Nanoskalige Biofunktionalisierung von Oberflächen durch Laserstrahlung zur Erzeugungzellspezifischer Leit- und Wachstumsstrukturen

Dr. Elke Bremus-Köbberling, Dipl.-Phys. Stefan Beckemper, Dr. Arnold Gillner

DFG SPP 1327 – Symposium 12.04.2011 in Berlin

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Gliederung

• Projektziele

• Nanostrukturen durch Interferenzverfahren

V h M i li (PEEK PI PDMS)• Versch. Materialien (PEEK, PI, PDMS)

• Versch. Strukturen (Variation von Rillenabstand und Tiefe)

• Doppelstrukturen (Noppen und Rillen)• Doppelstrukturen (Noppen und Rillen)

• Zellbesiedelung von nanostrukturierten Polymeren

• Photochemisch iniitierte Modifizierung von Polymeren

• Zusammenfassung und AusblickZusammenfassung und Ausblick

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Projektziele & Planung 11/2009 -10/2012

Topographisch und chemisch funktionaleNanostrukturen (sub-100 nm)

Erzeugung von Zell-Leitstrukturen sowie zellspezifischen Proteinmustern

• Methodische Weiterentwicklung der Interferenzstrukturierung (Zweistrahl Mehrstrahl Interferenz & ns ps, fs)

• Charakterisierung der Nanostrukturen (REM, AFM) & Zellbesiedelung

• Machbarkeitsuntersuchung: Laterale Strukturgrößen vs. Strukturtiefe

• Auswahl geeigneter photoaktivierbarer Verbindungen g g p g& Nachweis der Photomodifizierung im μm-Maßstab

• Konzepte zur Übertragung der Photochemie auf den Nanometermaßstab

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Mehrstrahlinterferenzaufbau, schematisch

2D- Anordnung

Mx=dielectric coated mirrorsMx dielectric coated mirrorsHx= half-wave-platesPx= polarizing-filters

Intensitätsverteilung auf Probe

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Mehrstrahlinterferenzaufbau, schematisch

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Nanostrukturen durch Interferenzverfahren

PEEK, = 2μm PI, = 250nm

PDMS Abguss 1μmPDMS Abguss, = 1μm

PEEK am, tkPI

= 3 μm -250 nmT = 50 – 600 nm

PDMS A 1 : 0,5

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Zweistrahlinterferenz

Strukturierung von PEEK

Tiefenvariation

Periodizität: 1.9 μm

Steg / Grabenbreite: 950 nm

lFluenz: 1.35 ; 1.85; 2.25 J/cm²

Spotdurchmesser: 450μm

Puls-Dauer: 35nsec

Wellenlänge: 355 nm

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Schematische Darstellung der 3D-Strahlenanordnung

Dreistrahlinterferenzanordnung

Noppenstrukturen

Simulation derIntensitätsverteilung(0°,60°,120°)

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Doppelstrukturen

Prozessstrategie:• 3-Strahl Interferenz NoppenSt a te e e oppe

• 2-Strahl Interferenz größerer Periode Gräben

Stege mit Noppen

Strukturprofil AFM

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Zellbesiedelung von nanostrukturierten Polymeren

Substrat: Nanorillen (Periode 4 μm, Tiefe 50 – 600 nm) in PEEK (Victrex)

Zellen: 3T3 (Fibroblasten) und B35 (neuronale Zellen)

B35 1300-100.10.tif B35 1000-1000a4.tifB35 1000-100-10.1.tif

Generell gutes Wachstum auf nanostrukturierten PEEK Proben

Richtung der Rillen

Generell gutes Wachstum auf nanostrukturierten PEEK Proben

Hohe Zelldichte: geringer Einfluss der Topographie

Niedrige Zelldichte: tendenzielle Ausrichtung an Topographie

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g g p g p

Zellbesiedelung von nanostrukturierten Polymeren

Substrat: Nanorillen (Periode 4 μm, Tiefe 50 – 600 nm) in PEEK (Victrex)

Zellen: 3T3 (Fibroblasten) und B35 (neuronale Zellen)

B35 2000-100.9.tif B35 2000-100.10.1.tif

Tiefere Rillen erzeugen tendenziell stärkere Ausrichtung Tiefere Rillen erzeugen tendenziell stärkere Ausrichtung

Starke Uneinheitlichkeit der Proben

Weitere Experimente erforderlich!

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p

DRG Zellen auf PI mit Nanorillen (120 nm)Nanorillen (120 nm)

A s ert ng der Zella sricht ngAuswertung der Zellausrichtung:

• Nanorillen im REM sichtbar (x2K)

• Bestimmung der Richtung der Nanorillen

• Zellen im REM (x500-1K)

• Bestimmung der Zellhauptachsen (ZHS)

• Bestimmung des Winkels zwischenNanorillen und ZHANanorillen und ZHA

• Einteilung in 45 Sektoren: 45 und 136-180 ausgerichtet, 46-135 nicht ausgerichtet

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Zellbesiedelung von nanostrukturierten Polymeren

Aktueller Versuchsplan:

2/2010 – 12/2010 Erarbeitung Interferenzstrukturierung

b d k ll d f h f

12/2010 – 3/2011 Erarbeitung der Protokolle und Auswerteverfahren für Zellbesiedelung

4/2011 – 10/2011 Reihenuntersuchungen an:

Neuronale B35 Zellen (serumfrei)

PEEKam, PI, PDMS (von PI abgeformt)

Nanorillen ( = 1μm 500nm 200nm) Nanorillen ( = 1μm, 500nm, 200nm)Nanorillen ( = 500 nm mit < 100 nm sub-Struktur)

Doppelstruktur aus Nanonoppen und Nanorillen (500 nm)(500 nm)

18.-20.9.2011 Veröffentlichung der Ergebnisse geplant auf Bionic Engineering Conference, Boston, USA

i li i f l C“Laser Functionalization of Polymers to Create Bio-inspired Surfaces” (Abstract eingereicht)

ok schwierig in Bearbeitung nicht gelungen

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ok schwierig in Bearbeitung nicht gelungen

Photochemisch iniitierte Modifizierung von Polymeren

Konzept: photochemisch ortsselektiv Ankergruppen einführen zur Immobilisierung von Biomolekülen (z B Proteine)zur Immobilisierung von Biomolekülen (z.B. Proteine)

N C OO

N

OF F

+PEEK

N3 C O N

OF F

NH

C O

O

N

OF FPEEKN

+

+ h (355 nm)

OF FKN2

_

R-NH2+Bestrahlungsregimes:

N C N

O

R

F FPE

UV-Lampen (254 nm, 365 nm), großflächig oder Kontaktmasken

NH

C NH

R

F F

EK

R = Protein, Fluoreszenz-Tag

UV-Laser (266 nm, 355 nm), scannend μm

Interferenztechniken (ns, fs) nm

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Photochemisch iniitierte Modifizierung von Polymeren

P

N3 C O

O

N

O

O

F F

F F OOF F

P P

F3C

NH2O

F F CF3+

+PEEK

NH

C O

O

N

OF F

PEEK

N2_

PEEK

F3C NH

C

F F

NH

CF3

+ h (355 nm)

Probe Bearbeitung C/F Verh.

PEEK1 F-Azide, irrad. hE, F-Amin 2,9 / 83,4

PEEK2 F-Azide, irrad. nE, F-Amin 8,3 / 77,9

Ref1 F-Azid no irrad F-Amin 3 4 / 81 7Ref1 F-Azid, no irrad., F-Amin 3,4 / 81,7

Ref2 no F-Azid, irrad. hE, F-Amin 5,1 / 80,3

XPS-Ergebnisse bestätigen Ankopplung

Weitere Optimierung notwendig

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Photochemisch iniitierte Modifizierung von Polymeren

Heterobifunktionelle Linker

Immobilisierung von „Photobiotin“ (Invitrogen)

Nachweis durch

O

DyLight 488-Streptavidin-Konjugat

ONH

NH

SNH

O

FF

O NH

N3

NH

NH

NH

O

F

FNH

O NH

O

S

O

N OO

F

FO N

O

S

O

N OO

F

FO N

O

Fluoreszierende Linie: L= 10mm, D= 10μm Entsprechende Durchlicht-Aufnahme

nur chemische Modifizierung keine topographische Veränderung

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Photomodifizierung

Aktueller Versuchsplan:

10/2010 – 2/2011 Erarbeitung der Protokolle und Auswerteverfahren für Immobiliserung der PhotolinkerImmobiliserung der Photolinker

XPS Nachweis

Funktionalisierung flächig und im μm-Bereich

5/2011 – 7/2011 Wiederholung der Photoimmobilisierungsexperimente

PEEKam, PDMS

355nm (Wdh ) 266 nm (neu)

355nm (Wdh.), 266 nm (neu)

Erzeugung von μm-Strukturen und Fluoreszenznachweis

5/2011 -6/2011 Recherche: Nachweis funktionaler Nanostrukturen mit NP - Nachweis über REM / EDX

7/2011 – 12/2011 Experimente zu chemisch funktionalen Nanostrukturen

ok schwierig in Bearbeitung nicht gelungen

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ok schwierig in Bearbeitung nicht gelungen

Zusammenfassung und Ausblick

• Zwei- / Dreistrahlinterferenz: • Topographische Doppelstrukturen

Phase 1 Phase 2 (geplant)

Zwei / Dreistrahlinterferenz:

Parameteroptimierung hinsichtlich

Material und Geometrie

Topographische Doppelstrukturen

• Topographisch – chemische

Doppelstrukturen

• ns & ps– Interferenz

• Photochemische Modifizierung:

pp

• Photochemische Nanostrukturierung

mit 266 nm Wellenlängeg

Identifizierung einer geeigneten

Chemie (F-Azide, Diazirine, • Fs-Interferenz mit sub-Struktur

(ripples)„Photobiotin“)

• Erzeugung und Nachweis von • Primäre Zellen & Co-Kulturen

„chemischen“ Nanostrukturen

• Zellbesiedelung

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Danksagung

Di l Bi l N di S ilDipl. Biol. Nadine Seiler

Dipl. Ing. (FH) Herbert Horn-Solle

Dipl. Biol. Beate Koch

B. Sc. Yvonne Bongard

Doro Leonhäuser

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