mRNA-Expression des CRH-Systems in menschlichen ...

Aus der Frauenklinik der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Br.

mRNA-Expression des CRH-Systems in menschlichen schwangerschaftsspezifischen

Geweben

INAUGURAL-DISSERTATION zur

Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät

der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Br.

Vorgelegt 2002 von Silke Biller

geboren in Bremervörde

Dekan Prof. Dr. M. Schumacher

1. Gutachter PD Dr. W. Schäfer

2. Gutachter PD Dr. M. Hüll

Jahr der Promotion 2003

Teile dieser Arbeit wurden veröffentlicht in:

Wetzka B, Sehringer B, Schäfer WR, Biller S, Hör C, Benedek E, Deppert WR,

Zahradnik HP (2002) Human intrauterine tissues show specific patterns of CRH,

CRH receptors, and CRH-binding protein in human gestational tissues at term.

Experimental and Clinical Endocrinology & Diabetes. Im Druck

I Inhaltsverzeichnis _________________________________________________________________________________

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung.............................................................................................. 1

1.1 Physiologie von Wehentätigkeit und Geburt ..........................................................1

1.2 Frühgeburt ...................................................................................................................3

1.3 Die Theorie einer Plazentaren Uhr ..........................................................................4

1.4 Corticotropin Releasing-Hormon .............................................................................5

1.4.1 CRH .......................................................................................................................6

1.4.2 Urocortin................................................................................................................7

1.4.3 CRH-Bindeprotein ...............................................................................................8

1.4.4 CRH-Rezeptoren.................................................................................................9

1.5 Die schwangerschaftsspezifischen Gewebe .......................................................10

1.5.1 Myometrium ........................................................................................................10

1.5.2 Dezidua ...............................................................................................................11

1.5.3 Die fetalen Eihäute – Chorion und Amnion ...................................................11

1.5.4 Plazenta ..............................................................................................................11

1.6 RT-PCR......................................................................................................................12

1.6.1 Molekularbiologische Grundlagen ..................................................................12

1.6.2 RNA-Extraktion ..................................................................................................13

1.6.3 Reverse Transkription.......................................................................................13

1.6.4 Polymerasekettenreaktion................................................................................14

1.7 Fragestellungen........................................................................................................17

2 Material und Methoden ..................................................................... 18

2.1 Materialien .................................................................................................................18

2.1.1 Reagenzien.........................................................................................................18

2.1.2 Chemikalien........................................................................................................19

2.2 Gewebebank .............................................................................................................20

2.2.1 Konzept der Gewebebank ................................................................................20

II Inhaltsverzeichnis _________________________________________________________________________________

2.2.2 Gewebegewinnung und Gewebeauswahl .....................................................20

2.2.3 Gewebeaufbereitung.........................................................................................22

2.2.4 Gewebedokumentation.....................................................................................22

2.3 Molekularbiologische Methoden ............................................................................23

2.3.1 RNA-Extraktion ..................................................................................................23

2.3.2 Photometrische Ermittlung der RNA-Konzentration ....................................24

2.3.3 Agarose-Gelelektrophorese .............................................................................24

2.3.4 Reverse Transkription.......................................................................................25

2.3.5 Polymerasekettenreaktion (PCR) ...................................................................26

2.3.6 Identifikation der PCR-Produkte ......................................................................27 2.3.6.1 Restriktionsendonuklease-Verdau .............................................................................................27 2.3.6.2 Sequenzierung..................................................................................................................................28

3 Ergebnisse.......................................................................................... 30

3.1 Gewebebank .............................................................................................................30

3.2 Methodische Aspekte ..............................................................................................34

3.2.1 RNA-Extraktion ..................................................................................................34

3.2.2 RT mit Oligo (dT) und Random Hexamere....................................................36

3.2.3 Etablierung der PCR-Bedingungen................................................................36

3.2.4 Primer-Auswahl..................................................................................................38

3.2.5 CRH-BP-Doppelbande .....................................................................................39

3.2.6 Uterine und choriale Dezidua ..........................................................................40

3.3 Molekularbiologische Ergebnisse ..........................................................................41

3.3.1 CRH .....................................................................................................................41

3.3.2 Urocortin..............................................................................................................42

3.3.3 CRH-BP...............................................................................................................43

3.3.4 CRH-R1...............................................................................................................46

3.3.5 CRH-R2...............................................................................................................47

4 Diskussion.......................................................................................... 48

4.1 Gewebebank – Gewebesammlung und Patientinnenkollektiv..........................48

III Inhaltsverzeichnis _________________________________________________________________________________

4.2 Methoden...................................................................................................................49

4.2.1 RNA-Extraktion ..................................................................................................49

4.2.2 Polymerasekettenreaktion................................................................................50

4.2.3 CRH- und Urocortin-Primer..............................................................................51

4.2.4 CRH-BP-Doppelbande .....................................................................................52

4.3 Expression des CRH-Systems...............................................................................53

4.3.1 CRH .....................................................................................................................53

4.3.2 Urocortin..............................................................................................................53

4.3.3 CRH-BP...............................................................................................................54

4.3.4 CRH-Rezeptoren...............................................................................................54

5 Zusammenfassung............................................................................ 56

6 Literaturverzeichnis........................................................................... 57

7 Anhang................................................................................................ 65

7.1 Liste der verwendeten Abkürzungen.....................................................................65

7.2 Verzeichnis der Tabellen.........................................................................................68

7.3 Verzeichnis der Abbildungen..................................................................................69

1 Einleitung _________________________________________________________________________________

1 Einleitung

Neuere Forschungsergebnisse deuten darauf hin, dass dem Corticotropin Releasing-

Hormon (CRH)-System eine wichtige Rolle bei der hormonellen Steuerung der Ge-

burt des Menschen zukommt (10, 31, 49).

In dieser Arbeit wurde die messenger Ribonukleinsäure (mRNA)-Expression der

Komponenten des CRH-Systems in schwangerschaftsspezifischen Geweben mittels

Reverse Transkription-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) untersucht. Dies umfass-

te eine Gewebesammlung und die Etablierung der Methode im Labor.

1.1 Physiologie von Wehentätigkeit und Geburt

Bei der Geburt wird durch die Wehentätigkeit der Fetus kontrolliert aus dem Uterus

herausgeleitet.

Klinisch beginnt die Geburt mit der Eröffnungsperiode. Unter regelmäßigen Wehen

wird die Zervix verkürzt und der Muttermund eröffnet. Bei vollständig eröffnetem Mut-

termund kommt es zur Ruptur der Fruchtblase, damit beginnt die Austreibungsperio-

de. Nach Durchwanderung des Beckens kommt es zum endgültigen Austritt des Kin-

des aus dem mütterlichen Körper. In der anschließenden Nachgeburtsperiode wird

die Plazenta entbunden (46).

Der Funktionszustand des Uterus lässt sich in Schwangerschaft und Geburt in vier

Phasen einteilen: Ruhestellung (Phase 0), Aktivierung (Phase 1), Stimulation (Phase

2) und Involution (Phase 3) (52). In jeder Phasen haben unterschiedliche Signalstoffe

Einfluss auf den Uterus.

• Phase 0

Während der Schwangerschaft befindet sich der Uterus im Ruhezustand. Er wird

überwiegend von Progesteron beeinflusst, we lches für den Erhalt der Schwanger-

schaft ausschlaggebend ist. Progesteron wird während der ersten drei Schwanger-

schaftsmonate vom Corpus luteum gebildet, anschließend von der Plazenta. Pro-

gesteron steigt bis zur Geburt im mütterlichen Serum kontinuierlich an, auch mit We-

henbeginn findet noch kein Abfall des Serumspiegels statt. Weitere Mediatoren der

Phase 0 sind Stickstoffmonoxid (NO) und Prostazyklin (PGI2), beide Stoffe führen zur

Relaxation des Myometriums.

2 Einleitung _________________________________________________________________________________

• Phase 1

Noch vor dem Geburtstermin wird das zervikale Bindegewebe unter Prostaglandin

(PG)-Einfluss erweicht (Zervixreifung) und die Uterusmuskulatur aktiviert, so werden

beide Uterusteile auf die Geburt vorbereitet. Im Fundus uteri kommt es zur verstärk-

ten Ausbildung von Gap junctions interzelluläre Verbindungen, die zu einer synchro-

nen Kommunikation zwischen den Zellen und zur einheitlichen Ausrichtung der Mus-

kelkontraktionen führen. Gap junctions entstehen aus Connexin – ein Protein, das in

den Muskelzellen des Uterus gebildet wird. Die Rezeptorexpression und Synthese

von Oxytocin und Prostaglandinen wird gesteigert.

Die Phase der Aktivierung ist Östrogen-vermittelt. Östrogen wird von der Plazenta

durch Umwandlung aus Dehydroepiandrosteron Sulfat (DHEAS) gebildet. DHEAS

stammt aus der fetalen Nebennierenrinde (NNR). Die Östrogensynthese nimmt im

Schwangerschaftsverlauf zu. Da sie von der fetalen DHEAS-Produktion abhängig ist,

gilt der maternale Östrogen-Serumspiegel als Parameter für den Reifegrad der feta-

len Hypothalamus-Hypophysen-NNR-Achse. Östrogen fördert ebenfalls die

Prostaglandinproduktion, die in allen intrauterinen Geweben synthetisiert werden.

• Phase 2

Der aktivierte Uterus wird durch Uterotonine stimuliert. Zur Wehentätigkeit kommt es,

wenn die kontraktionsfördernden die kontraktionshemmenden Faktoren übersteigen.

In dieser Phase findet die Geburt statt. Es kommt zu koordinierten rhythmischen We-

hen, die vom Fundus augehen. Die elektromechanische Kopplung ist optimal, die

Wirkungsmöglichkeit von Oxytocin und den Prostaglandinen PG E2 und PG F2 alpha

ist maximal ausgebildet. Oxytocin ist bei empfänglichem Uterus das stärkste Utero-

tonin. Es wird im Hypothalamus produziert und im Hypophysenhinterlappen (HHL)

gespeichert. Als weitere Syntheseorte gelten die intrauterinen Gewebe und dort be-

sonders die Dezidua.

• Phase 3

In Phase 3 wird die Plazenta geboren und der Uterus zurückgebildet. Es ist die Pha-

se der Involution, sie steht hauptsächlich unter dem Einfluss von Oxytocin.

3 Einleitung _________________________________________________________________________________

Tab. 1: Die Phasen der uterinen Aktivität während Schwangerschaft und Geburt. Aufgelistet sind die wichtigsten beteiligten Mediatoren, ihre Funktion und der Zeitraum ihres Hauptauf-tretens. Phase 0 1 2 3

Funktion Ruhigstellung Aktivierung Stimulation Involution

Zeitraum in der Schwanger-schaft

Schwangerschaft Spätschwanger-schaft

Geburt Nachgeburts

periode

Funktion in der Schwanger-schaft

Erhalt der

Schwangerschaft

Zervixreifung

Deziduale Akti-vierung

Sensitivi erung des Myometriums

Geburt Rückbildung des Uterus

Wichtige Media-toren

Progesteron

Prostazyklin

NO

Zytokine Prostaglandine Östrogene

Oxytocin

PG E2

PG F2alpha

Oxytocin

Die glatte Muskulatur des Uterus unterliegt hauptsächlich einer humoralen Regula-

tion. Die Innervationsfähigkeit nimmt im Verlauf der Schwangerschaft ab (9).

1.2 Frühgeburt

Die Schwangerschaft beim Menschen dauert 281 Tage post menstruationem (p.m.).

Von einer Frühgeburt spricht man, wenn es vor Beendigung der 38. Schwanger-

schaftswoche (SSW) p.m. zur Geburt kommt (46).

Fünf bis zehn Prozent aller Kinder in den Industrieländern kommen als Frühgeborene

zur Welt (46). Diese Quote hat sich in den letzten 30 Jahren nicht verringert (12). Die

Frühgeburtlichkeit bedingt wiederum etwa 80% der perinatalen Komplikationen und

Todesfälle (77).

Die Folgeprobleme für Frühgeborene ergeben sich aus der Unreife der Organsyste-

me (69). Die wichtigsten Symptome und Ursachen einer Frühgeburt sind vorzeitige

Wehentätigkeit (VWT), Chorioamnionitiden, die utero-plazentare Insuffizienz, sowie

die Zervixinsuffizienz (46).

Die Chorioamnionitis kann eine Bedrohung für den maternalen und fetalen Organis-

mus, die utero-plazentare Insuffizienz bei starker Unterversorgung des fetalen Orga-

nismus eine Gefährdung für den Fetus darstellen. In beiden Fällen kann die vorzeiti-

ge Beendigung der Schwangerschaft indiziert sein. Die Zervixinsuffizienz stellt einen

4 Einleitung _________________________________________________________________________________

unzureichenden mechanischen Schutz des unteren Eipols dar, der unterschiedliche

Ursachen haben kann.

Vorzeitige Wehen sind regelmäßige, koordinierte, die Zervix verkürzende und den

Muttermund eröffnende Kontraktionen des Uterus, die vor Abschluss der 37. SSW

auftreten (77). Etwa ein Drittel der vorzeitigen Wehen ist infektionsbedingt (71). An-

dere Ursachen können physische und psychische Überlastung der Schwangeren,

systemische Infektionen oder Fieber sein. Auch individuelle Besonderheiten wie ge-

nitale Fehlbildungen, eine besondere Dehnung des Uterus durch eine Mehr-

lingsschwangerschaft oder ein Polyhydramnion können Ursache sein. Als weitere

Möglichkeit kommt eine Rheobasensenkung mit herabgesetzter nervaler Erregbar-

keit des Uterus in Frage. Als Risikofaktoren gelten viele vorangegangene Schwan-

gerschaften, Nikotinabusus, Schwangerschaften sehr junger und sehr alter Schwan-

gerer, ein niedriger sozialer Status sowie ein niedriges Ausgangsgewicht vor der

Schwangerschaft (46, 52).

Therapiebedürftig sind Uterusaktivitäten, wenn mehr als sechs Kontraktionen in einer

Stunde auftreten oder die Dauer einer Kontraktion mehr als 30 Sekunden beträgt.

Dabei ist die Wirksamkeit auf den Muttermund unerheblich. Andersherum gilt, bei

Eröffnung des Muttermundes oder Verkürzung der Zervixlänge ist eine tokolytische

Therapie einzuleiten, unabhängig vom Nachweis einer Wehentätigkeit (77).

Therapeutisch steht eine Vielzahl an Möglichkeiten zur Verfügung, allerdings konnte

für keine Methode der sichere Beweis für ein Sistieren der Wehen für mehr als 48

Stunden bewiesen werden (52).

1.3 Die Theorie einer Plazentaren Uhr

McLean et. al. (49) haben die These formuliert, dass die Dauer einer Schwanger-

schaft möglicherweise schon zu einem frühen Gestationszeitpunkt determiniert wird.

In dieser Theorie spielt das CRH eine entscheidende Rolle. Sie beobachteten den

CRH-Plasmaspiegel und den CRH-Bindungsprotein (CRH-BP)-Plasmaspiegel im

Verlauf der Gestation. Dabei stellten sie einen langsamen Anstieg am Anfang der

Schwangerschaft und einen steilen Anstieg von CRH kurz vor der Geburt fest. Ent-

sprechend dieser Aufwärtsbewegung fand sich ein zunehmender Abfall von CRH-BP

im Plasma zum Ende der Schwangerschaft, was die exponentielle Aufwärtsbewe-

gung von CRH noch unterstützt .

5 Einleitung _________________________________________________________________________________

Bereits durch die Messungen des CRH-Plasmaspiegels in der Frühschwangerschaft

(16. bis 20. SSW) gelang eine tendenzielle Aussage über die Dauer einer Schwan-

gerschaft. Frauen mit einem hohen CRH-Plamaspiegel hatten ein erhöhtes Risiko

einer Frühgeburt, Frauen mit einem CRH-Plasmaspiegel unterhalb des Durchschnitts

neigten vermehrt zur Übertragung.

Abb. 1: Der mütterliche CRH- und CRH-BP-Plasmaspiegel im Schwangerschaftsverlauf (entnommen aus 49). Aus dem Anstieg von CRH und den Abfall von CRH-BP resultiert ein exponentieller Anstieg von bio-verfügbarem CRH im maternalen Plasma.

Diese Ergebnisse warfen die Frage auf, ob CRH ein Marker für die schwanger-

schaftsdauer oder ein entscheidender Faktor für den Geburtszeitpunkt ist.

Derzeit wird versucht, klinische Tests zu entwickelt, die durch Messung des mütterli-

chen CRH-Plasmaspiegels und anderer Parameter eine Vorhersage über eine dro-

hende Frühgeburt treffen sollen (12).

1.4 Corticotropin Releasing-Hormon

CRH ist ein 41-Aminosäuren Polypeptid, das 1981 als hypothalamisches Neuropep-

tid charakterisiert wurde (79). Seine bekannte Funktion ist die Steuerung der Hypo-

thalamus-Hypophysen-NNR-Achse im Rahmen der Stress-Antwort. CRH wird im Hy-

pothalamus gebildet und reguliert die Ausschüttung des Adrenocorticotropen-

Hormons (ACTH) im Hypophysenvorderlappen (HVL). Transportweg des CRH ist das

hypothalamischen Portalgefäßsystem.

ACTH erreicht über den Körperkreislauf die NNR und bewirkt dort eine Cortisolaus-

schüttung. Cortisol und ACTH wirken im Sinne einer negativen Feed-back-Schleife

6 Einleitung _________________________________________________________________________________

hemmend auf die hypothalamische CRH-Ausschüttung, während Stress einen positi-

ven Impuls darstellt. CRH wurde bald auch außerhalb des Hypothalamus nachge-

wiesen, zunächst weit verbreitet im Hirn dann in der Peripherie.

Weiter, an der Wirkung von CRH beteiligte Komponenten sind das CRH-

Bindungsprotein und die CRH-Rezeptoren 1 (CRH-R1) und 2 (CRH-R2) mit ihren

Subtypen. Ebenfalls zum CRH-System wird Urocortin (UCN) gerechnet, ein CRH-

verwandtes Peptid.

1982 wurde CRH erstmals in der Plazenta nachgewiesen (74) und später auch bei

nicht Schwangeren in den weiblichen Reproduktionsorganen: Myometrium, Endo-

metrium (47) und Ovarien (48). Es wird angenommen, dass CRH am entzündlichen

Prozess der Ovulation und der uterinen Physiologie beteiligt ist.

1.4.1 CRH

Es ist bekannt, dass der maternale Plasmaspiegel des bioverfügbaren CRH beim

Menschen kurz vor der Geburt stark ansteigt (25, 49, 53) und dass das CRH-Gen in

der Plazenta exprimiert wird (32, 67). Hieraus wurde abgeleitet, dass CRH eine wich-

tige Rolle bei der menschlichen Geburt haben könnte. Weitere Befunde zeigen, dass

das plazentare CRH autokrine und parakrine Effekte auf die intrauterinen Gewebe

hat und den maternalen und fetalen Organismus beeinflusst.

Die CRH-Produktion wird bis kurz vor der Geburt von Progesteron supprimiert. Dann

stimuliert plazentares CRH die fetale DHEAS- und Cortisol-Produktion (75) und damit

die plazentare Östrogensynthese; zugleich beeinflusst es die fetale Lungenreife. In

der Spätschwangerschaft kommt es wiederum zur Stimulation des plazentaren CRH

durch fetales Cortisol (34). Diese beiden Mechanismen gekoppelt führen zu einer

weiteren Steigerung aller Komponenten – plazentares CRH, fetales Cortisol und

DHEAS (36).

CRH wurde in den Endothelzellen der Nabelschnur nachgewiesen und wirkt vasodi-

latatorisch auf die fetoplazentare Einheit; dies ermöglicht einen verstärkten Zustrom

von Signalstoffen und energieliefernden Molekülen (19, 39, 80). Plazentares CRH

erhöht die Prostaglandinsynthese in Plazenta, Dezidua, Amnion und Chorion (34),

sowie von Gewebsmakrophagen und Monozyten, aber nicht vom Myometrium (73).

Umgekehrt steigern PG E2 und Interleukin (IL) 1beta die CRH-Synthese. Dies gilt als

parakrine Wirkung von plazentarem CRH unter der Geburt.

7 Einleitung _________________________________________________________________________________

Es wird angenommen, dass CRH über die durch zyklisches Adenosinmonophosphat

(cAMP) vermittelte Wirkung auf glatte Muskulatur in der Schwangerschaft an der Ru-

higstellung des Uterus beteiligt ist (33). Am Ende der Schwangerschaft soll CRH

durch Entkoppelung der Adenylatcyclase (26) zur verstärkten Kontraktilität des Ute-

rus führen. Es gibt Theorien, nach denen CRH einen synergistischen Effekt auf die

kontraktilen Mediatoren Oxytocin (23, 64) und Prostaglandin F2 alpha hat (6). Insge-

samt gibt es jedoch unterschiedliche Aussagen zum CRH-Einfluss auf die Uteruskon-

traktion.

Die Plazenta sezerniert in der Schwangerschaft CRH in den mütterlichen Kreislauf

(25). Es wurde nachgewiesen, dass in der Schwangerschaft plazentares CRH etwa

ab der Mitte des zweiten Trimenons zu steigen beginnt und mit der Wehentätigkeit zu

Spitzenwerten gelangt, die ein Vielfaches des Ausgangswertes darstellen (25, 49,

53). Ebenso wie beim hypothalamischen CRH ist auch für plazentares CRH Stress

ein Sezernierungsreiz (58, 61). Eine CRH-Expression wurde in Myometrium, Plazen-

ta, Amnion, Chorion und Dezidua nachgewiesen (60, 67). CRH greift auf vielfältige

Weise in die Mechanismen der Geburt ein (31).

1.4.2 Urocortin

Urocortin ist ein CRH-verwandtes Peptid. Es wurde erstmals 1995 im Rattenhirn

nachgewiesen. Es besteht aus 40 Aminosäuren (AS) und weist eine 45%ige Homo-

logie zum CRH auf. UCN weist eine hohe Affinität zu den Komponenten des CRH-

Systems auf (20, 80). Dabei liegt die Affinität zu CRH-R2 deutlich höher als die von

CRH selbst. Die second-messenger-Aktivität ist ebenfalls höher als bei CRH. Es wird

angenommen, dass UCN der endogene Ligand von CRH-R2 ist. UCN bindet auch an

CRH-R1 und CRH-BP – hier liegt die Affinität ähnlich hoch wie die vom CRH. UCN

wirkt als CRH-Agonist. Ebenso wie CRH stimuliert es die ACTH-Ausschüttung aus

der Hypophyse. Möglicherweise ist Urocortin ebenfalls am Geburtsprozess beteiligt,

denn es gelang, UCN-mRNA und -Peptid in allen intrauterinen Geweben nachzuwei-

sen (57). Daraus wurde die Hypothese über eine parakrine und autokrine Wirkung

von UCN abgeleitet.

Über die Funktion von UCN ist, verglichen mit CRH, eine 30-fache vasodilatatorische

Wirkung auf die fetoplazentare Einheit bekannt (80). UCN ist in ca. 80% der mütterli-

chen Plasmen ab der 7. SSW nachweisbar, die Konzentration ändert sich im

8 Einleitung _________________________________________________________________________________

Schwangerschaftsverlauf nicht. Bei nicht Schwangeren ist kein UCN im Plasma

nachweisbar (81).

UCN ist unabhängig von Wehenbelastung in Plazenta, Eihaut, Dezidua und der Ge-

fäßmuskulatur des Myometriums nachweisbar. Deshalb wurde die Hypothese aufge-

stellt, dass UCN lokal produziert wird und regulatorisch auf die uteroplazentare

Durchblutung wirkt (15). Einige Forschungsgruppen bezweifeln eine UCN-Beteiligung

an der Schwangerschaft. Der Nachweis einer UCN-Expression in schwangerschafts-

spezifischen Geweben gelang nicht immer und im Serum wurden nicht in allen Un-

tersuchungen messbare UCN-Konzentrationen gefunden (24).

1.4.3 CRH-Bindeprotein

Das CRH-BP ist ein 37 Kilodalton Glykoprotein (74) bestehend aus 322 Aminosäuren

(63). CRH-BP mRNA konnte bisher beim Menschen in Leber und Hirn sowie im Ge-

webe von Plazenta, Amnion, Chorion und Dezidua nachgewiesen werden (59, 63).

Das CRH-BP ist für humanes CRH spezifisch (43, 44). CRH und UCN binden an

CRH-BP und verlieren so ihre Bioaktivität im Blutkreislauf. So wird in der Schwan-

gerschaft die Stimulation des HVL verhindert und es erfolgt keine ACTH-

Ausschüttung (5). Dadurch ist der ACTH-Spiegel trotz erhöhter CRH-Werte in der

Schwangerschaft kaum erhöht (65). Die Bindung von CRH an CRH-BP ist zeit- und

dosisabhängig. Die Affinität von CRH zu Rezeptoren und Bindeprotein ist ähnlich. Da

es im Portalkreislauf von Hypothalamus und Hypophyse zu einer pulsatilen Aus-

schüttung von CRH kommt und die Entfernung sehr gering ist, wird an der Hypophy-

se eine sehr hohe CRH-Konzentration erreicht, die im Rahmen der CRH-gesteuerten

Stressantwort die Funktion auf parakrine Weise aufrechterhält. Zusätzlich ist die Hy-

pophyse durch die ansteigenden Cortisolwerte am Ende der Schwangerschaft durch

die negative Feed-back-Wirkung geschützt (42).

Es kommt am Geburtstermin beim Menschen zu einem Abfall des CRH-BP im müt-

terlichen Blut (7, 43). Dieser Abfall ist mitverantwortlich für den CRH-Anstieg kurz vor

der Geburt. Gleichzeitig wird dem freien CRH eine Clearance-Funktion für CRH-BP

nachgesagt, so dass sich dadurch beide Mechanismen zusätzlich verstärken (49).

Die Leber gilt als der Hauptproduktionsort vom CRH-BP (63). Da es auch an den lo-

kalen Syntheseorten von CRH auftritt, wird dem CRH-BP eine parakrine und autokri-

ne Wirkung zugesprochen. Das CRH-BP kommt auch bei nicht schwangeren Frauen

und bei Männern im Plasma vor (44).

9 Einleitung _________________________________________________________________________________

1.4.4 CRH-Rezeptoren

Die CRH-Rezeptoren gehören zur Familie der Guanylnukleotidregulatorischen (G)

Protein-gekoppelten Rezeptoren, die über Adenylatcyc lase ihren second messenger

cAMP aktivieren und so die Wirkung ihrer Liganden (hier CRH und UCN) herbeifüh-

ren (29). Die Rezeptoren verfügen über sieben Transmembran-Domänen. Bisher

wurden zwei CRH-Rezeptor-Isoformen CRH-R1 und CRH-R2 nachgewiesen (13).

Ihre Aminnosäurensequenzen sind zu 70% identisch.

Für CRH-R1 waren zu Beginn der Arbeit die Subtypen alpha, beta, c und d bekannt,

die als Spleiß-Varianten der 14 Exon-mRNA entstehen (Abb. 2). Die codierende Se-

quenz des CRH-R1 beta liegt auf allen 14 Exons. Der CRH-R1 alpha hat eine Deleti-

on auf Exon sechs, der CRH-R1c hat zwei Deletionen, auf Exon sechs und Exon

drei, der CRH-R1d hat zwei Deletionen, ebenfalls auf Exon sechs und auf Exon 13.

Für CRH-R2 entstehen beim Spleißen die Subtypen alpha, beta und gamma (83). Es

wurde festgestellt, dass die Liganden eine unterschiedliche Affinität zu den Rezepto-

ren besitzen. CRH und UCN haben eine ähnliche Affinität zu CRH-R1, UCN weist

eine wesentlich höhere Affinität zum CRH-R2 auf als CRH. In der späten Schwan-

gerschaft steigt die Affinität von CRH zu den Rezeptoren (33).

Abb. 2: Der menschliche CRH-R1 mit seinen Spleiß-Varianten (modifiziert nach 30). Die gesamte Sequenz stellt den Subtypen CRH-R1 beta dar. Die Sequenzen, die den jeweiligen an-deren Subtypen fehlen, sind gekennzeichnet.

10 Einleitung _________________________________________________________________________________

Es liegen viele Ergebnisse zur Verteilung der Rezeptoren und ihren Subtypen vor:

CRH-R1 wurde im Myometrium des schwangeren Uterus, am Geburtstermin und vor

dem Geburtstermin, mit und ohne Wehentätigkeit (26) nachgewiesen. Die Variante

CRH-R1 alpha wurde im schwangeren und nichtschwangeren Myometrium nachge-

wiesen (27). CRH-R2 ließ sich in einem Drittel der untersuchten schwangeren Uteri

nachweisen, unabhängig von Gestationsalter und Wehentätigkeit. Der Subtyp CRH-

R2 alpha wurde im schwangeren und nichtschwangeren Myometrium nachgewiesen

und damit erstmals außerhalb des Hirns (68). Im nicht-graviden Zustand sind CRH-

R1 und CRH-R2 ebenfalls im Myometrium exprimiert (17, 22). Es wird über eine vari-

able Verteilung der CRH-Rezeptoren im Myometrium diskutiert, dies besonders im

Hinblick auf die unterschiedlichen Funktionen des Uterus während der Wehentätig-

keit. Während der Fundus starke Kontraktionen aufweist, ist das untere Uterinseg-

ment relaxiert. Es wird ebenfalls angenommen, dass sich das CRH-Rezeptor-

Expressionsmuster im Myometrium im Schwangerschaftsverlauf verändert (31).

In Chorion und Dezidua gibt es eine CRH-R1-Expression (30), jedoch nicht im Amni-

on. Die Subtypen CRH-R1 alpha und c wurden in der Plazenta und den Eihäuten

nachgewiesen (38). Eine CRH-R2-Expression konnte weder in Eihäuten noch in der

Dezidua nachgewiesen werden (78).

1.5 Die schwangerschaftsspezifischen Gewebe

1.5.1 Myometrium

Der Uterus ist ein muskelstarkes Organ, das im nicht-gravidem Zustand 6-7cm lang

ist und ca. 40-65g wiegt. Der Uterus besteht aus dem Fundus uteri, der den Corpus

uteri kuppelartig überragt. Vom Corpus uteri gehen die Eileiter ab. Der Übergang zur

Zervix uteri wird durch den Isthmus uteri gebildet. Anatomisch scheint der Isthmus

uteri eher der Zervix uteri anzugehören, er wird jedoch etwa ab dem 3. Trimenon als

das untere Uterinsegment von der Schwangerschaft mit in Anspruch genommen. Im

unteren Uterinsegment wird bei der Sectio caesarea die Uterotomie vorgenommen.

Im Schwangerschaftsverlauf steigt die Masse des Uterus etwa um den Faktor 25.

Dabei kommt es sowohl zu einer Hypertrophie der glatten Muskelzellen als auch zu

einer Hyperplasie. Während der Uterus in der Schwangerschaft stark gedehnt wird,

bleibt die Zervix bis kurz vor der Geburt straff verschlossen.

11 Einleitung _________________________________________________________________________________

1.5.2 Dezidua

Die Dezidua ist das umgewandelte Endometrium in der Schwangerschaft. Das En-

dometrium unterteilt sich in eine am Menstruationszyklus beteiligte Lamina functiona-

lis und eine der Regeneration dienenden Lamina basalis. Mit der Implantation bildet

sich aus der Lamina functionalis die Dezidua, wohingegen die Lamina basalis durch

die Schwangerschaft kaum verändert wird. Die Dezidua wird in drei Abschnitte ge-

teilt: die Dezidua capsularis bedeckt den Keim zum Uteruslumen hin, die Dezidua

basalis liegt zwischen Uterusmuskulatur und Eibasis und die Dezidua parietalis klei-

det die Uterushöhle aus. Etwa im fünften Schwangerschaftsmonat haben sich Dezi-

dua capsularis und Dezidua parietalis angenähert, die Dezidua capsularis bildet sich

zurück, so dass die Dezidua parietalis am Chorion anliegt.

Die Dezidua dient der Blutversorgung der gefäßlosen Eihäute, ist für den Ionen- und

Wassertransport für das Fruchtwasser von Bedeutung und reguliert die Permeabilität

der Einheit. Als Syntheseort für Prolaktin und Relaxin spielt sie im Hormonhaushalt

der Schwangerschaft eine Rolle. Sie ist zentraler Ort der Prostaglandinsynthese.

Immunkompetente Zellen wie Granulozyten, Makrophagen, T- und B-Lymphozyten

sind in der Dezidua nachweisbar.

1.5.3 Die fetalen Eihäute – Chorion und Amnion

Die Eihaut, bestehend aus Amnion und Chorion, enthält das Fruchtwasser, das den

Fetus umgibt. Amnion und Chorion vereinigen sich zur doppelwandigen Fruchthöhle

und sind durch eine Intermediärschicht voneinander getrennt.

Das Amnion ist eine im Stadium der zweiblättrigen Keimscheibe zwischen

Trophoblast und Ektoderm entstehende Zellschicht, die zusammen mit dem Ekto-

derm des Embryos die Amnionhöhle bildet. Die Amnionzellen bilden einen geringen

Teil des Fruchtwassers.

Das Chorion entwickelt sich aus den Trophoblasten und besitzt endokrine Funktio-

nen.

1.5.4 Plazenta

Die Plazenta hat einen Durchmesser von 15 bis 20cm, ist zwei bis vier Zentimeter

dick und wiegt ca. 500g. Die maternale Seite zeigt die Kotyledonen und ist von einer

Deziduaschicht überzogen. Die fetale Seite ist von Amnion überzogen. Dazwischen

12 Einleitung _________________________________________________________________________________

weist die Plazenta drei Schichten auf: direkt an der Uteruswand liegt die Basalplatte,

an die der Zottenbaum und schließlich die Chorionpla tte anschließt.

Mütterlicher und fetaler Kreislauf sind durch Synzytiotrophoblasten getrennt. Die Pla-

zenta dient der Ernährung des Fetus und ist zentraler Ort der hormonalen Regulati-

on. Die Synzytiotrophoblasten und Zytotrophoblasten enthalten die Enzyme, die der

Plazenta die endokrine Funktion ermöglichen.

1.6 RT-PCR

Um zu klären, ob ein Gewebe Syntheseort für ein Protein ist, kann die Genexpressi-

on für das gesuchte Protein auf mRNA-Ebene untersucht werden. Eine hierfür ge-

eignete Methode ist die RT-PCR. Bei der RT wird mRNA zu komplementärer Des-

oxyribonukleinsäure (cDNA) umgeschrieben. In der PCR wird durch Amplifizierung

ausreichender Mengen cDNA eine weitere Charakterisierung (z.B. Gelelektrophore-

se) und Identifizierung (z.B. Restriktionsanalyse und Sequenzierung) ermöglicht.

1.6.1 Molekularbiologische Grundlagen

In Nukleinsäuren sind Mononukleotide über 5´-3´-Phosphodiesterbrücken zu Poly-

nukleotidketten verknüpft. Auf der DNA ist die genetische Information codiert. Durch

Genexpression wird die biologische Information eines Gens umgesetzt und für die

Zelle nutzbar gemacht. Dieser Vorgang lässt sich in mRNA-Synthese (Transkription)

und Proteinbiosynthese (Translation) einteilen.

Die Hauptklassen der RNA lassen sich nach ihrer Funktion einteilen, deren Anteil in

der Eukaryoten-Zelle unterschiedlich hoch ist: etwa 85% ribosomale-RNA (rRNA),

10-15% transfer-RNA (tRNA) und nur 1-5% mRNA (8). r-RNA und t-RNA entstehen

bei der Transkription. Sie sind Endprodukte der Genexpression und erfüllen ihre Auf-

gabe in der Zelle als RNA-Moleküle, sie werden deshalb auch stabile RNA genannt.

mRNA durchläuft beide Stufen der Genexpression: Transkription und Translation. Sie

dient als Vermittler zwischen einem Gen, das im Zellkern liegt, und dem Expressi-

onsprodukt – einem Polypeptid, das im Cytoplasma synthetisiert wird. mRNA-

Moleküle haben in der Regel eine kurze Lebensdauer. Bei Eukaryoten liegt die

Halbwertzeit der mRNA meist bei wenigen Stunden. Die absolute Menge einer be-

stimmten mRNA wird von der Transkriptions- sowie der Abbaugeschwindigkeit des

jeweiligen Gens gesteuert.

13 Einleitung _________________________________________________________________________________

Die Transkription erfolgt im Zellkern. Die DNA wird durch RNA-Polymerase in die

prä-mRNA umgeschrieben. Die prä-mRNA enthält neben Exons (expressed regions),

die die codierenden Sequenzen (CDS) enthalten, auch Introns (intervening regions).

Nach erfolgter Transkription wird an eukaryotischer prä-mRNA an das 5´-Ende eine

schützende „Cap-Struktur“ und an das 3´-Ende ein Poly(A)-Schwanz gehängt. In ei-

nem Reifungsprozess (Spleißen) werden die Introns herausgeschnitten. Anschlie-

ßend wird die reife mRNA in das Zytoplasma transportiert.

Die Translation erfolgt im Zytoplasma. Die mRNA dient an den Ribosomen als Matri-

ze für die Proteinsynthese. Die Sequenz der Aminosäuren ist auf der codierenden

Sequenz (CDS) auf der mRNA durch Basentriplets (Codons) festgelegt. Die spezifi-

sche Aminosäuren tragende tRNA besitzt Anticodons, die es ermöglichen, die Co-

dons zu lesen und die Aminosäuren zu übertragen. Die Proteinsynthese wird durch

ein Stopcodon terminiert.

1.6.2 RNA-Extraktion

Die RNA-Extraktion erfolgt in zwei Schritten. Zunächst wird das Gewebe homogeni-

siert und lysiert, dann wird die RNA isoliert.

Die Methode von Chomczynski und Sacchi (14) erfolgt mit einem wässrigen Puffe r,

der Guanidiniumthioisocyanat, Phenol und Chloroform als Zusätze enthält. Guanidi-

nium-Salze zerstören Zellen, lösen deren Bestandteile und denaturieren ubiquitär

vorkommende endogene RNasen. Durch Phenol, Chloroform und Wasser werden

RNA, DNA und Protein aufgrund unterschiedlicher Polarität in unterschiedliche Pha-

sen getrennt. Die in wässriger Phase gelöste RNA wird durch Isopropanol ausgefällt.

Die Gesamt-RNA-Ausbeute schwankt bei der Extraktion je nach Zelltyp und Gewe-

beart. In der Regel lassen sich 0,5-30mg Gesamt-RNA aus einem Gramm Gewebe

bzw. 5x108 Zellen gewinnen (8).

1.6.3 Reverse Transkription

Die Reverse Transkription beschreibt die Umkehr des genetischen Informationsflus-

ses. Diese Umkehr kommt in der Natur nur bei Retroviren vor. In vitro wird die RT vor

der PCR zur Umschreibung der mRNA in cDNA genutzt . Die direkte Amplifikation der

instabilen mRNA mittels PCR ist nicht praktikabel, daher wird die wesentlich stabilere

cDNA für die weiteren Arbeitsschritte benutzt . Das Umschreiben wird mit Enzymen

aus Retroviren, der Reversen Transkriptase durchgeführt. Die Reverse Transkriptase

14 Einleitung _________________________________________________________________________________

benötigt als Matrize einen Primer, von dem aus die RT gestartet werden kann. Ein

Primer ist ein Oligonukleotid, das zur Zielsequenz komplementär ist und an einer

Nukleinsäure als Startermolekül für die Neusynthese eines komplementären Nuk-

leinsäurestranges dient. Die eukaryotische mRNA kann mit Oligo (dT) aufgrund der

Poly(A)-Sequenz am 3´-Ende spezifisch in cDNA umgeschrieben werden, da Oli-

go(dT) an Adenin anlagert. Zur unspezifischen Umwandlung der Gesamt-RNA kön-

nen Random Hexamere verwendet werden, sie sind ein Gemisch verschiedener He-

xamere und lagern an unterschiedliche RNA-Sequenzen an. Die Synthese erfolgt

immer vom 5´- zum 3 -́Ende der mRNA.

1.6.4 Polymerasekettenreaktion

Die PCR ist eine in vitro-Technik, die eine selektive Vervielfältigung (Amplifizierung)

eines bestimmten DNA-Abschnitts ermöglicht. Voraussetzung ist die Kenntnis der

Sequenzen, die den untersuchten DNA-Abschnitt einschließen. Als Primer müssen

zwei Oligonukleotide synthetisiert werden, die sich an die bekannten Enden des

Zielbereichs anlagern und von dort die Synthese neuer, komplementärer

Polynukleotide starten.

Die PCR besteht aus Teilschritten, die bei unterschiedlichen Temperaturen erfolgen.

Zunächst erfolgt die Trennung der DNA-Stränge (Denaturierung) bei über 90°C, im

zweiten Schritt werden Primer bei 40-70°C an die Zielsequenz angelagert (Annea-

ling). Im dritten Schritt erfolgt die Neusynthese des komplementären DNA-Stranges

(Elongation) bei 72°C. Diese Schrittfolge wird 20-50mal wiederholt.

Zwei Entwicklungen erleichterten die PCR in der Anwendung. Die Amplifizierung wird

von thermostabilen DNA-Polymerasen aus dem Bakterium Thermus aquaticus in

Gegenwart von Desoxynucleosidtriphosphaten (dNTP) ausgeführt. Die DNA-

Polymerase wird durch Hitze nicht denaturiert und muss dem Reaktionsgemisch

nicht bei jedem Temperaturzyk lus erneut zugegeben werden. Für die Steuerung der

Temperaturzyklen wurden programmierbare Heizblocksysteme entwickelt (Thermo-

cycler). Diese können die benötigten Temperatursprünge innerhalb von Sekunden

mit hoher Präzision vollziehen.

Abbildung 3 zeigt schematisch die ersten Runden einer PCR. Im ersten Zyklus wer-

den DNA-Stränge ohne definierte Länge gebildet, da die DNA-Polymerase so lange

DNA synthetisiert, bis sie zufällig stoppt oder durch den Beginn eines neuen Vermeh-

rungszyklus unterbrochen wird. Auch im zweiten Zyklus ist die Länge der PCR-

15 Einleitung _________________________________________________________________________________

Produkte noch nicht festgelegt. Ab dem dritten Zyklus werden Amplikons definierter

Länge direkt gebildet.

Abb. 3: Schema der ersten Runden einer PCR (modifiziert nach 2).

Die Vermehrung verläuft in der PCR exponentiell, da die bereits synthetisierten DNA-

Abschnitte zur Synthese weiterer Kopien dienen. In der Theorie ist ein DNA-Molekül

als Ausgangsmaterial ausreichend. Dies ist in der Praxis nicht gegeben. Die Amplifi-

kation der cDNA in der PCR zeigt einen sigmoiden Verlauf. Das heißt, dass die Aus-

beute nicht in jedem Zyklus 100% ist. Dafür gibt es mehrere Ursachen: Die Effizienz

ist von Matrize zu Matrize unterschiedlich und von der Optimierung der Methode ab-

hängig. Nach etwa 25 bis 30 Zyklen besteht ein molarer Überschuss an Ziel-DNA,

dann ist meist die Enzymmenge der begrenzende Faktor für die Effizienz der Reakti-

on. Zudem konkurrieren bei zunehmender Amplikon-Konzentration die Amplikons mit

den Primern. Hybridisieren die Zielsequenzen untereinander, so kann an diesen kei-

ne Neusynthese stattfinden. Die Enzymaktivität nimmt ebenfalls ab; obwohl das En-

zym als thermostabil bezeichnet wird, denaturiert es mit der Zeit. Meist liegt die Aus-

beute einer PCR bei etwa 70%.

Zur Positivkontrolle für mRNA werden Haushaltsgene verwendet. Dies sind ubiquitär

exprimierte Gene. Häufig verwendete Haushaltsgene sind z.B. Glycerinaldehyd-3-

16 Einleitung _________________________________________________________________________________

phosphat Dehydrogenase (GAPDH), beta-Actin und Cyklophilin A. In dieser Arbeit

wurde Cyklophilin A (Cyph) verwendet. Cyklophilin A ist der zelluläre Rezeptor von

Cyclosporin und besitzt Peptidyltransferase-Aktivität. Es wurde gewählt, da es kaum

Expressionsschwankungen unterlegen ist.

Die weitere Charakterisierung und Identifizierung der Amplikons wird mittels Gele-

lektrophorese, Restriktionsanalyse und Sequenzierung durchgeführt. Bei der Elektro-

phorese werden Nukleinsäuren aufgrund unterschiedlicher Wandergeschwindigkei-

ten im elektrischen Feld aufgetrennt. Agarose-Gel, mit Ethidiumbromid zur Anfärbung

versehen, ist als Trägermaterial für Nukleinsäuren geeignet. Nukleinsäuren wandern

im elektrischen Feld als negativ geladene Teilchen zum positiven Pol. Die Laufge-

schwindigkeit im Gel ist abhängig von der Größe und Ladung der Nukleinsäuren. Die

Nukleotid-Zahl wird durch den mitlaufenden DNA-Marker mit definierten Größen ge-

schätzt.

Bei der Restriktionsanalyse werden PCR-Produkte durch Enzyme an spezfischen

Basenkombinationen gespalten. Daraus folgt für eine Sequenz eine definierte Anzahl

von Fragmenten mit einer definierten Anzahl von Basenpaaren. Diese Fragmente

können in der Elektrophorese aufgetrennt werden. So wird die Anzahl der Fragmente

ermittelt und die Anzahl der Basenpaare geschätzt.

Die herkömmliche PCR ist eine rein qualitative Methode. Da aber oftmals eine quan-

titative Aussage von besonderem Interesse ist, wurden semiquantitative und quanti-

tative Methoden entwickelt. Eine davon ist die Real-time-TaqMan-PCR. Ihr Prinzip

beruht auf einer Markierung der in die PCR eingesetzten DNA zwischen den Prime-

ransatzstellen mit einer Oligonukleotidsonde. Diese Sonde ist mit zwei komplementä-

ren Fluoreszenzfarbstoffen markiert, der Reporter- bzw. Quencher-Fluoreszenz. Die

Sonde wird durch Taq Polymerase und deren 5 -́3´-Exonuklease-Aktivität während

der Neusynthese abgebaut. Durch Abbau der Sonde wird Fluoreszenzlicht meßbar

und steigt proportional zur Anzahl der synthetisierten PCR-Produkte. Die Quantifizie-

rung erfolgt nach der Anzahl der Zyklen. Diese wird bestimmt, wenn ein bestimmter

Fluoreszenzsignal-Schwellenwert überschritten wird. Die quantitative Analyse wird

also während der Amplifikation durchgeführt (real-time). Für eine absolute Quantifi-

zierung muss ein externer Standard erstellt werden.

17 Einleitung _________________________________________________________________________________

1.7 Fragestellungen

In dieser Arbeit wurden schwangerschaftsspezifische Gewebe bei Schnittentbindun-

gen nach unterschiedlichen Schwangerschaftsverläufen und in unterschiedlichen

Gestationsaltern gesammelt. An diesen Geweben sollte die Expression des CRH-

Systems auf der mRNA-Ebene untersucht werden. Im Einzelnen wurden folgende

Aufgaben und Fragestellungen bearbeitet.

I. Aufbau einer Gewebebank mit Myometrium, Plazenta, Dezidua, Chorion und Am-

nion von unterschiedlichen Schwangerschaften.

II. Etablierung der RT-PCR-Methoden zur Untersuchung der Genexpression der

Komponenten des CRH-Systems (CRH, UCN, CRH-BP, CRH-R1 und CRH-R2).

III. Welche Komponenten des CRH-Systems werden auf mRNA-Ebene in welchen

schwangerschaftsspezifischen Geweben exprimiert?

IV. Ist die Expression des CRH-Systems in den schwangerschaftsspezifischen Ge-

weben vom Gestationsalter und von der Wehentätigkeit abhängig?

18 Material und Methoden _________________________________________________________________________________

2 Material und Methoden

2.1 Materialien

2.1.1 Reagenzien

1st Strand Buffer Life Technologies, Karlsruhe, Deutschland

Agarose Life Technologies, Karlsruhe, Deutschland

DNA Ladepuffer (10 x): Glycerin (50%) Merck, Darmstadt, Deutschland Bromphenolblau (0,05%) Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Schweden Xylencyanol (0,05%) Bio Ras, Hercules, USA

EDTA 50mM Serva Electrophoresis GmbH, Cleveland, USA

DNA-Marker (10 Vol%): 1KB+ Ladder Life Technologies, Karlsruhe, Deutschland 25bp DNA Ladder Life Technologies, Karlsruhe, Deutschland

dNTP Mix (10mM) Life Technologies, Karlsruhe, Deutschland

Dithioethritol (DTT) (0,1M) Life Technologies, Karlsruhe, Deutschland

Hanks´salt solution Biochrom KG, Berlin, Deutschland (ohne Calcium und Magnesium)

Loading Buffer Loading Dye Solution MBI Fermentas

MgCl2 (25mM) Life Technologies, Karlsruhe, Deutschland

NaCl (5 M) Fluka Chemie GmbH, Buchs, Schweiz

Oligo (dT) Life Technologies, Karlsruhe, Deutschland

PBS Dulbecco´s Life Technologies, Karlsruhe, Deutschland (ohne Calcium, Magnesium und Natriumbicarbonat)

10xPCR Puffer minus Mg: Life Technologies, Karlsruhe, Deutschland 200mM Tris HCl (pH 8,4) 500mM KCl

Peq Gold RNA Pure peqlab Biotechnologies GmbH, Erlangen, Deutschland

Peq Gold TriFast peqlab Biotechnologies GmbH, Erlangen, Deutschland

QIA quick PCR purification Kit Qiagen, Hilden, Deutschland

Random Hexamere Life Technologies, Karlsruhe, Deutschland


Restriktionsendonukleasen: ALU I (aus Arthrobacter luteus) Boehringer, Mannheim, Deutschland HAE III (aus Haemophilus aegyptius) Boehringer, Mannheim, Deutschland

RNA-Ladepuffer hergestellt aus: Foramid (20%) 10xDNA-Ladepuffer-Farbmix (25%)

Aqua ad iniectabila (55%) B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland

Superscript Life Technologies, Karlsruhe, Deutschland

Taq DNA Polymerase Life Technologies, Karlsruhe, Deutschland

10xTBE Puffer (pH 8,0): Tris 121,14g/mol USB-United States Biochemical, Cleveland,

USA Borsäure 61,83g/mol Merck, Darmstadt, Deutschland EDTA 40ml/l 0,5M (pH 8,0) Serva Electrophoresis GmbH, Cleveland,

USA

2.1.2 Chemikalien

Aqua ad iniectabilia B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland

Chloroform J.T. Baker, Deventer, Holland

Diethylpyrocarbonate (DEPC) Sigma Aldrich Chemie GmbH, Steinheim,

Deutschland

Ethanol 100 % J.T. Baker, Deventer, Holland

Ethanol 70% (vergällt) Allchem GmbH, Freiburg, Deutschland

Ethanol 75 % J.T. Baker, Deventer, Holland

Ethidiumbromid 10mg/ml Carl Roth GmbH & Co., Karlsruhe, Deutsch-land

HCl (1M) Merck, Darmstadt, Deutschland

Isopropanol Merck, Darmstadt, Deutschland

KCl Merck, Darmstadt, Deutschland

Natriumacetat Merck, Darmstadt, Deutschland


2.2 Gewebebank

2.2.1 Konzept der Gewebebank

Folgende schwangerschaftsspezifische Gewebe wurden zwischen Februar 1999 und

Juni 2000 gesammelt: Myometrium (Mu), Dezidua (D), Plazenta (P), Chorion (C) und

Amnion (A). Die Codierung der Proben erfolgte aus der laufenden Patientinnen-

Nummer und der Abkürzung der Gewebeart. Das Gewebe wurde ausschließlich bei

Schnittentbindungen gewonnen. Die Proben stammten sowohl von Schwangerschaf-

ten, die einer Wehenbelastung ausgesetzt waren, als auch von solchen, bei denen

es zu keiner Wehentätigkeit kam. Das Gestationsalter der Schwangerschaften lag

zwischen 24 und 41 Schwangerschaftswochen. Die Schwangerschaften wurden in-

folge unterschiedlicher Indikationen beendet. Ein hoher Anteil der Schwangerschaf-

ten wiesen pathologische Verläufe auf. Zusätzlich wurde Gewebe eines nicht

schwangeren Uterus entnommen. Dieses stammte von einer Hysterektomie, die we-

gen eines Zervixkarzinoms durchgeführt wurde.

Für die beschriebene Gewebesammlung im Rahmen des von der Deutsche For-

schungsgemeinschaft (DFG) geförderten Projekts „Rolle von CRH bei der Auslösung

der Geburt“, liegt ein positives Votum der Ethikkommission der Albert-Ludwigs-

Universität Freiburg vor (Nr. 190 / 98 vom 5.10.1998).

Alle Frauen, bei denen Gewebe entnommen wurde, wurden vor der Gewebeentnah-

me in einem Aufklärungsgespräch und anhand eines vorbereiteten Informationsblatts

über das Projekt und das Vorgehen informiert und gaben schriftlich ihr Einverständ-

nis.

2.2.2 Gewebegewinnung und Gewebeauswahl

Myometrium

Nach Entwicklung des Kindes und der ersten Blutstillung entnahm der Operateur im

Zuge der Wundbegradigung Myometrium mit einem Skalpell vom oberen Rand des

unteren Uterinsegments. Das Myometrium wurde direkt im Operationssaal in das

vorbereitete Transportmedium Hanks´salt solution (Biochrom KG) gegeben.


Dezidua

Das deziduale Gewebe wurde auf zwei Arten gewonnen. Uterine Dezidua (Du) wisch-

te der Operateur mit sterilen Tupfern aus dem Cavum uteri. Von diesen Tupfern wur-

de im Operationssaal die Du abpräpariert und in das Transportmedium überführt. Um

eine ausreichend große Menge Du auf diese Weise zu gewinnen, mussten meist drei

Tupfer bearbeitet werden, was eine Zeit von ca. 10min beanspruchte. Choriale Dezi-

dua (Dc) wurde stumpf vom Chorion abgeschoben. Auf diese Weise ließen sich rela-

tiv große Mengen Dc gewinnen. Die Qualität der mit beiden Präparationstechniken

gewonnene Dezidua wurde im Rahmen einer weiteren Dissertation (72) systematisch

untersucht.

Plazenta

Die Gewinnung von Plazenta-Proben erfolgte in der Regel aus einer Kotyledone rela-

tiv nah am Nabelschnuransatz, wo die Plazenta meist die größte Dicke aufweist. Es

wurden Plazenta-Bereiche ausgewählt, die ein besonders homogenes Gewebe ohne

Blutgefäße und Septen aufwiesen und deutlich von Eihäuten und Dezidua entfernt

waren. Mit Skalpell oder Schere wurden würfelförmige Gewebestücke mit einer Sei-

tenlänge von ca. 2cm entnommen.

Die Plazenta wurde zunächst routinemäßig mit dem Neugeborenen in den Kreißsaal

gebracht. Hier erfolgte oft die Entnahme des Plazentarestblutes. Dies hatte für die

Gewebeentnahme den Vorteil, dass das Plazentagewebe weniger Blutverunreini-

gung enthielt. Bei Pathologien des Neugeborenen wurde die Plazenta zusätzlich in

der Pädiatrie untersucht. Erst im Anschluss an diese Untersuchungen konnte Plazen-

tagewebe entnommen werden.

Chorion und Amnion

Amnion- und Choriongewebe konnten wie das Plazentagewebe erst nach den Routi-

neuntersuchungen im Kreißsaal gewonnen werden.

Chorion und Amnion ließen sich nach der Freipräparierung eines Haltebereichs leicht

von Hand auseinanderziehen. Wie bei der Plazenta wurde das Gewebe nach Homo-

genität und geringster Verunreinigung ausgewählt.


2.2.3 Gewebeaufbereitung

Nach Erhalt der Gewebe wurden diese in das Transportmedium Hanks´salt solution

ohne Calcium und Magnesium (BiochromKG) gegeben. Als Transportbehälter wur-

den Mehrzweckbecher 100ml (Greiner Labortechnik, Österreich) oder PP-Röhrchen,

steril, 50ml (cellstar, Greiner Labortechnik, Österreich) verwendet. Um Verunreini-

gungen weitestgehend auszuschließen, erfolgte die Weiterverarbeitung der Gewebe

im Zellkulturlabor an der Sterilbank (Biohit Deutschland GmbH, Köln).

Um das Gewebe von Blut zu befreien, wurde es in PBS Dulbecco´s ohne Calcium,

Magnesium und Natriumbicarbonat (Life Technologies) bei Raumtemperatur durch

langsames Schütteln auf einem Schüttler (MS 2 Minishaker IKA Works, Inc. Wilming-

ton, NC) gewaschen. Die weniger verunreinigten Gewebe wurden als erstes verar-

beitet (erst Amnion, dann Chorion, dann Dezidua). Danach wurde erst Myometrium

und dann Plazenta weiter verarbeitet. Diese Gewebe wurden nicht vollständig von

Blut befreit. Der Waschvorgang wurde aber zugunsten einer schnelleren Weiterver-

arbeitungszeit abgebrochen. Die gereinigten Gewebestücke wurden zu möglichst

drei Aliquots in beschriftete Reaktionsgefäße (2,0 oder 1,5ml, Eppendorf, Hambug,

Deutschland) gefüllt und sofort in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die weitere

Lagerung erfolgte bei -70°C. Die Verarbeitungsdauer von Erhalt des Gewebes im

Operationssaal bis zum Schockgefrieren des Feuchtgewebes betrug 30-50min.

2.2.4 Gewebedokumentation

Die Proben wurden nach klinischen und labortechnischen Gesichtspunkten doku-

mentiert. Ein Gewebeinformationsblatt beinhaltete Angaben über Aliquotzahl, Lage-

rungsort und -nummer, sowie Besonderheiten bei der Verarbeitung oder makrosko-

pische Auffälligkeiten der Gewebe sowie Eckdaten der Schwangerschaft. Die spe-

ziellen klinischen Angaben wurden getrennt dokumentiert. Alle Daten wurden ent-

sprechend dem Datenschutzgesetz anonymisiert.


2.3 Molekularbiologische Methoden


Die RNA-Extraktion wurde nach der single-step-Methode von Chomczynski & Sacchi

durchgeführt (14). Dazu wurde der peq-GOLD TriFast Kit (Peqlab Biotechnologie)

benutzt.

Das bei -70°C gelagerte Gewebe wurde gewogen und in gefrorenem Zustand dis-

membriert (Mikrodismembrator II, B. Braun, Melsungen AG, Deutschland). Auf 50-

100mg Gewebe wurde 1ml peq-GOLD TriFast gegeben und erneut dismembriert.

Anschließend wurde das Homogenisat aufgetaut.

Zur Phasentrennung wurde das Homogenisat in Reaktionsgefäße (2ml, Eppendorf)

gefüllt. Pro Milliliter peq-GOLD TriFast wurden 0,2ml Chloroform (J.T. Baker) zuge-

geben. Dieses Gemisch wurde geschüttelt und anschließend zur Phasentrennung

bei 4°C und 12.000 x g für 3-10min zentrifugiert (Zentrifuge 5417 R, Eppendorf).

Hierbei entstanden als Unterphase ein DNA- und proteinhaltiges Phenol-Chloroform-

Gemisch, darüberliegend die DNA-haltige Interphase und die RNA-haltige wässrige

Oberphase. Die Oberphase wurde vorsichtig abpipettiert und in ein Reaktionsgefäß

(1,5ml, Eppendorf) zur RNA-Präzipitation überführt.

Pro eingesetztem Anteil peq-GOLD TriFast wurde ein halber Anteil Isopropanol

(Merck) zugegeben. Nach Schütteln wurde die ausgefällte RNA bei 4°C und 12.000 x

g für 60-90min abzentrifugiert.

Das weißliche, geleeartige RNA-Pellet wurde erneut mit 75%igem Ethanol (J.T. Ba-

ker) gewaschen und abschließend etwa 30min luftgetrocknet. Es wurde dabei darauf

geachtet, das Pellet nicht vollständig auszutrocknen, da dies die Löslichkeit der RNA

erheblich herabsetzt.

Zur weiteren Verarbeitung wurde die RNA mit 100µl RNase-freiem Wasser durch

wiederholtes Aufziehen in eine Pipettenspitze in Lösung gebracht. Dieser Vorgang

erforderte je nach Trockenheit des RNA-Pellets 10-20min.

Die Qualität der RNA-Extraktion wurde im Agarose-Gel geprüft. Die quantitative Ana-

lyse erfolgte photometrisch.

Die RNA-Lösung wurde für wenige Tage bei -20°C im gefällten Zustand mit

100%igen Ethanol (J.T. Baker) (2,5-faches Volumen der RNA-Lösung) und NaCl


(5M, Fluka Chemie GmbH) (0,1-faches Volumen der RNA-Lösung) gelagert. Vor der

weiteren Verarbeitung wurde dieses Ethanol-Präzipitat erneut gewaschen und gelöst.

2.3.2 Photometrische Ermittlung der RNA-Konzentration

Die Ermittlung der Konzentration der gewonnenen RNA wurde photometrisch durch-

geführt.

Dazu wurde die RNA-Absorption bei 260nm (A260) bestimmt und gegen die Absorpti-

on bei 320nm als Nullwert abgeglichen. Anhand des Verhältnisses der Absorption bei

260nm und 280nm wurde die Lösung auf mögliche Proteinverunreinigung geprüft.

Bei der Durchführung wurden die Proben auf Eis gelagert. Es wurde ein Ultrospec

3000 Photometer (Pharmacia Biotech) und eine Suprasil Quarz Küvette (Hellma)

verwendet. Der Null-Abgleich erfolgte mit DEPC-Wasser (Sigma Aldrich Chemie

GmbH). Die eingesetzte RNA wurde in DEPC-Wasser 1:100 verdünnt. Eine A260 von

1 entspricht einer Konzentration von 38µg/µl RNA (70). Berechnet wurden die Men-

gen mit 40µg/µl.

2.3.3 Agarose-Gelelektrophorese

Bei der Gel-Herstellung wurde Agarose (Life Technologies) in 1 x TBE Puffer (TRIS,

USB-United States Biochemical; Borsäure, Merck; EDTA, Serva Electrophoresis

GmbH) durch Hitzezufuhr gelöst und mit 0,5µg Ethidiumbromid (Carl Roth GmbH &

Co.) pro 50ml 1 x TBE Puffer versehen. Gel zur DNA-Charakterisierung enthielt 2%,

Gel zur RNA-Qualitätskontrolle 1% Agarose. Das Gel wurde in Gel-Kammern (Mini-

sub cell GT, 200/2.0, Bio Rad, Hercules, USA) gegossen, die mit Kämmen versehen

waren, die die Taschen für die Proben bildeten. Es wurde auf die vollständige Lö-

sung der Agarose geachtet und nach dem Gießen wurden die Luftblasen vom Gel

entfernt. Beides behindert die gleichmäßige Bandenwanderung.

Das Beladen des Gels wurde in der Elektrophorese-Kammer durchgeführt. Bei DNA

wurden 5-10µl DNA mit 2µl Ladepuffer (Glycerin, 5%, Merck; EDTA, 5%, Serva E-

lectrophoresis GmbH; Bromphenolblau 0,005%, Phamacia Biotech AB; Xylen Cyanol

0,005%, Bio Ras) gemischt. Das im Ladepuffer enthaltene Glycerin erhöht die spezi-

fische Dichte der Lösung, damit die Proben in die mit TBE gefüllten Gelkammern

hineinsinken. Der Farbstoff stellt einen Marker für die „Lauffront“ dar. Bei RNA wur-

den 2µl RNA-Probe mit 5µl RNA-Ladepuffer vermischt (Formamid 20%, 10xDNA La-

depuffer 25%, Aqua ad iniectiabila 55%).


Die Elektrophorese erfolgte in Gel-Kammern bei einer Stromstärke von 60-80mA

(EPS 300, Pharmacia Biotech, San Francisco, USA). Die Laufzeit betrug bei RNA-

Beladung etwa 30min, bei DNA-Beladung etwa eine Stunde.

Zur Sichtbarmachung der Ethidiumbromid-gefärbten Banden standen ein Transillu-

minator (302nm, Bachofer Laboratoriumsgeräte, Reutlingen, Deutschland) und ein

Image Documentation and Analysis System (Raytest, Straubenhardt, Deutschland)

zur Verfügung, hier erfo lgte auch die Dokumentation.

Die DNA-Nukleotid-Zahl der Banden wurde durch die DNA-Marker 1KB+Ladder oder

25bp DNA Ladder (beide Life Technologies) geschätzt.

Abb. 4: Verwendete DNA-Marker bei der Agarose-Gel-Elektrophorese.

2.3.4 Reverse Transkription

Die RT-Ansätze zur Denaturierung enthielten 2µg der jeweiligen RNA und wurden

auf ein Gesamtvolumen von 16µl mit DEPC-Wasser (Sigma Aldrich Chemie GmbH)

aufgefüllt. Die Denaturierung erfolgte im Thermocycler (T-Gradient Thermoblock, Bi-

ometra, Göttingen, Deutschland) bei 85°C für 5min. Die denaturierte RNA wurde bis

zur Weiterverarbeitung auf Eis gelagert.

Die cDNA-Synthese wurde mit dem „Super-Script preamplification system for first

strand cDNA Synthesis“ durchgeführt. Das Reaktionsgemisch enthielt ein Gesamtvo-

lumen von 30µl. Zur denaturierten RNA wurde First Strand RT buffer mit Tris-HCl (pH

8,3) 50mmol/l, KCl 75mmol/l, MgCl2 3mmol/l sowie Dithioethritol (DTT) 10mmol/l, Oli-

go (dT)- oder Random Hexamer-Primer 25ng/µl, dNTPs 2,7mmol/l und 10U/µl Su-

perscript II reverse transcriptase (alle Reagentien Life Technologies) gegeben. Die

cDNA-Synthese wurde bei 42°C für 90min durchgeführt, danach wurde die Enzymak-

tivität durch Hitzeinaktivierung bei 80°C über 15min gestoppt.


cDNA wurde mit DEPC-Wasser in einem Endvolumen von 90µl gelöst und bei -20°C

gelagert.

2.3.5 Polymerasekettenreaktion (PCR)

Das Gesamtvolumen des Reaktionsgemischs betrug 50µl. Es enthielt zwischen 1

und 30µl der jeweiligen cDNA (Tab. 8), PCR-Puffer bestehend aus Tris-HCl (pH 8,4)

20mmol/l und KCl 50mmol/l sowie MgCl2 1,5mmol/l, dNTP 800µmol/l, Taq DNA Po-

lymerase 0,025 U/µl (alle Reagentien Life Technologies) und die spezifischen Pri-

merpaare 4µmol/l (synthetisiert bei TIB MOLBIOL, Berlin, Deutschland) (Tab. 2). Das

Reaktionsgemisch wurde mit Aqua ad iniectabilia (B. Braun Melsungen AG) aufge-

füllt.

Tab. 2: Übersicht der verwendeten Primer.

Zielgen / Accession Nr. Richtung Primer Position Amplikonlän-ge

Refe-renz

CRH ah Sense 5´-TGGATCTCACCTTCCACCTC-3´ 481 – 500 308bp 1

NM_000756 Antisense 5´-CATTGTGTTGCTGCTGCAC-3´ 788 – 770

UCN pe Sense 5´-CAGGCGAGCGGCCGCG-´3 2809 – 2824 146bp 57

AF038633 Antisense 5´-CTTGCCCACCGAGTCGAAT-´3 2954 – 2936

CRH-BP se Sense 5´-TAGCAGGAGGAGCATCAG-3´ 481 – 498 400bp 82

X58022 Antisense 5´-GTCACAGCCAACTTTCATCT-3´ 880 – 861

CRH-R1st Sense 5´-GCCCTGCCCTGCCTTTTTCTA-3´ 235 – 255 334bp (á,d) 78

L23332 Antisense 5´-GCTCATGGTTAGCTGGACCA -3´ 568 – 549 421bp (â)

CRH-R2 ro Sense 5´-GCAGCTCGTTGACCATGAAG-3´ 609 – 627 615bp 68

U34587 Antisense 5´-GACACGAAGAAACCCTGGAA-3´ 1223 – 1204

Cyclophilin A Sense 5´-AGGGTGGTGACTTCACACGCCAT-3´ 202 – 224 268bp 4

Y00052 Antisense 5´-GTCTTGCCATTCCGGACCCAAA-3´ 469 – 447

CRH bl Sense 5´-TTTCCGCGTGTTGCTGC-´3 518 – 534 234bp 18

NM_000756 Antisense 5´-TTCCTGTTGCTGTGAGC-´3 751 – 735

CRH-R1ro Sense 5´-ACAAACAATGGCTACCGGGA-´3 275 – 294 592bp (á,c,d) 68

L23332 Antisense 5´-TCATGGGGCCCTGGTAGAT -´3 944 – 925 679bp (â)

CRH-R1bl Sense 5´-GGCAGCTAGTGGTTCGGCC-´3 219 – 238 274bp (á,d) 18

L23332 Antisense 5´-TCGCAGGCACCGGATGCTC-´3 490 – 470 361bp (â)


Das Primerpaar für CRH-BP wurde im Labor mit Hilfe des Programms Oligo 5.0 ent-

wickelt. Erste Ergebnisse mit dem Primerpaar wurden bereits veröffentlicht (82), die

anderen Sequenzen wurden der Literatur entnommen (Tab. 2). Die Primerpaare

werden nach dem Gen, das sie amplifizieren, benannt und nach den Anfangsbuch-

staben des Erstautors der Referenz.

Die Reaktionen wurden im Thermocycler (T-Gradient Thermoblock) durchgeführt.

Die Positivkontrolle der Reaktion wurde mit Cyclophili n A als Haushaltsgen durchge-

führt.

2.3.6 Identifikation der PCR-Produkte

Die Identität der PCR-Produkte wurde in Stichproben mittels Restriktionsverdau

nachgewiesen. Für jede Komponente des CRH-Systems wurde exemplarisch eine

Sequenzierung durchgeführt.

2.3.6.1 Restriktionsendonuklease-Verdau

Verwendet wurden die Restriktionsendonukleasen HAE III aus Haemophilus aegypti-

us mit der Schnittstelle GG-CC und ALU I aus Arthrobacter luteus (beide Boehringer)

mit der Schnittstelle AG-CT. HAE III und ALU I wurden in Reaktionsgemischen mit

einem Gesamtvolumen von 25µl angesetzt: 10U/µl Restriktionsendonuklease, 1µg

DNA und Puffer A (Boehringer) beim ALU I Verdau bzw. Puffer H (Boehringer) beim

HAE III Verdau. Aufgefüllt wurde mit Aqua ad iniectabilia (B. Braun Melsungen AG).

Nach einstündiger Inkubation im Heizblock (Thermostat 3401, Eppendorf, Deutsch-

land) bei 37°C wurde das Reaktionsgemisch in der Agarose-Gelelektrophorese auf-

getrennt.


Abb. 5: Restriktionsanalyse eines CRH-R1 Amplikons mit ALU I und HAE III. Das Amplikon wurde aus einer nested PCR gewonnen. Die first-round-PCR wurde mit den Primern CRH-R1ro durchgeführt. In der nested PCR wurde der CRH-R1ro sense-Primer mit dem CRH-R1bl antisense-Primer kombiniert. Die Banden 20bp und 15bp bei HAE III sind nicht abgebildet, da sie im Gel schlecht sichtbar waren.

2.3.6.2 Sequenzierung

Die Identität der PCR-Produkte wurde in Sequenzierungen kontrolliert. Die Big Dye

Terminator Cycle Sequenzierung an einem ABI Prism 377 Sequenzer (PE Biosys-

tems, Weiterstadt, Deutschland) wurde von der Core Facility der Inneren Medizin,

Abteilung I der Universität Freiburg, durchgeführt. Zur Sequenzanalyse wurde das

Programm Basic Blast 2.0 (National Center for Biotechnology Information, Washing-

ton DC, USA – www.ncbi.nlm.nih.gov) verwendet.

Um die Sequenz eines Amplikons im Big Dye Sequence Reaction Protokoll zu ermit-

teln, wurde ein Reaktionsgemisch erstellt. Dieses enthielt das Amplikon (10ng), einen

definierten Primer (3,2pmol), sowie den BigDye-Reaction Mix (4µl). Dieser Ansatz

wurde nach einem Protokoll erneut amplifiziert (Denaturierung 30s bei 96°C, Annea-

ling 15s bei 50°C, Elongation 4min bei 60°C). Das Amplikon dieser PCR wurde ext-

rahiert und zur weiteren Bearbeitung an die Core Facility gegeben.

Die PCR-Produkte wurden für die Sequenzierung entweder durch ein präparatives

Gel oder durch eine PCR-Produktreinigung vorbereitet.


Präparatives Gel und Gelreinigung

Im präparativen Gel wurde die Amplikon-haltige Bande aus dem Agarose-Gel auf

dem Transilluminator (Bachofer Laboratoriumsgeräte) geschnitten. Die Isolation des

Amplikons erfolgte im QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen). Das Gel wurde mit Puffer

entsprechend der Agarose-Konzentration und des Gel-Gewichts versehen und unter

Hitzezufuhr gelöst. Die Amplikons wurden durch QIAquick spin columns herausgefil-

tert, mit Iso-propanol (Merck) gewaschen und mit Aqua ad iniectabilia (B.Braun Mel-

sungen AG) aus dem Filtersystem gelöst.

PCR-Produktreinigung

Die PCR-Produktreinigung wurde mit dem QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen)

durchgeführt. Die Reinigung verlief durch ein Filtersystem in einer Zentrifuge (Biofug

pico, Heraeus Instruments, Osterode, Deutschland). Das PCR-Produkt wurde mit

PB-Puffer (Qiagen) im Verhältnis 1:5 verdünnt. Das Reaktionsgemisch wurde in eine

mit einem Filter versehene Säule gegeben und zentrifugiert. Das PCR-Produkt wurde

im Filtersystem gehalten, die Verunreinigungen konnten verworfen werden, danach

wurde das PCR-Produkt mit PE-Puffer (Qiagen) auf die gleiche Art gewaschen und

anschließend mit Aqua ad iniectabilia (B. Braun Melsungen AG) aus der Säule ge-

löst.

30 Ergebnisse _________________________________________________________________________________

3 Ergebnisse

3.1 Gewebebank

Bei der Gewebesammlung gab es Unterschiede in der Gewebe-Verfügbarkeit. Pla-

zenta und Eihäute wurden zu je drei Aliquots mit einem Feuchtgewicht von ca. 1g

asserviert. Die Myometriummenge war vom Operateur und der intraoperativen Situa-

tion abhängig. Die geringsten Mengen hatten ein Feuchtgewicht von etwa 90mg.

Noch geringere Gewebemengen ergaben sich für die Du. Hier lag das minimale

Feuchtgewicht eines Aliquots bei 23mg. Die Tupfer mit dem Gewebe aus dem Ca-

vum uteri enthielten große Mengen Blutkoagel und Eihautreste, wohingegen Dezidua

nur in kleinen Partikeln vorhanden war. Myometrium und Dezidua wurden bei gerin-

ger Gewebemenge in weniger als drei Aliquots asserviert. Dc konnte in ähnlich gro-

ßen Mengen asserviert werden wie von Eihäute. Diese Gewinnungsmethode wurde

zeitgleich mit dieser Arbeit entwickelt (72).

Das Feuchtgewicht wurde im gefrorenen Zustand ermittelt. Da es sich dabei um eine

Zustandsänderung ohne Mengenveränderung handelt, wurde das ermittelte Gewicht

dem Feuchtgewicht gleichgesetzt. Diese Reihenfolge wurde gewählt, um die Verar-

beitungszeit und die Kontaminationsgefahr gering zu halten.

Die Gewebebank enthielt nach der Sammelperiode von Februar 1999 bis Juni 2000

Gewebe von etwa 100 Schwangerschaften. Aus diesem Pool wurden Proben für die

weiteren Untersuchungen ausgewählt und in Gruppen unterteilt. Laborbedingte Krite-

rien waren dabei, dass die Probenmenge für die weitere Verarbeitung ausreichte, die

Zeit zwischen Entnahme und Gefrieren der Proben nicht außergewöhnlich lang war.

Die klinischen Kriterien für die Gruppenbildung waren Gestationsalter und Wehentä-

tigkeit. Daraus ergaben sich zunächst folgende vier Gruppen:

• Entbindung am Termin ohne Wehen

• Entbindung als Frühgeburt ohne Wehen

• Entbindung am Termin unter Wehen

• Entbindung als Frühgeburt unter Wehen

Im Verlauf der Arbeit wurde zusätzlich vorzeitige Wehentätigkeit berücksichtigt und

folgende Gruppen aufgenommen:

• Entbindung am Termin mit vorzeitigen Wehen

• Entbindung a ls Frühgeburt mit vorzeitigen Wehen

31 Ergebnisse _________________________________________________________________________________

Tab. 3: Übersicht über die Schwangerschaften, von denen Gewebe untersucht wurde. Die Patientinnen sind durch die Nummern der Gewebebank gekennzeichnet.

Reife SSW Keine Wehen Vorzeitige

Wehen

Wehen unter der

Geburt

Termingerechte Geburten 41 15 25 40 6, 28 29 39 24, 20, 26 23 38 62, 64

Frühgeburten 37 72, 21 71, 17 36 30 35 49 34 46, 13 33 65 32 31 30 78 29 28 18 27 40

Die einzelnen Schwangerschaftsanamnesen zeigten individuelle Besonderheiten.

Diese werden für die Patientinnen mit einer termingerechten Geburt in Tabelle 4, für

die Patientinnen mit Frühgeburten in Tabelle 5 aufgeführt, sowie exemplarisch an

einem Fallbeispiel dargestellt.

Fallbeispiel 78:

Bei einer 20-jährigen Zweitgraviden, Zweitpara kam es in der 30. SSW zur sekundären Sectio caesarea wegen drohender kindlicher Asphyxie mit unstillbarer Wehentätigkeit und V.a. Amnionin-fektsyndrom. In der 12. SSW kam es zu Abortus imminens Blutungen. In der 29. SSW traten erneut vaginale Blutungen mit vorzeitiger Wehentätigkeit auf. Mit der Verdachtsdiagnose eines Amnioninfekt-syndroms wurde tokolytisch und antibiotisch behandelt und eine Lungenreifeinduktion mit Cortison durchgeführt. In der 29+1. SSW kam es zum vorzeitigen Blasensprung. Am folgenden Tag zeig-ten sich im Cardiotokogramm (CTG) variable Dezelerationen und es wurde bei nie ganz unter-drückter Wehentätigkeit die sekundäre Sectio durchgeführt. Das Kind war hypotroph und bedurfte pädiatrischer Betreuung wegen Unreife. In der 18. SSW war eine Amnionzentese mit unauffälli-gem Ergebnis durchgeführt worden. Die erste Schwangerschaft verlief unauffällig und endete mit einer Spontangeburt in der 39. SSW.

32 Ergebnisse _________________________________________________________________________________

Tab. 4: Klinische Befunde der termingerechten Geburten. G/P gibt die Anzahl der bisherigen Schwangerschaften und Geburten an. Sectio-Datum Pat.- Nr. Alter G/P SWW Sectio-Indikation Schwangerschaftsverlauf und Vorgeschichte

07/99 15 30 3/1 40+1 Beckenendlage (BEL) bei einer Erstpara

Zustand nach (Z.n.) Abortabrasiones 1992 und 1994

08/99 28

27 2/2 39+3 Relatives Missverhältnis Z.n. sekundärer Sectio 1995 wegen relativem Missverhältnis mit anschließender positiver Gut-man-Martius Aufnahme

02/99 6 38 2/2 39+1 Relatives Missverhältnis Unauffällige Amnionzentese in der 15. SSW Einnahme von Paracetamol und Tramadol be-darfsweise ab der 34. SSW wegen Lumboischial-gie Z.n. sekundärer Sectio 1990 wegen relativem Missverhältnis

08/99 26 34 3/3 38+5 Vorausgegangene Ute-rus- Operation (OP)

C-Reaktives Protein (CRP) präpartal 1,1mg/dl, Erkältung Z.n. sekundärer Sectio 1990 wegen relativem Missverhältnis Z.n. primärer Re-Sectio 1995 wegen relativem Missverhältnis, vorzeitiger Blasensprung (VBS)

07/99 20 28 2/2 38+4 Vorausgegangene Ute-rus- OP

Z.n. Myomenukleation 1998 Z.n. Spontanpartus 1994

08/99 24 32 4/2 38+2 Relatives Missverhältnis Z.n. Abortus imminens Blutung in der 10.SSW Nikotinabusus Z.n. sekundärer Sectio 1989 wegen relativem Missverhältnis mit anschließender positiver Gut-man-Martius Aufnahme Z.n. Abortabrasio 1995 Z.n. Abruptio 1997

01/00 64 28 3/2 37+6 BEL bei relativer Erstpara Z.n. VWT 19. und 33. SSW Z.n. Bronchitis 30. SSW, antibiotische Therapie Insulinpflichtiger Gestationsdiabetes seit der 35. SSW Magnesium in der Schwangerschaft Z.n. Spontanpartus Z.n. Abruptio

01/00 62 38 4/1 37+3 BEL bei Erstpara, Uterus bicornis

Z.n. VWT und Isthmocervikale Insuffizienz (ICI) 23. und 28. SSW, Behandlung mit Diazepam und Magnesium oral, Cerclage ab 23. SSW Z.n. vaginalen Blutungen, 18. SSW Z.n. Sterilitätsbehandlung Z.n. drei Frühaborten

08/99 25 26 1/1 40+4 Sekundäre Sectio bei Geburtsstillstand

Geburtseinleitung mit Prostaglandin-Gel, intra-cervikal, wegen beginnender Gestose Digitalis Gabe ab der 30. SSW wegen fetaler Tachyarrhythmie (sub partal Metoprolol)


Wehenunterstützung mit Oxytocin Magnesium in der Schwangerschaft


Wehenunterstützung mit Oxytocin Nottokolyse vor der Sectio mit Fenoterol (Partu-sisten) Z.n. intrauteriner Fruchttod (IUFT), spontan aus-gestoßen

33 Ergebnisse _________________________________________________________________________________

Tab. 5: Klinische Befunde der Frühgeburten. Sectio-Datum Pat.-Nr. Alter G/P SWW Sectio-Indikation Schwangerschaftsverlauf und Vorgeschichte

07/99 21 29 1/1 36+6 Maternale Erkrankung Z.n. Radiatio 1999

02/00 72 35 1/1 36+2 Geminigravidität bei Erstpara mit beginnender Diskordanz

Intraoperativ Gabe von PG F2 alpha Pessareinlage in der 20. SSW Z.n. operativer Lagekorrekur des Uterus

11/99 49 23 2/1 34+6 Geminigravidität bei Erstpara mit Nabel-schnur-Komplikationen

Z.n. Abruptio 1998

07/99 18 37 6/3 27+3 Progrediente Pr ä-eklampsie

Gestosebeginn in der 25. SSW Z.n. Lungenreifeinduktion mit Celestan Z.n. Amnionzentese 15. SSW Z.n. Spontanpartus 1990 und 1992 Z.n. Abort 1994 Z.n. Abruptiones 1985 und 1996

07/99 17 25 2/3 36+4 Gemini mit Wachstums Diskordanz

VWT, 29. SSW Z.n. Spontanpartus

02/00 71 33 2/2 36+2 V.a. relatives Missver-hältnis

VWT und vaginale Candidosis, 34. SSW Z.n. Lungenreifeinduktion Z.n. sekundärer Sectio, drohender kindlicher Asphyxie 42. SSW, 1998

09/99 30 27 2/2 35+6 Maternale psychische Belastung

VWT 34. SSW, Magnesium und Diazepam Z.n. Vakuumextraktion 1994

04/99 13 42 4/1 33+5 Notsectio Drohende kindliche Asphyxie bei vaginaler Blutung bei Plazenta praevia marginalis

Z.n. Amnionzentese Z.n. Harnwegsinfekt (HWI) und Kolpitis im zweiten Trimenon Z.n. VWT und vaginaler Blutung (33. SSW), behandelt mit Magnesium, Diazepam, Cefotiam. Z.n. Lungenreifeinduktion Präpartal erhöhte Infektparameter (Leukozyten 22,5 tsd/l, CRP 3,5 mg/ml) Z.n. Abortabrasio, 8. SSW, 1997 Z.n. Abortabrasio, 25. SSW bei VBS, 1988 Z.n. Abortabrasio, 25. SSW bei VBS, 1987 Z.n. Konisation 1986

10/99 46 29 1/1 33+1 Gemini bei Erstpara, I in BEL und maternaler Harnstau

ICI mit Pessareinlage, 25. SSW VWT ab 30. SSW, Magnesium, Fenoterol, Cefoti-am, Metronidazol Präpartal erhöhte Infektparameter (CRP 2,3mg/ml) Z.n. Lungenreifeinduktion Z.n. Uretertransplantation bei vesikouretralen Reflux, 1994

01/00 65 30 1/1 32+6 Maternale psychische Belastung

Z.n. Nierenstau, 22. und 26. SSW Z.n. ICI mit Pessareinlage, 27. SSW Z.n. VWT 27. SSW, Magnesium und Diazepam Z.n. Lungenreifeinduktion Präpartal erhöhte Infektparameter (CRP 1,3mg/ml) Z.n. Beckenringfraktur 1973 Z.n. Pyelonephritis, 1991

10/99 40 30 32 26+2 BEL bei Unreife nach VBS mit drohender kindli-cher Infektionsgefahr

VBS, vaginale Streptokokken Präpartal erhöhte Infektparameter (Leukozyten 14,4tsd/l, CRP 4,8mg/ml), Cefotiam, Metronidazol VWT, Magnesium, Fenoterol, Diazepam Z.n. Lungenreifeinduktion Z.n. Spontanpartus 1990 Z.n. Konisation 1993 Z.n. Abortabrasio mit Uterusverletzung 1992

03/00 78 20 2/2 29+2 Drohende kindliche Asphyxie, bei unstillbaren Wehen und V.a. Amnio-ninfektsyndrom

Abortus Imminens 12. SSW Amnionzentese VBS 29+1. SSW VWT mit drohendem Amnioninfektsyndrom 29. SSW Vaginale Blutung 29. SSW Z.n. Spontanpartus 1998

34 Ergebnisse _________________________________________________________________________________

3.2 Methodische Aspekte


Die RNA-Qualität wurde anhand der 28S rRNA (5,0kb) und 18S rRNA (1,9kb) (2) in

der Gelelektrophorese beurteilt (Abb 6a+b). Zur weiteren Untersuchung wurden nur

Proben mit vorhandenen 28S- und 18S-Banden eingesetzt.

Die aus weniger Nukleotiden bestehende mRNA liegt im Gel unterhalb der 18S-

rRNA-Bande, ist aber nicht sichtbar, weil der mRNA-Gehalt sehr gering ist und sie

unterschiedliche Sequenzlängen hat. Befindet sich genomische DNA in der RNA-

Extraktion, treten Banden nahe der Auftragungsstelle auf. Genomische DNA besteht

aus weitaus mehr Nukleotiden (>10kb) als RNA und wandert daher im Gel weniger

weit. Eine Degradierung von RNA durch RNAse zeigt sich im Gel als breiter

„Schmier“ im Bereich kurzer Fragmente.

Abb. 6: Beispiele für die extrahierte RNA von unterschiedlicher Qualität. (a) zeigt eine intakte RNA nach Extraktion. Die 28S- und 18S -Banden sind deutlich und mit gutem Kontrast ausgeprägt. Nahe der Auftragungsstelle ist genomische DNA sichtbar. (b) zeigt eine teilde-gradierte RNA ohne genomische DNA. (c) zeigt eine degradierte RNA, es ist keine 28S- und 18S-Bande mehr sichtbar, die RNA -Fragmente sind als „Schmier“ an der „Gelfront“ sichtbar.

Die RNA-Extraktion wurde an 85 Gewebeproben durchgeführt, 26 Proben zeigten im

Gel eine Verunreinigung mit genomischer DNA. Die meisten Kontaminationen mit

genomischer DNA zeigten sich bei Chorion-Proben (12 von 16). Bei den 23 Plazen-

ta-Proben waren neun mit genomischer DNA kontaminiert. Weniger verunreinigte

Proben gab es bei Myometrium (drei von 22) und Dezidua (zwei von 18). Die sechs

Amnion-Proben zeigten keine DNA-Kontamination. In Tabelle 6 sind die RNA-Proben

mit genomischer DNA vergleichend mit den CRH- und UCN-PCR-Ergebnissen dar-

35 Ergebnisse _________________________________________________________________________________

gestellt. Aufgrund der verwendeten Primer für diese Komponenten kann genomische

DNA hier zu falsch positiven Ergebnissen führen.

Die CRH-Expression wurde an zehn Proben untersucht, die genomische DNA ent-

hielten. Die neun Plazenta-Proben zeigten eine Expression, die Dezidua-Probe zeig-

te keine.

Die UCN-Expression wurde an 24 Proben untersucht, die genomische DNA enthiel-

ten. Die drei Myometrium-Proben davon zeigten eine Expression. Insgesamt zeigten

13 von 21 Myometrium-Proben eine UCN-Expression. Sechs von acht Plazenta-

Proben mit genomischer DNA und vier von neun Plazenta-Proben ohne genomische

DNA zeigten eine UCN-Expression. Zwei Dezidua-Proben enthielten genomische

DNA und zeigten eine UCN-Expression und neun von 13 Dezidua-Proben ohne ge-

nomische DNA zeigten eine UCN-Expression. Fünf von elf Chorion-Proben mit ge-

nomischer DNA zeigten eine UCN-Expression aber keine der vier untersuchten Pro-

ben ohne genomische DNA.

Tab. 6: RNA-Proben verglichen mit den PCR-Ergebnisse von CRH und UCN. Grau hinterlegt sind Proben, die genomische DNA enthielten. (+) und (-) kennzeichnen in den Spalten CRH und UCN die Ergebnisse der durchgeführten PCR-Versuche. Für die leeren Felder liegen keine Ergebnisse vor.

Pat.-Nr. M P D C A M P D C A M P D C A15 - + - - - + +28 - + - + + + -6 + + - + -

26 - + - + - - -20 - + + - +24 - + - + - + +64 + - + -62 - + +25 + - + + -29 + + + + + +23 + + - + -21 - + -72 + - + +49 + - +18 - + - -17 + - - -71 - + +30 + + + + + +13 + + - -46 + - + +65 - + +78 +40 - + - + + + +

RNA CRH UCN

36 Ergebnisse _________________________________________________________________________________

3.2.2 RT mit Oligo (dT) und Random Hexamere

Die RT wurde alternativ mit Oligo (dT) bzw. Random Hexameren durchgeführt. Ta-

belle 21 zeigt die PCR-Ergebnisse für die unterschiedlichen CRH-Komponenten. Die

CRH- und CRH-BP-Ergebnisse zeigen unabhängig von den in der RT benutzten

Primern positive und negative Ergebnisse. Beim Nachweis von UCN und dem CRH-

R1 wurden in der PCR ausschließlich negative Ergebnisse erhoben, wenn Oligo (dT)

in der RT eingesetzt wurde.

Tab. 7: Expression der CRH-Komponenten in Abhängigkeit von den RT-Primern. Grau unterlegt sind die Proben, die mit Oligo (dT)-Primern synthetisiert wurden. Einen weißen Hinter-grund haben Proben, die mit Random Hexameren synthetisiert wurden. Für leere Felder liegen keine Ergebnisse vor. Alle Dezidua- und Chorion-Proben wurden mit Random Hexameren als Primer syn-thetisiert und sind deshalb nicht in der Tabelle aufgeführt.

3.2.3 Etablierung der PCR-Bedingungen

In dieser Arbeit wurden die PCR-Bedingungen für die untersuchten Komponenten

des CRH-Systems etabliert. Es wurde die optimale Einsatzmenge der cDNA titriert,

die geeignete Zyklenanzahl für die jeweiligen Primer in der PCR gesucht, sowie die

geeignete Annealing-Temperatur für die jeweiligen Primer in der Gradienten-PCR

CRH UCN CRH-BP CRH-R1

Pat.-Nr. Mu P A Mu P A Mu P A Mu P A

15 - + - - - + - - - -28 - + + + + + +6 + + - + + +26 - + - + - + + - + - -20 - + + - + - +24 - + + - + + +64 + - + + +62 - + + + +25 + - + + -29 + + - + + - -23 + + - + -21 - + + + +72 + - + + +49 + - + + +18 - + - + -17 + - +71 - + +30 + - + + + + -13 + + - + +46 + - + - +65 - + + + + +40 - + + + - + -78 + -

37 Ergebnisse _________________________________________________________________________________

ermittelt. Die Ergebnisse dieser Vorversuche sind exemplarisch in den Abbildungen

7-9 dargestellt.

Abb. 7: PCR mit unterschiedlichen cDNA-Einsatzmengen.

Abb. 8: CRH-BP Bande im Gel nach unterschiedlicher Anzahl PCR-Zyklen. (a) zeigt die Plazenta-Probe 26 nach 30 Zyklen. (b) zeigt die Plazenta-Probe 26 nach 35 Zyklen.

Abb. 9: Gradienten-PCR mit dem CRH-R1bl.

Tab. 8: Übersicht über angewandten RT-PCR Bedingungen.

Zielgen cDNA Vorinkubation Denaturierung Annealing Extension Long Extension Zyklen Referenz

CRH ah

1 µl

95 °C / 5 min

95 °C / 1 min

56 °C / 1 min

72 °C / 3 min

72 °C / 5 min

40

1

UCN pe 1 µl 94 °C / 3 min 94 °C / 30 s 60 °C / 40 s 72 °C / 90 s 72 °C / 10 min 35 57

CRH-BP se 1 µl 94 °C / 3 min 94 °C / 30 s 63 °C / 40 s 72 °C / 90 s 72 °C / 10 min 35 82

CRH-R1st 30 µl 95 °C / 5 min 94 °C / 30 s 62 °C / 30 s 72 °C / 30 s 72 °C / 8 min 32 78

CRH-R2ro 5 µl 94 °C / 5 min 94 °C / 1 min 62 °C / 1 min 72 °C / 2 min 72 °C / 5 min 30 68

38 Ergebnisse _________________________________________________________________________________

3.2.4 Primer-Auswahl

Die Primer wurden größtenteils aus der Literatur entnommen und die darauf aufbau-

end geeigneten Bedingungen für das Labor entwickelt.

Zum Nachweis einer CRH-Expression wurde zunächst ein Primerpaar von di Blasio

et. al. (18) verwendet – CRHbl. Die gesuchte 234bp-Bande konnte in keinem der

durchgeführten Versuche sichtbar gemacht werden. Sie wurde durch das Primerpaar

von Ahmed et. al. (1) – CRHah – ersetzt.

Für den Nachweis von CRH-R1 wurden zunächst zwei Primerpaare ausgewählt. Der

CRH-R1ro konnte die Subtypen alpha, c und d in einer Amplikonlänge von 592bp,

den Subtyp beta in einer Amplikonlänge von 679bp amplifiziert. Der CRH-R1bl Primer

amplifiziert die Subtypen alpha und d in einer Länge von 274bp und den Subtyp beta

mit 361bp. Der Subtyp c wird nicht erfasst.

Für diese beiden CRH-R1 Primerpaare ließen sich in der Gradienten-PCR keine ge-

eigneten Temperaturen finden, die sämtliche möglichen Banden darstellten. Einmalig

gelang ein Sichtbarmachen der kürzeren Bande des CRH-R1bl. Bei einer durchge-

führten nested PCR konnte der CRH-R1 Subtyp alpha und/oder d gezeigt werden.

Bei der nested PCR wurden in der first-round-PCR CRH-R1ro-Primer eingesetzt . Die-

se zeigten im Gel keine Banden. Das erhaltene PCR-Produkt wurde 1:500 verdünnt

und anstelle der cDNA in der second-round-PCR eingesetzt. Es wurde das Primer-

paar CRH-R1ro sense und CRH-R1bl antisense eingesetzt. Das erwartete Amplikon

hatte eine Länge von 216bp. Mit dieser Methode gelang der Nachweis des CRH-R1.

Das zuletzt verwendete Primer-Paar CRH-R1st amplifiziert die Subtypen alpha und d

(334bp) und beta (421bp). Der Subtyp c konnte mit diesem Primerpaar nicht nach-

gewiesen werden, da der sense Primer auf Exon drei ansetzt, der beim Subtyp c

nach Spleißen fehlt. Die Subtypen alpha und d konnten durch das Primerpaar nicht

unterschieden werden, da der Subtyp d eine Deletion auf Exon 13 hat. Dieses wurde

vom verwendeten Primerpaar nicht erfasst. Der Subtyp beta enthält als einziger Sub-

typ das Exon sechs. Dadurch wird das CRH-R1 beta Amplikon länger als die Ampli-

kons der Subtypen alpha und d und kann sich als zweite Bande darstellen.

39 Ergebnisse _________________________________________________________________________________

Exons

Isoformen 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Primer sense antisense

CRH-R1alpha

CRH-R1beta

CRH-R1c

CRH-R1d

Abb. 10: Ansatzstellen der verwendeten CRH-R1st-Primer (modifiziert nach 62).

Die ausgewählten Primerpaare von CRHah und UCNpe liegen auf einem Exon. Das

bedeutet, dass die Primer in der PCR nicht zwischen mRNA und genomischer DNA

unterscheiden. Das Vorliegen von genomischer DNA kann anhand der Gele-

lektrophorese der RNA-Extraktion beurteilt werden.

3.2.5 CRH-BP-Doppelbande

Beim Nachweis des CRH-BP in der PCR ließ sich regelmäßig neben der erwarteten

Bande in Höhe von 400bp eine zweite unerwartete Bande bei etwa 300bp nachwei-

sen. Diese Bande stellte sich ebenso eindeutig dar wie die 400bp-Bande.

Da der optische Eindruck darauf schließen ließ, dass es sich bei der zweiten Bande

um ein definiertes Amplikon handeln könnte, wurde der Frage nachgegangen, we l-

chen Ursprung diese zweite Bande hatte.

Abb. 11: Gradienten-PCR der CRH-BP-Doppelbande. Die 300bp-Bande verliert bei zunehmender Temperatur an Helligkeit und Kontrast ohne ganz zu ve r-schwinden. Die 400bp-Bande gewinnt bis zu einer Temperatur von 64,7°C an Deutlichkeit, anschlie-ßend nimmt sie wieder ab.

Es wurde eine Gradienten-PCR durchgeführt (Abb. 11, um zu klären, ob es sich um

ein temperaturabhängiges Phänomen handelte. Hierbei stellte sich die 300bp-Bande

bei niedrigeren Temperaturen deutlicher dar als die 400bp-Bande. Bei höheren Tem-

40 Ergebnisse _________________________________________________________________________________

peraturen gestaltete sich das Bild umgekehrt: die Bande bei 400bp war deutlicher

exprimiert als die 300bp-Bande. Es gelang aber an keinem Ende der Temperaturska-

la, eine solitäre Darstellung einer der beiden Banden zu erlangen.

Es wurde ein präparatives Gel durchgeführt, um beide Banden zu sequenzieren. Das

Alignment wies bei der 300bp-Bande eine Homologie von etwa 50% zur Sequenz

des CRH-BP auf und zeigte eine hohe Anzahl nicht identifizierter Basen. Die 400bp-

Bande wurde durch die Sequenzierung als CRH-BP identifiziert.

3.2.6 Uterine und choriale Dezidua

Tabelle 9 stellt die PCR-Ergebnisse der Komponenten des CRH-Systems für Dezi-

dua nach der Gewinnungsmethode dar. CRH wurde in keiner der drei Dezidua-

Proben nachgewiesen, UCN wurde in sieben von acht Dc-Proben und in drei von fünf

Du-Proben nachgewiesen. CRH-BP wurden in vier von elf Dc-Proben und in einer von

vier Du-Proben nachgewiesen. CRH-R1 wurden in zwei von fünf Dc-Proben und in

einer von zwei Du-Proben nachgewiesen. Es lag kein Hinweis auf unterschiedliche

PCR-Ergebnisse aufgrund der Dezidua-Gewinnungsmethode vor.

Tab. 9: Expression der Komponenten des CRH-Systems in uteriner und chorialer Dezidua. Grau unterlegt sind die Proben, die aus dem Cavum uteri gewonnen wurden, einen weißen Hinter-grund haben die vom Chorion abgetragenen Dezidua-Proben. Nr.15 wurde eingerahmt, da diese Pro-be in der RNA-Extraktion genomische DNA enthielt.

Pat.-Nr. CRH UCN CRH-BP CRH-R125 + -15 - + - -6 + - -20 + + +64 - -62 -21 + +72 + - -30 + +65 -40 - + +29 + -26 - - -23 + -24 - + + +17 -

41 Ergebnisse _________________________________________________________________________________

3.3 Molekularbiologische Ergebnisse

3.3.1 CRH

Es wurden 35 Gewebeproben auf ihre CRH-Expression hin untersucht. Die folgende

Abbildung zeigt beispielhaft ein Agarose-Gel der schwangerschaftsspezifischen Ge-

webe.

Abb. 12: Agarose-Gel der CRH-Expression. Dargestellt sind die Proben der Patientin Nr.15 sowie beispielhaft für alle durchgeführten PCR eine Positivkontrolle mit Cyclophilin A (von einem anderen Gel).

20 Plazenta-Proben, neun Myometrium-Proben, vier Dezidua-Proben und zwei Am-

nion-Proben wurden untersucht, Chorion-Proben wurden nicht untersucht. Mit einer

Ausnahme (P18) war bei allen Plazenta-Proben eine CRH-Expression nachweisbar.

P18 stammte von einer Schwangerschaft ohne Wehen aus der 28. SSW. Die Proben

der weiteren Gewebearten zeigten keine CRH-Expression.

42 Ergebnisse _________________________________________________________________________________

Tab. 10: Die RT-PCR Ergebnisse von CRH. Die Ergebnisse der Dezidua-Proben wurden alternativ von uteriner (Du) bzw. chorialer Dezidua (Dc) ermittelt. Nur Proben, von denen Ergebnisse vorlagen, erhielten einen Eintrag: (+) für den Nac hweis, (-) für keinen Nachweis einer Expression. Für die leer gelassenen Felder liegen keine Ergebnisse vor.

Geburtsreife Pat.-Nr. SSW Wehen M P Du Dc A

Termingerechte Geburten 15 40+1 keine Wehen - + - - 28 39+3 - + - 6 39+1 + 26 38+5 - + - 20 38+4 - + 24 38+2 - + - 64 37+6 VWT . + 62 37+3 - + 25 40+4 Wehen +

29 39+4 + 23 38+4 +

Frühgeburten 21 36+6 keine Wehen - + 72 36+2 + 18 27+3 - 30 35+6 VWT + 30 35+6 + 13 33+5 + 46 33+1 + 65 32+6 - + 40 26+4 - + -

3.3.2 Urocortin

Die UCN-Expression wurde an 72 Proben untersucht. Abbildung 13 zeigt beispielhaft

ein Agarose-Gel mit Urocortin-Expression in den verschiedenen Geweben.

Abb. 13: Agarose-Gel der UCN-Expression. Die Gewebe stammen von der Patientin Nr. 30.

Die UCN-Expression im Myometrium wurde bei acht von elf Proben von terminge-

rechten Geburten und bei sechs von zehn Proben von Frühgeburten nachgewiesen.

Vier von neun Plazenta-Proben von termingerechten Geburten waren positiv und

43 Ergebnisse _________________________________________________________________________________

sieben von neun von Frühgeburten. 15 Dezidua-Proben wurde bezüglich der UCN-

Expression untersucht. Acht von zehn termingerechten Dezidua-Proben und vier von

fünf Dezidua-Proben von Frühgeburten zeigten eine Expression. Die UCN-

Expression von Chorion wurde ebenfalls an 15 Proben untersucht, drei von acht

Proben von termingerechten Geburten und drei von sieben Proben von Frühgeburten

zeigten eine Expression. Die UCN-Expression im Amnion-Gewebe wurde an drei

Proben untersucht, zwei zeigten eine Expression. Tabelle 11 stellt die Ergebnisse

dar. Eine Abhängigkeit des Expressionsmusters von Wehen und Gestationsalter

zeigte sich nicht.

Tab. 11: Die RT-PCR-Ergebnisse von UCN.

Geburtsreife Pat.-Nr. SSW Wehen M P Du Dc C A

Termingerechte Geburt 15 40+1 keine Wehen - . + + 28 39+3 + + + - 6 39+1 + - + - 26 38+5 + - - - 20 38+4 + - + 24 38+2 + - + + 64 37+6 VWT - + - 62 37+3 + 25 40+4 Wehen - + + - 29 39+4 + + + + + 23 38+4 + - + -

Frühgeburt 21 36+6 keine Wehen - 72 36+2 - + + 49 34+6 - + 18 27+3 + - - 17 36+4 VWT + - - - 71 36+2 - + + 30 35+6 + + + + + 13 33+5 + - - 46 33+1 - + + 65 32+6 + 40 26+4 + + + + 78 29+2 Wehen +

3.3.3 CRH-BP

Für das CRH-BP liegen von 78 Gewebeproben aus 22 Schwangerschaften Ergeb-

nisse aus der RT-PCR vor. Die folgende Abbildung zeigt beispielhaft Ergebnisse der

Gewebearten im Agarose-Gel.

44 Ergebnisse _________________________________________________________________________________

Abb. 14: Agarose-Gel der CRH-BP-Expression.

In der folgenden Tabelle sind die Ergebnisse zum CRH-BP zusammengefasst.

Tab. 12: Die RT-PCR Ergebnisse vom CRH-BP.

Reife Pat.-Nr. SSW Wehen M P Du Dc C A

Termingerechte Geburten 15 40+1 keine Wehen - + - - - 28 39+3 + + + - 6 39+1 + + - - 26 38+5 + + - - 20 38+4 + - + - 24 38+2 + + + + 64 37+6 VWT + + - 62 37+3 + + - 25 40+4 Wehen + - - - 29 39+4 + - - - - 23 38+4 + - - -

Frühgeburten 21 36+6 keine Wehen + + + + 72 36+2 + + - 49 34+6 + + 18 27+3 + - - 17 36+4 VWT + - 71 36+2 + - 30 35+6 + + + - 13 33+5 + - + 46 33+1 - + - 65 32+6 + + - 40 26+4 - + + + - 78 29+2 Wehen -

Die CRH-BP-Expression zeigt in dieser Untersuchung keine Abhängigkeit vom

Gestationsalter. Bei Myometrium-Proben wurde CRH-BP-Nachweis bei zehn von elf

Proben von termingerechten Geburten und bei acht von elf Proben von Frühgeburten

nachgewiesen. In Plazenta-Proben zeigte sich CRH-BP in sieben von elf Proben von

termingerechten Geburten und bei acht von neun Proben von Frühgeburten. Diese

Gewebe zeigten unabhängig vom Gestationsalter zumeist eine CRH-BP-Expression.

45 Ergebnisse _________________________________________________________________________________

In Dezidua-Proben von termingerechten Geburten wurde CRH-BP in drei von zehn

Proben nachgewiesen und in drei von sechs Proben von Frühgeburten. Chorion-

Proben termingerechter Geburten zeigten in einer von acht Proben eine CRH-BP-

Expression und in zwei von sechs Proben von Frühgeburten. Von Amnion wurden je

drei Proben von termingerechten und Frühgeburten untersucht, eine Probe einer

Frühgeburt zeigte eine Expression. Diese drei Gewebearten zeigten unabhängig vom

Gestationsalter in den meisten Proben keine CRH-BP-Expression.

Die CRH-BP-Expression in Abhängigkeit von der Wehentätigkeit für die Gewebear-

ten zeigt Abbildung 16. Ohne Wehen zeigen neun von zehn Myometrium-Proben,

acht von zehn Plazenta-Proben, vier von acht Dezidua-Proben, zwei von sieben

Chorion-Proben und keine der beiden Amnion-Proben eine CRH-BP-Expression.

Proben mit VWT zeigten bei sechs von acht Myometrium-Proben, alle sieben Plazen-

ta-Proben, zwei von sechs Dezidua-Proben, eine von vier Chorion-Proben und eine

von drei Amnion-Proben eine CRH-BP-Expression. Bei Proben mit Wehen unter der

Geburt zeigten drei der vier Myometrium-Proben eine CRH-BP-Expression in Plazen-

ta, Dezidua, Chorion und Amnion zeigte sich keine Expression.

Die Myometrium-Probe der Gruppe mit Wehen unter der Geburt stammt von Patien-

tin Nr. 78, einer Schwangerschaft aus der 30. SSW mit einem Amnioninfektsyndrom.

Die drei anderen Schwangerschaften waren sekundäre Sectiones.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

M P D C A M P D C A M P D C A

keine WT VWT WT bei der Geburt

Pro

ben

zah

l

pos

neg

Abb. 15: CRH-BP-Expression in Abhängigkeit von der Wehentätigkeit.

46 Ergebnisse _________________________________________________________________________________

3.3.4 CRH-R1

Die CRH-R1-Expression wurde mit dem Primerpaar CRH-R1st untersucht. Dieses

Primerpaar erfasst die Subtypen CRH-R1 alpha und d in einer Amplikonlänge von

334bp und den Subtypen CRH-R1 beta in einer Amplikonlänge von 421bp. Es wur-

den ausschließlich die Expression der Subtypen CRH-R1 alpha und/oder d nachge-

wiesen. Die CRH-R1-Expression wurde an 17 Gewebeproben aus acht Schwanger-

schaften untersucht. Sechs Schwangerschaften stammten von termingerechten Ge-

burten ohne Wehen, zwei von Frühgeburten, eine ohne Wehen, die andere mit VWT.

Abb. 16: Agarose-Gel der CRH-R1-Expression. Das gesuchte Amplikon hat eine Länge von 334bp.

Bei den Myometrium-Proben zeigten sieben der acht Proben ein positives Ergebnis.

Die beiden untersuchten Plazenta-Proben waren negativ. Drei von vier Dezidua-

Proben waren positiv, die Chorion-Probe und beide Amnion-Proben waren negativ.

Der Nachweis einer CRH-R1 mRNA-Expression gelang nur in Myometrium- und De-

zidua-Proben. Der vollständig untersuchte Probensatz Nr.15 zeigte in keiner Gewe-

beart eine CRH-R1-Expression.

Tab. 13: Die RT-PCR Ergebnisse von CRH-R1.

Geburtsreife Pat.-Nr. SSW Wehen M P Du Dc C A

Termingerechte Geburt 15 40+1 - - - - - - 28 39+3 - + + 6 39+1 - + 26 38+5 - + - - 20 38+4 - + + 24 38+2 - + +

Frühgeburt 21 36+6 - + 65 32+6 VWT +

47 Ergebnisse _________________________________________________________________________________

3.3.5 CRH-R2

Der CRH-R2 wurde in Stichproben mit dem Primerpaar CRH-R2ro nachgewiesen.

Das Primerpaar unterscheidet nicht zwischen den Subtypen alpha, beta und gamma.

Die nachstehende Abbildung zeigt ein CRH-R2 Agarose-Gel.

Abb. 17: Agarose-Gel der CRH-R2-Expression.

Es wurden sechs Myometrium-Proben untersucht, alle zeigten eine CRH-R2 Expres-

sion.

Tab. 14: Die RT-PCR Ergebnisse von CRH-R2.

Geburtsreife Pat.-Nr. SSW Wehen M

Termingerechte Geburten 6 39+1 keine Wehen + 20 38+4 + 62 37+3 VWT +

Frühgeburten 21 36+6 keine Wehen + 65 32+6 VWT + 40 26+4 +

48 Diskussion _________________________________________________________________________________

4 Diskussion

4.1 Gewebebank – Gewebesammlung und Patientinnenkollektiv

In der Universitäts-Frauenklinik Freiburg gab es während der Sammelperiode (16

Monate) ca. 1.600 Geburten, davon waren ca. ein Drittel Schnittentbindungen, aus

etwa jeder fünften wurde Gewebe gewonnen. Gewebe wurde nicht entnommen,

wenn kein schriftliches Einverständnis vorlag. Etwa jede zweite Schwangere lehnte

eine Gewebeentnahme ab. Ebenfalls kein Gewebe wurde von Schwangeren mit in-

fektiösen Erkrankungen gesammelt. Nur wenige Gewebeproben konnten von sekun-

dären Sectiones gesammelt werden. Die Aufklärung der Schwangeren war in dieser

psychisch sehr belastenden Situation schwierig. Zudem konnte in diesen Fällen das

Labor oft nicht rechtzeitig informiert werden, da diese Schnittentbindungen ungeplant

und häufig nachts erfolgten. Ein weiteres Problem bei der Gewebesammlung stellte

die Gewinnung des Myometriums dar: ein Teil der Schwangeren stimmte der Ent-

nahme von Gewebe aus der Nachgeburt zu, schloss aber die Entnahme von Myo-

metrium explizit aus .

Myometrium wurde an der Uterotomie im unteren Uterinsegment entnommen. Dieser

Abschnitt des Uterus ist bei den Geburtswehen relaxiert. Wehenbelastetes Gewebe

aus dem Fundus ist nur bei Hysterektomien oder T-Schnitt-Erweiterungen der Utero-

tomie zu gewinnen, beides sind seltene Komplikationen der Schnittentbindung.

Bei den Dezidua-Entnahmetechniken ließ sich mit Dc mehr Gewebe gewinnen. Da zu

den Ergebnissen von Du keine Unterschiede zu erkennen waren, ist diese Methode

der Dezidua-Gewinnung von Vorteil.

Bei der Interpretation der Untersuchungsbefunde muss berücksichtigt werden, dass

die Proben aus einer Universitätsklinik stammten, was einen überdurchschnittlich

hohen Anteil pathologisch verlaufender Schwangerschaften besonders bei den

Schnittentbindungen erklärt.

In der Gruppe der termingerechten Geburten ohne Wehen wurden einige geplante

Schnittentbindungen erst nach dem errechneten Termin durchgeführt. Dies zeigt die

Variationsbreite beim Einsetzen spontaner Wehen bei physiologisch verlaufenden

Schwangerschaften. Bei 60% aller Spontangeburten setzen die Wehen zehn Tage

vor bis zehn Tage nach dem errechneten Termin ein (46). Möglicherweise ließe sich

durch Heranziehen des präpartalen Zervix-Scores die Geburtsnähe weiter eingren-

49 Diskussion _________________________________________________________________________________

zen. Ob klinische Untersuchungen eine ausreichende Untersucher-unabhängige

Standardisierung zulassen, ist fraglich. Da aber zur Geburt hin viele Veränderungen,

die auch das CRH betreffen, eintreten (36, 49, 75), wäre die Möglichkeit einer weite-

ren Einteilung der Phase 1 für die Untersuchung des Expressionsmusters des CRH-

Systems interessant.

Die Proben von Frühgeburten ohne Wehen beinhalten eine Schwangerschaft mit

einer progredienten Präeklampsie. Für dieses Krankheitsbild wurden bisher Untersu-

chungen bezüglich CRH durchgeführt, die sich mit CRH-Vorstufen oder dem Plas-

maspiegel befassten (1, 53, 54).

Die Proben der sekundären Sectiones waren sehr zeitnah zur Gewebegewinnung

unterschiedlichen Noxen ausgesetzt (Prostaglandin-Gel, Oxytocin, beta-2-

Sympathomime-tika). Ob und in welchem Umfang diese Noxen auf die Expression

des CRH-Systems Einfluss haben, sollte eruiert werden. Wenn es gelingen würde,

eine größere Anzahl Gewebeproben von sekundären Sectiones zu gewinnen, könn-

ten die hier erhobenen Befunde zum CRH-BP weiter geprüft werden.

Die Frühgeburt mit nicht-aufhaltbaren Wehen (Nr. 78) liegt in einem Amnioninfekt-

syndrom begründet. Vorzeitige Wehen treten zu einem Drittel infektionsbedingt über

eine Aktivierung des Zytokinsystems auf (71). Das CRH-System spielt dabei eine

untergeordnete Rolle. Andere Abweichungen von den physiologischen Prozessen

können auf eine Uterotonin-Enzymabbauschwäche (z.B. Prostaglandinhydrogenase

(PGDH)-Enzymschwäche im Chorion) zurückzuführen sein (71, 11). Bei Geminigra-

viditäten kommt es aufgrund einer starken Dehnung des Uterus häufig zu VWT und

Frühgeburten (11). Auch hier ist die Rolle des CRH-Systems eher von geringer Be-

deutung.

Zum üblichen Management einer drohenden Frühgeburt zählt die wiederholte Ce-

lestangabe. Der Einfluss dieser Noxe auf das CRH-System müsste eruiert werden.

4.2 Methoden


Die RNA-Qualität wurde mit Agarose-Gelen anhand der 28S und der 18S rRNA-

Bande beurteilt. Als kritische Punkte bei der RNA-Extraktion wurden eine Kontamina-

tion mit genomischer DNA und der RNA-Abbau durch RNase identifiziert.

50 Diskussion _________________________________________________________________________________

Innerhalb einzelner Extraktionsversuche war die RNA-Qualität konsistent und es ließ

sich eine individuelle Lernkurve erkennen. Starke Degradierungen traten bei späte-

ren RNA-Extraktionen kaum noch auf.

Empfehlenswert für die RNA-Extraktion ist ein DNase-Verdau. Auf diese Weise wer-

den genomische DNA und eventuell auftretende Amplikonverunreinigungen im Labor

abgebaut. Eine weitere Reinigungs-Methode für RNA ist der RNeasy-Kit (QiaGen).

Zum Schutz vor RNase können Lösungen und Behältnisse, mit denen die extrahierte

RNA in Berührung kommt, mit RNAse-deaktivierenden Mitteln behandelt werden.

Die Bedeutung von genomischer DNA für die Ergebnisse von CRH und UCN wird in

den Abschnitten der entsprechenden Komponenten diskutiert.

4.2.2 Polymerasekettenreaktion

Wesentliche Aspekte bei der Etablierung der RT-PCR sind die Primer-Auswahl, die

cDNA-Menge und die Annealing-Temperatur.

Die Annealing-Temperaturen wurden in der Gradienten-PCR evaluiert, die cDNA-

Einsatzmenge wurde anlehnend an veröffentlichte Arbeiten erhöht (68, 78). Zur Eta-

blierung der Methode sind Positivkontrollen der Gewebe zu empfehlen: Hypothala-

mus- für CRH und Hypophysengewebe für die weiteren Komponenten.

Für die Primerpaare CRHbl und CRH-R1bl konnten keine PCR-Bedingungen ermittelt

werden. Dies kann an Unterschieden in der Laborausstattung und Chemikalienwahl

liegen. Zu Beginn der Arbeit stand ein anderer Thermocycler (Techne Genius) zur

Verfügung. Auch die RNA-Qualität könnte von Bedeutung sein, die ersten Extraktio-

nen zeigten im Agarose-Gel starke RNase Wirkungen, was die photometrische Kon-

zentrationsermittlung beeinflußte. Außerdem wurden die Primerpaare z.T. in anderen

Geweben eingesetzt : CRHbl und CRH-R1bl in Endometrium (18), CRH-R1ro in Myo-

metrium von Schwangeren und nicht Schwangeren (68). Mit dem Primerpaar CRH-

R1ro konnten Ergebnisse erhoben werden (Abb. 9), jedoch nicht zum Subtypen beta

und überwiegend in der aufwendigeren nested-PCR. Die Primer wurden durch ande-

re ersetzt. Das verwendete Primerpaar CRH-R1st ist grundsätzlich in der Lage, die

Subtypen alpha und d sowie den Subtyp beta nachzuweisen (78). Der Subtyp c, der

bereits in Myometrium, Plazenta und Eihäuten nachgewiesen wurde (27, 38), ist mit

diesem Primerpaar nicht nachweisbar. Für den Subtypen beta wurden mit diesem

Primerpaar weder in dieser noch in anderen Arbeiten Ergebnisse erzielt (78).

51 Diskussion _________________________________________________________________________________

Der Erfolg einer PCR könnte auch von den eingesetzten Primern in der RT abhängig

sein. Random Hexamere zeigten sich in dieser Arbeit den Oligo (dT) überlegen. Pro-

ben, die mit Oligo (dT) umgeschrieben wurden, zeigten nie eine UCN- und CRH-R1-

Expression (Tab.18). Dies könnte daran liegen, dass die mRNA in der RT nicht voll-

ständig zu cDNA umgeschrieben wurde. Oligo (dT) startet die Synthese vom Poly-A-

Schwanz der mRNA. Liegt dann das PCR-Primerpaar nahe dem 5´-Terminus, kön-

nen diese bei unvollständiger Transkription nicht anlagern und es erfolgt keine Ampli-

fikation. So traten in der PCR möglicherweise falsch negative Ergebnisse auf. Ran-

dom Hexamere unterscheiden nicht zwischen den RNA-Spezies, sie setzen zufällig

an und starten die cDNA-Synthese an verschiedenen Stellen. Die entstehenden

cDNA-Sequenzen variieren in Länge und je nach transkribiertem Abschnitt.

Die RT-PCR erbringt einen Nachweis über die Expression in einem Gewebehomo-

genisat. Um die mRNA-Expression des CRH-Systems auf zellulärer Ebene nachzu-

weisen, könnte eine in situ-PCR angewendet werden.

4.2.3 CRH- und Urocortin-Primer

Die Primerpaare von CRHah und UCNpe liegen auf einem Exon. Am Beispiel des

UCN wird die Problematik in der PCR dargestellt.

Das UCN-Gen des Menschen liegt auf dem Chromosom 2. Es ist 3081bp lang und

beinhaltet zwei Exons. Ein Exon liegt zwischen Position 2216 und 2318 und ist

103bp lang, das zweite Exon befindet sich zwischen Position 2540 und 3081, es ist

512bp lang. Die codierende Sequenz liegt vollständig auf dem zweiten Exon von Po-

sition 2583 bis Position 2957. Das in dieser Arbeit verwendete Primerpaar lagert mit

dem sense-Primer an die Positionen 2809 bis 2824 an, der antisense-Primer an die

Positionen 2954 bis 2936. Das Primerpaar überspannt kein Intron. Genomische DNA

und cDNA werden in gleicher Länge amplifiziert und können nicht unterschieden

werden.

Das Vorliegen genomischer DNA wurde in den Gelen der RNA-Extraktion geprüft

und diese mit den Ergebnissen der CRH- und UCN-Expression verglichen. Es zeigte

sich keine Korrelation zwischen den CRH- und UCN-Ergebnissen bezüglich der Pro-

ben, die genomische DNA enthielten. Der Gehalt genomischer DNA erscheint durch

die deutlich ausgeprägten Banden sehr hoch. Ethidiumbromid interkaliert in den Nuk-

leinsäuren. Durch dessen höhere Anzahl in genomischer DNA wird der Gehalt leicht

überschätzt. Die Amplifikation genomischer DNA kann mit GAPDH als Haushaltsgen

52 Diskussion _________________________________________________________________________________

direkt geprüft werden (3, 68). GAPDH überspannt ein 114bp Intron. So entsteht bei

Amplifikation von genomischer DNA eine 354bp-Bande, bei cDNA eine 240bp-

Bande. Hierbei stehen aber das kurze und das lange Amplikon in Konkurrenz zuein-

ander. Die Neusynthese kürzerer Amplikons wird schneller durchgeführt, als die län-

gerer Amplikons. Bei geringem Gehalt genomischer DNA nimmt die Amplifikation der

längeren Sequenz weiter ab. Folglich kann auch diese Methode die Amplifikation

genomischer DNA nicht sicher ausschließen. Cyclophilin A ist für den Nachweis ge-

nomischer DNA nicht geeignet. Die Primerpaare liegen auf der DNA mehrere tau-

send Basenpaare auseinander. Ein derart langes Amplikon wird in der RT-PCR nicht

synthetisiert.

Zur sicheren Vermeidung dieses methodischen Problems müssen die Primer auf un-

terschiedlichen Exons positioniert werden.

4.2.4 CRH-BP-Doppelbande

Die positiven Ergebnisse der CRH-BP-Expression zeigten im Agarose-Gel neben der

erwarteten 400bp-Bande häufig eine weitere Bande bei etwa 300bp. In der Sequen-

zierung wurde die 400bp-Bande als CRH-BP identifiziert. Das 300bp-Amplikon wurde

durch Sequenzierung keinem Gen eindeutig zugeordnet, es zeigte eine 50%ige Ho-

mologie zum CRH-BP. Die Gradienten-PCR zeigte die 300bp-Bande temperaturab-

hängig in der Bandenausprägung, aber nicht in der Existenz.

Mögliche Herkunft der 300bp-Bande wäre eine weitere Anlagerungsstelle auf der

mRNA für einen der Primer, so dass eine zweite, kürzere Variante des CRH-BP

Amplikons amplifiziert werden könnte. Die geringe Homologie der Sequenzen spricht

allerdings eher gegen diese These. Möglicherweise handelt es sich um ein Bruch-

stück des CRH-BP Amplikons, aber auch diese Annahme steht im Widerspruch zum

Ergebnis der Sequenzierung. Ein weiterer Erklärungsversuch liegt in der Annahme,

dass das Amplikon eine Sekundärstruktur annimmt und deshalb im Gel als 300bp-

Bande erscheint. Ein Argument für diese These ist, dass in der Sequenzierung ein

hoher Anteil der Basen nicht identifiziert werden konnte. Ob eine Sekundärstruktur

möglich ist, die im Gel als 300bp-Bande erscheint, ließe sich mit entsprechender

Software ermitteln. Das Phänomen einer Nebenbande wurde bereits beschrieben

(78), jedoch ohne Angaben von Ursachen.

53 Diskussion _________________________________________________________________________________

4.3 Expression des CRH-Systems

4.3.1 CRH

Eine CRH-Expression auf mRNA-Ebene wurde in dieser Arbeit in 19 von 20 Plazen-

ta-Proben beobachtet (Tab.12). Lediglich bei Plazenta-Probe Nr.18 aus der 27+3.

SSW wurde keine CRH-Expression nachgewiesen. Grund könnte die frühe Schwan-

gerschaftswoche sein. Der CRH-Plasmaspiegel ist in frühen SSW sehr niedrig (49).

Dies könnte sich bei der Expression in der Plazenta widerspiegeln. Bei dieser

Schwangerschaft waren bis zur Geburt keine Wehen aufgetreten. Plazenta-Probe Nr.

40 aus der 26+4. SSW exprimierte CRH, hier kam es im Schwangerschaftsverlauf zu

vorzeitigen Wehen. Ein falsch positives Ergebnis der Probe Nr.40 ist nicht

auszuschließen, da diese Probe genomische DNA enthielt und das CRHah-

Primerpaar auf einem Exon anlagerte. Ebenfalls wäre in diesen frühen SSW eine

interindividuelle Differenz in der CRH-Expression der Plazenta eine mögliche

Begründung. Myometrium, Dezidua und Amnion wurden in dieser Arbeit stichprobenartig unter-

sucht und zeigten keine CRH-Expression. Dagegen wurde in anderen Studien eine

CRH-Expression in allen schwangerschaftsspezifischen Geweben nachgewiesen. In

weiterführenden Versuchen im hiesigen Labor mit nested-PCR wurde CRH ebenfalls

in allen schwangerschaftsspezifischen Geweben nachgewiesen (82).

4.3.2 Urocortin

Die Urocortin-Expression zeigte ein heterogenes Bild. Nur ein Teil der Proben expri-

mierte UCN, unabhängig von Gewebeart, Gestationsalter und Wehentätigkeit (Tab.

13). Das UCNpe Primerpaar lag auf einem Exon. Deshalb können Proben, die geno-

mische DNA enthielten, falsch positive Ergebnisse gezeigt haben (Tab. 10). Bei Be-

trachtung der Chorion-Proben zeigt sich, dass keine der vier Proben ohne genomi-

sche DNA eine UCN-Expression zeigten. Proben, die genomische DNA enthielten,

zeigten in fünf von elf Proben eine UCN-Expression. Mit denselben Proben wurde

CRH untersucht. Im Vergleich der CRH- und UCN-Ergebnisse zeigen sich keine

Übereinstimmungen bezüglich der Proben. Bei späteren UCN-Untersuchungen mit

einer quantitativen PCR zeigte sich jedoch eine sehr niedrige UCN-Expression in

schwangerschaftsspezifischen Geweben.

Anders als bei CRH gibt es für UCN keine deutlichen Hinweise auf eine wichtige Rol-

le bei Schwangerschaft und Geburt. Weder wurden Veränderungen des maternalen

54 Diskussion _________________________________________________________________________________

UCN-Plasmaspiegels im Schwangerschaftsverlauf gemessen, noch traten Unter-

schiede zum UCN-Plasmaspiegel nicht Schwangerer auf (15). Dennoch zeigt Urocor-

tin eine Expression in den schwangerschaftsspezifischen Geweben (57) und hat eine

starke vasodilatatorische Wirkung auf die fetoplazentare Einheit. Die Rolle von Uro-

cortin und anderen, dem CRH verwandten, Peptiden in der Schwangerschaft bedür-

fen weiterer Klärung. Erst kürzlich wurden UCN II und UCN III nachgewiesen, die

ausschließlich an CRH-R2 binden (41, 60).

4.3.3 CRH-BP

In dieser Arbeit wurde erstmals eine CRH-BP-Expression in allen schwangerschafts-

spezifischen Geweben, auch im Myometrium, nachgewiesen (82). Eine CRH-BP-

Expression wurde zuvor in Plazenta, Dezidua und Eihäuten beschrieben (59).

CRH-BP wurde in 18 von 22 Myometrium-Proben und in 15 von 20 Plazenta-Proben

nachgewiesen. Dezidua, Chorion und Amnion wurde stichprobenartig untersucht

(Tab. 12). Die Ergebnisse deuten auf ein CRH-BP-Expressionsmuster hin, das von

Wehen abhängig sein könnte . Proben von Schwangerschaften ohne Geburtswehen

exprimierten CRH-BP in allen Gewebearten, Proben von sekundären Sectios expri-

mierten CRH-BP ausschließlich im Myometrium. Aufgrund der kleinen Fallzahl erfor-

dern diese Ergebnisse eine weitere Sicherung. Interessant wäre eine quantitative

Untersuchung mittels Taq Man und eine Untersuchung auf Protein-Ebene, beispiels-

weise mit Western Blot. Interessant wäre auch das räumliche Verteilungsmuster im

Myometrium, da das Myometrium unter der Geburt gleichzeitig unterschiedliche

Funktionen hat. Hier wurde ausschließlich Myometrium aus dem unter der Geburt

relaxierten unteren Uterinsegment untersucht.

4.3.4 CRH-Rezeptoren

Die CRH-Rezeptoren weisen unterschiedliche Subtypen auf. Seit Beginn der Arbeit

wurden weitere CRH-R1-Subtypen beschrieben. Die folgende Abbildung demons t-

riert die aktuell bekannten Spleiß-Varianten.

Aus der Abbildung ergibt sich, dass mit dem CRH-R1st-Primerpaar die Subtypen al-

pha, d, f und g nicht-unterscheidbar nachgewiesen werden konnten. Der Subtyp beta

zeigte keine Expression. Er wurde bisher nur mit spezifischen Primerpaaren im My-

ometrium nachgewiesen (22, 27). Vom CRH-R2 sind die Subtypen alpha, beta und

gamma bekannt. Das verwendete Primerpaar differenziert diese nicht (68).

55 Diskussion _________________________________________________________________________________

Abb. 18: Schematische Darstellung der Spleiß-Varianten des menschlichen CRH-R1 (101). Eine mögliche Weiterführung dieser Arbeit bestünde in der Untersuchung zur regio-

nalen Verteilung der CRH-Rezeptoren und ihrer Subtypen in schwangerschaftsspezi-

fischen Geweben, insbesondere auch die regionale Verteilung innerhalb des Uterus.

CRH-R1

Eine CRH-R1-Expression wurde in Myometrium und Dezidua nachgewiesen (Tab.

13). Gewebe von Plazenta und Eihäuten wurde stichprobenartig untersucht und zeig-

te keine Expression. Dies steht im Gegensatz zu anderen Arbeiten (22, 38). Auch im

hiesigen Labor gelang später mit einer nested-PCR der CRH-R1-Nachweis in allen

schwangerschaftsspezifischen Geweben.

Jede Gewebeart von Patientin Nr. 15 wurde untersucht und es konnte nie eine CRH-

R1-Expression nachgewiesen werden. Auch in Myometrium und Dezidua zeigte Nr.

15 als einzige der untersuchten Proben keine CRH-R1-Expression. Es stellt sich die

Frage, ob dies eine individuelle Variante darstellt, oder Ergebnis methodischer Prob-

leme ist. Das Ergebnis wird dadurch gestützt, dass nicht alle Ergebnisse der Nr. 15 in

derselben PCR erhoben wurden. Die RT der Myometrium-, Plazenta- und Amnion-

Probe wurde mit Oligo (dT) durchgeführt, die der Dezidua aber mit Random Hexame-

re. Für Plazenta-, Dezidua- und Chorion-Gewebe liegen für andere Komponenten

des CRH-Systems positive Nachweise vor. Bei Betrachtung des Schwangerschafts-

verlaufs zeigen sich keine Auffälligkeiten. Interessant wäre zu beobachten, ob dieses

Phänomen bei weiteren Einzelfällen auftritt, und in welchem Stadium der uterinen

Aktivität die Rezeptorexpression erhoben wurde, da angenommen wird, dass sich die

Rezeptorexpression im Verlauf der Stadien der uterinen Aktivität ändert (31).

56 Zusammenfassung _________________________________________________________________________________

5 Zusammenfassung

Zahlreiche Veröffentlichungen der letzten Jahre deuten auf eine zentrale Rolle von

CRH bei der hormonellen Steuerung der menschlichen Geburt.

In dieser Arbeit wurde die mRNA-Expression von Corticotropin Releasing-Hormon

(CRH), Urocortin (UCN), CRH-Bindungsprotein (CRH-BP) sowie der CRH-

Rezeptoren 1 und 2 (CRH-R1 bzw. 2) an menschlichen schwangerschaftsspezifi-

schen Geweben, die bei Schnittentbindungen gewonnen wurden, mittels Reverse

Transkription-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) untersucht. Dazu wurde eine Ge-

webebank mit Myometrium, Plazenta, Dezidua, Chorion und Amnion von ca. 100 Pa-

tientinnen aufgebaut.

Zunächst wurden die RT-PCR-Methoden für alle o.g. Komponenten des CRH-

Systems etabliert. Untersuchte Einflussgrößen waren dabei die RNA-Qualität, die

Primerauswahl und die Austestung geeigneter PCR-Bedingungen mittels Gradien-

ten-PCR. Bei CRH und UCN wurde als kritischer Punkt die Kontamination der RNA

mit genomischer DNA identifiziert.

Eine CRH-Expression wurde unter den angewandten PCR-Bedingungen ausschließ-

lich in Plazenta gefunden (in 19 von 20 Proben). Dagegen wurde das verwandte

Peptid UCN auch in anderen Geweben nachgewiesen. Im Myometrium wurde erst-

mals die Expression von CRH-BP nachgewiesen, welches darüber hinaus auch in

Plazenta, Dezidua, Chorion und Amnion gefunden wurde. CRH-R1 wurde in Myo-

metrium und Dezidua, nicht aber in Plazenta und Amnion gefunden. Im Myometrium

war ferner eine CRH-R2-Expression nachweisbar.

Die Ergebnisse zum CRH-BP deuten auf ein wehenabhängiges Expressionsmuster

hin. Proben primärer Sectiones exprimierten CRH-BP in allen schwangerschaftsspe-

zifischen Geweben, Proben sekundärer Sectiones ausschließlich in Myometrium.

Die Beobachtung, dass CRH in der Plazenta und seine Rezeptoren in den Zielgewe-

ben Myometrium und Dezidua exprimiert werden, stützt das Modell, dass intrauterin

gebildetes CRH an der hormonellen Steuerung der Geburt beteiligt ist.

Offene Fragen zur Rolle von CRH beim Geburtsprozess bestehen u.a. noch bezüg-

lich quantitativer Daten zur Expression des CRH-Systems auf mRNA-Ebene in Ab-

hängigkeit von Gestationsalter und Wehentätigkeit und der räumlich differentiellen

Expression von CRH-Rezeptoren und ihrer Subtypen im Uterus.

57 Literaturverzeichnis _________________________________________________________________________________

6 Literaturverzeichnis

1. Ahmed I, Glynn BP, Perkins AV, Castro MG, Rowe J, Morrison E, Linton EA (2000) Processing of procorticotropin-releasing hormone (pro-CRH): Molecu-lar forms of CRH in normal and preeclamptic pregnancy. Journal of Clinical Endocrino logy and Metabolism 85: 755-764

2. Alberts B, Bray D, Lewis J, Raff M, Roberts K, Watson JD (1994) Molecular

biology of the cell. Third Edition. Garland Publushing Inc., New York, London 3. Bamberger CM, Wald M, Bamberger AM, Süleyman E, Beil FU, Schulte HM

(1998) Human lymphocytes produce urocortin, but not corticotropin-releasing hormone. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 83: 708-711

4. Behan DP, De Souza EB, Potter E, Sawchenko P, Lowry PJ, Vale WW (1996)

Modulatory actions of corticotropin-releasing factor-binding protein. Annals of the New York Academy of Sciences 780: 81-95

5. Behan DP, Linton EA, Lowry PJ (1989) Isolation of the human plasma cortico-

trophin-releasing factor-binding protein. Journal of Endocrinology 122: 23-31

6. Benedetto C, Petraglia F, Marozio L, Chiarolini L, Florio P, Genazziani AR, Massobrio M (1994) Corticotropin-releasing hormone increases prostaglandin F2 alpha activity on human myometrium in vitro. American Journal of Obstet-rics and Gynecology 171: 126-131

7. Berkowitz GS, Lapinski RH, Lockwood CJ, Florio P, Blackmore-Prince C,

Petraglia F (1996) Corticotropin-releasing factor and its binding protein: Ma-ternal serum levels in term and preterm deliveries. American Journal of Ob-stetrics and Gynecology 174: 1477-1483

8. Brown TA (1999) Moderne Genetik. 2. Auflage. Spektrum Akademischer Ver-

lag, Heidelberg, Berlin

9. Casey ML, MacDonald PC (1997) The endocrinology of human parturition. Annals of the New York Academy of Sciences 828: 273-284

10. Challis JRG, Matthews SG, Gibb W, Lye SJ (2001) Endocrine and paracrine

regulation of birth at term and preterm. Endocrine Reviews 21: 514-550

11. Challis JRG, Sloboda DM, Alfaidy N, Lye SJ, Gibb W, Patel FA, Whittel WL, Newnham JP (2002) Prostaglandins and mechanisms of preterm birth. Repro-duction 124: 1-17

12. Chan EC, Smith R (2001) Lessons in labour. Trends in Endocrinology and Me-

tabolism 12: 44-46

13. Chen R, Lewis KA, Perrin MH, Vale WW (1993) Expression cloning of a hu-man corticotropin-releasing-factor receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 90: 8967-8971


14. Chomczynski P, Sacchi N (1987) Single-step method of RNA isolation by acid

guanidine thiocyanate-phenol-chloroform. Analytical Biochemistry 162:156-159

15. Clifton VL, Qing G, Murphy VE, Schwartz J, Madsen G, Smith R (2000) Local-

ization and characterization of urocortin during human pregnancy. Placenta 21: 782-788

16. Clifton VL, Read MA, Leitch IM, Boura AL, Robinson PJ, Smith R (1994) Cor-

ticotropin-releasing hormone-induced vasodilatation in the human fetal placen-tal circulation. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 80: 2388-2393

17. Clifton VL, Telfer JF, Thompson AJ, Cameron IT, Teoh TG, Lye SJ, Challis JR

(1998) Corticotropin-releasing hormone and proopiomelanocortin-derived pep-tides are present in human myometrium. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 83: 3716-3721

18. Di Blasio AM, Pecori Giraldi F, Viganò P, Petraglia F, Vignali M, Cavagnini F

(1997) Expression of corticotropin-releasing hormone and its R1 receptor in human endometrial stroma cells. Journal of Clinical Endocrinology and Me-tabolism 82: 1594-1597

19. Dieterich KD, Lehnert H, De Souza EB (1997) Corticotropin-releasing factor

receptors: An overview. Experimental and Clinical Endocrinology & Diabetes 105: 65-82

20. Donaldson CJ, Sutton SW, Perrin MH, Corrigan AZ, Lewis KA, Rivier JE,

Vaughan JM, Vale WW (1996) Cloning and characterization of human uro-cortin. Endocrinology 137: 2167-2170

21. Egarter C, Husslein P (1998) Geburtsregulation und Wehensteuerung: Physio-

logie, Pathophysiologie und klinische Implikationen. Wissenschaftliche Ver-lagsgesellschaft mbH, Stuttgart

22. Florio P, Franchini A, Reis FM, Pezzani I, Ottaviani E, Petraglia F (2000) Hu-

man placenta, chorion, amnion and decidua express different variants of corti-cotropin-releasing factor receptor messenger RNA. Placenta 21: 32-37

23. Florio P, Lombardo M, Gallo R, Di Carlo C, Sutton S, Genazzani AD, Petraglia

F (1996) Activin A, corticotropin-releasing factor and prostaglandin F2 alpha increase immunoreactive oxytocin release from cultured human placenta cells. Placenta 17: 307-311

24. Glynn BP, Wolton A, Rodriguez-Linares B, Phaneuf S, Linton EA (1998) Uro-

cortin in pregnancy. American Journal of Obstetrics and Gynecology 179: 533-539


25. Goland RS, Wardlaw SL, Stark RI, Brown LS, Frantz AG (1986) High levels of corticotropin-releasing hormone immunoactivity in maternal and fetal plasma during pregnancy. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 63: 1199-1203

26. Grammatopoulos D, Thompson S, Hillhouse EW (1995) The human myo-

metrium expresses multiple isoforms of the corticotropin-releasing hormone receptor. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 80: 2388-2393

27. Grammatopoulos D, Dai Y, Chen J, Karteris E, Papadopoulou N, Easton AJ,

Hillhouse EW (1998) Human corticotropin-releasing hormone receptor: Differ-ences in subtype expression between pregnant and non pregnant myometria. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 83: 2539-2544

28. Grammatopoulos D, Milton NG, Hillhouse EW (1994) The human myometrial

CRH receptor: G proteins and second messengers. Molecular and Cellular Endocrinology 99: 245-250

29. Grammatopoulos D, Stirrat GM, Williams SA, Hillhouse EW (1996) The bio-

logical activity of the corticotrophin-releasing hormone receptor-adenylate cy-clase complex in human myometrium is reduced at the end of pregnancy. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 81: 745-751

30. Grammatopoulos DK, Dai Y, Randeva HS, Levine MA, Karteris E, Easton AJ,

Hillhouse EW (1999) A novel spliced variant of the type 1 corticotropin-releasing hormone receptor with a deletion in the seventh transmembrane domain present in the human pregnant term myometrium and fetal mem-branes. Molecular Endocrinology 13: 2189-2202

31. Grammatopoulos DK, Hillhouse EW (1999) Role of corticotropin releasing hor-

mone in onset of labour. Lancet 354: 1546-1549

32. Grino M, Chrousos GP, Margioris AN (1987) The corticotrophin releasing hor-mone gene is expressed in human p lacenta. Biochemical and Biophysical Re-search Communications 148: 1208-1214

33. Hillhouse EW, Grammatopoulos D, Milton NGN, Quateros HWP (1993) The

identification of a human myometrial corticotropin-releasing hormone receptor that increases in affinity during pregnancy. Journal of Clinical Endocrino logy and Metabolism 76: 736-741

34. Jones SA, Challis JR (1998) Local stimulation of prostaglandin production by

corticotropin-releasing hormone in human fetal membranes and placenta. Bio-chemical and Biophysical Research Communications 159: 192-199

35. Junqueira LC, Carneiro J (1996) Zytologie, Histologie und mikroskopische

Anatomie des Menschen. 3. Auflage. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York


36. Karalis K, Goodwin G, Majzoub JA (1995) Cortisol blockade of progesterone: A possible molecular mechanism involved in the initiation of human labor. Na-ture Medicine 2: 556-560

37. Karalis K, Sano H, Redwine J, Listwalk S, Wilder RL, Chrousos GP (1991)

Autocrine or paracrine inflammatory actions of corticotropin-releasing hormone in vivo. Science 254: 421-423

38. Karteris E, Grammatopoulos D, Dai Y, Olah KB, Gobara TB, Easton A, Hill-

house EW (1998) The human placenta and fetal membranes express the cor-ticotropin-releasing hormone receptor 1alpha (CRH-1alpha) and the CRH-C variant receptor. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 83: 1376-1379

39. Leitch IM, Boura ALA, Botti C, Read MA, Walters WAW, Smith R (1998)

Vasodilatator actions of urocortin and related peptides in the human perfused placenta in vitro. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 83: 4510-4513

40. Leu SJ, Singh VK (1992) Stimulation of interleukin-6 production by corticotro-

phin-releasing factor. Cellular Immunology 143: 220-227

41. Lewis K, Li C, Perrin MH, Blount A, Kunitake K, Donaldson C, Vaughan J, Reyes TM, Gulyas J, Fischer W, Bilezikjan L, Rivier J, Sewchenko PE, Vale WW (2001) Identification of urocortin III, an additional member of the cortico-tropin-releasing factor (CRF) family with high affinity for the CRF2 receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 98: 7570-7575

42. Linton EA, Behan DP, Saphier PW, Lowry PJ (1990) Corticotropin-releasing

hormone (CRH)-binding protein: Reduction in the adrenocorticotropin-releasing activity of placental but not hypothalamic CRH. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 70: 1574-1580

43. Linton EA, Perkins AV, Woods RJ, Eben F, Wolfe CDA, Behan DP, Potter E,

Vale WW, Lowry PJ (1993) Corticotropin releasing hormone-binding protein (CRH-BP): Plasma levels decrease during the third trimester of normal human pregnancy. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 76: 260-262

44. Linton EA, Wolfe CDA, Behan DP, Lowry PJ (1988) A specific carrier sub-

stance for human corticotrophin releasing factor in late gestational maternal plasma which could mask the ACTH-releasing activity. Clinical Endocrinology 28: 315-324

45. Martin R (1996) Elektrophorese von Nuc leinsäuren. Reihe: Labor im Fokus.

Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin, Oxford

46. Martius G, Breckwoldt M, Pfleiderer A (1994) Lehrbuch der Gynäkologie und Geburtshilfe. Georg Thieme Verlag, Stuttgart, New York


47. Mastorakos G, Scopa CD, Kao LC, Vryonidou A, Friedmann TC, Kattis D, Ra-bin D, Chrousos GP (1996) Presence of immunoreactive corticotrophin-releasing hormone in human endometrium. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 81: 1046-1050

48. Mastorakos G, Scopa CD, Vryonidou A, Friedmann TC, Kattis D, Phenekos C,

Merino MJ, Chrousos GP (1994) Presence of immunoreactive corticotrophin-releasing hormone in normal and polycystic human ovaries. Journal of Clinical Endocrino logy and Metabolism 79: 1191-1197

49. McLean M, Bisits A, Davies J, Woods R, Lowry P, Smith R (1995) A placental

clock controlling the length of human pregnancy. Nature Medicine 1: 460-463

50. Netter FH (1987) Genitalorgane. Band 3. Farbatlanten der Medizin. 2. Auflage. Georg Thieme Verlag, Stuttgart, New York

51. Newton CR, Graham A (1994) PCR. Reihe: Labor im Fokus. Spektrum Aka-

demischer Verlag, Heidelberg, Berlin, Oxford

52. Norwitz ER, Robinson JN, Challis JRG (1999) The control of labor. The New England Journal of Medicine 341: 660-666

53. Okamoto E, Takagi T, Makino T, Sata H, Iwata I, Nishino E, Mitsuda N, Sugita

N, Otsuki Y, Tanizawa O (1989) Immunoreactive corticotrophin-releasing hor-mone, adrenocorticotropin and cortisol in human plasma during pregnancy, delivery and post partum. Hormonal Metabolism Research 21: 566-572

54. Perkins AV, Eben F, Wolfe CDA, Schulte HM, Linton EA. (1993) Plasma me-

asurements of corticotrophin-releasing hormone-binding protein in normal and abnormal human pregnancy. Journal of Endocrinology 138:149-157

55. Perkins AV, Linton EA, Eben F, Simpson J, Wolfe CDA, Redman CWG (1995)

Corticotrophin-releasing hormone binding-protein in normal and pre-eclamptic human pregnancies. British Journal of Obstetrics and Gynaecology 102: 118-122

56. Perrin MH, Vale WW (1999) Corticotropin releasing factor receptors and their

ligand family. Annals of the New York Academy of Sciences 885: 312-328

57. Petraglia F, Florio P, Gallo R, Simoncini T, Saviozzi M, Di Blasio AM, Vaughan J, Vale W (1996) Human placenta and fetal membranes express human uro-cortin mRNA and peptide. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 81: 3807-3810

58. Petraglia F, Garuti GC, De Ramundo B, Angioni S, Genazzani AR, Bilezikjian

LM (1990) Mechanism of action of interleukin-1 beta in increasing corticotro-phin releasing-factor and adrenocorticotropin hormone release from cultered human p lacenta cells. American Journal of Obstetrics and Gynecology 163: 1307-1312


59. Petraglia F, Potter E, Cameron VA, Sutton S, Behan DP, Woods RJ, Saw-chenko PE, Lowry PJ, Vale W (1993) Corticotropin-releasing factor-binding protein is produced by human placenta and intrauterine tissues. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 77: 919-924

60. Petraglia F, Sawchenko PE, Rivier J, Vale W (1987) Evidence for local stimu-

lation of ATCH secretion by corticotrophin-releasing factor in human placenta. Nature 328: 717-719

61. Petraglia F, Sutton S, Vale W (1989) Neurotransmitters and peptides modu-

late the release of immunoreactive corticotrophin-releasing factor from cul-tered human placenta cells. American Journal of Obstetrics and Gynecology 160: 247-251

62. Pisarchik A, Slominski AT (2001) Alternative splicing of CRH-R1 receptors in

human and mouse skin: identification of new variants and their differential ex-pression. The FASEB Journal 15: 2754-2756

63. Potter E, Behan DP, Fischer WH, Linton EA, Lowry PJ, Vale WW (1991) Clon-

ing and characterisation of the cDNA for human and rat corticotrophin-releasing factor-binding proteins. Nature 349: 423-426

64. Quartero HW, Fry CH (1989) Placental corticotrophin releasing factor may

modulate human parturition. Placenta 10: 439-443

65. Rees LH, Burke CW, Chard T, Evans SW, Lethworth AT (1975) Possible pla-cental origin of ACTH. Nature 254: 620-622

66. Reyes TM, Lewis K, Perrin MH, Kunitake KS, Vaughan J, Arias CA, Ho-

genesch JB, Gulyas J, Rivier J, Vale WW, Sawchenko PE (2001) Urocortin II: a member of the corticotropin-releasing factor (CRF) neuropeptide family that is selectiveley bound by type 2 CRF receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 98: 2843-2848

67. Riley SC, Walton JC, Herlick JM, Challis JR (1991) The localization and distri-

bution of corticotrophin-releasing hormone in human placenta and fetal mem-branes throughout gestation. Journal of Clinical Endocrinology and Metabo-lism 75: 1001-1007

68. Rodriguez-Linares B, Linton EA, Phaneuf S (1998) Expression of corticotro-

pin-releasing hormone receptor mRNA and protein in the human myometrium. Journal of Endocrinology 156: 15-21

69. Rossi E, Gugler E, Vassella F (1997) Pädiatrie. 3. Auflage. Thieme Verlag:

Stuttgart, New York

70. Sambrook J, Russell DW (2001) Molecular cloning – A laboratory manual. Third Edition. Cold Spring Habor Laboratory Press, Cold Spring Habor, New York


71. Schäfer WR, Zahradnik HP (2001) Programmierte Eskalation – Die Steuerung der Geburt. Geburtshilfe und Frauenheilkunde 61: 157-166

72. Schumacher E (2002) Die Rolle der Dezidua für die Wehentätigkeit beim

Menschen – vergleichende Untersuchungen an verschiedenen Deziduapräpa-rationen. Dissertationsvorhaben

73. Sehringer B, Schäfer WR, Wetzka B, Deppert WR, Brunner-Spahr R, Benedek

E, Zahradnik HP (2000) Formation of inflammatory cytokines in human term myometrium is stimulated by lipopolysaccharide but not by corticotropin re-leasing hormone. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 85: 4859-4865

74. Shibasaki T, Odagiri E, Shizume K, Ling N (1982) Corticotropin-releasing fac-

tor-like aktivity in human placental extracts. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 55: 384-386

75. Smith R, Mesiano S, Chan EC, Brown S, Jaffe RB (1998) Corticotropin-

releasing hormone directly and preferentially stimulates dehydroepiandroster-one sulphate secretion by human fetal adrenal cortical cells. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 83: 2916-2920

76. Smith R (1999) Das Timing der Geburt. Die Uhr in der Plazenta. Spektrum der

Wissenschaft 6: 46-52

77. Steller J. (1997) Neonatologie. In: Goerke K, Steller J, Valet A (Hg.) Klinik Leitfaden Gynäkologie Geburtshilfe. 4. Auflage. Gustav Fischer Verlag, Ulm, Stuttgart, Jena, Lübeck, S.277-306

78. Stevens MY, Challis JRG, Lye SJ (1998) Corticotropin-releasing hormone re-

ceptor subtype 1 is significantly up-regulated at the time of labor in the human myometrium. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 83: 4107-4115

79. Vale W, Spiess J, Rivier C, Rivier J (1981) Characterization of a 41-residue

ovine hypothalamic peptide that stimulates secretion of corticotropin and â-endorphine. Science 213: 1394-1397

80. Vaughan J, Donaldson C, Bittencourt J, Perrin MH, Lewis K, Sutton S, Chan

R, Turnball AV, Lovejoy D, Rivier C, Rivier J, Sawchenko PE, Vale W (1995) Urocortin, a mammalian neuropeptide related to fish urotensin I and to cortico-tropin-releasing factor. Nature 378: 287-292

81. Watanaba F, Oki Y, Ozawa M, Masuzawa M, Iwabuchi M, Yoshimi T, Nishigu-

chi T, Iino K, Sasano H (1999) Urocortin in human placenta and maternal plasma. Peptides 20: 205-209

82. Wetzka B, Sehringer B, Schäfer WR, Biller S, Hör C, Benedek E, Deppert WR,

Zahradnik HP (2002) Human intrauterine tissues show specific patterns of CRH, CRH receptors, and CRH-binding protein in human gestational tissues at term. Experimental and Clinical Endocrinology & Diabetes. Im Druck


83. Woods RJ, Grossman A, Saphier P, Kennedy K, Ur E, Behan D, Potter E, Vale W, Lowry PJ (1994) Association of human corticotropin-releasing hor-mone to its binding protein in blood may trigger clearance of the complex. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 78: 73-76

65 Anhang _________________________________________________________________________________

7 Anhang

7.1 Liste der verwendeten Abkürzungen

µg Mikrogramm

µl Mikroliter

A260 Absorption bei 260nm

A Amnion

ACTH Adrenocorticotropes Hormon

AG-CT ALU I Schnittstelle (Adenin, Guanin-Cytosin, Thymin)

ALU I Restriktionsendonuklease aus Arthrobacter luteus

AS Aminosäuren

bp Basenpaare

BEL Beckenendlage

C Chorion

cAMP zyklisches Adenosinmonophosphat

cDNA komplementäre Desoxyribonukleinsäure

CDS codierende Sequenz

Cl Chlor

cm Zentimeter

CRH Corticotropin Releasing-Hormon

CRH-BP Corticotropin Releasing-Hormon-Bindeprotein

CRH-R1 Corticotropin Releasing-Hormon-Rezeptor Subtyp 1

CRH-R2 Corticotropin Releasing-Hormon-Rezeptor Subtyp 2

CRP C-Reaktives Protein

CTG Cardiotokogramm

Cyph Cyclophilin A

D Dezidua

Dc Dezidua, vom Chorion abgeschoben

Du Dezidua aus dem Uterus entnommen

DEPC Diethylpyrocarbonat

DFG Deutsche Forschungsgemeinschaft

DHEAS Dehydroepiandrosteron Sulfat

66 Anhang _________________________________________________________________________________

dl Deziliter

dNTP Desoxynucleosidtriphosphat

DNA Desoxyribonucleinsäure

DTT Dithioethritol

EDTA Äthylendiamintetraessigsäure (ethylene diamine tetraacetic acid)

Exon expressed regions

g Gramm

GAPDH Glycerinaldehyd-3-phosphat Dehydrogenase

GG-CC HAE III Schnittstelle (Guanin-Cytosin)

G/P Gravidität/Parität

G-Protein Guanylnukleotidregulatorisches Protein

h Stunde

HCl Salzsäure

HAE III Restriktionsendonuklease aus Haemophilus aegyptius

HHL Hypophysenhinterlappen

HVL Hypophysenvorderlappen

HWI Harnwegsinfekt

ICI Isthmo-Cervikale-Insuffizienz

IL Interleukin

Introns intervening regions

IUFT intrauteriner Fruchttod

K Kalium

kb Kilobasen

KCl Kaliumchlorid

M Molar

mA Milliampere

Mu Myometrium, entnommen aus dem unteren Uterinsegment

mM Millimolar

Mg Magnesium

mg Milligramm

MgCl Mgnesiumchlorid

min Minute

ml Milliliter

mRNA messenger Ribonukleinsäure

67 Anhang _________________________________________________________________________________

Na Natrium

NaCl Natriumchlorid

nm Nanometer

NNR Nebennierenrinde

NO Stickstoffmonoxid

OP Operation

P Plazenta

Pat. Patientin

PCR Polymerasekettenreaktion (Polymerase Chain Reaction)

PG Prostaglandin

PGI2 Prostazyklin

pH -log[H3O+]

p.m. post menstruationem

pmol pico Mol

prä-mRNA Das primäre, nicht weiterverarbeitete Transkript eines proteinco-dierten Gens

RNA Ribonukleinsäure

rRNA ribosomale Ribonukleinsäure

RT Reverse Transkription

RT-PCR Reverse Transkription-Polymerasekettenreaktion

s Sekunde

SSW Schwangerschaftswoche

Taq Polymerase hitzestabile DNA-Polymerase (Herkunft Thermus Aquaticus)

TRIS Tris (hydroxylmethyl)-aminomethan

tRNA transfer RNA

tsd Tausend

U Units

UCN Urocortin

UV ultraviolett

VBS Vorzeitiger Blasensprung

VWT Vorzeitige Wehentätigkeit

x g x-faches der Erdbeschleunigung

Z.n. Zustand nach

68 Anhang _________________________________________________________________________________

7.2 Verzeichnis der Tabellen

Tab. 1: Die Phasen der uterinen Aktivität während Schwangerschaft und Geburt

Tab. 2: Übersicht der verwendeten Primer

Tab. 3: Übersicht über die Schwangerschaften, von denen Gewebe untersucht wur-de

Tab. 4: Klinische Befunde der termingerechten Geburten

Tab. 5: Klinische Befunde der Frühgeburten

Tab. 6: RNA-Proben verglichen mit den PCR-Ergebnisse von CRH und UCN

Tab. 7: Expression der CRH-Komponenten in Abhängigkeit von den RT-Primern

Tab. 8: Übersicht über angewandte RT-PCR Bedingungen

Tab. 9: Expression der Komponenten des CRH-Systems in uteriner und chorialer Dezidua

Tab. 10: Die RT-PCR Ergebnisse von CRH

Tab. 11: Die RT-PCR-Ergebnisse von UCN

Tab. 12: Die RT-PCR Ergebnisse vom CRH-BP

Tab. 13: Die RT-PCR Ergebnisse von CRH-R1

Tab. 14: Die RT-PCR Ergebnisse von CRH-R2

69 Anhang _________________________________________________________________________________

7.3 Verzeichnis der Abbildungen

Abb. 1: Der mütterliche CRH- und CRH-BP-Plasmaspiegel im Schwangerschafts-verlauf

Abb. 2: Der menschliche CRH-R1 mit seinen Spleiß-Varianten

Abb. 3: Schema der ersten Runden einer PCR

Abb. 4: Verwendete DNA-Marker bei der Agarose-Gel-Elektrophorese

Abb. 5: Restriktionsanalyse eines CRH-R1 Amplikons mit ALU I und HAE III

Abb. 6: Beispiele für die extrahierte RNA von unterschiedlicher Qualität

Abb. 7: PCR mit unterschiedlichen cDNA-Einsatzmengen

Abb. 8: CRH-BP Bande im Gel nach unterschiedlicher Anzahl PCR-Zyklen

Abb. 9: Gradienten-PCR mit dem CRH-R1bl

Abb. 10: Ansatzstellen der verwendeten CRH-R1-Primer

Abb. 11: Gradienten-PCR der CRH-BP-Doppelbande

Abb. 12: Agarose-Gel der CRH-Expression

Abb. 13: Agarose-Gel der UCN-Expression

Abb. 14: Agarose-Gel der CRH-BP-Expression

Abb. 15: CRH-BP-Expression in Abhängigkeit von der Wehentätigkeit

Abb. 16: Agarose-Gel der CRH-R1-Expression

Abb. 17: Agarose-Gel der CRH-R2-Expression

Abb. 18: Schematische Darstellung der Spleiß-Varianten des menschlichen CRH-R1

Danksagung

Bedanken möchte ich mich bei

Herrn PD Dr. Wolfgang Schäfer für die Überlassung des Themas und für seine

Unterstützung und Diskussionsbereitschaft während der gesamten Arbeit und die

vielen Tipps und Anregungen vor allem auch in der Phase des

Zusammenschreibens.

Herrn Bernd Sehringer, der in der Laborphase immer ansprechbar für Fragen und

Probleme war und auch während des Schreibens half viele „Hürden“ zu nehmen und

jederzeit zur Verfügung stand.

Frau Eszter Benedek die besonders bei den ersten Schritten im Labor tatkräftig Hilfe

leistete und beharrlich bei methodischen Problemen zur Seite stand.

Frau Dr. Birgit Wetzka, die vor allem bei Schwierigkeiten bezüglich der

Gewebesammlung immer wieder hilfreiche Hinweise gab.

Dem gesamten Laborteam, die zu einer angenehmen und produktiven

Arbeitsathmosphäre beitrugen und jederzeit „mal eben zwischendurch“ anfallende

Fragen und Probleme zu lösen halfen.

Meiner Mutter, meinem Vater, Uli, Veronique, Simi, Maja, Tina, Wendy und Susanne,

die mich in unterschiedlicher Weise unterstützt haben.

Lebenslauf

Name: Silke Biller

Geburtsdatum: 27.10.1967

Geburtsort: Bremervörde

1974 – 1978 Grundschule Selsingen

1978 – 1980 Orientierungsstufe an der Haupt- und Realschule Selsingen

1980 – 1988 St. Viti Gymnasium Zeven

Juni 1988 Erlangung der Allgemeinen Hochschulreife

SS 1998 Beginn des Medizinstudiums an der Albert-Ludwigs-Universität

Freiburg

Februar 1999 Beginn der Dissertation im Endokrinologischen Labor der

Universitäts-Frauenklinik, Freiburg

„mRNA-Expression des CRH-Systems in menschlichen

schwangerschaftsspezifischen Geweben“

November 1999 3. Abschnitt der Ärztlichen Prüfung

Juli 2000 – Dezember 2001 ÄiP an der Universitäts-Frauenklinik, Freibug

mRNA-Expression des CRH-Systems in menschlichen ...

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