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  • Next Generation Sequencing Core FacilityMax Planck Institute for Molecular GeneticsBerlin, Germany

    Dr.BerndTimmermann

    NeueDNASequenzierungstechnologienimberblick

    22 Mrz 2012, Anhrung Deutscher Ethikrat

  • Max-Planck-Gesellschaft

    MaxPlanckInstitutfrmolekulareGenetik

    80InstituteundForschungseinrichtungen

    21514Mitarbeiter

    Budget1,400Mrd.Euro

    22 Mrz 2012, Anhrung Deutscher Ethikrat

  • Entwicklung des Sequenzierungsdurchsatzes

    ModifiziertnachMRStrattonetal.Nature 458,719724(2009)

    1980198519901995200020052010

    1000,000,000

    100,000,000

    10,000,000

    1,000,000

    100,0000

    10,000

    1000

    100

    10

    GelbasierteSysteme

    Kapillarsequenzierung

    NextGenerationSequencing

    ersteGenerationKapillarsequenzer

    zweiteGenerationKapillarsequenzer

    MicrowellPyrosequencing

    ShortReadSequencer

    DurchsatzproGert[K

    ilobasen/Tag]

    Jahr

    22 Mrz 2012, Anhrung Deutscher Ethikrat

  • Entwicklung der Sequenzierungstechnologien

    96 Sequenzen parallel 3.2 Milliarden Sequenzen

    pro Gertelauf

    Humanes Genomprojekt1000 Genomes Project

    22 Mrz 2012, Anhrung Deutscher Ethikrat

  • Roche/454Genome Sequencer FLX Illumina

    HiSeq 2000/GAIIx

    Identifizierung von Transkriptionsfaktoren Methylierungsanalysen Identifizierung von miRNAs Expressionsanalysen Sequenzierung von Zielregionen Re-Sequenzierung von Genomen

    de novo Sequenzierung Metagenome Analysen Sequenzierung von PCR Produkten Analyse von Transkripten Sequenzierung von Zielregionen

    22 Mrz 2012, Anhrung Deutscher Ethikrat

  • Grundlagen Illumina Sequenzierung

    Probenvorbereitung

    Bindung von Einzelmoleklen auf einer festen Oberflche

    Clusterbildung durch monoclonale Verfielfltigung

    Generierung von DNA Clustern

    22 Mrz 2012, Anhrung Deutscher Ethikrat

  • 5

    G

    T

    C

    A

    G

    T

    C

    A

    G

    T

    C

    A

    GT

    3

    5

    C

    A

    G

    TC

    A

    T

    C

    A

    C

    C

    TAG

    CG

    TA

    Einbau der ersten Base

    Cycle 1: Zufhrung der Nukleotide und Polymerase

    Entfernen der nicht eingebauten Daten

    Signaldetektion

    Cycle 2-n: Erneute Zufuhr von Nukleotiden und Enzymen

    Sequenzierung durch Synthese

    22 Mrz 2012, Anhrung Deutscher Ethikrat

  • 22 Mrz 2012, Anhrung Deutscher Ethikrat

    Referenzsequenz ....CGAGCGAATGAAGTCGGGAGTCGTAATGAGCCCGTAATCCCGTTAGTA....

    CGAGCGAATGAAGTCGGGAGTCCTAATGAGCCCGTAGAGCGAATGAAGTCGGGAGTCCTAATGAGCCCGTAA

    CGAATGAAGTCGGGAGTCCTAATGAGCCCGTAATCCTGAAGTCGGGAGTCCTAATGAGCCCGTAATCCCGTT

    TCGGGAGTCCTAATGAGCCCGTAATCCCGTTAGTA

    Sequence Reads

    Umwandlung der Bilddaten in die DNA Sequenz

  • Ausgangsmaterial: ~ 1-3 g DNA

    Library Preparation: ~ 1 Tag

    Cluster Generation: ~ 1 Tag

    Laufzeit/ Single read ~ 2 Tage (36 b)Leselnge: Paired End ~ 10 Tage (2 x 100 b)

    Datenprozessierung: ~ 1 Tag

    Datenmenge: Paired End ~ 500 Gigabasen

    Anzahl der Sequenzen: bis zu 3200 Mio

    Fakten Illumina Sequenzierung (HiSeq 2000)

    22 Mrz 2012, Anhrung Deutscher Ethikrat

  • Ausgangsmaterial: ~ 0.5 g DNA

    Probenvorbereitung: ~ 4 Stunden

    Emulsions PCR: ~ 1 Tag

    Gertelaufzeit: 20 Stunden

    Datenprozessierung: ~ 10 Stunden

    Datenmenge: 700 - 1000 Megabasen

    Anzahl der Sequenzen: 1.000.000 - 1.600.000

    Leselnge: 700 - 800 Basen

    Fakten 454 Sequenzierung

    22 Mrz 2012, Anhrung Deutscher Ethikrat

  • 1. Genome is loaded into a PicoTiter plate

    3. Load Reagentsin a single rack

    4. Sequencing

    2. Load PicoTiter plate into instrument

    454 Sequencing Instrument

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  • Ziele

    Erstellung einer ffentlichen Datenbank mit allen SNVs und CNVs mit einer Allelfrequenz von >1% in verschiedenen Populationen

    Entwicklung und Evaluierung von Methoden: Generierung von Daten durch verschiedene Next-Generation

    Sequencing Plattformen Austausch und Kombination von Daten und analytischen Methoden Identifizierung der genetischen Variation aus Nextgen Daten

    (Nature 2010, Science 2010 and Nature 2011)

    22 Mrz 2012, Anhrung Deutscher Ethikrat

    www.1000genomes.org

  • DNA RNA

    Protein

    MethylationMutations

    mRNAmiRNATumor/

    Kontrollgewebe

    Sequenzierung

    Bioinformatik

    22 Mrz 2012, Anhrung Deutscher Ethikrat

    www.oncotrack.eu

  • Anreicherung von ZielregionenDNAPreparation Anreicherung Sequenzierung

    A1 SP1

    A2

    genomicDNA

    Fragments(200500bp)

    Ligationofadapters

    Hybridization

    Selectionwithstreptavidinbeads

    AmplificationandQuantification

    22 Mrz 2012, Anhrung Deutscher Ethikrat

  • Sequenzierung in der Diagnostik

    IRON StudyInterlaboratory Robustness of NGS

    22 Mrz 2012, Anhrung Deutscher Ethikrat

  • Sequenzierung in der Diagnostik

    IRON StudyInterlaboratory Robustness of NGS

    22 Mrz 2012, Anhrung Deutscher Ethikrat

  • Insgesamt wurden 92 Varianten identifiziert

    Im Vergleich zu den Vergleichsdaten aus der Sanger Sequenzierung, konnten mit der verwendeten 454 Technologien alle bekannten Varianten von allen Teilnehmern der Ringstudie sicher bestimmt werden

    In dieser Multicenterstudie konnte gezeigt werden, da Amplicon-basiertes NGS in der Diagnostik technisch machbar ist, eine hohe Concordance zwischen den verschiedenen Laboren erreichbar ist und so auch fr die Charakterisierung von hmatologischen Malignomen geeignet ist.

    Kohlmann et al. (2011), Leukemia

    Sequenzierung in der Diagnostik

    IRON StudieErgebnisse

    22 Mrz 2012, Anhrung Deutscher Ethikrat

  • Bestimmung von Varianten

    22 Mrz 2012, Anhrung Deutscher Ethikrat

  • Qualitt der Mutationsdetektion

    Concordance mit Affymetrix Array "genome-wide human SNP array 6.0"

    22 Mrz 2012, Anhrung Deutscher Ethikrat

  • SensitivittderDetektionvonMutationen

    Querings et al. (2011), PlosOne

    22 Mrz 2012, Anhrung Deutscher Ethikrat

  • Lam et al. (2012), Nat Biotechnol

    VergleichendeSequenzierungdesmenschlichenGenoms

    ber 3,7 Millionen Unterschiede zum Referenzgenom

    Abweichungen in Abhngigkeit von der verwendeten Technologie

    .

    22 Mrz 2012, Anhrung Deutscher Ethikrat

  • Vielen Dank fr IhrInteresse!