Nachweis von BHV-1-Antikörpern aus (Tank)milchproben · Bovillis IBR GK/D (leb.) Ibraxion (inakt.)...

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Nachweis von BHV-1-Antikörpern aus (Tank)milchproben Martin Beer Bundesforschungsanstalt für Viruskrankheiten der Tiere Insel Riems Friedrich-Löffler-Institute Institut für Virusdiagnostik NRL für BHV-1

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Nachweis von BHV-1-Antikörpern aus(Tank)milchproben

Martin Beer

Bundesforschungsanstalt fürViruskrankheiten der Tiere

Insel RiemsFriedrich-Löffler-InstituteInstitut für Virusdiagnostik

NRL für BHV-1

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Vorschau

Warum BHV-1-(Tank-, Sammel-, Pool-)Milchserologie?

Zusammenfassung und Ausblick

MB 10.03

Geeignete Diagnostika und ihre Verwendung

Testmaterial und Poolgrößen

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BHV-1-Nachweis aus Milch:Wann und warum?

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Strategien der BHV-1-Eradikation

konventionelles Konzept Marker-Konzept

- Serologische Untersuchung auf„Vollvirus“- oder gB-Antikörper

- Poolmilch-Screening- Einzelblutproben und epidemiologische Analyse

Impfung mit markierten (gE-deletierten) Vakzinen + serologischeUntersuchung von Einzelblutprobenauf markerspezifische Antikörper

Diagnostik +Abschaffen seropositiver Tierekeine Vakzinierung (Ausnahmen:

Mastbestände, Reagenten)

Markervakzinierung undMarkerdiagnostik

Selektion BHV-1-negativerBetriebe und Tiere

„Verdrängen“ von FeldvirusSelektion markernegativer Tiere

MB 09.03

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Situation in der EU (2)

BHV-1-frei

BHV-1 durchseucht

BHV-1 durchseucht +Bekämpfung

MB 09.03

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Neue Bezeichnung (EU): DIVA-Vakzine (Differentiating Infectedfrom Vaccinated Animals)

Identifizierung von Feldvirus-infizierten Tieren durch den Nachweisvon gE-Antikörpern = Markerdiagnostik (DIVA-Diagnostik)

BHV-1-Genom (136kb)

5´ 3´UL USIR TR

gEgG gD gI US9

gC gB

Wildtyp

gE-minus Deletion

BHV-1-Markervakzine (gE-Deletionsvakzine)

Rhinobovin®-Marker(leb./inakt.)

Bovillis IBR GK/D(leb.)

Ibraxion (inakt.)

MB 09.03

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Situation in Deutschland (2)

M = MarkerkonzeptK = konventionelles KonzeptM/K = Kombination,

Schwerpunkt MK/M = Kombination,

Schwerpunkt K

M

M

M

M/KK/M

M/K

K/M

K/M

K/M

K/MK

K/M

88%82%

97%

T

T T T = Tankmilchserologie

MB 09.03

T

T

T

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MB 09.03

BHV-1-Tankmilchserologie istbesonders geeignet für Gebiete mit

geringer Herdenprävalenz ohneMarkerimpfung (<70%)

oderzur Bestimmung der

Herdenprävalenz

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BHV-1-Milchserologie: Womit testen und wie?

MB 10.03

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BHV-1-Diagnostik (1)

MB 10.03

Konventionelle Diagnostik:

- indirekte („Vollvirus“; „Komplex“) ELISAs

- Glykoprotein B (gB)-blocking ELISAs

- Neutralisationstest („Goldstandard“?)

Markerdiagnostik:

- Glykoprotein E (gE)-blocking ELISAs

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BHV-1 humorale Immunantwort

Wic

htig

e B

HV

-1-A

ntik

örpe

r-in

duzi

eren

de P

rote

ine

gB

gD

gC

gE

gG

Stärke der humoralen Immunantwort

Antikörper nach 8-10 Tagen nachweisbar

Antikörper nach 10-14Tagen nachweisbar

Antikörper nach 10-14Tagen nachweisbar

Antikörper nach 14-35(?)Tagen nachweisbar

neutralisierende Antikörper

neutralisierende Antikörper

MB 11.02

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BHV-1-Diagnostik (2)

MB 09.03

-20

0102030405060708090

100

-30 -20 -10 0 10 20 30

Tage nach Testinfektion

ELI

SA

-Wer

te in

%

Impfgruppe: gE-ELISA Kontrollgruppe: gE-ELISA

Impfgruppe: gB-ELISA Kontrollgruppe: gB-ELISA

Grenze gB-ELISA Grenze gE-ELISA

Marker-impfung

Test-infektion

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BHV-1-Diagnostik (3)

Hohe Spezifität und Sensitivität der markerunabhängigen Tests: - gB-ELISA, indirekter ELISA, Neutralisationstest

Unterscheidung „markergeimpft“ oder infiziert:- gE-ELISA

Seronegative latente Trägertiere können nicht erkannt werden (SNLC)

Geringere Spezifität und Sensitivität des gE-ELISA (25%- 95%, Frischephänomen, Vakzinephänomen , späte gE-Immunantwort bei Impflingen)

Bei markergeimpften Tieren keine Alternative zum gE-Ak-Nachweis

MB 10.03

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Nationaler BHV-1-Ringtest 2001

Milchproben

Probe Herkunft/Art BHV-1-AK BHV-1-gE-AK

R26 1:256-Verdünnung Positivserum in Negativpoolmilch ++ ++R27 1:1024 Verdünnung Positivserum in Negativpoolmilch + +R28 1:4 Verdünnung Positivmilch in Negativpoolmilch ++ -R29 1:16 Verdünnung Positivmilch in Negativpoolmilch + -R30 Negativmilch - -

Verschiedene ELISA-Tests zugelassen: - indirekte ELISAs, - gB-blocking-ELISAs- gE-blocking-ELISAs

Kein „Nicht-ELISA“ Test !

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indirekter BHV-1-ELISA "Trachitest" 1st generation, Fa. Dr. Bommeli AGRingtestmilch 26 27 28 29 30Charge Lab.-Code %

162-782 BFAV 1 1 1 1 0 100%0703-872 (Platte) U 1 1 1 0,5 0 80%1301-782 M 1 1 1 1 0 100%1427-787 I 1 1 1 0,5 0 80%142-684 E 1 1 1 1 0 100%874 (Platte) AA 1 1 1 0,5 0 80%IBR 1123 D MM 1 1 1 0,5 0 80%142-782 G 1 1 1 1 0 100%881 (Platte) K 1 1 1 1 0 100%0205-877 (Platte) O 1 1 1 1 0 100%782 (Platte) C 1 1 1 1 0 100%142-782 S 1 1 1 1 0 100%930 JJ 1 1 1 1 0 100%142-782 X 1 1 1 1 0 100%0510-844 D 1 1 1 1 0 100%0305-880 BB 1 1 1 1 0 100%142-782 LL 1 1 1 0 0 80%

R 1 0,5 0 0 0 20%2081-865 HH 1 1 1 1 0 100%0305-880 V 1 1 1 1 0 100%142-782 W 1 1 1 1 0 100%0205-877 Z 1 1 1 0,5 0 80%0205-877 Z 1 1 1 0 0 80%0703-872 (Platte) N 1 1 1 0,5 0 80%142-787 J 1 1 1 1 0 100%

Probenstatus 1 1 1 1 0 90%

- 90 % richtig bewertet (Mittelwert)- 16x 100% richtig bewertet

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Milchproben:gB-blocking-ELISA

- 87 % richtig bewertet

BHV-1-gB-blocking -ELISA Fa. IDEXXRingtestmilch 26 27 28 29 30Charge Lab.-Code %40262-1357 /-1134BFAV 1 1 1 1 0 100%40262-1134 U 1 1 1 0,5 0 80%40262-1357 KK 1 1 1 1 0 100%40262-1134 M 1 1 1 0,5 0 80%40262-1019 Q 1 0 1 0 0 60%40262-1134 Y 1 1 1 1 0 100%40262-1357 AA 1 1 1 1 0 100%40262-1357 W 1 1 1 0,5/0 0 80%40262-1231 II 1 1 1 1 0 100%40262-1231 X 1 1 1 1 0 100%40256-1328 L 1 1 1 0 0 80%

P 1 1 1 1 0 100%D 1 1 1 1 0 100%

40262-1357 F 1 0,5 1 0 0 60%40262-1357 N 1 0,5 1 0 0 60%

Probenstatus 1 1 1 1 0 87%

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Milchproben:gE-blocking-ELISA

- 47 % richtig bewertet

BHV-1-gE-blocking -ELISA Fa. IDEXXRingtestmilch 26 27 28 29 30Charge Lab.-Code09537-710 CU BFAV 1 1 0 1 0 80%09537-620 FU U 1 0 0 0,5 0 40%09537-710 CU KK 1 0 0 0 0 40%09537-710 CU CC 1 0 0 0 0 40%09537-076 HAT Q 0 0 0 0 0 20%710 CU Y 1 0 0 0 0 40%09537-710 CU E 1 0 0 0 0 40%09537-331 AU I 1 0 0 0 0 40%09537-706 CT II 1 0 0 0 0 40%05131-647 CU O 1 1 1 1 0 100%09537-331 AU C 1 0 0 0 0 40%09537-710 CU S 1 1 1 1 0 100%05133-110 MT JJ 1 0 0 0 0 40%04-01952-02 X 1 0 0 0 0 40%

D 1 0 0 0 0 40%09537-620 FU R 1 0 1 0 0 60%09538-470 FU F 1 0 0 0 0 40%09537-710 CU N 1 0 0 0 0 40%09537-331 AU J 0 0 0 0 0 20%

Probenstatus 1 1 0 0 0 47%

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EU-Ringtest 2001: Milchproben

Table 4. Overall results of milk tests

different tests used per type

number of labs

overall sens.

overall spec.

range of highest pos. dilution

(average, log2) repeatab.

n = 4 gB-spec. ELISA n = 8 0.81

(26/32) 0.83

(20/24) ≤ 3.0 92.3% (96/104)

n = 7 indirect ELISA n = 7 0.98

(39/40) 0.93

(28/30) ≥ 3.5 95.4% (124/130)

n = 3 gE-spec. ELISA n = 5 0.58

(7/12) 0.88

(14/16) 3.0 96.2% (50/52)

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Indirekte BHV-1-Antikörper-ELISAsbesitzen beste Eignung für BHV-1-

Milchserologie

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Gesetzliche Vorgaben und Probenmaterial

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Gesetzliche Vorgaben in Deutschland

1986: Leitlinien für den Schutz von Rinderbeständen vor IBR/IPV

1997: BHV-1-Infektion als anzeigepflichtige Tierseuche

1997: “Verordnung zum Schutz der Rinder vor einer Infektionmit dem Bovinen Herpesvirus Typ 1“

2001: Erste Verordnung zur Änderung der BHV-1-Verordnung

2003: Zweite Verordnung zur Änderung der BHV-1-Verordnung?

Gesetzgebung:

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MB 13.03

§ 2aUntersuchungen

(1) Der Besitzer hat, soweit sein Rinderbestand nicht bereits nach § 1 Abs. 2 Nr. 1 BHV1-frei ist,alle Zucht- und Nutzrinder im Alter von über neun Monaten im Abstand von längstens zwölfMonaten nach näherer Anweisung der zuständigen Behörde,

1. sofern die Rinder des Bestandes nicht gegen eine BHV1-Infektion geimpft worden sind, blut-oder milchserologisch auf Antikörper gegen das Virus der BHV1-Infektion,

2. sofern die Rinder des Bestandes mit Impfstoffen nach § 2 Abs. 1 Nr. 1 geimpft worden sind,blutserologisch auf Antikörper gegen das gE-Glykoprotein des Virus der BHV1-Infektionuntersuchen zu lassen. Satz 1 gilt nicht für Reagenten. Die zuständige Behörde kann im EinzelfallAusnahmen von Satz 1 zulassen, wenn unter Berücksichtigung des seuchenhygienischen Risikosdes Bestandes und der Seuchensituation ihres Zuständigkeitsgebietes Belange derSeuchenbekämpfung nicht entgegenstehen und die Rinder des Bestandes regelmäßigentsprechend den Empfehlungen des Impfstoffherstellers geimpft werden.

(2) Die zuständige Behörde kann, soweit es aus Gründen der Seuchenbekämpfung erforderlichist, die Untersuchung aller Rinder eines Bestandes oder ihres Zuständigkeitsgebieteseinschließlich der Entnahme von Blutproben anordnen.

BHV-1-VO vom Februar 2002: Milchserologie (1)

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BHV-1-VO vom Februar 2002: Milchserologie (2)

MB 10.03

Anlage 1, Abschnitt I und II:

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Probenmaterial: Einzelmilch, Poolmilch, Sammelmilch, nativ - konzentriert

BHV-1-VO:

1. Einzelmilch2. Pool von bis zu 5 Einzelmilchen3. Sammelmilch (> 30% laktierende Kühe im Betrieb) von bis zu 50 Kühen

Zugelassene ELISAs:

1. Einzelmilch (nativ)2. Sammelmilch bis ? Tiere (nativ)3. Sammelmilch bis 50 Tiere (Konzentrat)

Problem: Grenzwerte und Validierung

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Zusammenfassung

ü (Tank)milchserologie ist ein wichtiges und kostengünstiges Diagnostikum für die BHV-1-Bekämpfung (Prävalenz!)

ü Indirekte ELISAs Mittel der Wahl

ü Gesetzliche Bestimmungen und Testvalidierung/-zulassung müssen besser aufeinander abgestimmt werden (Nativmilch, Milchkonzentrat, Einzel- oder Poolmilch)

ü Referenzmilch (NRL für BHV-1, R-Panel)

ü Zukünftige Entwicklungen: - Milchtest für gE-Antikörper-Nachweis - neue Konzentrierungsverfahren

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