Neue Methoden der Pflanzenzüchtung Institut für zur ... · embryo rescue Mutationsauslösung,...

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Christian Jung, Plant Breeding Institute, University of Kiel Agrar- und Ernährungswissenschaftliche Fakultät Neue Methoden der Pflanzenzüchtung zur Selektion und gezielten Veränderung von Nutzpflanzen Christian Jung 6. Agrarwissenschaftliches Symposium, 24. September 2015 , Innovative Biomasse-Erzeugung , Herausforderungen und Perspektiven, Weihenstephan Institut für Pflanzenbau und Pflanzenzüchtung

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  • Christian Jung, Plant Breeding Institute, University of Kiel

    Agrar- und Ernährungswissenschaftliche Fakultät

    Neue Methoden der Pflanzenzüchtung

    zur Selektion und gezielten

    Veränderung von Nutzpflanzen

    Christian Jung

    6. Agrarwissenschaftliches Symposium, 24. September 2015 , Innovative Biomasse-Erzeugung , Herausforderungen und Perspektiven,

    Weihenstephan

    Institut für

    Pflanzenbau und

    Pflanzenzüchtung

  • Christian Jung, Plant Breeding Institute, University of Kiel

    Die Anwendung biotechnologischer Methoden in der Pflanzenzüchtung

    Verkürzung der

    ZüchtungsphaseDH-Produktion,

    in vitro Vermehrung

    Genetisch veränderte

    Pflanzen

    Erhöhung des Selek-

    tionserfolges

    Gentechnisch

    veränderte Pflanzen

    • de facto

    • de jure

    Erweiterung der gene-

    tischen Variabilität

    Art-

    bastardierungSomatische Fusion

    embryo rescueMutationsauslösung,

    genome editingallele

    mining

    Zell- und Gewebekultur Gentechnik, Genetik, Molekularbiologie

    Biostatistik, Bioinformatik,

    Genomforschung

    Pflanzengenetische

    Ressourcen

    Marker-gestützte Selektion,

    genomic selection

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    Alle diploiden Pflanzen besitzen eine ähnliche Anzahl von Genen (25.000 – 35.000),

    unterscheiden sich aber im Anteil der repetitiven DNA des Genoms (bis 95%).

    10µmPhoto: Thomas Schmidt

    Größenvariation pflanzlicher Chromosomen

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    Stadien der strukturellen Genomanalyse

    109 108 107 106 105 104 103 Bp

    Chromosom

    ......AGCAGATTT

    AGACGTAGAT

    TGCAGATGAC

    AGTAGACGGA

    TAGACGGATG

    CGGTGATGAC

    GTGTGGGGTG

    ACGGTGAGTG

    TTTATGTGAGG

    GTCGTGAGTG

    GCGAGGGTGC

    AGTTGGGTCG

    TGGTGAAAAC

    GTGTGACTGA

    TGCTGATGCT

    GACGTTGACG

    TAAGTTTGA.....

    DNA-SequenzPhysische Karte aus large-

    insert Klonen (BAC-contigs)

    genetische KarteKerngenom

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    Marker-gestützte Selektion vs. Genomische Selektion

    Marker

    Gene, QTL

    Marker-gestützte Selektion:

    • wenige Marker

    • Einzelne Gene

    Genomische Selektion:

    • sehr viele Marker

    • Viele (alle) Gene, die an der Ausprägung eines Merkmals

    beteiligt sind (quantitative trait loci, QTL)

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    Hochdurchsatz-Genotypisierungen als

    Voraussetzung für die genomische Selektion

    Microarray Technologie: Hundertausende oder Millionen

    Sequenzen auf einem Chip (Whole genome DNA chip

    array)

    Next generation sequencing Technologie: bis zu 300

    Milliarden Nukleotide/Lauf (1 Woche)

    • SNP Detektion

    • Mapping by sequencing: Kartierung von crossover in

    spaltenden Populationen

    Affymetrix.com

    http://www.liv.

    ac.uk/lmf/

    Illumina hiseq

    DNA SNP array

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    Zwei Schritte führten zur Steigerung des Fruchtgewichtes bei

    Tomaten

    Lin T, et al. (2014) Genomic analyses provide insights into the history of tomato

    breeding. Nature Genetics 46 (11):1220-1226.

    PIM: S. pimpinellifolium (wild ancestor)

    CER: S. lycopersicum var. cerasiforme (cherry tomato)

    BIG: S. lycopersicum (big-fruited tomato)

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    Die Möglichkeiten zur gentechnischen Veränderung von

    Nutzpflanzen sind in den letzten Jahren stark erweitert worden

    Spendergen

    Transformation

    Die traditionelle Sichtweise gentechnisch veränderter Pflanzen:

    Erweiterungen und Abwandlungen:

    • Cisgene Pflanzen

    • Ektopische Regulation endogener Gene

    • Genome editing

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    Methoden zur Mutagenese pflanzlicher Gene

    • Zufällige Mutagenese durch

    – Bestrahlung

    – Chemische Substanzen

    • Insertionsmutagenese

    • Genome editing

    9

    Zahlreich, ungerichtet,

    spontan

    Ortsspezifisch, gezielt auf

    eine Sequenz hin gerichtet

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    Genome editing, targeted genome

    modification

    • Einzelnukleotid-Mutation:

    – Betrifft ein Gen, welches Bestandteil des Genoms ist oder

    – gleichzeitig mehrere Gene, wenn diese über ein hohes Maß an

    Sequenzhomologie verfügen (Genfamilien)

    – Punktmutation (ein bis wenige Nukleotide), frame shift Mutation

    • Einfügen von Insertionen in einem bestimmten Sequenzabschnitt durch

    homologe Rekombination (gene replacement)

    • Deletion größerer Chromosomen-Fragmente

    – Gleichzeitiger Einsatz von zwei sgRNAs

    • Veränderte Genexpression

    • Routine für Reis, Mais, Soja

    10

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    Präzises genome editing und ortsspezifische

    Mutageneseortsspezifische Rekombinase (künstliche Restriktionsenzyme) zur Erzeugung von Doppelstrangbrüchen

    (DSB)

    Führt zur Stimulation des zellulären DNA Reparatursystems: DSBs werden beseitigt durch

    • homologe Rekombination (Resultat ist eine de jure gentechnisch veränderte Pflanze) oder durch die

    • fehleranfällige Verknüpfung nicht-homologer Enden (non-homologous end joining NHEJ)

    Zinkfinger Nukleasen (ZFNs)

    • Fusion einer Zinkfinger DNA-Bindedomäne mit der FokI Endonuklease

    • Zinkfinger DNA-Bindedomäne kann gentechnisch so verändert werden, dass eine bestimmte

    Zielseqauenz im Genom angesteuert wird (je 3 Bp, die miteinander verknüpft werden können, so dass

    bis zu 18 Bp lange Sequenzen gebunden werden)

    • Zwei Gene müssen in die Zelle eingebracht werden (mit oder ohne Insertions-DNA)

    Transcription Activator-Like Effector Nucleases (TALENs)

    • Künstliche Restriktionsenzyme nach Fusion der TAL Effektor DNA-Bindedomäne mit der FokI

    Endonuklease

    homing endonucleases (oder meganucleases)

    Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPRs)

    Methoden, um die ortsspezifische Rekombinase in die Pflanzenzelle einzubringen:

    • Agroinfiltration

    • virale Vektoren

    • Agrobacterium vermittelter Transfer, üblicherweise in einem Expressionsplasmid, mit oder ohne

    template Sequenz oder zu inserierender DNA

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    Gezielte Modifikationen mit Designer Endonukleasen

    Endonuklease

    Erkennungssequenzen

    1. Deletion

    Results of Zinc Finger Nuclease treatment of a specific gene sequence

    2. Insertion

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    Ortsspezifische Mutagenese mit dem CRISPR-Cas

    System

    CRISPR-Cas System: Immunabwehr von Bakterien gegen

    fremde DNA (Viren, Plasmide)

    • CRISPRs: Clustered regularly interspaced short

    palindromic repeats

    • Cas: CRISPR associated RNA-guided DNA

    endonuclease (üblicherweise Endonuklease Cas9)

    • sgRNA: single guide RNA (Fusion aus crRNA und

    tracrRNA), gentechnisch modifiziert, bindet spezifisch

    an eine Zielsequenz

    Protospacer: transcribed sequences from the invading DNA

    PAM: protospacer adjacent motif (2-5 bp)

    crRNA: CRISPR RNAs

    tracrRNA: transactivating CRISPR RNA

    Jinek et al (2012): Science 337:816-821

  • Christian Jung, Plant Breeding Institute, University of Kiel

    Genome editing with cropsSpecies technique Target gene Purpose/phenotype

    Rice TALENs OsBADH2 encoding betaine

    aldehyde dehydrogenase

    knockout

    Rice TALENs CAO1 branching pattern

    Rice TALENs Disease resistance gene

    OsSWEET14

    bacterial blight resistance

    Maize TALENs IPK1, herbicide resistance Reduced phytate content, herbicide resistance, homologous

    recombination to simultaneously deliver the herbicide

    resistance gene and knock out the phytate synthase gene

    Maize meganuclease MS26 Male sterility

    Soybean TALENs Fatty acid desaturase 2

    (FAD2)

    High oleic acid, low linoleic acid

    Cotton Gene insertion Herbicide resistance

    Rapeseed Zinc finger nucleases b-ketoacyl-ACP synthase II

    (KASII)

    Altered gene regulation

    Wheat CRISPR/Cas9 Inositol oxygenase and

    phytoene desaturase genes

    Wheat CRISPR/Cas9 TaMLO Broad spectrum resistance to powdery mildew, Simultaneous

    targeting different homoeoalleles

    Sorghum CRISPR/Cas9 Proof of concept

    Barley TALENs Proof of concept, haploid barley cells manipulated to

    produce DH barley

    Tomato TALENs PROCERA gibberellic acid metabolism

    Tomato CRISPR/Cas9 ARGONAUTE7 Leaf shape

    Potato, apple Zinc finger nucleases Proof of concept

    Orange CRISPR/Cas9 phytoene desaturase

    14(September 2015)

  • Christian Jung, Plant Breeding Institute, University of Kiel

    Züchtung von nachwachsenden

    Rohstoffen für die Biomasseerzeugung

    Biomasse:

    • Festbrennstoffe aus Lignocellulose (perennierende Pflanzen und schnell wachsende

    Baumarten wie Miscanthus sinensis, Chinaschilf, Pappeln, Weiden)

    • zucker-, stärke- oder ölhaltige Pflanzen (z. B. Zuckerrüben, Kartoffeln, Raps) zur

    Erzeugung pflanzlicher Kraftstoffe (z. B. Ethanol, Pflanzenöl,

    Pflanzenölmethylester)

    • Überführung von Lignozellulose-Biomasse in Ethanol

    • gasförmige Energieträger (z. B. Biogas aus Gülle) zur Wärme- und Stromerzeugung

    Traditionelle Nutzung der zur Biomasseerzeugung genutzten Kulturpflanzen

    • Erzeugung von Nahrungs- und Futtermitteln → erfordert duale Ausrichtung der

    Zuchtziele

    • nur als Rohstoffe für die Biomasseerzeugung

    15

  • Christian Jung, Plant Breeding Institute, University of Kiel

    Züchterische Aktivitäten von nachwachsenden

    Rohstoffen für die Biomasseerzeugung

    Quelle Nutzung Traditionelle

    Zuchtziele

    Zuchtziel für Biomasseerzeugung

    Raps Samenöl Ölertrag Ölertrag

    Getreide Bioethanol,

    Ganzpflanzensilage,

    Biogas

    Samenertrag,

    Backqualität

    Gesamte Biomasse, hohe alpha Amylase Aktivität

    Zuckerrüben Bioethanol/Biogas Bereinigter

    Zuckerertrag

    Zuckerertrag

    Mais Biogas (Bioethanol) Kornertrag,

    Biomasse,

    Futterqualität

    Methanertrag, Nutzung von Kurztagsgenen zur

    Züchtung spätreifender Sorten, geringer

    Ligningehalt

    Miscanthus-Hybriden,

    incl.

    Miscanthus × giganteus

    Festbrennstoff Biomasseertrag Biomasseertrag

    Weiden, Pappeln, Pinien Festbrennstoff Biomasseertrag Biomasseertrag

    Luzerne Futterqualität Biomasseertrag

    Sorghum (Sorghum

    bicolor), Sudangras (S.

    sudanense)

    Bioethanol/Biogas Kornertrag Biomasseertrag, Veränderung des Gehaltes an

    Komponenten der Zellwand (Zellulose,

    Hemicellulose, Lignin)

    Deutsches Weidelgras

    (Lolium perenne)

    Biogas Futterqualität Methanertrag

    Energieversorgung – Bioenergie – Ernährung – technische Lösungen

  • Christian Jung, Plant Breeding Institute, University of Kiel

    Energiemaiszüchtung• Reife verzögern: Kurztaggene aus exotischen Populationen integrieren

    • Kältetoleranz in spätes Zuchtmaterial einlagern

    GGP Bonn, W. Schmidt (KWS SAAT AG)

    Silomais Energiemais

    Methanbildung Minimal im Pansen Maximal im Fermenter

    Verweildauer ½ Tag 30 – 40 Tage

    Stärkegehalt Hoch > 32 % ausgereiftes

    Korn notwendig

    Nicht entscheidend

    TS-Gehalt 30- 35 % zur max.

    Futteraufnahme

    25 – 30 % zur Vermeidung

    von Sickersaft

  • Christian Jung, Plant Breeding Institute, University of Kiel

    Die pflanzliche Zellwand: Ein Forschungsobjekt

    für die Bioenergieerzeugung

    Pflanzliche Biomasse (exklusive Ernteorgane) besteht größtenteils aus Zellwandbestandteilen

    Ziel: Züchtung von Pflanzen mit höherem Celluloseanteil und geringerem Protein- und Ligninanteil (N-Gehalt)

    Ektopische Expression von Cellulose-Synthasegenen

    Ektopische Expression von Transkriptionsfaktoren (z.B. NAC- and Myb-domain-containing proteins), die die Bildung sekundärer Zellwändbestandteile initiieren

    Transgene Pappeln mit verringertem Ligninanteil (Energieersparnis bei Holzverarbeitung)

    Steigerung der Effizienz des Celluloseabbaus(Clostridium thermocellum, Trichoderma-Pilze)

    18http://www.daviddarling.info/images/plant_cell_wall.gif

  • Christian Jung, Plant Breeding Institute, University of Kiel

    Winterrüben, eine neuartige Kultur für die europäische Landwirtschaft

    AUTUMN WINTER

    SPRINGSUMMER

    Winterrübenanbau mit schossresistenten

    ZuckerrübenWinterrübenanbau mit herkömmlichen

    Zuckerrüben

    AUTUMN WINTER

    SPRINGSUMMER

    Zuckerrübe: höchstes CO2 Einsparungspotential aller Pflanzen in Europa, ideal für Biogas

    Lagerung: Rüben für Biogas-Produktion müssen geschnitztelt werden, Lagerung als Silage, hoher Milchsäureanteil, kein

    Energieverlust bei Lagerung über Jahre

    hoher Wasseranteil (80%): großer Lagerflächenbedarf

    Hoher Schmutzanteil verringert Gärvolumen, höherer Maschinenverschleiß

    Ziel: weitere Steigerung des Zuckerertrages

  • Christian Jung, Plant Breeding Institute, University of Kiel

    Zwei Gene kontrollieren das Schossen bei

    Zuckerrüben

    20

    BBX19 BTC1d

    BvFT1 BvFT2

    REC

    Interaction

    Activation

    Repression

    A B

    A: Kontrollpflanze nach Vernalisation

    B: BTC1-RNAi transgene Pflanze nach Vernalisation

    Winterrüben Prototyp: BTC1-reprimierte transgene Pflanzen

    schossen nicht nach Vernalisation

    Dally et al., 2014

  • Christian Jung, Plant Breeding Institute, University of Kiel

    Methoden zur Veränderung von Genen einer Nutzpflanze und

    deren rechtliche Bewertung

    • Artbastardierung

    • Induzierte zufällige

    Mutagenese

    Genetisch veränderte Pflanze

    Ohne gesetzliche Regelungen

    Sehr viele Veränderungen

    Gentechnik-Gesetzgebung

    • Einschleusen fremder Gene in

    das Genom

    • Gezielte Veränderung

    endogener Gene durch

    Gentransfer

    Gentechnisch veränderte Pflanze

    Eine Veränderung

    Induzierte gezielte

    Mutagenese (genome

    editing)

    Gentechnisch veränderte Pflanze

    Eine Veränderung