Neuer Antibiotika-Nachweis:SCHNELL

I I I I 11QUALITÄTSMANAGEMENT UND SICHERNachweis von Antibiotika-Rückständen in Rohmilch

mit dem neuartigen Biosensor MCR3

I I

Unsere Autorin:Christine Habel

Bereichsleiterin ..Hemm-stoffe und Referenzma-

terialien", MilchprüfringBayern

Grundsätzlich sind Antibiotika inder Milchviehhaltung unverzichtbar.Trotzdem wird versucht, den Einsatz vonAntibiotika zu minimieren. Wenn Antibi-otika eingesetzt werden, so kann es trotzallerVorsichtsmaßnahmen zu Rückstän-den in der Milch kommen. Sie bergen

Positivkontrolle

Negativkontrolle

Ceftiofur

Nafcillin

Enrofloxacin

Tylosin

Erythromycin A

Gentamicin

Neomycin B

Cephapirin

Penicillin G

Ampicillin

Cloxacillin

Streptomycin

SDA

SMA

42 1/13 . FOOO-Lab

Fotoaufnahme eines Antibiotika-Chips

ein gewisses Allergiepotenzial, es kannzu Resistenzbildungen kommen und eskönnen auch toxische Effekte auftreten.Besonders für Molkereien spielen Pro-duktionsstörungen durch Antibiotika-Rückstände eine große Rolle.

Welch wirtschaftlicher Schaden ent-stehen kann, sei an einem Beispielgezeigt: Die gesetzliche Rückstands-höchstmenge für Cloxacillin (Trocken-stellerpräparat) beträgt 30 !AgiL. Dasbedeutet, dass 30 mg Cloxacillin 1.000L Milch unbrauchbar machen. Ein Eute-rinjektor Cloxacillin entspricht 600 mgCloxacillin. Würden nun alle vier Euter-viertel behandelt werden, so hätte maninsgesamt 2400 mg Cloxacillin ins Eutereingebracht. Frisch nach der Behand-lung gemolken, könnten so bis zu 80.000LMilch verunreinigt werden.

Rückstandskontrollen sind grund-sätzlich gesetzlich vorgeschrieben, dochsie werden durch jeden Lebensmittel-hersteller aus seiner Verantwortunggegenüber dem Verbraucher herausdurchgeführt.Als npraktizierter Verbrau-cherschutz" steht dies dem Tierschutzgegenüber.

Um sich dieser Problematik konkretanzunehmen und die Verbraucher vorAntibiotikarückständen in Lebensmit-teln zu schützen, wurden von Gesetz-geberseite maximale Rückstandswertefestgelegt (MRL - maximum residuelimit). Doch hier liegt im Moment eineDiskrepanz zwischen diesem gesetz-lichen .son- und dem nIst", denn es gibtfür die Praxis keine schnelle und vorallem auch bezahlbare Methode zurÜberwachung der MRL's vor Ort.

Die Voraussetzung für die Überwa-chung der MRL's ist die Identifikationdes Wirkstoffes bzw. des Rückstandes

(Qualifizierung) und die Bestimmungdessen Kon-zentration, um mit dem MRLvergleichen zu können (Quantifizierung).Hier hat sich aus didaktischen Gründendie Abkürzung nQuaQua" eingebürgert,welche diese beiden Elemente nQualifi-zierung" und nQuantifizierung" einpräg-sam beschreibt.

Rückstandssituation gut.aber verbesserungsfähig

Die aktuelle Entwicklung zeigt, dassdie hemmstoffpositiven Fälle rückläufigsind. So wurden 2011 in Bayern nnur"0,13 % der Lieferanten positiv getestet.Dies hat mehrere Gründe:Ivermehrte Eigenkontrolle (Hoftests, ko-

stenlose Tests durch Molkereien)Ivermehrte Aufklärung und Sensibilisie-

rung durch Molkereien, Tierärzte, MPRu.a.

I Neue LM-Hygiene-Recht seit 2006 (kon-krete Maßnahmen in Bayern seit März2008)

. jeder Hemmstofffall wird an diezuständige Behörde gemeldet, waseinen Besuch des Amtstierarzteszur Folge hat

. nMehrfachtäter" (innerhalb von36 Monaten mehr als ein Hemm-

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10 ~g/L

1OOO~g/L

Ermittlung der Konzentrationen durchAufnahme einer Kalibrierkurve

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TNP: 14~g/ LMRL: 4~g/ LWR: 3- 150 ~g/ L

O.1po

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Bsp.: Kalibrierkurve für Penicillin G

stofffall) werden zusätzlich durcheinen MPR-Mitarbeiter besucht

. 2010 - 127 Betriebsbegehungen2011 - 89 Betriebsbegehungen

I tägliche Probenahme. jede Milchablie-ferung wird beprobt. So ist immer eineRückstellprobe vorhanden. Die Verur-sacher für hemmstoffpositive Tank-samrnelzüge können ermittelt und zumSchadenersatz heran gezogen werden.

Vergleich derzeitverfügbarerNach\Neissysteme:

Die derzeit verfügbaren Nachweissystemekann man in 3 Gruppen unterteilen:I die mikrobiologischen TestsI die Rezeptor-SchnelltestsI die physikalisch-chemische Referenz-

methodeBei dem mikrobiologischen Hemm-

stoff test handelt es sich in Deutsch-land laut Gesetzesvorgabe um den Bril-lantschwarz Reduktionstest (BRT):I es ist ein unspeziftscher Test für alle

HemmstoffeI er besitzt ein breites Nachweisspektrum

aller für die Milchviehhaltung relevanterAntibiotika

I Untersuchungszeit ca. 2-2,5 hBei den Wirkmechanismen der Re-

zeptor-Schnelltests handelt es sich umimmunologische Rezeptor-Antigen-Bindungen bzw. um eine enzymatischeReaktion. Schnelltests können in derRegel nur einzelne bestimmte Arznei-mittelgruppen nachweisen, nämlichdie, die der eingesetzte Rezeptor bin-den kann. Ob also eine Substanz qua-

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lifiziert werden kann, ist vom Rezeptorabhängig. Ein negatives Schnelltester-gebnis weist also noch keine Hemm-stofffreiheit nach. Der Vorteil hier liegtaber auch klar auf der Hand: Die kurzeDauer bis zu einem Ergebnis.

Die dritte Gruppe von Methoden stelltdie Referenzanalytik dar:Hierbei werden meist mittels Flüssig-chromatographie, gekoppelt mit einemMassenspektrometer, die einzelnenWirkstoffgruppen nachgewiesen. Fürdie Methode muss eine je nach nachzu-weisender Gruppe unterschiedliche, z.T.aufwendige Probenvorbereitung durch-geführt werden. Dadurch und auchdurch die teuren Messgeräte entstehenrelativ hohe Messkosten. Diese ist dieeinzige Methode, die den Wirkstoff tat-sächlich qualifizieren und quantifizie-ren kann (- QUA-QUA).

Zusammenfassungder einzelnenNach\Neissysteme:

Der gesetzlich vorgeschriebene mi-krobiologische Test BRT besitzt zwarein breites Nachweisspektrum undist relativ kostengünstig, kann abernur qualifizieren, also eine ja/nein-Aussage treffen und dauert sehr lan-ge. Die Schnelltests haben hier ihreStärke: Sie sind kostengünstig undliefern deutlich schnellere Ergebnisse.Der Nachteil besteht darin, dass dieseaber nur bestimmte Wirkstoffgruppennachweisen und auch nicht quantifi-zieren können. Die Referenzmethodebietet als Einzige die Möglichkeit einer

Qualifizierung und Quantifizierung.Werden alle Wirkstoffgruppen unter-sucht, so ist sie vom Spektrum mitdem mikrobiologischen Test vergleich-bar. Aufgrund ihrer hohen Kosten undder Dauer der Untersuchung ist sie imRoutineablauf nicht oder lediglich be-dingt einsetzbar.

Idealerweise brauchte man also einSystem, das eine Mischung aus allendrei Testsystemen ist: breites Nach-weisspektrum, Identifizierung des An-tibiotikums mit Konzentrationsangabe,kostengünstig und schnell.

Hier setzt der BioSensor zum Nach-weis von Antibiotika in Milch - MCR 3(Munich Chip Reader- 3. Generation) an.

Detektionsprinzip (indirektkompetitiver ELISA]:

In einer Spritze befindet sich ein An-tikörpercocktail aus 14 verschiedenenspezifischen Antikörpern, von denAntibiotika-Derivaten, die derzeit mitdem Biosensor nachgewiesen werdenkönnen.

Dieser Antikörpercocktail wird beiStart der Messung mit der zu untersu-chenden Milchprobe in eine Inkubati-onsschleife geleitet. Falls Antibiotika inder Milch vor-handen sind, binden die-se an die spezifischen Antikörper.

Dieses Milch-Antikörper-Gemischwird nun über einen Messchip ge-leitet, auf den die nachzuweisenden

Beispiel einerhemmstoffpositivenProbe im Vergleichzu einer negativenMilchprobe

MCR 3: 560 f,lg/LBRT:) 400 f,lg/LMRL: 4 f,lg/L

1/13 . FOOO-Lab 43

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Beispiel einer Auswertung am MCR3

Antibiotika fest immobilisiert sind.Die noch freien Antikörper des Anti-körpercocktails können sich an dieentsprechenden Antigene auf demChip binden. Die so auf dem Chip ge-bundenen Primärantikörper werdendann mittels eines enzymmarkiertenSekundärantikörpers markiert. ZurMarkierung des Sekundärantikörperswird das Enzym Meerrettich-Pero-xidase verwendet. Es katalysiert dieReaktion von Wasserstoffperoxid mitLuminol, wobei Licht emittiert wird,welches mit einer sensitiven CCD-Ka-mera detektiert wird. Die Lichtintensi-tät ist direkt proportional zu der ober-flächen konzentration der gekoppeltenAnalyten.

Es gilt also der umgekehrte Nachweis:Je mehr Antibiotika in einer Milchprobeist, desto weniger freie Antikörper sindvorhanden und binden am Chip. Destoweniger Licht wird erzeugt.

Im Anschluss an die Fotoaufnahmewerden die entstandenen Antikörper-bindungen mit einem sauren Mediumabgewaschen, so dass gleich wiedereine neue Messung gestartet werdenkann.

ta laktame, Makrolide, Sulfonamide,Aminoglykoside) 5 fach aufgetragen,mit Positiv- und Negativ-Kontrolle. Dieabsolute Lichtintensität ist charakte-ristisch für jedes Antibiotikum.

Ermittlung derKonzentrationendurch Aufnahme einerKalibrierkurve:

Es werden 7 verschiedene Konzentra-tion, von 0 - 1000 ~g/L, eines Milch-standards der alle 14 verschiedenen

Antibiotika enthält gemessen. Bei ei-ner negativen Milch erhält man dasmaximale Signal für jedes Antibioti-kum. Bei einer Konzentration von 10~g/L sind die Signale schon deutlichabgeschwächt. Bei einer Konzentra-tion von 1000 ~g/L leuchtet nur nochdie Positivkontrolle. Aus den einzel-nen Messungen wird eine Kalibrier-kurve erstellt.

Bsp.: Kalibrierkurvefür Penicillin G:

Der lineare Bereich, zwischen 10 %und 80 %, legt den Arbeitsbereichfest. Bei anderen Antibiotika ist derTest weit sensitiver als der MRL. Dortkönnen Grenzwertüberschreitungendurch Verdünnung der Probe festge-stellt werden.

Beispiel einerhemmstoffpositivenProbe im Vergleichzu einer negativenMilchprobe:

Links ist die Fotoaufnahme einerhemmstofffreien Milchprobe (maxima-les Signal für alle Antibiotika) gezeigt.Rechts sieht man die Aufnahme einerhemmstoffpositiven Milch probe. DasSignal von Penicillin G ist deutlich abge-schwächt bzw. verschwindet im Hinter-grundrauschen. Der MCR 3 misst eineKonzentration von 560 ~g/L (deutlicheGrenzwertüberschreitung mit) 4 ~g/L).Durch Verdünnung der Milch probe

Seit Oktober 2008:4146 Proben

Fotoaufnahme einesAntibiotika-Chips:

Die CCD-Kameraaufnahme zeigt dieLichtsignale der 14 Antibiotika ausverschiedenen Wirkstoffgruppen (Be- Antibiotika-Verteilung

44 1/13 . FOOO-Lab

70%

• Kein AntibiotikumAmpicillin

• Cloxacillin• Penicillin G-Streptomycin

• Penicillin G• Cloxacillin-Ampicillin• Penicillin G-Neomycin B• Sonstige

Detektierte Antibiotika MRL [lJgI L] MCR3 [lJg/L] BRT [lJgI L]Ampicillin 4 215 ~ 200Ampicillin, Cloxacill in 4, 30 44, 201 ~ 40, ~ 120Cloxacillin 30 283 ~ 300Cephapirin 60 37 ~ 25Penicillin G 4 605 ~ 200Penicillin G, Neomycin B 4, 1. 500 1.012,8.650 ~ 800Penicillin G, Streptomycin 4, 200 58,291 ~ 40, *

Penicillin G, Streptomycin, Nafcillin 4, 200, 30 42,37,105 ~40, *, ~ 120Streptomycin 200 501 •Ceftiofur 100 92 .

* Bestätigt mit Rezeptor-Schnelltest

Detektierte Antibiotika beim Milchprüfring Bayern e.V.im Vergleich zum BRT

konnte mit dem BRT eine Konzentrati-on von) 400 f,lg!Lermittelt werden, waseine gute Vergleichbarkeit darstellt.

BeispieleinerAuswertung am MCR3:

In der Auswertesoftware werden in ei-ner Maske alle Daten dargestellt. Obensind die Daten und die Kalibrierkurvenaller 14 Antibiotika zu finden. Untenlinks sind die Intensitäten des jeweilsausgewählten Antibiotikums der Kali-brierkurve aufgelistet.

Unten rechts findet man die Ergeb-nisse einer hemmstoffpositiven Milch-probe. In diesem Fall liegt eine zwei-fache Grenzwertüberschreitung vor:Penicillin G mit 40 f,lg!L und Neomy-ein B mit 1800 f,lg!L.

Antibiotika-Verteilung:

Seit Oktober 2008 wurden beim Milch-prüfring Bayern e.Y.über 4.000 hemm-stoff-positive Proben mit dem MCR 3nachuntersucht. Über 90 % der Probenenthalten in irgend einer Form das Be-talaktam Penicillin G. Besonders auf-fallend ist aber auch die Häufigkeitder Wirkstoffkombinationen, die vonGesetzgeberseite derzeit nicht berück-sichtigt werden.

Detektierte Antibiotikabeim MilchprüfringBayern e.V. imVergleich zum BRT:

Die gefundenen Konzentrationenwurden jeweils mit dem BRT verg-lichen und zeigen eine sehr gute Über-einstimmung.

Vergleich mit derReferenzanalytik:

Die Referenzanalytik wurde an dermuva kempten mittels HPLC-MS durch-geführt. In der Tabelle sind Beispieleaus der Wirkstoffgruppe der Betalak-tame aufgelistet. Auch hier ist einegute Vergleichbarkeit zwischen MCR 3,BRTund HPLC-MS zu verzeichnen.

Antibiotika, wie das Neomycin B, fürdie zu der Zeit keine Referenzanalytikmöglich war, konnten mit einem ELI-SA-Test bestätigt werden.

Welche Bedeutunghaben diese Ergebnissein der Praxis?

Aufgrund verschiedener Testsystemekönnen Rückschlüsse auf die einge-

setzten Medikamente gezogen wer-den. Dies bietet einen sehr großenVorteil bei der Ursachenfindung undAufklärung von hemmstoffpositivenFällen, wie nachfolgendes Fallbeispielzeigt:

Der BRT weist in der Verdünnung einpositives Ergebnis von 1:4 auf. DieserWirkstoff ist mit Penicillinase inaktivier-bar, folglich muss es sich um ein Beta-laktam handeln.

Dies wurde auch durch einenSchnelltest bestätigt. Mit einem weite-ren Schnelltest, für Streptomycin wur-de auch ein positives Ergebnis festge-stellt. Der MCR3 kann nun mit einerMessung beide Wirkstoffe bestätigenund auch die Konzentration feststel-len. Was sowohl eine Kosten-, als auchZeitersparnis bringt.

Diese Möglichkeit der Wirkstoffbe-stimmung stellt eine große Hilfe dar, diemittlerweile nicht nur von den Außen-dienstmitarbeitern des MPR, sondernauch von Veterinären und Landwirtengenutzt wird.

Fazit:

Der MCR3 bietet eine einmalige Chan-ce für die MilchWirtschaft, schon frühin der produktionskette Rückständevon Antibiotika sicher nachzuweisen.Durch Qualifizierung und Quantifi-zierung entsteht ein mehr an Sicher-heit für alle an der ProduktionsketteMilch Beteiligte. So kann zum erstenMal weltweit die für die praktische An-wendung bestehende "diagnostischeLücke" bei der Untersuchung auf Anti-biotikarückstände in der Lebensmittel-kette Milch geschlossen.

Detektierte Antibiotika MRL [lJglL) BRT [lJgI L] MCR 3 [iJgI L] HPLC-MS[lJglL)

Penicillin G 4 ?:4 3,8 3,9Penicillin G 4 ?:4 6 4,3Penicillin G 4 ?:40 22 30Penicillin G 4 z 800 833 976Penicillin G, Neomycin B 4, 1. 500 ?: 16 15, 56 15,30Cloxacillin 30 z 30 25 21Cloxacillin 30 z 30 37 34Cloxacillin 30 ?:60 102 105Cloxacillin 30 ?: 300 265 281Cloxacillin 30 z 300 200 274

Es werden nicht nur einzelne Antibioti-ka aus verschiedenen Wirkstoffgruppen(z.B. Ampicillin, Cephapirin, Streptomy-cin) auf MRL-Niveau nachgewiesen, son-dern auch Wirkstoffkombinationen, bishin zur 3fach-Kombination. Vergleich mit der Referenzanalytik • Bestätigt durch ELiSA

1/13· FOOO-Lab 45

Februar 2013

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