Neue Methoden der Pflanzenzüchtung Institut für zur ... · embryo rescue Mutationsauslösung,...

Christian Jung, Plant Breeding Institute, University of Kiel

Agrar- und Ernährungswissenschaftliche Fakultät

Neue Methoden der Pflanzenzüchtung

zur Selektion und gezielten

Veränderung von Nutzpflanzen

Christian Jung

6. Agrarwissenschaftliches Symposium, 24. September 2015 , Innovative Biomasse-Erzeugung , Herausforderungen und Perspektiven,

Weihenstephan

Institut für

Pflanzenbau und

Pflanzenzüchtung


Die Anwendung biotechnologischer Methoden in der Pflanzenzüchtung

Verkürzung der

ZüchtungsphaseDH-Produktion,

in vitro Vermehrung

Genetisch veränderte

Pflanzen

Erhöhung des Selek-

tionserfolges

Gentechnisch

veränderte Pflanzen

• de facto

• de jure

Erweiterung der gene-

tischen Variabilität

Art-

bastardierungSomatische Fusion

embryo rescueMutationsauslösung,

genome editingallele

mining

Zell- und Gewebekultur Gentechnik, Genetik, Molekularbiologie

Biostatistik, Bioinformatik,

Genomforschung

Pflanzengenetische

Ressourcen

Marker-gestützte Selektion,

genomic selection


Alle diploiden Pflanzen besitzen eine ähnliche Anzahl von Genen (25.000 – 35.000),

unterscheiden sich aber im Anteil der repetitiven DNA des Genoms (bis 95%).

10µmPhoto: Thomas Schmidt

Größenvariation pflanzlicher Chromosomen


Stadien der strukturellen Genomanalyse

109 108 107 106 105 104 103 Bp

Chromosom

......AGCAGATTT

AGACGTAGAT

TGCAGATGAC

AGTAGACGGA

TAGACGGATG

CGGTGATGAC

GTGTGGGGTG

ACGGTGAGTG

TTTATGTGAGG

GTCGTGAGTG

GCGAGGGTGC

AGTTGGGTCG

TGGTGAAAAC

GTGTGACTGA

TGCTGATGCT

GACGTTGACG

TAAGTTTGA.....

DNA-SequenzPhysische Karte aus large-

insert Klonen (BAC-contigs)

genetische KarteKerngenom


Marker-gestützte Selektion vs. Genomische Selektion

Marker

Gene, QTL

Marker-gestützte Selektion:

• wenige Marker

• Einzelne Gene

Genomische Selektion:

• sehr viele Marker

• Viele (alle) Gene, die an der Ausprägung eines Merkmals

beteiligt sind (quantitative trait loci, QTL)


Hochdurchsatz-Genotypisierungen als

Voraussetzung für die genomische Selektion

Microarray Technologie: Hundertausende oder Millionen

Sequenzen auf einem Chip (Whole genome DNA chip

array)

Next generation sequencing Technologie: bis zu 300

Milliarden Nukleotide/Lauf (1 Woche)

• SNP Detektion

• Mapping by sequencing: Kartierung von crossover in

spaltenden Populationen

Affymetrix.com

http://www.liv.

ac.uk/lmf/

Illumina hiseq

DNA SNP array


Zwei Schritte führten zur Steigerung des Fruchtgewichtes bei

Tomaten

Lin T, et al. (2014) Genomic analyses provide insights into the history of tomato

breeding. Nature Genetics 46 (11):1220-1226.

PIM: S. pimpinellifolium (wild ancestor)

CER: S. lycopersicum var. cerasiforme (cherry tomato)

BIG: S. lycopersicum (big-fruited tomato)


Die Möglichkeiten zur gentechnischen Veränderung von

Nutzpflanzen sind in den letzten Jahren stark erweitert worden

Spendergen

Transformation

Die traditionelle Sichtweise gentechnisch veränderter Pflanzen:

Erweiterungen und Abwandlungen:

• Cisgene Pflanzen

• Ektopische Regulation endogener Gene

• Genome editing


Methoden zur Mutagenese pflanzlicher Gene

• Zufällige Mutagenese durch

– Bestrahlung

– Chemische Substanzen

• Insertionsmutagenese

• Genome editing

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Zahlreich, ungerichtet,

spontan

Ortsspezifisch, gezielt auf

eine Sequenz hin gerichtet


Genome editing, targeted genome

modification

• Einzelnukleotid-Mutation:

– Betrifft ein Gen, welches Bestandteil des Genoms ist oder

– gleichzeitig mehrere Gene, wenn diese über ein hohes Maß an

Sequenzhomologie verfügen (Genfamilien)

– Punktmutation (ein bis wenige Nukleotide), frame shift Mutation

• Einfügen von Insertionen in einem bestimmten Sequenzabschnitt durch

homologe Rekombination (gene replacement)

• Deletion größerer Chromosomen-Fragmente

– Gleichzeitiger Einsatz von zwei sgRNAs

• Veränderte Genexpression

• Routine für Reis, Mais, Soja

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Präzises genome editing und ortsspezifische

Mutageneseortsspezifische Rekombinase (künstliche Restriktionsenzyme) zur Erzeugung von Doppelstrangbrüchen

(DSB)

Führt zur Stimulation des zellulären DNA Reparatursystems: DSBs werden beseitigt durch

• homologe Rekombination (Resultat ist eine de jure gentechnisch veränderte Pflanze) oder durch die

• fehleranfällige Verknüpfung nicht-homologer Enden (non-homologous end joining NHEJ)

Zinkfinger Nukleasen (ZFNs)

• Fusion einer Zinkfinger DNA-Bindedomäne mit der FokI Endonuklease

• Zinkfinger DNA-Bindedomäne kann gentechnisch so verändert werden, dass eine bestimmte

Zielseqauenz im Genom angesteuert wird (je 3 Bp, die miteinander verknüpft werden können, so dass

bis zu 18 Bp lange Sequenzen gebunden werden)

• Zwei Gene müssen in die Zelle eingebracht werden (mit oder ohne Insertions-DNA)

Transcription Activator-Like Effector Nucleases (TALENs)

• Künstliche Restriktionsenzyme nach Fusion der TAL Effektor DNA-Bindedomäne mit der FokI

Endonuklease

homing endonucleases (oder meganucleases)

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPRs)

Methoden, um die ortsspezifische Rekombinase in die Pflanzenzelle einzubringen:

• Agroinfiltration

• virale Vektoren

• Agrobacterium vermittelter Transfer, üblicherweise in einem Expressionsplasmid, mit oder ohne

template Sequenz oder zu inserierender DNA


Gezielte Modifikationen mit Designer Endonukleasen

Endonuklease

Erkennungssequenzen

1. Deletion

Results of Zinc Finger Nuclease treatment of a specific gene sequence

2. Insertion


Ortsspezifische Mutagenese mit dem CRISPR-Cas

System

CRISPR-Cas System: Immunabwehr von Bakterien gegen

fremde DNA (Viren, Plasmide)

• CRISPRs: Clustered regularly interspaced short

palindromic repeats

• Cas: CRISPR associated RNA-guided DNA

endonuclease (üblicherweise Endonuklease Cas9)

• sgRNA: single guide RNA (Fusion aus crRNA und

tracrRNA), gentechnisch modifiziert, bindet spezifisch

an eine Zielsequenz

Protospacer: transcribed sequences from the invading DNA

PAM: protospacer adjacent motif (2-5 bp)

crRNA: CRISPR RNAs

tracrRNA: transactivating CRISPR RNA

Jinek et al (2012): Science 337:816-821


Genome editing with cropsSpecies technique Target gene Purpose/phenotype

Rice TALENs OsBADH2 encoding betaine

aldehyde dehydrogenase

knockout

Rice TALENs CAO1 branching pattern

Rice TALENs Disease resistance gene

OsSWEET14

bacterial blight resistance

Maize TALENs IPK1, herbicide resistance Reduced phytate content, herbicide resistance, homologous

recombination to simultaneously deliver the herbicide

resistance gene and knock out the phytate synthase gene

Maize meganuclease MS26 Male sterility

Soybean TALENs Fatty acid desaturase 2

(FAD2)

High oleic acid, low linoleic acid

Cotton Gene insertion Herbicide resistance

Rapeseed Zinc finger nucleases b-ketoacyl-ACP synthase II

(KASII)

Altered gene regulation

Wheat CRISPR/Cas9 Inositol oxygenase and

phytoene desaturase genes

Wheat CRISPR/Cas9 TaMLO Broad spectrum resistance to powdery mildew, Simultaneous

targeting different homoeoalleles

Sorghum CRISPR/Cas9 Proof of concept

Barley TALENs Proof of concept, haploid barley cells manipulated to

produce DH barley

Tomato TALENs PROCERA gibberellic acid metabolism

Tomato CRISPR/Cas9 ARGONAUTE7 Leaf shape

Potato, apple Zinc finger nucleases Proof of concept

Orange CRISPR/Cas9 phytoene desaturase

14(September 2015)


Züchtung von nachwachsenden

Rohstoffen für die Biomasseerzeugung

Biomasse:

• Festbrennstoffe aus Lignocellulose (perennierende Pflanzen und schnell wachsende

Baumarten wie Miscanthus sinensis, Chinaschilf, Pappeln, Weiden)

• zucker-, stärke- oder ölhaltige Pflanzen (z. B. Zuckerrüben, Kartoffeln, Raps) zur

Erzeugung pflanzlicher Kraftstoffe (z. B. Ethanol, Pflanzenöl,

Pflanzenölmethylester)

• Überführung von Lignozellulose-Biomasse in Ethanol

• gasförmige Energieträger (z. B. Biogas aus Gülle) zur Wärme- und Stromerzeugung

Traditionelle Nutzung der zur Biomasseerzeugung genutzten Kulturpflanzen

• Erzeugung von Nahrungs- und Futtermitteln → erfordert duale Ausrichtung der

Zuchtziele

• nur als Rohstoffe für die Biomasseerzeugung

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Züchterische Aktivitäten von nachwachsenden

Rohstoffen für die Biomasseerzeugung

Quelle Nutzung Traditionelle

Zuchtziele

Zuchtziel für Biomasseerzeugung

Raps Samenöl Ölertrag Ölertrag

Getreide Bioethanol,

Ganzpflanzensilage,

Biogas

Samenertrag,

Backqualität

Gesamte Biomasse, hohe alpha Amylase Aktivität

Zuckerrüben Bioethanol/Biogas Bereinigter

Zuckerertrag

Zuckerertrag

Mais Biogas (Bioethanol) Kornertrag,

Biomasse,

Futterqualität

Methanertrag, Nutzung von Kurztagsgenen zur

Züchtung spätreifender Sorten, geringer

Ligningehalt

Miscanthus-Hybriden,

incl.

Miscanthus × giganteus

Festbrennstoff Biomasseertrag Biomasseertrag

Weiden, Pappeln, Pinien Festbrennstoff Biomasseertrag Biomasseertrag

Luzerne Futterqualität Biomasseertrag

Sorghum (Sorghum

bicolor), Sudangras (S.

sudanense)

Bioethanol/Biogas Kornertrag Biomasseertrag, Veränderung des Gehaltes an

Komponenten der Zellwand (Zellulose,

Hemicellulose, Lignin)

Deutsches Weidelgras

(Lolium perenne)

Biogas Futterqualität Methanertrag

Energieversorgung – Bioenergie – Ernährung – technische Lösungen


Energiemaiszüchtung• Reife verzögern: Kurztaggene aus exotischen Populationen integrieren

• Kältetoleranz in spätes Zuchtmaterial einlagern

GGP Bonn, W. Schmidt (KWS SAAT AG)

Silomais Energiemais

Methanbildung Minimal im Pansen Maximal im Fermenter

Verweildauer ½ Tag 30 – 40 Tage

Stärkegehalt Hoch > 32 % ausgereiftes

Korn notwendig

Nicht entscheidend

TS-Gehalt 30- 35 % zur max.

Futteraufnahme

25 – 30 % zur Vermeidung

von Sickersaft


Die pflanzliche Zellwand: Ein Forschungsobjekt

für die Bioenergieerzeugung

Pflanzliche Biomasse (exklusive Ernteorgane) besteht größtenteils aus Zellwandbestandteilen

Ziel: Züchtung von Pflanzen mit höherem Celluloseanteil und geringerem Protein- und Ligninanteil (N-Gehalt)

Ektopische Expression von Cellulose-Synthasegenen

Ektopische Expression von Transkriptionsfaktoren (z.B. NAC- and Myb-domain-containing proteins), die die Bildung sekundärer Zellwändbestandteile initiieren

Transgene Pappeln mit verringertem Ligninanteil (Energieersparnis bei Holzverarbeitung)

Steigerung der Effizienz des Celluloseabbaus(Clostridium thermocellum, Trichoderma-Pilze)

18http://www.daviddarling.info/images/plant_cell_wall.gif


Winterrüben, eine neuartige Kultur für die europäische Landwirtschaft

AUTUMN WINTER

SPRINGSUMMER

Winterrübenanbau mit schossresistenten

ZuckerrübenWinterrübenanbau mit herkömmlichen

Zuckerrüben

AUTUMN WINTER

SPRINGSUMMER

Zuckerrübe: höchstes CO2 Einsparungspotential aller Pflanzen in Europa, ideal für Biogas

Lagerung: Rüben für Biogas-Produktion müssen geschnitztelt werden, Lagerung als Silage, hoher Milchsäureanteil, kein

Energieverlust bei Lagerung über Jahre

hoher Wasseranteil (80%): großer Lagerflächenbedarf

Hoher Schmutzanteil verringert Gärvolumen, höherer Maschinenverschleiß

Ziel: weitere Steigerung des Zuckerertrages


Zwei Gene kontrollieren das Schossen bei

Zuckerrüben

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BBX19 BTC1d

BvFT1 BvFT2

REC

Interaction

Activation

Repression

A B

A: Kontrollpflanze nach Vernalisation

B: BTC1-RNAi transgene Pflanze nach Vernalisation

Winterrüben Prototyp: BTC1-reprimierte transgene Pflanzen

schossen nicht nach Vernalisation

Dally et al., 2014


Methoden zur Veränderung von Genen einer Nutzpflanze und

deren rechtliche Bewertung

• Artbastardierung

• Induzierte zufällige

Mutagenese

Genetisch veränderte Pflanze

Ohne gesetzliche Regelungen

Sehr viele Veränderungen

Gentechnik-Gesetzgebung

• Einschleusen fremder Gene in

das Genom

• Gezielte Veränderung

endogener Gene durch

Gentransfer

Gentechnisch veränderte Pflanze

Eine Veränderung

Induzierte gezielte

Mutagenese (genome

editing)

Gentechnisch veränderte Pflanze

Eine Veränderung

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