Nachweis von BHV-1-Antikörpern aus (Tank)milchproben · Bovillis IBR GK/D (leb.) Ibraxion (inakt.)...
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Nachweis von BHV-1-Antikörpern aus(Tank)milchproben
Martin Beer
Bundesforschungsanstalt fürViruskrankheiten der Tiere
Insel RiemsFriedrich-Löffler-InstituteInstitut für Virusdiagnostik
NRL für BHV-1
Vorschau
Warum BHV-1-(Tank-, Sammel-, Pool-)Milchserologie?
Zusammenfassung und Ausblick
MB 10.03
Geeignete Diagnostika und ihre Verwendung
Testmaterial und Poolgrößen
BHV-1-Nachweis aus Milch:Wann und warum?
Strategien der BHV-1-Eradikation
konventionelles Konzept Marker-Konzept
- Serologische Untersuchung auf„Vollvirus“- oder gB-Antikörper
- Poolmilch-Screening- Einzelblutproben und epidemiologische Analyse
Impfung mit markierten (gE-deletierten) Vakzinen + serologischeUntersuchung von Einzelblutprobenauf markerspezifische Antikörper
Diagnostik +Abschaffen seropositiver Tierekeine Vakzinierung (Ausnahmen:
Mastbestände, Reagenten)
Markervakzinierung undMarkerdiagnostik
Selektion BHV-1-negativerBetriebe und Tiere
„Verdrängen“ von FeldvirusSelektion markernegativer Tiere
MB 09.03
Situation in der EU (2)
BHV-1-frei
BHV-1 durchseucht
BHV-1 durchseucht +Bekämpfung
MB 09.03
Neue Bezeichnung (EU): DIVA-Vakzine (Differentiating Infectedfrom Vaccinated Animals)
Identifizierung von Feldvirus-infizierten Tieren durch den Nachweisvon gE-Antikörpern = Markerdiagnostik (DIVA-Diagnostik)
BHV-1-Genom (136kb)
5´ 3´UL USIR TR
gEgG gD gI US9
gC gB
Wildtyp
gE-minus Deletion
BHV-1-Markervakzine (gE-Deletionsvakzine)
Rhinobovin®-Marker(leb./inakt.)
Bovillis IBR GK/D(leb.)
Ibraxion (inakt.)
MB 09.03
Situation in Deutschland (2)
M = MarkerkonzeptK = konventionelles KonzeptM/K = Kombination,
Schwerpunkt MK/M = Kombination,
Schwerpunkt K
M
M
M
M/KK/M
M/K
K/M
K/M
K/M
K/MK
K/M
88%82%
97%
T
T T T = Tankmilchserologie
MB 09.03
T
T
T
MB 09.03
BHV-1-Tankmilchserologie istbesonders geeignet für Gebiete mit
geringer Herdenprävalenz ohneMarkerimpfung (<70%)
oderzur Bestimmung der
Herdenprävalenz
BHV-1-Milchserologie: Womit testen und wie?
MB 10.03
BHV-1-Diagnostik (1)
MB 10.03
Konventionelle Diagnostik:
- indirekte („Vollvirus“; „Komplex“) ELISAs
- Glykoprotein B (gB)-blocking ELISAs
- Neutralisationstest („Goldstandard“?)
Markerdiagnostik:
- Glykoprotein E (gE)-blocking ELISAs
BHV-1 humorale Immunantwort
Wic
htig
e B
HV
-1-A
ntik
örpe
r-in
duzi
eren
de P
rote
ine
gB
gD
gC
gE
gG
Stärke der humoralen Immunantwort
Antikörper nach 8-10 Tagen nachweisbar
Antikörper nach 10-14Tagen nachweisbar
Antikörper nach 10-14Tagen nachweisbar
Antikörper nach 14-35(?)Tagen nachweisbar
neutralisierende Antikörper
neutralisierende Antikörper
MB 11.02
BHV-1-Diagnostik (2)
MB 09.03
-20
0102030405060708090
100
-30 -20 -10 0 10 20 30
Tage nach Testinfektion
ELI
SA
-Wer
te in
%
Impfgruppe: gE-ELISA Kontrollgruppe: gE-ELISA
Impfgruppe: gB-ELISA Kontrollgruppe: gB-ELISA
Grenze gB-ELISA Grenze gE-ELISA
Marker-impfung
Test-infektion
BHV-1-Diagnostik (3)
Hohe Spezifität und Sensitivität der markerunabhängigen Tests: - gB-ELISA, indirekter ELISA, Neutralisationstest
Unterscheidung „markergeimpft“ oder infiziert:- gE-ELISA
Seronegative latente Trägertiere können nicht erkannt werden (SNLC)
Geringere Spezifität und Sensitivität des gE-ELISA (25%- 95%, Frischephänomen, Vakzinephänomen , späte gE-Immunantwort bei Impflingen)
Bei markergeimpften Tieren keine Alternative zum gE-Ak-Nachweis
MB 10.03
Nationaler BHV-1-Ringtest 2001
Milchproben
Probe Herkunft/Art BHV-1-AK BHV-1-gE-AK
R26 1:256-Verdünnung Positivserum in Negativpoolmilch ++ ++R27 1:1024 Verdünnung Positivserum in Negativpoolmilch + +R28 1:4 Verdünnung Positivmilch in Negativpoolmilch ++ -R29 1:16 Verdünnung Positivmilch in Negativpoolmilch + -R30 Negativmilch - -
Verschiedene ELISA-Tests zugelassen: - indirekte ELISAs, - gB-blocking-ELISAs- gE-blocking-ELISAs
Kein „Nicht-ELISA“ Test !
indirekter BHV-1-ELISA "Trachitest" 1st generation, Fa. Dr. Bommeli AGRingtestmilch 26 27 28 29 30Charge Lab.-Code %
162-782 BFAV 1 1 1 1 0 100%0703-872 (Platte) U 1 1 1 0,5 0 80%1301-782 M 1 1 1 1 0 100%1427-787 I 1 1 1 0,5 0 80%142-684 E 1 1 1 1 0 100%874 (Platte) AA 1 1 1 0,5 0 80%IBR 1123 D MM 1 1 1 0,5 0 80%142-782 G 1 1 1 1 0 100%881 (Platte) K 1 1 1 1 0 100%0205-877 (Platte) O 1 1 1 1 0 100%782 (Platte) C 1 1 1 1 0 100%142-782 S 1 1 1 1 0 100%930 JJ 1 1 1 1 0 100%142-782 X 1 1 1 1 0 100%0510-844 D 1 1 1 1 0 100%0305-880 BB 1 1 1 1 0 100%142-782 LL 1 1 1 0 0 80%
R 1 0,5 0 0 0 20%2081-865 HH 1 1 1 1 0 100%0305-880 V 1 1 1 1 0 100%142-782 W 1 1 1 1 0 100%0205-877 Z 1 1 1 0,5 0 80%0205-877 Z 1 1 1 0 0 80%0703-872 (Platte) N 1 1 1 0,5 0 80%142-787 J 1 1 1 1 0 100%
Probenstatus 1 1 1 1 0 90%
- 90 % richtig bewertet (Mittelwert)- 16x 100% richtig bewertet
Milchproben:gB-blocking-ELISA
- 87 % richtig bewertet
BHV-1-gB-blocking -ELISA Fa. IDEXXRingtestmilch 26 27 28 29 30Charge Lab.-Code %40262-1357 /-1134BFAV 1 1 1 1 0 100%40262-1134 U 1 1 1 0,5 0 80%40262-1357 KK 1 1 1 1 0 100%40262-1134 M 1 1 1 0,5 0 80%40262-1019 Q 1 0 1 0 0 60%40262-1134 Y 1 1 1 1 0 100%40262-1357 AA 1 1 1 1 0 100%40262-1357 W 1 1 1 0,5/0 0 80%40262-1231 II 1 1 1 1 0 100%40262-1231 X 1 1 1 1 0 100%40256-1328 L 1 1 1 0 0 80%
P 1 1 1 1 0 100%D 1 1 1 1 0 100%
40262-1357 F 1 0,5 1 0 0 60%40262-1357 N 1 0,5 1 0 0 60%
Probenstatus 1 1 1 1 0 87%
Milchproben:gE-blocking-ELISA
- 47 % richtig bewertet
BHV-1-gE-blocking -ELISA Fa. IDEXXRingtestmilch 26 27 28 29 30Charge Lab.-Code09537-710 CU BFAV 1 1 0 1 0 80%09537-620 FU U 1 0 0 0,5 0 40%09537-710 CU KK 1 0 0 0 0 40%09537-710 CU CC 1 0 0 0 0 40%09537-076 HAT Q 0 0 0 0 0 20%710 CU Y 1 0 0 0 0 40%09537-710 CU E 1 0 0 0 0 40%09537-331 AU I 1 0 0 0 0 40%09537-706 CT II 1 0 0 0 0 40%05131-647 CU O 1 1 1 1 0 100%09537-331 AU C 1 0 0 0 0 40%09537-710 CU S 1 1 1 1 0 100%05133-110 MT JJ 1 0 0 0 0 40%04-01952-02 X 1 0 0 0 0 40%
D 1 0 0 0 0 40%09537-620 FU R 1 0 1 0 0 60%09538-470 FU F 1 0 0 0 0 40%09537-710 CU N 1 0 0 0 0 40%09537-331 AU J 0 0 0 0 0 20%
Probenstatus 1 1 0 0 0 47%
EU-Ringtest 2001: Milchproben
Table 4. Overall results of milk tests
different tests used per type
number of labs
overall sens.
overall spec.
range of highest pos. dilution
(average, log2) repeatab.
n = 4 gB-spec. ELISA n = 8 0.81
(26/32) 0.83
(20/24) ≤ 3.0 92.3% (96/104)
n = 7 indirect ELISA n = 7 0.98
(39/40) 0.93
(28/30) ≥ 3.5 95.4% (124/130)
n = 3 gE-spec. ELISA n = 5 0.58
(7/12) 0.88
(14/16) 3.0 96.2% (50/52)
Indirekte BHV-1-Antikörper-ELISAsbesitzen beste Eignung für BHV-1-
Milchserologie
Gesetzliche Vorgaben und Probenmaterial
Gesetzliche Vorgaben in Deutschland
1986: Leitlinien für den Schutz von Rinderbeständen vor IBR/IPV
1997: BHV-1-Infektion als anzeigepflichtige Tierseuche
1997: “Verordnung zum Schutz der Rinder vor einer Infektionmit dem Bovinen Herpesvirus Typ 1“
2001: Erste Verordnung zur Änderung der BHV-1-Verordnung
2003: Zweite Verordnung zur Änderung der BHV-1-Verordnung?
Gesetzgebung:
MB 13.03
§ 2aUntersuchungen
(1) Der Besitzer hat, soweit sein Rinderbestand nicht bereits nach § 1 Abs. 2 Nr. 1 BHV1-frei ist,alle Zucht- und Nutzrinder im Alter von über neun Monaten im Abstand von längstens zwölfMonaten nach näherer Anweisung der zuständigen Behörde,
1. sofern die Rinder des Bestandes nicht gegen eine BHV1-Infektion geimpft worden sind, blut-oder milchserologisch auf Antikörper gegen das Virus der BHV1-Infektion,
2. sofern die Rinder des Bestandes mit Impfstoffen nach § 2 Abs. 1 Nr. 1 geimpft worden sind,blutserologisch auf Antikörper gegen das gE-Glykoprotein des Virus der BHV1-Infektionuntersuchen zu lassen. Satz 1 gilt nicht für Reagenten. Die zuständige Behörde kann im EinzelfallAusnahmen von Satz 1 zulassen, wenn unter Berücksichtigung des seuchenhygienischen Risikosdes Bestandes und der Seuchensituation ihres Zuständigkeitsgebietes Belange derSeuchenbekämpfung nicht entgegenstehen und die Rinder des Bestandes regelmäßigentsprechend den Empfehlungen des Impfstoffherstellers geimpft werden.
(2) Die zuständige Behörde kann, soweit es aus Gründen der Seuchenbekämpfung erforderlichist, die Untersuchung aller Rinder eines Bestandes oder ihres Zuständigkeitsgebieteseinschließlich der Entnahme von Blutproben anordnen.
BHV-1-VO vom Februar 2002: Milchserologie (1)
BHV-1-VO vom Februar 2002: Milchserologie (2)
MB 10.03
Anlage 1, Abschnitt I und II:
Probenmaterial: Einzelmilch, Poolmilch, Sammelmilch, nativ - konzentriert
BHV-1-VO:
1. Einzelmilch2. Pool von bis zu 5 Einzelmilchen3. Sammelmilch (> 30% laktierende Kühe im Betrieb) von bis zu 50 Kühen
Zugelassene ELISAs:
1. Einzelmilch (nativ)2. Sammelmilch bis ? Tiere (nativ)3. Sammelmilch bis 50 Tiere (Konzentrat)
Problem: Grenzwerte und Validierung
Zusammenfassung
ü (Tank)milchserologie ist ein wichtiges und kostengünstiges Diagnostikum für die BHV-1-Bekämpfung (Prävalenz!)
ü Indirekte ELISAs Mittel der Wahl
ü Gesetzliche Bestimmungen und Testvalidierung/-zulassung müssen besser aufeinander abgestimmt werden (Nativmilch, Milchkonzentrat, Einzel- oder Poolmilch)
ü Referenzmilch (NRL für BHV-1, R-Panel)
ü Zukünftige Entwicklungen: - Milchtest für gE-Antikörper-Nachweis - neue Konzentrierungsverfahren