bei Wundheilung und entzündlichen

Lungenveränderungen S. 52

2.8 Perillaketon (PK) als lungentoxisches Agens S. 55

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3 MATERIAL UND METHODEN S. 59

3.1 Untersuchungsmaterial S. 59

3.2 Allgemeine Versuchsplanung S. 61

3.3 Methoden S. 63

3.3.1 Fixierung und Archivierung der Lungenbiopsieproben S. 63

3.3.2 Paraffineinbettung und Schnittherstellung für

licht-mikroskopische und immunhistochemische

Untersuchungen sowie terminal dUTP nick-end labeling

(TUNEL) S. 63

3.3.3 Immunhistochemische Untersuchungen S. 64

3.3.3.1 Bestimmung der Zellproliferationsrate S. 64

3.3.3.2 Bestimmung des Anteils der Makrophagen-

und Granulozytenpopulation an der

Gesamtzellzahl der Lunge S. 64

3.3.4 Bestimmung der Zelluntergangsrate im

terminal dUTP nick-end labeling (TUNEL) -Assay S. 67

3.3.5 Bestimmung des Anteils kollagener und retikulärer Fasern

an den alveolären Septen S. 69

3.3.6 Licht- und transmissionselektronenmikroskopische

Untersuchung S. 70

3.3.7 Molekularbiologische Präparationen S. 71

3.3.7.1 Allgemeine Maßnahmen S. 71

3.3.7.2 Isolierung von Gesamt-RNA aus tiefgefrorenem

Lungengewebe S. 72

3.3.7.3 Reverse Transkription S. 73

3.3.7.4 Quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) S. 74

3.3.8 Klinischer Score S. 79

3.4 Statistische Auswertung S. 80

4 ERGEBNISSE S. 81

4.1 Licht- und elektronenmikroskopische Untersuchungen S. 81

4.1.1 Biopsieproben vor der Applikation von Perillaketon S. 81

4.1.2. Biopsieproben nach der Applikation von Perillaketon S. 82

4.2 Ergebnisse der morphometrischen Untersuchungen S. 99

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4.2.1 Zellproliferationsrate S. 99

4.2.2 Zelluntergangsrate S. 102

4.2.3 Veränderungen des Anteils von Makrophagen und

Granulozyten an der Gesamtzellzahl S. 105

4.2.4 Gehalt der alveolären Septen an kollagenen und

retikulären Fasern S. 107

4.3 Untersuchungen zur Genexpression S. 109

4.3.1 Kontrolle der mRNA-Isolierung und cDNA-Synthese S. 110

4.3.2 Ergebnisse der qPCR S. 110

4.3.3 Expressionsrate von Interleukin-1β S. 111

4.3.4 Expressionsrate von TGF-β S. 113

4.3.5 Expressionsrate von Prokollagen a1(I) S. 115

4.3.6 Expressionsrate von Prokollagen a1(III) S. 117

4.4 Vergleich mit den klinischen Befunden S. 119

5 DISKUSSION S. 121

6 ZUSAMMENFASSUNG S. 139

7 SUMMARY S. 141

8 LITERATURVERZEICHNIS S. 143

9 ANHÄNGE S. 205

9.1 Ergebnisse der morphometrischen Untersuchungen (Rohdaten) S. 205

9.2 Ergebnisse der Reverse-Transkriptase quantitativen

Polymerase-Kettenreaktion (Rohdaten) S. 213

9.3 Reaktionslösungen und Färbungen S. 228

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Abkürzungsverzeichnis

A Adenosin

A-aDO2 Alveoloarterielle Sauerstoffdifferenz

AI-Zellen Alveolarepithelzellen vom Typ I

AII-Zellen Alveolarepithelzellen vom Typ II

ADC Active Cell Death

AIP Atypische Interstitielle Pneumonie

ALI Acute Lung Injury

AP-1 Activator Protein-1

ARDS Acute Respiratory Distress Syndrom

ATP Adenosin-5´-triphosphat

BALF Bronchioalveoläre Lavageflüssigkeit

BALT Bronchus-associated Lymphatic Tissue

bFGF basic Fibroblast Growth Factor

BMP Bone Morphogenetic Protein

bp Basenpaare

BSA Bovines Serumalbumin

ca. cirka

cAMP cyclisches Adenosinmonophosphat

CD Cluster of Differentiation

cDNA Complementary Deoxyribonucleic Acid

COPD Chronic Obstructive Pulmonary Disease

CYP450 Cytrochrom P450

DAB Diaminobenzidin-tetra-Hydrochlorid

DAD Diffuse Alveolar Damage

DC Dendritic Cells

DEPC Diethylpyrocarbonat

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Desoxyribonucleic Acid

DNase Desoxyribonuclease

dNTP 2´-Desoxyribonucleosid-5´-triphosphate

dUTP 2´-Uracil-5´-triphosphat

EF-1a Elongationfactor-1a

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EGF Epidermal Growth Factor

ER endoplasmatisches Retikulum

etc. et cetera

GSSG Glutathiondisulfid

HE Hämalaun-Eosin

ICAM Intercellular Adhesion Molecule

ICE Interleukin Converting Enzyme

IFN Interferon

IGF Insulin- like Growth Factor

IL Interleukin

ILD Interstitial Lung Disease

IPF Idiopathic Pulmonary Fibrosis

i.v. intra venam

K Kontrolle

KG Körpergewicht

LPS Lipopolysaccharide

LTGF Latent Transforming Growth Factor

MHC Major Histocombatibility Complex

MIS Mullerian Inhibitory Substance

MOV Multisystemisches Organversagen

mRNA Messenger-Ribonucleic Acid

NADPH Nicotinamide-Adenine-Dinucleotide-Phosphate

N-PCP III N-terminal Procollagenpeptide Type III

NSIP Idiopathic Nonspecific Interstitial Pneumonia

NTC No Template Control

PAI-1 Plasminogen Activator Inhibitor-1

PBS Phosphate Buffered Saline

PICP C-terminal Procollagenpeptide Type I

PIIICP C-terminal Procollagenpeptide Type III

PDGF Platelet Derived Growth Factor

PGE Prostaglandin E

PK Perillaketon

Proa1(III) Prokollagen a1(III)

Proa1(I) Prokollagen a1(I)

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qPCR quantitative Polymerase Chain Reaction

RNA Ribonucleic Acid

RNase Ribonuclease

ROI Reactive Oxygen Intermediates

RT-PCR Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction

s Standardabweichung

SARA Smad Anchor for Receptor Activation

Smad Mother against decapentaplegic Homolog

TdT Terminal desoxynucleotidyl Transferase

TEM Transmissionselektronenmikroskopie

TGF Transforming Growth Factor

TIMP Tissue Inhibitor of Metalloproteinases

TNF Tumor Necrosis Factor

tRNA Transfer-Ribonucleic Acid

TUNEL terminal dUTP nick end labeling

U Uracil

V Variationskoeffizient

x arithmetischer Mittelwert

xg x Erdbeschleunigung

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1 Einleitung und Ziele der Arbeit

Leistungsverluste bei Sportpferden stellen ein in zunehmendem Maße auftretendes Problem

dar, wobei hierfür als eine wesentliche Ursache interstitielle Lungenerkrankungen anzusehen

sind (BUERGELT et al., 1986, 1995; WINDER et al., 1988; DIEKMANN et al., 1990).

Zentral im Krankheitsgeschehen steht als Folge zahlreicher, sehr heterogener Insulte ein

initialer, akuter Alveolarschaden. Im anschließenden subakuten und chronischen Stadium

laufen regenerative und reparative Prozesse ab, wobei unter günstigen Voraussetzungen eine

vollständige Ausheilung möglich ist. Vielfach werden jedoch mehr oder weniger stark

ausgeprägte, irreversible Veränderungen in Form einer Lungenfibrose beobachtet, die mit

Ablagerung vor allem der Kollagentypen I und III im Bereich der alveolären Septen

einhergeht (DIEKMANN et al., 1990; JUBB, 1991; BIENKOWSKI u. GOTKIN, 1995;

BRUCE, 1995). Der Grad der dabei auftretenden restriktiven Lungenerkrankungen kann sehr

stark variieren, und insbesondere Sportpferde im Hochleistungsbereich zeigen schon bei

relativ geringer Beeinträchtigung der respiratorischen Funktionen erkennbare

Leistungseinbußen (DIEKMANN et al., 1990).

Über die Pathogenese des akuten Alveolarschadens und der interstitiellen Pneumonie

existieren bereits bei verschiedenen Spezies zahlreiche Untersuchungen. Im Besonderen

fehlen jedoch beim Pferd kontinuierliche Untersuchungen über längere Zeiträume, die alle

Phasen des Krankheitsverlaufs mit einschließen. Ein Modell der interstitiellen Pneumonie

beim Pferd könnte daher einen großen Beitrag zu einem besseren Verständnis der

Pathogenese und zu einer Verbesserung der klinischen Diagnostik leisten. Es sollte daher an

transkutan entnommenen Lungenbiopsieproben geklärt werden, ob eine einmalige intravenöse

Applikation von Perillaketon (1-(3-furyl) 4-Methylpentaton) beim Pferd zur Induktion eines

akuten Alveolarschadens und einer interstitielle Pneumonie geeignet ist. Diese

Veränderungen können potenziellen Modellcharakter für Untersuchungen der Lungenfibrose

besitzen.

Die Ziele der Arbeit waren:

1. Beschreibung der Perillaketon-induzierten Lungenveränderungen über einen Zeitraum

von vier Wochen nach Applikation im Hinblick auf morphologische und strukturelle

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Alterationen sowie auf die Expression Pathogenese-relevanter Gene (IL-1ß, TGF-ß,

Prokollagen a1(I) (COL1A1) und Prokollagen a1(III) (COL3A1)).

2. Ermittlung des Grades einer interstitiellen Fibrose als möglicher Spätschaden.

3. Beurteilung der prognostischen Relevanz der Genexpression von IL-1ß, TGF-ß,

COL1A1 und COL3A1.

4. Bewertung des Verfahrens als Modell für interstitielle Lungenerkrankungen beim

Pferd.

Die Entzündungsmediatoren IL-1ß und TGF-ß sowie die extrazellulären Matrixprotein-

vorläufer Prokollagen a1(I) und Prokollagen a1(III) besitzen große Bedeutung in der

Pathogenese akuter und chronischer Lungenerkrankungen. Weiterhin sollen in diesem

Zusammenhang Parameter für die Kollagensynthese aussichtsreiche Kandidaten für

prognostische Faktoren quoad restitutionem und quoad vitam darstellen (WAYDHAS et al.,

1993; MEDURI et al., 1998; BAUER et al., 2000; MARSHALL et al., 2000, MIKUNIYA et

al., 2000). Die Bestimmung der Genexpression von Prokollagen a1(I) und Prokollagen a1(III)

durch Reverse Transkriptase – quantitative Polymerasekettenreaktion könnte raschere und

exaktere Ergebnisse liefern als die bisher überwiegend auf Proteinebene durchgeführten

Untersuchungen. Zur Bearbeitung dieser Fragestellungen musste ein neues Verfahren etabliert

werden, das die Quantifizierung dieser Parameter einschließlich der Genexpressionsraten

intra vitam erlaubte. Für die Untersuchung der aus den Lungenbiopsieproben gewonnenen

mRNA-Spezies stand mit der quantitativen Polymerasekettenreaktion eine moderne,

hochspezifische und –sensitive Methode zur Verfügung, die auch für die Analyse von

Minimalbiopsieproben geeignet war.

In der vorliegenden Arbeit erfolgten somit erstma lig zusammenhängende und umfassende

Untersuchungen zur Pathogenese der interstitiellen Pneumonie des Pferdes in den

verschiedenen Stadien der Erkrankung. Die innovative Kombination der verschiedenen

Methoden und die Etablierung der Untersuchungsverfahren zur Genexpression von IL-1ß,

TGF-ß, Prokollagen a1(I) und Prokollagen a1(III) beim Pferd kann über die eigene Arbeit

hinaus bei zukünftigen Fragestellungen eine große Hilfe sein. Parallel zu dieser Arbeit wurden

umfassende Untersuchungen mittels erweiteter klinischer und sekretzytologischer Methoden

sowie bildgebender Verfahren von Frau Dr. Venner durchgeführt, um den Krankheitsverlauf

klinisch systematisch zu erfassen.

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2 Literaturübersicht

2.1 Die Normalstruktur der Lunge

Die Gliederung der Lunge in einzelne Lappen ist tierartlich unterschiedlich und unter den

Haussäugetieren beim Pferd am wenigsten ausgeprägt. Unterschieden werden an jeder Lunge

des Pferdes ein Lobus cranialis und ein Lobus caudalis, wobei dem Lobus caudalis pulmonis

dexter der Lobus accessorius medial angefügt ist. Typisch für das Pferd ist auch die

Aufzweigung des Bronchialbaumes. Der Bronchus cranialis teilt sich in beiden Lungen in

einen cranialen und caudalen Bronchus segmentalis. Der craniale Segmentbronchus entlässt

wiederum vier bis fünf dorsale und ventrale Äste, während sich vom caudalen vier kräftige

ventrale sowie fünf bis sieben kurze dorsale Bronchi segmentales abspalten (NICKEL u.

WILKENS, 1987).

2.1.1 Histologie, Ultrastruktur und Funktion

Allgemein

Im Anschluss an die terminalen Bronchioli, die den letzten Abschnitt des ausschließlich

luftleitenden Systems der Lunge bilden, finden sich die Bronchioli respiratorii und Ductus

alveolares. Die Wände der Alveolargänge bestehen aus dünnen spiralartig angeordneten

Bändern aus kollagenen und elastischen Fasern, zwischen denen die ebenfalls spiralig

angeordneten Mündungen der Alveoli liegen (WHIMSTER, 1970). Diese Anordnung

entspricht den Windungen einer Feder und besitzt daher die Fähigkeit sich in Abhängigkeit

von Inspiration und Exspiration zu dehnen und zusammenzuziehen. Die Alveolarwände

setzen sich aus penta- oder hexagonalen Abschnitten zusammen und bilden ein Polyeder

(ODERR, 1964). Das System der Alveolargänge und der polyedrischen Alveolen ist durch

seine Anordnung in der Lage, sich optimal an die bei der Atmung erfolgenden

Volumenänderungen anzupassen. Die Form der Alveolen, die Oberflächenspannung des

alveolären Flüssigkeitsfilms und in geringerem Maße bindegewebige Komponenten wie

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kollagene und elastische Fasern sind hauptverantwortlich für die Compliance der Lunge

(HABER et al., 1983). Die Dehnungsfähigkeit der Lunge wird durch oberflächenaktive

Substanzen, die das so genannte Surfactant bilden, erhöht. Insgesamt setzt sich die Lunge aus

über 42 verschiedenen Zelltypen zusammen, über die bereits in den siebziger Jahren

umfangreiche Übersichtsartikel verfasst wurden (JEFFEREY u. REID, 1975; BREEZE u.

WEEHLDON, 1977). Allein im Bereich der luftleitenden Wege finden sich zwölf

unterschiedliche Typen von Epithelzellen.

Die interalveolären Septen

Die interalveolären Septen, Septa interalveolaria, bilden den Hauptteil des lufttauschenden

Gewebes der Säugetierlunge. Diese Septen trennen benachbarte Lumina von Alveolen und

sind aus dem Alveolarepithel, einem umfangreichen Kapillarsystem und aus interstitiellem

Bindegewebe aufgebaut, wobei Epithel und Endothel jeweils einen Anteil von ca. 30 % an der

Ausbildung der Blut-Luft-Schranke haben und das interstitielle Bindegewebe etwa 40 %

(WEIBEL u. KNIGHT, 1964). Auf der einen Seite der Alveolarwand sind die Kapillaren eng

mit dem Alveolarepithel verbunden. Hier fusionieren die endo- und epitheliale

Basalmembran. An der gegenüberliegenden Seite sind Epithel und Endothel durch schmale

Bahnen interstitiellen Bindegewebes getrennt (CORRIN, 2000). Neben Endo- und

Epithelzellen finden sich als weiterer wichtiger Zelltyp die Alveolarmakrophagen (RIESNER,

1978). Sehr früh konnte festgestellt werden, dass die Septen keine kontinuierlichen,

lückenlosen Platten darstellen, sondern von Öffnungen unterbrochen sind (MACKLIN, 1936).

Diese so genannten Kohn´schen Poren stellen eine Verbindung zwischen benachbarten

Alveolen her (KOHN, 1893) und sollen dem kolateralen Druckausgleich dienen (PARRA et

al., 1978). Diese Öffnungen können außer beim Pferd (KAUP et al., 1990a) noch bei

zahlreichen anderen Spezies wie Mensch, Ratte (GIL u. WEIBEL, 1969), Maus (RANGA u.

KLEINERMAN, 1980) und Hund (PARRA et al., 1978) beobachtet werden und sind von

intaktem Alveolarepithel gesäumt. Es finden sich bis zu sieben Poren in einer Alveole, deren

Durchmesser zwischen 2 und 13 µm liegt. Zum Zeitpunkt der Geburt sind diese Öffnungen

noch nicht ausgebildet und entwickeln sich erst in den frühen Lebensabschnitten.

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Das Alveolarepithel

Die Alveolaroberfläche besteht bei Mensch und Tier hauptsächlich aus zwei Zelltypen, den

flachen, im Bereich der Alveolarsepten gelegenen Alveolarepithelzellen vom Typ I (AI-

Zellen) bzw. Pneumozyten Typ I und den größeren, vor allem in den alveolären Nischen

gelegenen granulierten Alveolarepithelzellen vom Typ II (AII-Zellen) bzw. Pneumozyten Typ

II (BASKERVILLE, 1970; WEIBEL, 1973; WAGNER et al., 1973; WEIBEL et al., 1976).

Die Zellen an der Alveolaroberfläche sind über tight junctions miteinander verbunden und

bilden so ein kontinuierliches Epithel (WEIBEL, 1973; SCHNEEBERGER et al., 1976),

wobei die Typ I-Zellen mit ihren Zytoplasmaausläufern krakenartig benachbarte Typ II-

Zellen überlappen. Der ultrastrukturelle Aufbau dieser Zellen ist bei allen bisher untersuchten

Tierarten sehr ähnlich (z.B. Mensch (BARTELS, 1979), Hase (MOORE u. SCHOENBERG,

1964), Rind (RYBICKA et al., 1974), Hamster (KUHN, 1978), Ratte (WEIBEL et al., 1976;

KAUP, 1982), Pferd (KAUP et al., 1990a)).

Alveolarepithelzellen vom Typ I (AI-Zellen)

Alveolarepithelzellen vom Typ I besitzen nur wenige Organellen und sind durch ihr flaches

Zytoplasma gekennzeichnet, das sich ausgehend von der nukleären Zone über eine

verhältnismäßig große Fläche ausdehnt. Sie bedecken beim Menschen im Schnitt eine Fläche

von bis zu 5098 µm2, weisen jedoch nur eine Dicke von etwa 0,2 µm auf. Insgesamt beträgt

ihr Anteil an der Gesamtzellpopulation der Lunge 8 %, sie bedecken jedoch ca. 95 % der

inneren Oberfläche (CRAPO et al., 1982). AI-Zellen sollen auch in der Lage sein

Alveolarwände zu penetrieren, so dass ein und dieselbe Zelle beide Seiten des

Alveolarseptums bedecken kann (WEIBEL, 1973). Ihre Aufgabe besteht in der Ausbildung

einer kontinuierlichen, aber sehr schmalen Auskleidung des weitaus größten Teils der

Alveolaroberfläche und sie sind somit einerseits an der Bildung der Blut-Luft-Schranke

beteiligt, andererseits dienen sie zusammen mit anderen Faktoren der Aufrechterhaltung der

mechanisch-statischen Stabilität der Alveole (RADFORD, 1964). Von großer Bedeutung ist

auch ihre Barrierefunktion zur Vermeidung eines übermäßigen Flüssigkeitsverlustes über die

Lungenoberfläche. Typ I-Zellen sind untereinander und mit Typ II-Zellen über tight-junctions

verbunden (KAUP et al., 1990a). Im Zytoplasma weisen sie zahlreiche Pinozytosevesikel auf,

die der Resorption von Makromolekülen dienen (SCHNEEBERGER, 1976; LAUWERYNS

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u. BAERT, 1977). Die dünnen Ausläufer der Typ I-Zellen sind sehr empfindlich gegenüber

zahlreichen exogenen schädigenden Einflüssen. Zusammen mit dem Kapillarendothel stellen

sie die vulnerabelste Komponente der Lunge dar (CORRIN, 2000).

Alveolarepithelzellen vom Typ II (AII-Zellen)

Zu den wichtigsten Funktionen der AII-Zellen gehören Synthese, Sekretion und Speicherung

oberflächenaktiver Substanzen, die das so genannte Surfactant bilden, das der Herabsetzung

der Oberflächenspannung an der Grenzfläche zwischen Luft und Alveolarwand dient. AII-

Zellen stellen weiterhin die Stammzellpopulation für Alveolarepithelzellen vom Typ I dar.

Auf einen Alveolarschaden mit Verlust von AI-Zellen folgt eine Regeneration mit

Proliferation von AII-Zellen und anschließender Differenzierung zu Typ I-Zellen

(ADAMSON u. BOWDEN, 1974; MASON et al., 1977ab; SUTINEN et al., 1980). Der

natürliche Turnover von AII-Zellen dauert etwa 25 Tage, während für die Differenzierung in

AI-Zellen nur ca. 48 h nötig sind. Histologisch treten dabei Übergangsformen auf (EVANS et

al., 1975). Weitere wesentliche Funktionen der AII-Zellen sind die Metabolisierung und

Detoxifikation von Xenobiotika (DOMIN et al., 1986) und ihre Beteiligung an der

Modulation der Hypophase des oberflächenaktiven Films (MASON et al., 1977ab) bzw. an

der Resorption von Flüssigkeit und Elektrolyten aus der Hypophase und deren

Weitertransport in das Interstitium. Sie halten in der wässrigen alveolären Hypophase ein

konstantes Elektrolytverhältnis und einen pH von 6,8 aufrecht (VAN GOLDE et al., 1988).

AII-Zellen sezernieren auch Bestandteile der extrazellulären Matrix (z. B. Fibronektin,

Prokollagen Typ IV, Thrombospondin, Laminin, Kollagen Typ V) (MASON et al., 1982;

SAGE et al., 1983; LWEBUNGA-MUKASA et al., 1984; CROUCH et al., 1987; SINGH et

al., 1988), Proteine des klassischen und alternativen Komplementsystems (STRUNK et al.,

1988) und bei der Ratte konnte auch die Produktion von Lysozym nachgewiesen werden

(ADAMSON u. KING, 1985). Die Alveolarepithelzellen vom Typ II besitzen kubische

Gestalt und werden hauptsächlich in den Nischen der Alveolen angetroffen. Sie machen nur

12-15 % der Gesamtzellpopulation der Lunge aus, stellen jedoch ca. 65 % des

Gesamtzellgehaltes der Alveole und bedecken etwa 3 % der Alveolaroberfläche (WEIBEL et

al., 1976; MORGENROTH u. KISSLER, 1980; HAIES et al., 1981). Untersuchungen an

Ratten haben gezeigt, dass die AII-Zellen kurz nach der Geburt diffus über die Alveole

verteilt sind, sich mit zunehmendem Alter der Tiere jedoch immer mehr in Bereich der

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alveolären Nischen konzentrieren: Einen Tag nach der Geburt befinden sich etwa 30 % aller

AII-Zellen in den alveolären Nischen, am dritten Tag 50 %, am 5. Tag 78 % und beim adulten

Tier 81 % (SHAPIRO et al., 1989). Ultrastrukturell weist die Oberfläche der AII-Zellen

zahlreiche 0,1 µm dicke Mikrovilli mit axialen Filamenten und Exkretionsöffnungen auf

(KUHN, 1978; KAUP et al., 1990a). Das organellenreiche Zytoplasma enthält neben einem

gut entwickelten Golgiapparat, rauem endoplasmatischen Retikulum sowie zahlreichen

Multivesikulärkörperchen und Mitochondrien die für diese Zellen typischen rundlichen bis

ovalen osmiophilen Granula. Diese von einer Membran umgebenen, ca. 0,5 bis 1 µm großen

Organellen bestehen aus konzentrisch angeordneten Lamellen, die eine Periodizität von 4,2

bis 9,4 nm aufweisen (KAUP, 1982; DOUGLAS et al., 1975; STRATTON et al., 1980; POST

et al., 1982) und in denen elektronendichte Bereiche mit einer Dicke von 2,6 nm mit

elektronendurchlässigen mit einer Breite von 1,6 nm alternieren. Aufgrund dieser

Innenstruktur werden sie als Lamellärkörperchen oder Lamellar Bodies bezeichnet (WEIBEL

et al., 1976; KAUP, 1982). Es handelt sich bei diesen Einschlüssen um intrazelluläre

Speicher- und Sekretionsorganellen oberflächenaktiver Substanzen (Surfactant) (ASKIN u.

KUHN, 1971; GIL u. REISS, 1973). Der Volumenanteil der Lamellärkörperchen am

Zytoplasma beträgt ca. 18 bis 24 % (MASSARO u. MASSARO, 1975). Die durchschnittliche

Anzahl dieser Einschlüsse pro AII-Zelle ist tierartlich unterschiedlich: Beim Pferd finden sich

bis zu acht (GILLESPIE u. TYLER, 1967ab) und bei der Ratte bis zu 150 Lamellar Bodies

pro Zelle (YOUNG et al., 1981). Auch die Größe der Lamellärkörperchen weist Unterschiede

auf. Die des Menschen besitzen im Vergleich zur Ratte einen geringeren Durchmesser und

zeigen häufig eine multizentrische Anordnung der Lamellen (MORGENROTH u. KISSLER,

1980; DOBBS, 1990).

Alveoläres Interstitium

Das Bindegewebsgerüst der Lunge wird von deren Interstitium gebildet. Es ist am stärksten

ausgeprägt in der Umgebung von Luftwegen und Arteriolen im Zentrum der Läppchen sowie

um die Venen in deren Peripherie. Auf Ebene der Alveolen sind diese beiden wesentlichen

Lokalisationen des pulmonalen Bindegewebes durch feine Verzweigungen verbunden, die

letztlich das alveoläre Interstitium bilden. Dieses ist zusammengesetzt aus kollagenen und

elastischen Fasern, zwischen denen sich Fibroblasten, Myofibroblasten und Histiozyten

befinden. In diesem Bereich zeigen sich auch spärlich Nerven und Nervenendigungen. Die

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Myofibroblasten liegen in enger räumlicher Beziehung zu den Kapillaren und regulieren die

alveoläre Perfusion (ADLER et al., 1989). Zu den weiteren im Interstitium gelegenen Zellen

gehören eine Form von Histiozyten, die einen Intermediärtyp zwischen Blutmonozyten und

Alveolarmakrophagen darstellt (CROWELL et al., 1992; SEBRING u. LEHNERT, 1992;

JOHANNSON et al., 1997), Mastzellen und lymphoide Elemente. Die Alveolarwände weisen

keine Lymphgefäße auf. Die interstitielle Flüssigkeit wird über die größeren

Bindegewebsansammlungen im Bereich der Luftwege, Arteriolen und Venen drainiert. Die

eigentliche Bindegewebsmatrix der Septen besteht zu 60 % aus kollagenen Fasern, die etwa

20 % des Trockengewichts ausmachen, zu 35 - 40 % aus elastischen Fasern und zu 1 - 2 %

aus Proteoglykanen (HANCE u. CHRYSTAL, 1975). Bei den Kollagenfasern des

Bindegewebes handelt es sich überwiegend um die Typen I und III, der Fasertyp II tritt in den

Knorpelgewebsstrukturen des Tracheobronchialbaumes auf und Typ IV ist ein integraler

Bestandteil der Basalmembran (CLARK et al., 1983; AMENTA et al., 1988). Die elastischen

Fasern finden sich nach SOBIN et al. (1974) vor allem in der Wand der Ductus alveolares und

zwischen den sie umgebenden Blutgefäßen. Gelegentlich bilden sie fächerförmig

aufgesplitterte Ausläufer, die bis in die Alveolarsepten reichen.

Alveoläre Kapillaren

Die kontinuierlichen, alveolären Kapillaren bilden ein stark verflochtenes Netzwerk aus sich

überkreuzenden Gefäßen (GUNTHEROTH et al., 1982). Pro Alveole existieren etwa 1000

solcher Kapillarsegmente (WEIBEL, 1984), wobei jede Blutzelle, die die Lunge durchfließt,

etwa 60 von ihnen passiert. Begleitet werden die Kapillaren von lang ausgezogenen,

kontraktilen Perizyten, die zahlreiche zytoplasmatische Filamente enthalten und in der

endothelialen Basalmembran liegen (WEIBEL, 1974). Die auskleidenden Endothelzellen

besitzen einen abgeflachten Kern und ein schmales, weit ausgezogenes Zytoplasma, das in

seiner Dicke etwa der der AI-Zellen entspricht und eine Lebensdauer von etwa 100 bis 180

Tagen. Die einzelnen Zellen sind durch tight junctions und gap junctions miteinander

verknüpft, überlappen sich häufig unter Ausbildung marginaler Falten und formen einen

geschlossenen Verband. Es finden sich zahlreiche Pinozytosevesikel mit einem Durchmesser

von 60 – 70 nm, die sich sowohl luminal als auch basal als Caveolae öffnen können und als

solche teilweise noch mit einem Diaphragma, bestehend aus einer einfachen Membran,

verschlossen sind. Leukozyten besitzen im Vergleich zu Erythrozyten aufgrund ihrer weniger

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ausgeprägten Verformbarkeit eine geringere Passagegeschwindigkeit durch die dünnen

Alveolarkapillaren (MACNEE u. SELBY, 1990), wobei diese Verzögerung bei entzündlichen

Prozessen noch verstärkt wird. Im Gegensatz zum großen Kreislauf, in dem die Migration

neutrophiler Granulozyten auf Ebene der Venulen stattfindet, erfolgt sie in der Lunge in den

Alveolarkapillaren (DOWNEY et al., 1993).

Lungenmakrophagen

Da die Lunge permanent einer großen Bandbreite an Umweltpathogenen ausgesetzt ist, stellt

sie eine wichtige Eintrittspforte für Infektionskrankheiten dar. Alveolarmakrophagen spielen

daher im Atmungstrakt eine wesentliche Rolle im Rahmen der körpereigenen Abwehr und

sind in der Lage zahlreiche zytotoxische und immunregulatorische Substanzen, wie ROI

(Reactive Oxygen Intermediates), TNFα oder Interleukine, zu bilden (LOHMANN-

MATTHES et al., 1994). In Abhängigkeit von ihrer Lokalisation lassen sich die

Lungenmakrophagen in verschiedene Untergruppen einteilen: Alveolarmakrophagen,

interstitielle und intravasale Makrophagen (LOHMANN-MATTHES et al., 1994).

Alveolarmakrophagen besitzen aufgrund ihrer Lokalisation in der Interphase des alveolären

Surfactantfilms eine einzigartige Stellung (JOHNSSON et al., 1986). Es handelt sich um die

einzigen Makrophagen im Organismus, die physiologischerweise Kontakt zu atmosphärischer

Luft besitzen. Sie bilden somit die erste Linie der körpereigenen Abwehr gegen inhalierte

Pathogene und spielen eine große Rolle bei der Clearence aufgenommener Staubpartikel.

Hinsichtlich der Fc-Rezeptor-vermittelten Phagozytose zeigen alveoläre und interstitielle

Makrophagen dieselbe Effektivität (CROWELL et al., 1992; LAVNIKOVA et al., 1993). In

Bezug auf andere Funktionen weisen diese beiden Subpopulationen erhebliche Unterschiede

auf. So besitzen Alveolarmakrophagen eine höhere Aktivität bei der Fc-Rezeptor-

unabhängigen Phagozytose, der Bildung von Sauerstoffradikalen und diversen Cytokinen wie

TNFα und IFN-α / β , weisen jedoch eine vergleichsweise geringere Expression von MHCII-

Molekülen, von IL-1 und IL-6 auf (STEINMÜLLER et al., 2000). Alveolarmakrophagen

besitzen unregelmäßige Umrisse und zahlreiche Pseudopodien als prominente,

zytoplasmatische Ausstülpungen. Das Zytoplasma ist reich an dichten Vesikeln mit

lysosomalen Enzymen, ebenso an Phagosomen und multilokulären Phagolysosomen

(CORRIN et al., 1969). Alveolarmakrophagen sind normalerweise in dem die Alveolen

auskleidenden Flüssigkeitsfilm lokalisiert, können jedoch im Zuge einer Immersionsfixierung

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abgeschwemmt werden. Das die innere Oberfläche der Lunge auskleidende Material ist

chemotaktisch für Alveolarmakrophagen (SCHWARTZ u. CHRISTMAN, 1979), deren

Phagozytoseaktivität zudem durch Surfactant gesteigert wird (LAFORCE et al., 1973).

Gleichzeitig dienen sie unter anderem auch dem Abbau von sezernierten

Surfactantbestandteilen (RAO et al., 1981). Die Herkunft der Alveolarmakrophagen ist

Gegenstand zahlreicher Diskussionen. Es existieren höchstwahrscheinlich zwei wesentliche

Mechanismen für die Aufrechterhaltung dieser Makrophagenpopulation. Hierzu gehört zum

einen die chemotaktische Rekrutierung von Blutmonozyten, die wiederum dem Knochenmark

entstammen und unter steady-state-Bedingungen sowie bei akuten entzündlichen

Veränderungen in die Alveolen emigrieren (BLUSSE VAN OUD ALBAS u. VAN FURTH,

1979; ADAMSON u. BOWDEN, 1980; BOWDEN u. ADAMSON, 1980; BLUSSE VAN

OUD ALBAS et al., 1983; TAKAHASHI et al., 1996). Zum anderen spielt, da sich auch

teilende Makrophagen in den Alveolarlumina nachweisen lassen, die Proliferation

ortsständiger Zellen eine Rolle (GOLDE et al., 1974; CHEN et al., 1988; LOHMANN-

MATTHES et al., 1994). Es existieren Hinweise darauf, dass die Proliferation vor Ort den

größten Anteil an der Aufrechterhaltung der Population der Alveolarmakrophagen besitzt

(SHELLITO et al., 1987). Die Verweildauer der Alveolarmakrophagen in der Lunge beträgt

beim Menschen etwa sieben Tage (BOWDEN u. ADAMSON, 1982). Danach wird der größte

Teil der Zellen über die Luftwege abtransportiert und schließlich abgeschluckt oder

ausgehustet, wobei die Atembewegungen diese Wanderung unterstützen. Auch eine Rückkehr

der Alveolarmakrophagen in das Interstitium ist möglich. Da sie dazu neigen sich in den

Lungenbläschen anzusammeln, die die relativ unbeweglichen bronchiovaskulären Strukuren

im Zentrum der Lungenacini begrenzen, erfolgt der Übertritt vor allem in diesem Bereich

(HARMSEN et al., 1985). Es wird in diesem Zusammenhang angenommen, dass die

interstitielle Translokation von Makrophagen eine Rolle bei der Antigenpräsentation und der

Einleitung immunologischer Reaktionen spielt (HARMSEN et al., 1985). Bei

Lungenerkrankungen zeigt sich sowohl eine erhebliche Zunahme an Alveolarmakrophagen

als auch an weniger differenzierten, im Interstitium befindlichen Makrophagen. Letztere

können gelegentlich bei der Emigration in das Alveolarlumen beobachtet werden

(VIJEYARATNAM u. CORRIN, 1972). Im Tiermodell konnte gezeigt werden, dass bei

entzündlichen Reaktionen eine biphasische Antwort erfolgt, mit einem Influx von Monozyten

in den ersten 24 Stunden und einer späteren Proliferation von Makrophagen im Interstitium

(ADAMSON u. BOWDEN, 1980). Kinetikstudien haben ergeben, dass die meisten

Monozyten, die sich in Alveolarmakrophagen umwandeln, sehr rasch in die Alveolen

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auswandern und nur ein geringer Prozentsatz sich zuerst im Interstitium differenziert

(ADAMSON u. BOWDEN, 1980, 1982). Die Reifung von Monozyten geht einher mit einer

Zunahme an Zytoplasma, einer Abnahme der Myeloperoxidaseaktivität und der Entwicklung

charakteristischer Lysosomen. Bei erhöhtem Bedarf können in den Alveolen aber auch

unreife Makrophagen mit nur spärlichen Lysosomen beobachtet werden. Bei den

verschiedenen Subpopulationen an Alveolarmakrophagen, die aufgrund unterschiedlicher

Dichte getrennt werden können, handelt es sich vermutlich um einzelne Reifungsstadien

(NAKSTAD et al., 1989).

Tabelle 1: Anteil von Makrophagen an der Gesamtzellzahl der Lunge bei verschiedenen

Spezies

Mensch

(CRAPO et

al., 1982)

Pavian

(CRAPO et

al., 1994)

Ratte

(CRAPO et

al., 1980)

Gesamtzellzahl / Lunge (x109) 230 ± 25 48 ± 5 0,89 ± 0,04

Anteil von Makrophagen an der

Gesamtzellpopulation (%)

9,4 ± 2,2 2,3 ± 0,7 3,0 ± 0,3

Lymphozyten

B- und T-Lymphozyten, wobei letztere in zwei Subpopulationen (Th1- und Th2-Zellen)

unterteilt werden können, sind wesentlich an humoraler und zellulärer Immunabwehr sowie

an Überempfindlichkeitsreaktionen beteiligt (Corrin, 2000). Sie spielen jedoch nur bei einem

Teil der entscheidenden zellulären Interaktionen in Rahmen der primären und sekundären

Immunreaktionen eine Rolle und müssen in enger Nachbarschaft zu antigenpräsentierenden

Zellen lokalisiert sein. Es wird angenommen, dass auch im Körper zirkulierende und in die

Lunge eingewanderte Lymphozyten aus dem Gastrointestinaltrakt nach oraler Immunisierung

eine Rolle bei der pulmonalen Immunabwehr spielen. Lymphozyten finden sich sowohl im

Bereich von Epithel und Lamina propria der luftführenden Wege, im Bronchus-assoziierten

lymphatischen Gewebe (BALT), im Lungenparenchym und den bronchioalveolären Räumen.

Zudem existiert ein pulmonaler intravaskulärer Pool, der sich in seiner Zusammensetzung aus

den verschiedenen lymphozytären Subpopulationen vom peripheren Blut unterscheidet

(Übersicht in PABST u. TSCHERNIG, 1995). Beim Pferd existieren vergleichsweise wenige

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Untersuchungen über Verteilung und Anteile der einzelnen Subpopulationen in der Lunge.

Beim Menschen überwiegen im trachealen und bronchialen Epithel zytotoxische T-Zellen

(CD8+) gegenüber T-Helferzellen (CD4+) (FOURNIER et al., 1989), B-Lymphozyten

werden hier kaum angetroffen, während in der bronchialen Lamina propria CD4+-Zellen

vorherrschen (HUNNINGHAKE et al., 1981). Stichprobenartige Untersuchungen von

Lungenbiopsieproben (WATSON et al., 1997) weisen auf ähnliche Verhältnisse beim Pferd

hin. Bei Patienten mit Idiopathic Nonspecific Interstitial Pneumonia (NSIP) und

Lungenfibrose finden sich nach YAMADORI et al. (2000) B-Lymphozyten hauptsächlich im

Bereich von Lymphfollikeln, CD4+-Lymphozyten sind in deren Peripherie und in den

verbreiterten Wänden fibrotischer Alveolen lokalisiert, während CD8+-Zellen eher diffus

verteilt sind. Bei diesen klinischen Entitäten zeigt sich auch eine Zunahme von Lymphozyten

in der BALF. Die Rolle von Lymphozyten bei der Entstehung fibrotischer Veränderungen in

Zusammenhang mit verschiedenen Lungenerkrankungen ist unterschiedlich. Aufgrund von

Tierversuchsergebnissen vermuten MAJESKI et al. (2003), dass T-Lymphozyten von

wesentlicher Bedeutung bei der Entwicklung einer intraluminalen Fibrose bei Bronchiolitis

Obliterans Organizing Pneumonia sind, nicht jedoch bei ARDS. Nach DAVIS et al. (2001)

existieren starke Hinweise darauf, dass Lymphozyten eine Rolle bei der Entstehung der

silikoseinduzierten Lungenfibrose spielen, während IRIFUNE et al. (2003) bei chronischer

Hypersensitivity Pneumonitis lediglich eine Beteiligung von TH1-Zellen an der Ausbildung

einer reversiblen Alveolitis beschreibt, eine fibrogene Wirkung jedoch verneint. Beim Pferd

lässt sich in Zusammenhang mit Chronischer Obstruktiver Bronchopneumonie (COB) eine

erhebliche Zunahme an CD4+-Zellen und des CD4/CD8-Verhältnisses im peripheren Blut

nachweisen (WATSON et al., 1997).

Dendritische Zellen (DC)

Beim Pferd existieren nahezu keine Untersuchungen über pulmonale, dendritische Zellen,

während die Verhältnisse bei anderen Tierarten (z. B. Ratte (HOLT et al., 1990), Maus und

Meerschwein (SCHOON-HEGRAD et al., 1991)) und beim Menschen (HOLT et al., 1989)

ausführlich beschrieben sind. Sie besitzen eine nur kurze Lebensdauer, und die biologische

Erneuerung, die innerhalb eines Zeitraums von 7 - 10 Tagen stattfindet, erfolgt, verglichen

mit mehr als 21 Tagen bei epidermalen Langerhans-Zellen, sehr rasch. Sie reagieren auf

bakterielle oder virale Infektionen mit einer raschen Proliferation (HOLT u. STUMBLES,

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2000). Dendritische Zellen sind primär für Antigenprocessing, Antigenpräsentation und T-

Zell-Aktivierung verantwortlich. Sie bestimmen maßgeblich das Ausmaß, die Kinetik und die

Art einer adaptiven Immunreaktion (Übersicht in PEEBLES u. GRAHAM, 2001), sie sind

jedoch auch über die Ausschüttung von IL-10 an der Ausbildung einer Toleranz gegenüber

inhalierten Antigenen beteiligt (ABCARI et al., 2001). Ganz allgemein werden dendritische

Zellen aufgrund ihres Reifegrades und ihrer Lokalisation eingeteilt (Übersicht in LIPSCOMB

u. MASTEN, 2002):

- DC-Vorläufer in Knochenmark und Blut,

- unreife DC außerhalb lymphatischer Organe, z. B. im Trachealepithel,

- reifende DC nach Aufnahme von Antigenen, wie sie z. B. in afferenten Lymphgefäßen

anzutreffen sind,

- reife, antigenpräsentierende DC in Lymphknoten.

In der humanen Lunge sind zwei verschiedene Arten von dendritischen Zellen beschrieben:

Follicular Dendritic Cells als Bestandteil des Bronchus-assoziierten lymphatischen Gewebes

und S100-positive Interdigitating Dendritic Cells (HANCE, 1993; VANHAARST et al.,

1994). Beide leiten sich von Stammzellen aus dem Knochenmark ab und erreichen die Lunge

auf hämatogenem Wege. Interdigitating Dendritic Cells finden sich in Lymphknoten und sind

weit verbreitet im Bindegewebe der Lunge, im Bereich der Wände von Bronchien, Bronchioli

und Alveolen, interlobulären Septen und der Pleura anzutreffen. Sie besitzen lange

zytoplasmatische Ausläufer, bilden an der Epithelbasis in den luftführenden Wegen ein

Netzwerk und nehmen somit für die Erkennung inhalierter Antigene eine ideale Position ein.

Beide Typen von dendritischen Zellen dienen der Antigenpräsentation gegenüber T-

Lymphozyten. Die Antigenpräsentation erfolgt über deren Oberfläche in Assoziation mit dem

HLA-DR-Histokompatibilitätskomplex. Auch größere antigentragende Partikel, wie Konidien

oder Hyphen von Pilzen, werden phagozytiert. Langerhans-Zellen, die sich zwar überwiegend

in der Epidermis, jedoch auch in geringer Anzahl in der Lunge finden, stellen eine

Subpopulation dendritischer Zellen dar. Ebenso wie dendritische Zellen sind sie in der

unveränderten Lunge in der Regel nicht im Alveolarlumen anzutreffen. Sie zeichnen sich

durch die so genannten Birbeck-Granula aus (BIRBECK et al., 1961), die im Zuge der

Ingestion oberflächengebundener Antigene im Zytoplasma entstehen. Bemerkenswert ist, dass

sich pulmonale Langerhans-Zellen bei Patienten mit fibrotischen Lungenveränderungen nicht

nur im Bronchialepithel, sondern auch im Epithel von Alveolen mit proliferierenden AII-

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Zellen nachweisen lassen (KAWANAMI et al., 1981). Die Anzahl dendritischer Zellen steigt

aufgrund ihrer Aufgabe an, Antigene im Rahmen von Immunreaktionen gegenüber

Lymphozyten zu präsentieren (MCWILLIAM et al., 1994). DC können in diesem

Zusammenhang aus dem Bereich des Epithels in die regionären Lymphknoten auswandern

(HOLT et al., 1994). Dort sind in dendritischen Zellen MHC II / Antigen–Komplexe noch

über längere Zeit nachweisbar (VU et al., 2002). Die Lebensdauer der dendritischen Zellen

ist, wie bereits erwähnt, begrenzt und ihr Verbleib in den Lymphknoten daher terminiert.

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2.2 Interstitielle Pneumonie und Diffuse Alveolar Damage (DAD)

Der Begriff Diffuse Alveolar Damage (DAD) ist in der Humanmedizin die Bezeichnung für

ein Syndrom, das durch einen diffusen Schaden des Alveolarepithels und des

Kapillarendothels im distalen Lungenparenchym hervorgerufen wird und gleicht in Ätiologie,

Pathogenese und Verlauf dem Wesen der interstitiellen Pneumonie, wie sie in der

Veterinärmedizin aufgefasst wird. Die klinischen Symptome als Folge dieser Veränderungen

werden unter dem Begriff Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS) zusammengefasst

und sind charakterisiert durch respiratorische Insuffizienz, Zyanose und arterielle Hypoxämie,

die letztlich zu einem extrapulmonalen Multisystemischen Organversagen (MOV) und zum

Tod führen können. Klassischerweise wird der Ablauf der interstitiellen Pneumonie in drei

Phasen eingeteilt: initiale Entzündung / exsudative Phase, fibroproliferative Phase und

schließlich Regeneration oder interstitielle und interalveoläre Fibrose (ZAPOL et al., 1979;

KERINS et al., 1995; MEDURI, 1996). Die Ergebnisse jüngerer Untersuchungen weisen

jedoch darauf hin, dass entzündliche und fibrotische Prozesse nicht wie ursprünglich

angenommen nacheinander ablaufen, sondern parallel (ASHA et al., 1997; CHESNUTT et al.,

1997b; MARSHALL et al., 2000). Wie weit interstitielle Pneumonien bei Pferden verbreitet

sind, ist nicht genau geklärt. Zwar wiesen nach Untersuchungen von WINDER und VON

FELLENBERG (1987) an 115 Schlachtpferden bereits 15,6 % der Tiere das

histopathologische Erscheinungsbild einer interstitiellen Pneumonie auf, es wird jedoch noch

zusätzlich mit einer erheblichen Dunkelziffer gerechnet. Nach der Auswertung von 4255

Sektionsfällen in Kentucky zwischen den Jahren 1993 und 1996 waren interstitielle

Pneumonien mit 12,5 % aller Fälle die zweithäufigste Erkrankung der unteren Atemwege

beim Pferd (WILLIAMS, 1997).

Das wesentliche pathohistologische Kriterium einer interstitiellen Pneumonie ist eine diffuse

oder unregelmäßig verteilte Schädigung der alveolären Septen, die vorrangig zu einer initialen

exsudativen Reaktion führt, gefolgt von proliferativen und / oder fibrotischen Prozessen

(KERINS et al., 1995; MEDURI, 1996). Dieser Zustand kann durch verschiedene Insulte

herbeigeführt werden, zu denen neben infektiösen Ursachen (z. B. Influenza equi, Equines

Arteriitis Virus, Pneumocystis carinii), anorganischen Stäuben (z. B. Silikose) Toxinen

(Pyrrolizidinalkaloide, Crofton Weed, Perillaketon), Hypersensitivitätsreaktionen und akuter

Pankreatitis auch Schock und Septikämie gehören, wobei die Ursache beim Pferd nur selten

festgestellt werden kann (MOORE et al., 1981; TURK et al., 1981; BUERGELT et al., 1986;

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DIEKMANN et al., 1990; BRUCE, 1995; BUERGELT, 1995; PERRON-LEPAGE et al.,

1999; DEL PIERO, 2000). Auch die toxische Wirkung durch die therapeutische Applikation

hochkonzentrierten Sauerstoffs ist eine mögliche Ursache (JUBB, 1991). Das Fehlen einer

bevorzugten Orientierung der Schäden im Bereich kleiner luftführender Wege unterscheidet

die interstitielle Pneumonie von der Bronchopneumonie. Im Allgemeinen treten die

Veränderungen disseminiert auf, oft jedoch akzentuiert in den dorsokaudalen

Lungenabschnitten. In den meisten Fällen sind die auslösenden Insulte für die

Alveolarschäden hämatogenen Ursprungs, was zu einem ausgedehnten oder unregelmäßigen

Verteilungsmuster der Schäden in den Azini führt, wohingegen sie bei aerogener Irritation

zentroazinär lokalisiert sind. Es gibt jedoch auch Ausnahmen von dieser für den Ursprung der

Noxen typischen Verteilung. Ebenso wie in anderen Organen sind die morphologisch

fassbaren Reaktionen auf viele unterschiedliche Agentien sehr ähnlich und nicht spezifisch für

die jeweilige Ätiologie. Unabhängig davon, ob die Ursachen toxischer, metabolischer oder

infektiöser Natur sind, verursachen sie Schäden an Alveolarepithelzellen vom Typ I und am

alveolären Kapillarendothel. Art, Eintrittspforte und Intensität einer Noxe bestimmen jedoch

die zeitliche Reihenfolge, ob als Erstes Epithel- oder Endothelschäden auftreten. Aufgrund

ihrer fehlenden Regenerationsfähigkeit sind Alveolarepithelzellen vom Typ I in der Regel am

stärksten betroffen (JUBB, 1991). In einem frühen Stadium zeigen AI-Zellen Vesikelbildung

im Zytoplasma, gefolgt von Zelluntergang, Ablösung und Freilegung der Basalmembran.

Auch an kapillären Endothelzellen findet sich eine Vesikelbildung, aufgrund ihres besseren

Regenerationsvermögens lassen sich jedoch bloßgelegte endotheliale Basalmembranen nur

sehr selten beobachten (CORRIN u. VIJEYARATNAM, 1975; BACHOFEN u. WEIBEL,

1977). Während dieser akuten Phase können serofibrinöses Exsudat, Stauung und Ödeme der

Alveolarwände beobachtet werden. Fibrin, andere Serumproteine und Zelldebris kondensieren

dabei häufig zu hyalinen Membranen (HILL et al., 1976; KATZENSTEIN et al., 1976).

Zudem finden sich im alveolären Exsudat für gewöhnlich Leukozyten und Erythrozyten sowie

eine gemischtzellige, interstitielle Infiltration. Der Ersatz degenerierter AI-Zellen erfolgt

durch Proliferation und Differenzierung von AII-Zellen, wobei die intakte Basalmembran als

Leitschiene dient. Alveolen, gesäumt von kubischen AII-Zellen, sind ein typisches Zeichen

für subakute bis chronische interstitielle Pneumonien (ADAMSON u. BOWDEN, 1974).

Nach Regression der Entzündung und bei fehlender Fibrose der Alveolarwände ist eine

vollständige Heilung möglich. Die Proliferation der AII-Zellen markiert den Übergang von

der exsudativen in die proliferative Phase. Beginnende fibrotische Veränderungen zu diesem

Zeitpunkt sind mögliche und sehr kritische Prozesse. Bereits 72 h nach einem DAD kann die

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Proliferation von Fibroblasten eintreten und unreife Fibroblasten können innerhalb von drei

Tagen nach hochgradiger Exsudation in den Alveolarlumina beobachtet werden. Fibrotische

Prozesse können also sowohl interalveolär als auch intraalveolär ablaufen, wobei deren

Umfang vom Ausmaß der Entzündungsreaktion abhängt (MEDURI u. CHINN, 1994). Bei

überlebenden Tieren heilen akute interstitielle Pneumonien mit mehr oder weniger stark

ausgeprägter Narbenbildung ab. Ähnlich der kutanen Wundheilung sind auch in der Lunge

Myofibroblasten mit in reparative Vorgänge einbezogen (PACHE et al., 1998). Chronische,

progressive Entzündungen sind nur selten zu beobachten und stehen in Zusammenhang mit

einer dauerhaften oder wiederholten Exposition gegenüber dem auslösenden Agens. Die

chronische interstitielle Pneumonie ist durch die intraalveoläre Akkumulation mononukleärer

Zellen - in erster Linie Makrophagen - durch Proliferation und Persistenz von AII-Zellen,

interstitielle lymphozytäre Infiltrate und Zubildung von Bindegewebe charakterisiert (JUBB,

1991).

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2.3 Zelltod: Nekrose und Apoptose

2.3.1 Morphologische und biochemische Kriterien von Apoptose und Nekrose

Beim Zelluntergang ist grundsätzlich zwischen einem passiven und einem aktiv durch die

Zelle selbst herbeigeführten Zelltod zu unterscheiden. Die Nekrose ist ein pathologisch

bedingtes Absterben von Zellen infolge einer Noxe, wie z. B. Anoxie, chemischen oder

physikalischen Einflüssen etc., die zu einer irreparablen Schädigung führen. Der Zelltod

durch Apoptose wird durch zelleigene Proteine und energieabhängige Syntheseprozesse von

der sterbenden Zelle aktiv vollzogen (GREEN et al., 1994), weshalb viele Autoren die

Bezeichnung Active Cell Death (ADC) vorziehen (GREEN et al., 1994; SCHULTE-

HERMANN et al., 1994).

Tabelle 2: Morphologische Kriterien zur Differenzierung von Apoptose und Nekrose

(THOMPSON et al., 1992)

Apoptose Nekrose

Absterben einzelner Zellen Absterben von Zellgruppen Vesikelbildung an der Zellmembran ohne Integritätsverlust

Verlust der Membranintegrität

intakte Lysosomen Auflösung der Lysosomen homogene Kondensation des Chromatins inhomogene Clusterbildung des

Chromatins cell shrinkage und Zerfall in apoptotische Körperchen

Zellschwellung und Lyse

Phagozytose durch Nachbarzellen und Makrophagen

Phagozytose durch Makrophagen

fehlende entzündliche Reaktion entzündliche Reaktion

Tabelle 3: Biochemische Kriterien zur Differenzierung von Apoptose und Nekrose

(THOMPSON et al., 1992)

Apoptose Nekrose

feinregulierter Prozess mit Synthese- und Aktivierungsschritten

Verlust der Regulation der Ionenhomöostase

de novo Transkription von Genen fehlende de novo Transkription von Genen energieabhängiger Prozess energieunabhängiger Prozess abhängig von der Synthese essentieller Makromoleküle

unabhängig von Protein- oder Nukleinsäuresynthese

geordnete Fragmentierung der DNA in Oligonukleosomen (180 – 200 bp)

ungeordnete Verdauung der DNA

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29

2.3.2 Die Rolle von Apoptose bei akutem Alveolarschaden

DAD-Patienten weisen erhebliche Schäden des Alveolarepithels auf, die eine wesentliche

Rolle in der Pathogenese der Erkrankung spielen (WARE u. MATTHAY, 2000). Diese stellen

eine Reaktion auf eine Vielzahl möglicher Noxen dar, die in diesem Zusammenhang nicht

direkt zur Nekrose führen, sondern den Active Cell Death einleiten (HENGARTNER, 2000).

Aufgrund der Signalwege die hier eine Rolle spielen, kann grob zwischen einer

rezeptorvermittelten, Fas-abhängigen und einer mitochondrienabhängigen Apoptose

unterschieden werden (BUDINGER u. CHANDEL, 2001). Der erste Weg, der vor allem im

Bereich entzündlicher Veränderungen anzutreffen ist, geht mit der verstärkten Sekretion des

proapoptotischen Moleküls FasL einher, das über die Bindung an spezifische Rezeptoren die

Caspasekaskade aktiviert (WALCZAK u. KRAMMER, 2000). Die zweite Möglichkeit führt

über die Zerstörung der Mitochondrienmembran zur Freisetzung von Cytochrom C in das

Cytosol und in der Folge ebenfalls zum Ablauf der Caspasekaskade (VAN DER HEIDEN,

1999; KROEMER u. REED, 2000). Die mitochondrienabhängige Apoptose ist im Gegensatz

zur Fas-abhängigen eine Reaktion auf viele verschiedene Stimuli, zu denen neben oxidativem

Stress, Chemotherapeutika und Strahlung (BUDINGER u. CHANDEL, 2001) möglicherweise

auch mechanische Überbeanspruchung gehört (EDWARDS et al., 1999). In der BAL-

Flüssigkeit von ARDS-Patienten finden sich deutlich erhöhte FasL-Konzentrationen, deren

apoptosefördernde Wirkung auf Zellkulturen durch neutralisierende Antikörper gehemmt

werden kann (MATUTE-BELLO et al., 1999). Auch zeigt sich in vitro nach periodischer

mechanischer Überdehnung von AII-Zellmonolayern ein Anstieg von Apoptosemarkern

(EDWARDS et al., 1999). Eine IL-6 induzierte verstärkte Bcl-2-Expression kann über die

Stabilisierung der Mitochondrienmembran Lungenzellen vor Apoptose als Folge

hyperoxischer Einwirkung schützen (WARD et al., 2000). Eine Bcl-2 Überexpression übt

jedoch keinen Einfluss auf die FasL- oder TNF- mediierte Apoptose aus (WALCZAK u.

KRAMMER, 2000). Zusammengefasst kann man aufgrund einer mittlerweile großen Anzahl

von Studien vermuten, dass bei ARDS sowohl der Fas- als auch der mitochondrienabhängige

Active Cell Death große Bedeutung besitzen (BUDINGER u. CHANDEL, 2001). Historisch

ging man davon aus, dass die Mechanismen des Zelltodes sich bei Zellen mit den

morphologischen Erscheinungen von Apoptose bzw. Nekrose unterscheiden. Nach neueren

Untersuchungen wird jedoch eine etwas andere Betrachtungsweise vorgeschlagen. Die

verschiedenen morphologischen Veränderungen sind möglicherweise nur in einem

unterschiedlichen ATP-Gehalt der betroffenen Zellen zum Zeitpunkt einer

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30

Caspaseaktivierung begründet. Da die Caspasekaskade ATP-abhängig ist, kann bei einer

vorliegenden ATP-Depletion oder einer Caspasehemmung ein weniger geordneter

„nekrotischer“ Zelltod ablaufen (EGUCHI et al., 1997; HIRSCH et al., 1997). Bei der eher

geordneten „apoptotischen“ Form des Zelltodes könnte pharmakologisch die Überlebensrate

von Zellen und somit die Prognose bei ARDS verbessert werden, während bei den

minderregulierten Formen derartige Therapieversuche wohl erfolglos bleiben würden

(BUDINGER u. CHANDEL, 2001).

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31

2.4 Ki-67 als Proliferationsmarker

Ki-67 ist ein kernständiges Nicht-Histon Protein, das sehr eng mit der Proliferation von

somatischen Zellen verknüpft (ENDL u. GERDES, 2000) und in allen aktiven Phasen des

Zellzyklus nachweisbar ist (GERDES et al., 1984). Die Expression beginnt bei vorher

ruhenden Zellen in der späten G1-Phase, steigt in der S-Phase an und erreicht das Maximum

in der G2- und M-Phase (SASAKI et al., 1987). Nach der Mitose fällt sie sofort ab. Sich

kontinuierlich teilende Zellen zeigen während der gesamten G1-Phase eine positive Reaktion

für Ki-67. Die G0-Phase ist regelmäßig Ki-67-negativ (GERDES et al., 1984). Während des

größten Teils der Interphase in vitro proliferierender Zellen wird Ki-67 hauptsächlich in den

Nukleoli und dort insbesondere in deren Peripherie vorgefunden (TAKAGI et al., 1999). In

der Mitose findet sich Ki-67 bei Mensch und Maus als Netzwerk an der Oberfläche

kondensierter Chromosomen (VERHEIJEN et al., 1989; TAKAGI et al., 1999). Sehr bald

nach dem Austritt aus der Mitose, in der frühen G1-Phase, ist Ki-67 über viele kleine nukleäre

Foci verteilt, die später in der G1-Phase in und um den neu gebildeten Nukleolus und die

Heterochromatinbezirke des Kerns kondensieren (KREITZ et al., 2000). Nach Sequenzierung

der cDNA des Ki-67 Proteins durch SCHLÜTER et al. (1993) ist eine breite Palette an

monoklonalen Antikörpern (z. B. MIB 1-3, MIB 5, IND.64, JG-67-2a) gegen rekombinante

Teile des Ki-67-Antigens erhältlich (KUBBUTAT et al., 1994). Das Gen besitzt eine Länge

von etwa 30.000 bp und enthält 15 Exons. Die Transkription und anschließende Prozessierung

führen zur Entstehung verschiedener Splicingvarianten des Proteins, zu denen auch die beiden

prominenten Formen gehören, die auf Proteinebene nachgewiesen werden. Die Tatsache, dass

Ki-67 ausschließlich während der Mitose exprimiert wird, macht die Markierung dieses

Proteins durch spezifische Antikörper zu einem wichtigen und mittlerweile sehr verbreiteten

Instrument zur Beurteilung der Zellproliferation (SCHOLZEN u. GERDES, 2000). Auch

beim Pferd wurde die Markierung von Ki-67 bereits von verschiedenen Autoren in

Zusammenhang mit zahlreichen Fragestellungen verwendet und die Kreuzreaktivität,

insbesondere von MIB-1, mit equinem Material gesichert (MARTENS et al., 2000; ROELS et

al., 2000; WATSON u. AL-ZI`ABI, 2002). Trotz der zahlreichen Untersuchungen über Ki-67

ist dessen genaue Funktion des Proteins jedoch bislang noch unbekannt.

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32

2.5 Struktur, Verteilung und Stoffwechsel von Kollagen in der Lunge

Allgemein

Zur Familie der Kollagene gehören bislang 20 bekannte eng verwandte Mitglieder, die grob in

sieben verschiedene Gruppen eingeteilt werden (HULMES, 1992). Eine achte Gruppe besteht

aus Proteinen, die teilweise typische tripelhelikale Domänen besitzen, jedoch nicht zu den

Kollagenen gezählt werden. Die fibrillären Formen, zu denen auch Kollagen Typ I und III

gehören, stellen die in der Lunge am häufigsten auftretende Gruppe dar (KIRK et al., 1984).

Prinzipiell besitzen alle Kollagene die gleiche Grundstruktur (KÜHN, 1986). Sie setzen sich

aus jeweils drei Polypeptid-α-Ketten zusammen, die entweder identische oder verschiedene

AS-Sequenzen besitzen können (VAN DER REST u. GARRONE, 1991; BIENKOWSKI u.

GOTKIN, 1995). Diese bilden höhermolekulare Vorstufen, die so genannten Prokollagene,

die zusätzlich globuläre N- und C-terminale Extensionspeptide besitzen und aus denen

letztlich reife Kollagenproteine entstehen. In Verbindung mit den 20 Isotypen wurden bislang

33 verschiedene α-Ketten entdeckt. Die Extensionspeptide sollen unter anderem eine

intrazelluläre Fibrillogenese verhindern, da die tripelhelikalen Kollagenmonomere eine starke

Tendenz zum self-assembly besitzen (CROUCH, 1990). Im Rahmen der Fibrillogenese lagern

sich drei proα-Ketten an ihren C-terminalen Bereichen aneinander, um in N-terminaler

Richtung fortschreitend eine rechtsgewundene Tripelhelix mit einem Durchmesser von etwa

1,5 nm zu bilden (KÜHN, 1986). Zur Stabilisierung der helikalen Struktur erfolgt die

posttranslationale Hydroxilierung etwa der Hälfte aller Prolinreste. Nach Sekretion des

Proteins werden die Extensionspeptide der proα-Ketten durch teilweise membranständige

Proteasen abgespalten und durch das endständige und laterale Aneinanderlagern von

Kollagenmonomeren entstehen Fibrillen. Man ging lange Zeit davon aus, dass einmal

gebildetes Kollagen inert sei und keinem weiteren Stoffwechsel unterliege. Tatsächlich hat

sich jedoch gezeigt, dass sich Kollagene ebenso wie andere Proteine durch ständige Auf- und

Abbauvorgänge in einem dynamischen Gleichgewicht befinden. Man vermutet, dass bei

jungen erwachsenen Ratten pro Tag etwa 10 % des gesamten Kollagengehaltes der Lunge

umgesetzt werden (MCANULTY u. LAURENT, 1987). Diese Umbauraten sind bei

wachsenden Tieren größer und nehmen mit fortschreitendem Alter ab. Der permanente

Turnover von Kollagen bleibt jedoch zeitlebens auf einem gewissen Level erhalten (MAYS et

al., 1989; MAYS et al., 1991).

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33

2.5.1 Kollagen Typ I und Typ III

Das in der menschlichen Lunge befindliche Kollagen besteht zu 90 % aus den interstitiellen

Fasertypen I und III, die beim Erwachsenen in der unveränderten Lunge in einem Verhältnis

von etwa 2:1 vorliegen (KIRK et al., 1984b) und sich außer im Interstitium noch in großen

Bronchien und Blutgefäßen finden. Fibroblasten, die etwa 40 % aller Lungenzellen

ausmachen, stellen die Hauptproduzenten der Kollagentypen I und III dar (HANCE et al.,

1976), wobei jedoch auch Endothelzellen (MACARAK, 1984), Epithelzellen (BIENKOWSKI

u. GOTKIN, 1995), Mesothelzellen (RENNARD et al., 1984) und glatte Muskelzellen zu

deren Synthese in der Lage sind (BIENKOWSKI u. GOTKIN, 1995). Kollagen Typ I ist aus

drei so genannten α(I)-Ketten aufgebaut, die sich vor allem durch ihren hohen Prolingehalt

von bis zu 20 % auszeichnen, der die helikale Struktur der Ketten bedingt, und durch ihre

Primärstruktur mit Glycin in jeder dritten Position. Bei einem Kollagen Typ I-Molekül

handelt es sich in der Regel um ein Heterotrimer aus zwei α1(I)- und einer α2(I)-Kette. Bei

Mangel an α2(I)-Ketten können auch α1(I)-Homotrimere gebildet werden (BIENKOWSKI u.

GOTKIN, 1995). Die Gene für die proα1(I)- und proα2(I)-Ketten - COL1A1 und COL1A2 -

befinden sich beim Menschen auf den Chromosomen 17 bzw. 7 (SANDEL u. BOYD, 1990).

Obwohl die mRNA-Konzentrationen normalerweise ein recht stabiles Verhältnis von 2:1

aufweisen, kann die Transkription der Gene unabhängig voneinander erfolgen (FINE et al.,

1989; FINE et al., 1990). Kollagen Typ III ist in Struktur und Zusammensetzung dem

Kollagen Typ I sehr ähnlich, wobei es jedoch im Unterschied dazu ein Homotrimer aus

α1(III)-Ketten darstellt. Beide Formen finden sich vorrangig im Interstitium (BIENKOWSKI

u. GOTKIN, 1995), wobei diese interstitiellen Kollagenfibrillen Kopolymere dieser beiden

Kollagentypen darstellen (FLEISCHMAJER et al., 1990; XU et al., 1993). Kollagen Typ I

und III können aber auch in Verbindung mit dem von glatten Muskelzellen und Fibroblasten

sezernierten Kollagen Typ IV im Interstitium feine Fasern bilden (AMENTA et al., 1988).

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34

2.5.2 Regulation des Kollagenstoffwechsels

Es existieren zahlreiche Mechanismen zur Regulation des Kollagenstoffwechsels. Diese

schließen die Migration von Fibroblasten zu einem aktiven Fokus ein,

Fibroblastenproliferation und klonale Selektion von Fibroblastensubtypen sowie Modulation

der zellulären Kollagensynthese und -degradierung (BIENKOWSKI u. GOTKIN, 1995).

Zahlreiche endokrine, parakrine und autokrine Mediatoren sind in der Lage, die Funktion von

Fibroblasten zu beeinflussen (CROUCH, 1990). So sind Fibrinogen und Endothelin 1 aus

endo- und epithelialen Zellen Stimuli für Fibroblastenmigration und -proliferation

(BITTERMAN et al., 1983; AKIYAMA et al., 1989). Die vermutlich größte Rolle spielen

jedoch Cytokine – Interleukine, Interferon und Polypeptid-Wachstumsfaktoren – als

hochpotente Modulatoren des Zellstoffwechsels. Sie werden von Bindegewebs- und

Entzündungszellen gebildet und sind zudem in der Lage ihre eigene Synthese zu stimulieren

(ZHANG et al., 1993). Da sie mit Oberflächenrezeptoren unterschiedlicher Spezifität

reagieren (PARTANEN et al., 1993) und verschiedene Signaltransduktionswege in

unterschiedlichen Zellen aktivieren (z. B. cAMP (ZHANG et al., 1993), Tyrosinkinasen

(DARNELL et al., 1994)), können sie gegensätzliche Effekte hervorrufen (YAN et al., 1994).

Daher sind viele dieser Substanzen in der Lage, mehrere Funktionen gleichzeitig zu

übernehmen. So regen Mediatoren wie IGF-1 (Insulin-like Growth Factor-1) und IL-1

(Interleukin-1) Kollagensynthese und Fibroblastenproliferation an, wobei monozytäres IL-1

gleichzeitig auch einen extrazellulären Kollagenabbau durch verstärkte Kollagenase-

ausschüttung induziert (BIENKOWSKI u. GOTKIN, 1995).

Die Regulation der Kollagensynthese erfolgt gleichzeitig an mehreren Stellen des

Stoffwechselweges auf transkriptionaler, translationaler und posttranslationaler Ebene. Die

Transkription der codierenden Gene wird durch zahlreiche Agentien beeinflusst, zu denen

neben Prostaglandinen vom E-Typ insbesondere Cytokine - vor allem IL-1α, -1β und TGF-ß

(Transforming Growth Factor-β) - gehören. Posttranskriptional wird die Kollagensynthese

über die Stabilität der gebildeten mRNA und die Effektivität der Translation beeinflusst

(MAKELA u. VUORIO, 1986). Nach GEESIN et al. (1988) spielt hier unter anderem

Ascorbinsäure eine Rolle. Darüber hinaus existieren Feedbackmechanismen, wobei vor allem

die N- und C-terminalen Telopeptide der Prokollagene in der Lage sind, die

Kollagenneusynthese zu beeinflussen (WIESTNER et al., 1979). Das N-terminale Propeptid

führt in diesem Zusammenhang zu einer unspezifischen Hemmung der Translation

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35

(GOLDENBERG u. FINE, 1985), Fragmente des C-terminalen Propeptides können sowohl

inhibitorisch als auch stimulierend wirken (KATAYAMA et al., 1991).

Die posttranslationale Regulation erfolgt vor allem durch den Abbau von Kollagen auf zwei

verschiedenen Ebenen:

1. Ein erheblicher Anteil des im Bindegewebe gebildeten Kollagens wird bereits vor seiner

Sekretion degradiert (BIENKOWSKI, 1985). Der basale Level dieses intrazellulären

Kollagenabbaus in Lungenfibroblasten liegt bei etwa 15 % (BARILE et al., 1990) des

neugebildeten Prokollagens (KEHRER, 1985; PICKRELL et al., 1987), steigt jedoch bei

vermehrter Bildung strukturell abnormalen Kollagens oder unter Einfluss von PGE1 an

(BIENKOWSKI et al., 1978; BARILE et al., 1988). Über die Lokalisation des Abbaus

existieren unterschiedliche Ansichten. BERG et al. (1980) beschreiben eine lysosomale

Proteolyse, während RIPLEY et al. (1993) von einer Degradierung in einem distalen

Kompartiment des Sekretionsweges ausgehen. Ob derartige Vorgänge, wie bei anderen

Proteinen bekannt, bereits auf der Ebene des endoplasmatischen Retikulums ablaufen, ist

unklar (FRA u. SITIA, 1993).

2. Das bereits sezernierte Kollagen unterliegt einer extrazellulären Proteolyse, die durch

spezifische Enzyme und deren Inhibitoren reguliert wird (MATRISIAN, 1990; MURPHY

u. DOCHERTY, 1992). Sowohl die Enzyme als auch ihre Inhibitoren unterliegen

wiederum der Regulation durch zahlreiche Mediatoren.

Eine Steigerung der Kollagenbildung ist auch indirekt durch verstärkte Fibroblasten-

proliferation oder Chemotaxis möglich. Zahlreiche Mediatoren verschiedener Zelltypen, wie

Makrophagen, Monozyten, Lymphozyten, Fibroblasten, epi- und endotheliale Zellen, spielen

hierbei eine Rolle. Daneben existieren noch frei zirkulierende Faktoren. Weiterhin setzt sich

die Fibroblastenfraktion in den einzelnen Organen aus mehreren Subpopulationen mit

unterschiedlichen Eigenschaften zusammen (HURUM et al., 1982; KONDO et al., 1985) und

es existieren Hinweise darauf, dass in von Patienten mit Lungenfibrose gewonnenen

Fibroblastenlinien Zellklone mit einer überdurchschnittlich hohen Teilungsrate vorliegen

(JORDANA et al., 1988).

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36

-OH

AAA

Mannose- und Scavengerrezeptoren

Kollagenfibrillen

Kernmembran

Hydroxilierung

Bildung der Tripelhelix

Transcrip tion Factor Antagonists

Sekretion Zellmembran

Abspaltung der Propeptide

C-Propeptidase

N-Propeptidase

Lysyloxidaseinhibitoren

-O-Gal-Glc

Gal-O- Gal-O-

-OH

-OH

HO-

-OH

Translation

-OH

Matrixmetalloproteinasen

Tissue Inhibitors of Metalloproteinase MMP-Aktivatoren

Zellkern

Transkription

Quervernetzung

Intrazelluläre Degradierung N- und C-

terminale Propeptide

Abb. 1: Schematische Darstellung der Kollagenbiosynthese (CROUCH, 1990; BIENKOWSKI u. GOTKIN, 1995; SCHUPPAN et al., 1999)

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37

2.5.3 Die Bedeutung von Kollagen Typ I und Typ III bei diffusem Alveolarschaden und

interstitieller Pneumonie

Nach allgemeiner Auffassung besteht die erste akute Phase von DAD und interstitieller

Pneumonie in einer massiven Steigerung der alveolären Permeabilität, die zu einer

Akkumulation proteinreicher Ödemflüssigkeit in Interstitium und Alveolarlumina führt.

Diesem Frühstadium folgt im Rahmen einer konsekutiven interstitiellen Pneumonie (JUBB,

1991) eine fibroproliferative Phase, die entweder die Regeneration der Alveoli einleitet oder

aber auch zu einer progressiven Obliteration der interstitiellen und alveolären

Lungenkompartimente führen kann (BITTERMAN, 1992). Die dabei ablaufenden Vorgänge

umfassen Proliferation von Endothelzellen, Proliferation und Migration von Fibroblasten,

Angiogenese sowie die Neubildung von extrazellulären Matrixproteinen (MEDURI et al.,

1998). Unter anderem beschreiben ZAPOL et al. (1979) eine Verdreifachung neu gebildeten

Kollagens als Folge von ARDS gegenüber unveränderten Lungen. Das ansonsten sehr stabile

Verhältnis von Kollagen Typ I zu Typ III in der Lunge von 2:1 kann auf bis zu 4:1 ansteigen

(LAST et al., 1983). Ähnlich wie bei der kutanen Wundheilung sind auch bei der Lunge

Myofibroblasten mit in die Regeneration / Reparation einbezogen (MARINELLI et al., 1990).

Die fibroproliferative Reaktion stellt einen limitierenden Faktor bei der Wiederherstellung der

normalen Lungenfunktion dar und beeinflusst wesentlich die Prognose sowohl quoad

valitudinem als auch quoad vitam. Verschiedene Autoren verwenden in diesem

Zusammenhang biologische Marker für die Kollagensynthese als mögliche diagnostische und

prognostische Parameter (KIRK et al., 1984a; HORSLEV-PETERSEN, 1990). Mehrere

Arbeitsgruppen (WAYDHAS et al., 1993; CLARK et al., 1995; ASHA et al., 1997; MEDURI

et al., 1998) nutzten hierfür den Gehalt des N-terminalen Prokollagen-Typ III-Peptids (N-

PCP-III) in bronchioalveolärer Lavageflüssigkeit (BALF) oder Trachealaspiraten und konnten

bemerkenswerterweise bereits in den ersten 24 h nach der klinischen Diagnose eine verstärkte

Kollagensynthese feststellen sowie einen Zusammenhang zwischen der Peptidmenge und der

Mortalität der untersuchten ARDS-Patienten: Der Anstieg der N-PCP-III-Konzentration über

1,75 U / ml im Trachealaspirat ging mit einer Verdoppelung des Todesrisikos einher. Bei

kardiogen oder hydrostatisch bedingten Lungenödemen hingegen lagen keine erhöhten Werte

vor. Histologisch oder immunhistochemisch fanden sich nachweisbare Kollagenablagerungen

erst nach mehreren Tagen. Andere Studien zeigen zudem, dass innerhalb von 24 h in BALF

und Plasma von ARDS-Patienten ebenfalls deutlich erhöhte Konzentrationen von Cytokinen

und Wachstumsfaktoren vorliegen, die Kollagensynthese und Fibroblastenproliferation

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stimulieren (PUGIN et al., 1996; CHESNUTT et al., 1997b). Verlaufsuntersuchungen des N-

PCP-III-Gehaltes über mehrere Tage weisen bei ARDS-Patienten mit erhöhtem Todesrisiko

auf eine prolongierte fibroproliferative Phase hin (MARSHALL et al., 2000). Da sich die

Nettokollagenablagerung in der Lunge aus dem dynamischen Gleichgewicht von

Prokollagensynthese und Kollagenabbau ergibt, kann man durchaus davon ausgehen, dass bei

Patienten mit besserer Prognose degradierende Prozesse im Vergleich zu profibrotischen

überwiegen (MCANULTY et al., 1997; COKER u. LAURENT, 1998). Untersuchungen zum

Stoffwechsel von Kollagen Typ I liefern vergleichbare Ergebnisse zu Kollagen Typ III. So

zeigt sich eine Verdoppelung des Prokollagen Typ I mRNA-Levels bei Patienten mit DAD

nach cardiovaskulärem Bypass bereits nach 108 min (DEHEINZELIN et al., 1997). Auch

immunhistochemisch konnte im Alveolarbereich nicht nur erst in der fibroproliferativen

Phase eine Zunahme Kollagen Typ I-bildender Zellen nachgewiesen werden, in 50 % aller

Fälle der Studie gelang dies auch im frühen, exsudativen Stadium (LIEBLER et al., 1998).

ARMSTRONG et al. (1999) verwenden bei ARDS / ALI-Patienten das C-terminale Propeptid

(PICP) von Kollagen Typ I als Maß für die Kollagenneosynthese und COL2-3 / 4short-

Neoepitope, die Abbauprodukte von Kollagen Typ I und II, als Maß für die Kollagenolyse.

Bereits am ersten Tag zeigt sich auch hier, gemessen an der PICP-Konzentration in der

BALF, eine Steigerung der Kollagensynthese, während gleichzeitig, gemessen an der

Konzentration der COL2-3 / 4short-Neoepitope, ein verminderter Kollagenabbau vorliegt, so

dass eindeutig die Nettoablagerung von Kollagen Typ I begünstigt wird. Der Vorteil der

Messung von PICP besteht darin, dass seine Freisetzung in direktem Zusammenhang mit der

Kollagensynthese steht, während das C-terminale Propeptid von Kollagen Typ III (PIIICP)

bei Entzündungs- und Abbauvorgängen ebenfalls vermehrt auftritt (RISTELLI u. RISTELLI,

1995). Jedoch werden auch anhand der Bestimmung von PIIICP vergleichbare

Schlussfolgerungen gezogen (CHESNUTT et al., 1997a).

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39

2.6 Transforming Growth Factor (TGF) -β

2.6.1 Struktur, Regulation und Signalbildung

Der 1981 erstmals beschriebene Transforming Growth Factor-β (MOSES et al., 1981;

ROBERTS et al., 1981) stellt den hochkonservierten Prototyp einer Gruppe von über 28

Peptiden dar, die als TGF-β-Superfamilie bezeichnet wird (VENTER et al., 2001). Zu dieser

Superfamilie gehören neben der TGF-β-Familie die Bone Morphogenetic Proteins Family

(BMP), die Mullerian Inhibitory Substance Family (MIS), die Aktivin / Inhibin Familie und

zahlreiche weitere, strukturell verwandte Faktoren bei Vertebraten, Insekten und Nematoden

(MASSAGUE, 1998). TGF-β dient unter anderem der Regulation des Zellwachstums in der

embryonalen, fetalen und neonatalen Entwicklung und beim Erwachsenen, der

Differenzierung, Migration und Adhäsion von Zellen, der Modulation der Zusammensetzung

der extrazellulären Matrix, spielt eine Rolle bei der Apoptosesteuerung und besitzt

immunsuppressive Effekte (MASSAGUE et al., 1994, LAWRENCE, 1996; COX u.

MAURER, 1997).

Es existieren fünf bekannte TGF-β-Isoformen. TGF-β1-3 finden sich bei Säugetieren, während

TGF-β4 beim Huhn und TGF-β5 beim Krallenfrosch nachgewiesen werden konnten

(LAWRENCE, 1996). Thrombozyten stellen eine wesentliche Quelle für TGF-β1 dar (VAN

DEN EUNDEN–VAN RAAIJ et al., 1988), darüber hinaus sind fast alle Zelltypen des

Organismus in der Lage, TGF-β-Isoformen zu exprimieren, insbesondere aktivierte T- und B-

Lymphozyten, Makrophagen, neutrophile Granulozyten und Fibroblasten (ROBERTS u.

SPORN, 1990). Die einzelnen Isoformen werden in verschiedenen Organen in

unterschiedlichen Verhältnissen und Mengen gebildet (BONEWALD, 1999). TGF-β1-3

besitzen beim Menschen jeweils eigene Genloci auf verschiedenen Chromosomen, wobei

TGF-β1 eine hohe Sequenzhomologie von 74 % zu TGF-β2 und von 78 % zu TGF-β3 aufweist

(LAWRENCE, 1996). Trotz dieser großen Ähnlichkeit erfolgt eine voneinander unabhängige

Regulation der Expression von TGF-β1 und TGF-β2 (DANIELPOUR et al., 1989). TGF-β1

wird als inaktives, 55 kDa großes, latentes Vorläuferprotein (LTGF-β) aus 390 Aminosäuren

gebildet, das vor der Entfaltung seiner biologischen Wirkung aktiviert werden muss. Bei der

aktiven Form von TGF-β1, die das C-terminale Ende des Precursors darstellt, handelt es sich

um ein Homodimer mit einem Molekulargewicht von 25 kDa. Die beiden Untereinheiten

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40

bestehen aus je 112 Aminosäuren und sind über drei Disulfidbrücken miteinander verbunden,

die auch der Stabilisierung der β-Faltblattstruktur dienen (VERRECCHIA u. MAUVIEL,

2002). Eine Autoinduk tion der Transkription von TGF-β1 ist möglich, die durch AP-1-

Bindungsstellen (Activator Protein-1) in den Promoterregionen vermittelt wird (KIM et al.,

1990). Große Bedeutung besitzt auch die Aktivierung durch Integrin αvβ6 (MUNGER et al.,

1999), wobei TGF-β seinerseits in der Lage ist die Expression dieses Integrins zu fördern, und

somit eine positive Rückkopplungsschleife entstehen kann (SHEPPARD et al., 1992).

Aufgrund der großen Anzahl verschiedener Aktivierungsmöglichkeiten wird davon

ausgegangen, dass über diese Mechanismen ebenfalls eine Regulation der TGF-β-Aktivität

erfolgt (PIRCHER et al., 1986). Humanes rekombinantes, latentes TGF-β1 besitzt in vivo eine

Halbwertszeit von 90 min, wohingegen aktiviertes TGF-β1 bei Mensch und Ratte innerhalb

eines Zeitraumes von 3 min vor allem durch die Leber eliminiert wird (COFFREY et al.,

1990; WAKEFIELD et al., 1995). Die biologische Wirkung der Mitglieder der TGF-β-

Familie wird durch die Bindung an spezifische Membranrezeptoren vermittelt. Es existieren

in diesem Zusammenhang drei wesentliche Rezeptortypen, die als TβRI, -II und -III

bezeichnet werden und unterschiedliche Affinität zu den einzelnen Isoformen aufweisen. So

zeigen Typ II-Rezeptoren eine 100-fach höhere Affinität zu TGF-β1 und TGF-β3 als zu TGF-

β2 (LIN et al., 1992). Eine Bindung an die zur Familie der Serin / Threonin-Rezeptoren

gehörigen Typen I und II führt eine Signalbildung nach sich, während nach einer Anlagerung

an den Typ III-Rezeptor (Betaglykan) eine Signaltransduktion nicht zwingend erfo lgt

(DERYNCK u. FENG, 1997; PADGET et al., 1998). Seine Anwesenheit führt jedoch zu einer

Erhöhung der Affinität des Liganden an die Typ II-Rezeptoren (DERYNCK u. FENG, 1997)

und dient möglicherweise der Stabilisierung des TβRI-TβRII-Komplexes (MITTL et al.,

1996). Die weitere Transduktion des Signals erfolgt hauptsächlich durch Phosphorylierung

zytoplasmatischer, zur Smad-Familie gehörender Mediatoren (PIEK et al., 1999;

MASSAGUE u. CHEN, 2000; MASSAGUE u. WOTTON, 2000).

2.6.2 Allgemeine Funktion

Die Isoformen des Transforming Growth Factor-β bilden eine Gruppe multifunktioneller

Proteine, deren drei wichtigste biologische Aufgaben in der Proliferationshemmung, der

Stimulation der Synthese extrazellulärer Matrix und der Immunsupression liegen

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(BONEWALD, 1999). Paradoxerweise kann TGF-β darüber hinaus aber auch starke

proinflammatorische Wirkungen entfalten (WAHL, 1992a). Das zur TGF-β-Gruppe gehörige

Cytokin TGF-β1 stellt einen wichtigen Wachstumsfaktor dar, der die Zellproliferation sowohl

stimulieren als auch hemmen kann, spielt eine wesentliche Rolle bei der Organogenese und

Wundheilung (ROBERTS u. SPORN, 1990) und ist vielseitig an der Regulation des

Immunsystems beteiligt (TIZARD, 2000). Während die Proliferation von epithelialen,

endothelialen und hämatopoetischen Zellen unterdrückt wird, zeigt TGF-β1 gegenüber

mesenchymalen Zellen wachstumsfördernde Eigenschaften (LAWRENCE, 1996;

ALEVIZOPOULOS u. MERMOD, 1997). Der genaue Mechanismus, der dieser

unterschiedlichen Wirkungsweise zugrunde liegt, ist noch nicht bekannt. Die mitogenen

Effekte scheinen jedoch nur indirekt von TGF-β1 hervorgerufen zu werden und von einer

Vermittlung durch autokrine Mediatoren, wie PDGF (Platelet-derived Growth Factor) und

EGF (Epidermal Growth Factor), oder von Bestandteilen der extrazellulären Matrix abhängig

zu sein (MASSAGUE, 1990; MASSAGUE u. POLYAK, 1995; ALEVIZOPOLOUS u.

MERMOD, 1997). Die sehr stark ausgeprägten wachstumshemmenden Eigenschaften

(MOSES et al., 1985) beruhen auf einem reversiblen Arrest der G1-Phase des Zellzyklus

(DERYNCK u. FENG, 1997). TGF-β1 ist darüber hinaus in der Lage die Differenzierung

verschiedener Zelltypen zu beeinflussen oder auch Apoptose zu induzieren

(ALEVIZOPOULOS u. MERMOD, 1997). So ist das Cytokin direkt oder indirekt durch

Vermittlung anderer Cytokine an der Regulation von Entwicklung, Differenzierung und

Funktion von B- und T-Lymphozyten beteiligt (ABBAS et al., 1996; TIZARD, 2000). TGF-

β1 beeinflusst auch Funktion und Aktivität von Makrophagen und zeigt hier in Abhängigkeit

von der Anwesenheit anderer Cytokine hemmende oder stimulierende Wirkung. Neben einer

Abnahme der Aktivität von Gewebemakrophagen wird auch die Bildung von

Stickstoffmonoxid und Wasserstoffperoxid unterdrückt (ROBERTS u. SPORN, 1990;

DUBOIS et al., 1995; LAWRENCE, 1996; TIZARD 2000). Es vermindert die Aktivität von

Natürlichen Killerzellen (ROBERTS u. SPORN, 1990) und unterdrückt die endotheliale

Adhäsion von Granulozyten (PFISTER et al., 1992). Außer diesen supressiven Effekten zeigt

TGF-β1 auch stimulierende. Es verstärkt die Chemotaxis für Makrophagen, neutrophile

Granulozyten und Fibroblasten (OSSEGE et al., 1994; TIZARD, 2000) und wirkt mitogen

insbesondere auf Fibroblasten. Monozyten exprimieren unter Einfluss von TGF-β1 verstärkt

Integrine, Interleukin-1 (IL-1) und Tumor Nekrose Faktor-α (TNF-α). Von sehr großer

Bedeutung in der Regulation entzündlicher Prozesse sind die antiinflammatorischen

Eigenschaften. In diesem Zusammenhang ist TGF-β1 ein Antagonist zu

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Entzündungsmediatoren wie IL-1, IL-2, IL-3, IL-12, TNF-α, TNF-β , IFN-α und IFN-γ

(ROBERTS u. SPORN, 1990; DUBOIS et al., 1995; TIZARD, 2000) und daher auch als

„Anti-Cytokin“ bezeichnet (ABBAS et al., 1996).

2.6.3 Einfluss von TGF-β auf den Kollagenstoffwechsel

Der Transforming Growth Factor-β ist der stärkste bekannte Stimulus der Kollagenbildung

(ROBERTS et al., 1986; IGNOTZ u. MASSAGUE, 1986; VARGA et al., 1986). Er

unterscheidet sich von anderen kollagenstimulierenden Cytokinen dadurch, dass er die

Produktion von Kollagen auf allen Ebenen des Stoffwechselweges gleichzeitig fördern kann

(RHAGOW, 1991), und wird daher auch als „Master Switch“ in Zusammenhang mit

fibrotischen Veränderungen bezeichnet (GIRI et al., 1993; BIENKOWSKI u. GOTKIN,

1995). TGF-β wird vor allem von Fibroblasten und Makrophagen synthetisiert und ist in der

Lage seine eigene Produktion autokrin und parakrin zu stimulieren (KELLEY et al., 1993).

Nach Untersuchungen mehrerer Arbeitsgruppen steigert TGF-β die Genexpression von

COL1A1 (FINE et al., 1990; DIAZ et al., 1989) und in Maus-NIH / 3T3-Zellen konnte

darüber hinaus eine Hochregulierung von COL1A2 nachgewiesen werden (ROSSI et al.,

1988; FINE et al., 1990). Der Effekt von TGF-β auf die Transkription von Kollagenen wird

dabei vermutlich durch die Bindung des Nuclear Factor-1 oder eines ähnlichen Proteins an

regulatorische Sequenzen nahe der Promoterregion von COL1A1 und COL1A2 vermittelt

(ROSSI et al., 1988; RITZENTHALER et al., 1993). Bemerkenswerterweise war in vitro ein

positiver Effekt auf die Expression von COL1A2 bei embryonalen humanen

Lungenfibroblasten nicht nachvollziehbar (FINE et al., 1990). TGF-β erhöht nicht nur die

Transkription und Stabilität spezifischer mRNA für Prokollagene, sondern reduziert auch den

intrazellulären Abbau von Prokollagenen, hemmt die Produktion von extrazellulären

Kollagenasen und stimuliert die Bildung von Metalloproteinaseinhibitoren, wie Tissue

Inhibitors of Metalloproteinase (TIMP´s), Plasminogen-Activator-Inhibitor und α2-

Makroglobulin (EDWARDS et al., 1987; VARGA u. JIMINEZ, 1987; PENTTINEN et al.,

1988; OVERALL et al., 1989; SHI et al., 1990; MCANULTY et al., 1991). Nach

Untersuchungen von KAWAGUCHI et al. (1992) und SCHULTZ et al. (1992) steigert TGF-β

die Prolylhydroxylaseaktivität in Hautfibroblasten bei Sklerodermie und die der Lysyloxidase,

die für die Ausbildung kovalenter Crosslinks zwischen α-Ketten verantwortlich ist. Auch die

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Synthese von Fibronektin wird erhöht, das sich an extrazelluläre Kollagenfibrillen bindet und

das Wachstum von Fibroblasten fördert (AKIYAMA et al., 1989), ebenso die Ausschüttung

von Interleukin-6, das seinerseits wiederum die Bildung von TIMP´s in Fibroblasten und

Monozyten fördert (ELIAS et al., 1991). In vivo stimuliert TGF-β in fibrotischem Gewebe

direkt die Replikation von Zellen (RHAGOW et al., 1989), ebenso von Lungenfibroblasten in

vitro (SCHREIER et al., 1993). Inwieweit TGF-β auf Lungenfibroblasten chemotaktisch

wirkt, ist unklar. Mehrere Arbeitsgruppen gehen davon aus, dass es sich um einen sehr

wirkungsvollen chemotaktischen Faktor für Fibroblasten in verschiedenen Weichgeweben

handelt (PIERCE et al., 1989a; ADELMANN-GRILL et al., 1990), nach Untersuchungen von

OSORNIO-VARGAS et al. (1993) besitzt TGF-β jedoch keinen Einfluss auf das

Migrationsverhalten von rodenten Lungenfibroblasten oder Swiss 3T3-Fibroblasten. In

Tiermodellen für Lungenfibrose konnte sowohl ein Anstieg von TGF-β-mRNA als auch des

Proteins selbst festgestellt werden, dessen höchste Konzentration zum Zeitpunkt der

maximalen Kollagensynthese beobachtet werden konnte (KELLEY et al., 1985; HOYT u.

LAZO, 1988). Im Initialstadium bleomycininduzierter Lungenfibrose gelang immun-

histochemisch der Nachweis von TGF-β in der subepithelialen Matrix, später in Makrophagen

und im fortgeschrittenen Stadium in den Rändern der fibrotisch veränderten, hyperzellulären

Areale (KHALIL et al., 1989). Durch in situ-Hybridisierung konnte bei

Lungenfibrosepatienten die Anwesenheit von TGF-β-mRNA in Bereichen entzündlicher

Reaktionen in der Frühphase festgestellt werden, in denen Makrophagen in enger

Nachbarschaft zu Prokollagen Typ I-mRNA-bildenden Fibroblasten liegen (BROEKEL-

MANN et al., 1991). Immunhistochemische Studien zeigen auch, dass TGF-β nicht nur

intrazellulär in Alveolarmakrophagen und hyperplastischen Pneumozyten Typ II auftritt,

sondern sich darüber hinaus auch extrazellulär in Nachbarschaft zu Pneumozyten vom Typ II

in fibrotischem, interstitiellem Bindegewebe findet (BROEKELMANN et al., 1991; KHALIL

u. GREENBERG, 1991; CORRIN et al., 1994).

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2.6.4 Die Rolle von TGF-β im Entzündungsgeschehen

Obwohl bei verschiedenen Lungenerkrankungen bereits zahlreiche Untersuchungen über die

Rolle von chemotaktischen Cytokinen, wie z. B. IL-8, vorliegen, gibt es vergleichsweise nur

wenige Erkenntnisse über den Einfluss von Angehörigen der TGF-β-Familie (BÜHLING et

al., 1999). Unter den zahlreichen Polypeptidwachstumsfaktoren nimmt TGF-β aufgrund

seiner umfassenden Wirkungen auf Zellproliferation und -differenzierung eine einzigartige

Stellung ein (ROBERTS u. SPORN, 1990). Zusätzlich zu seinen komplexen und essentiellen

regulatorischen Effekten auf das Wachstum aller Zelltypen besitzt TGF-β große Bedeutung

als Immunmodulator (WAHL et al., 1989; WAHL, 1992a). Da es sich bei TGF-β sowohl um

ein immunsupressives als auch um ein sehr potentes proinflammatorisches Protein handelt,

spielt es eine wichtige Rolle bei der Initiierung, Progression und Regression entzündlicher

Reaktionen (WAHL, 1992a). Diese gegensätzlichen Wirkungen von TGF-β unterliegen einer

Kontrolle durch Latenz und selektiver Expression des Cytokins, durch Rezeptormodulation

und Suszeptibilität der Zielzellen in Abhängigkeit verschiedener Stadien von Entwicklung,

Reifung und Aktivierung (WAHL, 1992a). Unmittelbar nach Schädigungen oder dem

Einsetzen einer Immunreaktion erfolgt im betroffenen Bereich die Freisetzung von TGF-β aus

Thrombozyten (ASSOIAN et al., 1983), das eine stark chemotaktische Substanz für

Monozyten (WAHL et al., 1987), neutrophile Granulozyten (BRANDES et al., 1991a; FAVA

et al., 1991; REIBMANN et al., 1991) und T-Lymphozyten (ADAMS et al., 1991) darstellt.

Das hohe Potential zur Rekrutierung von Entzündungszellen konnte in situ durch die

intradermale (ROBERTS et al., 1986) und intraartikuläre (ALLEN et al., 1990; FAVA et al.,

1991) Applikation des nativen oder rekombinanten Proteins nachgewiesen werden. Während

bei gesunden Individuen durch die lokale Verabreichung von TGF-β eine leukozytäre

Infiltration induziert werden kann (LYNCH et al., 1989), unterbleibt bei monozytopenischen

Tieren eine solche Reaktion (PIERCE et al., 1989b). Die entzündungsfördernden

Eigenschaften durch die Rekrutierung weißer Blutzellen beruhen auf vier in gegenseitiger

Wechselbeziehung stehenden Wegen molekularer Signalgebung: Modulation der Expression

von Integrinen, gesteigerte Adhäsion von Monozyten, Förderung der Sekretion

matrixspezifischer Kollagenasen und Chemotaxis (WAHL et al., 1987; WAHL et al., 1992b).

Die Translokation von Entzündungszellen durch die extrazelluläre Matrix erfordert die

Freisetzung matrixdegradierender Enzyme, wobei TGF-β die Produktion einer 92 kDa- und

97 kDa-Gelatinase sowie von Kollagenase Typ IV in Monozyten fördert (WAHL et al.,

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1992a). Da TGF-β jedoch in vitro die Adhäsion von Leukozyten an Endothelzellen hemmt

(GAMBLE u. VADAS, 1988), ist unklar, welcher Mechanismus für die lokale Akkumulation

von Leukozyten in vivo nach Injektion von TGF-β verantwortlich ist. Eine erhöhte

Integrinexpression kann hier jedoch durchaus eine Rolle bei verstärkten Wechselwirkungen

zwischen Zellen sowie Zellen und Matrix spielen (WAHL et al., 1992a). Monozyten reagieren

bereits auf pikomolare TGF-β-Konzentrationen und zeigen eine verstärkte mRNA-Expression

sowohl von TGF-β1 als auch von TGF-β2 (MCCARTNEY-FRANCIS et al., 1990). Auch

aktivierte T-Lymphozyten sezernieren vermehrt diese beiden Isoformen (KEHRL et al.,

1986). Entsprechend können die höchsten Konzentrationen von TGF-β-mRNA im Verlauf

von Entzündungsreaktionen und in Zusammenhang mit zellvermittelten Immunreaktionen

beobachtet werden (YAMAMURA et al., 1991). Über die Fähigkeit zur Rekrutierung von

Entzündungszellen hinaus stellt TGF-β einen potenten Regulator anderer wesentlicher

Zellfunktionen dar. Bereits in pikomolaren Konzentrationen ist TGF-β in der Lage in

ruhenden Monozyten die mRNA-Level verschiedener Entzündungsmediatoren, wie IL-1,

TNF, PDGF, bFGF (basic Fibroblast Growth Factor) und IL-6, zu erhöhen (WAHL et al.,

1987; ALLEN et al., 1990; WAHL et al., 1990; MCCARTNEY-FRANCIS et al., 1990;

KEHRL et al., 1986; YAMAMURA et al., 1991; TURNER et al., 1990). Die Sekretion von

IL-1, TNF und IL-6 kann wiederum eine Cytokinkaskade auslösen, in der jedes dieser

Moleküle eine eigene Rolle spielt (MCCARTNEY-FRANCIS et al., 1990; WISEMAN et al.,

1988; TURNER et al., 1990). Zum Beispiel führt IL-1 posttranskriptional zu einer verstärkten

Bildung von aktivem TGF-β , das durch positives Feedback wiederum die Synthese von IL-1

fördert (MCCARTNEY-FRANCIS et al., 1990). Zusätzlich zur Induktion von verschiedenen

Cytokinen stimuliert TGF-β die Präsentation von CD16 (FcγRIII) auf der Oberfläche

rekrutierter Monozyten (WELCH et al., 1990; PHILLIPS et al., 1991), das zusammen mit

dem Anstieg von Adhäsionsmolekülen die Phagozytoseaktivität und die Freisetzung toxischer

Sauerstoffradikale sowohl in vitro (WELCH et al., 1990) als auch in vivo (WAHL et al.,

1992b; ALLEN et al., 1991) steigert. Eine der wesentlichen Aufgaben in der Wirkung von

TGF-β auf Monozyten scheint also in der, wenn auch zeitlich begrenzten, Kontrolle einer

ganzen Reihe von biologisch aktiven Molekülen zu liegen, die zahlreiche Ereignisse im

Ablauf einer Entzündungsreaktion beeinflussen (BRANDES et al., 1991b). In mehreren

Studien konnte gezeigt werden, dass die Isoformen von TGF-β wichtige Regulatoren in der

Pathogenese von Lungenerkrankungen, wie Fibrose (MORELAND et al., 1992; KHALIL et

al., 1996), akuten und chronischen Entzündungen (XING et al., 1992; KOTECHA et al.,

1996), Hypersensitivity Pneumonitis (DENIS u. GHADIRIAN, 1992) und Transplantat-

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abstoßung, spielen (MAGNAN et al., 1996). BÜHLING et al. (1999) gehen aufgrund von

Untersuchungen der Konzentrationen von TGF-β1 und TGF-β2 in der BALF von Patienten

mit unterschiedlichen Lungenerkrankungen wie Pneumonie, Interstitial Lung Disease (ILD)

und Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD) davon aus, dass diese Cytokine den

Ablauf entzündlicher Reaktionen bei Pneumoniepatienten beeinflussen. Jedoch lagen erhöhte

Level von TGF-β1 und TGF-ß2 nur bei solchen Patienten vor, bei denen auch das Wachstum

pathogener Keime nachweisbar war. TGF-β1 kann daher einen potentiellen Marker für den

Schweregrad vorliegender infektiöser Prozesse darstellen.

2.6.5 Rolle von TGF-β bei akutem Alveolarschaden

TGF-β spielt eine wichtige Rolle bei entzündlichen Reaktionen und der Regeneration von

Gewebeschäden in zahlreichen Organen einschließlich der Lunge (SHULL et al., 1992). Das

Verhalten von TGF-β wurde in diesem Zusammenhang intensiv in der späten Phase der

Reparation nach ALI / DAD (Acute Lung Injury / Diffuse Alveolar Damage) untersucht, wo es

wesentlich an der Entstehung von Lungenfibrose beteiligt ist (BROEKELMANN et al., 1991;

GIRI et al., 1993). Jedoch stellen sich auch schon sehr früh, innerhalb von 48 h nach

bleomycininduzierten Lungenschäden TGF-β-bedingte Wirkungen ein, zum Beispiel in Form

einer deutlichen Zunahme der Expression von TGF-β-induzierbaren Genen (KAMINSKI et

al., 2000). In vitro konnten bereits nach 60 - 120 min direkte Effekte auf Endothelzellen

beobachtet werden, die nach acht bis neun Stunden ihr Maximum erreichten. Es zeigte sich

eine deutliche Permeabilitätssteigerung als Folge der Ausbildung von Interzellularspalten

durch Endothelzellkontraktion, ausgelöst durch Aktivierung der Myosin Light Chain-Kinase

Signalkaskade (HURST et al., 1999). Diese Abläufe scheinen dabei von der jeweiligen

Zellzyklusphase und dem Konfluenzgrad eines Monolayers abzuhängen. Ruhende Zellen

zeigen keine Reaktion. Zudem gelang der Nachweis einer zeit- und dosisabhängigen

Zunahme der Transepithelial Electric Resistance (TER) bei Primärkulturen rodenter

Pneumozyten Typ II nach der Applikation von rhTGF-β1, so dass davon ausgegangen werden

kann, dass TGF-β eine wesentliche Rolle bei der Entstehung von Lungenödemen in vivo

spielt. Auch am Tiermodell für ALI konnte ein Zusammenhang zwischen der ausgeprägten

Exsudation und TGF-β hergestellt werden. Die lokale Aktivierung des Cytokins durch

Integrin αvβ6 besitzt dabei essentielle Bedeutung (PITTET et al. 2001). Für die TGF-β

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abhängige Steigerung der epithelialen Permeabilität scheint ein anderer Mechanismus als für

die der endothelialen verantwortlich zu sein, die durch eine Myosin Light Chain-Kinase

vermittelte Kontraktion hervorgerufen wird. Man geht davon aus, dass hier eine Depletion

von intrazellulärem Gluthation und die Zunahme seiner oxidierten Form Gluthationdisulfid

(GSSG) eine große Rolle spielt. Untersuchungen der Gluthationkonzentration im alveolären

Flüssigkeitsfilm sowohl in Modellen (MODELSKA, 1999) als auch von ALI-Patienten

(BUNNEL u. PACHT, 1993) weisen auf eine wesentliche Beteiligung einer Abnahme von

Gluthation an einer erhöhten epithelialen Durchlässigkeit für Proteine hin (GUIDOT et al.,

2000). Eine mögliche Erklärung ist die Tatsache, dass TGF-β die Gluthationsynthese von

Lungenepithelzellen auf transkriptioneller Ebene durch Beeinflussung der γ-

Glutamylcysteinsynthetase hemmt (ARSALANE et al., 1997). Weiterhin agiert TGF-β als

prooxidative Substanz über eine Erhöhung der zellulären H2O2-Bildung, das sekundär die

endotheliale Permeabilität steigert (DAS u. FANBURG, 1991), und ein TGF-β-abhängiger

GSSG-Anstieg führt zu einer Steigerung der paraze llulären Durchlässigkeit in

Endothelzellmonolayern (RAO et al., 2000). TGF-β fördert auch zusammen mit TNF-α durch

die erhöhte Freisetzung von PAI-1 (Plasminogen Activator Inhibitor-1) aus humanen

Lungenfibroblasten und der damit verbundenen prokoagulatorischen Wirkung die interstitielle

und intraalveoläre Ablagerung von Fibrin, wie sie bei ARDS oder Pneumonien anzutreffen ist

(IDELL et al., 1992). In vitro stimuliert TGF-β in humanen Hautfibroblasten aber auch die

Sekretion von Urokinase- und Tissue Plasminogen Activator-Inhibitoren (LAIHO et al.,

1986a) und hemmt in fetalen humanen Lungenfibroblasten die Ausschüttung von Urokinase

und Tissue Plasminogen Activator (LAIHO et al., 1986b), so dass eine Hemmung der

Fibrinolyse auf mehreren Ebenen erfolgt.

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2.6.6 Bedeutung von TGF-β bei Regeneration und Reparation nach akutem

Alveolarschaden

Für einen ungestörten Gasaustausch ist die komplexe dreidimensionale und fragile Struktur

der Lunge von größter Bedeutung. Erstaunlicherweise kann sich diese Struktur bei

Erwachsenen auch nach erheblichen Schädigungen, z. B. durch bakterielle Infektionen oder

toxische Einflüsse, wieder regenerieren. Allerdings besteht auch die Möglichkeit, dass durch

fehlerhafte Wechselwirkungen zwischen extrazellulärer Matrix, mesenchymalen Zellen,

Epithel-, Endothel- und Entzündungszellen Störungen im Heilungsablauf entstehen

(WARBURTON et al., 2000). Für die Erhaltung der Struktur und damit der Funktionalität der

Lunge ist daher eine exakte zeitliche und räumliche Abstimmung der Regulation der

zellulären Abläufe essentiell (SHEPPARD, 2001). Im Anschluss an die akute Phase einer

Entzündungsreaktion spielt TGF-β eine wichtige Rolle bei der Entzündungshemmung,

Geweberegeneration und der Entstehung von Fibrose (WAHL, 1992a). Zum Teil sind die

durch TGF-β initiierten Abläufe unter anderem aufgrund dessen kurzer biologischer

Halbwertszeit (WAKEFIELD et al., 1991) und der Abnahme von TGF-β-Rezeptoren

(WELCH et al., 1990; WAHL, 1992a) selbstlimitierend und reversibel (ROBERTS et al.,

1986; ALLEN et al., 1990). TGF-β1 bildet zusammen mit IL-1β (SHEPPARD, 2001),

Bleomycin (JONES u. REEVE, 1978) und Fas death Receptor-Liganden (HAGIMOTO et al.,

1997) eine kleine Gruppe von Substanzen, die zu einer Umgehung des normalen

Heilungsprozesses führen und sich selbst unterhaltende Prozesse induzieren, und zu

Lungenfibrose führen (SHEPPARD, 2001; SIME et al., 1997). Da sich in der Lunge gesunder

Erwachsener bereits große Mengen an latentem TGF-β finden, kann Fibrose ohne gesteigerte

Proteinexpression von TGF-β allein infolge einer lokalen Aktivierung (MUNGER et al.,

1997), zum Beispiel durch Integrin αvβ6 (MUNGER et al., 1999), entstehen (SHEPPARD,

2001). Immunhistochemisch konnte bei pulmonaler Fibrose in humanem Lungengewebe ein

vermehrtes Auftreten von TGF-β in sich regenerierendem Epithel nachgewiesen werden

(KHALIL u. GREENBERG, 1991). Zusätzlich zu seiner Eigenschaft, eine generalisierte

fibrotische Reaktion einzuleiten und aufrechtzuerhalten, kann TGF-β , das zunächst von

infiltrierenden Makrophagen und anschließend von ortsständigen epithelialen und

mesenchymalen Zellen gebildet wird, die Regeneration von Alveolarepithel verzögern. TGF-

β ist in der Lage in niedriger Konzentration die Proliferation von Alveolarepithelzellen zu

stimulieren, jedoch deren Differenzierung zu hemmen (HOWE et al., 1990). Darüber hinaus

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fördert TGF-β die Bildung basalmembrandegradierender Kollagenasen (OVERALL et al.,

1991; WAHL et al., 1993), wodurch der Übertritt interstitieller Zellen in die Alveolarlumina

und die dortige Ablagerung von Kollagen erleichtert wird (BIENKOWSKI u. GOTKIN,

1995).

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50

2.7 Interleukin (IL) -1ß

2.7.1 Allgemein

Die Interleukin-1-Genfamilie besteht aus drei Mitgliedern, IL-1α, IL-1β und IL-1Ra, von

denen IL-1α und IL-1β agonistische Wirkungen besitzen und IL-1Ra einen spezifischen

Rezeptorantagonisten darstellt. Interleukin-1 (IL-1) ist der Prototyp eines multifunktionellen

Cytokins, wobei IL-1α und IL-1β in Wirkung und biologischer Aktivität vielfach nicht

unterschieden werden können und nur geringe Speziesspezifität aufweisen. Zunächst als

Kostimulus für T-Zellen beschrieben (GERY et al., 1972) wurde Interleukin-1 nach über

beinahe 30 Jahren intensiver Forschung als zentraler Mediator bei der Initiation und

Modulation von Entzündungs- und anderen Immunreaktionen etabliert. Im Gegensatz zu den

Lymphocyte und Colony Stimulating Factors ist IL-1 in der Lage - oft auch in Kombination

mit anderen Cytokinen - nahezu jeden Zelltyp zu beeinflussen. IL-1α und IL-1β werden zwar

von unterschiedlichen Genen kodiert und weisen in ihrer Aminosäuresequenz lediglich eine

Homologie von 26 % auf, jedoch enthalten die Gene sieben hochkonservierte Exons und

liegen bei der Maus eng benachbart auf Chromosom 2 (D´EUSTACHIO et al., 1987). Die

aktiven Formen von IL-1α und IL-1β mit einem Molekulargewicht von 17 kDa entstehen aus

inaktiven 31 kDa schweren Vorläufern, die nicht mit einem Signalpeptid ausgestattet sind

(AURON et al., 1984; MARCH et al., 1985). Im Gegensatz dazu wird IL-1Ra, das ein

Signalpeptid trägt, ohne erforderliche Aktivierung direkt von der Zelle sezerniert und in dieser

Form als secreted IL-1Ra (sIL-1Ra) bezeichnet (DINARELLO, 1998). Neben

Blutmonozyten, Lymphozyten, Keratinozyten und Astrozyten sind noch zahlreiche andere

Zellen in der Lage IL-1 zu bilden, wobei nach Stimulation mit Endotoxinen in Monozyten das

Verhältnis von IL-1β zu IL-1α - sowohl was die mRNA als auch das aktive Protein betrifft -

9:1 beträgt (MARCH et al., 1985). IL-1β stellt einen potenten proinflammatorischen Faktor

dar, dessen Ausschüttung und Aktivität sehr starken regulativen Mechanismen unterliegen.

Diese Kontrollmechanismen beeinflussen neben Genexpression, Proteinsynthese und

Sekretion auch Oberflächenrezeptoren, lösliche Rezeptoren und Rezeptorantagonisten. Es

existieren zwei Typen von Oberflächenproteinen, die die wichtigsten Rezeptoren für IL-1β

darstellen. Die Anlagerung des Liganden an einen IL-1-Typ I-Rezeptor (IL-1RI) führt dabei

zu einer Signaltransduktion, während bei einer Bindung an IL-1-Typ II-Rezeptoren (IL-1RII)

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eine Signalbildung unterbleibt. IL-1RII dient daher einer Minderung der IL-1-Effekte und

wird auch als Decoy Receptor bezeichnet (COLOTTA et al., 1994).

2.7.2 Regulation der Genexpression und Proteinsynthese von IL-1ß

Es existieren zahlreiche Stimuli mikrobiellen und nichtmikrobiellen Ursprungs, die in der

Lage sind, Transkription und Synthese der drei Proteine der Interleukin-1-Familie zu

induzieren. In Abhängigkeit vom Stimulus kann der Level der IL-1β-mRNA sehr rasch

innerhalb von 15 min ansteigen, jedoch auch bereits nach 4 h wieder abfallen. Man geht

davon aus, dass diese Abnahme durch die Bildung eines transkriptionalen Repressors und /

oder durch die Senkung der biologischen Halbwertszeit der mRNA herbeigeführt wird

(JARROUS u. KAEMPFER, 1994). Bei Autoinduktion von IL-1β können jedoch erhöhte

mRNA-Level auch über einen Zeitraum von 24 h aufrechterhalten werden (SCHINDLER et

al., 1990c; SERKOLLA u. HURME, 1993). Zahlreiche weitere Faktoren sind zu einer

Steigerung der Genexpressionsrate von IL-1β in der Lage, während sie jedoch einen nur

unzureichenden oder schwachen Stimulus für die Proteinsynthese darstellen und der größte

Teil der mRNA wieder degradiert wird (SCHINDLER et al., 1993). So fördern C5a

(SCHINDLER et al., 1990b), hypoxische Zustände (GHEZZI et al., 1991), Adhärenz an

Oberflächen (SCHINDLER et al., 1990a) und Blutgerinnung (MILENO et al., 1995) die

Bildung großer Mengen an IL-1β-mRNA in Monozyten, ohne jedoch die Translation

nennenswert zu beeinflussen. Diese Diskrepanz zwischen Transkription und Translation ist

charakteristisch sowohl für IL-1β als auch für TNF-α (SCHINDLER et al., 1990a). Obwohl

sich die IL-1β-mRNA an Polyribosomen anlagert, unterbleibt eine signifikante Steigerung der

Elongation des Proteins (KASPAR u. GEHRKE, 1994). Bei gleichzeitiger Anwesenheit von

IL-1β selbst oder von Endotoxinen zeigen jedoch Zellen mit hohen Leveln an IL-1β-mRNA

eine deutliche Zunahme der Translationsrate (SCHINDLER et al., 1990ab). Dieser Zustand

kann unter anderem auf eine Stabilisierung der nichttranslierten AU-reichen Regionen

zurückgeführt werden, wie sie in LPS-stimulierten Zellen beobachtet werden kann (MILLER

et al., 1992). Ein weiterer Effekt in diesem Zusammenhang ist die Stabilisierung der IL-1β-

mRNA durch das IL-1β Protein selbst über eine Hemmung der Deadenylierung (STOECKLE

u. GUAN, 1993). Im Anschluss an die Synthese verbleibt ProIL-1β vor allem im Cytosol und

wird nach erfolgter Interleukin Converting Enzyme (ICE)-vermittelter Cleavage von der Zelle

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ausgeschleust (BLACK et al., 1988). Im Gegensatz zu IL-1α existiert von IL-1β keine

bekannte membranständige Form (JOBLING et al., 1988). Neben ICE sind noch andere

Proteasen in der Lage ProIL-1β durch Spaltung an der Position 116-117 (Aspartat-Alanin) in

die aktive Form zu konvertieren (HAZUDA et al., 1990; HAZUDA et al., 1991). Hierzu

gehören neben Trypsin (KOBAYASHI et al., 1991), Elastase (DINARELLO et al., 1986),

Chymotrypsin (MIZUTANI et al., 1991a) und Mastzellchymase (MIZUTANI et al., 1991b),

die in entzündlichen Sekreten gefunden werden können. Ihre Rolle bei der in vivo-

Umwandlung des IL-1β-Precursors ist fraglich, da jedoch auch im lebenden Organismus

Entzündungszellen absterben und rupturieren können, sind eine Freisetzung des Precursors

und extrazelluläre Aktivierung grundsätzlich möglich (DINARELLO, 1998).

2.7.3 IL-1 bei Wundheilung und entzündlichen Lungenveränderungen

IL-1 besitzt große Bedeutung als Mediator bei entzündlichen Reaktionen und der

Blutgerinnung (OPPENHEIM et al., 1986). Verschiedene Lungenzellen sind in der Lage IL-1

zu synthetisieren, wobei die Bildungsrate von IL-1 in Makrophagen im Rahmen der

Umwandlung von Blutmonozyten zu Alveolarmakrophagen auf nur noch 5 % des

Ausgangswertes sinkt (WEWERS et al., 1984; RICH et al., 1987). Lokale Wirkungen von

IL-1 dienen der Rekrutierung und Aktivierung immunkompetenter Zellen, wie

polymorphkerniger neutrophiler Granulozyten, Makrophagen und Lymphozyten, und ist in

der Lage in Fibroblasten und Chondrozyten die Synthese von Prostaglandinen und latenten

Kollagenasen zu fördern (MIZEL et al., 1981). Auch die Suszeptibilität der Lunge gegenüber

schädigenden Insulten wird durch IL-1 beeinflusst. So zeigen mit IL-1 und TNF

vorbehandelte Ratten nach Applikation von 100 %igem Sauerstoff deutlich weniger stark

ausgeprägte Lungenveränderungen und eine geringere Mortalität, wobei dieser Effekt

vermutlich durch eine IL-1-vermittelte Induktion von Superoxiddismutase und anderen

antioxidativen Enzymen hervorgerufen wird (WHITE et al., 1987). Die Verabreichung von

IL-1 kann jedoch auch zu Lungenschäden führen, die mit pulmonaler Leukostase und akuten,

pulmonalen, nichtletalen Endothelzelldefekten einhergehen (GOLDBLUM et al., 1988). Die

IL-1-Produktion in der Lunge, vor allem durch Monozyten und Makrophagen, kann durch

verschiedene Faktoren induziert werden. Hierzu gehören inhalierte anorganische Stäube und

Fasern, wie Quarzstaub und Asbest (SCHMIDT et al., 1984), auch Lipopolysaccharide

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(BERNADINE et al., 1988). Nach Untersuchungen von PARSEY et al. (1998) sollen

interstitielle neutrophile Granulozyten bei Endotoxämie die Hauptproduzenten von IL-1β im

Parenchym sein. IL-1β spielt auch eine Rolle sowohl in frühen (PIEDBOEUF et al., 1998) als

auch in späten Phasen entzündlicher Reaktionen der Lunge, beim wundheilungsbedingten

Gewebeumbau (MAY et al., 1991) und bei fibrotischen Veränderungen (OPPENHEIM et al.,

1986). So kann bei der Maus nach hyperoxischen Lungenschäden ab dem zweiten Tag ein

Anstieg der IL-1β-Expression in interstitiellen Makrophagen und neutrophilen Granulozyten

festgestellt werden, wobei die Transkripte - im Gegensatz jedoch zum Protein - ab dem

vierten Tag disseminiert auftraten (PIEDBOEUF et al., 1998). Im Tiermodell konnte darüber

hinaus auch nachgewiesen werden, dass akute entzünd liche Lungenschäden, die durch die

Ausschüttung von IL-1β initiiert werden, in progressive fibrotische Veränderungen übergehen

können (KOLB et al., 2001). Durch intratracheale Applikation von Interleukin-1 gelang es

eine Steigerung der Permeabilität im Alveolarbereich und eine Neutrophileninfiltration

hervorzurufen (HYBERTSON et al., 1997). Diese Steigerung der Gefäß- und

Gewebepermeabilität kann durch eine Stimulation der Freisetzung von Proteasen,

Kollagenasen und Hyaluronidasen erklärt werden. Die Adhäsion und Transmigration von

neutrophilen Granulozyten aus den Kapillarlumina in das Lungenparenchym wird durch eine

IL-1 mediierte Hochregulierung endothelialer Adhäsionsmoleküle gefördert, zu denen neben

E-Selektin auch ICAM-1 gehört (WARD, 1997). Auch bei Patienten mit Adult Respiratory

Distress Syndrome (ARDS) zeigen sich erhöhte Werte für IL-1β in bronchioalveolärer

Lavageflüssigkeit und in Alveolarmakrophagen (PUGIN et al., 1996; ZIEGENHAGEN et al.,

1998) sowie in fibroproliferativen Bereichen bei Idiopathischer Lungenfibrose (IPF) (PAN et

al., 1996). Sowohl IL-1α als auch -β fördern die Bildung von Prokollagen Typ I und III,

Glycosaminglykanen und Fibronektin in Fibroblasten sowie von Kollagen Typ IV in

Epithelzellen. Zusätzlich fördern sie indirekt über eine verstärkte Expression des Platelet-

derived Growth Factors (PDGF) und des PDGFα-Rezeptors die Proliferation von

Fibroblasten. IL-1α und -β dienen auch als frühe Mediatoren im Rahmen chronischer

Entzündungen und stimulieren die Fibrosierung durch Cytokininduktion, wie von IL-1 selbst,

IL-6 sowie von CXC- und CC-Chemokinen (KEANE u. STRIETER, 2002).

Bemerkenswerterweise existieren auch Hinweise darauf, dass IL-1β eine wesentliche Rolle

bei der Heilung von Schäden des Alveolarepithels bei Patienten mit Acute Lung Injury (ALI)

und ARDS spielt. So zeigt sich in vitro nach Hemmung der IL-1β-Aktivität durch den

natürlichen Antagonisten IL-1Ra bei A549-Zellen eine deutlich reduzierte

Regenerationsfähigkeit. Auch finden sich bei der Defektbehebung in Monolayern von

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Primärkulturen rodenter Alveolarepithelzellen sehr hohe IL-1β-Konzentrationen. Dabei soll

IL-1β vor allem das Spreiten der am Defektrand gelegenen Zellen sowie deren Migration und

nicht die Zellproliferation fördern. Darüber hinaus steigert IL-1β die Sekretion von EGF und

TGF-α von Alveolarepithelzellen, die ihrerseits durch parakrine und autokrine Stimulation

die Epithelregeneration positiv beeinflussen. Auch eine erhöhte Expression des Epithelial

Growth Factor-Rezeptors, der die gemeinsame Andockstelle für EGF und TGF-α darstellt,

durch IL-1β ist nicht ausgeschlossen (GEISER et al., 2001). Aufgrund der gemessenen

systemischen und in der BALF angetroffenen Werte sowie aufgrund seiner gesicherten und

postulierten Effekte bei entzündlichen Lungenveränderungen soll IL-1β neben TNFα und das

Verhältnis IL-1Ra / IL-1β ein guter Parameter zur Beurteilung des Schweregrades von

Lungenschäden sein bzw. ein geeigneter prognostischer Faktor für Sarcoidosis beim

Menschen (BAUER et al., 2000; MIKUNIYA et al., 2000).

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2.8 Perillaketon (PK) als lungentoxisches Agens

Herkunft

Perillaketon (1-(3-furyl)4-Methylpentaton) ist das wichtigste toxische Agens von Perilla

frutescens. Diese Pflanze ist unter einer Reihe von Namen wie Perillaminze oder

Beafsteakpflanze bekannt, kann bis zu 2 m groß werden und wird aufgrund der

purpurfarbenen Tönung der reifen Blätter auch als Purpurminze bezeichnet. Ursprünglich

stammt sie aus dem asiatischen Raum und gelangte von dort nach Nordamerika, wo sie vor

allem im Osten und Südosten in der Nähe von Flüssen, in Schluchten und an Straßenrändern

zu finden ist. Ihre Aufnahme führt bei Weidegängern, insbesondere bei Rind und Schaf, zu

Atypischer Interstitieller Pneumonie (AIP), damit zu respiratorischer Insuffizienz und häufig

auch zum Tod der Tiere (KERR et al., 1986). Neben Perilla frutescens existieren noch

verwandte Spezies, die vor allem in Japan kommerziell genutzt werden. Unter anderem

werden daraus Lebensmittelfarbstoffe, Tierfutter und Öl gewonnen. Die Blätter mancher

Arten eignen sich zum Würzen von Speisen oder als Zusatz zu Japanischem Tabak (WILSON

et al., 1977). Es finden sich in Perilla frutescens im Wesentlichen vier verschiedene toxische

Inhaltsstoffe: 1-Perillaaldehyd, Perillaketon (PK), Egomaketon und Isoegomaketon. Bei

Perillaketon, Egomaketon und Isoegomaketon handelt es sich um an Position 3 substituierte

Furanringe, die chemisch mit 4-Ipomeanol verwandt sind. Isoegomaketon stellt das in den

Blättern vorherrschende Furan im Frühsommer dar, während Perillaketon später in der

Wachstumsperiode überwiegt (GARST u. WILSON, 1984).

Perillaketon im Tiermodell

Perillaketon wird in Tiermodellen für die Induktion nichtkardiogener Lungenödeme und

ARDS (GUERRY-FORCE et al., 1987; BERNARD et al., 1995; SNAPPER et al., 1998;

SNAPPER et al., 1999; HWANG et al., 2001) sowie für restriktive Lungenerkrankungen

beim Pferd (BREEZE et al., 1984) eingesetzt. Dieser Zustand ist die Folge einer erheblichen

mikrovaskulären Permeabilitätssteigerung in der Lunge, jedoch ohne Blutdruckveränderungen

oder eine Erhöhung des Gefäßwiderstandes. Somit besitzt diese Substanz in Tiermodellen

z. B. gegenüber E.-coli-LPS oder Ölsäure große Vorteile.

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Pathohistologische Veränderungen

Bei Schafen konnten bereits 15 min nach Beginn der Applikation per infusionem Stauungen

der Lungenkapillaren und nach 180 min Extravasation von Erythrozyten in das Interstitium

und die Alveolarlumina beobachtet werden. Auch finden sich in den ersten 10 – 15 min eine

Ödematisierung der Alveolarwände, später des Interstitiums und der Austritt von

Ödemflüssigkeit in die Lumina. Nach 180 min können häufig auch perivaskuläre Ödeme mit

Ansammlungen von neutrophilen Granulozyten und mononukleären Zellen nachgewiesen

werden, wobei die Margination der Neutrophilen schon in den ersten Minuten einsetzt, die

Migration jedoch erst nach etwa 2 h stattfindet. Histologisch finden sich neben Ödemen und

entzündlichen Infiltraten Schädigungen des Gefäßendothels und der Alveolarepithelzellen

vom Typ I. Bei verendeten Weidetieren kann auch eine Proliferation von

Alveolarepithelzellen vom Typ II nachgewiesen werden, die im Zuge regenerativer Prozesse

die Alveolen säumen. Die makroskopischen Befunde bei PK-bedingten Veränderungen

bestehen in einem deutlich erhöhten Organgewicht und Flüssigkeitsgehalt der explantierten

Lunge mit erweiterten, ödematisierten interlobulären Septen und interstitiellem und bullösem

Emphysem. Es zeigen sich Ödemflüssigkeit in Trachea und Bronchien und mitunter auch

hämorrhagische Areale im Lungenparenchym (GUERRY-FORCE et al., 1988; KERR et al.,

1986). Bemerkenswert ist, dass im Tierversuch mit Mäusen die Veränderungen bei

Vergiftungen mit PK und 4-Ipomeanol nicht zu unterscheiden sind (BOYD et al., 1974).

Elektronenmikroskopische Veränderungen

Auch elektronenmikroskopisch kann im Tiermodell bereits innerhalb der ersten 15 min des

Versuches Ödemflüssigkeit in den interstitiellen Räumen und den Alveolen nachgewiesen

werden. In diesem Zeitraum fanden sich auch bereits erhebliche Schäden des Endothels mit

einem Anstieg der Elektronendichte, mit Vesikelbildung, Vakuolisierung, Fragmentierung des

Zytoplasmas, Verklumpung des Chromatins und manchmal Ablösung der Endothelzellen in

alveolären Kapillaren. In Zusammenhang mit der entblößten Basalmembran zeigten sich

häufig Plättchenaggregate. Auf Ebene der Kapillaren weisen die Perizyten ebenfalls eine

erhöhte Elektronendichte auf, was auf eine Schädigung der gesamten Gefäßwand hinweist.

Nach 120 min zeigen sich ausgedehnte Schäden und Unterbrechungen des Endothels,

vergesellschaftet mit intravaskulären Fibrinkonglomeraten. Im zum Endothel benachbarten

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Interstitium können flockiger Debris, Erythrozyten und Fibrin beobachtet werden. Während

die Endothelschäden immer mit einem interstitiellen Ödem vergesellschaftet sind, können zu

sehr frühen Zeitpunkten auch Foci mit Ödemen ohne erkennbare Beeinträchtigung der Gefäße

angetroffen werden. Später im Versuchsablauf findet sich auch eine Ablösung von

Pneumozyten vom Typ I und die Alveolarräume in diesen Bereichen enthalten große Mengen

an proteinreicher Flüssigkeit und Fibrin. Nach 180 min weist bereits etwa die Hälfte der

gesamten Zellpopulation Schäden auf, während die Pneumozyten vom Typ II zu allen

Zeitpunkten der Untersuchung unverändert zu sein scheinen. Betroffen sind auch die

terminalen und respiratorischen Bronchioli. Nach 30 min können gelegentlich subepitheliale

Ödeme beobachtet werden und fokal nichtziliertes Brochialepithel mit verminderter

Elektronendichte und einer Dilatation des glatten und rauen endoplasmatischen Retikulums.

Funktionell äußern sich die Veränderungen letztlich in respiratorischer Insuffizienz,

verminderter dynamischer Compliance und Hypoxämie. Zudem zeigt sich eine Abnahme der

funktionellen Residualkapazität. Im Tierversuch lassen sich bei Kaninchen, Hunden und

Schweinen auch Leberzelldegenerationen und -nekrosen nachweisen, Hunde können

zusätzlich blutigen Durchfall zeigen und Schweine neurologische Symptome (GARST et al.,

1985).

Wirkungsmechanismus

Verschiedene Autoren gehen davon aus, dass 3-substituierte Furane durch pulmonale

Cytochrom P450-Enzyme (CYP450) aktiviert werden müssen, um ihre toxische Wirkung zu

entfalten (BOYD et al., 1978; DUTCHER u. BOYD, 1979; BOYD, 1980). GARST u.

WILSON (1984) beschreiben eine bemerkenswerte Beziehung zwischen dem Ausmaß der

Schädigungen verschiedener Organe, wie Lunge, Leber und Niere, durch PK und deren

Gehalt an Cytochrom P450. Auch soll ein Zusammenhang zwischen der Letalität und den

Aktivitäten von CYP 450-Enzymen und der NADPH-Cytochrom C-Reduktase bestehen

(KERR et al., 1986). Obwohl der genaue Wirkungsmechanismus noch nicht geklärt ist,

stützen diese Ergebnisse die Hypothese, dass Perillaketon, ebenso wie das chemisch sehr

ähnliche 4-Ipomeanol, durch das Cyp450-Enzymsystem erst metabolisch aktiviert werden

muss. RIVANDRANATH et al. (1984) vermuten, dass Furane in diesem Zusammenhang

nichtgesättigte Dialdehyde wie Acetylacrolein und Methylbutenedial bilden können, die

unmittelbar vor Ort der Entstehung reagieren. Ein weiterer Hinweis auf eine metabolische

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Aktivierung ist die Tatsache, dass sich bei Hühnern und Japanischen Wachteln, die keine

CYP450-Aktivität in der Lunge besitzen, zwar Leberveränderungen finden, die Atemorgane

jedoch unbeeinträchtigt bleiben (BOYD, 1977). In vitro-Versuche mit bovinen aortalen

Endothelzellen führen zu anderen Ergebnissen (WATERS et al., 1993). Zwar hat eine

Behandlung der Zellen mit PK ebenfalls eine deutliche Permeabilitätssteigerung des

Monolayers zur Folge, ein Einsatz von Ketokonazol als CYP450-Inhibitor zeigt jedoch keine

Wirkung, was gegen eine Aktivierung der Substanz durch mikrosomale Monooxigenasen

spricht. Es zeigen sich jedoch unter Einfluss von PK eine Zunahme interzellulärer Spalten,

jedoch keine Zelluntergänge. Diese „Permeabilitätssteigerung“ ist nach Absetzten von PK

reversibel. Bei der Betrachtung des Zytoskeletts weisen die Endothelzellen Unterbrechungen

und Fragmentierung der Aktinfilamente auf und es finden sich Parakristalle. Als weitere

mögliche Mechanismen werden unter anderem rezeptorvemittelte Effekte oder

Unterbrechungen von Adhäsionsmolekülen zur Basalmembran diskutiert (WATERS et al.,

1993).

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3 Material und Methoden

3.1 Untersuchungsmaterial

Die Planung des Tierversuchs, die Durchführung der klinischen Untersuchungen und der

Probenentnahmen erfolgte durch Frau Dr. Monika Venner (Klinik für Pferde, Tierärztliche

Hochschule Hannover), die in diesem Zusammenhang parallel zur vorliegenden Arbeit

ebenfalls ein Thema im Rahmen des Ph.D.-Studiums bearbeitete (VENNER, 2003). Im

Rahmen dieser Arbeit wurden nach umfassender klinischer Untersuchung und oraler

Entwurmung mit Ivermectin (IvomecP®, Merial, Halbermoos) an zehn lungengesunden,

adulten Pferden Versuche durchgeführt. Der Impfstatus war bei den meisten Pferden

unbekannt. Die Pferde wurden in der Klinik für Pferde der Tierärztlichen Hochschule

Hannover zwei Wochen vor Versuchsbeginn und während des Versuchs auf Späneeinstreu

und mit Blickkontakt zu anderen Pferden aufgestallt. Die standardisierte Fütterung bestand

dreimal täglich aus nassem Heu sowie einer Mischung aus Hafer und Pellets mit Möhren.

Sofern ihr klinischer Zustand dies zuließ, wurden die Tiere täglich 30 - 45 min frei in der

Reithalle oder an der Longe bewegt. In einem Vorversuch zur Dosisfindung erfolgte bei zwei

Pferden die intravenöse (i.v.) Applikation von 5 mg / kg KG 1-(3-furyl)4-Methylpentaton

(Perillaketon) in insgesamt 13 ml Dimethylsulfoxid (DMSO), wobei die Gesamtdosis zu

gleichen Teilen auf zwei Bolusinjektionen im Abstand von 30 min verteilt wurde. Im darauf

folgenden Hauptversuch, ebenfalls zu gleichen Teilen verteilt auf zwei Bolusinjektionen im

Abstand von 30 min, erhielten sechs weitere Pferde eine intravenöse Dosis von 6 mg / kg KG

zur Erzeugung eines akuten Alveolarschadens. Die Synthese von Perillaketon wurde nach der

Methode von GARST et al. (1984, 1985) vom Institut für Chemie der Tierärztlichen

Hochschule, Hannover, durchgeführt. Die Verabreichung der Perillaketon / DMSO-Lösung

erfolgte über einen Teflonkatheter (Vygonüle S, 12 Gauche, Fa. Vygon, Aachen, Best.-Nr.

103.827) in der Vena jugularis. Die Tiere der höheren Dosisgruppe des Hauptversuchs (6 mg /

kg KG) wurden bei Auftreten schwerwiegender klinischer Symptome als lebenserhaltende

Maßnahme über 48 h zweimal täglich mit 1 mg / kg KG Methylprednisolon (Urbason®,

Eurim Pharm, Pid ing) und mit Furosemid (Dimazon®, Intervet, Unterschleißheim) i.v.

behandelt. Zur Gewinnung von Lungengewebe als Untersuchungsmaterial erfolgte am

sedierten Pferd ab dem ersten Versuchstag zweimal wöchentlich in regelmäßigen Abständen

die transkutane Entnahme von je zwei Bioptaten vom linken und rechten Hauptlappen aus

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dem Bereich zwischen 8. und 11. Interkostalraum bzw. bei kleineren Pferden zwischen dem 7.

und 10. Interkostalraum. Als Kontrollen dienten von jedem Pferd insgesamt acht an zwei

verschiedenen Tagen aus denselben Bereichen vor Versuchsbeginn entnommene Proben. Die

Gewinnung erfolgte mit Hilfe einer halbautomatischen Biopsiepistole (Pro-Mag 2.2,

USBiopsy engineered medical products, Franklin, USA) mit Einmalbiopsienadeln (14

Gauche, 10 cm Länge), die gegenüber der herkömmlichen True-Cut Nadel hinsichtlich

Probenqualität und Nebenwirkungen für das Pferd deutliche Vorteile besitzt (VENNER et al.,

in Druck). Die Proben besaßen eine Größe von bis zu 1,5 x 0,2 x 0,2 cm und waren nur in

wenigen Fällen erheblich kleiner. Zu einigen Zeitpunkten lieferten die Biopsien jedoch nicht

von allen vier Lokalisationen auswertbares Gewebe. Für die vorliegende Arbeit erfolgten im

Hauptversuch die Untersuchungen bis zur 4. Woche, wobei Pferd 3 und 5 bereits am 11. bzw.

9. Versuchstag in moribundem Zustand euthanasiert werden müssen. Dieser Beobachtungs-

zeitraum war gerechtfertigt, da in anderen Untersuchungen (ZAPOL et al., 1979; COLLINS et

al., 1984) bereits drei Wochen nach einem erfolgten diffusen Alveolarschaden eine Zunahme

der Kollagengehaltes der Lunge um das Dreifache beobachtet werden konnte. Zudem

erfolgten pathohistologische Untersuchungen an Biopsieproben anhand von HE – gefärbten

Paraffinschnitten und Semidünnschnitten noch über weitere vier Wochen. Nach Ablauf dieser

Zeit wurden die Tiere euthanasiert und die Lungen explantiert. Eine Lunge jedes Tieres wurde

im Rahmen der Ph.D.-Arbeit von Frau Dr. Venner an der Klinik für Pferde für

computertomographische Untersuchungen verwendet, die verbliebene Lunge umfassend

pathohistologisch ausgewertet.

Tabelle 4: Übersicht über die Versuchspferde

Versuchstier

Nr.

Alter Geschlecht Rasse Gewicht Dosierung

Perillaketon (i.v.)

1 3 Jahre Wallach Warmblut 510 kg 5 mg / kg KG

2 5 Jahre Wallach Warmblut 600 kg 5 mg / kg KG

3 3 Jahre Stute Warmblut 490 kg 6 mg / kg KG

4 2 Jahre Stute Traber 480 kg 6 mg / kg KG

5 2 Jahre Wallach Warmblut 480 kg 6 mg / kg KG

6 5 Jahre Stute Traber 420 kg 6 mg / kg KG

7 3 Jahre Wallach Warmblut 550 kg 6 mg / kg KG

8 3 Jahre Stute Warmblut 550 kg 6 mg / kg KG

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3.2 Allgemeine Versuchsplanung

Um anhand der Lungenbiopsieproben der Versuchspferde die induzierten Schäden der

alveolären Septen, regenerative und eventuelle reparative Prozesse charakterisieren zu

können, sollten zunächst licht- und elektronenmikroskopische Untersuchungen an Hämalaun-

Eosin (HE) -gefärbten Paraffinschnitten und Semidünnschnitten bzw. an Ultradünnschnitten

einer jeden Lokalisation durchgeführt werden. Zur Beurteilung des initialen, durch

Perillaketon hervorgerufenen diffusen Alveolarschadens, der die Grundlage für alle weiteren

auftretenden Veränderungen bildete, wurden nekrotische und apoptotische Zellen durch

terminal dUTP nick -end labeling (TUNEL) dargestellt, und durch die Gegenüberstellung von

TUNEL-positiven Zellen und Gesamtzellzahl die Apoptose- und Nekroserate bestimmt. Um

den Verlauf und das Ausmaß der mit regenerativen und möglicherweise reparativen

Vorgängen einhergehenden, fibroproliferativen Phase und einer eventuellen Fibrose zu

erfassen, erfolgte zum einen die immunhistochemische Markierung von Ki-67 zur Darstellung

von proliferierenden Zellen, wobei in Bezugsetzung zur Gesamtzellzahl die Proliferationsrate

ermitteltet wurde. Des Weiteren diente die morphometrische, phasenanalytische Auswertung

von in der Heidenhainschen Azanfärbung dargestellten kollagenen und retikulären Fasern

dazu, eine Zu- oder auch Abnahme des Anteils extrazellulärer Matrixbestandteile an den

alveolären Septen festzustellen und somit den Grad ablaufender fibrotischer oder auch

erosiver Prozesse zu bestimmen. Zur Untersuchung des Ausmaßes entzündlicher zellulärer

Infiltrate wurden Makrophagen und Granulozyten durch immunhistochemische Markierung

von Myeloid / Histiozyten-Antigen (MAC 387) dargestellt und in Bezug zur Gesamtzellzahl

gesetzt. Diese Untersuchungen sollten dazu dienen, eine Aussage über das Ausmaß der

entzündlichen Reaktion treffen zu können und das unterschiedliche Auftreten der

verschiedenen Typen von Entzündungszellen in den einzelnen Phasen der interstitiellen

Pneumonie darzustellen. Die Durchführung der quantitativen Polymerase-Kettenreaktion

diente der Untersuchung der Veränderungen der Genexpression der Cytokine TGFß und IL-

1ß sowie der Strukturproteine Prokollagen a1(I) und a1(III). Diese neu zu etablierenden

Methoden mussten bei der Anwendung an diesen sehr geringen Gewebemengen hoch sensitiv

und präzise quantitativ sein. Es sollte dabei geklärt werden, wie sich die Genexpressionen

dieser Cytokine und extrazellulären Matrixproteine im Verlauf dieser experimentell erzeugten

interstitiellen Pneumonie verhalten. Ferner sollten sie zu den Ergebnissen der oben

aufgeführten morphologischen und morphometrischen Untersuchungen in Bezug gesetzt und

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geprüft werden, in wie weit sie sich als möglicher prognostischer Parameter quoad

restitutionem und quoad vitam eignen. Durch die Kombination der Untersuchungsmethoden

und der transkutanen Entnahmetechnik, die die Gewinnung von Lungengewebe intra vitam

ermöglicht, sollten erstmals umfassende und zusammenhängende Untersuchungen über die

Pathogenese der interstitiellen Pneumonie in allen Phasen des Krankheitsverlaufs bis zur

Ausheilung oder einer möglichen Lungenfibrose erfolgen. Die etablierten Methoden können

Modellcharakter für Genexpressionsanalysen an Minimalbiopsieproben besitzen.

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3.3 Methoden

3.3.1 Fixierung und Archivierung der Lungenbiopsieproben

Unmittelbar nach der Entnahme wurde das gewonnene Gewebe mit einer sterilen

Skalpellklinge dreigeteilt und die Einzelproben fixiert bzw. archiviert. Für die spätere

Isolierung von Gesamt-RNA wurde eine der Teilproben sofort in flüssigem Stickstoff

schockgefrostet und anschließend bei –80°C gelagert. Für die lichtmikroskopischen und

immunhistochemischen Untersuchungen erfolgte die Fixierung einer der Teilproben für

maximal 24 Stunden in 4 %iger, neutral gepufferter Paraformaldehydlösung (siehe Anhang)

und für die elektronenmikroskopische Auswertung für mindestens 24 Stunden in 5 %igem

Glutaraldehyd in Cacodylatpuffer (siehe Anhang).

3.3.2 Paraffineinbettung und Schnittherstellung für lichtmikroskopische und

immunhistochemische Untersuchungen sowie terminal dUTP nick-end

labeling (TUNEL)

Die formalinfixierten Proben wurden in einem Automatensystem (Hypercenter II, Fa.

Shandon, Frankfurt) nach dreistündiger Spülung in Leitungswasser in einer aufsteigenden

Alkoholreihe (70 %iges, 80 %iges und 96 %iges Ethanol jeweils 45 min, zweimal 100 %iger

Isopropylalkohol für 45 min) dehydriert und nach zweimaligem Spülen in Essigsäure-n-

Butylester (je 60 min) als Intermedium in Paraplast Plus (Fa. Shandon, Frankfurt) eingebettet.

Schließlich erfolgte die Herstellung 2-3 µm dicker Schnitte mit einem Schlittenmikrotom, die

in einem Wasserbad (42°C) gestreckt und auf Superfrost Plus Objektträger (Menzel-Gläser,

Braunschweig, Best.-Nr.: 041300) aufgezogen wurden. Abschließend wurden sie für 20

Minuten bei 60°C in einem Wärmeschrank getrocknet. Die Aufbewahrung erfolgte bei

Raumtemperatur.

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3.3.3 Immunhistochemische Untersuchungen

3.3.3.1 Bestimmung der Zellproliferationsrate

Zur Ermittlung der Zellproliferationsrate in Abhängigkeit vom zeitlichen Verlauf der

Lungenveränderungen wurden diejenigen Zellen der Gewebepräparate, die sich in Zellteilung

befanden mit Antikörper gegen Ki-67 (MIB-1, Fa. DAKO, Hamburg, Best.-Nr. M 7240)

identifiziert. Die Auswertung erfolgte mit Hilfe des Bildanalyseprogramms analySIS 3.2

(Fa. Soft Imaging System GmbH, Münster), wobei pro Biopsieprobe, soweit aufgrund der

Schnittgröße möglich, unter dem Mikroskop wenigstens zwei Sichtfelder bei zehnfacher

Vergrößerung ausgezählt wurden. Die Gesamtzahl proliferierender Zellen zu den einzelnen

Zeitpunkten ergab sich aus der Summe der markierten Zellen aller Biopsieproben eines

Entnahmetages. Da die Biopsieproben entnahmebedingt unterschiedlich stark komprimiert

bzw. ent faltet waren, wurde als Bezugspunkt für die Zellproliferationsrate nicht die

Schnittfläche sondern die Gesamtzellzahl des untersuchten Bereichs gewählt. Die

Bestimmung der Gesamtzellzahl erfolgte an den entsprechenden Lokalisationen HE-gefärbter

Konsekutivschnitte durch computergestützte Zählung der sich blauviolett darstellenden

Zellkerne. Hierfür wurden auf Objektträger gezogene Paraffinschnitte mit Hämalaun-Eosin

(ROMEIS, 1989) in einem Färbeautomaten (Varistain 24-3, Fa. Shandon, Frankfurt) gefärbt.

Die Zellproliferationsrate ergab sich aus dem Anteil Ki-67-positiver Zellen an der

Gesamtzellzahl. Luftführende Wege, Bindegewebssepten, größere Gefäße und intraalveoläre

Bestandteile wurden nicht in die Bestimmung der Zellproliferationsrate miteinbezogen. Die

Durchführung der immunhistochemischen Markierung ist unter 3.1.3.3.2 beschrieben.

3.3.3.2 Bestimmung des Anteils der Makrophagen- und Granulozytenpopulation an

der Gesamtzellzahl der Lunge

Zur Untersuchung der Makrophagenpopulation wurde eine immunhistochemische Markierung

von Myeloid / Histiozyten-Antigen (Klon MAC 387, Fa. DAKO, Hamburg, Best.-Nr. M0747)

durchgeführt. Die Auswertung erfolgte mit Hilfe des Bildanalyseprogramms analySIS 3.2

(Fa. Soft Imaging System GmbH, Münster), wobei pro Biopsieprobe, soweit aufgrund der

Schnittgröße möglich, unter dem Mikroskop wenigstens zwei Sichtfelder bei zehnfacher

Vergrößerung ausgezählt wurden. Die Gesamtzahl der Makrophagen zu den jeweiligen

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Zeitpunkten ergab sich aus der Summe der MAC 387-positiven Zellen aller Biopsieproben

eines Entnahmetages. Da die Biopsieproben entnahmebedingt unterschiedlich stark

komprimiert bzw. entfaltet waren, wurde als Bezugspunkt für den Umfang der

Makrophagenpopulation nicht die Schnittfläche sondern die Gesamtzellzahl des untersuchten

Bereichs gewählt. Die Gesamtzellzahl ergab sich aus der Summe der mit Hämalaun

blauviolett gefärbten Zellkerne. Luftführende Wege, Bindegewebssepten und größere Gefäße

wurden nicht in die Bestimmung von Makrophagenpopulation und Gesamtzellzahl

miteinbezogen.

Vorgehensweise

1. Entparaffinieren und Rehydrieren: Xylol: 3 x 5 min

Isopropanol: 5 min

Ethanol 96 %: 3 min

Ethanol 70 %: 3 min

Ethanol 50 %: 3 min

2. 30 min Hemmung der endogenen Peroxidase in 85 %igem Ethanol mit 0,5 % H2O2.

3. 3 x 5 min Spülen in PBS (siehe Anhang) unter ständigem Rühren

4. Antigendemaskierung: Ki-67: 6 x 5 min Demaskierung der Antigene in der

Mikrowelle (750 W) in kochendem Citratpuffer

(pH=6, 10mM), hergestellt aus Konzentrat

(ProTaqstura, Vertrieb über quartett GmbH,

Berlin) (siehe Anhang)

MAC 387: 20 min Demaskierung der Antigene in

Demaskierungslösung G (1:4 in Aqua dest.)

(Fa. Biologo, Wettenberg, Best.-Nr. DE007)

bei 95°C im Wasserbad

5. 3 x 5 min Spülen in PBS unter ständigem Rühren

6. Blockserum: Verbringen der Schnitte in Coverplates (Fa. Shandon, Frankfurt, Best.-Nr.

72110013) und Überschichten mit 1:5 in PBS verdünntem, inaktiviertem Ziegen-

Normalserum für 20 min bei Raumtemperatur zur Unterdrückung unspezifischer

Hintergundfärbungen

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7. Erstantikörper: Ki-67: Zugabe von 150 µl Maus Ki-67 (MIB-1,

Fa. DAKO, Hamburg, Best.-Nr. M 7240)

monoklonalem Antikörper (1:100 in PBS mit

0,05 % Tween20 und 1 % BSA)

MAC 387: Zugabe von 150 µl Maus-anti- Myeloid /

Histiozyten-Antigen (Klon MAC 387, Fa.

DAKO, Hamburg, Best.-Nr. M0747) mono-

klonalem Antikörper(1:200 in PBS mit 0,05 %

Tween20 und 1 % BSA)

und Inkubation über Nacht bei 4°C

8. 3 x Spülen mit je 600 ml PBS bei Raumtemperatur

9. Zweitantikörper: Überschichten mit 150 µl des 1:200 in PBS verdünnten Sekundär-

antikörpers (biotinyliertes Ziege-anti-Maus Serum) für 30 min bei Raumtemperatur

10. 3 x Spülen mit je 600 ml PBS

11. Überschichten mit 1:250 in PBS verdünntem Avidin-Biotin-Komplex (Fa. Vector,

Burlingham, USA, Best.-Nr. PK6100) für 45 min

12. 3 x Spülen mit je 600 ml PBS

13. Enzymhistochemische Reaktion: Überführen der Schnitte in eine Küvette und fünf-

minütige Inkubation in 150 ml einer 0,05 %igen Diaminobenzidin-tetra-Hydrochlorid

(DAB) Lösung mit 0,03 % H2O2 unter ständigem Rühren. Mit Anti-Ki-67 markierte

Zellkerne färbten sich rotbraun

14. Spülen der Schnitte in PBS und verbringen in fließendes Leitungswasser für insgesamt

15 min

15. Nur MAC 387: Gegenfärbung in Hämalaun nach Meyer für 15 s und Bläuen für 5 min

unter fließendem Leitungswasser

16. Entwässerung: Ethanol 50 %: 3 min

Ethanol 70 %: 3 min

Ethanol 96 %: 3 min

Isopropanol: 5 min

Xylol: 3 x 5 min

17. Eindecken mit Corbitbalsam (Fa. Hecht, Kiel)

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Kontrollen

Die Etablierung der Methoden zum Nachweis von Ki-67 und Myeloid / Histiozyten-Antigen

erfolgte an Paraffinschnitten von unverändertem, equinem Lungengewebe und equinen

Mandibularlymphknoten, die hinsichtlich Fixierungsmedium und –dauer dem zu

untersuchenden Gewebe entsprachen. Diese wurden auch als Positiv- und Negativkontrollen

bei jeder Reaktion mitgeführt, als Negativkontrollen dienten zusätzlich Originalproben aus

dem vorliegenden Tierversuch. Die Negativkontrollen wurden statt mit dem Primärantikörper

oder dem Sekundärantikörper mit balb / C-Mausaszites (Ki-67: 1:1000, MAC 387: 1:2000)

überschichtet. Zur Beurteilung eventueller unspezifischer Hintergrundreaktionen wurde das

Normalserum durch PBS ersetzt.

3.3.4 Bestimmung der Zelluntergangsrate im terminal dUTP nick-end labeling

(TUNEL) Assay

Zur Durchführung der TUNEL-Reaktion für die Bestimmung der Zelluntergangsrate wurde

das In Situ Apoptosis Detection Kit (ApopTag, Best.-Nr.: S7101) der Firma Appligene

Oncor (Heidelberg) verwendet. Das Prinzip der TUNEL-Reaktion basiert auf der

enzymatischen Markierung der freien 3 -́OH-Termini von Einzel- oder Doppelstrang-DNA-

Bruchstücken mit digoxigeninhaltigen Nukleotiden durch eine terminal deoxynucleotidyl

transferase (TdT). Diese Bruchstücke entstehen durch Fragmentierung der DNA in

apoptotischen Zellen und finden sich dort im Zellkern und in apoptotischen Körperchen. Die

so an die Bruchenden des DNA-Stranges ange lagerten Digoxigenin-dNTP-Oligomere dienten

als Bindungsstellen für einen peroxidasekonjugierten Anti-Digoxigenin-Antikörper.

Fragmentierte DNA lässt sich außer in apoptotischen auch in nekrotischen Zellen nachweisen

(COLLINS et al., 1992). Die Antigen-Antikörper-Reaktion war somit durch Verwendung von

Diaminobenzidin-tetra-Hydrochlorid dargestellt werden. Die Auswertung erfolgte mit Hilfe

des Bildanalyseprogramms analySIS 3.2 (Fa. Soft Imaging System GmbH, Münster), wobei

pro Biopsieprobe, soweit aufgrund der Schnittgröße möglich, unter dem Mikroskop

wenigstens zwei Sichtfelder bei zehnfacher Vergrößerung bearbeitet wurden. Da die

Biopsieproben entnahmebedingt unterschiedlich stark komprimiert bzw. entfaltet waren,

wurde als Bezugspunkt für die Zellproliferationsrate nicht die Schnittfläche sondern die

Gesamtzellzahl des untersuchten Bereichs gewählt. Die Anzahl nekrotischer und

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apoptotischer Zellen zu den einzelnen Zeitpunkten ergab sich aus der Summe der

Einzelproben des jeweiligen Entnahmetages. Die Gesamtzellzahl ergab sich aus der Summe

der mit Hämalaun blauviolett gefärbten Zellkerne und der Anzahl TUNEL-positiver Zellen.

TUNEL-positive Zellen und mit Hämalaun gefärbte Kerne im Bereich von luftführenden

Wegen, Bindegewebssepten und größeren Gefäßen wurden von der Messung ausgeschlossen.

Vorgehensweise

1. Entparaffinieren und Rehydrieren: Xylol: 3 x 5 min

Isopropanol: 5 min

Ethanol 96 %: 3 min

Ethanol 70 %: 3 min

Ethanol 50 %: 3 min

2. Einmaliges Spülen der Schnitte in PBS (siehe Anhang) für 5 min unter ständigem Rühren.

3. Abtrocknen der Objektträger und Umranden der Schnitte mit einem Fettstift

4. Andauen des Gewebes mit Proteinase K-Gebrauchslösung (siehe Anhang) für 10 min bei

Raumtemperatur in einer feuchten Kammer

5. Umsetzen in eine Küvette und 4 x 2 min Spülen in PBS unter ständigem Rühren.

6. Hemmung der endogenen Peroxidasen mit 2 % H2O2 in PBS für 5 min unter ständigem

Rühren

7. 2 x 5 min Spülen der Schnitte in PBS unter ständigem Rühren

8. Auftragen von 75 µl Equilibrierungsspuffer pro Schnitt für 10 min

9. Equilibrierungspuffer abschütteln, Überführen der Präparate in eine vorgewärmte feuchte

Kammer und Auftragen von 54 µl Working Strength TdT Solution (siehe Anhang) pro

Schnitt und Abdecken mit CoverSlip-Folie. Inkubation für 60 min bei 37°C im

Brutschrank

10. Entfernen der CoverSlip-Folie und Überführen der Objektträger in vorgewärmten Stop-

Wash-Puffer (siehe Anhang). Inkubation für 30 min bei 37°C im Schüttelwasserbad.

11. 3 x 5 min Spülen in PBS unter ständigem Rühren

12. Auftragen von 55 µl Anti-Digoxigenin-Peroxidase pro Schnitt und Abdecken mit

CoverSlip-Folie; Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur

13. Umsetzen in eine Küvette und 4 x 2 min Spülen in PBS unter ständigem Rühren.

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14. Enzymhistochemische Reaktion: Überführen der Schnitte in eine Küvette und

fünfminütige Inkubation in 150 ml einer 0,05 %igen Diaminobenzidin-tetra-Hydrochlorid

Lösung (DAB) mit 0,03 % H2O2 unter ständigem Rühren zur Darstellung der TUNEL-

Reaktion. TUNEL-positive Zellen färbten sich rotbraun

15. Kurzes Eintauchen der Schnitte in Aqua dest.

16. Gegenfärben in Hämalaun nach Meyer für 15 s und anschließendes Bläuen der Schnitte

für 5 min unter fließendem Leitungswasser

17. Entwässerung: Ethanol 50 %: 3 min

Ethanol 70 %: 3 min

Ethanol 96 %: 3 min

Isopropanol: 5 min

Xylol: 3 x 5 min

18. Eindecken mit Corbitbalsam (Fa. Hecht, Kiel)

Kontrollen

Zur Überprüfung der Spezifität der Reaktion wurden die vom Hersteller gelieferten

Positivkontrollen mitgeführt. Als Negativkontrollen dienten Originalproben aus dem

vorliegenden Tierversuch sowie Gewebeschnitte von unverändertem equinem Lungengewebe

und equiner Mandibularlymphknoten, die statt mit dem Digoxigenin-dNTP-haltigen

Reaktionspuffer oder Anti-Digoxigenin-Peroxidase mit PBS überschichtet wurden.

3.3.5 Bestimmung des Anteils kollagener und retikulärer Fasern an den

alveolären Septen

Zur Bestimmung des Anteils kollagener und retikulärer Fasern am Gesamtgewebe der

alveolären Septen wurden diese in der Heidenhainschen Azanfärbung dargestellt. Die Schnitte

wurden in einer absteigenden Alkoholreihe entparaffiniert und rehydriert (3 min Ethanol

50 %, 3 min Ethanol 70 %, 3 min Ethanol 96 %, 5 min Isopropanol, 3 x 5 min Xylol) in Aqua

dest. gespült und anschließend in vorgewärmter Azokarminlösung (siehe Anhang) über 15

min im Brutschrank bei 60°C inkubiert. Nach dem Spülen in Aqua dest. gelangten die

Präparate bei Raumtemperatur für 3 min in alkalische Anilinlösung (siehe Anhang), für 1 min

in essigsauren Alkohol (siehe Anhang) und für 30 min in 5 %ige Phosphorwolframsäure.

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Nach abermaligem Waschen in Aqua dest. erfolgte über 30 min die Inkubation in Anilinblau-

Orange-Essigsäure-Gebrauchslösung (siehe Anhang) und erneutes Spülen. Zur

Differenzierung wurden die Schnitte kurz in 96 %iges Ethanol getaucht und zum Entwässern

für 2 min in Propanol und danach in Essigsäure-n-Butylester gegeben. Abschließend erfolgte

das Eindecken mit Corbitbalsam. Kollagenes und retikuläres Bindegewebe stellten sich blau

dar, alle übrigen Strukturen färbten sich in Rot- und Orangetönen. Mit Hilfe des

Bildanalyseprogramms analySIS 3.2 (Fa. Soft Imaging Systems GmbH, Münster) erfolgte

durch Phasenanalyse die Bestimmung der Flächen der einzelnen Farbanteile. Pro

Biopsieprobe, soweit aufgrund der Schnittgröße möglich, wurden unter dem Mikroskop

wenigstens zwei Sichtfelder bei zehnfacher Vergrößerung untersucht. Da die Biopsieproben

entnahmebedingt unterschiedlich stark komprimiert bzw. entfaltet waren, wurde als

Bezugspunkt für den Kollagenanteil nicht die Gesamtschnittfläche, die auch die

Alveolarlumina beinhaltet, gewählt, sondern die Gesamtfläche ausschließlich der alveolären

Septen des untersuchten Bereichs. Die Gesamtfläche der alveolären Septen im Paraffinschnitt

ergab sich aus der Summe der rötlich und der blau gefärbten Strukturen. Der Anteil

kollagener und retikulärer Fasern ergab sich aus dem Anteil blau gefärbter Strukturen an der

Gesamtfläche der alveolären Septen. Luftführende Wege, Bindegewebssepten, größere

Gefäße und intraalveoläre Bestandteile wurden in die Phasenanalyse nicht mit einbezogen.

3.3.6 Licht- und transmissionselektronenmikroskopische Untersuchungen

Die lichtmikroskopische Untersuchung erfolgte sowohl an mit HE gefärbten Paraffinschnitten

(siehe Anhang) des formalinfixierten Gewebes, als auch an mit Toluidinb lau gefärbten

Semidünnschnitten des in Glutaraldehyd fixierten Gewebes (siehe unten). Für die

elektronenmikroskopische Untersuchung wurden die mindestens für 24 Stunden in 5 %iger

Glutaraldehydlösung fixierten Teilproben der Lungenbiopsien in ca. 1 x 1 x 1 mm große

Stücke geschnitten, für 4 x 15 min in Cacodylatpuffer (siehe Anhang) gespült, in 1 %igem

Osmiumtetroxid nachfixiert, erneut mehrmals in Cacodylatpuffer gewaschen und

anschließend in einer aufsteigenden Alkoholreihe (30 %iges, 50 %iges, 70 %iges, 90 %iges

und absolutes unvergälltes Ethanol) dehydriert. Im nächsten Schritt gelangten die

Gewebeproben für 30 min in Propylenoxid als Intermedium und zur Infiltration für 30 min in

ein Gemisch aus Propylenoxid und Glycidether (Fa. Serva, Heidelberg, Best.-Nr. 21045) und

schließlich in reinen Glycidether. Danach erfolgte die Einbettung in Glycidether mit 1,5 %

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DMP-30 (2, 4, 6-Dimethylaminomethylphenol) (Fa. Serva, Heidelberg, Best.-Nr. 36975) als

Akzelerator. Die vorbereiteten Proben wurden in flachen Silikonformen ausgegossen

(Flacheinbettung) und abschließend zur Polymerisation in einen programmierbaren

Wärmeschrank gegeben (24 h 35°C, 24 h 45°C, 4 Tage 60°C). Die Kunstharzblöcke wurden

mit Hilfe eines Pyramitoms (Fa. Reichert-Jung, Nußloch, Österreich) zugetrimmt und

zunächst zur Anfertigung von 0,5 µm dicken Semidünnschnitten an einem Ultramikrotom

Ultracut E (Fa. Reichert-Jung, Nussloch, Österreich) mit Glasmesser verwendet. Die

Semidünnschnitte dienten nach Färbung in 0,25 %igem Toluidinblau (1 min) sowohl der

lichtmikroskopischen Auswertung als auch der Vororientierung und Auswahl der Lokalisation

für die Elektronenmikroskopie. Von den ausgewählten Bereichen wurden mit Hilfe eines

Ultramikrotoms Ultracut E mit Diamantmesser (Fa. Diatome, Ag Biel, Schweiz) 70 nm dicke

Ultradünnschnitte hergestellt, diese auf Kupferobjektträgernetze (Science-Services, München)

verbracht und in einem Kontrastierautomaten Modell 2168 Ultrostainer Carlsberg System (Fa.

LKB, Bromma, Schweden) einer 2-Schritt-Kontrastierung unterzogen: im ersten Schritt

erfolgte für 30 min eine Inkubation in Ultrostain I (Uranylacetatlösung, Fa. Le ica, Benzheim,

Best.-Nr. 2168-200) mit anschließender Spülung in blasenfreiem Aqua bidest., im zweiten

Schritt wurden die Ultradünnschnitte für die Gegenkontrastierung für 80 s in Ultrostain II

(Bleicitratlösung, Fa. Leica, Benzheim, Best.-Nr. 2168-210) inkubiert und ebenfalls

abschließend in blasenfreiem Aqua bidest. gespült. Die elektronenmikroskopische

Untersuchung erfolgte an einem Transmissionselektronenmikroskop EM 10C der Firma Zeiss

(Oberkochen).

3.3.7 Molekularbiologische Präparationen

3.3.7.1 Allgemeine Maßnahmen

Um einen möglichst hohen Schutz vor DNA-Kontaminationen und dem Einfluss von RNasen

zu gewährleisten, wurden zur Durchführung der Präparationen die allgemein anerkannten

Maßnahmen molekularbiologischen Arbeitens im Labor beachtet:

- Tragen von Latex-Einmalhandschuhen (Fa. Jürgens, Hannover, Best.-Nr. 9405220),

die nach jedem Präparationsschritt gewechselt wurden

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- Sämtliche verwendeten Gefäße, Materialien und Lösungen zur Extraktion von

Gesamt-RNA oder Durchführung von reverser Transkription und quantitativer

Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) wurden für 20 min bei 121°C und 2,5 bar

autoklaviert

- Zweifach destilliertes Wasser, sofern es sich nicht um vom Hersteller für die

entsprechenden Präparationen geliefertes Wasser handelte, für die Isolierung von

Gesamt-RNA, reverse Transkription und qPCR wurde mit Diethylpyrocarbonat

(DEPC) (Fa. Aldrich, Steinheim, Best.-Nr. 27238-8) nach der Methode von

EHRENBERG et al. (1974) behandelt (siehe Anhang)

- Um Produktkontaminationen vor und während der Durchführung der qPCR zu

vermeiden, wurden die RNA-Präparationen und das Ansetzen der Reagenzien für

reverse Transkription und qPCR in einem eigens dafür vorgesehenen, abgetrennten

Raum vorgenommen, in den keine DNA aus PCR-Produkten eingebracht wurde

- Bei der Präparation mit Mikroliterpipetten wurden sterile, RNase- und DNase-freie,

gestopfte Einmalpipettenspitzen (Fa. Biozym, Hameln, Best.-Nr. 691975 und 692151)

verwendet

- Bei allen PCR-Amplifikationen wurden in jeder Reaktionscharge zur Überprüfung auf

DNA-Kontaminationen entsprechende Negativkontrollen mitgeführt, bei denen das

Template durch das gleiche Volumen an DEPC-behandeltem Wasser ersetzt wurde

3.3.7.2. Isolierung von Gesamt-RNA aus tiefgefrorenem Lungengewebe

Die Isolierung von Gesamt-RNA aus den in flüssigem Stickstoff archivierten Teilproben

erfolgte mit Hilfe des RNeasy Mini Kits der Firma Qiagen (Hilden, Best.-Nr. 74104). Das

Prinzip der Isolierung beruht auf einer selektiven Ausfällung von RNA-Molekülen mit einer

Länge von mehr als ca. 200 Basen und der Bindung an eine Silikagelmembran bei definierten

Salzkonzentrationen. Kleinere Moleküle wie 5.8 S RNA, 5 S RNA und tRNA binden

aufgrund ihrer geringeren Größe von ca. 160, 120 bzw. 70-90 Nukleotiden nicht und werden

eluiert. Alle Arbeitsschritte wurden bei Raumtemperatur ausgeführt. Zu Beginn der

Extraktion mussten die Teilproben in 1,5 ml Reaktionsgefäßen (Eppendorf, Hamburg, Best.-

Nr. 0030 125.150) nach Zugabe von 350 µl Lysispuffer RLT mit 1 % 2-Mercaptoethanol mit

einem Mikropistill (Fa. Eppendorf, Hamburg, Best.-Nr. 0030 120.973) zerkleinert werden.

Das im Puffer enthaltene Guanidin-Isothiocyanat und das zugesetzte 2-Mercaptoethanol

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besitzen starke denaturierende Eigenschaften und dienen daher unter anderem der

Inaktivierung von RNasen. Im Anschluss wurde die Suspension in eine Qiashredder-Säule

(Fa. Qiagen, Hilden, Best.-Nr. 79654) überführt und in einer Zentrifuge bei 10.000 x g 5 min

lang durch die auftretenden Scherkräfte homogenisiert, das Homogenisat zur Verbesserung

der Bindungseigenschaften der RNA an die Säulenmembran mit 350 µl 70 %igem Ethanol

versetzt, auf eine RNeasy Mini-Säule verbracht, 15 s bei 10.000 x g zentrifugiert und diese

anschließend mit 350 µl Puffer RW1 (15 s, 10.000 x g) gewaschen. Grundsätzlich bindet

DNA bei anderen Salzkonzentrationen wie RNA an die Silikagelmembran, und wird mit dem

angewandten Verfahren bei Verwendung sehr kleiner Gewebeproben, wie sie hier vorlagen,

sehr effektiv entfernt. Dennoch erfolgte als weitere Maßnahme, um eine Amplifikation

genomischer DNA bei der quantitativen PCR zu vermeiden, auf der Säule für 15 min bei

Raumtemperatur ein DNase-Verdau (RNase-Free DNase-Set, Fa. Qiagen, Hilden, Best.-Nr.

79254). In den folgenden Schritten wurde, um Salze und Proteine von der Membran zu

entfernen, mit 350 µl Puffer RW1 (15 s, 10.000 x g) und zweimal mit 500 µl Puffer RPE (15

s, 10.000 x g, bzw. 2 min 10.000 x g) gewaschen. Die Pufferlösungen wurden vom Hersteller

mitgeliefert. Das jeweils anfallende Eluat wurde verworfen. Die nun noch an das Silikagel

gebundene RNA konnte durch Auftragen von 50 µl RNase-freiem Wasser gelöst und

abzentrifugiert (1 min, 10.000 x g) werden. Da in der nachfolgenden quantitativen PCR die

gemessene Kopienzahl der mRNA-Spezies gegen ein „Housekeeping-Gen“ normalisiert

wurde, war es möglich, adäquate Mengen aller Einzelproben eines Versuchstages zu einem

Pool zusammenzufassen. Die Lagerung der so gewonnen, in DEPC-behandeltem Wasser

gelösten RNA erfolgte bei -80°C.

3.3.7.3 Reverse Transkription

Zur Synthese der komplementären DNA (cDNA) wurde das Omniscript Reverse

Transcriptase-System der Firma Qiagen (Hilden, Best.-Nr. 205113) verwendet (Tabelle 5).

Bei dieser Reaktion wurden Random Hexamer-Primer (Fa. Promega, Madison, USA, Best.Nr.

C1181) verwendet, Hexanukleotide mit statistisch verteilter Basenzusammensetzung, die

entsprechend ihrer individuellen Sequenz an verschiedensten Stellen hybridisieren und damit

eine cDNA-Synthese über die gesamte Länge der mRNA ermöglichen. Die reverse

Transkription wurde durch das multifunktionale Enzym Omniscript Reverse Transcriptase

katalysiert, das Aktivitäten sowohl als RNA-abhängige DNA-Polymerase, Hybrid-abhängige

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Exoribonuklease (RNase H) und DNA-abhängige DNA-Polymerase besitzt, von denen die

ersten beiden Wirkungen für die cDNA-Erststrangsynthese von Bedeutung sind. Während die

RNA-abhängige DNA-Polymeraseaktivität zur Transkription der RNA-Vorlage in

komplementäre DNA dient, degradiert das Enzym durch seine Funktion als Exoribonuklease

RNA in RNA-DNA Hybriden, während freie RNA nicht beeinflußt wird, und verbessert

dadurch die Sensitivität der nachfolgenden quantitativen PCR. Reagenzien und Gesamt-RNA

wurden auf Eis aufgetaut, kurz auf einem Vortexer gemischt und zentrifugiert. Bei einem

Reaktionsvolumen von 20 µl für jede RNA-Sammelprobe wurden pro Ansatz folgende

Komponenten zu einem Mastermix zusammenpipetiert und gut gemischt:

Tabelle 5: Komponenten des Reaktionsansatzes für die reverse Transkription

Buffer RT (10x) * 2 µl

dNTP Mix (5 mM pro dNTP) * 2 µl

Random Hexamer-Primer (250 µg / ml) (Fa. Promega, Madison, USA,

Best.Nr. C1181)

1 µl

RNase-Out (10 U / µl) (Fa. Invitrogen, Karlsruhe, Best.-Nr. 10777-019) 1 µl

Omniscript Reverse Transcriptase (4 U) * 1 µl

RNase-freies Wasser 6 µl

* vom Hersteller mitgeliefert

Pro Ansatz wurden 13 µl des Mastermix in ein 500 µl-Reaktionsgefäß gegeben und 7 µl in

DEPC-behandeltem Wasser gelöste Gesamt-RNA hinzugefügt. Die Reaktion erfolgte in

einem programmierbarem Thermocycler T3 (Fa. Biometra, Göttingen) bei 25°C für 10 min,

37°C für 60 min und zur Inaktivierung des Enzyms bei 93°C für 5 min. Das Produkt wurde

direkt in der qPCR eingesetzt oder bei -20°C gelagert.

3.3.7.4 Quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR)

Untersucht wurde die Genexpression der Cytokine TGFß und Interleukin-1ß sowie der

extrazellulären Matrixproteine Prokollagen a1(I) und a1(III). Als „Housekeeping-Gen“ diente

der Elongationsfaktor-1a (EF-1a), der sich durch eine extrem konstante Expressionsrate

auszeichnet (GRUBER u. LEVINE, 1997). Zu diesem Zweck wurde die bislang beim Pferd

noch nicht bekannte Sequenz von EF-1a ermittelt und GenBank (Genbank-Nr.: AY237113)

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75

zur Verfügung gestellt. Die Quantifizierung der cDNA erfolgte in einem Fluoreszenzdetektor

mit integriertem Thermocycler und 96-Loch-Mikrotiterplatte Mx4000 Multiplex QPCR

System der Firma Stratagene (LaJolla, USA). In einer PCR-Reaktion wurden neben den

Sammelproben der Lungenbiopsien eines jeden Entnahmetages stets Negativkontrollen und

die Verdünnungsreihe eines entsprechenden DNA-Mengens tandards gemessen. Der

Mengenstandard wurde aus equiner mRNA mittel RT-PCR gewonnen, wobei die Primer für

deren Amplifikation in der PCR ein Fragment begrenzten, das das Fragment der Sonden-

Primer-Paare der quantitativen PCR sowohl in 5´-, als auch in 3 -́Richtung deutlich überragte.

Bei den Negativkontrollen handelte es sich um no template controls (NTCs), bei denen die

cDNA durch DEPC-behandeltes Wasser ersetzt wurde. Die Proben zur Bestimmung der

Expression der untersuchten Gene, des „Housekeeping-Gens“ und die Negativkontrollen

wurden in zwei identischen Messdurchgängen als Triplikate gemessen, die einzelnen

Standardverdünnungen als Duplikate. Diese Mehrfachmessungen dienten der Sicherung der

Reproduzierbarkeit der Ergebnisse. Zur Etablierung der qPCR wurden verschiedene

Annealing-Temperaturen, MgCl2- und Sondenkonzentrationen an einer Standard-

verdünnungsreihe getestet, bis die für das verwendete Sonden-Primer-Paar besten

Bedingungen ermittelt waren. Die Auswahl der verwendeten Primer und Sonden erfolgte mit

Hilfe des Computerprogramms BeaconDesigner® 2.03 der Firma Premier Biosoft

International (Palo Alto, USA) (Tabelle 6). Die Primersynthese wurde von den Firmen

Invitrogen (Karlsruhe) und Applied Biosystems (Weiterstadt) durchgeführt, die Herstellung

der Oligonukleotidsonden (TaqMan-Sonden) von der Firma Applied Biosystems

(Weiterstadt). Bei allen Sonden wurde TAMRA als Quencherfarbstoff verwendet, als

Reporterfarbstoff dienten FAM bzw. VIC. Die Komponenten für einen Reaktionsansatz mit

einem Volumen von 25 µl stammten bis auf das DEPC-behandelte Wasser aus Brilliant Core

Reagent Kits der Firma Stratagene (LaJolla, USA, Best.-Nr. 600530) (Tabelle 7).

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76

Tabelle 6: Nukleotidsequenzen und Schmelzpunkte verwendeter Primer und TaqMan-Sonden

untersuchte

mRNA-Spezies

(Genbanknummer)

Schmelzpunkt

(bei 100 mM

NaCl)

Sequenz (5´→3´) Reporter-

farbstoff

Produkt-

länge

Forward Primer

59,2°C TACTAGTGCTGACG

CCTGGC

Reverse Primer

59,1°C TTCCGCTTCACCAG

CTCCAT

Transforming

Growth Factor 1β

(AF175709)

TaqMan-Sonde

68,9°C CCGCCGGACTGTCC

ACCTGCAAGA

VIC-5´-…

79 bp

Forward Primer

59,3°C GGCTGCACTTCACT

GTTGTCTA

Reverse Primer

59,5°C CTGAGGATTGGCTC

TGGGAAAC

Interleukin 1ß

(U92481)

TaqMan-Sonde

68,2ºC CTGCTCCACCCGCC

TGCTGGG

FAM-5´-…

117 bp

Forward Primer

59,2°C CACAACAGGAAGTT

GCTGAAGGA

Reverse Primer

59,1°C CATATTATGTCATC

GCAGAGAACAGATC

Prokollagen a1(III)

(AF117954)

TaqMan-Sonde

68,4ºC TGCTCCCATCTTGGT

CAGTCCTATGCGG

FAM-5´-…

130 bp

Forward Primer

59,2°C GCTGGAATTCCGTG

CCTGG

Reverse Primer

58,4°C GCCTTGGAAACCTT

GGGGAC

Prokollagen a1(I)

(AF034691)

TaqMan-Sonde

68,9ºC TCCTTCTGGTCCTCG

TGGTCTCCCTGG

FAM-5´-…

144 bp

„Housekeeping Gen“

(Genbanknummer)

Schmelzpunkt

(bei 100 mM

NaCl)

Sequenz (5´→3´) Reporter-

farbstoff

Produkt-

länge

Forward Primer

60°C CAAAAACGACCCAC

CAATGG

Reverse Primer

62°C GGCCTGGATGGTTC

AGGATA

Elongationsfaktor-

(AY237113)

TaqMan-Sonde

68,5°C AGCAGCTGGCTTCA

CTGCTCAGGTG

FAM-5´-…

98 bp

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77

Tabelle 7: Konzentrationen und Volumina der einzelnen Komponenten eines Reaktions-

ansatzes

* vom Hersteller mitgeliefert

Die einzelnen Komponenten wurden entsprechend der Anzahl an Reaktionen auf Eis

zusammenpipettiert und durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren gemischt. Nach dem

Aliquotieren erfolgte die Zugabe von 1 µl gelöster cDNA, bzw. bei den Negativkontrollen

von 1 µl DEPC-behandeltem Wasser. Das Zeit-Temperatur-Profil der nachfolgenden

Zweistufen-PCR mit 40 Zyklen wurde entsprechend der zuvor durchgeführten

Etablierungsarbeiten der jeweiligen Sonde gewählt (Tabelle 8).

Komponenten Spezifität eingesetztes Volumen Endkonzentration

Core Reagent Buffer (10x)* 2,5 µl

dNTP (je 5mM)* 1 µl 200 µM

TGFß 2,78 µl 5 mM

IL-1ß 4,17 µl 7,5 mM

Proa1(III) 2,78 µl 5 mM

Pro1(I) 2,78 µl 5 mM

MgCl2 (50 mM)*

EF-1a 2,78 µl 5 mM

ForwardPrimer (7 pmol / µl) 1,25 µl 300 nM

Reverse Primer (7 pmol / µl) 1,25 µl 300 nM

TGFß 0,1 µl 200 nM

IL-1ß 0,05 µl 100 nM

Proa1(III) 0,1 µl 200 nM

Pro1(I) 0,1 µl 200 nM

TaqMan-Sonde

EF-1a 0,1 µl 200 nM

Referenzfarbstoff (ROX)* 0,38 µl 76 nM

Surestart TaqPolymerase

(5 U / µl)*

0,13 µl 0,0025 U / µl

DEPC-behandeltes Wasser ad 25 µl

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Tabelle 8: Zeit-Temperatur-Profile der Zweistufen-PCR

TaqMan-Sonde Initiale Denaturierung Denaturierung Annealing und

Extension

Transforming Growth

Factorβ

95°C / 10 min 95°C / 15 s 64°C / 1 min

Interleukin-1ß 95°C / 10 min 95°C / 15 s 61°C / 1 min

Prokollagen a1(III) 95°C / 10 min 95°C / 15 s 61°C / 1 min

Prokollagen a1(I) 95°C / 10 min 95°C / 15 s 61°C / 1 min

Elongationsfaktor-1α 95°C / 10 min 95°C / 15 s 64°C / 1 min

Aus dem Quotienten der Fluoreszenzsignale von Reporter- (FAM oder VIC) und passivem

Referenzfarbstoff (ROX) wurde automatisch ein normalisiertes Reportersignal (Rn-Wert)

berechnet. Die Rn(+)-Werte stellten das relative Reportersignal der zu messenden Proben und

die Rn(-)-Werte das der Leerkontrollen dar. Aus der Differenz des Rn(-)-Wertes

(Hintergrundfluoreszenz) und des Rn(+)-Wertes der ersten Zyklen ergab sich der ∆Rn-Wert

(dRn), der logarithmisch in einem Koordinatensystem an der Abszisse aufgetragen wurde, und

mit dessen Hilfe eine Amplifikationskurve erstellt wurde. Diese Amplifikationskurve

entspricht der graphischen Darstellung des zeitlichen Verlaufs der Zunahme an Produkt im

jeweiligen Reaktionsgefäß. Aus den Fluoreszenzdaten in einem schwankungsarmen Bereich

von mindestens 5 der ersten 12 Zyklen konnte eine Basislinie abgeleitet werden, die zur

Ermittlung eines Messgrenzwertes (sog. threshold) diente. Der threshold sollte dabei in einem

Bereich ≤ 0,015 dRn liegen. Der Thresholdcycle (CT), der die Grundlage für die Berechnung

der Ausgangskopienzahl bildete, stellte den Schnittpunkt des thresholds mit der

Amplifikationskurve dar. Zur Quantifizierung der zu messenden Proben wurde anhand der

mitgeführten definierten Verdünnungsreihe (DNA-Kopienstandard) automatisch eine

Standardkurve der logarithmierten CT-Werte erstellt. Durch Interpolation der CT-Werte der

Proben aus dem Tierversuch konnte so die der in der jeweiligen Probe vorhandene

ursprüngliche Kopienzahl ermittelt werden.

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3.3.8 Klinischer Score

Als Grundlage für den Vergleich des Verlaufs der morphologisch und morphometrisch

erfassten Lungenveränderungen sowie der Genexpressionsdaten mit der klinischen

Symptomatik, wurde der von Frau Dr. Venner anhand der semiquantitativen Erfassung

klinischer Befunde erhobene Score herangezogen (Venner et al., 2003). Dieser klinische

Score wurde dabei nach dem ursprünglich zur Bewertung der Chronisch Obstruktiven

Bronchitis des Pferdes erstellten System von Ohnesorge et al. (1998) ermittelt, nach dem eine

Bewertung einzelner klinischer Parameter und Symptome mit Punkten erfolgt (Tabellen 9 +

10). Durch die Ermittlung der Gesamtpunktzahl wird eine vergleichende Beurteilung des

Krankheitsverlaufs verschiedener Pferde mit ähnlichen Lungenerkrankungen ermöglicht.

Tabelle 9: Übersicht über die Punkteverteilung bei der Untersuchung des Respirationstraktes

(Ohnesorge et al., 1998)

Merkmal Veränderung Punktzahl

Husten

(spontan / auslösbar)

Nein

Ja

0

1

Ruhedyspnoe

Nein

Verstärkte abdominale Atmung

Afteratmen / Dampfrinne

0

1

3

Auskultationsbefund Vesikulär / Vesikulär verstärkt

Rasseln / Giemen / Knistern

0

2

Perkussionsbefund

= 3 Finger erweitertes Lungenfeld

handbreit erweitertes Lungenfeld

> 2 handbreit erweitertes Lungenfeld

0

1

2

Tracheobronchoskopie

Septum scharfrandig

Septum deutlich verdickt

Sekretmenge / Viskosität =1

Sekretmenge / Viskosität = 1 - 2

Sekretmenge / Viskosität = 4

0

1

0

1

2

Zytologie des

Tracheobronchialsekrets

Makrophagen, neutrophile oder eosinophile

Granulozyten

= ++

= +++

0

1

Blutgasanalyse

(Alveolo-arterielle

Sauerstoffdifferenz (A-aDO2))

< 7 mm Hg

7 – 14 mm Hg

> 14 mm Hg

0

1

2

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80

Tabelle 10: Scorepunktzahl in Abhängigkeit vom Grad der Erkrankung

3.4 Statistische Aus wertung

Die Angabe der Ergebnisse der morphometrischen Auswertung erfolgte in Form des

arithmetischen Mittels ( x ) der Werte der Biopsieproben eines Entnahmetages. Die

Ergebnisse der quantitativen Polymerase-Kettenreaktion wurden als arithmetisches Mittel ( x )

der Kopienzahlen der gemessenen mRNA-Spezies pro Kopienzahl des Housekeeping-Gens

EF-1a aus sechs einzelnen Experimenten (je ein Triplikat in zwei identischen

Messdurchgängen) dargestellt. Dazu wurde die jeweilige einfache Standardabweichung

(s = ((n? x2-(? x)2 / n(n-1))½) bestimmt. Zwischen den einzelnen Messdurchgängen der

quantitativen PCR wurde der Variationskoeffizient berechnet (V = s / x (Ct)), der nach den

Empfehlungen von BUSTIN (2000) unter 5 % liegen sollte.

Score Grad der Erkrankung

0 - 1 gesund

2 - 3 geringgradig

4 - 5 mittelgradig

7 - 14 hochgradig

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4 Ergebnisse

4.1 Licht- und elektronenmikroskopische Untersuchungen

4.1.1 Befunde vor der Applikation von Perillaketon

Die Kontrollbiopsien der Lungen der acht untersuchten Pferde stellten sich licht- und elektro-

nenmikroskopisch gleichermaßen als ausgereiftes Lungengewebe und ohne erkennbare pa-

thologische Veränderungen dar (Abb. 2 + 14). Die Alveolarsepten waren luminal von dünnen

Alveolarepithe lzellen vom Typ I bedeckt, die einen geschlossenen Zellverband bildeten. In

den alveolären Nischen und sehr vereinzelt auch mittig an den Septen konnten Alveolarepi-

thelzellen vom Typ II angetroffen werden, zum Teil mit bereits lichtmikroskopisch gut er-

kennbaren, intrazytoplasmatischen Granula. Ganz vereinzelt fanden sich in den Lumina auch

Alveolarmakrophagen. Nicht nur im Bereich der größeren interlobulären Septen, sondern

auch auf Ebene der Alveolarwände waren kollagene Bindegewebsstrukturen zu erkennen, die

dem normalen Stützgerüst der Lunge zuzuordnen waren. Sie stellten sich dort als schmale,

meist nur auf einer Seite der Wand gelegene Stränge oder Platten dar mit einer teilweise sehr

typischen, lockenartig gewundenen Binnenstruktur. Soweit in den Schnitten Bronchioli vorla-

gen, wiesen diese einen Besatz aus ziliiertem Bronchialepithel und auch von Clarazellen auf.

Die überwiegenden Proben waren entnahmebedingt in unterschiedlichem Ausmaß kompri-

miert. Zudem fanden sich intraluminal in unterschiedlicher Anzahl freie Erythrozyten (Abb.

2) und ein abschnittsweise graduell variierendes, zumeist jedoch sehr gering ausgeprägtes

alveoläres Ödem als Folge des Entnahmetraumas. In einigen wenigen Lokalisationen konnten

vor allem in den Randbereichen der Bioptate Lipidtröpfchen und versprengtes quergestreiftes

Muskelgewebe nachgewiesen werden, die eine Kontamination der Probe mit Material aus

Unterhautfettgewebe und Interkostalmuskulatur als Folge der transkutanen Entnahmetechnik

zu interpretieren waren. Elektronenmikroskopisch stellte sich die Blut-Luft-Schranke als

schmale Barriere mit einer Dicke von etwa 0,15 – 0,5 µm dar, bestehend aus Alveolarepithe l-

zellen vom Typ I, den beiden zum Teil verschmolzenen epi- und endothelialen Basalmembra-

nen sowie dem Kapillarendothel (Abb. 15). In der Regel war sie nur an einer Seite des Al-

veolarseptums abschnittsweise durch eine dünne Platte aus reifen Kollagenfibrillen zwischen

Epi- und Endothel verstärkt (Abb. 16). Die kubischen, rundkernigen Alveolarepithelzellen

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82

vom Typ II waren charakterisiert durch eine mäßige Zahl relativ großer Lamellarkörperchen,

die einen Großteil des Zytoplasmas einnahmen, und einen apikalen, lückenlosen Besatz mit

Mikrovilli. Alveolarepithelzellen vom Typ I hingegen zeigten neben einem abgeflachten Kern

ein sehr schmales und sehr organellenarmes Zytoplasma. Das Kapillarendothel besaß eben-

falls einen abgeflachten Kern und ein dünn ausgezogenes Zytoplasma. Benachbarte Zellen

bildeten einen lückenlosen Verbund. Auffälligstes Merkmal waren die zahlreichen, ubiquitär

vertretenen und überwiegend membrannah gelegenen Pinozytosevesikel. In einigen Bereichen

konnten eine Schwellung von Endothelzellen und eine ziehharmonikaartige Faltung der Sep-

ten beobachtet werden, die höchstwahrscheinlich auf das Entnahmetrauma zurückzuführen

waren.

4.1.2. Biopsieproben nach der Applikation von Perillaketon

Pferd 1 und Pferd 2 aus dem Vorversuch zeigten nach einer einmaligen, intravenösen Appli-

kation von 5 mg Perillaketon / kg KG nur gering ausgeprägte histomorphologische Verände-

rungen. Daher wurde die verabreichte Menge im Hauptversuch auf 6 mg / kg KG erhöht, wo-

durch eine stärkere Reaktion ausgelöst werden konnte. Somit lagen bei der Auswertung der

Proben eine niedrige und eine höhere Dosisgruppe vor. Bei den Versuchstieren 3, 4, 5, 6, 7

und 8 des Hauptversuchs waren durchweg gleichartige und sehr ausgeprägte Veränderungen

mit nahezu identischer Chronologie zu beobachten, die sich in drei verschiedene Phasen ein-

teilen ließen. Grundsätzlich konnten am selben Entnahmetag an den verschiedenen Biopsielo-

kalisationen der einzelnen Pferde gleiche Befunde erhoben werden. Die Zahl der untersuchten

Biopsien pro Tag und Pferd war damit ausreichend und eine gemeinsame Untersuchung der

Proben eines Entnahmetages mit den molekularbiologischen Methoden gerechtfertigt.

Phase 1 (Tag 1 - 4 post applicationem):

Die Tiere der niedrigeren Dosisgruppe wiesen während dieses Zeitraums im Vergleich zu den

Kontrollproben keine Veränderungen auf.

Am ersten Tag unmittelbar nach der Applikation von Perillaketon ließen sich bei den Pferden

der höheren Dosisgruppe nur geringfügige lichtmikroskopisch erkennbare Veränderungen

gegenüber den Kontrollproben nachweisen. Neben einer leichten Zunahme an Makrophagen

und bei den Pferden 3 und 5 auch an neutrophilen Granulozyten sowie proliferierenden AII-

Zellen fand sich in wenigen Lokalisationen geringgradig fibrinreiches Exsudat (Abb. 19 +

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83

20). Elektronenmikroskopisch zeigten AI-Zellen bei allen Tieren - besonders ausgeprägt je-

doch bei Pferd 3 und Pferd 5 - über weite Strecken eine zum Teil erhebliche Vakuolisierung

des Zytoplasmas (Abb. 18). Vereinzelte Kerne befanden sich im Frühstadium der Pyknose mit

Wandhyperchromasie, tiefen Invaginationen der Kernmembran und zeigten mitunter einem

prominenten Nukleolus. Zahlreiche Endothelzellen wiesen eine deutliche Schwellung auf

(Abb. 17). Gleichzeitig fanden sich aber auch in geschwollenen Endothelzellen und auch von

solchen mit unveränderter Dicke zahlreiche sehr gut umschriebene Abschnitte, die von außer-

ordentlich abgeflachten Endothel-zellausläufern bedeckt waren. Erst bei starker Vergrößerung

(50.000x) konnte eindeutig nachgewiesen werden, dass die endotheliale Basalmembran in

diesen Bereichen nicht entblößt war (Abb. 20 + 21). Zu allen Zeitpunkten des Versuchs waren

in den untersuchten Bereichen die Verbindungen zwischen benachbarten Endothelzellen in-

takt. Die lichtmikroskopisch festgestellten vermehrten Makrophagen und neutrophilen Gra-

nulozyten waren vor allem intrakapillär und interstitiell lokalisiert. Weiterhin konnten im In-

terstitium multifokal durch Ödemflüssigkeit auseinander gedrängte Kollagenfaserbündel be-

obachtet werden (Abb. 24) und es fanden sich vereinzelt Mastzellen (Abb. 23). Lichtmikro-

skopisch ließ sich vom 3. – 4. Tag bei den Tieren der höheren Dosisgruppe im Vergleich zu

den Kontrollproben ein abschnittsweise variierendes, geringgradig stärker ausgeprägtes al-

veoläres Ödem feststellen. Es fanden sich auch geringgradig vermehrt alveoläre-, interstitielle

und intrakapilläre Makrophagen und in mehreren Lokalisationen in den Alveolarlumina ge-

ringgradig fibrinreiches Exsudat. Als Reaktion auf den Verlust von AI-Zellen war multifokal

eine gering- bis mittelgradige Proliferation von Alveolarepithelzellen vom Typ II zu beob-

achten. Die alveolären Septen wiesen abschnittsweise eine geringfügige Ödematisierung auf

und die Kapillaren waren mäßig gestaut, wodurch es in einigen Bereichen zu einer geringen

Verbreiterung der Alveolarwände kam. Im Interstitium waren geringgradig vermehrt

Mastzellen zu beobachten. Elektronenmikroskopisch lagen weiterhin über große Strecken AI-

Zellen mit ausgeprägter Vakuolisierung des Zytoplasmas vor und darüber hinaus zahlreiche

Lokalisationen mit entblößter Basalmembran nach Desquamation von AI-Zellen (Abb. 22).

Als Folge dieser Defekte zeigte sich multifokal eine Proliferation von AII-Zellen. Diese wie-

sen teilweise ein sehr prominentes und mitunter dilatiertes, glattes endoplasmatisches Reti-

kulum auf, und es fanden sich im Rahmen ihrer Differenzierung in AI-Zellen verschiedene

Übergangsformen mit einer Abnahme bis hin zum völligen Verschwinden von Lamellarkör-

perchen und einer unterschiedlich starken Abflachung des Zytoplasmas. Der Mikrovillibesatz

der Zellmembran war auch bei sehr weit differenzierten Zellen noch vorhanden. Mitunter fan-

den sich von ihrer Form her noch kubische AII-Zellen, die jedoch mit langen, sehr schmalen

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84

und mit Mikrovilli besetzten Ausläufern die angrenzende Basalmembran bedeckten. In eini-

gen Bereichen zeigten ihre Zellkerne einen sehr prominenten Nukleolus, der zusammen mit

dem ausgeprägten glatten ER auf eine verstärkte Stoffwechselleistung hinwies. An mehreren

Lokalisationen konnten teilweise an der Basalmembran gelegene und teilweise frei im Al-

veolarlumen befindliche große, kubische und organellenarme Zellen beobachtet werden, mit

geringen Mengen an überwiegend rauem ER, einzelnen Mitochondrien und einem gering aus-

geprägten Golgiapparat. Sie enthielten auch wenige, sehr kleine Lamellarkörperchen, wiesen

zum Teil einen geringen, lückenhaften Mikrovillibesatz auf und konnten somit als AII-Zellen

interpretiert werden (Abb. 25), sofern sie keinen Kontakt mehr zur Basalmembran besaßen,

im Zustand nach Desquamation. In den Alveolarlumina lagen auch Makrophagen und Zellde-

tritus vor. Vereinzelt fanden sich in intrakapillär gelegenen Makrophagen phagozytierte La-

mellarkörperchen, was die Vermutung nahe legte, dass es sich dabei um ursprüngliche Al-

veolarmakrophagen handelte, die nach der Ingestion untergegangener AII-Zellen oder von

intakt ausgeschleusten Lamellarkörperchen wieder über das Interstitium in die Kapillaren

ausgewandert waren. Im Interstitium konnten neben Makrophagen und neutrophilen Granulo-

zyten auch Mastzellen festgestellt werden sowie durch Ödemflüssigkeit auseinander ge-

drängte Kollagenfaserbündel. Das Endothel wies ebenso wie am ersten Tag sowohl Schwel-

lungen als auch Bereiche auf, die nur durch sehr schmale Zytopla smaausläufer bedeckt wur-

den. Darüber hinaus ließen sich einzelne Endothelzellen mit hoher Elektronendichte als Aus-

druck degenerativer Veränderungen beobachten. Nach den licht- und elektronenmikroskopi-

schen Befunden entsprach dieses erste Versuchstadium mit Nachweis eines akuten Alveolar-

schadens der exsudativen Phase der interstitiellen Pneumonie. Zwar waren keine hyalinen

Membranen wie in ausgeprägten klassischen Fällen von interstitiellen Pneumonien feststell-

bar, jedoch fanden sich multifokal geringgradige Exsudatmengen. Es konnte kein exakter

Zeitpunkt des Wechsels der exsudativen zur proliferativen Phase festgelegt werden, da sich

hier sowohl Exsudat als auch Schäden der Alveolarwand gleichzeitig zusammen mit einer

Proliferation von AII-Zellen beobachten ließen, die den Beginn der zweiten Phase der

interstitiellen Pneumonie darstellt. Es kann also ein fließender Übergang zwischen exsudati-

ver und proliferativer Phase angenommen werden.

Phase 2 (Tag 4 - 11 post applicationem):

Bei den Versuchstieren der niedrigeren Dosisgruppe (5 mg / kg KG) konnten in diesem Zeit-

raum lichtmikroskopisch und durch immunhistochemische Markierung von Ki-67 bzw. MAC

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85

387 lediglich eine geringgradig verstärkte AII-Zellproliferation und bei Pferd 2 eine gering-

gradige Zunahme an Makrophagen festgestellt werden.

In dieser Phase ließen sich an den Tieren der höheren Dosisgruppe die stärksten Veränderun-

gen beobachten, die am 8. bis 11. Tag post applicationem ihr Maximum erreichten und bei

den Pferden 3 und 5 im Vergleich zu den Pferden 4, 6, 7, und 8 noch ausgeprägter waren.

Aufgrund der hochgradigen klinischen Erscheinungen mussten Pferd 5 am 9. und Pferd 3 am

11. Versuchstag euthanasiert werden. Es zeigte sich ein im Vergleich zu den Kontrollproben

mittelgradiges alveoläres Ödem und eine mittelgradige Zunahme von Makrophagen (Abb.

13), die - wie in der immunhistochemischen Darstellung mit MAC 387 erkennbar - sowohl in

den alveolären Septen lokalisiert waren und ebenso als Alveolarmakrophagen auftraten. Die

Anzahl an großen, rundkernigen und organellenarmen Zellen mit wenigen, kleinen Lamellar-

körperchen, die elektronenmikroskopisch als AII-Zellen zum Teil nach Desquamation inter-

pretiert wurden, stieg drastisch an. In einzelnen Lokalisationen füllten sie zusammen mit

Alveolarmakrophagen die alveolären Lumina vollständig aus, wobei dieser Eindruck jedoch

durch die entnahmebedingte Kompression des Gewebes verstärkt wurde. Als Reaktion auf

den Epitheldefekt zeigte sich eine disseminierte, abschnittsweise variierende mittel- bis hoch-

gradige Proliferation von AII-Zellen, die zusammen mit der Einlagerung von Ödemflüssigkeit

zu einer erheblichen Verbreiterung der Blut-Luft-Schranke führte (Abb. 3). In diesem Stadi-

um lag vor allem bei den euthanasierten Pferden 3 und 5 unmittelbar ante mortem ubiquitär

eine nahezu vollständige Auskleidung der Alveolen mit AII-Zellen vor, die dem Lungenge-

webe ein adenoides Erscheinungsbild verliehen. Am Höhepunkt der Veränderungen fanden

sich bei den Tieren der höheren Dosisgruppe, am stärksten ausgeprägt bei Pferd 3 und Pferd

5, multifokal-herdförmige intraalveoläre Ansammlungen von neutrophilen Granulozyten

(Abb. 4) und eine deutliche Leukozytostase. Ausschließlich in dieser Phase konnte neben gra-

nulohistiozytären Infiltraten lichtmikroskopisch auch eine geringgradige Zunahme von Lym-

phozyten beobachtet werden. Bei der immunhistochemischen Markierung von Ki-67 ließen

sich nicht nur an der luminalen Seite der Septen proliferierende Zellen feststellen, die mitun-

ter die gesamte Alveole auskleideten, sondern auch plumpkernige, im Interstitium gelegene

Zellen. Vereinzelt lagen auch im Alveolarlumen Ki-67-positive Zellen vor (Abb. 9). Elektro-

nenmikroskopisch fanden sich bei den Tieren der höheren Dosisgruppe in diesem Versuchs-

stadium die größte Anzahl an AII-Zellen und Übergangsformen. Bei den angetroffenen AI-

Zellen war die Vakuolisierung im Vergleich zu Phase 1 erkennbar geringer ausgeprägt. Es

zeigten sich eine Ödematisierung und eine Infiltration des Interstitiums mit Makrophagen und

neutrophilen Granulozyten, die auch in den Alveolarlumina anzutreffen waren. Ebenso ließen

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86

sich interstitielle Mastzellen beobachten. Die Schwellung des Endothels war, wenn auch ge-

ringer ausgeprägt, noch vorhanden und es konnten einzelne, sehr elektronendichte

Endothelzellen festgestellt werden. Hochgradig abgeflachte Endothelzellausläufer fanden sich

in den untersuchten Bereichen jedoch nicht mehr. Mitunter waren im Interstitium Fibroblasten

mit hochgradig dilatiertem endoplasmatischem Retikulum anzutreffen. Nach den licht- und

elektronenmikroskopischen Befunden entsprach dieses zweite Versuchsstadium mit dem

Nachweis einer ausgeprägten Proliferation nicht nur epithelialer sondern auch interstitieller

Zellen und einer deutlichen Infiltration mit Entzündungszellen der proliferativen Phase der

interstitiellen Pneumonie.

Phase 3 (Tag 11 – 18 post applicationem)

In der letzten Phase zeigte sich eine Regression der Veränderungen. Bei der lichtmikroskopi-

schen Betrachtung erfolgte ein Rückgang der entzündlichen zellulären Infiltrate, des alveolä-

ren und interstitiellen Ödems sowie auch der Proliferation von AII-Zellen. Damit in Überein-

stimmung standen die Ergebnisse der immunhistochemischen Markierung granulohis tiozytä-

rer Zellen und proliferierender Zellen. Während jedoch eine Abnahme MAC 387-positiver

Zellen auf das Ausgangsniveau zu erkennen war, blieb die Anzahl Ki-67 positiver Zellen

noch bis zum Ende des Beobachtungszeitraums erhöht. In der Spezialfärbung für kollagene

und retikuläre Fasern nach Heidenhain konnte im Vergleich mit der Ausgangssituation kein

vermehrtes Bindegewebe beobachtet werden. Bei den Pferden 1, 2 und 4 waren ab dem 15.

Tag und bei den Pferden 6, 7 und 8 ab dem 18. Tag post applicationem gegenüber den Kon-

trollen keine abweichenden Befunde mehr zu erheben. Dieses letzte Versuchsstadium ent-

sprach aufgrund der morphologischen Befunde mit Ausnahme der euthanasierten Tiere 3 und

5 der Phase der Ausheilung der interstitiellen Pneumonie. Bei den Pferden 1, 2, 4, 6, 7 und 8

wurden weiterhin bis insgesamt acht Wochen nach Versuchsbeginn Biopsieproben entnom-

men und pathohistologisch untersucht. Es konnten keine Hinweise auf fibrotische Verände-

rungen angetroffen werden. Nach Ende dieser acht Wochen wurden die Tiere mit Ausnahme

der Pferde 3 und 5 euthanasiert und die Lungen explantiert. Während je eine Lunge eines

Versuchstieres an der Klinik für Pferde für computertomographische Untersuchungen ve r-

wendet wurde, erfolgte eine umfassende pathohistologische Untersuchung an der verbliebe-

nen Lunge. Hier konnten in acht definierten Lokalisationen (Kraniallappen, craniale, caudale,

mediale, laterale, dorsale, ventrale und zentrale Abschnitte des Hauptlappens) an mit HE-

gefärbten Paraffinschnitten keine Hinweise auf fibrotische Veränderungen gefunden werden.

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87

Abb. 2 (Pferd 3, Kontrolle): Normal strukturierte Lunge: Alveolarlumen (AL), alveoläre Septen ( ), entnahmebedingte, extravasale Erythrozyten ( * ) und Kompression von Alveolen ( + )(HE, 350x)

AL

AL *

*

Abb. 3 (Pferd 3, Tag 8, proliferative Phase): Massive Verbreiterung der alveolären Septen durch hochgradige, disseminierte Proliferation von Alveo-larepithelzellen vom Typ II ( ) und ein interstitielles Ödem ( + ); gemischtzellige, alveoläre und interstitielle Infiltrate ( * ) (HE, 350x)

*

*

+

+

* +

* *

+

+

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88

Abb. 4 (Pferd 5, Tag 8, proliferative Phase): Herdförmige, intraalveoläre Infiltration mit polymorphkernigen, neutrophilen Granulozyten und Alveo-larmakrophagen ( ), alveoläres Ödem ( * ) (Semidünnschnitt, Toludin-blau, 350x)

*

Abb. 5 (Pferd 8, Kontrolle): In der Heidenhainschen Azanfärbung blau dargestellte kollagene und retikuläre Fasern vor Versuchsbeginn als Teil des normalen Stützgerüstes der Lunge ( ) (Azan, 350x)

*

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89

Abb. 6 (Pferd 8, Tag 29): In der Heidenhainschen Azanfärbung blau darge-stellte kollagene und retikuläre Fasern 11 Tage nach Ende der Ausheilungs-phase als Teil des normalen Stützgerüstes der Lunge ( ) (Azan, 350x)

Abb. 7 (Pferd 8, Kontrolle): Expression von Ki-67: Proliferierende Zellen im unveränderten Lungengewebe vor der Applikation von Perillaketon (MIB-1, Gegenfärbung mit Hämalaun, 175x)

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90

Abb. 8 (Pferd 8, Tag 8, proliferative Phase): Expression von Ki-67: Hochgradige Zunahme proliferierender Zellen in der proliferativen Phase ( ) (MIB-1, Gegenfärbung mit Hämalaun, 175x)

Abb. 9 (Pferd 8, Tag 8, proliferative Phase): Expression von Ki-67: Ki-67-positive Zellen säumen nicht nur die Alveolen, sondern finden sich auch im Interstitium ( * ) und frei im Alveolarlumen ( ); massive Verbreiterung der alveolären Septen ( ) (MIB-1, Gegenfärbung mit Hämalaun, 570x)

*

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91

Abb. 10 (Pferd 5, Kontrolle): Vereinzelte Zelluntergänge im Rahmen der physiologischen Zellmauser der Lunge ( ) (TUNEL, Gegenfärbung mit Hämalaun, 350x)

Abb. 11 (Pferd 5, Tag 4, exsudative Phase): Vermehrte Zelluntergänge bei Pferd 5 unmittelbar ante mortem ( ); die Kompression der Alveolarlumi-na ist entnahmebedingt (TUNEL, Gegenfärbung mit Hämalaun, 350x)

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92

Abb. 12 (Pferd 7, Kontrolle): Expression des Myeloid / Histiozyten-Antigens: Überwiegend im Bereich der Septen lokalisierte DAB-positive Zellen mit der Morphologie von Makrophagen ( ) (MAC 387, Gegenfärbung mit Hämalaun, 175x)

Abb. 13 (Pferd 7, Tag 8, proliferative Phase): Expression des Myeloid / Histiozyten-Antigens: Zunahme von intraalveolären ( ) und interstitiellen ( ), granulohistiozytären Infiltraten (MAC 387, Gegenfärbung mit Hämalaun, A: 175x, B: 350x)

A B

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93

Abb. 14 (Pferd 1, Kontrolle): Übersicht über die normale Ultrastruktur der Lunge: Alveolarlumen (AL), Alveolarepithelzellen vom Typ I ( ), Kapillar-endothel ( ), Kapillarlumen (KL), Erythrozyten (E) (TEM, 1.600x)

AL

KL

E

E

Abb. 15 (Pferd 1, Kontrolle): Normalstruktur der Blut-Luft-Schranke: intra-alveoläre Ödemflüssigkeit ( * )Alveolarlumen (AL), Alveolarepithelzelle vom Typ I (AI), Basalmembran (BM), Endothelzelle (EZ), Endothelzell-verbindung ( ), Kapillarlumen (KL), Erythrozyt (E) (TEM, 20.000x)

AL

AI

BM

EZ

E

KL

KL

AL

*

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94

Abb. 16 (Pferd 1, Kontrolle): Normales Stützgerüst der Lunge im Bereich der alveolären Septen: Alveolarepithelzelle vom Typ I (AI); kollagene Fasern (KF), Endothelzelle (EZ), Erythrozyt (E) (TEM, 20.000x)

Abb. 17 (Pferd 2, Tag 1, exsudative Phase): Ausgeprägte Schwellung des Kapillarendothels: Alveolarepithelzelle vom Typ I ( ), Endothelzelle (EZ), geschlossene Endothelzellverbindungen ( ), Kapillarlumen (KL) (TEM, 5.000x)

EZ

E EZ

KF

AI

KL

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95

Abb. 18 (Pferd 7, Tag 1, exsudative Phase): degenerierende Alveolar-epithelzelle vom Typ I (AI) mit hochgradig vakuolisiertem Zytoplasma ( ); Alveolarlumen (AL); kollagene Fasern (KF); Mastzelle (MZ) (TEM, 6.300x)

AI

AL

KF

Abb. 19 (Pferd 5, Tag 1, exsudative Phase): frei im Alveolarlumen gelegenes Fibrin ( ); Alveolarepithelzelle Typ I (AI); Endothelzelle (EZ) (TEM, 6.300x)

AI

EZ

MZ

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96

Abb. 20 (Pferd 5, Tag 1, exsudative Phase): Abschnitte im Endothelzell-verband, die nur durch außerordentlich dünne Zytoplasmaausläufer über-brückt werden ( ); ödematisierte Endothelzelle (EZ); intraalveoläre Ödem-flüssigkeit mit Fibrin ( * ); Alveolarepithelzelle Typ I (AI) (TEM, 8.000x)

*

AI EZ

Abb. 21 (Pferd 5, Tag 1, exsudative Phase): Ausschnittsvergrößerung von Abb. 20: stark abgeflachter Endothelzellausläufer ( ); Kapillarlumen (KL); Basalmembran (BM); Alveolarepithelzelle vom Typ I (AI) (TEM, 50.000)

KL

BM

AI

*

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97

Abb. 22 (Pferd 5, Tag 4, exsudative Phase): entblößte Basalmembran nach Desquamation von Alveolarepithelzellen Typ I ( ); Alveolarlumen (AL); Erythrozyt (E), Endothelzelle (EZ); Kapillarlumen (KL) (TEM, A: 6.300x, B: 25.000x)

A

AL AL EZ

EZ

KL

KL

B

E

Abb. 23 (Pferd 7, Tag 4, exsudative Phase): Entzündliche, zelluläre, interstitielle Infiltrate: Mastzelle (MZ), polymorphkerniger neutrophiler Granulozyt (PMN); durch Ödemflüssigkeit auseinander gedrängte kollagene Fasern (KF) (TEM, 6.300x)

MZ

PMN

KF

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98

Abb. 24 (Pferd 4, Tag 4, exsudative Phase): proliferierende Alveolarepithel-zellen vom Typ II ( ) mit intrazytoplasmatischen Lamellarkörperchen (LK); durch interstitielle Ödemflüssigkeit auseinander gedrängte kollagene Fasern (KF); Alveolarlumen (AL); Fibroblast mit dilatiertem, endoplasmatischem Retikulum ( * ) (TEM, 6.300x)

KF LK AL

LK

Abb. 25 (Pferd 3, Tag 8): Proliferation von Alveolarepithelzellen vom Typ II (AII): im Rahmen der Differenzierung zu Alveolarepithelzellen vom Typ I lassen sich nur noch sehr kleine zytoplasmatische Lamellarkörperchen nachweisen ( ); Nukleolus (N) (TEM, 2.500x)

AII

AII

N

*

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99

4.2 Ergebnisse der morphometrischen Untersuchungen

Für die exakte Erfassung der in den licht- und elektronenmikroskopischen Untersuchungen

erhobenen Befunde und um eine Grundlage für den Vergleich des Verlaufs der

Lungenveränderungen mit den durch qPCR ermittelten Genexpressionsdaten zu schaffen,

erfolgte eine morphometrische Quantifizierung von verschiedenen Parametern für

regenerative, degenerative, entzündliche und reparative Prozesse. Hierfür wurden die

Zellproliferationsrate durch immunhistochemische Markierung von Ki-67, die

Zelluntergangsrate im TUNEL-Assay und der Umfang infiltrierender Granulozyten und

Makrophagen als Maß für die ablaufende entzündliche Reaktion durch immunhistochemische

Markierung des Myeloid / Histiozyten-Antigens bestimmt. Die Infiltration mit Lymphozyten

wurde rein lichtmikroskopisch beurteilt. Zudem diente die phasenanalytische Bestimmung des

Gehalts an kollagenen und retikulären Fasern anhand der Heidenhainschen Azanfärbung auf

Ebene der alveolären Septen der Beurteilung möglicher fibrotischer oder auch erosiver

Prozesse.

4.2.1 Zellproliferationsrate

Um das Ausmaß ablaufender regenerativer und reparativer Vorgänge beurteilen zu können,

wurden proliferierende Zellen durch die immunhistochemische Markierung von Ki-67

dargestellt. Durch die Bestimmung ihres Anteils an der Gesamtzellzahl zu den jeweiligen

Zeitpunkten der Biopsieprobenentnahme konnte die Proliferationsrate ermittelt werden. Im

Vergleich der Immunhistochemie mit den licht- und elektronenmikroskopischen

Untersuchungen hatte sich gezeigt, dass es sich bei den Ki-67-positiven Zellen weitaus

überwiegend um Alveolar-epithelzellen vom Typ II handelte, jedoch fanden sich auch im

Interstitium gelegene, plumpkernige, proliferierende Zellen mit fibroblastenähnlicher

Morphologie.

Bei den Tieren der niedrigeren Dosisgruppe (Pferde 1 + 2) zeigte sich im Durchschnitt ab

Tag 1 ein Anstieg des Anteils Ki-67-positiver Zellen an der Gesamtzellzahl von 1,1 % (± 0,4)

in den Kontrollen um den Faktor 3,8 bis auf 4,2 % (± 0,9) am 7. Versuchstag. Zwar fanden

sich bei den licht- und elektronenmikroskopischen Untersuchungen keine Hinweise auf das

Vorliegen von Alveolarschäden, dennoch spricht die Zunahme für den Ablauf regenerativer

Prozesse. Nach Erreichen des Maximalwertes erfolgte eine Regression bis zu Tag 14 und im

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100

Weiteren sogar eine Überkompensation mit einem Absinken der Zellproliferationsrate auf

unter 50 % des Ausgangswertes (Abb. 26, Anhänge Tabelle 11).

Bei den Tieren der höheren Dosisgruppe (Pferde 3, 4, 5, 6, 7 und 8) zeigte sich in der

exsudativen Phase bereits unmittelbar nach der Applikation von Perillaketon eine

durchschnittliche Zunahme des Anteils Ki-67-positiver Zellen an der Gesamtzellzahl von 4,5

% (± 3,9) auf 10,9 % (± 8,4) an Tag 1 und 8,7 % (± 4,3) an Tag 4. Danach konnte ein

sprunghafter Anstieg beobachtet werden, der am 8. Tag mit 25,6 % (± 7,5) seinen Höchstwert

erreichte und als wesentliches Kennzeichen des Übergangs von der exsudativen zur

proliferativen Phase aufgefasst wurde. Im anschließenden Ausheilungsstadium zeigte sich

eine kontinuierliche Abnahme bis zu Tag 18, jedoch blieb die Zellproliferationsrate auch nach

einer Versuchsdauer von 22 Tagen mit durchschnittlich 9,6 % (± 4,0) um 215 % signifikant

erhöht. Grundsätzlich sank die Zellproliferationsrate bis Ende des Beobachtungszeitraums bei

keinem Pferd der höheren Dosisgruppe zurück auf die Ausgangswerte (Abb. 27, Anhänge

Tabellen 11 + 12). Die an Tag 29 gemessene durchschnittliche Zellproliferationsrate von 10,0

% (± 5,2) war noch immer etwa doppelt so hoch wie die der Kontrollen. Es ist also davon

auszugehen, dass noch längere Zeit nach dem Ausheilungsstadium regenerative und / oder

reparative Prozesse abliefen, die durch rein lichtmikroskopische Betrachtung nicht erfasst

werden konnten.

Auffällig war auch eine vorübergehende Abnahme der Zellproliferationsrate in der

exsudativen Phase bei den Pferden 4, 6 und 7.

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101

0

5

10

15

20

25

30

35

40

K 1 4 8 11 15 18 22 24 29

Pferd 3

Pferd 4

Pferd 5

Pferd 6

Pferd 7

Pferd 8

0

1

2

3

4

5

6

K 1 3 7 10 14 17 21 24 28

Pferd1

Pferd2A

ntei

l Ki-6

7-po

sitiv

er Z

elle

n an

der

Ges

amtz

ellz

ahl (

%)

Versuchstag

Abb. 26: Zellproliferationsrate (Vorversuch)

Ant

eil K

i-67-

posi

tiver

Zel

len

an d

er G

esam

tzel

lzah

l (%

)

Abb. 27: Zellproliferationsrate (Hauptversuch)

**

**

Versuchstag

* Kontrolle ** Pferd 3 und Pferd 5 wurden am 11. bzw. am 9. Versuchstag in moribundem Zustand euthanasiert

*

*

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102

4.2.2 Zelluntergangsrate

Um das Ausmaß des Perillaketon- induzierten Zelluntergangs zu beurteilen, wurden nekroti-

sche und apoptotische Zellen durch terminal dUTP nick end labeling (TUNEL), einem seit

langem bekannten und gut etablierten Verfahren, dargestellt. Mit der Bestimmung des Anteils

TUNEL-positiver Zellen an der Gesamtzellzahl zu den jeweiligen Zeitpunkten der Biopsie-

probenentnahme konnte die Rate untergehender Zellen ermittelt werden. Ultrastrukturell fan-

den sich in diesem Zusammenhang bei Alveolarepithelzellen vom Typ I morphologische Kor-

relate zur Nekrose. Veränderungen, wie sie bei Apoptose beobachtet werden können, waren

zwar nicht anzutreffen, da jedoch der Anteil TUNEL-positiver Zellen mit Ausnahme der

Pferde 3 und 5 unmittelbar vor der Euthanasie bei unter 2 % lag, ist es nicht unwahr-

scheinlich, dass apoptotische Zellen bei der punktuellen elektronenmikroskopischen

Untersuchung nicht erfasst wurden.

Der Anteil TUNEL-positiver Zellen an der Gesamtzellzahl bei den Pferden 1 und 2 aus dem

Vorversuch zeigte ausgehend von durchschnittlich 0,4 % (± 0,1) zunächst einen geringen

Abfall, stieg von Tag 3 bis Tag 14 gegenüber den Kontrollen um 91 % auf 0,7 % (± 0,1) an

und fiel ab Tag 17 wieder auf das Ausgangsniveau (Abb. 28, Anhänge Tabelle 13). Aufgrund

der Tatsache, dass dieser Prozess erst etwa sieben Tage nach der Applikation von Perillaketon

abläuft, ist ein direkter kausaler Zusammenhang nicht gesichert und indirekte Mechanismen

sind zu diskutieren. Bemerkenswerterweise geht jedoch dem Anstieg eine Zunahme der Pro-

liferationsrate voraus, so dass es sich um einen kompensatorischen Effekt zu einem ablaufen-

den Gewebe-Remodeling handeln könnte. Pferd 1 mit der höheren Zelluntergangsrate wies

auch die höhere Zellproliferationsrate auf.

Im Hauptversuch zeigten die Tiere interindividuell sehr unterschiedliche Reaktionen. Die

stärksten Veränderungen fanden sich bei Pferd 3 und Pferd 5. Hier erfolgte unmittelbar vor

dem Tod am Übergang von der exsudativen zur proliferativen Phase eine erkennbare

Zunahme TUNEL-positiver Zellen. Ausgehend von 1,9 % lag bei Pferd 3 ein Anstieg um den

Faktor 2,2 auf 4,1 % bis zum 8. Tag vor und bei Pferd 5 ausgehend von 0,5 % um das

5,7fache auf 3,0 % bis zum 4. Tag. Diese vergleichsweise massiven Defekte können den

moribunden Zustand der Tiere erklären. Lediglich noch bei Pferd 8 zeigte sich immerhin eine

Steigerung der Zelluntergangsrate gegenüber dem Ausgangswert von 0,9 % um den Faktor

1,7 auf 1,6 % von Tag 1 bis Tag 8, um bis zum 15. Tag wieder abzufallen. Bei diesem Tier

konnten am 4. Versuchstag keine Lungenbiopsieproben gewonnen werden. Bei den Pferden 4,

6 und 7 waren keine signifikanten Abweichungen zu beobachten, obwohl auch hier

Epitheldefekte und als Folge davon eine deutlich erhöhte AII-Proliferation nachgewiesen

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103

werden konnten. Ein Effekt der möglicherweise in Betracht gezogen werden muss, ist, dass

untergehende Epithelzellen vor ihrem Nachweis bereits desquamiert und durch die

Mechanismen der bronchioalveolären Clearance abtransportiert wurden. Somit wäre auch bei

den Pferden 3 und 5 nicht das volle Ausmaß untergehender Zellen erfasst (Abb. 29, Anhänge

Tabellen 13 + 14).

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104

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0,70

0,80

K 1 3 7 10 14 17 21 24 28

Pferd 1

Pferd 2

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

K 1 4 8 11 15 18 22 24 29

Pferd 3

Pferd 4

Pferd 5

Pferd 6

Pferd 7

Pferd 8

Abb. 29: Zelluntergangsrate (Hauptversuch)

Ant

eil T

UN

EL

-pos

itive

r Zel

len

an d

er G

esam

tzel

lzah

l (%

)

Abb. 28: Zelluntergangsrate (Vorversuch)

Ant

eil T

UN

EL

-pos

itive

r Zel

len

an d

er G

esam

tzel

lzah

l (%

)

Versuchstag

* Kontrolle ** Pferd 3 und Pferd 5 wurden am 11. bzw. am 9. Versuchstag in moribundem Zustand euthanasiert

**

**

Versuchstag

*

*

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105

4.2.3 Veränderungen des Anteils von Makrophagen und Granulozyten an der

Gesamtzellzahl

Entzündungszellen spielen eine große Rolle bei der Expression von Cytokinen und nehmen

dadurch erheblichen Einfluss nicht nur auf die Kollagensynthese, sondern auch auf zahlreiche

andere Prozesse im Rahmen eines Entzündungsgeschehens. Als Maß für die ablaufende

Entzündungsreaktion und um ihren Einfluss auf die mittels quantitativer

Polymerasekettenreaktion bestimmte Expression von TGF-β , Interleukin-1β , Prokollagen

a1(I) und a1(III) beurteilen zu können, wurden Granulozyten und Makrophagen

immunhistochemisch durch die Markierung des Myeloid / Histiozyten-Antigens dargestellt

und ihr Anteil an der Gesamtzellzahl bestimmt. Aufgrund ihrer Morphologie handelte es sich

dabei überwiegend um diffus verteilte Makrophagen, während Granulozyten in geringerem

Umfang vertreten waren und zu herdförmigen Ansammlungen neigten.

In der niedrigeren Dosisgruppe zeigte Pferd 1 über den gesamten Beobachtungszeitraum

keine signifikanten Änderungen der Makrophagen- und Granulozytenpopulation, während bei

Pferd 2 ab dem ersten Versuchstag eine kontinuierliche Zunahme ausgehend von einem

Anteil MAC 387-positiver Zellen an der Gesamtzellzahl von 1,6 % vor Versuchsbeginn auf

4,8 % an Tag 7 erfolgte. Von Tag 7 bis Tag 10 konnte eine Abnahme etwa bis auf das

Ausgangsniveau beobachtet werden (Abb. 30, Anhänge Tabelle 15).

In der höheren Dosisgruppe erfolgte bei Pferd 5 und 6 in der exsudativen Phase bereits 24 h

nach der Applikation von Perillaketon, bei den anderen Pferden der Gruppe erst ab Tag 1 eine

deutliche Zunahme MAC 387-positiver Zellen. Die durchschnittliche Infiltration mit

Makrophagen und Granulozyten erreichte gleichzeitig mit der Zellproliferationsrate in der

proliferativen Phase ihren Höhepunkt. Ausgehend von 2,5 % (± 0,6) MAC 387-positiven

Zellen in den Kontrollen zeigte sich ein Anstieg um den Faktor 3,6 bis zu einem Maximum

von 9,1 % (± 1,8) am 8. Tag. Eine Ausnahme bildete hier Pferd 5, das bereits nach 5 Tagen

euthanasiert wurde. Im anschließenden Ausheilungsstadium konnte im Gegensatz zur

Zellproliferationsrate ein völliges Abklingen der Entzündungsreaktion bis Tag 15 beobachtet

werden (Abb. 31, Anhänge Tabellen 15 + 16). Eine geringgradige Zunahme lymphozytärer

Infiltrate ließ sich lichtmikroskopisch lediglich in der proliferativen Phase beobachten.

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106

0

1

2

3

4

5

6

K 1 3 7 10 14 17 21 24 28

Pferd 1

Pferd 2

0

2

4

6

8

10

12

K 1 4 8 11 15 18 22 24 29

Pferd 3

Pferd 4

Pferd 5

Pferd 6

Pferd 7

Pferd 8

Abb. 30: Anteil MAC 387-positiver Zellen an der Gesamtzellzahl (Vorversuch)

Ant

eil a

n de

r Ges

amtz

ellz

ahl (

%)

Versuchstag

Abb. 31: Anteil MAC 387-positiver Zellen an der Gesamtzellzahl (Hauptversuch)

Ant

eil a

n de

r Ges

amtz

ellz

ahl (

%)

Versuchstag

** **

* Kontrolle ** Pferd 3 und Pferd 5 wurden am 11. bzw. am 9. Versuchstag in moribundem Zustand euthanasiert

*

*

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107

4.2.4 Gehalt der alveolären Septen an kollagenen und retikulären Fasern

Um mögliche fibrotische oder erosive Prozesse beurteilen zu können, die mit einer Zunahme

bzw. Verringerung des Gehalts der alveolären Septen an extrazellulärer Matrix einhergehen,

erfolgte die computergestützte phasenanalytische Auswertung der in der Heidenhainschen

Azanfärbung dargestellten kollagenen und retikulären Fasern bis zum 29. Versuchstag.

In der niedrigen Dosisgruppe zeigte sich auch nach einer Versuchsdauer von 28 Tagen keine

signifikante Änderung des Gehalts kollagener und retikulärer Fasern (Abb. 32, Anhänge Ta-

belle 17).

Bei den Pferden 4, 6, 7 und 8 aus der höheren Dosisgruppe konnte während des gesamten

Beobachtungszeitraums von 29 Tagen keine signifikante Änderung der Menge der in der

Heidenhainschen Azanfärbung dargestellten extrazellulären Matrixbestandteile nachgewiesen

werden. Lediglich bei Pferd 8 ließ sich ein geringer Anstieg der linearen Trendlinie

beobachten, wobei jedoch der Anteil kollagener und retikulärer Fasern an Tag 29 mit 14,8 %

nur unwesentlich über dem Ausgangswert von 12,5 % lag. Die Pferde 3 und 5 wurden

aufgrund der kurzen Versuchsdauer von nur 7 bzw. 11 Tagen nicht in die Messung

einbezogen (Abb. 33, Anhänge Tabellen 17 + 18).

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108

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

K 1 3 7 10 14 17 21 24 28

Pferd 1

Pferd 2

TrendliniePferd 1

TrendliniePferd 2

0

2

4

6

8

10

12

14

16

K 1 4 8 11 15 18 22 25 29

Pferd 4

Pferd 6

Pferd 7

Pferd 8

TrendliniePferd 4TrendliniePferd 6

TrendliniePferd 7

TrendliniePferd 8

Abb. 32: Anteil kollagener und retikulärer Fasern an der Gesamtfläche der alveolären Septen (Vorversuch)

Ant

eil a

n de

r Ges

amtfl

äche

der

al

veol

ären

Sep

ten

(%)

Versuchstag

Abb. 33: Anteil kollagener und retikulärer Fasern an der Gesamtfläche der alveolären Septen (Hauptversuch)

Ant

eil a

n de

r Ges

amtfl

äche

der

al

veol

ären

Sep

ten

(%)

Versuchstag

*

*

* Kontrolle

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109

4.3 Untersuchungen zur Genexpression

Mit der Reverse Transkriptase quantitativen Polymerasekettenreaktion stand eine

hochsensitive und -spezifische Methode zur Verfügung, mit der es möglich war, unter

Verwendung sehr geringer Mengen von Lungengewebe die Expression von IL-1β , TGF-β ,

COL1A1 und COL1A3 auf mRNA-Ebene zu bestimmen. Von diesen Faktoren ist bekannt,

dass sie eine wesentliche Rolle in akuten und chronischen Erkrankungen der Lunge bei

verschiedenen Tierspezies und dem Menschen spielen und in diesem Zusammenhang auch als

potenzielle prognostische und diagnostische Parameter gelten. Ziel dieser Untersuchungen

war es, im Vergleich mit der Entwicklung der morphometrisch erfassten

Lungenveränderungen und dem von Frau Dr. Venner untersuchten klinischen Verlauf die

Bedeutung der Genexpression der jeweiligen mRNA-Spezies in den verschiedenen Phasen

der Perillaketon- induzierten Lungenveränderungen festzustellen. Von großem Interesse war

dabei zu prüfen, ob sich die Annahme über ihre mögliche Eignung als diagnostisches

Hilfsmittel oder prognostischer Faktor auf die Untersuchung der Expression dieser mRNA-

Spezies übertragen lässt. Als Probenmaterial diente dabei das regelmäßig während des

Krankheitsverlaufes an mehreren verschiedenen Lokalisationen durch transkutane Biopsie

gewonnene Lungengewebe, wobei die daraus isolierte mRNA der Proben eines

Entnahmetages als Sammelprobe zusammengefasst wurde. Diese Vorgehensweise war

aufgrund der übereinstimmenden lichtmikroskopischen Befunde aller Lokalisationen eines

Entnahmetages gerechtfertigt. Jede einzelne Biopsieprobe wurde vor der Bildung der

Sammelproben dreigeteilt und sowohl zur Durchführung der morphologischen als auch der

morphometrischen und molekularbiologischen Untersuchungen herangezogen. Daher war ein

direkter Vergleich der Ergebnisse der verschiedenen Methoden möglich. Von den mRNA-

Sammelproben wurden die Ct-Werte und die Kopienzahl mit den jeweiligen

Standardabweichungen für IL-1ß, TGF-ß, Prokollagen a1(I) und Prokollagen a1(III) und das

hier verwendete „Housekeeping-Gen“ EF-1a bestimmt (tabellarische Zusammenstellung der

Werte aller Messdurchgänge siehe Anhang 9.2). Die Kopienzahlen von der zu untersuchenden

mRNA-Spezies wurden anhand der Werte von EF-1a korrigiert, um die eingesetzten

unbekannten mRNA-Mengen und mögliche unterschiedliche Effizienzen der Reversen

Transkription auszugleichen. Der zeitliche Verlauf der korrigierten Expressionsdaten wurde

zur besseren Übersicht für jedes einzelne Gen pro Pferd als Liniendiagramm dargestellt und

mit den Ergebnissen der morphometrischen Untersuchungen verglichen.

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110

4.3.1 Kontrolle der mRNA-Isolierung und cDNA-Synthese

Um die mRNA-Isolierung und die anschließende cDNA-Synthese mit einer relativ einfachen

aber präzisen Methode zu kontrollieren, wurden von jedem Pferd exemplarisch die zu einem

Pool zusammengefassten mRNA-Isolate eines Entnahmetages mittels Standard-RT-PCR

untersucht. Dabei konnten in allen Proben das „Housekeeping-Gen“ EF-1a und die zu

untersuchenden mRNA-Spezies von IL-1ß, TGF-ß, Prokollagen a1(I) und Prokollagen a1(III)

nachgewiesen werden. Zusätzliche Amplifikationsprodukte wurden nicht beobachtet und bei

den Negativkontrollen traten keine Amplifikate auf.

4.3.2 Ergebnisse der qPCR

Die Gewebeproben wurden in zwei Messdurchgängen mit je dreifacher Probemessung bei

identischen Protokollen untersucht, wobei zwischen diesen beiden Messungen ein

Variationskoeffizient von 5 % nie überschritten wurde (BUSTIN, 2000). Zur Überprüfung des

sicheren Nachweises geringer Kopienzahlen wurde exemplarisch eine Verdünnungsreihe des

cDNA-Mengenstandards von EF-1a von 102 Kopien bis 109 Kopien pro µl erstellt. Aus den

als Triplikaten gemessenen Ct-Werten und den jeweiligen Standardabweichungen (s) geht

hervor, dass auch mit Ausnahme von TGF-ß noch 100 Kopien in der Probe sicher detektiert

und amplifiziert werden konnten. Die Nachweisgrenze von TGF-ß lag bei 103 Kopien.

Grundsätzlich wurde bei keinem der untersuchten Gene in den auszuwertenden Proben eine

Konzentration von weniger als 105 Kopien pro Probe gemessen. Für die Negativkontrollen

wurde DEPC-behandeltes Wasser als Template verwendet.

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111

4.3.3 Expressionsrate von Interleukin-1β

Bei den eigenen RT qPCR-Untersuchungen zeigten die Versuchspferde sehr heterogene

Verläufe der Expression des multifunktionalen Cytokins IL-1ß (Abb. 34 + 35, Anhänge

Tabellen 29 + 30). Die einzelnen Kurven zeigten ein sehr unterschiedliches Verhalten und

zum Teil sehr große Schwankungen, die überwiegend in keinem erkennbaren Zusammenhang

mit den morphometrisch erfassten Parametern stehen. Bei den Pferden 1 und 2 aus dem

Vorversuch war jedoch ein durchschnittlicher Anstieg der IL-1ß-Expression von Tag 10 bis

14 um den Faktor 2,4 gegenüber dem Ausgangswert erkennbar, der zeitlich mit dem Verlauf

der Zelluntergangsrate zusammenfiel. Auch bei Pferd 4 aus dem Hauptversuch zeigte sich

eine Zunahme von Tag 8 bis Tag 22 um das Doppelte gegenüber dem Kontrollwert. Ein

einheitlicher Trend war insgesamt jedoch nicht erkennbar. Bemerkenswerterweise verlief die

biphasische Entwicklung der Expression von IL-1ß bei Pferd 6 mit den Höchstwerten an Tag

1 und 18 parallel zur Expressionsrate von Prokollagen a1(I) und a1(III). Diese Höchstwerte

stellen jedoch nur sehr geringe Zunahmen um den Faktor 1,2 bzw. 1,3 gegenüber den

Ausgangswerten dar.

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112

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

K 1 3 7 10 14 17 21 24

Pferd 1

Pferd 2

Abb. 34: Expression von Interleukin-1β (Vorversuch)

Kop

ienz

ahl /

105 K

opie

n E

F-1α

Versuchstag

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

5

K 1 4 8 11 15 18 22 25 29

Pferd 3

Pferd 4

Pferd 5

Pferd 6

Pferd 7

Pferd 8

Abb. 35: Expression von Interleukin-1β (Hauptversuch)

Kop

ienz

ahl /

105 K

opie

n E

F-1α

Versuchstag

**

**

* Kontrolle ** Pferd 3 und Pferd 5 wurden am 11. bzw. am 9. Versuchstag in moribundem Zustand euthanasiert

*

*

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113

4.3.4 Expressionsrate von TGF-β

Ebenso wie bei IL-1ß zeigten die Tiere bei der Bestimmung der Expressionsrate von TGF-ß

interindividuell ein sehr unterschiedliches Verhalten. Nur bei den Pferden 1 und 2 der

niedrigen Dosisgruppe und den Pferden 4 und 7 der höheren Dosisgruppe konnten auffällige

Veränderungen beobachtet werden.

Bei Pferd 1 erfolgte ab Tag 3 ein Anstieg der Expression von TGF-β ausgehend von einem

Kontrollwert von 0,65 Kopien pro 103 Kopien EF-1a um das 2,9-fache auf 1,9 Kopien pro 103

Kopien EF-1a an Tag 7, um anschließend bis zum 17. Tag wieder auf das Ausgangsniveau

abzufallen. Bei Pferd 2 zeigte sich eine parallele, jedoch um 4 Tage verzögert eintretende

Zunahme um den Faktor 2,8 bis Tag 10. Auch hier nahmen die Werte wieder bis Tag 17 ab

(Abb. 36, Anhänge Tabelle 31).

In der höheren Dosisgruppe zeigte Pferd 4 im Vergleich zu einem Kontrollwert von 5,8

Kopien pro 103 Kopien EF-1α ab dem 11. Tag eine 2,2-fache Zunahme auf 12,8 Kopien pro

103 Kopien EF-1α an Tag 15, die bis Tag 18 wieder auf das Ausgangsniveau sank. Ein noch

ausgeprägterer Anstieg fand sich bei Pferd 7, der sich über die proliferative Phase bis zum

Ende der Ausheilungsphase erstreckte. Hier erfolgte in Bezug auf den Ausgangswert von

ebenfalls 5,8 Kopien pro 103 Kopien EF-1a ein Anstieg von Tag 4 bis Tag 11 um den Faktor

3,9 auf 22,5 Kopien pro 103 Kopien EF-1a mit einer raschen Regression ebenfalls bis Tag 15.

Bemerkenswerterweise war bei diesen beiden Tieren, die als einzige in der Gruppe eine

signifikante Zunahme der TGF-ß-Expression aufwiesen, auch die größte Zunahme der

Prokollagen a1(I)-Expression festzustellen. Ein gewisser kausaler Zusammenhang mit TGF-ß

als profibrotischen Stimulus erscheint hier möglich. Bei Pferd 7 verliefen die

Expressionsraten von TGF-ß und Prokollagen a1(III) bis zum Erreichen der Höchstwerte

nahezu parallel. Während jedoch TGF-ß in der Ausheilungsphase wieder zum

Ausgangsniveau zurückkehrte, waren die Werte für Prokollagen a1(I) und a1(III) auch noch

am Ende des Beobachtungszeitraums erhöht (Abb. 37 + 39). Die Pferde 3, 5, 6 und 8 wiesen

während der gesamten Versuchsdauer keine signifikanten Änderungen bei der Expression von

TGF-β auf (Abb. 37, Anhänge Tabelle 32).

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114

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

K 1 3 7 10 14 17 21 24

Pferd 1

Pferd 2

0

5

10

15

20

25

K 1 4 8 11 15 18 22 24 29

Pferd 3

Pferd 4

Pferd 5

Pferd 6

Pferd 7

Pferd 8

Abb. 36: Expression von TGF-β (Vorversuch)

Kop

ienz

ahl /

103 K

opie

n E

F-1α

Versuchstag

Abb. 37: Expression von TGF-β (Hauptversuch)

Kop

ienz

ahl /

102 K

opie

n E

F-1α

Versuchstag

**

**

* Kontrolle ** Pferd 3 und Pferd 5 wurden am 11. bzw. am 9. Versuchstag in moribundem Zustand euthanasiert

*

*

Page 115: Morphologische Charakterisierung und molekulare ... · 2.1.1 Histologie, UItrastruktur und Funktion S. 13 2.2 Interstitielle Pneumonie und Diffuse Alveolar Damage (DAD) S. 25 2.3

115

4.3.5 Expressionsrate von Prokollagen a1(I)

In der niedrigeren Dosisgruppe konnten keine auffälligen Veränderungen der Genexpression

von Prokollagen a1(I) beobachtet werden (Abb. 38, Anhänge Tabelle 33).

Bei fast allen Tieren der höheren Dosisgruppe zeigte sich im Gegensatz zur sehr heterogenen

Reaktion, wie sie für IL-1ß und TGF-ß festgestellt wurde, eine ähnliche Entwicklung der

Prokollagen a1(I)-Expression. Bereits in den ersten 24 h der exsudativen Phase konnte

durchschnittlich nahezu eine Verdoppelung der Expression von Prokollagen a1(I) festgestellt

werden. Diese Zunahme setzte sich im proliferativen Stadium fort und von Tag 8 bis 15

konnte eine Vervierfachung gegenüber dem Ausgangswert beobachtet werden. Eine Abnahme

erfolgte erst am Ende der Ausheilungsphase ab Tag 18 und die Expression lag auch noch nach

einer Versuchsdauer von 29 Tagen im Durchschnitt 2,7-fach über dem Ausgangsniveau.

Damit erreichte die Expression von Prokollagen a1(I) ihr Maximum um mehrere Tage

verzögert zu Prokollagen a1(III). Pferd 3 und Pferd 5 zeigten unmittelbar ante mortem am

Übergang von exsudativer zu proliferativer Phase eine starke Abnahme der Expression von

Prokollagen a1(I) (Abb. 39, Anhänge Tabelle 34). Aber auch bei den Pferden 4, 6 und 8

konnte in der exsudativen Phase ein vorübergehender Abfall der Prokollagen a1(I)-

Expression beobachtet werden. Die Pferde 4 und 7, bei denen die höchsten Werte anzutreffen

waren, wiesen als einzige Tiere eine signifikante Zunahme der TGF-ß-Expression auf.

Bemerkenswert ist, dass bei der morphometrischen Auswertung der Heidenhainschen

Azanfärbung zu keinem Zeitpunkt eine signifikante Steigerung des Anteils der extrazellulären

Matrix an den Alveolarsepten zu beobachten war. Im Vergleich zur Zellproliferationsrate und

zur Infiltrationsrate MAC 387-positiver Zellen, die ihr Maximum durchschnittlich bereits am

8. Tag erreichten und danach wieder abnahmen, stieg die Prokollagen a1(I)-Expression weiter

an und deren Höhepunkt fand sich erst an Tag 18. Während die entzündlichen Infiltrate an

Tag 15 wieder auf die Kontrollwerte zurückgingen, blieben Zellproliferation und Prokollagen

a1(I)-Expression bis zum Ende des Beobachtungszeitraums erhöht.

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116

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

K 1 3 7 10 14 17 21 24

Pferd 1

Pferd 2

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

K 1 4 8 11 15 18 22 24 29

Pferd 3

Pferd 4

Pferd 5

Pferd 6

Pferd 7

Pferd 8

Abb. 38: Expression von Prokollagen a1(I) (Vorversuch)

Kop

ienz

ahl /

102 K

opie

n E

F-1α

Versuchstag

Abb. 39: Expression von Prokollagen a1(I) (Hauptversuch)

Kop

ienz

ahl /

102 K

opie

n E

F-1α

Versuchstag

**

**

* Kontrolle ** Pferd 3 und Pferd 5 wurden am 11. bzw. am 9. Versuchstag in moribundem Zustand euthanasiert

*

*

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117

4.3.6 Expressionsrate von Prokollagen a1(III)

In der niedrigen Dosisgruppe zeigten sich bei der Genexpression von Prokollagen a1(III) kei-

ne deutlichen Veränderungen gegenüber dem Ausgangswert (Abb. 40, Anhänge Tabelle 35).

Durch die in der vorliegenden Arbeit durchgeführte qPCR konnte in der hohen Dosisgruppe

bereits 24 h nach der Induktion eines akuten Alveolarschadens durch Perillaketon ein

deutlicher Anstieg der Expression von Prokollagen a1(III) festgestellt werden. In der

exsudativen Phase lag am ersten Versuchstag die durchschnittliche Genexpression von

Prokollagen a1(III) um den Faktor 2,4 über den Kontrollwerten. Die Zunahme setzte sich bis

zum Ende der proliferativen Phase fort und erreichte an Tag 11 ihr Maximum mit dem

16,6fachen des Kontrollwertes. Bei Pferd 7 erfolgte sogar ein Anstieg um das 20fache. Im

Anschluss daran sanken die Werte wieder, erreichten jedoch bei keinem Pferd das

Ausgangsniveau und waren über die Ausheilungsphase hinaus bis zum Ende des

Beobachtungszeitraums von 29 Tagen noch durchschnittlich 10fach erhöht (Abb. 41,

Anhänge Tabelle 36). Pferd 6 zeigte durch das Fehlen eines deutlichen Anstiegs der

Expression von Prokollagen a1(III) in der proliferativen Phase ein Verhalten gegen den

Trend. Bemerkenswert ist, dass bei der morphometrischen Auswertung der Heidenhainschen

Azanfärbung zu keinem Zeitpunkt eine signifikante Steigerung des Anteils der extrazellulären

Matrix an den Alveolarsepten zu beobachten war (Abb. 33). Verglichen mit der Entwicklung

von Prokollagen a1(III) erreicht die Expression von Prokollagen a1(I) ihr durchschnittliches

Maximum erst mit einer Verzögerung von 7 Tagen. Betrachtet man den zeitlichen Verlauf der

Zellproliferationsrate und der Infiltrationsrate MAC 387-positiver Zellen, so erreichten diese

zusammen mit der Expression von Prokollagen a1(III) ihre Höchstwerte. Während der Anteil

MAC 387-positiver Zellen durchschnittlich bis zum 15. Tag wieder auf das Ausgangsniveau

fiel, blieben die Zellproliferationsrate und die Expression von Prokollagen a1(III) erhöht.

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118

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

K 1 3 7 10 14 17 21 24

Pferd 1

Pferd 2

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

K 1 4 8 11 15 18 22 24 29

Pferd 3

Pferd 4

Pferd 5

Pferd 6

Pferd 7

Pferd 8

Abb. 40: Expression von Prokollagen a1(III) (Vorversuch)

Kop

ienz

ahl /

102 K

opie

n E

F-1α

Versuchstag

Abb. 41: Expression von Prokollagen a1(III) (Hauptversuch)

Kop

ienz

ahl /

102 K

opie

n E

F-1α

Versuchstag

** **

* Kontrolle ** Pferd 3 und Pferd 5 wurden am 11. bzw. am 9. Versuchstag in moribundem Zustand euthanasiert

*

*

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119

4.4 Vergleich mit den klinischen Befunden

Als Grundlage für den Vergleich der in der vorliegenden Arbeit gewonnenen Ergebnisse mit

dem klinischen Verlauf wurde der von Frau Dr. Venner anhand der semiquantitativen

Erfassung klinischer Befunde erhobene klinische Score herangezogen (Venner et al., 2003).

Entsprechend dieses Bewertungsschemas zeigte sich bereits ab der Applikation von

Perillaketon ein kontinuierlicher Anstieg des durchschnittlichen klinischen Scores in der

höheren Dosisgruppe, der am 5. Tag mit 8,5 Punkten sein Maximum erreichte und damit für

eine hochgradige, lebensbedrohende Lungenerkrankung sprach. Bis zum 15. Versuchstag

erfolgte eine stetige Abnahme bis zu einer mittleren Scorepunktezahl von 1. Dieser Wert blieb

bis zum 32. Tag konstant und kehrte zwischen Tag 35 und 40 wieder auf den Ausgangswert

zurück. Im Vergleich dazu erreichten die durchschnittliche Zellproliferationsrate und die

Infiltrationsrate mit Granulozyten und Makrophagen erst mit einer Verzögerung von 3 Tagen

am 8. Versuchstag ihr Maximum also zu einem Zeitpunkt, an dem der klinische Score bereits

wieder abnahm. Die Zellproliferationsrate blieb ebenfalls zusammen mit dem klinischen

Score noch nach dem lichtmikroskopisch festgestellten Ende der Ausheilungsphase erhöht,

während der durchschnittliche Anteil granulohistiozytärer Infiltrate an der Gesamtzellzahl an

Tag 15 zusammen mit dem klinischen Score das Niveau des Kontrollwertes erreichte. Die

durchschnittlichen Genexpressionen von Prokollagen a1(III) und a1(I) erreichten ihr

Maximum verglichen mit dem klinischen Score deutlich verzögert an Tag 11 bzw. an Tag 18,

also zu Zeitpunkten, an denen der Grad der klinischen Symptome bereits wieder deutlich

abgenommen hatte. Ein Zusammenhang des Verlaufs der klinischen Symptomatik mit der

Expression von IL-1ß und TGFß konnte nicht beobachtet werden.

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120

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

K 1 3 5 7 10 13 17 20 24 27 30

Pferd 3

Pferd 4

Pferd 5

Pferd 6

Pferd 7

Pferd 8

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

K 1 3 5 7 10 13 17 20 24 27 30

Pferd 1

Pferd 2

Abb. 42: Klinischer Score (Vorversuch) 1

Kop

ienz

ahl /

102 K

opie

n E

F-1α

Versuchstag

Abb. 43: Klinischer Score (Hauptversuch) 1

Kop

ienz

ahl /

102 K

opie

n E

F-1α

Versuchstag

* Kontrolle ** Pferd 3 und Pferd 5 wurden am 11. bzw. am 9. Versuchstag in moribundem Zustand euthanasiert

** **

*

*

1 Mit freundlicher Genehmigung von Frau Dr. M. Venner (Klinik für Pferde, Tierärztliche Hochschule Hannover)

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121

5 Diskussion

Interstitielle Lungenerkrankungen sind eine häufige Folge zahlreicher, sehr heterogener

Insulte und werden bei Sportpferden als eine wesentliche Ursache für eine in zunehmendem

Maße auftretende verminderte Leistungsfähigkeit betrachtet (BUERGELT et al., 1986;

WINDER et al., 1988; DIEKMANN et al., 1990; BUERGELT, 1995). Initial steht dabei im

Krankheitsverlauf ein akuter Alveolarschaden im Zentrum, gekennzeichnet durch Defekte des

Alveolarepithels und –endothels mit fibrinreicher Exsudation in die Alveolarlumina, der mit

einem Funktionsverlust der alveolo-kapillären Einheiten einhergeht. Es folgen im subakuten

und chronischen Stadium regenerative und reparative Prozesse, zu denen vor allem eine

reaktive Proliferation von Alveolarepithelzellen vom Typ II, aber auch von Fibroblasten

gehört. Unter günstigen Voraussetzungen ist eine vollständige Ausheilung möglich, vielfach

werden jedoch als Konsequenz mehr oder weniger stark ausgeprägte irreversible

Veränderungen in Form von Lungenfibrose beobachtet. Hier erfolgt zwar grundsätzlich eine

deregulierte, überschießende Ablagerung aller extrazellulären Matrixproteine, im

Vordergrund steht jedoch die Akkumulation vor allem der Kollagentypen I und III

(DIEKMANN et al., 1990; JUBB, 1991; BIENKOWSKI u. GOTKIN, 1995; BRUCE, 1995).

Der Grad der dabei auftretenden restriktiven Lungenerkrankungen kann sehr stark variieren,

und insbesondere Sportpferde im Hochleistungsbereich zeigen schon bei relativ geringer

Beeinträchtigung der respiratorischen Funktionen erkennbare Leistungseinbußen. Aber auch

bei der Nutzung von Pferden aus der Hobby- und Freizeithaltung können sie eine Rolle

spielen (DIEKMANN et al., 1990). Ein Tiermodell der interstitiellen Pneumonie des Pferdes

könnte daher als wertvolles Instrument sowohl für eine Verbesserung der klinischen

Diagnostik und Prognosestellung genutzt werden, als auch zu einem besseren Verständnis der

Pathogenese führen.

Das erste Ziel der vorliegenden Arbeit war es, durch Darstellung der pathomorphologischen

Lungenveränderungen auf licht- und elektronenmikroskopischer Ebene sowie durch

immunhistochemische Methoden an transkutan gewonnenen Biopsieproben zu klären, ob

experimentell über einen akuten Alveolarschaden durch eine einmalige intravenöse

Applikation von Perillaketon (1-(3-furyl)4-Methylpentaton) das Bild einer interstitiellen

Pneumonie beim Pferd induziert werden kann. Der Versuchsansatz wurde dabei in Anlehnung

an bereits bestehende Tiermodelle etabliert, in denen Perillaketon zur Induktion

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122

nichtkardiogener Lungenödeme und Diffuse Alveolar Damage (DAD) beim Schaf

(BERNARD et al., 1995; SNAPPER et al., 1998; HWANG et al., 2001) oder restriktiver

Lungenerkrankungen beim Pony (BREEZE et al., 1984) verwendet wurde. Nach der

Bestätigung dieser Hypothese, schloss sich als zweite Fragestellung an, welche Rolle die

Genexpressionen der Cytokine Interleukin-1ß und TGF-ß sowie der extrazellulären

Matrixproteinvorläufer Prokollagen a1(I) und Prokollagen a1(III) im Krankheitsverlauf

spielen. Von diesen Faktoren ist bekannt, dass sie große Bedeutung bei akuten und

chronischen Lungenerkrankungen besitzen und aussichtsreiche Kandidaten als prognostische

Parameter für verschiedene Lungenerkrankungen, vor allem für DAD beim Menschen,

darstellen. In den bisherigen in diesem Zusammenhang stehenden Veröffentlichungen über

IL-1ß, TGF-ß und Parametern für die Kollagensynthese beim Menschen wurden

Untersuchungen überwiegend auf Proteinebene an bronchioalveolärer Lavageflüssigkeit und

an Trachealaspiraten durchgeführt (KIRK et al., 1984b; HORSLEV-PETERSEN, 1990;

WAYDHAS et al., 1993; CLARK et al., 1995; ASHA et al., 1997; DEHEINZELIN et al.,

1997; MEDURI et al., 1998; BAUER et al., 2000; MARSHALL et al., 2000; MIKUNIYA et

al., 2000).

Bei dem in der vorliegenden Arbeit zur Induktion einer interstitiellen Pneumonie eingesetzten

Perillaketon handelt es sich um das wichtigste toxische Agens der Purpurminze (GARST et

al., 1984). Es ist seit langem bekannt, dass die Aufnahme der Pflanze bei Weidetieren zur

Entstehung einer interstitiellen Pneumonie führt (KERR et al., 1986). Die nach einem

Verfahren von GARST und WILSON (1984) und GARST et al. (1985) synthetisierte

Reinsubstanz wurde bereits auch von mehreren Autoren in Tierversuchen zur Erzeugung

eines akuten Alveolarschadens eingesetzt (BREEZE et al., 1984; GUERRY-FORCE et al.,

1988; BERNARD et al., 1995; SNAPPER et al., 1998; SNAPPER et al., 1999; HWANG et

al., 2001). Im Unterschied zu diesen Untersuchungen wurde in der vorliegenden Arbeit der

Beobachtungszeitraum mit 29 Tagen deutlich länger gewählt und nach 60 Tagen eine

abschließende Sektion geplant, um auch das Stadium der Ausheilung oder - sofern sie sich bei

nur einmaliger Exposition gegenüber dem toxischen Agens einstellen sollte - die Entstehung

einer Lungenfibrose mit erfassen zu können. Grundsätzlich müssen bei der Verwendung von

Pferden im Tierversuch das Fehlen definierter Laborstämme und die hohen Kosten bei der

Anschaffung in Betracht gezogen werden sowie der große Aufwand bei Monitoring,

Unterbringung und Versorgung im Rahmen von einem Untersuchungszeitraum von mehreren

Wochen. Zudem sind im Zusammenhang mit Studien wie sie hier durchgeführt wurden nur

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123

lungengesunde Tiere einsetzbar, wodurch die Auswahl geeigneter Tiere erheblich

eingeschränkt wird. In der vorliegenden Arbeit konnte daher nur eine relativ geringe Anzahl

von Tieren eingesetzt werden. Das heterogene Tiermaterial muss zudem als Ursache für die

zum Teil sehr starken interindividuellen Schwankungen der Ergebnisse diskutiert werden. Da

an den Pferden 1 und 2 aus dem Vorversuch nach einer Dosierung von 5 mg Perillaketon / kg

KG als Bolusinjektion nur gering ausgeprägte histomorphologische Alterationen beobachtet

werden konnten, wurden bei den folgenden Tieren 6 mg Perillaketon / kg KG eingesetzt.

Hierdurch konnten ausgeprägtere Veränderungen herbeigeführt werden. Im Vergleich dazu

sind bei Versuchen zur Erzeugung nichtkardiogener Lungenödeme beim Schaf Dosierungen

von 15 bis zu 30 mg PK / kg KG beschrieben, die anästhesierten oder wachen Tieren als

Dauertropfinfusion verabreicht wurden (COGGESHALL et al., 1987; ABERNATHY et al.,

1992). Auch BREEZE et al. (1984) verwendeten zur Induktion restriktiver

Lungenveränderungen beim Pony 18 mg PK / kg KG wobei die Applikation ebenfalls über

Dauertropfinfusion erfolgte. Da die in der vorliegenden Arbeit verwendeten Versuchspferde

nach der intravenösen Applikation von 6 mg PK / kg KG als Bolusinjektion hochgradige, zum

Teil lebensbedrohliche klinische Symptome zeigten, war eine Steigerung auf die beim Schaf

und Pony beschriebenen Dosierungen nicht sinnvoll. Diese abweichenden Reaktionen können

auf rasse- und speziesspezifische Unterschiede und auch auf die Applikationsform

zurückzuführen sein.

Zur Gewinnung von Lungengewebe kam mit der durchgeführten transkutanen Entnahme von

Biopsieproben mittels der halbautomatischen Biopsiepistole Pro-Mag 2.2 (Fa. USBiopsy

engineered medical products, Franklin, USA) ein für diese Zwecke neuartiges Verfahren zum

Einsatz, das gegenüber der Anwendung einer herkömmlichen True-Cut Nadel hinsichtlich

Probenqualität und Nebenwirkungen für das Pferd deutliche Vorteile besitzt (VENNER et al.,

im Druck). Da von den einzelnen Bioptaten mehrere Teilproben gewonnen wurden, die

jeweils für die morphologischen, morphometrischen und molekularbiologischen

Untersuchungen herangezogen wurden, konnte ein direkter Vergleich zwischen dem Verlauf

der morphologischen Veränderungen und der Expressionsrate der ausgewählten mRNA-

Spezies gezogen werden. Diese Kombination verschiedener Methoden, die an intra vitam

gewonnenem Probenmaterial durchgeführt wurden und eine unmittelbare Gegenüberstellung

der jeweiligen Ergebnisse ermöglicht, besitzt Modellcharakter für zukünftige ähnliche

Untersuchungen. Insbesondere mit der Reverse Transkriptase - quantitativen Polymerase-

kettenreaktion wurde ein hochspezifisches und -sensitives Verfahren etabliert, das sich bei der

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124

Auswertung sehr kleiner Gewebemengen wie den hier vorliegenden Minimalbiopsieproben

eignet.

Bei der lichtmikroskopischen und ultrastrukturellen Auswertung der Kontrollbiopsieproben,

die vor Versuchsbeginn von verschiedenen Lokalisationen entnommen wurden, konnte nur

normal strukturiertes Lungengewebe festgestellt werden. Es fand sich physiologischerweise

auftretendes und zum Stützgerüst der Lunge gehörendes kollagenes Bindegewebe. Aufgrund

des bei der Gewinnung der Biopsien verursachten Traumas wurden verschiedene

entnahmebedingte Artefakte beobachtet, die grundsätzlich bei der Beurteilung der Proben mit

in Betracht gezogen werden mussten. Es handelte sich dabei auf lichtmikroskopischer Ebene

um eine unterschiedlich starke Kompression des Lungengewebes bis hin zu subtotaler oder

totaler Atelektase, ein graduell variierendes, überwiegend sehr gering ausgeprägtes alveoläres

Ödem und intraalveolär gelegene Erythrozyten. In sehr wenigen Fällen - bezogen auf alle

gewonnenen Proben - fanden sich in den Randbereichen der Bioptate Lipidtröpfchen und

versprengtes quergestreiftes Muskelgewebe, die eine Kontamination mit Material aus

Unterhautfettgewebe und Interkostalmuskulatur als Folge der transkutanen Entnahmetechnik

darstellten. Elektronenmikroskopisch konnte vereinzelt in einigen Bereichen auch eine

Schwellung des Kapillarendothels beobachtet werden sowie eine ziehharmonikaartige Faltung

der alveolären Septen. Nach der einmaligen intravenösen Applikation von Perillaketon in

einer Dosis von 6 mg / kg KG konnten die hervorgerufenen Lungenveränderungen anhand

ihrer licht- und elektronenmikroskopisch dargestellten Morphologie in drei verschiedene

Phasen eingeteilt werden, die in ihrem Erscheinungsbild den einzelnen der von JUBB (1991)

beschriebenen Stadien der interstitiellen Pneumonie entsprachen: initiale exsudative Phase (1.

bis 4. Tag post applicationem), proliferative Phase (4. bis 11. Tag post applicationem) und bei

den Pferden 4, 6, 7 und 8 Ausheilung (11. bis 18. Tag post applicationem). Pferd 3 und Pferd

5 mussten am 11. bzw. am 9. Versuchstag in moribundem Zustand euthanasiert werden. Mit

der angewandten transkutanen Entnahmetechnik konnten nicht von allen Lungenarealen

Proben gewonnen werden, sondern nur aus einem begrenzten oberflächlichen Abschnitt der

beiden Hauptlappen bis zu einer Tiefe von etwa 1,5 – 2 cm. Da jedoch in den

unterschiedlichen Biopsielokalisationen des gleichen Entnahmetages stets übereinstimmende

morphologische Befunde erhoben wurden, konnte man davon ausgehen, dass die

Lungenveränderungen systemisch auftraten. Die im ersten Stadium angetroffenen

Veränderungen der Alveolarwand mit endothelialen und epithelialen Schäden, interstitiellem

und intraalveolärem Ödem und entzündlicher zellulärer Infiltration entsprechen dem Bild der

in der Literatur beschriebenen exsudativen Phase. Zwar waren keine hyalinen Membranen

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wie in ausgeprägten klassischen Fällen von interstitieller Pneumonie darstellbar, jedoch

fanden sich multifokal geringgradige Exsudatmengen. Interzellularspalten, wie sie bei in

vitro-Versuchen unter Einfluss von Perillaketon an bovinen aortalen Endothelzellen gefunden

wurden (WATERS et al., 1993), oder Unterbrechungen des Endothelzellverbandes mit

Verlust von Endothelzellen bei in vivo-Studien (KERR et al., 1986; GUERRY-FORCE et al.,

1988) konnten nicht beobachtet werden. Zwar zeigten sich gut umschr iebene, hochgradig

ausgedünnte Bereiche im Zytoplasma von ödematisierten Endothelzellen, kapillarseitig

entblößte Abschnitte der Basalmembranen waren jedoch nicht zu beobachten. Es ist nicht

auszuschließen, dass diese Abschnitte der Blut-Luft-Schranke, bei denen die Basalmembran

kapillarseitig nur noch von extrem dünnen Endothelzellbrücken bedeckt war, neben der

Degeneration von Endothelzellen und dem Verlust von AI-Zellen eine Rolle bei der

Permeabilitätssteigerung der Blut-Luft-Schranke spielen. Grundsätzlich können nach

Angaben verschiedener Autoren kapillarseitig entblößte Basalmembranen bei alveolären

Schäden aufgrund der Regenerationsfähigkeit von Endothelzellen nur selten beobachtet

werden. Zudem werden degenerierende Endothelzellen vor ihrer Ablösung häufig von

Zytoplasmaausläufern benachbarter Zellen unterminiert, um nach deren Verlust eine

Kontinuitätsunterbrechung des Zellverbandes zu vermeiden (CORRIN u. VIJEYARATNAM,

1975; BACHOFEN u. WEIBEL, 1977; JUBB, 1991). Vereinzelt angetroffene intrakapilläre

Makrophagen mit phagozytierten Lamellarkörperchen lassen darauf schließen, dass

ursprüngliche Alveolarmakrophagen nach der Ingestion untergegangener AII-Zellen oder von

intakt ausgeschleusten Lamellarkörperchen wieder über das Interstitium in die Kapillaren

ausgewandert sind. Die pathomorphologischen Veränderungen des zweiten Stadiums vom 4.

bis 11. Tag entsprachen dem Bild der proliferativen Phase der interstitiellen Pneumonie. Der

Übergang dieser beiden Phasen ist klassischerweise durch die beginnende Proliferation von

AII-Zellen gekennzeichnet (JUBB, 1991). Grundsätzlich lag jedoch in der vorliegenden

Arbeit ein fließender Übergang vor, und es konnten in beiden Phasen in unterschiedlichem

Ausmaß sowohl Epitheldefekte als auch proliferierende AII-Zellen nachgewiesen werden. Die

Einteilung der einzelnen Stadien der Perillaketon-induzierten Lungenveränderungen erfolgte

daher vor allem aufgrund des Umfangs der AII-Zellproliferation. Die immunhistochemische

Markierung von Ki-67 hat zudem gezeigt, dass sich proliferierende Zellen - wie für dieses

Stadium der Erkrankung typisch - nicht nur an der luminalen Seite der Alveolen befanden, bei

denen es sich elektronenmikroskopisch um AII-Zellen und deren Übergangsformen im

Rahmen ihrer Differenzierung in AI-Zellen handelte, sondern auch im verbreiterten

Interstitium. Diese plumpkernigen Zellen glichen in ihrem Erscheinungsbild Fibroblasten.

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Zudem fanden sich elektronenmikroskopisch Fibroblasten mit dilatiertem, endo-

plasmatischem Retikulum als Ausdruck erhöhter Stoffwechselaktivität. Diese Befunde

können in diesem Stadium in Zusammenhang mit der verstärkten Expression von Prokollagen

a1(I) und Prokollagen a1(III) gesehen werden. Die hochgradige Vermehrung von

Alveolarepithelzellen vom Typ II, die den meisten Alveolen ein adenoides Aussehen verlieh,

führte zusammen mit dem ebenfalls beobachteten interstitiellen Ödem und der Schwellung

von Endothelzellen zu einer erheblichen Verbreiterung der Blut-Luft-Schranke, wodurch die

in dieser Phase auftretende respiratorische Insuffizienz erklärbar ist. Nach Erreichen des

Höhepunktes der Proliferation von AII-Zellen erfolgte in der dritten Phase von Tag 11 bis 18

post applicationem bei den Pferden 4, 6, 7 und 8 eine Rückbildung der Veränderungen, bis

rein lichtmikroskopisch im Vergleich zu den Kontrollen keine abweichenden Befunde mehr

erhoben werden konnten. Bei der, mit Ausnahme der Pferde 3 und 5, fortgeführten

Auswertung von Biopsieproben am HE-gefärbten Paraffinschnitt und am Semidünnschnitt bis

zur 8. Woche nach Versuchsbeginn und der anschließenden, pathohistologischen

Untersuchung einer Lunge pro Pferd konnten keine Hinweise auf fibrotische Veränderungen

gefunden werden. Die angetroffenen pathohistologischen und ultrastrukturellen

Veränderungen in der akuten und subakuten Phase entsprechen prinzipiell den

Beschreibungen experimenteller, Perillaketon- induzierter Lungenveränderungen bei Schafen

und Pferden anderer Autoren (BREEZE et al., 1984; GUERRY-FORCE et al., 1988;

BERNARD et al., 1995; SNAPPER et al., 1998; SNAPPER et al., 1999; HWANG et al.,

2001). Sie sind auch vergleichbar mit der bei Rindern beobachteten interstitiellen Pneumonie

nach spontaner Vergiftung durch Aufnahme von Purpurminze beim Weidegang (KERR et al.,

1986) und mit Veränderungen wie bei Chronisch Obstruktiver Bronchitis (COB) des Pferdes

auf alveolärer Ebene (KAUP et al., 1990bc). Bei den Tieren der niedrigeren Dosisgruppe (5

mg PK / kg KG) fanden sich in allen Phasen, sofern überhaupt nachweisbar, im Vergleich mit

der höheren Dosisgruppe (6 mg PK / kg KG) deutlich geringer ausgeprägte Erscheinungen,

was für eine geringe toxische Breite von Perillaketon spricht.

Um das Ausmaß und den genauen zeitlichen Verlauf der festgestellten Veränderungen zu

erfassen, wurden die wesentlichen pathomorphologischen Parameter anhand geeigneter

Methoden dargestellt und morphometrisch quantifiziert. Diese Daten dienten auch als

Grundlage für den Vergleich des zeitlichen Ablaufs der morphologischen Veränderungen mit

den Ergebnissen der Genexpressionsstudien.

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Folgende Parameter wurden gemessen:

1. die Zellproliferationsrate als Maß für ablaufende regenerative und reparative Prozesse,

bestimmt durch die immunhistochemische Markierung von Ki-67,

2. die Perillaketon- induzierte Zelluntergangrate, bestimmt durch terminal dUTP nick end

labeling,

3. die Infiltrationsrate von Granulozyten und Makrophagen als Parameter für die

ablaufende entzündliche Reaktion, bestimmt durch die immunhistochemische

Markierung des Myeloid / Histiozyten-Antigens und

4. der Anteil kollagener und retikulärer Fasern an den alveolären Septen als Parameter

für fibrotische oder erosive Prozesse, phasenanalytisch bestimmt in der

Heidenhainschen Azanfärbung.

Betrachtet man die Zellproliferationsrate, so ließen sich bei den Tieren aus dem Hauptversuch

sehr einheitliche Reaktionen feststellen. Bereits in der exsudativen Phase zeigten sich durch

die Verdoppelung Ki-67-positiver Zellen bis zum 4. Tag in zunehmendem Umfang

ablaufende regenerative Prozesse. Sie erreichten in der proliferativen Phase am 8.

Versuchstag ihr Maximum. Da es sich dabei aufgrund der elektronenmikroskopischen

Untersuchung im Wesentlichen um Alveolarepithelzellen vom Typ II und deren

Übergangsformen handelte, kann dieser hohe Wert nur durch zuvor erfolgte Desquamation

von Alveolarepithelzellen vom Typ I erklärt werden. Der sprunghafte Anstieg der

Zellproliferationsrate von Tag 4 bis Tag 8 unterstützte die in der lichtmikroskopischen

Untersuchung getroffene Festlegung des Übergangs von der exsudativen Phase in die

proliferative. Im anschließenden Ausheilungsstadium erfolgte zwar eine Regression, der

Anteil proliferierender Zellen blieb jedoch auch noch nach dessen Ende an Tag 18 bis zum

Abschluss der Untersuchungen an Tag 29 auf doppeltem Niveau der Ausgangswerte. Daher

muss davon ausgegangen werden, dass über die lichtmikroskopisch festgestellte

Ausheilungsphase des Perillaketon- induzierten akuten Alveolarschadens hinaus eine

überkompensierende Defektheilung und / oder kompensierte reparative Prozesse ablaufen.

Wie in der Auswertung MAC 387-positiver Zellen festgestellt, findet sich keine gleichzeitige,

über die Ausheilungsphase hinaus fortgesetzte entzündliche Reaktion. Bei den beiden Tieren

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der niedrigeren Dosisgruppe waren licht- und elektronenmikroskopisch keine Veränderungen

im Sinne einer exsudativen Phase zu beobachten, es zeigte sich aber trotzdem von Tag 1 bis

Tag 7 eine Zunahme der Proliferationsrate durchschnittlich um den Faktor 3,8 verglichen mit

den Kontrollen, was auch hier für den Ablauf regenerativer Prozesse spricht. Der bei

mehreren Pferden in der exsudativen Phase beobachtete zeitlich begrenzte Abfall der

Zellproliferationsrate ist eine mögliche Folge der Behandlung mit Methylprednisolon.

Die Perillaketon- induzierte Zelluntergangsrate wurde durch terminal dUTP nick end labeling,

einem seit langem bekannten und gut etablierten Verfahren, als Anteil TUNEL-positiver

Zellen an der Gesamtzellzahl bestimmt. Mit dieser Methode ist zwar eine Differenzierung

zwischen Apoptose und Nekrose nicht möglich und nicht alle nekrotischen Zellen können

erfasst werden, jedoch ist sie für eine Abschätzung des Umfangs untergehender Zellen

durchaus geeignet. Elektronenmikroskopisch waren nur nekrotische Veränderungen von

Alveolarepithelzellen vom Typ I anzutreffen und typische Hinweise auf Apoptose fehlten.

Aufgrund des verhältnismäßig geringen Anteils der Zelluntergänge kann grundsätzlich jedoch

nicht ausgeschlossen werden, dass bei der ultrastrukturellen Auswertung Apoptosen nicht

erfasst wurden. Die stärksten Veränderungen fanden sich bei Pferd 3 und Pferd 5, die bereits

nach wenigen Tagen in moribundem Zustand euthanasiert werden mussten. Hier konnte ab

dem ersten Versuchstag eine signifikante Zunahme der Zelluntergangsrate festgestellt werden.

Diese vergleichsweise massiven Defekte können den moribunden Zustand der Tiere erklären.

Die übrigen Tiere dieser Gruppe zeigten keine erkennbaren Abweichungen, obwohl auch hier

die deutlich erhöhte AII-Proliferation auf die Regeneration von Epitheldefekten hinweist.

Auch in anderen Tierversuchen in denen Perillaketon zur Induktion eines akuten

Alveolarschadens eingesetzt wurde, konnten Untergänge von Alveolarepithelzellen vom Typ

I und Epitheldefekte beobachtet werden, dort jedoch bereits in den ersten Minuten bis zu zwei

Stunden (GARST et al., 1985; KERR et al., 1986; GUERRY-FORCE et al., 1988). Eine

mögliche Erklärung kann darin liegen, dass untergehende Epithelzellen vor ihrem Nachweis

bereits desquamiert und durch die Mechanismen der bronchioalveolären Clearance

abtransportiert wurden. Somit wäre auch bei den Pferden 3 und 5 nicht das volle Ausmaß von

Apoptose und Zellnekrose erfasst. Bemerkenswerterweise konnte auch bei den Tieren der

niedrigen Dosisgruppe, die die am wenigsten ausgeprägten morphologischen Veränderungen

aufwiesen, eine durchschnittliche Zunahme der Nekrose- und Apoptoserate von Tag 3 bis Tag

14 um 91 % gegenüber den Kontrollen beobachtet werden. Die Tatsache, dass dieser Prozess

erst etwa sieben Tage nach der Applikation von Perillaketon abläuft, macht einen

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Zusammenhang unwahrscheinlich. Bemerkenswerterweise geht jedoch dem Anstieg eine

Zunahme der Proliferationsrate voraus, so dass es sich um einen kompensatorischen Effekt zu

einem ablaufenden Gewebe-Remodeling handeln könnte. Pferd 1 mit der höheren

Zelluntergangsrate wies auch die höhere Zellproliferationsrate auf.

Betrachtet man die Rate granulohistiozytärer Infiltrate, gemessen am Anteil MAC 387-

positiver Zellen an der Gesamtzellzahl, so zeigte sich in der exsudativen Phase bei der Hälfte

der Tiere des Hauptversuchs bereits in den ersten 24 h nach der Applikation von Perillaketon

eine einsetzende entzündliche Reaktion, während sie bei den übrigen Pferden mit einem Tag

Verzögerung eintrat. Es folgte dann eine kontinuierliche Zunahme, bis in der proliferativen

Phase bei allen Pferden am 8. Tag das Maximum erreicht war, und in der anschließenden

Ausheilungsphase eine kontinuierliche Regression. Es zeigte sich somit ein nahezu paralleler

Verlauf der entzündlichen Reaktion zu den an der Zellproliferationsrate festgemachten

regenerativen Prozessen, mit der Ausnahme, dass die Entzündungsreaktion in der

Ausheilungsphase vollständig abklang, die Zellproliferationsrate jedoch weiterhin erkennbar

erhöht blieb. In der niedrigeren Dosisgruppe konnte nur bei Pferd 2 vom 1. bis zum 7. Tag

eine mäßige Infiltration mit Entzündungszellen festgestellt werden, die bereits an Tag 10

wieder auf das Ausgangsniveau zurückging. Eine geringgradige Zunahme von Lymphozyten

konnte lichtmikroskopisch lediglich in der proliferativen Phase beobachtet werden. Als

Ursache für den zeitlich begrenzten Abfall der Infiltrationsrate mit MAC-387-positiven Zellen

am Übergang von der exsudativen zur proliferativen Phase muss die Behandlung mit

Methylprednisolon in Betracht gezogen werden.

Um den Umfang möglicher fibrotischer oder erosiver Prozesse, die mit einer Zunahme bzw.

Verringerung des Gehalts der alveolären Septen an extrazellulärer Matrix einhergehen, genau

erfassen zu können, erfolgte die phasenanalytische Auswertung der in der Heidenhainschen

Azanfärbung dargestellten kollagenen und retikulären Fasern. Bei keinem der Tiere beider

Dosisgruppen konnten nach einem Beobachtungszeitraum von 29 Tagen signifikante

Änderungen im Sinne von Fibrose oder Erosion beobachtet werden. Da die

Zellproliferationsrate noch bis zum Ende des Beobachtungszeitraums um etwa das Doppelte

gegenüber den Ausgangswerten erhöht war und in der proliferativen Phase proliferierende,

interstitielle Zellen und aktive Fibroblasten nachweisbar waren, kann aufgrund dieser Befunde

davon ausgegangen werden, dass ablaufende reparative Prozesse kompensiert wurden.

Lediglich bei Pferd 8 zeigte sich ein leichter Trend zu einer verstärkten Akkumulation

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extrazellulärer Matrixproteine, jedoch lag der Anteil kollagener und retikulärer Fasern an den

alveolären Septen an Tag 29 mit 14,81 % nur unwesentlich über dem Kontrollwert von 12,48

%. Diese Ergebnisse, zusammen mit dem Rückgang der Infiltrationsrate MAC 387-positiver

Zellen bis Tag 15 und die lichtmikroskopische Beurteilung lymphozytärer Infiltrate schließen

die Entstehung einer chronisch persistierenden Entzündung und fibrotischer Prozesse bis Tag

29 aus. Im Vergleich dazu konnte in anderen Untersuchungen (ZAPOL et al., 1979;

COLLINS et al., 1984) drei Wochen nach erfolgtem DAD eine Zunahme des

Kollagengehaltes der Lunge um das Dreifache beobachtet werden. Die Ergebnisse der

vorliegenden Arbeit stehen auch in starkem Kontrast zu anderen Tiermodellen für toxisch

induzierte Lungenfibrose. Zum Beispiel wurden nach Bleomycin-bedingtem Alveolarschaden

bei Ratten erhebliche Zunahmen an kollagenen Fasern innerhalb von 7 (OKUDELA et al.,

1999) bzw. 14 Tagen (LAXER et al., 1999) beobachtet. Signifikante Ablagerungen an

extrazellulären Matrixproteinen fanden sich auch binnen 14 Tagen bei Paraquat- induzierten

Lungenschäden in Mäusen (HEMMATI et al., 2002). Auch in den Biopsieproben, die mit

Ausnahme der Pferde 3 und 5 noch bis acht Wochen nach Versuchsbeginn entnommen

wurden, konnten am HE-gefärbten Paraffinschnitt und am Semidünnschnitt keine Hinweise

auf chronisch entzündliche oder fibrotische Prozesse gefunden werden. Bei der

pathohistologischen Untersuchung einer der beiden explantierten Lungen der Pferde 1, 2, 4, 6,

7 und 8 fanden sich ebenfalls keine Anzeichen für Lungenfibrose.

Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die Ergebnisse der morphometrischen

Untersuchungen die licht- und elektronenmikroskopischen Befunde bestätigen. Jedoch zeigte

sich bei der Auswertung der immunhistochemischen Darstellung von Ki-67 auch noch 11

Tage nach Ende der Ausheilungsphase eine erhöhte Zellproliferationsrate, die auf noch

ablaufende regenerative und / oder reparative Prozesse hindeutet. Fibrotische Veränderungen

konnten zusätzlich anhand der phasenanalytischen Auswertung der Heidenhainschen

Azanfärbung ausgeschlossen werden.

Um eine spezifische, quantitative Aussage über den zeitlichen Verlauf der Expressionsraten

der mRNA von IL-1ß, TGF-ß, Prokollagen a1(I) und a1(III) in den Lungenbiopsieproben

machen zu können, wurde die Reverse Transkriptase-quantitative Polymerasekettenreaktion

(RT-qPCR) im real-time-Modus etabliert. Diese relativ neue Untersuchungsmethode wurde

von GIBSON et al. (1996) entwickelt und kombiniert die Amplifikation, Detektion und

Quantifizierung von Nukleinsäuren in einem Reaktionsansatz. Allgemein zählen zu den

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131

Vorzügen dieser Methode ihre hohe Spezifität, Sensitivität und Reproduzierbarkeit der Daten,

die durch ausgewählte Primer- und Sondenkombinationen erzielt werden. Zusätzlich zu den

Primerpaaren, die als Begrenzung des Amplikons einen wichtigen Beitrag zur Spezifität und

Sensitivität liefern, werden diese noch durch die Verwendung einer Oligonukleotidsonde

erhöht, die während der Anlagerungs- und Extensionsphase der PCR an das Amplikon

hybridisiert (BUSTIN, 2000). Für die RT-qPCR in dieser Arbeit wurde wegen der Stabilität

bei hohen Temperaturen ein so genanntes TaqMan-Assay, bestehend aus Taq-Polymerase und

TaqMan-Sonden, verwendet. Die etablierte Methode erlaubte einen hochsensitiven und

hochspezifischen Nachweis bei gleichzeitiger Quantifizierung der Expression der zu

untersuchenden mRNA-Spezies. Bei der Messung der Gewebeproben konnten bei keiner

mRNA-Spezies pro Reaktion weniger als 105 Kopien festgestellt werden und die

Standardabweichungen lagen, bezogen auf die Werte der gemessenen Triplikate, immer unter

1. Im Gegensatz zur Standard RT-PCR, wo die kleinste nachweisbare Kopienzahl theoretisch

eine Kopie beträgt (WANG u. BROWN, 1999), kann in der RT-qPCR diese Sensitivität in der

Regel nicht erzielt werden (BUSTIN, 2000). Um sicherzustellen, dass eine Amplifikation von

kontaminierender, genomischer DNA und somit eine Verfälschung der Messergebnisse

ausgeschlossen war, wurde die isolierte mRNA einem DNase-Verdau unterzogen.

Als Kriterium für die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse kann der Variationskoeffizient

zwischen zwei identischen Messdurchgängen herangezogen werden. Die cDNA der

Lungenbiopsieproben wurde in zwei Messdurchgängen jeweils in Form von Triplikaten

untersucht. Dabei lag der Variationskoeffizient innerhalb und zwischen den Läufen innerhalb

der von BUSTIN (2000) empfohlenen Grenzen von 0 und 5 %. Zur Standardisierung der

Messdaten wurde außerdem die cDNA des Housekeeping-Gens EF-1a in allen Proben über

die Bestimmung der entsprechenden Ct-Werte ermittelt. EF-1a wird in allen Zell- und

Gewebetypen mit konstanter Kopienzahl exprimiert und eignet sich daher als universelle

Referenz-mRNA-Spezies (GRUBER u. LEVINE, 1997). In diesem Zusammenhang wurde in

der vorliegenden Arbeit die cDNA-Sequenz des equinen EF-1a erstmalig bestimmt. Damit

konnten Variationen der eingesetzten mRNA-Mengen, unterschiedliche Effektivitäten der

Reversen Transkription sowie die Wirkungen eventueller Polymerase-Inhibitoren (z. B.

Glykogen, Hämoglobinbestandteile) in den Proben ausgeglichen werden. Um die EF-1a

Expression in den Bioptaten in Kopienzahlen ausdrücken zu können, wurde ebenso wie für

IL-1ß, TGF-ß, Prokollagen a1(I) und a1(III) je eine Standardkurve erstellt. Diese

Standardkurven wurden trotz der hohen Reproduzierbarkeit der Messergebnisse in jedem

Durchgang bestimmt. Die daraus errechnete Regressionskurve diente als Korrektur für die

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Werte der untersuchten mRNA-Spezies, die für die Evaluierung der Expressionsraten als

Quotient pro jeweiliger Kopienzahl von EF-1a angegeben wurden. Bei der Interpretation der

gewonnen Ergebnisse muss in Betracht gezogen werden, dass auch bei EF-1a trotz seiner sehr

konstanten Genexpressionrate in gewissem Umfang mit einer Hochregulierung zu rechnen ist.

Es besteht also grundsätzlich die Möglichkeit, dass die tatsächliche Expression der

bestimmten mRNA-Spezies über der gemessenen liegt.

Zusammenfassend kann gesagt werden, dass im Rahmen dieser Arbeit ein präzises

quantitatives und gleichzeitig hochsensitives sowie hochspezifisches Nachweisverfahren für

die mRNA von IL-1ß, TGF-ß, Prokollagen a1(I) und a1(III), ausgehend von

Minimalbiopsieproben, etabliert werden konnte. Als Nachteil des Verfahrens der RT-qPCR

ist jedoch der relativ hohe Kostenaufwand zu nennen. Die Kosten setzen sich im

Wesentlichen aus der Anschaffung eines spektrofluorimetrischen Thermocyclers mit

dazugehöriger, erforderlicher PC-Hard- und Software, aus benötigten speziellen Reaktionskits

und den Fluorophor-markierten Oligonukleotidsonden zusammen. Weiterhin ist die

aufwendige Etablierung jedes Nachweisverfahrens für die einzelnen mRNA-Spezies zu

nennen.

Bei den eigenen RT-qPCR-Untersuchungen zeigten die Versuchspferde hinsichtlich der

Expression des multifunktionalen Cytokins IL-1ß sehr heterogene Reaktionen. Bei den

Pferden 1 und 2 aus dem Vorversuch war ein Anstieg der IL-1ß-Expression von Tag 10 bis 14

erkennbar, der zeitlich mit dem Verlauf der Zelluntergangsrate zusammenfiel. Der von

GOLDBLUM et al. (1988) beobachtete Effekt von IL-1ß, Endothelzellschäden hervorzurufen,

kann hiermit in Zusammenhang stehen. Auch bei Pferd 4 aus dem Hauptversuch zeigte sich

eine Zunahme von Tag 8 bis Tag 22 um das Doppelte gegenüber dem Kontrollwert. Trotz der

von IL-1ß beschriebenen Eigenschaften, Entzündungszellen zu rekrutieren und zu aktivieren

(MIZEL et al., 1981; WARD, 1997), an der Entstehung von Defekten von

Alveolarepithelzellen beteiligt zu sein und gleichzeitig aber auch bei der Regeneration von

Lungenschäden eine Rolle zu spielen (GOLDBLUM et al., 1988; GEISER et al., 2001),

konnte hier im Hauptversuch beim Vergleich mit den pathomorphologischen Befunden, der

Zellproliferationsrate, der Infiltrationsrate MAC 387-positiver Zellen oder der im TUNEL-

Assay bestimmten Zelluntergangsrate kein zeitlicher Zusammenhang festgestellt werden.

BAUER et al. (2000) und MIKUNIYA et al. (2000) vermuteten, dass die Bestimmung von

IL-1ß aus bronchioalveolärer Lavageflüssigkeit auf Proteinebene mit dem Ausmaß von

Lungenschäden korreliert oder sich als potenzieller prognostischer Faktor, z. B. bei

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133

Sarcoidosis des Menschen, eignet. Diese Annahmen konnten im vorliegenden Modell der

interstitiellen Pneumonie des Pferdes nicht auf die Expressionsrate von IL-1ß übertragen

werden.

Ebenfalls zeigten die Tiere bei der Bestimmung der Expressionsrate des Cytokins TGF-ß, das

allgemein als einer der wichtigsten Promotoren fibrotischer Veränderungen angesehen wird

(GIRI et al., 1993; BIENKOWSKI u. GOTKIN, 1995), ein interindividuell unterschiedliches

Verhalten. Nur bei den Pferden 4 und 7 der höheren Dosisgruppe und bemerkenswerterweise

bei den Pferden 1 und 2 der niedrigen Dosisgruppe konnten auffällige Änderungen beobachtet

werden. Der Beginn der hochregulierten TGF-ß-Expression war bei diesen vier Tieren sehr

unterschiedlich und lag zwischen Tag 3 (Pferd 1) und Tag 11 (Pferd 4). KAMINSKI et al.

(2000) konnten im Vergleich dazu im Tiermodell der Maus für Lungenfibrose nach 48 h

TGF-ß-bedingte Effekte feststellen. Bei den Pferden 4 und 7 erstreckte sich die verstärkte

TGF-ß-Expression über die proliferative Phase bis zum Ende der Ausheilungsphase, was

darauf hinweisen kann, dass hier, wie von HOWE et al. (1990) und SHULL et al. (1992)

beschrieben, ein Zusammenhang mit dem Ablauf regenerativer oder antiinflammatorischer

Prozesse bestehen könnte. Allerdings lag bei beiden Tieren bereits vor dem Anstieg von TGF-

ß eine verstärkte Zellproliferation vor, die noch nach dem Rückgang der TGF-ß-Expression

erhöht blieb. Auch eine signifikante Steigerung der Expression durch granulohistiozytäre

Infiltrate, wie von YAMAMURA et al. (1991) beschrieben, ist nicht nachweisbar. Jedoch sind

nach HOWE et al. (1990) auch ortsständige, epitheliale und mesenchymale Zellen in der

Lage, TGF-ß zu bilden. Nach Untersuchungen zahlreicher Autoren (ROBERTS et al., 1986;

IGNOTZ u. MASSAGUE, 1986; VARGA et al., 1986) stellt TGF-ß den stärksten bekannten

Stimulus der Kollagensynthese dar und fördert die Expression von COL1A1 und COL3A1

(ROSSI et al., 1988; RITZENTHALER et al., 1993). Die Pferde 4 und 7 wiesen als einzige

Tiere dieser Gruppe eine signifikante Zunahme der TGF-ß-Genexpression auf und zeigten

auch die größten Maximalwerte der Prokollagen a1(I)- und a1(III)-Expression. Darüber

hinaus lagen unabhängig von der Genexpression von TGF-ß bei diesen beiden Tieren in der

exsudativen Phase und auch noch nach Ende der Ausheilungsphase erhöhte

Genexpressionsraten von Prokollagen a1(I) und a1(III) vor. Bei den Pferden 3, 4, 5, 6 und 8

zeigte sich in allen Stadien eine Zunahme der Prokollagenexpressionen ohne nachweisbar

hochregulierte TGF-ß-Expression. Auch FINE et al. (1990) konnte in vitro keine positiven

Effekte von TGF-ß auf die Expression von COL1A2 an embryonalen, humanen Fibroblasten

feststellen. Im Gegensatz dazu beobachteten KELLEY et al. (1985) und HOYT und LAZO

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134

(1988) an Mäusen mit Bleomycin- induzierter Lungenfibrose eine maximale TGF-ß-

Expression zum Zeitpunkt der maximalen Kollagensynthese. Bei der Interpretation der

Ergebnisse muss in Betracht gezogen werden, dass die Aktivität von TGF-ß auch in

erheblichem Maße posttranslational reguliert wird. Nach MUNGER et al. (1999) und PITTET

et al. (2001) existieren große Mengen an latentem TGF-ß-Protein, die z. B. durch Integrin

avβ6 lokal aktiviert werden können. Eine Steigerung der TGF-ß-Aktivität ist somit

unabhängig von einer verstärkten Genexpression möglich. Die Feststellung verschiedener

Autoren, dass TGF-ß großen Anteil an der Pathogenese verschiedener akuter und chronischer

Lungenerkrankungen besitzt (DENIS u. GHADIRIAN, 1992; MORELAND et al., 1992;

XING et al., 1992; KHALIL et al., 1996; KOTECHA et al., 1996; MAGNAN et al., 1996;

BÜHLING et al., 1999), kann aufgrund der Ergebnisse für den vorliegenden Fall allenfalls

nur partiell für seine Genexpression vermutet werden. Eine Eignung der Genexpressionsrate

von TGF-ß als potenzieller prognostischer Marker für interstitielle Lungenerkrankungen war

allein aufgrund der interindividuell sehr heterogenen Reaktionen hier nicht ersichtlich.

Grundsätzlich ist im vorliegenden Modell aufgrund der Ergebnisse der pathohistologischen

Untersuchungen und der Bestimmung des Anteils der extrazellulären Matrix an den

alveolären Septen davon auszugehen, dass mögliche profibrotische Wirkungen von TGF-ß

kompensiert wurden.

Die Tatsache, dass in den licht- und elektronenmikroskopischen Untersuchungen sowie in der

morphometrischen Auswertung der Heidenhainschen Azanfärbung keine Hinweise auf die

Ausbildung fibrotischer Veränderungen festgestellt werden konnten, steht in Kontrast zu den

Ergebnissen der Expressionsstudien bezüglich der Prokollagengene COL1AI und COL3AI.

Durch die in der vorliegenden Arbeit durchgeführte RT-qPCR konnte in der hohen

Dosisgruppe bereits 24 h nach der Erzeugung eines Perillaketon- induzierten akuten

Alveolarschadens ein deutlicher Anstieg der Genexpression sowohl von Prokollagen a1(I) als

auch von Prokollagen a1(III) festgestellt werden. Damit vergleichbar berichten

DEHEINZELIN et al. (1997) von einer frühzeitigen Hochregulierung von Kollagen Typ I-

mRNA-Spezies bei Patienten mit ARDS. Im Gegensatz zur sehr heterogenen Reaktion, wie

sie für IL-1ß und TGF-ß festgestellt wurde, zeigte sich hier bei fast allen Tieren dieser Gruppe

eine ähnliche Entwicklung. Die Ergebnisse stehen im Einklang mit bereits existierenden

Veröffentlichungen über Parameter der Kollagensynthese als mögliche diagnostische und

prognostische Faktoren in der Frühphase beim ARDS des Menschen. Gut untersucht sind in

diesem Zusammenhang vor allem das N-terminale Propeptid von Prokollagen Typ III und das

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135

C-terminale Propeptid von Prokollagen Typ I in bronchioalveolärer Lavageflüssigkeit oder

Trachealaspiraten (WAYDHAS et al., 1993; CLARK et al., 1995; ASHA et al., 1997;

MEDURI et al., 1998), deren Konzentrationen bereits sehr früh innerhalb von 24 h ansteigen

und auf eine verstärkte Kollagensynthese hinweisen. Entsprechend zeigte sich im

vorliegenden Versuch ein Anstieg der durchschnittlichen Expressionsrate von Prokollagen

a1(III) während der exsudativen Phase, die in der proliferativen Phase an Tag 11 ihr

Maximum erreichte. Parallel dazu, mit einem gut erkennbar um mehrere Tage verzögert

erreichtem Maximalwert, erfolgt die Zunahme von Prokollagen a1(I). Hier finden sich die

Höchstwerte erst an den Tagen 15 und 18, also gegen Ende der Ausheilungsphase. Auch

VUORIO et al. (1989) konnten nach der Inhalation von Silikatstäuben an Ratten einen

Anstieg des mRNA-Levels in der Lunge von Kollagen Typ III vor Kollagen Typ I

beobachten. In den eigenen Untersuchungen erfolgte nach Erreichen des Maximums wieder

eine Regression, jedoch blieben die Werte bis zum Ende des Untersuchungszeitraumes von 29

Tagen deutlich über dem Ausgangsniveau.

Der bei mehreren Pferden während der exsudativen Phase oder am Übergang zur

proliferativen Phase beobachtete zeitlich begrenzte Abfall der Genexpression ist

möglicherweise als eine Folge der Behandlung mit Methylprednisolon anzusehen.

Bemerkenswert ist, dass bei der morphometrischen Auswertung der Heidenhainschen

Azanfärbung zu keinem Zeitpunkt eine signifikante Steigerung des extrazellulären

Matrixanteils der Alveolarsepten zu beobachten war. Es ist also davon auszugehen, dass die

verstärkte Genexpression von Prokollagen a1(I) und a1(III) durch nachgeschaltete

Mechanismen im multiregulierten Kollagenstoffwechselweg kompensiert wurde. Die

durchschnittliche Genexpression von Prokollagen a1(III) verlief in der hohen Dosisgruppe

während der exsudativen Phase bis zum Ausheilungsstadium in etwa parallel zur

Zellproliferationsrate, wobei die Tiere mit der höchsten Zellproliferationsrate in der Regel

auch die höchsten Werte für Prokollagen a1(III) aufwiesen. Einige Tage dazu verzögert

verlief die Entwicklung der Prokollagen a1(I)-Genexpression. Auch die Zellproliferationsrate

blieb nach Erreichen ihres Höchstwertes bis zum Ende der Untersuchungen über dem

Ausgangsniveau. Nur zu Anfang verhielten sich die Durchschnittswerte der Infiltrationsrate

MAC 387-positiver Zellen, die durch die Ausschüttung von Entzündungsmediatoren und

Cytokinen die Kollagensynthese stimulieren können, wie die Expressionen der gemessenen

Prokollagengene. Der Anteil granulohistiozytärer Infiltrate fiel jedoch im Ausheilungsstadium

auf den Ausgangslevel zurück, so dass sich die weiterhin erhöhten mRNA-Level von

Prokollagen a1(I) und a1(III) nicht durch eine entzündliche Reaktion erklären ließen. Eine

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136

geringgradige Zunahme lymphozytärer Infiltrate konnte lichtmikroskopisch nur in der

proliferativen Phase beobachtet werden.

Zusammengefasst ist also davon auszugehen, dass die Genexpressionen von Prokollagen

a1(I) und a1(III) innerhalb von 24 h nach der Induktion eines akuten Alveolarschaden durch

Perillaketon hochreguliert wird. Darüber hinaus erfolgte noch nach Ende der

Ausheilungsphase eine kompensie rte Überexpression dieser Prokollagengene. Die Tatsache,

dass die Genexpressionen von Prokollagen a1(I) und a1(III) bei allen Tieren die

pathohistologische Veränderungen und klinische Symptome im Sinne einer interstitiellen

Pneumonie aufwiesen, bereits unmittelbar nach der Induktion hochreguliert wurde, ist eine

Eigenschaft, wie sie von einem potenziellen prognostischen Marker erwartet wird.

Grundsätzlich stellen jedoch aufgrund der vorliegenden Ergebnisse die Expressionen von

Prokollagen a1(I) und a1(III) keine aussichtsreichen Kandidaten als prognostische Faktoren

für interstitielle Lungenerkrankungen dar. Unter welchen Bedingungen und ab welchem

Ausmaß eine verstärke Expression zur Lungenfibrose führt, konnte in der vorliegenden Arbeit

nicht geklärt werden. Ihre Eignung die Tendenz zur Entstehung chronisch-persistierender

Veränderungen beurteilen zu können, muss nach diesen grundsätzlichen, sondierenden

Versuchen in umfangreicheren klinischen Studien abgeklärt werden. Es kann jedoch gesagt

werden, dass eine deutliche Hochregulation der Genexpressionen von Prokollagen a1(I) und

Prokollagen a1(III) innerhalb des Beobachtungszeitraumes von 29 Tagen und auch bis zur

erfolgten Sektion nach acht Wochen aufgrund hier nicht geklärter gegenregulatorischer

Mechanismen im multiregulierten Stoffwechselweg nicht zur Entstehung einer Lungenfibrose

führen muss. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass im Rahmen einer interstitiellen

Pneumonie neben einer verstärkten Genexpression von Prokollagenen noch weitere Faktoren

vorhanden sein müssen um zu einer Lungenfibrose zu führen.

Bei der Beurteilung des klinischen Verlaufs anhand des von Frau Dr. Venner erhobenen

klinischen Scores, zeigte sich bis zum 5. Tag nach der Applikation von Perillaketon eine

Zunahme des Ausmaßes der klinischen Symptome. Der zu Beginn der proliferativen Phase

erreichte Maximalwert von durchschnittlich 8,5 Scorepunkten sprach dabei für das Vorliegen

einer hochgradigen, lebensbedrohenden Lungenerkrankung. Bis zum 15. Tag erfolgte eine

steige Abnahme bis zu einer mittleren Scorepunktzahl von 1 und die Pferde waren somit als

klinisch gesund zu beurteilen. Die Tatsache, dass die stärksten klinischen Erscheinungen drei

Tage vor den ausgeprägtesten histomorphologischen Veränderungen auftraten, kann damit in

Zusammenhang stehen, dass bei der transkutanen Biopsieentnahme nicht von allen Bereichen

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137

der Lunge Gewebe gewonnen werden konnte. Ein unterschiedliches Ausmaß und ein

unterschiedlicher zeitlicher Verlauf der Alterationen in verschiedenen Lungenabschnitten

müssen als Ursache diskutiert werden. Diese Tatsache muss auch bei der Verwendung von

transkutan gewonnenen Lungenbiopsieproben in der klinischen Diagnostik berücksichtigt

werden. Wie elektronenmikroskopisch und in der immunhistochemischen Markierung von

Ki-67 dargestellt, tragen proliferierende Zellen vor allem in der proliferativen Phase erheblich

zur Verbreiterung der Blut-Luft-Schranke bei. Dennoch zeigen sich im Vergleich des

klinischen Scores mit den Ergebnissen der computergestützten, morphometrischen Analyse

erstaunlicherweise größere Parallelen zur Rate granulohistiozytärer Infiltrate als zur

Zellproliferationsrate. Die Frage die dadurch aufgeworfen wird, welchen genauen Anteil

entzündliche Infiltrate und proliferierende Zellen jeweils an der Entstehung der klinischen

Symptomatik besitzen, kann möglicherweise Einfluss auf eine Therapie der interstitiellen

Pneumonie in der proliferativen Phase besitzen. Zu deren Klärung wären weitere

Untersuchungen an einem umfangreicheren Patientengut erforderlich.

Insgesamt kann gesagt werden, dass durch die einmalige intravenöse Applikation von 6 mg /

kg KG Perillaketon, wobei die Dosis auf zwei Injektionen im Abstand von 30 min verteilt

wurde, das pathomorphologische Bild einer interstitiellen Pneumonie bis zu ihrer Ausheilung

erzeugt werden konnte. Bei der Verwendung Perillaketon- induzierter Lungenveränderungen

als Modell muss jedoch mit in Betracht gezogen werden, dass die Substanz in der benötigten

Dosierung große Nebenwirkungen besitzt. Zwei Pferde mussten bereits deutlich vor Ablauf

des festgesetzten Untersuchungszeitraums euthanasiert werden und die übrigen Tiere wurden

als lebenserhaltende Maßnahme über einen Zeitraum von 48 h mit Methylprednisolon und

Furosemid behandelt. Insbesondere die Anwendung steroidaler Antiphlogistika kann Einfluss

auf den Krankheitsverlauf nehmen und muss bei der Interpretation der Ergebnisse

einschränkend berücksichtigt werden. Wegen der immunsuppressiven Eigenschaften ist mit

einer Dämpfung der entzündlichen Reaktion zu rechnen, zudem ist auch die Hemmung der

Synthese von extrazellulären Matrixproteinen in Betracht zu ziehen. Es ist nicht

auszuschließen, dass im vorliegenden Versuch die Ausbildung einer chronisch-persistierenden

Entzündung oder fibrotischer Veränderungen unterdrückt wurde, obwohl aufgrund der

Ergebnisse der morphometrischen Untersuchungen und der Reverse Transkriptase-

quantitativen Polymerasekettenreaktion sowie der Kürze der Behandlungsdauer mit hoher

Wahrscheinlichkeit von einem zeitlich auf wenige Tage begrenzten Effekt auszugehen ist. Ein

weiterer Aspekt ist die interindividuelle Variabilität der Reaktion auf Perillaketon, wie sie

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138

auch bei Versuchen an Schafen beschrieben wurde (COGGESHALL et al., 1987). Mit

Ausnahme von Pferd 3 und Pferd 5 wurden für die vorliegende Untersuchung pro Tier über

die Untersuchungsdauer von 29 Tagen in regelmäßigen Abständen insgesamt 36

Lungenbiopsieproben transkutan entnommen. An den Gewebeproben der Pferde 1 und 2 aus

dem Vorversuch konnte nach dem Abklingen der durch Perillaketon- induzierten

Veränderungen im Vergleich zu den Kontrollproben keine abweichenden Befunde mehr

erhoben werden, obwohl weiterhin Bioptate entnommen wurden. Auch die

Zellproliferationsrate, die Zelluntergangsrate und der Anteil an Entzündungszellen

normalisierten sich bei weiterhin erfolgter Probenentnahme. Trotz dieser hohen Zahl an

Eingriffen an der Lunge kann also davon ausgegangen werden, dass sie keinen erkennbaren

Einfluss auf die Versuchsergebnisse besitzen. Grundsätzlich ist also das neu etablierte

Tiermodell des Pferdes geeignet, verschiedenste Fragestellungen in Zusammenhang mit

interstitiellen Lungenerkrankungen des Pferdes auch in Zukunft zu bearbeiten.

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6 Zusammenfassung

Morphologische Charakterisierung und molekulare Pathogenese Perillaketon-induzierter

Lungenveränderungen beim Pferd als Modell für die interstitielle Pneumonie

Stefan Schmidbauer

Um einen Beitrag zu einem besseren Verständnis der Pathogenese interstitieller Lungener-

krankungen zu leisten, wurden im Rahmen dieser Arbeit über einen Zeitraum von vier Wo-chen

transkutan entnommene Lungenbiopsieproben von sechs ausgewachsenen Pferden un-tersucht.

Bei den Tieren sollte durch die einmalige intravenöse Applikation von Perillaketon (1-(3-furyl) 4-

Methylpentaton) über einen akuten, diffusen Alveolarschaden eine interstitielle Pneumonie

induziert werden. Die morphologischen Veränderungen wurden auf licht- und

elektronenmikroskopischer Ebene untersucht. Als wesentliche Parameter zur Charakterisie-rung

des Krankheitsverlaufs wurden die Zellproliferations- und die Zelluntergangsrate, die Rate

granulohistiozytärer Infiltrate und der Anteil kollagener und retikulärer Fasern an den alveolären

Septen durch computergestützte, morphometrische Analyse ermittelt. Aufgrund ihrer gr oßen

Bedeutung bei akuten und chronischen Lungenerkrankungen und ihre mögliche Eignung als

prognostische Faktoren quoad vitam und quoad valitudinem, erfolgte darüber hinaus die

Bestimmung der Expressionsraten des Transforming Growth Factor-ß (TGF-ß), von Interleukin-

1ß (IL-1ß), Prokollagen a1(I) (COL1A1) und Prokollagen a1(III) (COL3A1). Mit der Reverse

Transkriptase-quantitativen Polymerasekettenreaktion (RT-qPCR) stand hie rfür eine

hochsensitive und -spezifische Untersuchungsmethode zur Verfügung, die für

Genexpressionsstudien anhand von Minimalbiopsieproben geeignet war.

Es wurden folgende Ergebnisse erzielt:

1. Durch die einmalige intravenöse Applikation von 6 mg Perillaketon / kg KG konnten bei

sechs Pferden Veränderungen induziert werden, wie sie für die exsudative (Tag 1 – 4), die

proliferative (Tag 4 – 11) und die Ausheilungsphase (Tag 11 – 18) der interstitiellen

Pneumonie beschrieben sind. Von der exsudativen Phase bis in die proliferative Phase

konnten in unterschiedlichem Umfang epi- und endotheliale Defekte der alveolä ren Septen

mit geringgradiger Exsudation in die Alveolarlumina beobachtet werden. Die

Zellproliferationsrate als Ausdruck regenerativer und reparativer Prozesse stieg ab dem 1.

Versuchstag deutlich an und erreichte an Tag 8 ihren Maximalwert. Nach einem

Rückgang war auch 11 Tage nach Ende der Ausheilungsphase noch eine verstärkte

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140

Zellproliferation feststellbar. Die Rate granulohistiozytärer Infiltrate stieg ebenfalls von

Tag 1 bis zu ihrem Maximum an Tag 8 an. Im Anschluss erfolgte eine Regression auf das

Ausgangsniveau bis Tag 15. Lediglich in der proliferativen Phase lag lichtmikroskopisch

feststellbar eine geringgradige Zunahme lymphozytärer Infiltrate vor. Bei zwei Tieren, die

aufgrund der Perillaketon-induzierten Lungenveränderungen in moribundem Zustand

euthanasiert werden mussten, zeigte sich unmitte lbar ante mortem ein deutlicher Anstieg

der Zelluntergangsrate.

2. Bei allen Tieren, die Veränderungen wie bei interstitieller Pneumonie aufwiesen, konnte

bereits nach 24 h in der exsudativen Phase eine Hochregulierung der Expression von

COL1A1 und COL3A1 beobachtet werden, die bis zum Abschluss des

Beobachtungszeitraums am 11. Tag nach Ende der lichtmikroskopisch festgestellten

Ausheilungsphase noch anhielt. Eine signifikante Zunahme extrazellulärer

Matrixbestandteile an den alveolären Septen oder morphologische Korrelate von

Lungenfibrose konnten im Beobachtungszeitraum von 29 Tagen nicht nachgewiesen

werden. Grundsätzlich ist aus diesen Ergebnissen zu schließen, dass eine deutliche

Hochregulierung von Prokollagen a1(I) und Prokollagen a1(III) bei Perillaketon-

induzierter interstitie ller Pneumonie nicht zu Entstehung von Lungenfibrose führen muss.

Als Ursache sind hier ungeklärte gegenregulatorische Mechanismen im multiregulierten

Stoffwechselweg anzunehmen. Die Eignung der Genexpressionsraten von COL1A1 und

COL3A1 als prognostische Faktoren für Lungenfibrose nach interstitieller Pneumonie ist

aufgrund der gewonnenen Ergebnisse fraglich. Unter welchen Bedingungen und ab

welchem Ausmaß eine verstärke Expression beim Pferd zur Lungenfibrose führt, konnte

in der vorliegenden Arbeit nicht geklärt werden. Hierfür sind nach diesen grundsätzlichen,

sondierenden Versuchen umfangreichere, klinische Studien erforderlich.

3. Bei je zwei Pferden mit pathomorphologischen Veränderungen wie bei interstitieller

Pneumonie konnte eine Hochregulierung der TGF-ß-Expression und der IL-1ß-Expression

beobachtet werden. Diese verstärkte Expression führte bei den betroffenen Tieren jedoch

nicht zu messbarer Fibrose.

In der vorliegende n Arbeit wurden erstmals umfangreiche und zusammenhängende

Untersuchungen in allen Stadien der interstitiellen Pneumonie beim Pferd bis zur Ausheilung

durchgeführt. Die Kombination der transkutanen Entnahmetechnik intra vitam, umfangreicher

morphologischer und morphometrischer Untersuchungen sowie der RT-qPCR an

Minimalbiopsieproben der Lunge des Pferdes stellt eine methodische Innovation dar, die

Modellcharakter für zukünftige molekularpathologische Studien am lebenden Tier haben kann.

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7 Summary

Morphological characterization and molecular pathology of perilla-mint ketone induced acute

alveolar damage in horses as a model for interstitial pneumonia

Stefan Schmidbauer

In order to gain a better understanding upon the pathogenesis of interstitial lung diseases

transcutaneous lung biopsies of six adult horses were examined. In order to induce interstitial

pneumonia these horses received once 6 mg perilla ketone (1-(3-furyl) 4 –methylpentatone)

per kg body weight intravenously. The results of the lung biopsies were examined over a

period of four weeks post application (post appl.). The morphological changes were

investigated by light- and transmission electron microscopy. As parameters for the disease

follow-up, the cellular proliferation rate, cell death rate, rate of granulo-histiocyte infiltration

and the percentage of collagenous and reticular fibers were evaluated by computer aided

morphometric analysis. Because these factors are commonly accepted to play an important

role in acute and chronic lung diseases, the expression rates of transforming growth factor-ß

(TGF-ß), interleukin –1ß (IL-1ß), procollagen α1(1) (COL1A1) and procollagen α1(III)

(COL3A1) were analyzed.. The reverse transcriptase quantitative polymerase chain reaction

(RT-qPCR) were used as a highly sensitive and specific method for studying these gene

expressions.

The following results were obtained:

1. Following intravenous application of 6 mg perilla ketone per kg body weight six

horses developed changes typical for the exsudative (day 1 – 4), proliferative (day

4 – 11) and healing phase (day 11 – 18) of interstitial pneumonia. In the

exsudative phase and in the proliferative phase an epithelial and endothelial

damage of the alveolar septa in varying degree and low grade exsudation were

observed. The cellular proliferation rate, as a marker for regenerative and

reparative processes, significantly increased beginning on the first day of

examination and reached a maximum value on day eight post appl.. After

regression, eleven days after the end of the healing phase, an increased cellular

proliferation was still detectable. The granulo-histiocyte infiltration also increased

from day one post appl. and reached a maximum value at day eight. Afterwards a

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142

decrease to the control level till day 15 occurred. Light microscopically, a low

grade lymphocyte infiltration was seen in the fibriproliferative phase. In two

moribund horses, that had to be euthanized because of the perilla ketone induced

changes a significant increase of the cell death rate was detected.

2. In all animals with induced interstitial pneumonia an upregulation of COL1A1

and COL3A1 was observed after the first 24 hours of the exsudative phase, lasting

till day eleven post appl. after the end of the light microscopic evaluated healing

phase, not leading to morphological changes of any lung fibrosis. It can be

concluded that in perilla keton induced interstitial pneumonia an overexpression

of procollagen α1(1) and procollagen α1(III) in between the observation period of

29 days must not lead to lung fibrosis. This must be due to antiregulatory

mechanisms in the multiregulated metabolic pathway of collagene. It remains

unclear, if the gene expression rates of COL1A1 and COL3A1 will serve as

valuable markers for the prognostic factors of lung fibrosis after interstitial

pneumonia. The conditions under which an upregulated expression leads to a lung

fibrosis in the horse were not evaluated. More basic clinical studies are necessary

to deal with this specific problem.

3. TGF-ß and IL-1ß upregulation was observed in two horses each, respectively.

These increased expressions did not lead to detectable lung fibrosis.

This work constitutes the first extensive and coherent study dealing with all stages of

interstitial pneumonia in the horse until the healing phase. The combination of transcutaneous

biopsy, extensive morphologic and morphometric analysis in combination with the reverse

transcriptase polymerase chain reaction in minimal biopsies constitutes a methodic innovation

with possible model character for future molecular pathological studies in living animals.

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205

9 Anhänge

9.1 Ergebnisse der morphometrischen Untersuchungen (Rohdaten)

Tabelle 11: Ergebnisse der morphometrischen Bestimmung der Zellproliferationsrate anhand

der immunhistochemischen Markierung von Ki-67 (Pferd 1 – 4)

Pferd 1 Pferd 2

Versuchstag x Ki-67-pos. Zellen (%) s x Ki-67-pos. Zellen (%) s

x Kontrolle 0,8 0,6 1,3 00,3

1 0,7 0,4 1,6 00,3

3 4,2 2,2 2,8 01,6

7 4,8 1,8 3,6 00,3

10 1,2 0,9 2,0 01,5

14 1,0 0,8 1,8 01,3

17 0,6 0,0 2,3 01,5

21 0,7 0,3 0,3 00,1

24 0,2 0,1 0,8 00,7

28 0,6 0,5 0,2 00,2

Pferd 3 Pferd 4

Versuchstag x Ki-67-pos. Zellen (%) s x Ki-67-pos. Zellen (%) s

x Kontrolle 00,7 0,5 01,9 13,0

1 02,6 1,9 18,4 09,4

4 04,0 0,7 08,7 02,3

8 15,8 5,2 21,3 12,4

11 * * 18,1 12,9

15 05,1 02,4

18 05,8 02,0

22 03,6 05,0

25 05,8 02,4

29 02,5 03,4

x Ki-67-pos. Zellen = arithmetisches Mittel des Anteils Ki-67-positiver Zellen an der Gesamtzellzahl aller

Biopsielokalisationen eines Entnahmetages; x Kontrolle = arithmetisches Mittel der Werte aller

Kontrolleproben; s = Standardabweichung

* Pferd 3 wurde am 11. Tag in moribundem Zustand euthanasiert

Page 206: Morphologische Charakterisierung und molekulare ... · 2.1.1 Histologie, UItrastruktur und Funktion S. 13 2.2 Interstitielle Pneumonie und Diffuse Alveolar Damage (DAD) S. 25 2.3

206

Tabelle 12: Ergebnisse der morphometrischen Bestimmung der Zellproliferationsrate anhand

der immunhistochemischen Markierung von Ki-67 (Pferd 5 – 8)

Pferd 5 Pferd 6

Versuchstag x Ki-67-pos. Zellen (%) s x Ki-67-pos. Zellen (%) s

x Kontrolle 0,4 0,2 08,1 34,0

1 3,1 1,1 05,4 06,3

4 4,9 3,3 12,3 23,0

8 * * 34,4 21,0

11 26,0 10,5

15 15,2 10,6

18 05,3 02,7

22 10,9 03,4

25 05,8 03,7

29 14,3 11,0

Pferd 7 Pferd 8

Versuchstag x Ki-67-pos. Zellen (%) s x Ki-67-pos. Zellen (%) s

x Kontrolle 09,3 05,7 06,5 03,7

1 22,3 06,7 13,7 66,6

4 13,8 07,5 25,3 10,0

8 31,4 11,8 ** **

11 36,3 16,2 14,7 06,9

15 28,6 10,8 13,7 06,6

18 10,0 00,7 14,5 05,1

22 11,8 11,0 12,1 03,8

25 13,8 01,0 03,4 01,8

29 11,7 08,8 11,4 04,6

x Ki-67-pos. Zellen = arithmetisches Mittel des Anteils Ki-67-positiver Zellen an der Gesamtzellzahl aller

Biopsielokalisationen eines Entnahmetages; x Kontrolle = arithmetisches Mittel der Werte aller

Kontrolleproben; s = Standardabweichung;

* Pferd 5 wurde am 9. Tag in moribundem Zustand euthanasiert

** keine auswertbaren Biopsieproben gewinnbar

Page 207: Morphologische Charakterisierung und molekulare ... · 2.1.1 Histologie, UItrastruktur und Funktion S. 13 2.2 Interstitielle Pneumonie und Diffuse Alveolar Damage (DAD) S. 25 2.3

207

Tabelle 13: Ergebnisse der morphometrischen Bestimmung der Zelluntergangsrate anhand der

Darstellung nekrotischer und apoptotischer Zellen durch terminal dUTP nick end

labeling (Pferd 1 – 4)

Pferd 1 Pferd 2

Versuchstag x TUNEL-pos. Zellen (%) s x TUNEL-pos. Zellen (%) s

x Kontrolle 0,4 0,2 0,3 0,1

1 0,2 0,2 0,2 0,1

3 0,2 0,1 0,1 0,1

7 0,3 0,4 0,4 0,1

10 0,7 0,5 0,2 0,0

14 0,7 0,3 0,6 0,5

17 0,1 0,1 0,5 0,2

21 0,1 0,1 0,5 0,3

24 0,2 0,1 0,4 0,6

28 0,4 0,3 0,2 0,1

Pferd 3 Pferd 4

Versuchstag x TUNEL-pos. Zellen (%) s x TUNEL-pos. Zellen (%) s

x Kontrolle 1,9 1,4 1,1 0,7

1 1,2 1,0 0,6 0,3

4 2,0 0,0 0,7 0,1

8 4,1 2,0 0,5 0,8

11 * * 0,7 0,5

15 0,4 0,3

18 0,6 0,4

22 0,9 0,5

25 0,8 0,4

29 0,6 0,5

x TUNEL-pos. Zellen = arithmetisches Mittel des Anteils TUNEL-positiver Zellen an der Gesamtzellzahl aller

Biopsielokalisationen eines Entnahmetages; x Kontrolle = arithmetisches Mittel der Werte aller

Kontrolleproben; s = Standardabweichung;

* Pferd 3 wurde am 11. Tag in moribundem Zustand euthanasiert

Page 208: Morphologische Charakterisierung und molekulare ... · 2.1.1 Histologie, UItrastruktur und Funktion S. 13 2.2 Interstitielle Pneumonie und Diffuse Alveolar Damage (DAD) S. 25 2.3

208

Tabelle 14: Ergebnisse der morphometrischen Bestimmung der Zelluntergangsrate anhand der

Darstellung nekrotischer und apoptotischer Zellen durch terminal dUTP nick end

labeling (Pferd 5 – 8)

Pferd 5 Pferd 6

x TUNEL-pos. Zellen (%) s x TUNEL-pos. Zellen (%) s

x Kontrolle 0,6 0,2 0,5 0,4

1 0,5 0,3 0,7 0,4

4 3,0 2,4 0,4 0,3

8 * * 0,2 0,2

11 0,4 0,3

15 0,2 0,2

18 0,3 0,2

22 0,4 0,2

25 0,3 0,2

29 0,5 0,2

Pferd 7 Pferd 8

x TUNEL-pos. Zellen (%) s x TUNEL-pos. Zellen (%) s

x Kontrolle 0,9 0,8 1,0 0,6

1 0,2 0,3 1,0 0,5

4 0,4 0,3 ** **

8 0,5 0,2 1,6 1,2

11 0,5 0,2 1,1 0,6

15 0,8 0,5 0,8 0,2

18 1,0 0,5 1,0 0,6

22 0,5 0,4 0,6 0,3

25 0,7 0,4 1,6 1,0

29 0,4 0,5 0,8 0,4

x TUNEL Zellen = arithmetisches Mittel des Anteils TUNEL-positiver Zellen an der Gesamtzellzahl aller

Biopsielokalisationen eines Entnahmetages; x Kontrolle = arithmetisches Mittel der Werte aller

Kontrolleproben; s = Standardabweichung;

* Pferd 5 wurde am 9. Tag in moribundem Zustand euthanasiert

Page 209: Morphologische Charakterisierung und molekulare ... · 2.1.1 Histologie, UItrastruktur und Funktion S. 13 2.2 Interstitielle Pneumonie und Diffuse Alveolar Damage (DAD) S. 25 2.3

209

Tabelle 15: Ergebnisse der morphometrischen Bestimmung der Zellinfiltrationsrate von

Makrophagen und Granulozyten anhand der immunhistochemischen Markierung

MAC 387-positiver Zellen (Pferd 1 – 4)

Pferd 1 Pferd 2

Versuchstag x MAC 387-pos. Zellen (%) s x MAC 387-pos. Zellen (%) s

x Kontrolle 1,9 1,3 1,6 0,9

1 3,2 0,8 1,0 0,6

3 2,2 1,9 2,3 1,9

7 2,8 2,4 4,8 0,0

10 2,3 1,5 1,3 0,6

14 3,4 1,4 1,6 1,9

17 2,4 0,9 1,7 0,5

21 2,0 1,3 2,1 1,0

24 1,6 0,9 1,5 0,6

28 1,3 0,6 4,0 0,8

Pferd 3 Pferd 4

Versuchstag x MAC 387-pos. Zellen (%) s x MAC 387-pos. Zellen (%) s

x Kontrolle 1,5 1,1 3,1 2,3

1 0,5 0,8 4,2 2,6

4 2,0 1,4 4,0 1,5

8 6,5 3,8 8,0 6,2

11 * * 3,7 0,9

15 1,8 0,7

18 3,3 0,8

22 2,1 1,1

25 2,8 0,3

29 2,3 1,1

x MAC 387-pos. Zellen = arithmetisches Mittel des Anteils MAC 387-positiver Zellen an der Gesamtzellzahl

aller Biopsielokalisationen eines Entnahmetages; x Kontrolle = arithmetisches Mittel der Werte aller

Kontrolleproben; s = Standardabweichung;

* Pferd 3 wurde am 11. Tag in moribundem Zustand euthanasiert

Page 210: Morphologische Charakterisierung und molekulare ... · 2.1.1 Histologie, UItrastruktur und Funktion S. 13 2.2 Interstitielle Pneumonie und Diffuse Alveolar Damage (DAD) S. 25 2.3

210

Tabelle 16: Ergebnisse der morphometrischen Bestimmung der Zellinfiltrationsrate von

Makrophagen und Granulozyten anhand der immunhistochemischen Markierung

MAC 387-positiver Zellen (Pferd 5 – 8)

Pferd 5 Pferd 6

Versuchstag x MAC 387-pos. Zellen (%) s x MAC 387-pos. Zellen (%) s

x Kontrolle 2,5 1,9 02,2 1,1

1 6,4 2,5 07,3 3,7

4 6,1 2,0 07,0 3,4

8 * * 10,0 9,2

11 02,5 1,7

15 02,5 1,4

18 04,6 1,4

22 02,0 0,4

25 01,8 1,2

29 02,1 0,3

Pferd 7 Pferd 8

Versuchstag x MAC 387-pos. Zellen (%) s x MAC 387-pos. Zellen (%) s

x Kontrolle 3,1 1,9 04,0 2,4

1 2,6 0,6 02,6 2,3

4 8,5 4,7 ** **

8 9,5 2,6 11,2 5,2

11 6,2 1,9 07,8 4,7

15 4,1 1,5 01,9 0,9

18 2,9 0,4 02,0 0,8

22 1,6 0,6 01,5 0,6

25 4,7 2,6 02,8 1,9

29 2,0 1,0 01,8 0,8

x MAC 387-pos. Zellen = arithmetisches Mittel des Anteils MAC 387-positiver Zellen an der Gesamtzellzahl

aller Biopsielokalisationen eines Entnahmetages; x Kontrolle = arithmetisches Mittel der Werte aller

Kontrolleproben; s = Standardabweichung;

* Pferd 5 wurde am 9. Tag in moribundem Zustand euthanasiert

** keine auswertbaren Biopsieproben gewinnbar

Page 211: Morphologische Charakterisierung und molekulare ... · 2.1.1 Histologie, UItrastruktur und Funktion S. 13 2.2 Interstitielle Pneumonie und Diffuse Alveolar Damage (DAD) S. 25 2.3

211

Tabelle 17: Ergebnisse der phasenanalytischen Bestimmung des Anteils kollagener und

retikulärer Fasern an der alveolären Septen anhand der Darstellung in der

Heidenhainschen Azanfärbung (Pferd 1, 2, 4, 6)

Pferd 1 Pferd 2

Versuchstag x Anteil kollagener und

retikulärer Fasern (%) s

x Anteil kollagener und

retikulärer Fasern (%) s

x Kontrolle 010,3 09,1 11,8 07,6

1 08,7 06,8 14,8 04,3

3 10,1 03,5 08,7 03,0

7 16,2 06,9 10,5 06,1

10 13,2 16,7 10,7 04,3

14 04,9 02,1 14,0 09,2

17 08,5 02,2 08,2 02,9

21 08,6 04,7 16,7 10,8

24 07,8 01,9 08,1 03,3

28 15,7 08,7 06,4 02,5

Pferd 4 Pferd 6

Versuchstag x Anteil kollagener und

retikulärer Fasern (%) s

x Anteil kollagener und

retikulärer Fasern (%) s

x Kontrolle 07,1 2,4 07,6 1,8

1 14,0 3,1 07,6 4,6

4 05,6 1,7 08,1 2,9

8 08,3 8,0 03,2 2,5

11 07,9 4,9 08,2 3,6

15 06,9 3,3 09,1 8,1

18 08,7 1,4 12,4 8,5

22 08,9 5,7 07,1 5,2

25 08,9 5,4 06,9 2,7

29 09,6 5,5 06,3 3,3

x = arithmetisches Mittel des Anteils kollagener und retikulärer Fasern an den alveolären Septen aller

Biopsielokalisationen eines Entnahmetages; x Kontrolle = arithmetisches Mittel der Werte aller

Kontrolleproben; s = Standardabweichung;

Page 212: Morphologische Charakterisierung und molekulare ... · 2.1.1 Histologie, UItrastruktur und Funktion S. 13 2.2 Interstitielle Pneumonie und Diffuse Alveolar Damage (DAD) S. 25 2.3

212

Tabelle 18: Ergebnisse der phasenanalytischen Bestimmung des Anteils kollagener und

retikulärer Fasern an der alveolären Septen anhand der Darstellung in der

Heidenhainschen Azanfärbung (Pferd 7 + 8)

Pferd 7 Pferd 8

Versuchstag x Anteil kollagener und

retikulärer Fasern (%) s

x Anteil kollagener und

retikulärer Fasern (%) s

x Kontrolle 10,9 4,2 12,5 5,9

1 10,0 4,0 09,4 2,2

4 06,0 2,6 ** **

8 09,9 5,1 05,5 4,2

11 07,6 4,7 08,2 3,2

15 10,9 5,3 05,9 2,6

18 06,1 2,9 09,7 3,7

22 09,4 6,7 10,8 4,3

25 07,4 3,9 13,1 9,8

29 08,5 4,4 14,8 5,0

x = arithmetisches Mittel des Anteils kollagener und retikulärer Fasern an den alveolären Septen aller

Biopsielokalisationen eines Entnahmetages; x Kontrolle = arithmetisches Mittel der Werte aller

Kontrolleproben; s = Standardabweichung;

** keine auswertbaren Biopsieproben gewinnbar

Page 213: Morphologische Charakterisierung und molekulare ... · 2.1.1 Histologie, UItrastruktur und Funktion S. 13 2.2 Interstitielle Pneumonie und Diffuse Alveolar Damage (DAD) S. 25 2.3

213

9.2 Ergebnisse der quantitativen Polymerase-Kettenreaktion (Rohdaten)

Tabelle 19: Ergebnisse der qPCR für den Nachweis von IL-1ß-mRNA von Pferd 1 - 4

Pferd 1 Pferd 2

Versuchs-

tag x Ct s x Kop. s x Ct s x Kop. s

Kontrolle 1 29,63 0,63 1043950 316211 28,21 0,19 2541667 800396

Kontrolle 2 28,52 0,46 2179333 396213 27,92 0,14 3058167 834847

1 27,18 0,60 5.586.333 5.586.333 28,10 0,15 2.700.333 708.745

3 27,84 0,65 3.578.000 3.578.000 27,04 0,18 5.568.000 138.2386

7 26,78 0,60 7.333.167 7.333.167 27,82 0,16 3.269.167 805.613

10 28,05 0,57 3.068.500 3.068.500 28,07 0,18 2.768.667 778.373

14 26,43 0,45 9.195.500 9.195.500 26,45 0,20 8.337.000 175.4401

17 26,74 0,63 7.606.333 7.606.333 27,03 0,12 5.554.167 886.487

21 27,19 0,79 5.726.667 5.726.667 29,19 0,14 1.266.900 292.794

24 27,92 0,56 3.356.167 3.356.167 28,22 0,18 2.471.833 559.842

Pferd 3 Pferd 4

Versuchs-

tag x Ct s x Kop. s x Ct s x Kop. s

Kontrolle 1 27,91 0,63 3807000 1121032

Kontrolle 2 28,49 0,42 2474333 445988 28,04 0,60 1775667 199068

1 27,70 0,34 4.257.667 650.627 28,65 0,61 1.199.833 148.210

4 28,06 0,46 3.355.000 681.382 27,85 0,60 2.003.833 187.421

8 26,65 0,42 8.793.833 1.567.931 27,03 0,54 3.380.000 203.250

11 * * * * 26,69 0,51 4.240.500 426.825

15 27,00 0,64 3.482.167 499.068

18 27,73 0,62 2.182.500 324.455

22 26,99 0,67 3.528.333 671.086

25 27,67 0,55 2.256.000 349.425

29 27,60 0,49 2.350.333 263.875

x Ct = arithmetisches Mittel der Threshold Cycle aus Messdurchgang 1 + 2; x Kop. = arithmetisches Mittel

der Kopienzahlen aus Messdurchgang 1 + 2; s = Standardabweichung der Werte aus Messdurchgang 1 + 2;

* Pferd 3 wurde am 11. Tag in moribundem Zustand euthanasiert

** keine auswertbaren Biopsieproben gewinnbar

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214

Tabelle 20: Ergebnisse der qPCR für den Nachweis von IL-1ß-mRNA von Pferd 5 - 6

Pferd 5 Pferd 6

Versuchs-

tag x Ct s x Kop. s x Ct s x Kop. s

Kontrolle 1 31,57 0,48 313750 112536 30,79 0,64 228533 48465

Kontrolle 2 32,25 0,39 193417 55615 30,84 0,42 218183 22798

1 30,40 0,41 691.733 178.964 29,05 0,41 690.633 34.622

3 28,87 0,35 1.960.667 473.571 28,33 0,42 1.103.667 65.065

7 * * * * 28,65 0,42 896.000 71.625

10 29,73 0,51 446.617 48.787

14 29,37 0,30 564.767 55.896

17 30,55 0,36 262.033 20.529

21 29,75 0,28 440.500 40.949

25 29,87 0,25 408.950 48.277

Pferd 7 Pferd 8

Versuchs-

tag x Ct s x Kop. s x Ct s x Kop. s

Kontrolle 1 28,32 0,30 1453167 225762 27,48 0,27 2798833 497097

Kontrolle 2 28,07 0,21 1711333 168613 27,46 0,07 2793833 99425

1 26,53 0,14 4.982.167 507.799 26,98 0,13 3.907.833 278.929

4 26,20 0,23 6.265.167 737.158 ** ** ** **

8 26,62 0,23 4.702.667 487.299 27,43 0,28 2.904.833 516.687

11 27,02 0,11 3.553.667 413.238 26,98 0,19 3.913.333 403.712

15 27,79 0,26 2.112.833 477.373 28,35 0,18 1.512.167 146.128

18 26,47 0,19 5.252.167 770.236 27,29 0,11 3.150.833 320.673

22 26,73 0,23 4.382.500 623.626 26,87 0,14 4.208.167 310.062

25 26,81 0,25 4.127.500 588.872 27,21 0,23 3.363.167 522.699

29 27,14 0,20 3281.833 474.255 26,77 0,18 4.516.000 394.258

x Ct = arithmetisches Mittel der Threshold Cycle aus Messdurchgang 1 + 2; x Kop. = arithmetisches Mittel

der Kopienzahlen aus Messdurchgang 1 + 2; s = Standardabweichung der Werte aus Messdurchgang 1 + 2;

* Pferd 5 wurde am 9. Tag in moribundem Zustand euthanasiert

** keine auswertbaren Biopsieproben gewinnbar

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215

Tabelle 21: Ergebnisse der qPCR für den Nachweis von TGF-ß-mRNA von Pferd 1-4

Pferd 1 Pferd 2

Versuchs-

tag x Ct s x Kop. s x Ct s x Kop. s

Kontrolle 1 31,81 0,99 1.184.120 677.522 31,74 0,28 4.334.800 2.686.663

Kontrolle 2 30,61 0,72 2.129.683 866.394 32,89 0,79 1.659.740 727.546

1 29,65 0,46 3.626.000 901.120 32,54 0,63 1.951.000 641.401

3 29,24 0,35 4.632.167 980.347 31,68 0,44 4.333.800 2.487.382

7 28,51 0,58 7.452.667 2.610.796 31,79 0,66 3.853.400 2.384.003

10 28,63 0,63 6.630.000 2.753.472 32,66 0,97 2.652.000 2.294.842

14 29,42 0,70 4.532.200 1.665.279 31,68 0,63 4.589.400 3.178.256

17 30,79 0,79 2.036.400 1.125.832 31,84 0,59 2.971.167 982.441

21 30,15 0,91 2.932.333 1.463.888 34,40 1,00 862.340 675.226

24 30,63 1,04 2.197.125 1.150.109 32,26 0,82 2.542.667 1.468.307

Pferd 3 Pferd 4

Versuchs-

tag x Ct s x Kop. s x Ct s x Kop. s

Kontrolle 1 27,62 0,49 4.903.667 2.515.710 ** ** ** **

Kontrolle 2 29,42 0,37 1.479.867 806.839 29,34 0,37 4.428.500 835.244

1 29,01 0,42 1.988.533 1.028.206 29,70 0,47 3.554.667 647.317

4 29,15 0,17 1.757.800 8.66.004 29,43 0,70 4.347.000 1.400.627

8 27,03 0,57 7.262.500 4.246.329 27,25 0,75 16.529.500 5.712.273

11 * * * * 28,22 0,48 8.799.167 1.866.666

15 28,03 0,81 10.602.167 4.817.919

18 29,56 0,77 4.203.667 2.100.636

22 29,89 0,67 3.294.333 1.149.657

25 30,11 0,27 2.769.667 543.540

29 30,18 0,58 2.704.500 713.630

x Ct = arithmetisches Mittel der Threshold Cycle aus Messdurchgang 1 + 2; x Kop. = arithmetisches Mittel

der Kopienzahlen aus Messdurchgang 1 + 2; s = Standardabweichung der Werte aus Messdurchgang 1 + 2;

* Pferd 3 wurde am 11. Tag in moribundem Zustand euthanasiert

** keine auswertbaren Biopsieproben gewinnbar

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216

Tabelle 22: Ergebnisse der qPCR für den Nachweis von TGF-ß-mRNA von Pferd 5 - 8

Pferd 5 Pferd 6

Versuchs-

tag x Ct s x Kop. s x Ct s x Kop. s

Kontrolle 1 30,16 0,24 1.028.417 585.025 29,82 0,54 2.548.833 784.904

Kontrolle 2 30,49 0,30 852.917 523.927 30,43 0,72 1.784.067 656.481

1 29,64 0,44 1.483.650 1.034.325 29,64 0,54 2.839.333 798.983

4 28,22 0,44 3.442.000 1.590.873 28,77 0,83 5.122.000 2.191.137

8 * * * * 28,16 0,74 7.435.167 3.365.408

11 27,86 0,90 9.177.333 4.308.620

15 29,45 0,58 3.241.000 1.183.812

18 30,19 0,56 2.018.167 562.134

22 30,53 0,40 1.604.500 339.616

25 30,18 0,51 2.024.333 581.614

Pferd 7 Pferd 8

Versuchs-

tag x Ct s x Kop. s x Ct s x Kop. s

Kontrolle 1 28,55 0,23 7.938.000 1.193.994 28,69 0,15 6.893.333 3.716.932

Kontrolle 2 29,43 0,37 4.639.333 1.127.808 29,08 0,56 4.850.333 1.156.157

1 29,26 0,46 5.226.167 1.456.491 29,47 1,02 3.862.667 1.180.806

4 28,33 0,74 9.734.833 4.276.467 ** ** ** **

8 27,01 0,15 20.568.333 1.818.322 27,59 0,85 12.586.667 4.500.533

11 26,63 0,77 28.878.333 15.290.237 27,97 0,98 9.730.833 2.389.754

15 28,49 0,56 8.574.167 3.263.166 27,89 0,82 10.755.333 5.782.834

18 29,72 0,56 3.966.167 1.343.887 28,91 0,89 5.044.000 2.340.783

22 30,92 0,72 1.938.217 833.125 30,08 1,00 2.762.500 1.245.669

25 29,53 0,91 4.828.833 2.484.381 29,49 1,03 4.484.800 1.640.233

29 29,54 0,76 4.673.833 2.252.251 29,79 0,89 2.818.000 865.407

x Ct = arithmetisches Mittel der Threshold Cycle aus Messdurchgang 1 + 2; x Kop. = arithmetisches Mittel

der Kopienzahlen aus Messdurchgang 1 + 2; s = Standardabweichung der Werte aus Messdurchgang 1 + 2;

* Pferd 5 wurde am 9. Tag in moribundem Zustand euthanasiert

** keine auswertbaren Biopsieproben gewinnbar

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217

Tabelle 23: Ergebnisse der qPCR für den Nachweis von Prokollagen a1(I)-mRNA

von Pferd 1 - 4

Pferd 1 Pferd 2

Versuchs-

tag x Ct s x Kop. s x Ct s x Kop. s

Kontrolle 1 27,97 0,23 1.810.500 463.868 27,01 0,26 2.796.167 928.756

Kontrolle 2 26,96 0,21 3.492.167 787.875 26,62 0,29 3.569.333 984.622

1 25,94 0,37 6.996.833 2.132.558 26,47 0,24 3.924.833 1.003.266

3 25,44 0,26 9.553.500 2.428.944 25,10 0,38 9.800.833 2.706.515

7 25,96 0,23 6.804.167 1.689.667 25,75 0,41 6.324.500 1.711.699

10 26,19 0,28 5.846.000 1.570.143 27,29 0,12 2.281.500 515.589

14 26,12 0,24 6.110.667 1.345.851 26,07 0,21 5.159.333 1.423.130

17 26,67 0,30 4.265.833 1.119.563 25,90 0,37 5.783.000 1.581.422

21 26,11 0,29 6.188.667 1.707.925 27,77 0,24 1.668.833 431.995

24 26,98 0,37 3.513.000 1.050.468 25,86 0,30 5909.833 1.707.552

Pferd 3 Pferd 4

Versuchs-

tag x Ct s x Kop. s x Ct s x Kop. s

Kontrolle 1 27,13 0,24 2.929.833 559.774 ** ** ** **

Kontrolle 2 28,08 0,15 1.536.667 202.728 27,14 0,21 3.002.667 404.521

1 26,10 0,10 5.722.000 432.841 26,64 0,27 4.204.167 730.159

4 24,92 0,10 12.530.000 969.103 25,50 0,33 9.072.167 1.866.780

8 25,95 0,15 6.330.500 691.985 24,67 0,14 15.585.000 1.416.203

11 * * * * 24,04 0,23 23.816.667 3.615.913

15 24,62 0,16 16.083.333 1.684.324

18 25,34 0,27 10.018.167 1.733.701

22 25,36 0,26 9.902.500 1.648.394

25 25,88 0,23 6.948.667 1.042.623

29 26,02 0,25 6.337.167 1.005.572

x Ct = arithmetisches Mittel der Threshold Cycle aus Messdurchgang 1 + 2; x Kop. = arithmetisches Mittel

der Kopienzahlen aus Messdurchgang 1 + 2; s = Standardabweichung der Werte aus Messdurchgang 1 + 2;

* Pferd 3 wurde am 11. Tag in moribundem Zustand euthanasiert

** keine auswertbaren Biopsieproben gewinnbar

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218

Tabelle 24: Ergebnisse der qPCR für den Nachweis von Prokollagen a1(I)-mRNA

von Pferd 5 - 8

Pferd 5 Pferd 6

Versuchs-

tag x Ct s x Kop. s x Ct s x Kop. s

Kontrolle 1 27,71 0,08 2.158.167 118.916 27,35 0,18 2.801.500 262.032

Kontrolle 2 27,98 0,15 1.813.000 190.043 28,25 0,25 1.547.500 252.335

1 27,95 0,18 1.847.333 214.423 25,37 0,21 10.564.000 1.429.733

4 26,24 0,23 5.786.500 834.813 24,46 0,21 19.561.667 3.092.620

8 25,35 0,09 10.425.167 560.314 24,43 0,14 19.868.333 1.575.911

11 * * * * 24,37 0,20 20.561.667 2.166.614

15 25,45 0,29 10.129.167 2.010.495

18 25,50 0,34 9.818.000 1.819.110

22 28,26 0,34 7.276.400 1.245.028

25 25,10 0,29 12.814.667 2.195.815

Pferd 7 Pferd 8

Versuchs-

tag x Ct s x Kop. s x Ct s x Kop. s

Kontrolle 1 26,37 0,15 4.339.333 696.349 25,98 0,07 5.967.000 796.429

Kontrolle 2 26,01 0,26 5.570.333 1.151.406 25,99 0,13 5.928.000 1.037.662

1 26,15 0,16 5.061.333 868.219 24,72 0,19 13.821.667 2.230.744

4 24,89 0,25 11.789.167 2.508.777 ** ** ** **

8 23,84 0,23 23.706.667 4.853.393 23,80 0,14 25.498.333 4.226.769

11 22,74 0,17 51.631.667 7.778.405

15 23,03 0,22 40.718.333 8.471.726 23,39 0,10 33.316.667 2.887.412

18 23,42 0,40 32.043.333 9.230.744 23,43 0,19 32.820.000 6.228.416

22 23,98 0,38 21.845.000 6.104.319 24,53 0,24 15.770.000 2.977.724

25 25,14 0,32 10.074.167 2.471.003 24,36 0,30 17.686.667 3.781.527

29 24,23 0,40 18.485.000 4.637.606 24,11 0,36 21.116.667 5.213.892

x Ct = arithmetisches Mittel der Threshold Cycle aus Messdurchgang 1 + 2; x Kop. = arithmetisches Mittel

der Kopienzahlen aus Messdurchgang 1 + 2; s = Standardabweichung der Werte aus Messdurchgang 1 + 2;

* Pferd 5 wurde am 9. Tag in moribundem Zustand euthanasiert

** keine auswertbaren Biopsieproben gewinnbar

Page 219: Morphologische Charakterisierung und molekulare ... · 2.1.1 Histologie, UItrastruktur und Funktion S. 13 2.2 Interstitielle Pneumonie und Diffuse Alveolar Damage (DAD) S. 25 2.3

219

Tabelle 25: Ergebnisse der qPCR für den Nachweis von Prokollagen a1(III)-mRNA

von Pferd 1 - 4

Pferd 1 Pferd 2

Versuchs-

tag x Ct s x Kop. s x Ct s x Kop. s

Kontrolle 1 27,95 0,51 1824.476 319.311 26,82 0,31 3667.667 929.681

Kontrolle 2 27,09 0,38 3304.381 666.681 26,32 0,13 5047.000 586.812

16 25,26 0,38 11.426.238 2.226.568 25,82 0,13 7.105.000 946.869

3 24,91 0,62 14.397.619 3.177.500 24,59 0,06 16.326.667 1.303.897

7 25,16 0,40 12.199.476 1.975.767 25,18 0,16 10.997.167 1.652.361

10 30,62 0,60 5.795.000 708.114 27,36 0,30 2.539.000 622.123

14 25,02 0,49 13.159.524 1.440.686 25,79 0,20 7.300.000 1.311.911

17 25,94 0,40 7.190.381 1.264.831 25,60 0,33 8.409.000 2.074.726

21 25,06 0,33 13.347.143 3.219.259 27,34 0,23 2.544.167 444.969

24 25,65 0,36 8.837.429 1.897.917 25,28 0,15 10.277.500 1473.084

Pferd 3 Pferd 4

Versuchs-

tag x Ct s x Kop. s x Ct s x Kop. s

Kontrolle 1 25,60 0,24 3.337.850 2.509.896 ** ** ** **

Kontrolle 2 27,23 0,08 1.174.433 933.394 26,48 0,34 7132167 1.344.368

1 24,25 0,08 8.849.000 6.971.813 25,74 0,33 11621667 1.057.855

4 24,50 0,11 7.485.833 5.944.525 24,05 0,25 36733333 3.834.025

8 22,17 0,17 3.6092.667 28.214.428 22,32 0,27 118483333 8.194.002

11 * * * * 21,89 0,53 160550000 24.470.860

15 23,07 0,30 71.585.000 6.343.787

18 23,88 0,35 41.540.000 5.900.881

22 23,57 0,40 51.078.333 3.549.577

25 24,15 0,42 34.368.333 2.233.154

29 24,38 0,24 29.351.667 3.566.149

x Ct = arithmetisches Mittel der Threshold Cycle aus Messdurchgang 1 + 2; x Kop. = arithmetisches Mittel

der Kopienzahlen aus Messdurchgang 1 + 2; s = Standardabweichung der Werte aus Messdurchgang 1 + 2;

* Pferd 3 wurde am 11. Tag in moribundem Zustand euthanasiert

** keine auswertbaren Biopsieproben gewinnbar

Page 220: Morphologische Charakterisierung und molekulare ... · 2.1.1 Histologie, UItrastruktur und Funktion S. 13 2.2 Interstitielle Pneumonie und Diffuse Alveolar Damage (DAD) S. 25 2.3

220

Tabelle 26: Ergebnisse der qPCR für den Nachweis von Prokollagen a1(III)-mRNA

von Pferd 5 - 8

Pferd 5 Pferd 6

Versuchs-

tag x Ct s x Kop. s x Ct s x Kop. s

Kontrolle 1 26,75 0,50 1.343.000 1.024.459 26,54 0,69 5.753.000 1.266.323

Kontrolle 2 26,45 0,66 1.780.133 1.463.738 27,19 0,65 3.692.167 629.326

1 24,85 0,51 4.842.000 3.969.508 23,10 0,81 59.121.667 3.531.750

4 23,38 0,54 13.748.000 10.932.376 22,56 0,74 85.851.667 8.352.787

8 * * * * 22,21 0,70 108.208.333 6.831.868

11 22,82 0,79 72.343.333 10.558.058

15 23,51 0,78 44.760.000 4.248.459

18 23,76 0,73 37.783.333 2.674.933

22 23,70 0,67 39.295.000 3.041.307

25 23,20 0,94 57.048.333 13.044.043

Pferd 7 Pferd 8

Versuchs-

tag x Ct s x Kop. s x Ct s x Kop. s

Kontrolle 1 26,31 0,35 12.134.333 3.379.357 24,81 0,42 39.791.667 10.920.147

Kontrolle 2 24,86 0,30 32.425.000 7.103.539 24,91 0,31 36.613.333 7.644.168

1 24,81 0,33 33.555.000 8.013.570 23,74 0,41 82.515.000 21.941.246

4 23,40 0,23 86.496.667 13.241.925 ** ** ** **

8 21,40 0,30 338.333.333 57.764.060 21,36 0,29 407.450.000 57.885.534

11 20,86 0,32 492.350.000 93.169.711 21,40 0,26 394.533.333 51.887.327

15 22,15 0,29 203.300.000 35.185.338 22,10 0,31 246.083.333 44.292.908

18 22,50 0,30 160.466.667 29.644.876 21,88 0,29 285.233.333 41.378.336

22 23,75 0,47 70.308.333 22.239.879 23,12 0,04 122.033.333 5.374.632

25 22,29 0,28 185.450.000 34.168.216 22,16 0,20 23.621.667 28.394.465

29 21,91 0,40 242.533.333 5.984.153 22,20 0,24 230.216.667 30.782.814

x Ct = arithmetisches Mittel der Threshold Cycle aus Messdurchgang 1 + 2; x Kop. = arithmetisches Mittel

der Kopienzahlen aus Messdurchgang 1 + 2; s = Standardabweichung der Werte aus Messdurchgang 1 + 2;

* Pferd 5 wurde am 9. Tag in moribundem Zustand euthanasiert

** keine auswertbaren Biopsieproben gewinnbar

Page 221: Morphologische Charakterisierung und molekulare ... · 2.1.1 Histologie, UItrastruktur und Funktion S. 13 2.2 Interstitielle Pneumonie und Diffuse Alveolar Damage (DAD) S. 25 2.3

221

Tabelle 27: Ergebnisse der qPCR für den Nachweis von EF-1a-mRNA von Pferd 1 - 4

Pferd 1 Pferd 2

Versuchs-

tag x Ct s x Kop. s x Ct s x Kop. s

Kontrolle 1 26,98 0,17 2.427.333.333 403.837.426 28,45 0,54 1.139.500.000 115.250.597

Kontrolle 2 26,86 0,13 2.635.166.667 437.847.652 28,16 0,46 1.440.500.000 427.388.699

1 26,29 0,29 3.921.000.000 1.020.226.838 26,98 0,49 3.292.500.000 721.224.722

3 25,82 0,17 5.317.000.000 762.219.129 26,32 0,31 5.343.666.667 1.433.983.914

7 26,29 0,29 3.925.500.000 1.071.801.428 26,57 0,48 4.445.166.667 92.7076.966

10 26,13 0,07 4.286.833.333 405.028.106 28,68 0,44 977.383.333 177.968.800

14 26,65 0,27 3.096.666.667 857.157.551 27,38 0,74 2.445.000.000 352.331.662

17 25,96 0,24 4.804.166.667 444.427.459 27,06 0,46 3.075.666.667 327.370.534

21 26,61 0,10 3.088.166.667 356.080.562 29,31 1,43 783.260.000 405.408.976

24 27,19 0,11 2.099.000.000 406.411.122 26,96 0,41 3.341.833.333 776.930.992

Pferd 3 Pferd 4

Versuchs-

tag x Ct s x Kop. s x Ct s x Kop. s

Kontrolle 1 27,43 0,22 1.241.716.667 462.852.635 ** ** ** **

Kontrolle 2 27,64 0,23 1.064.333.333 419.714.011 28,13 0,16 761.633.333 147.595.537

1 26,94 0,46 1.844.516.667 825.979.541 28,65 0,25 526.433.333 135.650.045

4 27,08 0,34 1.661.683.333 722.116.335 27,12 0,35 1.626.000.000 437.045.078

8 25,98 0,25 3.712.166.667 1.420.270.878 26,56 0,29 2.475.166.667 762.520.404

11 * * * * 27,18 0,25 1.542.500.000 325.377.780

15 28,02 0,23 828.783.333 178.908.898

18 27,92 0,23 886.083.333 174.999.799

22 28,15 0,22 753.200.000 162.577.637

25 28,27 0,16 682.083.333 113.204.778

29 28,26 0,22 683.366.667 68.796.182

x Ct = arithmetisches Mittel der Threshold Cycle aus Messdurchgang 1 + 2; x Kop. = arithmetisches Mittel

der Kopienzahlen aus Messdurchgang 1 + 2; s = Standardabweichung der Werte aus Messdurchgang 1 + 2;

* Pferd 3 wurde am 11. Tag in moribundem Zustand euthanasiert

** keine auswertbaren Biopsieproben gewinnbar

Page 222: Morphologische Charakterisierung und molekulare ... · 2.1.1 Histologie, UItrastruktur und Funktion S. 13 2.2 Interstitielle Pneumonie und Diffuse Alveolar Damage (DAD) S. 25 2.3

222

Tabelle 28: Ergebnisse der qPCR für den Nachweis von EF-1a-mRNA von Pferd 5 - 8

Pferd 5 Pferd 6

Versuchs-

tag x Ct s x Kop. s x Ct s x Kop. s

Kontrolle 1 28,97 0,15 241.500.000 96963354 29,40 0,75 485.216.667 246.159.878

Kontrolle 2 28,50 0,17 331.550.000 92542158 29,30 0,61 496.283.333 172.497.437

1 28,21 0,20 409.850.000 105182941 28,10 0,64 1.239.283.333 425.785.901

4 26,53 0,26 1.478.000.000 416694612 26,79 0,71 3.230.333.333 617.833.850

8 * * * * 26,36 0,42 4.495.000.000 995.074.068

11 26,49 0,91 4.168.166.667 1.200.865.757

15 27,99 0,27 1.305.933.333 312.986.176

18 28,45 0,34 926.783.333 221.781.247

22 27,99 0,62 1.281.000.000 114.579.230

25 27,46 0,43 1.922.333.333 319.215.079

Pferd 7 Pferd 8

Versuchs-

tag x Ct s x Kop. s x Ct s x Kop. s

Kontrolle 1 27,26 0,26 1.013.466.667 289.475.821 27,88 0,31 1.417.633.333 645.154.167

Kontrolle 2 26,96 0,33 1.238.366.667 388.435.089 27,70 0,42 1.590.250.000 645.230.637

1 27,15 0,25 1.090.566.667 299.005.489 27,63 0,29 1.679.533.333 724.402.738

4 26,16 0,32 2.055.000.000 571.714.264 ** ** ** **

8 26,68 0,28 1.466.000.000 416.460.322 25,84 0,28 5.643.166.667 2.801.765.259

11 26,88 0,28 1.283.300.000 316.638.810 26,50 0,41 3.834.500.000 2.299.758.487

15 26,63 0,30 1.518.166.667 424.698.207 26,64 0,30 3.347.833.333 1.656.497.319

18 27,06 0,44 1.132.300.000 206.387.965 27,20 0,24 2.142.833.333 737.682.158

22 27,31 0,28 978.200.000 250.037.941 27,27 0,05 2.050.500.000 717.659.181

25 26,96 0,52 1.201.333.333 167.900.764 26,83 0,22 2.937.666.667 1.462.966.393

29 26,94 0,21 1.246.783.333 357.753.918 27,40 0,25 2.010.333.33 1.002.748.556

x Ct = arithmetisches Mittel der Threshold Cycle aus Messdurchgang 1 + 2; x Kop. = arithmetisches Mittel

der Kopienzahlen aus Messdurchgang 1 + 2; s = Standardabweichung der Werte aus Messdurchgang 1 + 2;

* Pferd 5 wurde am 9. Tag in moribundem Zustand euthanasiert

** keine auswertbaren Biopsieproben gewinnbar

Page 223: Morphologische Charakterisierung und molekulare ... · 2.1.1 Histologie, UItrastruktur und Funktion S. 13 2.2 Interstitielle Pneumonie und Diffuse Alveolar Damage (DAD) S. 25 2.3

223

Tabelle 29: Kopienzahl IL-1ß-mRNA / 105 Kopien EF-1a (Vorversuch)

Versuchstag Pferd 1 Pferd 2 x s

x Kontrolle 0,63 2,18 1,40 1,09

1 1,42 0,82 1,12 0,43

3 0,67 1,04 0,86 0,26

7 1,87 0,74 1,30 0,80

10 0,72 2,88 1,80 1,53

14 2,97 3,64 3,30 0,47

17 1,58 1,79 1,69 0,14

21 1,85 1,76 1,81 0,07

24 1,60 0,70 1,15 0,63

Tabelle : Kopienzahl IL-1ß-mRNA / 105 Kopien EF-1a (Hauptversuch)

Versuchstag Pferd 3 Pferd 4 Pferd 5 Pferd 6 Pferd 7 Pferd 8 x s

x Kontrolle 2,70 2,33 0,79 0,46 1,41 1,87 1,60 0,86

1 2,31 2,28 1,69 0,56 4,57 2,33 2,13 1,44

4 2,02 1,23 1,33 0,34 3,05 ** 1,67 1,00

8 2,37 1,37 * 0,20 3,21 0,51 1,50 1,13

11 * 2,75 0,21 2,77 1,02 1,69 1,28

15 4,20 0,34 1,39 0,45 1,60 1,80

18 2,46 0,61 4,64 1,47 2,30 1,74

22 4,68 0,20 4,48 2,05 2,86 2,13

25 3,31 0,23 3,44 1,14 2,03 1,60

29 3,44 ** 2,63 2,25 2,77 0,61

x Kontrolle = arithmetisches Mittel aller Kontrollwerte; x = arithmetisches Mittel; s = Standardabweichung;

* Pferd 3 und 5 wurden am 11. bzw. 9. Tag in moribundem Zustand euthanasiert

** keine auswertbaren Biopsieproben gewinnbar

Page 224: Morphologische Charakterisierung und molekulare ... · 2.1.1 Histologie, UItrastruktur und Funktion S. 13 2.2 Interstitielle Pneumonie und Diffuse Alveolar Damage (DAD) S. 25 2.3

224

Tabelle 30: Kopienzahl TGF-ß-mRNA / 105 Kopien EF-1a (Vorve rsuch)

Versuchstag Pferd 1 Pferd 2 x s

x Kontrolle 0,65 2,48 1,56 1,29

1 0,92 0,59 0,76 0,23

3 0,87 0,81 0,84 0,04

7 1,90 0,87 1,38 0,73

10 1,55 2,75 2,15 0,85

14 1,46 2,00 1,73 0,38

17 0,42 0,96 0,69 0,38

21 0,95 1,20 1,07 0,18

24 1,05 0,72 0,89 0,23

Tabelle 31: Kopienzahl TGF-ß-mRNA / 105 Kopien EF-1a (Hauptversuch)

Versuchstag Pferd 3 Pferd 4 Pferd 5 Pferd 6 Pferd 7 Pferd 8 x s

x Kontrolle 2,67 5,81 3,42 4,42 5,79 3,96 4,34 1,27

1 1,08 6,75 3,62 2,29 4,79 2,30 3,47 2,05

4 1,06 2,67 2,33 1,59 4,74 ** 2,48 1,41

8 1,96 6,68 * 1,65 14,03 2,23 5,31 5,29

11 * 5,70 2,20 22,50 2,54 8,24 9,64

15 12,79 2,48 5,65 3,21 6,03 4,70

18 4,74 2,18 3,50 2,35 3,19 1,19

22 4,37 1,25 1,98 1,35 2,24 1,46

25 4,06 1,05 4,02 1,53 2,66 1,60

29 3,96 ** 3,75 1,40 3,04 1,42

x Kontrolle = arithmetisches Mittel aller Kontrollwerte; x = arithmetisches Mittel; s = Standardabweichung

* Pferd 3 und 5 wurden am 11. bzw. 9. Tag in moribundem Zustand euthanasiert

** keine auswertbaren Biopsieproben gewinnbar

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225

Tabelle 32: Kopienzahl Prokollagen a1(I)-mRNA / 105 Kopien EF-1a (Vorversuch)

Versuchstag Pferd 1 Pferd 2 x s

x Kontrolle 0,10 0,25 0,18 0,10

1 0,18 0,12 0,15 0,04

3 0,18 0,18 0,18 0,00

7 0,17 0,14 0,16 0,02

10 0,14 0,24 0,19 0,07

14 0,20 0,23 0,21 0,02

17 0,09 0,19 0,14 0,07

21 0,20 0,23 0,22 0,02

24 0,17 0,17 0,17 0,00

Tabelle 33: Kopienzahl Prokollagen a1(I)-mRNA / 102 Kopien EF-1a (Hauptversuch)

Versuchstag Pferd 3 Pferd 4 Pferd 5 Pferd 6 Pferd 7 Pferd 8 x s

x Kontrolle 0,19 0,39 0,65 0,44 0,44 0,40 0,42 0,15

1 0,31 0,80 1,41 0,85 0,46 0,82 0,78 0,38

4 0,75 0,56 0,71 0,61 0,57 ** 0,64 0,09

8 0,17 0,63 * 0,44 1,62 0,45 0,66 0,56

11 * 1,54 0,49 1,35 1,13 0,56

15 1,94 0,78 2,68 1,00 1,60 0,88

18 1,13 1,06 2,83 1,53 1,64 0,82

22 1,31 0,57 2,23 0,77 1,22 0,74

25 1,02 0,67 0,84 0,60 0,78 0,19

29 0,93 ** 1,48 1,05 1,15 0,29

x Kontrolle = arithmetisches Mittel aller Kontrollwerte; x = arithmetisches Mittel; s = Standardabweichung;

* Pferd 3 und 5 wurden am 11. bzw. 9. Tag in moribundem Zustand euthanasiert

** keine auswertbaren Biopsieproben gewinnbar

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Tabelle 34: Kopienzahl Prokollagen a1(III)-mRNA / 105 Kopien EF-1a (Vorversuch)

Versuchstag Pferd 1 Pferd 2 x s

x Kontrolle 10,03 33,61 21,82 16,68

1 29,14 21,58 25,36 05,35

3 27,08 30,55 28,82 02,46

7 31,08 24,76 27,92 04,47

10 13,52 26,37 19,95 09,09

14 42,50 31,86 37,18 07,52

17 14,97 27,05 21,01 08,55

21 43,22 35,39 39,31 05,53

24 42,10 29,26 35,68 09,08

Tabelle 35 : Kopienzahl Prokollagen a1(III)-mRNA / 102 Kopien EF-1a (Hauptversuch)

Versuchstag Pferd 3 Pferd 4 Pferd 5 Pferd 6 Pferd 7 Pferd 8 x s

x Kontrolle 18,96 93,64 54,65 96,48 190,78 2,55 76,18 67,84

1 47,97 220,76 118,14 477,06 307,68 4,91 196,09 176,96

4 45,05 225,91 93,02 265,77 420,91 ** 210,13 148,95

8 97,23 478,69 * 240,73 2307,87 7,22 626,35 956,73

11 * 1040,84 173,56 3836,59 10,29 1265,32 1772,84

15 863,74 342,74 1339,12 7,35 638,24 585,21

18 468,80 407,68 1417,17 13,31 576,74 595,54

22 678,15 306,75 718,75 5,95 427,40 336,62

25 503,87 296,77 1543,70 8,04 588,10 668,73

29 429,52 ** 1945,27 11,45 795,41 1017,51

x Kontrolle = arithmetisches Mittel aller Kontrollwerte; x = arithmetis ches Mittel; s = Standardabweichung;

* Pferd 3 und 5 wurden am 11. bzw. 9. Tag in moribundem Zustand euthanasiert

** keine auswertbaren Biopsieproben gewinnbar

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Tabelle 36: Klinischer Score (Vor- und Hauptversuch) 2

x = arithmetisches Mittel; s = Standardabweichung;

* Pferd 3 und 5 wurden am 11. bzw. 9. Tag in moribundem Zustand euthanasiert

** keine Untersuchungen durchgeführt

2 Mit freundlicher Genehmigung von Frau Dr. M. Venner (Klinik für Pferde, Tierärztliche Hochschule Hannover

Versuchstag K 1 3 5 7 10 13 17 20 24 27 30 Pferd 1 0 0 2 1 0 0 0 0 0 ** 1 0

Pferd 2 0 1 1 1 1 1 1 1 0 ** 1 1

Pferd 3 0 0 0 8 10 *

Pferd 4 0 1 6 8 8 4 4 1 1 ** 1 1

Pferd 5 1 2 8 10 *

Pferd 6 1 2 6 6 4 0 0 0 2 ** 0 0

Pferd 7 0 1 2 10 8 6 5 4 1 ** 1 1

Pferd 8 0 1 8 10 4 2 1 0 0 ** 0 0

s 0,5 0,8 3,2 3,8 3,8 2,4 2,1 1,6 0,8 0,5 0,6

x Score 2 7 30 52 34 12 10 5 4 0 2 2

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9.3 Reaktionslösungen und Färbungen

1. Cacodylatpuffer (0,1 M, pH 7,0)

Stammlösung:

Cacodylsäure-Natriumsalz 21,4 g

Aqua dest. 1000 ml

Gebrauchslösung:

Stammlösung 500 ml

HCl (0,1 M) 41,5 ml

Aqua dest. ad 1000 ml

2. Citratpuffer

gebrauchsfertige Lösung: 20 ml Citrat-Puffer-Konzentrat (ProTaqstura, Vertrieb über quartett

GmbH, Berlin) ad 1000 ml Aqua dest.

3. Glutardialdehydlösung (5%)

Glutardialdehydlösung (25%) 200 ml

Cacodylatpuffer (1 M, pH 7,0) 800 ml

4. 4%ige Paraformaldehydlösung

Paraformaldehyd 40 g

Calciumchlorid-2-Hydrat 735 mg

Cacodylatpuffer (0,1 M, pH 7,0) 1000 ml

Die Lösung auf 70°C erwärmen und so lange rühren lassen, bis sie klar ist. pH-Wert mit 0,1

M HCl-Lösung auf 7,4 einstellen.

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5. Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)

NaCl 40,0 g

NaH2PO 7,8 g

Aqua dest. 5,0 l

mit 1N Natronlauge auf pH=7,0 bis 7,2 einstellen.

6. DEPC-behandeltes Wasser (0,1 Vol% DEPC)

DEPC (Pyrokohlensäurediethylester) 2 ml

Aqua bidest. ad 2 l

Inkubation im Schüttelwasserbad für 2 h und anschließendes Autoklavieren (20 min, 120°C,

2,5 bar)

7. Heidenhainsche Azanfärbung

Azokarminlösung:

0,1g Azokarmin G/ 100ml Aqua dest. kurz aufkochen lassen, nach dem Abkühlen filtrieren

und Zugabe von 1ml Eisessig

Alkoholische Anilinlösung:

96%iges Ethanol 1000 ml

Anilinöl 1 ml

Anilinblau-Orange-Essigsäure-Stammlösung:

Anilinblau 0,5 g

Orange G 2 g

Aqua dest. 100 ml

Eisessig 8 ml

Anilinblau-Orange-Essigsäure-Gebrauchslösung:

Stammlösung mit der doppelten Menge Aqua dest. verdünnen

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Essigsaurer Alkohol:

96%iges Ethanol 1000 ml

Eisessig 10 ml

8. Hämalaun-Eosin-Färbung (im Färbeautomaten Varistain 24-3, Fa. Shandon,

Frankfurt)

1. Entparaffinieren und Rehydrieren:

Xylol 4 x 2 min

Isopropanol 1 min

Ethanol 96% 1 min

Ethanol 70% 1 min

Ethanol 50% 1 min

2. Spülen in Aqua dest. 2 min

3. Färben in (Hämalaun nach Mayer) 10 min

4. Wässern unter fließendem Leitungswasser 15 min

5. Färben in Eosin 2 min

6. Spülen in Aqua dest. 1 min

7. Dehydrieren:

Ethanol 50% 30 s

Ethanol 70% 30 s

Ethanol 96% 30 s

Isopropanol 2 min

Xylol 1 3 x 2 min

8. Eindecken der gefärbten Schnitte mit Corbitbalsam (Fa. Hecht, Kiel)

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9. TUNEL-Assay (ApopTag , Kat.-Nr.: S7101, Fa. Appligene Oncor,

Heidelberg)

Verdaupuffer:

Tris-HCl (1M, pH 8,0) 5 ml

EDTA (0,5M, pH 8,0) 10 ml

Tween 20 0,5 ml

DEPC-H2O ad 100 ml

autoklavieren und Lagerung bei 4°C

Proteinase K-Stammlösung (10mg/ml):

Proteinase K 100 mg

Tris-HCL (1M, pH 8,0) 2 ml

CaCl2 (0,1M) 20 µl

DEPC-H2O ad 10 ml

Sterilfiltration und Lagerung bei -20°C

Proteinase K-Gebrauchslösung:

4µl Proteinase K-Stammlösung in 1996µl Verdaupuffer für 20 Schnitte

Working-Strength-TdT-Solution:

760µl Reaction-Buffer und 320µl TdT-Enzyme für 20 Schnitte

Stop-Wash-Buffer:

5ml Stop-Wash-Konzentrat und 170ml Aqua dest.

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Danksagung

Mein herzlicher Dank gilt Herrn Professor Dr. Dr. h.c. mult. W. Drommer für die

Überlassung des Themas, die Betreuung und Unterstützung bei der Erstellung der Arbeit im

Rahmen des Ph.D.-Studiums.

Weiterhin vielen Dank an die Mitglieder meiner Betreuungsgruppe, Herrn Professor Dr. Pabst

und Herrn Professor Dr. Löscher, für ihre Unterstützung und ihr Interesse an meiner Arbeit.

Herrn Professor Dr. A. Gruber gilt mein besonderer Dank für die jederzeit gewährte und

freundliche Hilfestellung, die zahlreichen guten Ratschläge und die Einarbeitung in die

molekularbiologischen Präparationen.

Vielen Dank an Frau Dr. Venner für die Überlassung der Biopsieproben und die kollegiale

Zusammenarbeit, die viel Freude gemacht hat.

Bei Herrn PD Dr. G. von Samson-Himmelstjerna und Frau Sandra Buschbaum möchte ich

mich für die Einarbeitung in die quantitative Polymerasekettenreaktion und die Unterstützung

bei der Etablierung der Methode bedanken.

Mein besonderer Dank gilt Frau Käthe Franke und Frau Kerstin Rohn für Freundlichkeit,

tatkräftige Unterstützung, Ratschläge und Motivation zu jeder Zeit. Ich möchte diese

Zusammenarbeit nicht missen.

Meinen Mitdoktoranden, Dorthe Harmeier, Bettina Horstmeier und Ina Leverköhne, danke

ich für Kollegialität und fachlichen Austausch. Die Zusammenarbeit hat großen Spaß

gemacht.

Vielen Dank auch Dir Indra, für Deine Geduld, Dein Verständnis und Deine Hilfe.

Dank auch meinen Eltern, die mich ein Leben lang unterstützt haben.