Neuronale in-vitro Differenzierung von murinen homozygoten ...

Aus der Abteilung Innere Medizin I, Hämatologie und Onkologie,

der Albert-Ludwigs-Universität, Freiburg im Breisgau

Neuronale in-vitro Differenzierung von murinen homozygoten Pbx1 Knock-out embryonalen

Stammzellen:

Ein System zum Studium der Funktion und zur Identifikation

potentieller Zielgene des Pbx1-Homeoboxproteins während der

zellulären Differenzierung

INAUGURAL-DISSERTATION

zur

Erlangung des Medizinischen Doktorgrades

der Medizinischen Fakultät

der Albert-Ludwigs-Universität

Freiburg im Breisgau

vorgelegt im Jahr 2005

von Anne Siobhain Jürgens

geboren in Neuss

Dekan: Prof. Dr. med. J. Zentner 1.Gutachter: Prof. Dr. med. R. Mertelsmann 2.Gutachter: Prof. Dr. med. M. Reincke Jahr der Promotion: 2005

Meinen Eltern und Michael

Literaturverzeichnis

LITERATURVERZEICHNIS

1 EINLEITUNG ____________________________________________________ 1

1.1 Grundsätzliches zur Genfunktionsanalyse in Stammzellen ____________ 1

1.2 Definition der embryonalen Stammzellen___________________________ 2

1.3 In Vitro-Differenzierung embryonaler Stammzellen___________________ 3

1.4 PBX1_________________________________________________________ 4

1.5 Klinische Relevanz von PBX1 ____________________________________ 8

1.6 HOX-Gene ____________________________________________________ 9

2 ZIELSETZUNG __________________________________________________ 11

3 MATERIAL UND METHODEN ______________________________________ 12

3.1 Material______________________________________________________ 12 3.1.1 Geräte ___________________________________________________ 12 3.1.2 Verbrauchsmaterialien_______________________________________ 13 3.1.3 Chemikalien_______________________________________________ 14 3.1.4 Enzyme __________________________________________________ 15 3.1.5 Antibiotika ________________________________________________ 15 3.1.6 Standards ________________________________________________ 16 3.1.7 Kits zur Bearbeitung von DNA und Protein _______________________ 16 3.1.8 Radioaktive Substanzen _____________________________________ 16 3.1.9 Antikörper ________________________________________________ 16 3.1.10 Medien, Medienzusätze und gepufferte Salzlösungen ______________ 16 3.1.11 Medien für das Arbeiten mit embryonalen Stammzellen_____________ 17

3.1.11.1 Medium zur Kultivierung embryonaler Stammzellen _________________ 17 3.1.11.2 Medium zur Differenzierung embryonaler Stammzellen ______________ 17 3.1.11.3 Medium zum Einfrieren embryonaler Stammzellen __________________ 17

3.1.12 Stamm-und Standardlösungen ________________________________ 18 3.1.13 Bakterien _________________________________________________ 19 3.1.14 Medien zur Anzucht von Bakterien _____________________________ 19 3.1.15 Oligonukleotide ____________________________________________ 20

3.1.15.1 RT-PCR Primer _____________________________________________ 20 3.1.16 Primer für die Northern Blot Analyse____________________________ 20

3.2 Methoden ____________________________________________________ 21 3.2.1 Methoden zur Arbeit mit eukaryoten Zellen_______________________ 21

3.2.1.1 Kultivierung embryonaler Stammzellen ___________________________ 21 3.2.1.2 Gelatinisieren von Zellkulturflaschen bzw. -platten __________________ 22 3.2.1.3 Trypsinieren von Zellen _______________________________________ 22 3.2.1.4 Einfrieren von Zellen _________________________________________ 22 3.2.1.5 Auftauen und Revitalisieren von Zellen ___________________________ 23 3.2.1.6 ES-Zelldifferenzierung ________________________________________ 23

3.2.2 Molekularbiologische Methoden _______________________________ 24 3.2.2.1 RNA-Isolierung aus kultivierten Zellen____________________________ 24 3.2.2.2 Konzentrationsbestimmung von cDNA- bzw. RNA-Lösung ____________ 25


3.2.2.3 Aufreinigung der präparierten gesamt RNA mittels RNAeasy __________ 25 3.2.2.4 cDNA-Synthese _____________________________________________ 26 3.2.2.5 In-vitro-Transkription _________________________________________ 26 3.2.2.6 RT-PCR ___________________________________________________ 27 3.2.2.7 Verdauung von DNA mit Restriktionsendonukleasen ________________ 29 3.2.2.8 Transformation von E. coli mit Plasmid- DNA ______________________ 29 3.2.2.9 Isolierung von Plasmid-DNA (Qiagen-Methoden) ___________________ 30 3.2.2.10 Gelelektrophorese zur Auftrennung von DNA und RNA–Fragmenten____ 31 3.2.2.11 Isolierung von DNA–Fragmenten aus Agarosegelen_________________ 32 3.2.2.12 Northern-Blot _______________________________________________ 32 3.2.2.13 Genexpressionsanalyse_______________________________________ 34

3.2.3 Proteinchemische Methoden__________________________________ 37 3.2.3.1 Immunzytochemie für Zellkulturen (Fluoreszenz-Methode)____________ 37

4 ERGEBNISSE___________________________________________________ 39

4.1 Etablierung eines neuronalen Differenzierungsprotokolls ____________ 39 4.1.1 ES-Zellkultur ______________________________________________ 39 4.1.2 In-vitro-ES-Zelldifferenzierung_________________________________ 41

4.2 Vergleichende Charakterisierung der Genexpression in Wildtyp, PBX1(+/-)- und PBX1(-/-)-Zelllinien _________________________________________ 46

4.2.1 Vergleichende semiquantitative RT-PCR Analyse _________________ 46 4.2.1.1 Expression von PBX1 während der zellulären Differenzierung _________ 46 4.2.1.2 Expression von neuronalen Genen während der zellulären Differenzierung47 4.2.1.3 Expression von FGF15, WNT1 und BMP4 ________________________ 49

4.2.2 Vergleichende immunzytochemische Analyse der Embryoidkörperchen 51 4.2.3 Vergleichende Genexpressionsanalyse _________________________ 53

4.2.3.1 Vergleich der undifferenzierten und der differenzierten WT-ES-Zellen ___ 54 4.2.3.2 Vergleich Wildtyp und Kock-out –ES-Zellen im differenzierten Stadium __ 64

4.2.4 Northern Blot Analyse _______________________________________ 74

5 DISKUSSION ___________________________________________________ 76

5.1 Neuronale Differenzierung der embryonalen Stammzellen in vitro _____ 76 5.1.1 Etablierung des neuronalen in-vitro-Differenzierungssystems ________ 77 5.1.2 Bestätigung der neuronalen in-vitro-Differenzierung________________ 78 5.1.3 Vergleich der Differenzierung in vitro mit der Entwicklung in vivo______ 80

5.2 Auswirkung der Inaktivierung von PBX1 in embryonalen Stammzellen auf die in-vitro-Differenzierung _____________________________________ 82

5.3 Vergleichende Charakterisierung der Genexpressionsmuster in WT und PBX1-K.O.-Zellen zur Identifikation von potentiellen Zielgenen________ 84

5.3.1 WNT1 und BMP4___________________________________________ 85 5.3.2 FGF15 ___________________________________________________ 87 5.3.3 IGF-Familie _______________________________________________ 87

5.3.3.1 IGF1______________________________________________________ 89 5.3.3.2 IGF1R ____________________________________________________ 90 5.3.3.3 IGF2______________________________________________________ 90 5.3.3.4 IGF2R ____________________________________________________ 91 5.3.3.5 H19 ______________________________________________________ 92

5.3.4 Colipase _________________________________________________ 93 5.3.5 Zusammenfassende Darstellung potentieller Zielgene von PBX1 _____ 94


5.4 Korrelation des zuvor beschriebenen in-vitro-Differenzierungssystems mit einem in vivo PBX1-K.O.-Maus-Modell ____________________________ 95

5.4.1 Rolle von PBX1 in der Entwicklung des Pankreas und in der Pathogenese des Diabetes ______________________________________________ 95

5.4.2 Rolle von PBX1 in der Hämatopoese ___________________________ 98

5.5 Schlussfolgerung und Perspektiven_____________________________ 100

6 ZUSAMMENFASSUNG __________________________________________ 102

7 LITERATURVERZEICHNIS _______________________________________ 103

8 ANHANG _____________________________________________________ 113

8.1 Herstellung der Embryonalen Stammzellen mit einem PBX1-Knock-out 113 8.1.1 Konstrukt des Vektors ______________________________________ 113 8.1.2 Homologe Rekombination ___________________________________ 114

9 ABKÜRZUNGEN _______________________________________________ 117

10 DANKSAGUNG ______________________________________________ 120

11 VERÖFFENTLICHUNGEN ______________________________________ 121

11.1 Abstracta ___________________________________________________ 121

11.2 Tagungsbeiträge _____________________________________________ 121

11.3 Seminarvorträge _____________________________________________ 122

12 LEBENSLAUF _______________________________________________ 123

Einleitung 1

1 Einleitung

1.1 Grundsätzliches zur Genfunktionsanalyse in Stammzellen

Alle Entwicklungsprozesse individueller Lebewesen werden durch Gene

gesteuert: frühe Organogenese, kontrollierte Zellteilung, Zellwanderung und

Differenzierung. Eine Möglichkeit, die Entwicklung eines Organismus auf

molekularer Ebene zu verstehen, ist die Identifikation beteiligter Gene und die

Analyse der Funktion ihrer Genprodukte. Die Entwicklung der embryonalen

Stammzell-Technologie der Maus hat es ermöglicht, durch homologe

Rekombination gezielte Mutationen in embryonalen Stammzellen (ES-Zellen)

zu erzeugen, um so die Funktion bereits identifizierter Gene zu untersuchen.

Die Übertragung genetisch modifizierter embryonaler Stammzellen auf

Mausembryos ermöglicht die Übertragung der Mutation in die Keimbahn. So

können sogenannte transgene „Knock-out“-Mäuse erzeugt werden, denen ein

spezifisches Genprodukt fehlt. Der Phänotyp solcher Mäuse kann auf die

Funktion des fehlenden Gens hindeuten (Capecchi, 1989; Joyner et al., 1989;

Koller and Smithies, 1992; Mansour et al., 1988).

Das betroffene Gen ist allerdings in allen Zellen des Organismus schon

während der prä- und postnatalen Entwicklung deletiert. Handelt es sich um ein

lebenswichtiges Gen, so ist seine Funktion in diesem Modell nur bedingt

aufklärbar, da die Knock-out(K.O.)-Maus schon früh während der embryonalen

Entwicklung stirbt. Als Weiterentwicklung dieser klassischen Methode wurde

deshalb die konditionale Geninaktivierung und verschiedene in-vitro-

Differenzierungsprotokolle entwickelt. Der konditionale Ansatz bietet die

Möglichkeit, das Zielgen topisch und zeitlich kontrolliert zu inaktivieren (Galli-

Taliadoros et al., 1995). Die in-vitro-Differenzierung von embryonalen

Stammzellen kann als Modellsystem dienen, um frühe Entwicklungsvorgänge

zu untersuchen. Einer der Vorzüge dieses in-vitro-Systems ist es, dass eine

hohe Anzahl an Zellen in verschiedenen Phasen der Differenzierung gewonnen

werden kann, und erlaubt dadurch eine umfassende molekularbiologische

Analyse (Czyz and Wobus, 2001). Der Vergleich der Expressionsmuster

während der Differenzierung zwischen WT- und K.O.-ES-Zellen verbessert die

Einleitung 2

Möglichkeit, die biologischen Funktionen für wichtige Gene in der

Differenzierung zu charakterisieren.

Auch in der klinischen Medizin sind Stammzellen in den Mittelpunkt des

Interesses gerückt. Die Medizin sucht nach Möglichkeiten, defekte Gewebe und

Organe zu ersetzen. Die Frage, ob Stammzellen für eine solche

Zellersatztherapie genutzt werden können, und welche Stammzellen hierfür am

besten geeignet sind, lässt sich zur Zeit noch nicht beantworten. ES-Zellen

haben den Vorteil, dass sie relativ gut charakterisiert und pluripotent sind. Ein

großer Nachteil ist die Immunreaktion bei der Transplantation. Auch bedürfen

die mit der Forschung an humanen embryonalen Stammzellen verknüpften

ethischen Probleme weiterer Klärung. Diese Diskussion wird derzeit sehr

kontrovers auf vielen Ebenen unserer Gesellschaft geführt (Rohwedel, 2001).

Eine weitere Möglichkeit zur Zellersatztherapie ergibt sich möglicherweise aus

der Verwendung adulter Stammzellen, die aus Geweben und Organen eines

Fötus oder eines adulten Organismus gewonnen werden. Ihr

Differenzierungspotential ist nach heutigen Erkenntnissen im Vergleich zu

embryonalen Stammzellen stärker eingeschränkt. Sie sind allerdings bisher

noch unzureichend charakterisiert. Da diese aus dem Gewebe des

Transplantationsempfängers isoliert werden können, ist die autologe

Transplantation hier einfacher zu verwirklichen. Intensive Forschungsarbeit ist

auf diesem Gebiet noch notwendig (Rohwedel, 2001).

1.2 Definition der embryonalen Stammzellen

ES der Maus wurden erstmals vor ca. 20 Jahren isoliert (Evans and Kaufman,

1981; Martin, 1981). Sie werden aus der inneren Zellmasse der

Mausblastozyste gewonnen und sind pluripotent, d.h. nach Injektion in die

Mausblastozyste können sie sich noch an der Ausbildung aller Gewebe und

Zelltypen beteiligen. Später verlieren sie diese Eigenschaft zunehmend. Sie

werden determiniert und verlieren nach jeder Zellteilung etwas von ihrem

Differenzierungspotential.

Unter bestimmten Bedingungen z.B. Zusatz von leukemia inhibitory factor (LIF)

bleiben ES-Zellen in vitro pluripotent. ES-Zellen können praktisch unbegrenzt

vermehrt werden. LIF ist ein Zytokin, das zu der IL6-Familie gehört. Es wurde

im Zusammenhang mit der Differenzierungsinduktion von M1 Leukämiezellen

Einleitung 3

identifiziert (Tomida et al., 1984). Später wurde es als Inhibitor der

Differenzierung von Maus ES-Zellen eingesetzt (Niwa, 2001; Smith et al., 1988;

Williams et al., 1988).

Es gibt nur wenige identifizierte Gene, die essentiell sind für die Pluripotenz von

ES-Zellpopulationen. Bisher bestätigt ist diese Funktion für den

Transkriptionsfaktor OCT3/4 der POU-Familie (OCT3 oder OCT4 oder Pou5f1).

Die OCT3/4-Expression ist beschränkt auf totipotente und pluripotente Zellen im

murinen Lebenszyklus (Pesce et al., 1998). Die Expression lässt sich in

Oozyten, in befruchteten Eizellen, in der inneren Zellmasse der Blastozyste, im

primitiven Ektoderm, im Eizylinder, in primordalen Keimzellen, im späteren

Stadium des Embryos und in Keimzellen von Erwachsenen nachweisen

(Palmieri et al., 1994; Scholer et al., 1990). Die Expression wird im

Trophoektoderm und im primitiven Endoderm herunterreguliert (Pesce and

Scholer, 2000). Die Rolle von OCT3/4 in der Mausentwicklung wurde durch

gezielte Gendeletion untersucht. OCT3/4 defiziente Embryos sterben während

der Implantation, da sie unfähig sind, die innere Zellmasse zu bilden (Nichols et

al., 1998). Untersuchungen in ES-Zellen haben gezeigt, dass die Expression

von OCT3/4 mit drei verschiedene Zellschicksalen korreliert ist (Niwa et al.,

2000). ES-Zellen benötigen eine kritische Expressionsrate an OCT3/4 zur

Stammzellerneuerung. Ein Expressionsanstieg führt zur Differenzierung in

Endoderm und Mesoderm und eine Reduktion führt zu Dedifferenzierung in

Trophoektoderm (Niwa et al., 2000).

OCT3/4 kann als Hauptregulator der Differenzierung von pluripotenten Zellen

angesehen werden (Niwa, 2001).

1.3 In Vitro-Differenzierung embryonaler Stammzellen

Sobald ES-Zellen in Suspension kultiviert werden, beginnen sie, sogenannte

Embryoidkörperchen zu bilden. Nach einigen Tagen in Kultur, können die

Embryoidkörperchen in Zellkulturflaschen mit adhäsiver Oberfläche transferiert

und dadurch die Differenzierung begonnen werden. Unter entsprechenden

Bedingungen differenzieren sie in spezialisierte Zelltypen: kardiale (Maltsev et

al., 1994; Rohwedel et al., 1998; Wobus et al., 1991), myogene (Rohwedel et

al., 1998; Rohwedel et al., 1994), neuronale (Bain et al., 1995; Gajovic et al.,

1997), hämatopoetische (Schmitt et al., 1991; Wiles, 1993), epitheliale (Bagutti

Einleitung 4

et al., 1996), endodermale (Sauer et al., 1998), adipogene (Dani et al., 1997)

und chondrogene Zellen (Kramer et al., 2000). Die Rekapitulation der

entwicklungsspezifischen Genexpressionsmuster ermöglicht die in-vitro-

Analyse von Entwicklungsprozessen auf molekularer Ebene. Die in-vitro-

Differenzierung embryonaler Stammzellen ist ein wichtiges Modell für die

Analyse der frühen Embryonalentwicklung.

1.4 PBX1

Das PBX1-Gen ist auf dem Chromosom 1q23

lokalisiert (Abb. 1-1) (Monica et al., 1991). Es ist

beim Menschen bei akuten lymphoblastischen

prä-B Leukämien durch Untersuchungen der

Translokation zwischen Chromosom 1 und 19

entdeckt worden, die zu dem onkogenen

Fusionsprotein E2a–PBX1 führt. Es handelt sich

bei PBX1 daher um ein Protoonkogen, das als

Transkriptionsfaktor fungiert (Kamps, 1997;

Kamps et al., 1990). PBX1 kann durch

alternatives Splicing für die längere Isoform

PBX1a und die kürzere Form PBX1b kodieren

(Asahara et al., 1999; Schnabel et al., 2001).

PBX1 gehört zur PBX-Familie von Homöobox

Genen in Vertebraten, die auch PBX2, PBX3 und

neuerdings PBX4 einschließen (Monica et al.,

1991; Wagner et al., 2001). Die PBX-Proteine gehören zur Klasse der TALE

(three amino acid loop extension)-Familie, eine Gruppe von Proteinen mit einer

Homöodomäne. PBX2 und PBX3 wurden aufgrund ihrer Sequenzhomologie mit

94%iger Sequenzidentität zu PBX1 entdeckt. Eine eventuelle Bedeutung in

Neoplasien oder anderen Krankheiten ist noch nicht bekannt. Während das

PBX1-Protein in allen Geweben außer in der B- und T–Zelllinie exprimiert wird,

werden PBX2 und PBX3 ubiquitär exprimiert. PBX4 wird während der

Spermatogenese gebildet (Wagner et al., 2001).

Abb. 1-1: Die genetische Struktur des Chromosoms 1 (http://www.informatics.jax.org)

Einleitung 5

Abb. 1-2: Kooperative DNA-Bindung von HOX- und PBX-Proteinen

Hox B1

PBX1

PBX1-Proteine binden mit HOX-Proteinen als

kooperative Partner an DNA in einem Komplex

mit einer Reihe von Proteinen und verändern

dadurch ihre Affinität und Spezifität (Abb. 1-2).

Die Dimerisierung von PBX- und HOX-

Proteinen an der DNA ist abhängig von einem

konservierten Pentapeptid-Motiv nahe dem N-

Terminus in der HOX-Homöodomäne. In

einigen Fällen ändert die Heterodimerisierung

die DNA bindende Spezifität und damit die

biologische Aktivität (Asahara et al., 1999;

Kamps, 1997; Knoepfler and Kamps, 1995).

Alternativ ist das Protoonkogen Meis1 ein häufiger intrazellulärer Partner für die

PBX-Proteine (Chang et al., 1997). Meis1 gehört zu den MEINOX-Proteinen,

eine weitere Subgruppe der TALE-Familie. Meis1 wurde zunächst in

myeloischen Leukämien in BXH-2

Mäusen identifiziert. BXH-2 Mäuse

entwickeln myeloische Leukämien,

verursacht durch ein ektopes murines

Leukämievirus, dessen Genprodukte

als eingebaute Mutagene die

Expression von zellulären

Protoonkogenen beeinflussen

(Moskow et al., 1995). Meis1 kann mit

PBX1 an bipartiten DNA-Sequenzen,

die aus 5`PBX1 (TGAT) und 3`Meis

(TGACAG) bestehen, dimerisieren. Die

Bindungsstelle von Meis1

unterscheidet sich demnach von der

von HOX-Proteinen (Chang et al.,

1997).

In einem sogenannten „kompetitiven

Modell“ wird angenommen, dass Meis

Abb. 1-3: Modell der unterschiedlichen DNA –Bindung durch PBX1-HOX und PBX1-Meis Heterodimere (aus Knoepfler et al., 1997)

Einleitung 6

und HOX-Proteine um die Heterodimerisierung von PBX1 konkurrieren. Ein

weiteres, sogenanntes „kooperatives Modell“ geht davon aus, dass HOX-

Proteine mit bereits gebildeten PBX-Meis-Komplexen zusammenwirken (Chang

et al., 1997).

Abbildung 1-3 zeigt ein Modell für die unterschiedliche DNA-Bindung durch die

PBX1-HOX und PBX1-Meis1 Heterodimere. Das monomere PBX1 besitzt eine

N-terminale Domäne, die die DNA-Bindung durch Homöodomäne-Proteine

verhindert. Die Dimerisierung mit HOX oder Meis1 wandelt PBX1 in eine DNA-

bindende Konformation, wobei HOX und Meis1 an eine unterschiedliche

Sequenz binden (Knoepfler et al., 1997).

Murine PBX1(-/-) Embryonen sterben zwischen Embryonaltag (E) 15,5 und E

16,5 und weisen sowohl schwere Skelettdeformitäten als auch schwere

Hypoplasien von abdominalen und thorakalen Organen und eine Aplasie der

Niere auf (Selleri et al., 2001). Optisch sehr auffallend ist die Blässe und ein

subkutanes Ödem der Embryonen (Abb. 1-4). Diese Merkmale treten zum

ersten Mal am E 12,5 auf und gehen mit einer schweren Anämie einher

(DiMartino et al., 2001; Selleri et al., 2001). PBX1(-/-) zeigen zudem schwere

Pankreashypoplasien mit markanten Defekten in exokrinen und endokrinen

Zelltypen. In diesen Embryos ist die Expression von ISL1 und ATOH5,

essentiellen Regulatoren der Pankreasmorphogenese und -differenzierung,

stark reduziert. PBX1(+/-) Mäuse sind lebensfähig und fruchtbar und zeigen

interessanterweise auch einen Phänotyp. Sie haben signifikant kleinere

Körpergrößen und zeigen

gravierende Abnormitäten in

den Inseln des Pankreas,

eine pathologische

Glukosetoleranz und

verminderte Insulinwerte.

Diese Veränderungen sind

mit dem Beginn eines

Diabetes mellitus assoziiert.

PBX1 scheint also essentiell

zu sein für die normale

Abb. 1-4: WT und PBX1(-/-) Embryos E 14, 5 (aus DiMartino et al., 2001)

Einleitung 7

Entwicklung und Funktion des Pankreas und seine Dysfunktion fördert die

Entwicklung eines Diabetes mellitus (Kim et al., 2002).

Bei der Maus wird PBX1 in vielen embryonalen Geweben in charakteristischer

Weise während der embryonalen Entwicklung exprimiert.

Immunhistochemische Analysen haben nachgewiesen, dass PBX1b nach der

Implantation durchweg während der Entwicklung exprimiert wird, besonders

aber in der frühen und mittleren Gestationsphase (Schnabel et al., 2001). Auch

die Daten dieser Experimente unterstreichen die Bedeutung von PBX1 in der

Embryogenese: PBX1 wird in Derivaten aller drei Keimblätter (Ektoderm,

Mesoderm und Endoderm) stark exprimiert. Sie erfolgt zunächst im paraxialen

Mesoderm und Endoderm, insbesondere aber ist die PBX1-Expression an

solchen Orten lokalisiert, wo eine mesenchymale - epitheliale Interaktion in der

aktiven Morphogenese von Geweben wie Lunge, Niere, Zähne und Haarfollikel

stattfindet (Schnabel et al., 2001).

Experimente mit BrdU Markierung

haben gezeigt, dass die Expression

von PBX1 sich teilweise mit Regionen

zellulärer Proliferation überschneidet,

z. B. in der Entwicklung des

Dienzephalons. Diese

Untersuchungen zeigen, dass PBX1 in

mehreren regulatorischen

Signaltransduktionswegen eine große

Rolle spielt, die teilweise auch die

zelluläre Proliferation und

Gewebeexpansion kontrollieren

(Schnabel et al., 2001).

Bei der Ratte wird PBX1 während der

embryonalen Entwicklung am

stärksten in neuronalen Gewebe

exprimiert (Roberts et al., 1995).

PBX1-Expression wird zuerst am E 14

im Rattenhirn nachweisbar, die

Abb. 1-5: In situ Analyse der PBX1 Expression im Gehirn einer Ratte. Nähere Erläuterungen im Text (aus Redmond et al., 1996)

Einleitung 8

Expressionsrate steigt bis zum E 17 und erreicht ihr Maximum in der ersten

postnatalen Woche. Anschließend sinkt die Konzentration auf ein niedrigeres

Niveau, welches auch im adulten Gehirn erhalten bleibt. PBX1 wird

interessanterweise vor allem in Regionen aktiver Neurogenese exprimiert:

während der embryonalen Entwicklung im Telenzephalon, postnatal in der

subventrikulären Zone, auf dem Migrationsweg zum Bulbus olfactorius und in

verschiedenen Schichten des Bulbus olfactorius, die Zielorte der migrierenden

Neuronen sind (Abb. 1-5). Das Expressionsmuster von PBX1 überschneidet

sich mit dem von HOX-Proteinen. Diese Überlappung deutet darauf hin, dass

sie zusammen mit HOX-Genen bestimmte Zielgene regulieren (Redmond et al.,

1996).

In situ Hybridisierung von PBX1 zusammen mit Markern für Zellproliferation

(PCNA), postmitotische Neurone (Klasse III β-Tubulin) und Gliazellen (GFAP)

zeigen, dass v.a. proliferierende Zellen der subventrikulären Zone und Neurone

PBX1 exprimieren und weniger die Gliazellen. Diese Ergebnisse deuten auf

eine wichtige Rolle von PBX1 in der Neurogenese hin (Redmond et al., 1996;

Roberts et al., 1995).

1.5 Klinische Relevanz von PBX1

1984 wurde die Translokation (1;19)

(q23;p13.3) zum ersten Mal bei prä-B

ALL beschrieben (Abb. 1-6) (Crist et al.,

1990; Williams et al., 1984). 25% aller

pädiatrischen prä-B ALL weisen die

Translokation (1;19) auf (Carroll et al.,

1984).

Obwohl es sich um eine der häufigsten

Translokationen in humanen Leukämien

handelt, wurde sie bisher in keiner

anderen Leukämie gefunden. Kinder mit

prä-B ALL und t(1;19) haben eine

schlechtere Prognose als Kinder, deren

prä-B Zellen keine feststellbare Chromosomentranslokation zeigen. Sie werden

deswegen mit einer aggressiveren Therapie behandelt (Crist et al., 1990). E2A

Abb. 1-6: Die molekularen Konsequenz der Chromosomentranslokation (1;19)

Einleitung 9

ist ein Transkriptionsaktivator, der an den Immunglobin κ L-Ketten Enhancer

bindet. Es wird vor allem in der B-Zellreihen exprimiert. Die Translokation

fusioniert die Homöodomäne von PBX1 mit der transkriptionalen

Aktivierungsdomäne von E2A. Das E2A–PBX1 Onkoprotein behält die

Fähigkeit, DNA als Komplex mit HOX-Proteinen zu binden, während es die

Möglichkeit, mit Meis1 zu dimerisieren, verliert. Die Sequenz, an der Meis1

bindet, geht durch die Translokation mit E2A verloren (Knoepfler et al., 1997).

Man geht daher davon aus, dass die Zielgene von PBX1 und E2A-PBX1 sich

nur teilweise überlappen. E2A-PBX1 trägt zur Pathogenese der akuten

Leukämie wahrscheinlich auch dadurch bei, dass es die aberrante Aktivierung

von Zielgenen bewirkt, wodurch die Differenzierung der B-Zellen blockiert und

das Wachstum der undifferenzierten Zellen induziert wird (Fu and Kamps, 1997;

Kamps, 1997). Die Expression von E2A-PBX1 in Mäuseknochenmark, kultiviert

in Gegenwart von GM-CSF, resultiert in einem rapiden Auswuchs einer

immortalisierten, GM-CSF abhängigen Myeloblastenzelllinie (Kamps and

Wright, 1994). E2A–PBX1 hat also folgende onkogene Wirkungen: 1.

Blockierung der Differenzierung von murinen myeloischen Zellen; 2. Induktion

myeloisch und T-lymphatisch Leukämien in Mäusen; 3. Induktion von Foci in

Fibroblastenkulturen (Dedera et al., 1993; Kamps and Baltimore, 1993; Kamps

et al., 1990).

1.6 HOX-Gene

Die HOX-Genfamilie umfasst eine Gruppe von Transkriptionsfaktoren, die durch

die Existenz einer bestimmten DNA-Bindungsdomäne charakterisiert werden.

Diese DNA-Bindungsdomäne wird Homöobox genannt (McGinnis and

Krumlauf, 1992). Homöoboxgene und ihre Proteine sind zuerst bei Drosophila

entdeckt worden. PBX-Proteine sind homolog zu dem Extradentical(Exd)-

Protein; es besteht eine 71%ige Sequenzidentität (Rauskolb et al., 1993).

Der Verlust dieser Gene durch Mutation oder Deletion führt zu bizarren

Phänotypen: z. B. Antennapedia Mutanten bei Drosophila Fliegen haben Beine

anstelle der Antennen, Ultrabithorax Mutanten haben ein weiteres Flügelpaar

(Ingham, 1988; Scott and O'Farrell, 1986); in der Maus verwandelt sich bei den

Mutanten ein Wirbelbogen in einen anderen oder der Entwicklungsablauf im

Hinterhirn ist geändert (Lumsden, 1990; McGinnis and Krumlauf, 1992). Beim

Einleitung 10

Menschen haben Mutanten Fusionen und Duplikationen in den Hand - oder

Fußknochen (Alberts, 1997).

Bei allen Lebewesen haben HOX-Gene eine multifunktionelle Rolle in der

Entwicklung der lebenswichtigen Organe wie Gehirn, Muskel und Knochen.

HOX-Gene kodieren Transkriptionsfaktoren, die die Expression von Genen

regulieren, die für die Einleitung verschiedener Entwicklungswege erforderlich

sind (McGinnis and Krumlauf, 1992).

HOX-Gene spielen in der Embryonalentwicklung eine große Rolle, vor allem in

der Entwicklung von Körpersegmenten (McGinnis and Krumlauf, 1992). Sie

bestimmen die axiale Identität des sich entwickelnden Embryos. Die Maus

besitzt 39 HOX-Gene, die in vier spezifischen Komplexen (HOXA – HOXD) auf

verschiedenen Chromosomen lokalisiert sind (Graham et al., 1989; Krumlauf,

1992). Jedes Gen innerhalb eines Komplexes wird mit einer Nummer

bezeichnet (1-13). Besonders eindrucksvoll ist die Organisation der HOX-

Genfamilie untereinander. Gene, die näher am 3`Ende von der Gruppe stehen,

werden zeitlich früher und weiter anterior in der Entwicklung exprimiert als

diejenigen Gene, die sich weiter am 5`Ende befinden. HOX-Gene wirken

entweder als aktivierende oder reprimierende Transkriptionsfaktoren (Graham

et al., 1989; Hunt and Krumlauf, 1991; Trainor et al., 2000).

Zielsetzung 11

2 Zielsetzung

PBX1-Knock-out-Mäuse sterben 15 – 16 Tage nach Gestation mit schwerer

Hypoplasie bzw. Aplasie multipler Organsysteme. PBX1 wird in der

embryonalen Entwicklung in Regionen aktiver Neurogenese exprimiert. Da

PBX1-Knock-out-Mäuse nicht überleben, kann die Funktion von PBX1 in der

neuronalen Entwicklung nur durch konditionale Knock-out-Techniken und durch

Untersuchungen in vitro analysiert werden.

Durch Verwendung des Cre-lox-Systems haben wir murine ES-Zellen mit einem

Einzel- und Doppelallel-Knock-out erzeugt.

Ziel dieser Arbeit war es, zunächst ein Differenzierungsprotokoll in vitro zu

etablieren. Im ersten Teil wurden bereits veröffentliche Protokolle getestet und

modifiziert. Der Erfolg der Differenzierung sollte morphologisch,

immunhistochemisch und molekular gesichert werden. Dann wurde die

Differenzierung in vitro in die neuronale Zelllinie an den Wildtyp, den PBX1(+/-)

und den PBX1(-/-) embryonalen Stammzellen durchgeführt und miteinander

verglichen.

Im zweiten Teil der Arbeit sollten die verschiedenen Zelllinien auf molekularer

Ebene miteinander verglichen werden. Dazu wurde an verschiedenen

Kontrollpunkten während der Differenzierung RNA isoliert. Um unterschiedliche

Genexpressionsmuster zu evaluieren, wurden RT-PCR Untersuchungen und

Genexpressionsanalysen mit Mikroarrays durchgeführt.

Mit diesem System können potentielle Zielgene von PBX1 während der

zellulären Differenzierung identifizieren werden.

Material und Methoden 12

3 Material und Methoden

3.1 Material

3.1.1 Geräte

Brutschrank Heraeus, Hanau

Eismaschine Ziegra, Isernhagen

Elektrophorese - Apparatur BioRad, München

Filmentwicklungsmaschine X-OMAT Kodak AG, Stuttgart

Fluidics Station 400 Affymetrix, Santa Clara/USA

GeneChip Scanner mit Workstation Affymetrix, Santa Clara/USA

Handcounter LB 122 (ß-Detector) Berthold, Wildbach

Heizblock TCR 100 Roth, Karlsruhe

Hybridisierungsofen Bachofer, Reutlingen

Hybridisierungsofen 640 Affymetrix, Santa Clara/USA

Inkubator, geregelte CO2-Atmosphäre Heraeus, Hanau

Magnetrührer Heidolph, Schwabach

Mikroskop Axiovert 100 Zeiss, Oberkochem

Mikroskop Axioplan 2 Zeiss, Oberkochem

Mikroskop DMIL Leica, Wetzlar

Mikroskop ID03 Zeiss, Oberkochem

Mikrowellenherd Siemens, Karlsruhe

Monitor Hantarex, Florenz/Italien

Murine Genome Array, U74Av2 Affymetrix, Santa Clara/USA

Neubauer Zählkammer Merck, Darmstadt

pH-Meter 761 Calimatic Knick, Berlin

Pipette, 10 µl Eppendorf, Hamburg

Pipette, 20 µl, 200 µl, 1000 µl Gilson,Villiers-le-Bel/Frankreich

Pipettierhilfe Pipet-Boy Integra Bioscience, Fernwald

Schüttelinkubator G25 New Brunswick Sc., Edison/USA

Spannungsgeräte Gibco BRL, Eggenstein

Spektrophotometer, GeneQuant pro Amersham, Braunschweig

ß-Counter, EASI COUNT 2000 Scotlab, Washington/USA


Sterilbank, Lamin Air HLB 2448 Heraeus, Hanau

Sterilbank, Microflow Nunc, Wiesbaden

Stickstofftank Air Liquide Kryotechnik, Düsseldorf

Thermocycler Gene Amp PCR 2400 Perkin-Elmer Cetus, Norwalk/USA

Thermoprinter Herolab, Wiesloch

UV – Cross linker Stratagene, Heidelberg

UV-Handlampe Typ HL-6-KM Bachofer, Reutlingen

UV-Transilluminator UVP, San Gabriel/USA

Video Copy Processor Herolab, Wiesloch

Vortex Super-Mixer Heidolph, Schwabach

Waagen Sartorius, Göttingen

Wasserbad Janke & Kunkel, Staufen

Wasserbad Haake, Karlsruhe

Zentrifuge 5417C Eppendorf, Hamburg

Zentrifuge Megafuge 3.0R Heraeus, Hanau

Zentrifuge Megafuge1.0R Heraeus, Hanau

Zentrifuge, Varifuge 3.0R Heraeus, Hanau

3.1.2 Verbrauchsmaterialien

Anzuchtkolben Schott, Mainz

Deckgläser Engelbrecht, Edermünde

Insulin-Spritzen Braun, Melsungen

Falcon- Röhrchen Falcon, Becton Dickinson

Gewebekulturflaschen Nunc, Wiesbaden

Glaswolle Serva, Heidelberg

Hybond-N+-Transfermembran Amersham, Braunschweig

Kryoröhrchen Nalge Nunc, Rochester N.Y./USA

Nalgene Filtrationssysteme Nalge Nunc, Rochester N.Y./USA

Objektträgerflaschen Nunc, Wiesbaden

Objektträgerkasten Roth, Karlsruhe

Pasteurpipetten aus Glas Brand, Wertheim

Pipettenspitzen Gibco BRL, Eggenstein

Petrischalen Greiner, Frickenhausen

Reaktionsgefäße Eppendorf, Hamburg


Röntgenfilme X-OMAT AR Kodak, Stuttgart

Schalen zum Abwiegen Bender & Holbein, Bruchsal

Skalpelle Feather, Basel/Schweiz

Sterilfilter, Millex-GP, 0.22 µm Millipore, Molsheim/Frankreich

Spritzen, steril Braun, Melsungen

Stericup Vakuumfiltereinheit Millipore, Molsheim/Frankreich

Whatman 3 MM-Papier Bender & Holbein, Bruchsal

3.1.3 Chemikalien

Alle Chemikalien besaßen den Reinheitsgrad pro analysi.

Agarose Sigma, Deisenhofen

Bacto-Hefe-Extract Difco, Detroit / USA

Bacto-Trypton Difco, Detroit / USA

Borsäure Merck, Darmstadt

Bromophenolblau Sigma, Deisenhofen

BSA BioLabs, Schwalbach/Taunus

Chloroform Merck, Darmstadt

DEPC Sigma, Deisenhofen

Dinatriumdiamintetraacetat Gibco BRL, Eggenstein

1,4-Dithiothreitol (DTT) Biomol, Hamburg

EDTA –Na2 x H2O (Titriplex) Merck, Darmstadt

Ethanol Merck, Darmstadt

Ethidiumbromid Serva, Heidelberg

Ficoll Sigma, Deisenhofen

Formamid Fluka, Neu - Ulm

Formaldehyd Merck, Darmstadt

Gelatine Serva, Heidelberg

Glukose Merck, Darmstadt

Glycerol Serva, Heidelberg

Isopropanol Merck, Darmstadt

Kaliumacetat Merck, Darmstadt

Luria Broth Base Gibco BRL, Eggenstein

2 – Mercaptoethanol Sigma, Deisenhofen

Methanol Fluka, Neu - Ulm


Magnesiumacetat Merck, Darmstadt

Morpholinpropansulfonsäure (MOPS) Merck, Darmstadt

Mowiol Calbiochem, La Jolla/USA

Natriumacetat Merck, Darmstadt

Natriumcitrat Merck, Darmstadt

Natriumchlorid Merck, Darmstadt

Natriumhydrogenphosphat Merck, Darmstadt

Natriumhydroxid Merck, Darmstadt

Paraformaldehyd ICN Biomedicals, Ohio/USA

Salzsäure HCl Merck, Darmstadt

Sephadex G-50 Pharmacia, Freiburg

Sodiumdodecylsulfat Sigma, Deisenhofen

Tri Pure Isolation Reagent Boehringer, Mannheim

Tris Base Merck, Darmstadt

Tris-Acetat Sigma, Deisenhofen

Triton Sigma, Deisenhofen

Tween 20 Merck, Darmstadt

Xylencyanol Sigma, Deisenhofen

3.1.4 Enzyme

Klenow-Enzym Calbiochem, LaJolla/USA

Restriktionsendonukleasen New England Biolabs, Frankfurt

Ribonuclease A Roche, Mannheim

Ribonuclease H Gibco BRL, Eggenstein

Reverse Transkriptase Gibco BRL, Eggenstein

E. coli DNA Polymerase Gibco BRL, Eggenstein

E. coli DNA Ligase Gibco BRL, Eggenstein

Taq-DNA Polymerase Perkin Elmer, Weiterstadt

3.1.5 Antibiotika

Ampicillin, Na-Salz Merck, Darmstadt

Penicillin/Streptomycin Gibco BRL, Eggenstein


3.1.6 Standards

1 kb-, 100bp-DNA-Leiter Gibco BRL, Eggenstein

Heringspermien-DNA Promega, Madison/USA

Lachsspermien-DNA Sigma, Münche

oligo p (dT) Primer Gibco BRL, Eggenstein

dNTPs 10mM Perkin Elmer,Weiterstadt

Bio-11-CTP 10mM Enzo Diagnostics Inc., Farmindale

Bio-16-UTP 10mM Enzo Diagnostics Inc., Farmindale

X-Gal Sigma, Deisenhofen

IPTG Sigma, Deisenhofen

Random-Primer Amersham, Braunschweig

3.1.7 Kits zur Bearbeitung von DNA und Protein

Ambion MEGA Script System Ambion Inc., Austin, Texas

GeneAmpRPCR Reagent Kit Perkin Elmer Cetus, Norwalk/USA

Qiagen Gel Extraction Kit Qiagen, Hilden

Qiagen Maxi Prep Kit Qiagen, Hilden

Qiagen Mini Prep Kit Qiagen, Hilden

Qiagen RNeasy Kit Qiagen, Hilden

Superskript Choice System Gibco BRL, Eggenstein

3.1.8 Radioaktive Substanzen

α-32P-dCTP Amersham, Braunschweig

3.1.9 Antikörper

PBX1 Santa Cruz, Heidelberg

β-Tubulin TUJI HISS Diagnostics GmbH, Freiburg

FITCm Dianova, Hamburg

Cy5 Dianova, Hamburg

ERK1 Dianova, Hamburg

3.1.10 Medien, Medienzusätze und gepufferte Salzlösungen

Knock-out-DMEM

(Dulbecco’s Modified Eagle Medium) Gibco BRL, Eggenstein


Knock-out-Serum Gibco BRL, Eggenstein

DMSO Roth, Karlsruhe

Fötales Kälberserum (FCS), steril Gibco BRL, Eggenstein

L-Glutamin, 200 mM , steril G Gibco BRL, Eggenstein

LIF Esgro, steril Chemicon, Temecula/USA

ß-Mercaptoethanol, steril Gibco BRL, Eggenstein

nicht-essentielle Aminosäuren, steril Gibco BRL, Eggenstein

PBS, Dulbecco´s (w/o Ca, Mg), steril Gibco BRL, Eggenstein

Penicillin/ Streptomycin, 200 x Gibco BRL, Eggenstein

Trypsin/EDTA, 0.5 g/l, steril Gibco BRL, Eggenstein

3.1.11 Medien für das Arbeiten mit embryonalen Stammzellen

3.1.11.1 Medium zur Kultivierung embryonaler Stammzellen

500 ml Knock-out-DMEM

80 ml Serum (statt FCS)

5 ml P/S

10 ml Glutamin

5 ml nicht-essentielle Aminosäuren

0,5 ml β-mercaptoethanol

0,5 ml LIF

3.1.11.2 Medium zur Differenzierung embryonaler Stammzellen

500 ml Knock-out-DMEM

5 ml FCS

5 ml P/S

10 ml Glutamin

5 ml nicht-essentielle Aminosäuren

50 µl ATRA in 50 ml Medium (Falcon)

3.1.11.3 Medium zum Einfrieren embryonaler Stammzellen

40 ml Knock-out-Serum

10 ml DMSO

0.5 ml Zellen + Medium + 0.5 ml Einfrierlösun in ein steriles Einfrierröhrchen

geben


3.1.12 Stamm-und Standardlösungen

5 x TBE: 54 g Tris Base

27,5 g Borsäure

5 ml 0,5 M EDTA

wurden in 1 l H2O gelöst.

20 x SSC: 175,3 g NaCl

88,2 g Na-Citrat

wurden in H2O bidest. gelöst , der pH- Wert auf 7,0

eingestellt und das Volumen auf 1 l aufgefüllt.

20% SDS: 20 g Natriumdodecylsulfat

wurden in 100 ml H2O bidest. bei 65 °C gelöst und

sterilfiltriert.

0.5 M EDTA: 181,1 g Dinatriumdiamintetraacetat x 2 H2O wurden in 800

ml H2O bidest. gelöst, der pH-Wert mit konzentrierter

Natronlauge auf 8,0 eingestellt, das Volumen auf 1 l

aufgefüllt und autoklaviert.

1 M Tris HCl: 121,1 g Tris

wurden in 800 ml H2O bidest. gelöst , der pH-Wert mit

konzentrierter HCl auf den gewünschten Wert zwischen 7,2

und 9,0 eingestellt und das Volumen auf 1 l aufgefüllt und

autoklaviert.

10 x TE: 100 mM Tris HCl (pH 7,6)

10 mM EDTA

20 x MOPS 12 g MOPS

4,1 g Na-Acetat

8,7 g EDTA


wurde in 500 ml H2O gelöst und mit NaOH auf pH 7

eingestellt.

Mowiol 2,4 g Mowiol

6,0 g Glycerol

6 ml aqua dest

Ein Magnetrührer wurde 1 h lang eingesetzt 12 ml 0,2 M

Tris-HCl, pH 8,5 wurde im Wasserbad (50 °C) inkubiert und

gelegentlich umgerührt. Der Ansatz wurde bei 5000 g 15 min

lang zentrifugiert, anschließend aliquotiert und im Kühlfach (-

20 °C) aufbewahrt.

3.1.13 Bakterien

E. coli TOP10F' F{lacIqTn10(TetR)}mcrA∆(mrrhsdRMSmcrBC)Φ80lacZ∆M15

∆lacX74 recA1 deoR araD139∆(ara-leu)7696 galU galK rpsL

(StrR) endA1 nupG Invitrogen

3.1.14 Medien zur Anzucht von Bakterien

LB-Medium: 10 g Bacto-Trypton

5 g Bacto-Hefe-Extract

8 g NaCl

wurden in 800 ml dH2O gelöst , mit 1 M NaOH auf pH 7,5

eingestellt und autoklaviert. Das LB-Medium wurde bei 4 °C

gelagert.

LB-Agarplatten: 15 g Agar pro Liter noch nicht autoklaviertes LB-Medium

Die Lösung wurde dann autoklaviert, nach Abkühlen auf

etwa 45 °C das jeweils benötigte Antibiotikum in der

erforderlichen Konzentration hinzugefügt und auf der

Sterilbank in Petrischalen gegossen. Nach Erstarren wurden

die Platten in 4 °C gelagert.


3.1.15 Oligonukleotide

Es wurden verschiedene Oligonukleotide als Primer für PCR verwendet. Diese

wurden nach Sequenzvorgabe von Dr. Igloi (Biologische Fakultät der

Universität Freiburg) synthetisiert und von ihm erworben.

3.1.15.1 RT-PCR Primer

Plus-Primer 5` 3` Minus-Primer 5` 3` Aktin GGCACCACACCTTCTACAATGAGC TGTAGCCACGCTCGGTCAGGAT

BMP4 AACTTTCGATGTGAGCCCTG

TGGTTGGTTGAGTTGAGGTG

FGF15 CAGAACTGAGAGCCAGGAGC

GCAAGCCAGAAGGTATGAAGT

GFAP TCGGAGTTGAAAGTTACAGG

AGGATGGTTGTGGATTCTTC

N-CAM CTGTGCGAGTTTCTACTACAGG

CATCCTCATTGAACTGGACG

Nestin GGAGAGTCGCTTAGAGGTGC TCAGGAAAGCCAAGAGAAGC

OTX1 GCTGTTCGCAAAGACTCGCTAC

ATGGCTCTGGCACTGATACGGATG

OTX2 CCATGACCTATACTCAGGCTTCAGG

GAAGCTCCATATCCCTGGGTGGAAAG

PAX6 ACGTACAGTGCTTTGCCACCCA

CCGCCATTTCTCTTTCTTTCCTGA

PBX1 5` GGTCGAAGCAATCAGCAAACACAA

GCACCTTTAGAAGCCCAGTTATGG

PBX1 3´ GATGCAGCTGAAACAGAG

ACCGGATTCGCTTATTTCCA

WNT1 ACCTGTTGACGGATTCCAAG

TCATGAGGAAGCGTAGGTCC

3.1.16 Primer für die Northern Blot Analyse

Plus-Primer 5` 3` Minus-Primer 5` 3` OCT3/4 ATTCTGATGTCTGGTCCTTCG CAGAGGCCCATGTCAGTTAAG

IGF1R ATTCTGATGTCTGGTCCTTCG CAGAGGCCCATGTCAGTTAAG

IGF1 CTACCAAAATGACCGCACCTGC GGGGAAATGCCCATCTTTGTAATG

IGF2R AGCTCGATGATGCGTCTGTC GAAAAGAATCCACAGCCAGTG

IGF2 TGTGCTGCATCGCTGCTTAC GGACATCTCCGAAGAGGCTC

H19 CAGGTATCGGACTCCAGAGGGATT GGTGGGTGCTATGAGTCTGCTCTT

Colipase CTTCCAGCTTCCATCCACCC CCAGCTAACTGCGTGATCTC

Aktin GGCACCACACCTTCTACAATGAGC GTAGCCACGCTCGGTCAGGAT


3.2 Methoden

3.2.1 Methoden zur Arbeit mit eukaryoten Zellen

Die Arbeit mit eukaryoten Zellen erfolgte in einem Zellkulturlabor. Es wurde

unter einem sterilen Abzug gearbeitet und nur steril verpackte Plastikware

genutzt. Es wurden stets Handschuhe und Labormäntel getragen, um die

Wahrscheinlichkeit von Kontaminationen so gering wie möglich zu halten. Die

Zellen wurden in wassergesättigter Atmosphäre unter 5% CO2 bei 37 °C

kultiviert. Medien und Lösungen wurden bei –20 °C bzw. 4 °C aufbewahrt und

vor Gebrauch auf 37 °C vorgewärmt.

3.2.1.1 Kultivierung embryonaler Stammzellen

Durch Verwendung des Cre-lox system wurden Einzel– und Doppelallel Knock-

out-ES-Zellen muriner embryonaler Stammzellen erzeugt. Die PBX1(+/-)- und

PBX1(-/-)-ES-Zellen wurden von M. Kolanczyk hergestellt. Der

Herstellungsprozess wird im Anhang (Kap. 8-1) erläutert.

Die ES-Zellen verschiedenen Genotyps wurden jeweils in mit 0,1% Gelatine

beschichtete Gewebekulturflaschen kultiviert. Als Medium wurde

standardisiertes Knock-out-DMEM verwendet, und jeweils 500 ml davon mit 80

ml Knock-out-Serum, 5 ml Penicillin/Streptomycin, 10 ml 200 mM Glutamin, 5

ml nicht-essentielle Aminosäuren, 0,5 ml β-Mercaptoethanol und 0,5 ml

Leukemia inhibitory factor (LIF) ergänzt. Das Medium wurde nach Zubereitung

in 4 °C aufbewahrt und kurz vor Gebrauch auf 37 °C aufgewärmt.

ES-Zellen können undifferenziert gehalten werden, indem sie auf Ammenzellen

oder in mit 0,1% Gelatine beschichtete Gewebekulturflaschen unter Zusatz von

LIF kultiviert werden. Die ES-Zellen wurden regelmäßig mit PBS ohne Ca2+ und

Mg2+ gewaschen und mit Trypsin von der gelatinierten Gewebekulturplatte

gelöst. Die Zellmorphologie wurde immer unter dem Mikroskop beobachtet, das

Medium regelmäßig gewechselt und abhängig von der Wachstumsrate

gesplittet. Bei regulären Passagen wurden die ES-Zellen zweimal durch Zugabe

von PBS-Puffer gewaschen und anschließend nach Trypsinierung 1:3 bis 1:6

geteilt. Vor der erneuten Plattierung wurde die Trypsinlösung durch


Zentrifugation bei 1200 U/min entfernt. Bei jeder Passage wurde ein Teil der

ES-Zellen in flüssigem Stickstoff kryokonserviert.

3.2.1.2 Gelatinisieren von Zellkulturflaschen bzw. -platten

Gelatine-Lösung: 0,1 g zellkulturgetestete Gelatine wurde in 100 ml PBS

durch Aufkochen und Mischen gelöst und anschließend auf

der Sterilbank durch einen 0,22 µm-Filter sterilfiltriert.

Die Böden der Zellkulturflaschen wurden für 10 min mit 0,1% Gelatine-Lösung

beschichtet. Die Gelatine wurde schließlich abgesaugt und nach mindestens 10

min Trocknen konnten die Zellkulturflaschen mit Zellen beschichtet werden.

3.2.1.3 Trypsinieren von Zellen

Das Medium wurde von der Zellkulturflasche abpipettiert und die Zellen 1 x mit

PBS gewaschen. Danach wurden die Zellen für ca. 5 min mit Trypsin/EDTA bis

zur Abrundung (mikroskopische Kontrolle) bzw. nach leichtem Klopfen

makroskopisch sichtbaren Ablösung bei 37 °C, 5% CO2 inkubiert. Die

Trypsinierung wurde durch Zugabe von Medium gestoppt, die Zellen durch Auf-

und Abpipettieren vereinzelt und in einem Falconröhrchen abzentrifugiert (1200

rpm, 5 min). Nun wurden die Zellen entweder in serumhaltigem Medium

resuspendiert und in der gewünschten Dichte ausplattiert oder zur weiteren

Verarbeitung (z.B. RNA-Isolierung) 1 x mit PBS gewaschen.

3.2.1.4 Einfrieren von Zellen

Einfriermedium: 50% ES-Zellmedium

40% Knock-out-Serum

10% DMSO

Die Zellen wurden trypsiniert und anschließend in ES-Zellmedium

aufgenommen. Nach dem Abzentrifugieren (5 min, 1200 rpm) und Absaugen

des Überstandes wurde das Zellpellet in 500 µl kaltem ES-Zellmedium

resuspendiert. In Kryoröhrchen wurden 500 µl kaltes Einfriermedium vorgelegt,

anschließend die Zellsuspension zügig hinzugemischt und mit Hilfe einer

Styropor-Ummantelung langsam auf –70 °C abgekühlt. Die Lagerung erfolgte

nach 18 – 24 h in flüssigem Stickstoff.


3.2.1.5 Auftauen und Revitalisieren von Zellen

Ein Kryoröhrchen wurde nach der Entnahme aus dem Stickstofftank für etwa 1

min im 37 °C-Wasserbad gehalten und unter Schwenken aufgetaut. Die

Zellsuspension wurde dann sofort in 6 ml Medium überführt, gemischt und bei

1200 rpm für 5 min zentrifugiert. Der Überstand wurde abgesaugt und das

Pellet in Medium resuspendiert.

3.2.1.6 ES-Zelldifferenzierung

ES-Zellen differenzieren bei ausreichender Dichte und dem Entzug von

Leukemia Inhibitory Faktor (LIF) und Feederzellen spontan in verschiedene

Zelltypen aller drei Keimblätter, wie z.B. Blut-, Endothel-, Skelettmuskel- und

Herzmuskelzellen. Diese Eigenschaft kann benutzt werden, um die Expression

bestimmter Gene während dieses Differenzierungsprozesses zu studieren.

In der vorliegenden Arbeit wurden PBX1-K.O.-ES-Zellen und WT-ES-Zellen in

vitro differenziert, um die Expression der Gene zu analysieren, die durch die

funktionelle PBX1-Elimination unterschiedlich reguliert werden. Es wurden die

Protokolle aus Bain et al. (Bain et al., 1995) und Gajovic et al. (Gajovic et al.,

1997) zugrundegelegt und modifiziert. Für die Induktion der Differenzierung

wurden die ES-Zellen 8 Tage lang auf Petrischalen in Suspension gehalten, um

die Bildung von Zellaggregaten zu fördern. Auf dem Boden dieser Petrischalen

sind ES-Zellen nicht in der Lage, sich anzuheften. Durch das E-Cadherin

Molekül, welches in der Zellmembran von ES-Zellen verankert ist, haben ES-

Zellen eine ausgeprägte Affinität zueinander und bilden spontan Aggregate, die

sogenannten Embryoidkörperchen. Sobald die Zellen auf den mit 0,1% Gelatine

überzogenen Gewebekulturflaschen (10 cm Durchmesser) eine bestimmte

Dichte erreicht hatten, wurden sie vorsichtig trypsiniert. Es war nicht möglich,

die Zellen in diesem Stadium zu zählen. Hätten wir sie noch stärker dissoziiert,

um einzelne Zellen zu erhalten, wäre die Fähigkeit, Aggregate zu bilden

verloren gegangen. Sie wurden auf eine Petrischale (14 cm Durchmesser) in

Knock-out-DMEM transferiert, das mit 1% FCS anstatt Serum, kein LIF und kein

β-Mercaptoethanol enthielt. Als FCS Konzentration wurde zunächst 10%

gewählt. Da jedoch mit 1% FCS bessere Ergebnisse erzielt wurden, wurde ein

Differenzierungsmedium mit 1% FCS verwendet (Kap. 4.1.2).


Nach 4 Tagen wurde das Medium gewechselt und zusätzlich 100 nM all-trans

Retinsäure (ATRA) beigefügt. Nur bei einer Kontrollgruppe wurde kein ATRA

hinzugefügt. Die Anzahl der Tage in Suspension entsprechend 4-/4- und 4-/4+

stammt aus dem Protokoll von Bain et al. (Bain et al., 1995). Die Konzentration

an ATRA wurde aufgrund der von Gajovic et al. beschriebenen Ergebnisse

gewählt (Gajovic et al., 1997).

Nach der 8 tägigen Induktionsperiode (4-/4+ bzw. 4-/4-) in der Petrischale,

wurden die Zellen auf je zwei 0,1% Gelatine überzogene Gewebekulturflaschen

(10 cm Durchmesser) und zwei mit 0,1% Gelatine überzogene Objektträger

transferiert, und für weitere 9 Tage kultiviert. Hier gingen sie spontan in den

Differenzierungsprozess über.

An zwei Kontrollpunkten (nach 3 und 9 Tagen) nach Zelladhäsion wurden die

Zellen morphologisch, molekularbiologisch und proteinchemisch analysiert.

3.2.2 Molekularbiologische Methoden

Alle folgende Methoden und Vorschriften wurden, soweit nicht anders

vorgegeben, dem Laborhandbuch „Molecular Cloning“ von Sambrock et al.

(1989) bzw. „Current Protocols in Molecular Biology“ von Ausubel et al. (1995)

entnommen.

3.2.2.1 RNA-Isolierung aus kultivierten Zellen

Die für die Präparation verwandten Chemikalien wurden ausschließlich für

diesen Zweck verwendet. Als Lösungsmittel wurde steriles pyrogenfreies

Wasser verwendet. Alle Präparationsschritte wurden auf Eis durchgeführt. Die

RNA-Isolierung wurde nach dem vom Boehringer Mannheim gestellten

Protokoll durchgeführt. Mit Hilfe des TriPure Isolation Reagent (Boehringen-

Mannheim) konnten RNA, DNA und Protein von der gleichen Probe gewonnen

werden. Die Methode basiert auf Flüssigkeitsphasentrennung. TriPure Isolation

Reagent enthielt Phenol und Guanidin Thiocyanat. Während der

Homogenisierung mit der Probe lysierte es die Zellen und denaturierte

endogene Nuklease.

Die Zellen aus einer 160 ml Zellkulturflasche wurden zweimal jeweils mit 1x

PBS gewaschen und anschließend wurden 3-4 ml TriPure Isolation Reagent

Medium dazugegeben und solange mit der Pipette auf- und abgezogen, bis alle


Zellen von der Oberfläche gelöst waren. Jeweils 1 ml wurde in ein 1,5 ml

Eppendorf Reaktionsgefäß überführt und 5 min inkubiert.

Nach Zugabe von 200 µl Chloroform wurde 15 sec gründlich durch Vortexen

gemischt und bei Raumtemperatur (RT) 15 min lang inkubiert. Nach

Zentrifugation (15 min, 14000 rpm, 4 °C) wurden drei Phasen: eine klare obere

Phase (für RNA-Isolierung), eine weiße Interphase und eine rote organische

untere Phase (für DNA- und Protein-Isolierung) erzeugt. Die obere Phase

wurde von den anderen beiden Phasen separiert und in ein neues 1,5 ml

Eppendorf Reaktionsgefäß überführt, mit 0,5 ml Isopropanol versehen und

durch Vortexen gemischt. Nach 10 min Inkubation bei RT wurde die DNA durch

Zentrifugation (10 min, 13000 rpm, 4 °C) pelletiert und der Überstand

verworfen. Das Pellet wurde in 1 ml 75% Ethanol resuspendiert. Nach

Zentrifugation (5 min, 8000 rpm, 4 °C) wurde Ethanol vorsichtig abpipettiert und

das Pellet luftgetrocknet. Das Pellet wurde in 20 µl aqua dest. dilutiert und bei –

80 °C gelagert. Anschließend stand die RNA zur weiteren Verarbeitung zur

Verfügung.

3.2.2.2 Konzentrationsbestimmung von cDNA- bzw. RNA-Lösung

Die photometrische Messung zur Quantifizierung und Reinheitsbestimmung der

DNA und RNA erfolgte bei einer Wellenlänge von 260 nm und 280 nm gegen

TE oder H2O in einer Quarzküvette.

3.2.2.3 Aufreinigung der präparierten gesamt RNA mittels RNAeasy

Das Volumen der gesamt RNA-Probe wurde mit RNase-freien Wasser auf 100

µl eingestellt, 350 µl Puffer RLT wurden zugegeben und der Ansatz wurde

kräftig geschüttelt. Nach Zugabe von 250 µl 100% Ethanol wurde das Lysat

gründlich mit der Pipette gemischt.

Eine RNeasy Minisäule wurde auf ein Sammelgefäß gesetzt und die Probe (700

µl) wurde auf die Minisäule gegeben und für 15 sec bei 10000 g bei RT

zentrifugiert. Der Durchfluss wurde verworfen. Die Minisäule wurde auf ein

neues Sammelgefäß transferiert. Nach Zugabe von 500 µl Puffer RPE und

Zentrifugation für 15 sec bei 10000 g wurde der Durchfluss nochmals verworfen

und der Waschvorgang wiederholt. Nach Transfer der Minisäule auf ein frisches

1,5 ml Eppendorf-Gefäß und nach Zugabe von 25 µl RNase-freiem Wasser


exakt auf die Membran der Minisäule wurde bei RT 5 min inkubiert und 2 min

bei max. Geschwindigkeit zentrifugiert. Dieser Elutionsschritt wurde wiederholt.

Das Eluat (ca. 50 µl) wurde mittels Vortexen gründlich gemischt.

Es folgte die Quantifizierung und Qualitätskontrolle, dazu wurde 1 µl Probe + 49

µl H2O und 1 µl Probe auf 1% Agarosegel gegeben und analysiert.

3.2.2.4 cDNA-Synthese

Um RNA in cDNA umzuwandeln, wurde das Superskript Choice System

verwendet.

Erststrangsynthese

10 µg/µl Gesamt-RNA wurden in Gegenwart von 1 µl oligo p(dT)15-Primer für

10 min bei 70 °C inkubiert und anschließend auf Eis abgekühlt. Hierbei

hybridisiert der Primer an die poly(A)-Schwänze der mRNA.

4 µl First Strand Buffer (250 mM Tris-HCl, pH 8,3 bei RT; 375 mM KCl; 15 mM

MgCl2), 2 µl 0,1 M DTT und 1 µl 10 mM dNTPs wurden in ein 0,5 ml Eppendorf

Reaktionsgefäß gegeben und für 2 min bei 42 °C inkubiert. Die cDNA-

Erstrangsynthese wurde durch Zugabe von 2 µl (200 U) Superscipt II (RNase H

(-) -Reverse-Transkriptase) und Inkubation 50 min bei 42 °C durchgeführt.

RTase synthetisiert mit den vier dNTPs eine Kopie der mRNA: es entsteht so

ein cDNA-mRNA-Hybrid.

Zweitstrangsynthese

In jede Erststrangsynthese-Reaktion (20 µl) wurden 130 µl 2nd- Strand Master

Mix (5 x 2nd-Strand Buffer, 10 mM dNTP, 10 U/µl E. coli DNA-Ligase, 10 U/µl

E. coli-DNA-Polymerase, 2 U/µl RNase H, H2O) gegeben und für 2 h bei 16 °C

inkubiert. Durch Zugabe von 10 µl 0,5 M EDTA wurde die Reaktion beendet.

Dann wurde die RNA durch RNase verdaut, und die einzelsträngige cDNA mit

Hilfe der DNA-Polymerase in eine doppelsträngige cDNA umgewandelt.

3.2.2.5 In-vitro-Transkription

Im nächsten Schritt wurde eine in-vitro-Transkription mit Hilfe des Ambion

MEGA Script Systems durchgeführt, wobei biotin-markierte cRNA hergestellt

wurde. 1,5 µl cDNA wurde mit 18,5 µl Master-Mix versehen (75 mM AmbT7

ATP, 75 mM AmbT7 GTP, 75 mM AmbT7 CTP, 75 mM AmbT7 UTP, 10 mM

Bio-11-CTP, 10 mM Bio-16-UTP l, 10 x T7 Buffer Mix, 10 x T7 Enzymmix) und


kurz zentrifugiert. Der Ansatz wurde für 6 h bei 37 °C inkubiert. Für die

Biotinmarkierung wurde Bio-11-CTP und Bio-16-UTP verwendet.

3.2.2.6 RT-PCR

Die Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) ist eine

empfindliche Methode zum Nachweis spezifischer mRNAs. Zunächst wurde die

mRNA von den undifferenzierten ES-Zellen und den mit ATRA und ohne ATRA

behandelten differenzierten Zellen an d3 und an d9 mittels des Superskript

Choice Systems in cDNA umgewandelt.

Es wurde die Erststrangsynthese durchgeführt (Kap. 3.2.2.4), und anschließend

wurde die Reaktion durch Erhitzen bei 70 °C für 15 min gestoppt. Danach

wurde 1 µl RNase H hinzugegeben und bei 37 °C für 20 min inkubiert, um die

RNA zu entfernen. Die cDNA wurde für die PCR eingesetzt .

Durch die PCR kann eine spezifische DNA-Sequenz millionenfach vermehrt

werden. Ausgehend von einer Matrize aus einzelsträngiger DNA synthetisieren

DNA-Polymerasen einen komplementären DNA-Strang. Als Startpunkt

benötigen DNA-Polymerasen einen doppelsträngigen DNA-Abschnitt. Dieser

Abschnitt kann dadurch erzeugt werden, dass Einzelstrang-DNA mit Primer

inkubiert wird. Ein PCR-Zyklus umfasst drei Schritte:

1. Denaturierung der dsDNA

2. Annealing der spezifischen Primer an die ssDNA

3. Extension der Primer mit Hilfe der Taq-Polymerase

Die PCR-Reaktionen wurden mit einem Thermocycler Gene Amp PCR 2400

durchgeführt. Soweit nicht anders erwähnt, wurden PCR-Reaktionen in einem

Gesamtvolumen von 50 µl in folgender Standardzusammensetzung

durchgeführt:

cDNA 25 – 50 ng

Primer: up- and downstream 25 pM

dNTPs (dATP, dGPT, dCTP, dTTP) 0,2 mM

Taq-Polymerase 1,25 U

PCR - Puffer 1 x

Mg2+ 1,5 mM

ddH2O


Die eingesetzte Menge an DNA war bei den verschiedenen PCR-Verfahren

unterschiedlich. Bei mehr als einer PCR-Reaktion mit identischen Primerpaaren

wurden grundsätzlich sogenannte Master-Mixe, bestehend aus den o.g.

Komponenten ohne DNA, hergestellt und diese dann zur DNA pipettiert.

Der PCR-Thermocycler wurde wie folgt programmiert:

Zyklen Temperatur Zeit

Vorabdenaturierung 1 96 °C 2 min

Denaturierung

Annealing

Extension

15 – 35

15 – 35

15 - 35

96 °C

46 – 56 °C

72 °C

20 sec

30 sec – 1min

1 min / 1 kb

Extension 1 72 °C 7 min

Kühlen 1 4 °C ∞

Die Dauer der Extensionsphase wurde je nach bp-Länge der zu

amplifizierenden Sequenz modifiziert. Es wurde pro kb 1 min berechnet. Nach

Beendigung der PCR wurden die Amplifikationsprodukte auf einem 1%

Agarosegel ausgewertet.

Primer Design

Der Design von Primerpaaren ist für PCR-Reaktionen von entscheidender

Bedeutung und wurde durch das Computerprogramm Vector NTI durchgeführt.

Alle Primer wurden in einem Servicelabor von Dr. Igloi (Biologische Fakultät der

Universität Freiburg) nach Sequenzvorgabe synthetisiert.

Semiquantitative PCR

Die semiquantitative PCR wurde verwendet, um indirekt RNA-Konzentrationen

eines Zelllysates zu bestimmen. Aktin, ein konstitutiv exprimiertes

Haushaltsgen, wurde hierbei als Standard benutzt. In einer ersten

Versuchsreihe wurde bestimmt, wie viele PCR-Zyklen durchgeführt werden

konnten, ehe das PCR-Fragment die logarithmische Amplifikationsphase

verließ. Die Intensität der amplifizierten DNA-Fragmente nahm bis zum

Verlassen dieser Phase zu. Anschließend konnten nun verschiedene Zelllysate

miteinander abgeglichen werden, indem jeweils nur so viel Zelllysat für die PCR

eingesetzt wurde, dass das Aktin in allen Reaktionen die gleiche

Bandenintensität erzielte. Die Intensität ließ sich mit dem bloßen Auge

abschätzen.


3.2.2.7 Verdauung von DNA mit Restriktionsendonukleasen

(Lehrach und Frischauf, 1982)

Die Aktivität von Restriktionsendonukleasen wird in Units (U) angegeben. Eine

Unit entspricht der Menge an Restriktionsenzym, die benötigt wird, um 1 µg

Lambda-DNA in einer Stunde vollständig zu schneiden.

Reaktionsansatz: x µg DNA

2 µl geeigneter 10 x Puffer (nach Angabe der Hersteller)

2 U Restriktionsendonuklease

20 µl H2O

Der Ansatz wurde 2 h bei 37 °C inkubiert und anschließend im Agarosegel

analysiert. Als Reaktionspuffer wurde das New England Biolabs (NEB) Puffer-

System verwendet. Diese Puffer werden vom Hersteller zusammen mit den

Enzymen geliefert.

3.2.2.8 Transformation von E. coli mit Plasmid- DNA

Es wurden 100 µl E. coli auf Eis aufgetaut. 1-2 µl DNA wurden (entsprechend

ca. 1 µg DNA) zugegeben, vorsichtig gerührt und 30 min auf Eis inkubiert. Der

Ansatz wurde für 2 min einem Hitzeschock von 42 °C im Wasserbad

unterzogen. Nach 2 min auf Eis wurden 250 µl SOC-Medium zugegeben und

für 1 h bei 37 °C im Schüttelinkubator bei 225 rpm inkubiert. Anschließend

wurden 20 µl und 200 µl auf LB-Agarplatten, die 200 µg/ml Ampicillin enthielten

und 30 min zuvor mit 40 µl IPTG (Isopropylthiogalactosid) und 40 µl X-Gal

behandelt wurden, ausgestrichen. Die Kultivierung erfolgte über Nacht bei 37

°C.

X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-ß-D-galactopyranosid) ist ein farbloses Substrat

der β-Galactosidase. E. coli synthetisiert das Enzym normalerweise, wenn es

Laktose verarbeitet, kann aber auch durch IPTG, ein Laktoseanalogon,

angeregt werden. Wird X-Gal gespalten, entsteht ein blaues Produkt, mit dem

sich die Expression von lacZ (β-Galactosidase) einfach nachweisen lässt.

Bakterien, die das Plasmid mit der zu klonierenden DNA-Sequenz tragen,

haben durch die Zerstörung des lac-Genes die Fähigkeit verloren, β-

Galaktosidase zu bilden. Sie erscheinen deshalb als weiße Kolonien. So

können bestimmte Klone selektioniert werden.


3.2.2.9 Isolierung von Plasmid-DNA (Qiagen-Methoden)

Mini-Präparation von Plasmid-DNA

5 ml LB-Medium mit 100 µg/ ml Ampicillin wurden mit einer transformierten E.

coli-Kolonie angeimpft und über Nacht im Schüttelinkubator (225 rpm) bei 37 °C

inkubiert. Die Bakteriensuspension wurde anschließend zentrifugiert (20 min, 4

°C, 3500 rpm), der Überstand verworfen, das Pellet in 250 µl P1-Puffer

(Resuspensionspuffer: 50 mM Tris Cl, pH 8,0, 10 mM EDTA, 100 µg/ml RNase

A) resuspendiert und 250 µl P2-Puffer (Lysepuffer: 200 mM, NaOH, 1% SDS)

hinzugegeben. Nach 5 min Lyse wurde diese durch Zugabe von 350 µl N3-

Puffer (Neutralisationspuffer: 3,0 M Kaliumazetat, pH 5,5) gestoppt.

Anschließend wurde für 10 min bei 14000 g zentrifugiert, der Überstand auf

eine Qiaprep spin Säule gegeben und diese 1 min bei 14000 g zentrifugiert. Die

DNA bindet dabei an die Silica Gel Membran der Säule. Sie wurde dann mit

0,75 ml PE-Puffer gewaschen, dieser 2 mal abzentrifugiert (jeweils 1 min,

14000 g), bevor die DNA mit 40 µl Wasser eluiert wurde. Die Lagerung erfolgte

in –20 °C.

Die Identität des Plasmids wurde durch Restriktionsverdau der Plasmid-DNA

überprüft.

Maxi-Präparation von Plasmid-DNA

250 ml LB-Medium mit 100 µg/ml Ampicillin wurden mit einer transformierten E.

coli Kolonie angeimpft und für 12 bis 16 h im Schüttelinkubator (225 rpm) bei 37

°C inkubiert. Die Bakteriensuspension wurde in 250 ml konische

Falconröhrchen umtransferiert. Nach Zentrifugation (20 min, 4 °C, 3500 rpm)

wurde der Überstand verworfen, das Pellet in 10 ml Puffer P1 resuspendiert

und in ein 50 ml Falconröhrchen überführt. Es wurden 10 ml Puffer P2

hinzugefügt, das Ganze durch vorsichtiges 4 bis 6 maliges Umkippen gemischt

und für 5 min bei RT inkubiert. 10 ml gekühlter Puffer P3 wurden zugegeben, es

wurde gemischt und für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. In der

Zwischenzeit wurde ein Qiagen-tip 500 mit 10 ml QBT- Puffers (750 mM NaCl,

50 mM MOPS, pH 7,0, 15% Isopropanol, 0,15% Triton X-100) äquilibriert.

Anschließend wurde der Überstand im Falconröhrchen auf die Qiagensäule

gegeben, nach Durchlaufen die Säule zweimal mit 10 ml QC-Puffer (1,0 M

NaCl, 50 mM MOPS: pH 7.0, 15% Isopropanol) gewaschen und die DNA mit 10


ml QF-Puffer (1,25 M NaCl, 50 mM Tris Cl, pH 8,5, 15% Isopropanol) eluiert.

Dem aufgefangenenen Eluat wurde zur DNA-Präzipitation 10,5 ml Isopropanol

hinzugegeben, es wurde gemischt und für 2 h bei 4 °C, 4000 rpm zentrifugiert.

Der Überstand wurde abgegossen, das DNA-Pellet in 10 ml 70% Ethanol

resuspendiert und für 15 min bei 4 °C, 4000 rpm zentrifugiert. Das

luftgetrocknete Pellet wurde in 200 - 400 µl TE-Puffer aufgenommen. Durch

Restriktionsverdau wurde die Identität der Plasmid-DNA überprüft.

3.2.2.10 Gelelektrophorese zur Auftrennung von DNA und RNA–Fragmenten

Agarosegel – Elektrophorese

Zur Auftrennung von DNA–Fragmenten unterschiedlicher Größe wurden

Agarosegele verwendet. Je nach Größe der zu trennenden Fragmente wurden

unterschiedliche Agarose-Konzentrationen verwendet (meist 1% Agarose).

2g Agarose wurden abgewogen, 200 ml TBE-Puffer, hinzugegeben und im

Mikrowellenherd aufgekocht bis die Agarose vollständig aufgelöst war. Nach

Abkühlen auf unter 55 °C wurde 20 µl Ethidiumbromid hinzugefügt, das Gel in

eine zuvor vorbereitete Gelform mit Kamm gegossen und bei RT abgekühlt.

Nach Erstarren des Gels wurde der Kamm und die Gelform entfernt und das

Gel in die mit TBE-Puffer gefüllte Elektrophoreseskammer eingebaut. Die

Proben wurden zusammen mit DNA–Ladepuffer (0,25% Bromophenolblau,

0.25% Xylencyanol, 30% Glycerol in H2O) in die durch den Kamm vorgeformten

Geltaschen pipettiert. Die Elektrophorese wurde unter einer Spannung von 3-4

V/cm2 durchgeführt. Die negativ geladenen DNA-Moleküle wandern zum

positiven Pol. Die Geschwindigkeit hängt von ihrer Größe und Konformation ab.

Durch den mit der DNA interkalierenden Fluoreszenzfarbstoff Ethidiumbromid

wurden die DNA-Fragmente unter UV-Licht als Banden sichtbar. Zur

Dokumentation wurden die Agarosegele auf dem UV-Transilluminator mittels

eines Video Copy Processors aufgenommen und über ein Thermoprinter ein

Ausdruck des Bildes erstellt.

Agarose- Formaldehyd-Gele zur Auftrennung von RNA

Die Gelkammer wurde zunächst über Nacht mit NaOH gefüllt. 1% Agarose

wurde in Laufpuffer (Laufpuffer: 20 mM MOPS; 5 mM Na-Acetat; 1 mM EDTA;

in H2O mit 2 N NaOH auf pH 7,0 eingestellt) aufgekocht, auf ca. 55 °C


abgekühlt, mit Ethidiumbromid und Formaldehyd (0,65%) versetzt und in den

vorbereiteten RNase-freien Gelträger gegossen.

Die RNA-Proben wurden mit 25 – 30 µl RNA-Ladepuffer (10 ml Formamid, 3,5

ml Formaldehyd 37%, 1 ml 20 x MOPS, 0,2 g Ficoll, 20 ml H20, Bromophenol

blau Pulver) versetzt, für 5 min auf 65 °C erhitzt und kurz auf 4 °C abgekühlt.

Die Elektrophorese wurde unter einer Spannung von 3-4 V/cm2 durchgeführt.

3.2.2.11 Isolierung von DNA–Fragmenten aus Agarosegelen

Die DNA wurde mittels des Qiaquick Gel Extraction Kits isoliert. Die

gewünschte DNA–Bande wurde unter UV – Licht (λ = 312 nm, UV–Handlampe)

mit einem sterilen Skalpell aus dem Agarosegel ausgeschnitten und in ein 1,5

ml Reaktionsgefäß überführt. Die Extraktion und Aufreinigung erfolgte unter

Verwendung des Protokolls für den Quiagen Gel Extraction Kit. 1 Vol. Gel

wurde mit 3 Vol. Solubilisierungspuffer QG versetzt und für 10 min inkubiert, bis

das Gel vollständig aufgelöst war. Nach Gabe von 1 Vol. Isopropanol, wurde die

Lösung auf eine Säule aufgetragen und für 1 min bei 15000 rpm in der

Minizentrifuge zentrifugiert. Die nun an die Säule gebundene DNA wurde mit

Waschpuffer (PE-Puffer mit Ethanol) gewaschen. Anschließend wurde 50 µl EB

Buffer (10 mM Tris-Cl, pH 8,5) auf die Membran platziert, ca. 1 min bei RT

inkubiert und schliesslich die DNA in einem letzten Zentrifugationsschritt eluiert.

3.2.2.12 Northern-Blot

Ein Restriktionsfragment mit einer bestimmten Basensequenz kann durch die

Hybridisierung der im Gel aufgetrennten und auf einen Filter übertragenen RNA

mit einer radioaktiv-markierten, komplementären RNA-Sonde detektiert werden

(Northern Blot). Die Sonden wurden RT-PCR basiert selber hergestellt. Die

dazu verwendeten Primer sind in Kap. 3.1.16 aufgelistet.

Markierung von DNA mit α³²P-dCTP

Die Proben wurden mittels RT-PCR gewonnen. Zur radioaktiven Markierung

von doppelsträngiger DNA wurde das Megaprime DNA Labeling System von

Amersham Pharmacia Biotech verwendet. Es wurden 5 µl DNA-Fragment (in

dH2O mit einer Konzentration von 0,5 – 1,0 µg/µl) mit 5 µl Random-Primer für 5

min aufgekocht (95 °C – 100 °C Heizblock) und kurz zentrifugiert. Danach

wurden 10 µl Labelling-Puffer (dNTP, Tris pH 7,8, MgCl2, β-Mercaptoethanol),


23 µl H2O, 2 µl Klenow-Enzym (1 U/µl) und 5 µl α-32P-dCTP (50 µCi)

hinzugeben. Der Ansatz wurde für 10 min bei 37 °C inkubiert. Sephadex G-50

(5 g Sephadex G –50 wurden in 50 ml TE aufgeschwemmt und autoklaviert)

wurde zur Abtrennung der radioaktiv markierten DNA–Fragmente von nicht

inkorporierten Nukleotiden eingesetzt. Eine sterile Einmalinsulinspritze wurde

mit einem Stopfen aus silanisierter Glaswolle am unteren Ende verschlossen

und mit Sephadex G-50 gefüllt. Die Spitze der Spritze wurde in ein 1,5 ml

Eppendorfreaktionsgefäß gestellt, in einem 15 ml Falconröhrchen 5 min bei

2500 rpm zentrifugiert und das Eluat verworfen. Der Ansatz wurde auf diese

Sephadex-G-50-Säule gegeben und zentrifugiert (2500 rpm, 5 min). Der

abzentrifugierte Ansatz wurde in ein Eppendorfgefäß überführt, für 5 min bei 95

°C - 100 °C inkubiert und danach für 5 min auf Eis gestellt. Die Radioaktivität

der Probe wurde vor Inkubation mit dem Hybond N-Filter im Scotlab easicount

(β-Counter) gemessen und lag bei ca. 10 - 100 kcpm/µl.

Transfer von RNA auf Hybond N-Filter Die RNA wurde nach ihrer Länge mittels eines formaldehydhaltigen

Agarosegels aufgetrennt. Das Formaldehyd denaturiert die RNA und verhindert

damit Basenpaarungen. Die RNA wurde von dem Gel mittels Kapillarblotting auf

eine Membran transferiert (Abb. 3-1).

Abb. 3-1: Blot-Aubau:

• Transfer-Puffer = 10 x SSC

• Basis-Block = Schwamm

• Filterpapier = 3 Schichten MM-Whatmannpapier

• Gel = Agarosegel mit aufgetrennter DNA

• Membran = Hybond N+Filter

• Gewiht = 300 bis 500 g Bleigewicht

(aus Nicholl, 1995)


Der Transfer der RNA auf den Filter erfolgte über Nacht. Der Filter wurde

anschließend für 5 min in 2 x SSC gewaschen. Die RNA-Seite des Filters wurde

markiert und nach 10 min Trocknen des Filters bei RT wurde durch UV-

Bestrahlung (20 sec) der RNA-Seite auf dem UV-Transluminator die RNA auf

die Filteroberfläche fixiert („cross-link“).

Hybridisierung der Hybond N+-Filter mit radioaktiv markierten DNA-

Sonden

Der Filter mit fixierter DNA wurde zunächst 5 min in 2 x SSC gewaschen und

vorsichtig in eine Glasröhre gerollt. Nun wurden 10 ml Church Puffer (0,5 M

Natriumhydrogenphosphat, pH 7,4, BSA, 1% SDS, 7% EDTA pH 8,0, 0,1

mg/ml, 65 °C ) und 100 µl Lachsspermien-DNA (zuvor in für 5 min in 100 °C

denaturiert) hinzugeben und schließlich für 30 min im Rotationsofen bei 65 °C

vorhybridisiert. Nachfolgend wurde das radioaktiv-markierte Oligonukleotid in

den Church Puffer gegeben und über Nacht im 65 °C Rotationsofen inkubiert.

Der Filter wurde dann 2 x 5 min mit LSW-Puffer (20 ml 20 x SSC, 2,5 ml 10%

SDS / 500 ml H2O) und anschließend 2 x 20 min mit zuvor auf 65 °C erwärmten

HSW-Puffer (2,5 ml 20 x SSC, 5,0 ml 10% SDS/500 ml H2O) im 65 °C

Rotationsofen gewaschen. Der Filter wurde feucht in Plastikfolie verpackt und in

einer Filmkassette bei –80 °C mit einem Kodak X-OMAT AR-Röntgenfilm

autoradiographiert.

3.2.2.13 Genexpressionsanalyse

Ein DNA-Mikroarray ('Chip') besteht aus Oligonukleotiden, die in höchster

Dichte auf einem Objektträger aufgebracht und fixiert werden. Die RNA der

verschiedenen Zelllinien werden mit den Arrays hybridisiert. Zueinander

komplementäre Nukleotidstränge gehen eine stabile nicht-kovalente

Wechselwirkung ein und können nachfolgend detektiert werden. Die

abschließende Auswertung der Expressionsdaten erfolgt durch den Einsatz

spezifischer Software (Mikroarray Suite Software 5.0) (Sherlock, 2000).

Mikroarray Chips wurden mit der RNA von den WT-ES-Zellen und PBX1(-/-)-

ES-Zellen im undifferenzierten und differenzierten Stadium hybridisiert.

Zusätzlich wurde noch ein zweiter PBX1(-/-)-Klon nach der Differenzierung

hybridisiert. Die zu untersuchende RNA wird in cDNA umgeschrieben und in

einer nachfolgenden in-vitro-Transkription amplifiziert. Dabei werden von der


T7-RNA-Polymerase biotinylierte Ribonukleotide in die wachsende cRNA-

Stränge inkorporiert. Die Detektion erfolgt nach Anfärben der DNA-cRNA

Hybride mit Streptavidin-Phycoerythrin mittels eines Argon-Ionen Lasers

(Kohlmann et al., 2002).

Als Mikroarray wurde das Murine Genome U74Av2 Array

verwendet (Abb. 3-2). Dieses Mikroarray umfasst 12000

murine Gene, davon sind 6000 Gene in der Mouse UniGene

database funktionell charakterisiert und 6000 Gene gehören

zu den EST-cluster. Die Gene werden jeweils durch 16

verschiedene Oligonukleotide repräsentiert. Als interne

Mismatch-Kontrolle werden ebenfalls sequenzspezifische

Oligonukleotide mit einer zentralen Punktmutation

verwendet. Die Mikroarray Software ist in der Lage, die

Hybridisierungsintensität von der „mismatch“ Probe von der exakt

komplementären Probe zu subtrahieren und errechnet damit für jede Probe die

spezifische Intensität

Zum Affymetrix Gene Chip system gehören zusätzlich zum Mikroarray, noch ein

„Fluidicis Station“, Scanner und eine „Computer Workstation“ (Abb. 3-3). Die

„Fluicids Station“ dient zum Waschen und Anfärben der Proben. Sie enthält vier

Module für je eine Probe. Jedes Modul wird unabhängig durch die Microarray

Software kontrolliert. Beim Scanner handelt es sich um ein Argon-Ionen Laser,

der in der Lage ist, die markierte cRNA zu detektieren. „Die Computer

workstation“ dient mit Microarray Software dazu, die „Fluicids Station“ und den

Scanner zu kontrollieren.

Abb. 3-3: Affymetrix GeneChip System: Fluicids Station, Scanner und ein Computer mit Worksstation (http://info.med.yale.edu)

Abb. 3-2: Murine Genome U74Av2 Array


Herstellung der cRNA

Aus den WT-Zellen und zwei PBX1(-/-)-Klonen wurden jeweils im

undifferenzierten und differenzierten Stadium (d9) biotin-markierte cRNA als

Sonde für die Hybridisierung der DNA-Mikroarraychips hergestellt. Dafür wurde

zunächst RNA isoliert (Kap. 3.2.2.1). Im Anschluss daran wurde die gesamt

RNA mittels RNAeasy (Quiagen) aufgereinigt (Kap. 3.2.2.3). Die mRNA wurde

in einer Erst-Strangsynthese und Zweit-Strangsynthese cDNA umgeschrieben

(Kap. 3.2.2.4). Im nächsten Schritt wurde eine in-vitro-Transkription mit Hilfe

des Ambion MEGA Script Systems durchgeführt (Kap. 3.2.2.5), wobei biotin-

markierte cRNA hergestellt wurde. Die Produkte aus der in-vitro-Transkription

wurden nochmals mittels des RNeasy Mini Kits aufgereinigt (Kap. 3.2.2.1)

Hybridisierung

Für die Hybridisierung wurde die biotinmarkierte cRNA in kleinere Fragmente

zerteilt. Die Fragmentierung wurde in einem Fragmentierungspuffer (200 mM

Tris-Acetat pH 7,5, 500 mM K-Acetat, 150 mM Mg-Acetat) durchgeführt. Es

wurde 35 min bei 95 °C inkubiert und sofort aufs Eis gelegt. Vor der

Hybridisierung wurden die Arrays mit 200 µl Hybridisierungspuffer befüllt und für

10 min bei 45 °C im Rotationsofen prähybridisiert. Nachdem die fragmentierten

cRNA (20 µl) für 2 min bei 65 °C erhitzt worden war, wurden 280 µl

Hybridisierungscocktail (10 mg/ml Heringspermien-DNA, 20x Kontroll-RNA 50

mg/ml acetyliertes BSA, 2x Hybridisierungspuffer) hinzugefügt. Der Ansatz

wurde zunächst bei 99 °C für 5 min, dann bei 45 °C für 5 min inkubiert und für 2

min bei maximaler Drehzahl zentrifugiert. Der Puffer wurde aus den Arrays

entfernt und die entsprechenden Arrays wurden mit 200 µl des entsprechenden

Hybridisierungscocktails befüllt und die Öffnungen wurden mit Klebepunkten

abgedichtet. Die Hybridisierung wurde 16 h bei 45 °C im Rotationsofen (60 rpm)

durchgeführt. Direkt im Anschluss auf die Hybridisierung folgten automatisierte

Waschschritte in den „Fluidics Stations“ der Firma Affymetrix. Jedem Array –

Typ ist ein bestimmtes Waschprotokoll zugeordnet. Es wurde mit stringentem

Waschpuffer (100 mM MES, 0,1 M Na+ + 0,01% Tween-20) und nicht-

stringentem Waschpuffer (6x SSPE (20xSSPE: 3 M NaCl, 0,2 M NaH2PO4, 0,02

M EDTA), 0,01% Tween-20) gewaschen. Die Arrays wurden in die passende

Module der Fluidics Station platziert und die Gefäße mit der Sape-Solution in


den Sample-Holder des entsprechenden Moduls gestellt. Das Waschprogramm

(EukGE-WS1) lief automatisch ab. Nach den Waschgängen wurde die

hybridisierte RNA auf den Chips gefärbt. Der Färbeschritt erfolgte im

Färbepuffer (2 x stain buffer, IgG 10 mg/ml, H2O), in Gegenwart von 50 mg/ml

acetyliertem BSA und 0,5 g/ml des Farbstoffs Anti - Streptavidin phycoerythrin

(SAPE).

Die Detektion erfolgt nach Anfärben der DNA-cRNA-Hybride mit Steptavidin-

Phycoerythrin mittels eines Argon-Ionen Lasers. Die „GenChip“-Software der

Firma Affymetrix wurde benutzt, um für jedes Gen aus der Intensität der Signale

einen einzelnen Wert berechnet. Die Werte wurden mit Hilfe einer Datenbank

ausgewertet.

3.2.3 Proteinchemische Methoden

3.2.3.1 Immunzytochemie für Zellkulturen (Fluoreszenz-Methode)

Das Prinzip beruht auf der Visualisierung der spezifischen Bindung eines

Antikörpers an sein Antigen. Die Detektion erfolgte mit einem direkt an den

Fluoreszenz-Farbstoff FITC oder CY5 gekoppelten Sekundärantikörper. Nach

Absaugen des Mediums wurden die Zellen in den Objektträgerflaschen mit 4%

Paraformaldehyd / PBS für 10 min fixiert. Anschließend wurden die Zellen 10

min in 3,7% Formaldehyd / PBS inkubiert und bei RT zweimal für je 5 min mit

PBS gewaschen. Da Paraformaldehyd die Membran nur fixiert, aber keine

Permeabilisierung der Zellmembran hervorruft, wurden die Zellmembranen

zweimal je 5 min mit 0,3% Triton-TX / PBS bei RT permeabilisiert, um den

Antikörpern den Zugang zu intrazellulären Antigenen zu ermöglichen.

Anschließend wurde erneut zweimal für je 5 min mit PBS gewaschen. Um

unspezifische Antigenbindungen des Sekundärantikörpers und damit ein falsch-

positives Ergebnis zu verhindern, erfolgte die Inkubation in Blocking Solution

(5% BSA / PBS) für 1 h im Dunkeln auf einen Schüttler. Nach zweimaligem

Waschen mit PBS erfolgte die Zugabe des Primärantikörpers (Eigenschaften

und Arbeitskonzentrationen siehe Tab.3-1) in 3% BSA und Inkubation für 24 h

bei 4 °C in einer feuchten Kammer. Nach Auswaschung mit PBS wurde der

Fluoreszenz-markierter Sekundärantikörper benutzt, in 3% BSA hinzugegeben

(Eigenschaften und Konzentrationen siehe Tab.3-2) und für 1 h bei RT


inkubiert. Nach Waschen mit PBS wurde die Objektträgerflasche vom

Objektträger entfernt. Nach Lufttrocknung wurde das Präparat mit Mowiol fixiert

und ein Deckblatt befestigt. Die Fluoreszenzpräparate wurden mit Hilfe eines

Fluoreszenzmikroskops photographiert (Axiovert, Zeiss).

Antikörper Eigenschaft Firma Verdünnung

TUJ1 monoklonal, Maus HISS Diagnostics Gmbh 1:500

ERK1 monoklonal, Maus Dianova 1:500

konjugierter Farbstoff

Eigenschaft Firma Verdünnung

FITC Ziege-anti-Maus IgG Dianova 1:200

Cy5 Ratte-anti-Maus IgG Dianova 1:200

Tab. 3-2: Liste der verwendeten Sekundärantikörper, deren Eigenschaft, Firma und Arbeitskonzentration

Tab. 3-1: Liste der verwendeten Primärantikörper, deren Eigenschaft, Firma und Arbeitskonzentration

Ergebnisse 39

Abb. 4-1: RT-PCR von OCT3/4 an undifferenzierten embryonalen Stammzellen „0“ von PBX1(+/+-), PBX1(+/-) und den beiden PBX1(-/-)-Zelllinien. „(-)“ bedeutet Negativkontrolle.

4 Ergebnisse

4.1 Etablierung eines neuronalen Differenzierungsprotokolls

Ziel dieser Dissertation war es, zunächst ein funktionstüchtiges Protokoll für die

Differenzierung embryonaler Stammzellen (ES-Zellen) in neuronale Zellen zu

etablieren.

4.1.1 ES-Zellkultur

Die Pluripotenz der benutzten ES-Zelllinien wurde über die OCT3/4-Expression

nachgewiesen (Kap. 1-2). Bei den undifferenzierten Wildtyp (WT)-, PBX1(+/-)-,

und zwei verschiedenen PBX1(-/-)-ES-Zelllinien wurde eine starke OCT3/4

Expression nachgewiesen. Die durch RT-PCR evaluierte Expressionsstärke

war in allen Zelllinien gleich (Abb. 4-1).

Die Morphologie der ES-Zellen wurde täglich unter dem Mikroskop observiert

und in regelmäßigen Abschnitten photographisch festgehalten. Sowohl die WT-

ES-Zelllinien, als auch die PBX1(+/-) und die PBX1(-/-)-ES-Zelllinien blieben

unter dem Zusatz von leukemia inhibitory factor (LIF) undifferenziert. Abbildung

4-2 zeigt die Morphologie der undifferenzierten WT-ES-Zellen (A und B) sowie

der PBX1(+/-)- (C und D) und der PBX1(-/-)-ES-Zelllinien (E - H). Die ES-Zellen

wuchsen in scharf abgrenzbaren Kolonien. Es konnte im undifferenzierten

Zustand kein Unterschied zwischen den Zelllinien verschiedenen Genotyps

festgestellt werden (Abb. 4-2).

Ergebnisse 40

Abb. 4-2: Die Morphologie im Phasenkontrastmikroskop der undifferenzierten ES-Zellen als WT-ES-Zellen und nach homologen Rekombination zum Knock-out des PBX1-Gens. Die ES-Zellen wuchsen auf zuvor mit EMFI Ammenzellen beschichteten Zellkulturflaschen in Kolonien und befanden sich im subkonfluenten Zustand. Es war kein Unterschied zwischen den Zelllinien sichtbar. A + B: PBX1(+/+); C + D: PBX1(+/-); E + F: PBX1(-/-) Klon 1; G + H: PBX1(-/-)Klon 2

Ergebnisse 41

Abb. 4-4: Embryoidkörperchen nach 4 Tagen in Suspension. A: PBX1(+/+), B:PBX1(+/-) und C: PBX1(-/-)

4.1.2 In-vitro-ES-Zelldifferenzierung

Abbildung 4-3 illustriert die Durchführung der Differenzierung von ES-Zellen in

vitro. Die Differenzierung wurde begonnen, indem die Zellen in Suspension

ohne LIF Faktor und zunächst ohne all-trans Retinsäure (ATRA) kultiviert

wurden. In diesem Stadium wurden die ES-Zellen in nichtadhäsiven

Petrischalen im Differenzierungsmedium gehalten. Unter diesen Bedingungen

adhärierten die ES-Zellen nicht an der Schalenoberfläche und begannen

Embryoidkörperchen mit dreidimensionalen Zell-Zell Interaktionen zu formen.

Diese Embryoidkörperchen waren zunächst klein und unregelmäßig geformt

(Abb. 4-4). Es zeigte sich kein Unterschied zwischen den WT-, PBX1(+/-)- und

PBX1(-/-)-Zelllinien.

Nach 4 Tagen in Suspension wurden die Zellen in zwei Gruppen geteilt, die

eine Hälfte wurde als Kontrollgruppe in Suspension ohne ATRA (4-/4-) und die

andere Hälfte in Suspension mit ATRA (4-/4+) gehalten.

Abb. 4-3: Schema für die in-vitro-Differenzierung von ES-Zellen. ES-Zellen wurden 4 Tage als Embryoidkörperchen kultiviert, gefolgt von weiteren 4 Tagen entweder mit oder ohne ATRA. Das Stadium in der Differenzierung wurde als X-/Y + oder – bezeichnet, wobei X die Anzahl der Tage bis zur ATRA Beigabe bezeichnet und Y die Tage mit (Y+) bzw. ohne (Y-) ATRA Zugabe. Die Zellen wurden auf Zellkulturflaschen transferiert. Als Kontrollpunkte wurden 3dpi, 3 Tage nach Induktion, und 9dpi, 9 Tage nach Induktion, festgelegt. (modifiziert nach Bain et al., 1996)

Ergebnisse 42

Die Embryoidkörperchen vergrößerten sich ab dem 5. und 6. Tag in Suspension

und nahmen eine Kugelform an (Abb. 4-5). Der morphologische Aspekt der ES-

Zelllinien unterschied sich nicht zwischen den einzelnen Genotypen.

Abb. 4-5: Embryoidkörperchen (4-/4+) nach 8 Tagen in Suspension nach Behandlung mit 100 nM ATRA. A,B: PBX1(+/+); C,D: PBX1(+/-); E,F: PBX1(-/-) Klon 1; G,H: PBX1(-/-) Klon 2.

Ergebnisse 43

Abb. 4-6: Embryoidkörperchen (3dpi) 3 Tage nach Readhäsion auf Zellkulturflaschen nach 100 nM ATRA Behandlung (4-/4+) Suspension A: PBX1(+/+), B: PBX1(+/-) und C: PBX1(-/-)

Nach 8 Tagen in Suspension wurden die Embryoidkörperchen wieder in

Gelatine-beschichtete Zellkulturflaschen transferiert. Innerhalb eines Tages

adhärierten die Embryoidkörperchen an den beschichteten Boden der

Zellkulturflasche. Nach der Wiederanheftung begannen sie in verschiedene

Gewebetypen zu differenzieren. In den folgenden Tagen begannen die

Embryoidkörperchen sich abzuflachen und auszustrecken (Abb. 4-6). Es waren

zunächst keine neuronale Fortsätze zu erkennen. In diesem Stadium der

Differenzierung (3dpi) konnten keine Unterschiede zwischen den Zelllinien

verschiedenen Genotyps (WT-, PBX1(+/-) und PBX1 (-/-) beobachtet werden.

Die ES-Zellen, die mit dem ATRA induzierten Differenzierungsprotokoll

behandelt wurden, differenzierten hauptsächlich zu neuronale Zellen, während

bei den anderen ES-Zellen, die nicht mit ATRA behandelt wurden,

verschiedene Zelltypen wie Herzmuskel-, Skelettmuskel- und hämatopoetische

Zellen vorlagen. Herzzellen kontrahierten rhythmisch und waren von daher

allein durch lichtmikroskopische Beobachtung leicht von den anderen Zelltypen

zu unterscheiden. Diese Herzzellen wurden allerdings nur bei Verwendung von

10% FCS im Differenzierungsprotokoll und in den Zellkulturen ohne ATRA-

Behandlung (–4/-4) beobachtet (Abb. 4-7). Als FCS-Konzentration im

Differenzierungsmedium wurde zunächst 10% FCS gewählt. Da jedoch

aufgrund morphologischer Kriterien mit 1% FCS bessere Ergebnisse erzielt

wurden (Steigerung Anzahl neuronaler Zellen, Verminderung Anzahl

Herzzellen), wurde ein Differenzierungsmedium mit 1% FCS verwendet.

Abb. 4-7: PBX1(+/+)-Embryoidkörperchen 3 Tage nach Readhäsion (3dpi) auf Zellkulturflaschen ohne ATRA Behandlung (4-/4-), 10% FCS. Pfeil zeigt auf sich rhythmisch kontrahierende Herzzellen.

Ergebnisse 44

Am Ende des Differenzierungsprozesses wurden die Zellen photographiert. Bei

allen Zelllinien konnte der Differenzierungsprozess erfolgreich durchgeführt

werden. Die neuronalen Zellen waren morphologisch an den Fortsätzen zu

erkennen. Sie begannen nach 4 –5 Tagen während der Readhäsion Fortsätze

zu bilden, bis sich nach 8-9 Tagen ein Netzwerk aus neuronalen Fortsätzen

ergab. Abbildung 4-8 zeigt am Beispiel von WT-Zellen in drei verschiedenen

Vergrößerungen die neuronalen Auswüchse. Die am Boden adhärierten

Embryoidkörperchen bildeten die Fortsätze aufeinander zu. So waren am Ende

des Differenzierungsprozesses mehrere Embryoidkörperchen durch diese

Fortsätze im Sinne eines netzwerkartigen Musters verbunden.

Bei den verschiedenen Zelllinien war der Aufbau dieses netzwerkartiges Muster

unterschiedlich. Bei den WT-Zellen waren die einzelnen Zellen in den

Fortsätzen perlenschnurartig aneinander gewachsen. Die PBX1(+/-)-Zellen

zeigten eine ähnliche Morphologie, dort befanden sich zusätzlich mehr Zellen

flach auf dem Boden anhaftend. Die PBX1(-/-)-Zellen wiesen noch mehr solcher

flachen Zellen auf, die Fortsätze waren aber nicht so strangartig geordnet wie

bei den WT-Zellen, sondern weiter gefächert (Abb. 4-9).

Abb. 4-8: WT-Embryoidkörperchen 9 Tage nach Readhäsion (9dpi) auf Zellkulturflaschen nach Behandlung mit 100 nM ATRA. Man sieht in drei verschiedenen Vergrößerungen die neuronalen Fortsätze, die die adhärierten Embryoidkörperchen aufeinander zubilden.

B

C

Ergebnisse 45

Abb. 4-9: Embryoidkörperchen 9 Tage nach Readhäsion (9dpi) auf Zellkulturflaschen nach Behandlung mit 100 nM ATRA. A,B: PBX1(+/+); C,D: PBX1(+/-); E,F: PBX1(-/-) Klon 1; G,H: PBX1(-/-) Klon 2

Ergebnisse 46

4.2 Vergleichende Charakterisierung der Genexpression in Wildtyp-, PBX1(+/-)- und PBX1(-/-)-Zelllinien

Nach Etablierung des Differenzierungssystems wurden die WT-, die PBX1(+/-)-

und zwei verschiedene PBX1(-/-)-Zelllinien miteinander verglichen. Folgende

Experimente wurden deshalb durchgeführt:

• Zu verschiedenen Kontrollzeitpunkten wurde mRNA isoliert (im

undifferenzierten Stadium, 3 Tage und 9 Tage nach Readhäsion der

Embryoidkörperchen).

• RT–PCR Untersuchungen wurden mit verschiedenen neuronalen und

mesodermalen Markern durchgeführt.

• Die Embryoidkörper wurden immunhistochemisch mit verschiedenen

Antikörpern analysiert.

• Genexpressionsanalyse mit Microarrays wurde zur Identifikation von

PBX1-Zielgen-Kandidaten durchgeführt.

• Northern Blot Analysen wurden angewandt, um die Ergebnisse der

Genexpressionsanalyse zu bestätigen.

4.2.1 Vergleichende semiquantitative RT-PCR Analyse

Abbildungen 4-10, 4-11 und 4-12 zeigen die Ergebnisse der semiquantitativen

PCR Analyse, die im folgenden näher beschrieben werden.

4.2.1.1 Expression von PBX1 während der zellulären Differenzierung

Bei der WT-Zelllinie und der PBX1(+/-)-Zelllinie wurde PBX1 sowohl in der

5´Region als auch in der 3`Region so gut wie nicht von ES exprimiert, aber

während der frühen zellulären Differenzierung („3“) hochreguliert (Abb. 4-10).

Die PBX1(-/-)-Zelllinien produzierten während der zellulären Differenzierung

eine mRNA ohne funktionsfähige Homöodomäne. In der entsprechenden PBX1

5`Region waren demnach auch bei den PBX(-/-)-Zelllinien nach der zellulären

Differenzierung RT-PCR-Banden sichtbar (Abb. 4-10). Da diese Mutante nicht

in der Lage ist, mit DNA oder HOX-Proteinen zu interagieren, wurde davon

ausgegangen, dass das mutierte PBX1-Produkt die Expression von Zielgenen

nicht regulieren kann. Das PCR Ergebnis zeigte, dass die entsprechende

Region in der PBX1 3`Region eliminiert wurde, denn bei den PBX1(-/-) Zellen

Ergebnisse 47

war zu keinem Zeitpunkt während der Differenzierung eine Bande sichtbar

(Abb. 4-10).

4.2.1.2 Expression von neuronalen Genen während der zellulären Differenzierung

Abbildung 4-11 zeigt Transkripte verschiedener neuronaler Gene (PAX6,

Nestin, OTX1, OTX2, N-cam, GFAP), deren neuronale Funktion in Tabelle 4-1

zusammengefasst ist.

Gen Funktion Referenz PAX6 wichtiger Transkriptionsfaktor in der Entwicklung des ZNS (Gajovic et al., 1997) Nestin intermediäres Filamentprotein, das in ZNS-Stammzellen

gebildet wird (Yang et al., 2001)

OTX 1 und 2

topisch und zeitlich begrenzte Expression während der Entwicklung des embryonalen Maushirns

(Acampora et al., 2000)

N-cam Funktion bei der Adhäsion zwischen neuronalen Zellen (Tomasiewicz et al., 1993)

GFAP Marker für Astrozyten im ZNS (Reeves et al., 1989)

Zellkulturen der WT-, der PBX1(+/-)- und PBX1(-/-)-Zelllinie zeigten nach ATRA-

induzierter Differenzierung eine Expression all dieser Gene:

• PAX6 wurde in undifferenzierten ES-Zellen („0“) nur geringfügig

exprimiert und wurde bereits während der frühen zellulären

Differenzierung („3“) hochreguliert.

• Nestin wurde nicht von undifferenzierten ES-Zellen („0“) exprimiert. Die

Expressionsrate steigte während der frühen Differenzierung („3“) und

nahm geringfügig während der späten Differenzierung („9“) ab.

Abb. 4-10: Expression von PBX1 in der 5`Region und 3`Region. Ergebnisse der RT-PCR Untersuchungen. Auf der X-Achse sieht man PBX1(+/+)-, PBX1(+/-)- und PBX1(-/-)-ES-Zelllinien im Vergleich. „0“ bedeutet undifferenziert, „3“ drei Tage und „9“ neun Tage nach Readhäsion. „+“ bedeutet mit 100 nM ATRA Behandlung, „-“ ohne ATRA. Aktin diente als Ladekontrolle. „(-)“ zeigt die Negativkontrolle.

Tabelle 4-1: Charakterisieung der verwendeten neuronalen Marker

Ergebnisse 48

• OTX1 wurde in der späten zellulären Differenzierung („9“) exprimiert,

während OTX2 in den undifferenzierten ES-Zellen („0“) und in der

späteren Differenzierungsphase („9“) gebildet wurde.

• N-cam wurde nur während der späten Differenzierung („9“) gebildet. Es

wurde nicht von den ES-Zellen exprimiert („0“), aber während der

zellulären Differenzierung langsam hochreguliert („3“).

• GFAP wurde nicht von den undifferenzierten ES-Zellen („0“) exprimiert,

während der frühen Differenzierung („3“) hochreguliert.

Der Vergleich der mit ATRA-behandelten Zellkulturen („+“) mit der

Kontrollgruppe („-“) zeigte, dass die neuronalen Marker mit Ausnahme von

OTX2 von den Zellkulturen mit ATRA-Behandlung mehr exprimiert wurden als

in den Zellkulturen ohne ATRA-Behandlung (Abb. 4-11).

Der Vergleich der Zelllinien untereinander zeigte, dass die neuronalen Marker

nach der zellulären Differenzierung („9“) von den PBX1(-/-)-Zelllinien stärker

exprimiert wurden als von den WT-Zelllinien.

Abb. 4-11: Expression von neuronalen Genen. Ergebnisse der RT-PCR Untersuchungen. Auf der X-Achse sieht man PBX1(+/+)-, PBX1(+/-)- und PBX1(-/-)-ES-Zelllinien im Vergleich. „0“ bedeutet undifferenziert, „3“ drei Tage und „9“ neun Tage nach Readhäsion. „+“ bedeutet mit 100 nM ATRA Behandlung, „-“ ohne ATRA. Aktin diente als Ladekontrolle. „(-)“ zeigt die Negativkontrolle.

Ergebnisse 49

4.2.1.3 Expression von FGF15, WNT1 und BMP4

Die RT-PCR-Ergebnisse von Verwendung WNT1-, BMP4- und FGF15-

spezifischer Primer sind von besonderem Interesse. WNT1 und FGF15 wurden

bei den WT- und PBX1(+/-)-ES-Zellen in der frühen Differenzierung („3“)

hochreguliert und anschließend wieder herunterreguliert („9“) (Abb. 4-12).

Bei den PBX1(-/-)-ES-Zellen wurden sie zeitgleich („3“) zu den WT-ES-Zellen

hochreguliert, allerdings während der späten Differenzierung nicht reprimiert,

sondern weiter hochreguliert („9“) (Abb. 4-12).

BMP4 verhielt sich bei allen Zelllinien während der zellulären Differenzierung

gegenläufig zu WNT1. Bei hoher WNT1-Expression wurde BMP4 in niedrigen

Mengen exprimiert und umgekehrt (Abb. 4-12).

WNT1 und FGF15 wurden in den Zellen, die mit ATRA behandelt wurden („+“)

stärker exprimiert als in den unbehandelten Kontrollzellen („-“). Der

mesodermale Marker BMP4 hingegen wurde in den unbehandelten Zellen mehr

exprimiert als in den mit ATRA behandelten Zellen (Abb. 4-12).

Abb. 4-12: Expression von FGF15, WNT1 und BMP4. Ergebnisse der RT-PCR Untersuchungen. Auf der X-Achse sieht man PBX1(+/+)-, PBX1(+/-)- und PBX1(-/-)-ES-Zelllinien im Vergleich. „0“ bedeutet undifferenziert, „3“ drei Tage und „9“ neun Tage nach Readhäsion. „+“ bedeutet mit 100 nM ATRA Behandlung, „-“ ohne ATRA. Aktin diente als Ladekontrolle. „(-)“ zeigt die Negativkontrolle.

Ergebnisse 50

Die Tabelle 4-2 fasst die RT-PCR Ergebnisse aus Kap. 4.2.1.2, Kap. 4.2.1.3

und Kap. 4.2.1.4 zusammen. Tabelle 4-2: Zusammenfassung der Ergebnisse der semiquanitativen RT-PCR Analyse.

PBX1 5`Region o < + < ++ WT o < + < ++ PBX1 (-/-) PBX1 3`Region o < (+) < + WT o = o = o PBX1 (-/-) PAX6 o < + < ++ WT o < + < ++ PBX1 (-/-) Nestin o < ++ > + WT o < ++ > + PBX1 (-/-) OTX1 o < (+) < + WT o < (+) < + PBX1 (-/-) OTX2 + > o < (+) WT + > o < (+) PBX1 (-/-) N-cam o = o < + WT o = o < + PBX1 (-/-) GFAP o < (+) < + WT o < (+) < + PBX1 (-/-) FGF15 (+) < + > (+) WT (+) < + < ++ PBX1 (-/-) WNT1 o < + > (+) WT o < + < ++ PBX1 (-/-) BMP4 + > (+) < + WT + > (+) = (+) PBX1 (-/-)

undifferenzierte

ES-Zelle

differenzierte

ES-Zelle (3dpi)

differenzierte

ES-Zelle (9dpi)

Die Tabelle fasst die semiquantitativen RT-PCR Ergebnisse für die WT- und PBX1(-/-)-Zellen, die mit 100 nM ATRA behandelt wurden, zusammen. „-“ bedeutet keine Expression, „(+)“ geringe Expression, „+“ starke Expression und „++“ bedeutet sehr starke Expression. In der linken Spalte sind die verschiedenen Gene angeordnet. In der rechten Spalte sind die zu der Zeile dazugehörigen Genotypen (entweder WT oder PBX1(-/-) angegeben.

Ergebnisse 51

4.2.2 Vergleichende immunzytochemische Analyse der Embryoidkörperchen

Immunzytochemische Analysen wurden an differenzierten Embryoidkörperchen

9 Tage nach Readhäsion mit einem gegen einen neuronalen Marker, β-Tubulin

Klasse III, gerichteten Antikörper durchgeführt. Zur Verbesserung des

Kontrastes wurde auch das Zytoplasma mit einem spezifischen Antikörper,

ERK1, gefärbt. Während der CY5-markierte Anti-Tuj1-Antikörper rot

fluoreszierte, wurde der FITC-markierte Anti-ERK1-Antikörper an der grünen

Fluoreszenz erkannt. Die Grünfluoreszenz von ERK 1 wies auf die Anzahl der

Zellen in dieser Region hin. Die Rotfluoreszenz zeigte die neuronalen

Auswüchse (Abb. 4-13; Abb. 4-14).

Abbildung 4-13 zeigt exemplarisch eine Übersichtsaufnahme der

Embryoidkörperchen mit neuronalen Fortsätzen bei WT- und PBX1(+/-)-Zellen.

Die Bilder zeigen nahezu kugelförmige Embryoidkörperchen, die aufeinanderzu

in Form eines Netzwerkes neuronale Fortsätze ausbilden.

Abbildung 4-14 zeigt in einer stärkeren Vergrößerung die verschiedenen

Zelllinien im Vergleich. Bei den Wildtypzellen waren die neuronalen Auswüchse

strangförmig angeordnet und begannen proximal an den Embryoidkörperchen.

Dieses Phänomen war bei den PBX1(+/-)-Zellen noch zum Teil sichtbar. Bei

den PBX1(-/-)-Zellen waren die neuronalen Fortsätze flächenhaft deckend. Bei

den PBX1-K.O.-ES-Zellen wurden allerdings vermehrt neuronale Auswüchse im

Vergleich zu den WT-Zellen entdeckt.

Abb. 4-13: Anti β-Tubulin Klasse III immunzytochemische Analysen an Embyoidkörperchen (9dpi). Grün zeigt FITC-markierte Anti-ERK1-Antikörper. Rot zeigt CY5-markierte Anti-Tuj1-Antikörper. A PBX1(+/+) und B PBX1(+/-) zeigen Embyoidkörperchen mit neuronalen Auswüchsen.

Ergebnisse 52

Abb. 4-14: Immunzytochemische Analysen an Embryoidkörperchen 9dpi. Schichtweise im Fluoreszenzmikroskop photographiert und verschiedene Scans übereinanderprojiziert.Grün: FITC-markierter anti-ERK1-Antikörper Rot: CY5-anti-Tuji-Antikörper A, B: PBX1(+/+) C, D: PBX1(+/-) E,F: PBX1(-/-) Klon 1 G,H: PBX1(-/-) Klon 2

Ergebnisse 53

4.2.3 Vergleichende Genexpressionsanalyse

In dieser Arbeit wurde die oligonukleotidgestütze Affymetrixmethode benutzt,

um eine genomweite Expressionsanalyse durchzuführen.

Der Expressionsvergleich der Zelllinien wurde zur Identifikation potentieller

Zielgene von PBX1 durchgeführt. Es bestand aber die Möglichkeit, die

undifferenzierten WT-ES-Zellen mit den differenzierten WT-Zellen, die

differenzierten WT-Zellen mit den differenzierten PBX1-K.O.-ES-Zellen und die

beiden verschiedenen PBX1-K.O.-Klone miteinander zu vergleichen (Abb. 4-

17).

Die Ergebnisse der beiden PBX1-K.O.-Klone waren weitgehend

deckungsgleich. Es handelte sich um heterogene Zellpopulationen, vollkommen

identische Ergebnisse waren daher nicht zu erwarten. Es wurden 235 Gene

unterschiedlich exprimiert, die Spannbreite der Werte reichte +5,7 bis –13.

Insgesamt sind die Zahlen wesentlich niedriger als bei allen anderen

Vergleichen. Der Vergleich Wildtyp undifferenzierte ES-Zellen und Wildtyp

differenzierte Zellen (Kap. 4.2.3.1) und der Vergleich Wildtyp- und Knock-out-

Zellen im differenzierten Stadium (Kap. 4.2.3.2) werden im folgenden

ausführlich dargestellt.

Abb. 4-17: Vergleichsmöglichkeiten der Wildtyp und PBX1(-/-) Zelllinien in verschiedenen Stadien der Differenzierung

Ergebnisse 54

4.2.3.1 Vergleich der undifferenzierten WT-ES-Zellen und der differenzierten WT-Zellen

Der Vergleich zwischen der undifferenzierten WT-ES-Zelllinie und der

differenzierten WT-Zelllinie zeigte die unterschiedlichsten Expressionsmuster.

2281 Gene wurden differentiell exprimiert. Die Spannbreite der Werte reichte

von +132,4 bis –136,5.

Die Expression von OCT3/4 wurde um das 131,6 fache nach Induktion der

Differenzierung herunterreguliert.

Auch einige Gene, die eine regulatorische Rolle im Zellzyklus spielen, wurden

während der Differenzierung herunterreguliert, so z.B. Cyclin E um das 51,5

fache. Die Mikroarray-Analyse zeigte darüber hinaus eine Vielzahl von Genen,

die während der Differenzierung hochreguliert wurden.

Diese Gene wurden in funktionelle Kategorien klassifiziert:

• Neuronale Marker

• Myogene Marker

• Zytoskelett- und extrazelluläre Marker

• Proteasen und Proteaseinhibitoren

• Wachstumsfaktoren und deren Rezeptoren

• Transkriptionsfaktoren

Jeder funktionellen Gruppe ist im folgenden ein Balkendiagramm (Abbildung 4-

18 bis 4-23) zugeordnet. In diesen Balkendiagrammen sind die einzelnen Gene

aufgelistet.

Ergebnisse 55

Neuronale Marker: Viele verschiedene neuronale Marker wurden während der zellulären

Differenzierung hochreguliert. Dazu gehören Neuronatin (X83569), Brain fatty

acid-binding protein (U04827), Zinc finger protein of the cerebellum (D32167),

Neuroserpin (AJ001700), Sialyltransferase 8 (X99646), Reelin (U24703) und

Microtubule-associated protein tau (M18775) (Abb. 4-18). Der Faktor „- fold

change“ in der Abbildung gibt an ,um welchen Wert die Gene jeweils höher

exprimiert wurden.

Abb. 4-18: Expressionsmuster der neuronalen Marker in der Microarray Analyse. Das Diagramm vergleicht die undifferenzierten WT-ES-Zellen und die differenzierten WT-Zellen. Das Expressionsmuster der undifferenzierten WT-ES-Zellen diente als Baseline. Der in der X-Achse erfasste Faktor „- fold change“ Wert gibt an, um welchen Wert das Gen in den differenzierten Zellen mehr exprimiert wurden als in den undifferenzierten ES-Zellen. GeneBank accession numbers: X83569 Neuronatin U04827 Brain fatty acid binding-protein D32167 Zinc finger protein des Cerebellums AJ001700 Neuroserpin X99646 Sialyltransferase 8 U24703 Reelin M18775 Microtubule-associated protein tau

2,7

4,8

7

10

20,8

54,4

76,8

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

M18775

U24703

X99646

AJ001700

D32167

U04827

X83569

Gen

eBan

k ac

cess

ion

num

ber

- fold change

Ergebnisse 56

Myogene Marker: Interessanterweise differenzierten die WT-ES-Zellen in unserem System auch

zum Teil in myogene Zellen. Verschiedene myogene Marker wurden während

der zellulären Differenzierung hochreguliert z.B. Murine MLC1V gene for

myosin alkali light chain (X12972); Actin, alpha 1, skeletal muscle (M12347);

Myosin Vb (M55253); vascular smooth muscle alpha-actin (X13297) und

slow/cardiac troponin C (M29793) (Abb. 4-19). Der Faktor „- fold change“ in der

Abbildung gibt an ,um welchen Wert die Gene jeweils höher exprimiert wurden.

Abb. 4-19: Expressionsmuster der myogenen Marker in der Microarray Analyse. Das Diagramm vergleicht die undifferenzierten WT-ES-Zellen und die differenzierten WT-Zellen. Das Expressionsmuster der undifferenzierten WT-ES-Zellen diente als Baseline. Der in der X-Achse erfasste Faktor „- fold change“ Wert gibt an, um welchen Wert das Gen in den differenzierten Zellen mehr exprimiert wurden als in den undifferenzierten ES-Zellen. GeneBank accession numbers: X12972 Murine MLC1V gene for myosin alkali light chain M12347 Actin, alpha 1, skeletal muscle M29793 Myosin Vb X13297 vascular smooth muscle alpha-actin M29793 slow/cardiac troponin C

3,7

8,6

8,6

10

12,7

0 2 4 6 8 10 12 14

M29793

X13297

M55253

M12347

X12972

Gen

eBan

k ac

cess

ion

num

ber

- fold change

Ergebnisse 57

Zytoskelett und extrazelluläre Matrix Es wurden auch viele Gene während der zellulären Differenzierung

hochreguliert, die eine Rolle in der Zusammensetzung des Zytoskeletts und der

extrazellulären Matrix spielen.

So wurde beispielsweise die Expressionsrate verschiedener Keratine

gesteigert: Keratin 18 Typ 1 (M22832), Keratin 18 Typ 2 (X15662) und Keratin

19 (M36129).

Verschiedene Kollagentypen wurden vermehrt von differenzierten Zellen

exprimiert: Procollagen Typ I Alpha1 (U03419), Pocollagen Typ IV Alpha1

(M15832), Procollagen Typ III Alpha1 (X52046), Procollagen Typ V Alpha2

(L02918), Procollagen Typ VI Alpha1 (X66405) und Procollagen Typ VI Alpha2

(Z18272).

Auch viele Vertreter der Gruppe der Laminine wurden nach der Differenzierung

verstärkt exprimiert: Laminin Alpha1 (M36775), Laminin Alpha4 (U69176),

Laminin B1 C-Terminus (X05212), Laminin Beta2 (U43541), Laminin Beta3

(U43298) und Laminin Gamma2 (U43327).

Hinzu kamen weitere verschiedene extrazelluläre Matrixproteine wie das

extrazelluläre Matrixprotein 1 (L33416), das extrazelluläre Matrixprotein 2

(U66166), Mucin 3 (AF027131) und Osteoblast specific factor 2 (auch: Runx2)

(D13664) (Abb. 4-20). Der Faktor „- fold change“ in der Abbildung gibt an ,um

welchen Wert die Gene jeweils höher exprimiert wurden.

Ergebnisse 58

Abb. 4-20: Expressionsmuster des Zytoskeletts und der extrazellulären Matrix in der Microarray Analyse. Das Diagramm vergleicht die undifferenzierten WT-ES-Zellen und die differenzierten WT-Zellen. Das Expressionsmuster der undifferenzierten WT-ES-Zellen diente als Baseline. Der in der X-Achse erfasste Faktor „- fold change“ Wert gibt an, um welchen Wert das Gen in den differenzierten Zellen mehr exprimiert wurden als in den undifferenzierten ES-Zellen. GeneBank accession numbers: Z18272 Procollagen, Typ VI, Alpha 2 X52046 Procollagen, Typ III, Alpha 1 U66166 Extracellular matrix protein 2 M22832 Keratin 18 Typ1 X66405 Procollagen, Typ VI, Alpha 1 AF027131 Mucin 3, intestinal D13664 osteoblast specific factor 2, Runx2 U43327 Laminin, gamma 2 U03419 Procollagen, Typ I, Alpha 1 U43541 Laminin, Beta 2 X15662 Keratin 18 Typ2 X05212 Laminin B1 C-Terminus M36120 Keratin 19 L02918 Procollagen, Typ V, Alpha 2, U43298 Laminin, Beta 3 M36775 Laminin, Alpha 1 M15832 Procollagen, Typ IV, Alpha 1 U69176 Laminin, Alpha 4 L33416 Extracellular matrix protein 1

2,3

2,4

2,2

2,7

2,7

3,4

3,7

3,9

4,6

4,8

5,4

5,5

5,8

6,8

7,6

10,2

10,7

10,7

14,2

0 2 4 6 8 10 12 14 16

L33416

U69176

M15832

M36775

U43298

L02918

M36120

X05212

X15662

U43541

U03419

U43327

D13664

AF027131

X66405

M22832

U66166

X52046

Z18272

Gen

eBan

k ac

cess

ion

num

ber

- fold change

Ergebnisse 59

Proteasen und Proteaseinhibitoren Sowohl bei spezifischen Proteasen als auch bei einigen Proteaseinhibtoren

konnte eine Steigerung der Expressionsrate in WT-ES-Zellen nach der

Differenzierung feststellt werden.

Dazu gehörte die Gruppe der Cathepsine: Cathepsin B (M665270), Cathepsin F

(AJ131851) und Cathepsin H (U06119).

Auch andere Protease waren vertreten: tissue plasminogen activator (J03520),

serine protease (D89871), calpain-like Protease (Y12582), serine protease

inhibitor 3 (U25844) und serine protease inhibitor 6 (U96700) (Abb. 4-21). Der

Faktor „- fold change“ in der Abbildung gibt an ,um welchen Wert die Gene

jeweils höher exprimiert wurden.

Abb. 4-21: Expressionsmuster der Proteasen und Proteaseinhibitoren in der Microarray Analyse. Das Diagramm vergleicht die undifferenzierten WT-ES-Zellen und die differenzierten WT-Zellen. Das Expressionsmuster der undifferenzierten WT-ES-Zellen diente als Baseline. Der in der X-Achse erfasste Faktor „- fold change“ Wert gibt an, um welchen Wert das Gen in den differenzierten Zellen mehr exprimiert wurden als in den undifferenzierten ES-Zellen. GeneBank accession numbers: Y12582 calpain-like Protease J03520 Plasminogen activator, tissue AJ131851 Cathepsin F U96700 Serine protease inhibitor 6 D89871 Serine protease U25844 Serine protease inhibitor 3 U06119 Cathepsin H M65270 Cathepsin B

2,2

3,2

3,3

4,5

6

10,4

14,7

66,7

0 10 20 30 40 50 60 70 80

M65270

U06119

U25844

D89871

U96700

AJ131851

J03520

Y12582

Gen

eBan

k ac

cess

ion

num

ber

- fold change

Ergebnisse 60

Wachstumsfaktoren und die Rezeptoren

Viele verschieden Wachstumsfaktoren wurden während der zellulären

Differenzierung von den WT-ES-Zellen heraufreguliert.

Dazu gehörten zahlreiche Vertreter der IGF-Familie: Insulin-like growth factor

(IGF)1 Rezeptor (AF056187), IGF2 (X71922), IGF binding protein 1 (X81579),

IGF binding protein 5 (L12447) und IGF binding protein 10 (M32490). Zusätzlich

wurden auch Wachstumshormonrezeptoren (M31680 und U15012)

hochreguliert (Abb. 4-22).

Gleichermaßen stieg auch die Expressionsrate der Familie der transforming

growth factor-beta. TGF-Beta type1 receptor (D25540), TGF-Beta 1 (X62940),

TGF-Beta 2 (X57413), TGF-Beta Tsk 7L (L15436) und TGF beta binding protein

(AF022889). Auch der leukemia inhibitory factor receptor (D17444) und bone

morphogenetic receptors (L25602 und D16250) wurden während der zellulären

Differenzierung hochreguliert (Abb. 4-22). Der Faktor „- fold change“ in der

Abbildung gibt an, um welchen Wert die Gene jeweils höher exprimiert wurden.

Ergebnisse 61

Abb. 4-22: Expressionsmuster der Wachstumsfaktoren und deren Rezeptoren in der Microarray Analyse. Das Diagramm vergleicht die undifferenzierten WT-ES-Zellen und die differenzierten WT-Zellen. Das Expressionsmuster der undifferenzierten WT-ES-Zellen diente als Baseline. Der in der X-Achse erfasste Faktor „- fold change“ Wert gibt an, um welchen Wert das Gen in den differenzierten Zellen mehr exprimiert wurden als in den undifferenzierten ES-Zellen. GeneBank accession numbers: L12447 Insulin-like growth factor binding protein 5 X71922 Insulin-like growth factor 2 X81579 Insulin-like growth factor binding protein 1 M31680 Growth hormone receptor U15012 Growth hormone receptor AF056187 Insulin-like growth factor I receptor L25602 Bone morphogenetic protein 2 M32490 Insulin-like growth factor binding protein 10 D17444 Leukemia inhibitory factor receptor L15436 Transforming growth factor-beta type I receptor (Tsk 7L) D25540 TGF-beta type I receptor D16250 Bone morphogenetic receptor for Bmp2 and Bmp4 AF022889 TGF beta binding protein (LTBP-1) X57413 Transforming growth factor, beta 2 X62940 Transforming growth factor beta 1 induced transcript 4

2

2,1

2,5

3,2

3,3

5

5,2

6,8

7,2

11,8

15,1

16,4

42,4

115,9

132,4

0 20 40 60 80 100 120 140

X62940

X57413

AF022889

D16250

D25540

L15436

D17444

M32490

L25602

AF056187

U15012

M31680

X81579

X71922

L12447

Gen

eBan

k ac

cess

ion

num

ber

- fold change

Ergebnisse 62

Transkriptionsfaktoren Schließlich wurden auch zahlreicheTranskriptionsfaktoren heraufreguliert. Dazu

gehörten Gene mit einer Homöodomäne: Sine oculis-related homeobox gene 2

(X80338), Short stature homeobox gene 2 (U66918), Distal-less homeobox

gene 2 (M80540), hox a3 (Y11717), iroquois homeobox protein 3 (Y15001) und

Homeobox A2 (M93148), Homeodomain protein Nkx-2,2 (U31566) und

Homebox protein PSX (AF017453). Einige der induzierten

Transkriptionsfaktoren sind bekanntermaßen ATRA abhängig: z.B. Stimulated

by retinoic acid gene 6 (AF063476), CRABP mRNA for cellular retinoic acid

binding (X15789) und Cellular retinoic acid binding protein II (M35523) (Abb. 4-

23).

Dazu kamen weitere Transkriptionsfaktoren, die in Prozesse der zellulären

Differenzierung involviert sind: LIM domain transcription factor LMO4

(AF074600), zinc finger protein (X95503), POU domain class 3 TF 3 (M88299)

und TF4(M88301) und die Transkriptionsfaktoren NF-ATc (AF087434) und

TFIIH (AJ002366) (Abb. 4-23). Der Faktor „- fold change“ in der Abbildung gibt

an, um welchen Wert die Gene jeweils höher exprimiert wurden.

Ergebnisse 63

Abb. 4-23: Expressionsmuster der Transkriptionsfaktoren in der Microarray Analyse. Das Diagramm vergleicht die undifferenzierten WT-ES-Zellen und die differenzierten WT-Zellen. Das Expressionsmuster der undifferenzierten WT-ES-Zellen diente als Baseline. Der in der X-Achse erfasste Faktor „- fold change“ Wert gibt an, um welchen Wert das Gen in den differenzierten Zellen mehr exprimiert wurden als in den undifferenzierten ES-Zellen. GeneBank accession numbers: X80338 Sine oculis-related homeobox 2, (Drosophila) AF074600 LIM domain transcription factor LMO4 X95503 Zinc finger protein AJ002366 Zranscription factor TFIIH AF017453 Homeobox protein PSX AF062476 Stimulated by retinoic acid gene 6 AF087434 Transcription factor NF-ATc isoform a (NF-ATca) X15789: Cellular retinoic acid binding protein U66918 Short stature homeobox 2 U31566 Homeodomain protein (Nkx-2,2) M80540 Distal-less homeobox 2 M88301 POU domain, class 3, transcription factor 4 Y11717 Hoxa3 gene Y15001 Iroquois homeobox protein 3 M93148 Homeo box A2 M88299 POU domain, class 3, transcription factor 3 M35523 Cellular retinoic acid binding protein II

16,5

15,2

15,2

12,5

10,5

8,9

6

4,3

4,2

4,2

3,7

2,9

2,9

2,6

2,6

2,6

2,3

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

X80338

AF074600

X95503

AJ002366

AF017453

AF062476

AF087434

X15789

U66918

U31566

M80540

M88301

Y11717

Y15001

M93148

M88299

M35523

Gen

eBan

k ac

cess

ion

num

ber

- fold change

Ergebnisse 64

4.2.3.2 Vergleich Wildtyp und Kock-out Zellen im differenzierten Stadium

Im Vergleich zwischen WT- und PBX1-K.O.-ES-Zellen wurden 790 Gene

unterschiedlich reguliert: die Spannbreite der Werte reichte von +33,2 bis –

109,8. Es wurden diejenigen Gene herausgefiltert, die sich in beiden

differenzierten PBX1-K.O.-Klonen gleichermaßen von den differenzierten WT-

Zellen unterschieden und solche ausgeschlossen, die weniger als um einen

Faktor 2 differierten. Es blieben 257 Gene übrig. Diese Gene wurden in

folgende funktionelle Gruppen kategorisiert:

• Neuronale Marker

• Myogene Marker

• Zelladhäsion und extrazelluläre Matrix

• Proteasen und Proteaseinhibitoren

• Wachstumsfaktoren und deren Rezeptoren

• Transkriptionsfaktoren

• Enzyme

Jeder funktionellen Gruppe ist im folgenden ein Balkendiagramm (Abbildung 4-

24 bis 4-30) zugeordnet.

Ergebnisse 65

Neuronale Marker Viele neuronale Marker wurden während der zellulären Differenzierung von

beiden PBX1-K.O.-Klonen stärker hochreguliert als von den WT-Zellen:

Dazu gehörten Sialytransferase 8 (X99646), Reelin (U24703), mouse brain H5

(X61452), nel-like 2 (U59230), Catenin alpha 2 (D25281), neuron specific gene

family member 1 (M98530), microtubule-associated protein tau (M18775), h2-

Calponin (Z19543), GT12 Protein (Y13832), Amphiregulin (L41352) und

neuronal intermediate filament protein (L27220) (Abb. 4-24).

Abb. 4-24: Expressionsmuster der neuronalen Marker. Ergebnisse der Microarray-Analyse. Ein Diagramm vergleicht jeweils die WT- und die PBX1-K.O.-Zellen im differenzierten Stadium. Das Expressionsmuster der WT-Zelllinie dient als Baseline. Der in der X-Achse erfasste Faktor gibt an, um welchen Wert das Gen im PBX1(-/-)-Klon höher exprimiert wird als in den WT-Zellen. Jedem Gen sind zwei Balken zugeordnet. Der erste Balken (rot) gibt den Wert von PBX1(-/-)-Klon 1 und der zweite Balken (blau) gibt den Wert von PBX1(-/-)-Klon 2 wieder. GeneBank accession numbers (Diagrammbalken von unten nach oben): U24703 Reelin X99646 Sialytransferase 8 X61452 mouse brain H5 D25281 Catenin alpha 2 U59230 Mel91 nel-like 2 homolog M18775 microtubule-associated protein tau M98530 neuron specific gene family member 1 Y13832 GT12 Protein L41352 Amphiregulin L27220 neuronal intermediate filament protein

9,63,6

7,36,2

6,72,9

4,82,6

4,44,4

3,82,3

3,42,7

2,92,2

2,42,3

2,12

0 2 4 6 8 10 12

U24703

X99646

X61452

D25281

U59230

M18775

M98530

Y13832

L41352

L27220

Gen

eBan

k ac

cess

ion

num

ber

- fold change

Ergebnisse 66

Myogene Marker Die Ergebnisse der Mikroarray-Analyse zeigten, dass die Zellen zum Teil in

Muskelzellen differenzierten. Dabei wurden die myogenen Marker stärker von

den beiden PBX1(-/-)-Klonen als von den WT-Zellen produziert. Dazu gehörten:

skeletal muscle Aktin Alpha (M12347), vascular smooth muscle alpha-actin

(X13297), slow myosin heavy chain (AJ223362), Transgelin SM 22 α (Z68618),

cardia actin Alpha (M15501), Murine MLC1V gene for myosin alkali light chain

(exon 1) (ventricular/slow muscle isoform) (X12972), cardiac ankyrin repeat

protein, myosin light chain (AF041847) (Abb. 4-25).

Abb. 4-25: Expressionsmuster der myogenen Marker. Expressionsmuster der neuronalen Marker. Ergebnisse der Microarray-Analyse. Ein Diagramm vergleicht jeweils die WT- und die PBX1-K.O.-Zellen im differenzierten Stadium. Das Expressionsmuster der WT-Zelllinie dient als Baseline. Der in der X-Achse erfasste Faktor gibt an, um welchen Wert das Gen im PBX1(-/-)-Klon höher exprimiert wird als in den WT-Zellen. Jedem Gen sind zwei Balken zugeordnet. Der erste Balken (rot) gibt den Wert von PBX1(-/-)-Klon 1 und der zweite Balken (blau) gibt den Wert von PBX1(-/-)-Klon 2 wieder. GeneBank accession numbers (Diagrammbalken von unten nach oben): M12347 Skeletal muscle Aktin Alpha X13297 Vascular smooth muscle actin Alpha AJ223362 Slow myosin heavy chain Z68618 Transgelin SM 22 α, cardia actin Alpha X12972 Murine MLC1V gene for myosin alkali light chain (ventricular/slow

muscle isoform M15501 Aktin Alpha, cardiac AF041847 Cardiac ankyrin repeat protein AA839903 Myosin light chain

33,226,1

30,719,5

13,37,7

9,54,4

6,53,6

6,54,4

6,23,3

3,32,7

0 5 10 15 20 25 30 35

M12347

X13297

AJ223362

Z68618

X12972

M15501

AF041847

AA839903

Gen

eBan

k ac

cess

ion

num

be

- fold change

Ergebnisse 67

Zelladhäsion und extrazelluläre Matrix Proteine der extrazellulären Matrix wurden unterschiedlich reguliert. Einige

Intermediärfilamente (AA755126) und Procollagene (AB000636) wurden von

den PBX1(-/-)-Zelllinien nach der Differenzierung höher reguliert, einige

Procollagene (X66405 und Z18272) wurden weniger von den WT-Zellen

exprimiert (Abb. 4-26). Einige Proteine, die in der Zelladhäsion eine Rolle

spielen wurden von den PBX1(-(-)-Zellen höher reguliert: Integrin beta 4

(L04678), transient receptor potential cation channel (AI842649), claudin 3

(AF095905), membrane-associated protein 17 (AW011791). Der endodermale

Marker Aquaporin (L02914) hingegen wurde herunterreguliert (Abb. 4-26).

Abb. 4-26: Expressionsmuster der Zelladhäsion und der extrazelluläre Matrix. Ergebnisse der Microarray-Analyse. Ein Diagramm vergleicht jeweils die WT- und die PBX1-K.O.-Zellen im differenzierten Stadium. Das Expressionsmuster der WT-Zelllinie dient als Baseline. Der in der X-Achse erfasste Faktor gibt an, um welchen Wert das Gen im PBX1-K.O.-Klon höher (+) bzw. niedriger (-) exprimiert wird als in den WT-Zellen. Jedem Gen sind zwei Balken zugeordnet. Der erste Balken (rot) gibt den Wert von PBX1(-/-)-Klon 1 und der zweite Balken (blau) gibt den Wert von PBX1(-/-)-Klon 2 wieder. GeneBank accession numbers (Diagrammbalken von unten nach oben): L04678 Integrin beta 4 AI842649 transient receptor potential cation channel AF095905 claudin 3 AW011791 membrane-associated protein 17 L02914 Aquaporin AA755126 Wayne State University 77, intermediate filament AB000636 Procollagen, type XIX, alpha1 X66405 Procollagen, type VI, alpha1 Z18272 Procollagen, type VI, alpha1

72,3

4,64,1

3,83,5

2,72

-3-4,5

9,14,4

2,52,3

-2,9-4,1

-5-6,7

-8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8 10

L04678

AI842649

AF095905

AW011791

L02914

AA755126

AB000636

X66405

Z18272

Gen

eBan

k ac

cess

ion

num

ber

- fold change

Ergebnisse 68

Proteasen und Proteaseinhibitoren Die Proteasen und Proteaseinhibitoren verhielten sich nach der Differenzierung

unterschiedlich. Einige wurden nach Differenzierung von den PBX1-K.O.-ES-

Zellen vermehrt produziert: Serin Protease 11 (AW125478) und Serin Protease

Inhibitor (AB006960). Andere wurden in den WT-Zellen stärker exprimiert:

Cathepsin H (U06119), Serin Protease Inbitor mReck (AB006960), Calpain 6

(AI747133), Tissue Plasminogen activator (J03520) und Cathepsin B

(AI851255) (Abb. 4-27).

Abb. 4-27: Expressionsmuster der Proteasen und Proteaseinhibitoren Ergebnisse der Microarray-Analyse. Ein Diagramm vergleicht jeweils die WT- und die PBX1-K.O.-Zellen im differenzierten Stadium. Das Expressionsmuster der WT-Zelllinie dient als Baseline. Der in der X-Achse erfasste Faktor gibt an, um welchen Wert das Gen im PBX1-K.O.-Klon höher (+) bzw. niedriger (-) exprimiert wird als in den WT-Zellen. Jedem Gen sind zwei Balken zugeordnet. Der erste Balken (rot) gibt den Wert von PBX1(-/-)-Klon 1 und der zweite Balken (blau) gibt den Wert von PBX1(-/-)-Klon 2 wieder. GeneBank accession numbers (Diagrammbalken von unten nach oben): AW125478 Serin Protease 11 AB006960 Serin Protease Inhibitor U06119 Cathepsin H AB006960 Serin Protease Inbitor mReck AI747133 Calpain 6 J03520 Tissue Plasminogen activator AI851255 Cathepsin B

4,53,1

3,32,7

-2,1-2,7

-2,4-4,9

-2,4-2,9

-3-3,5

-4,6-6,3

-8 -6 -4 -2 0 2 4 6

AW125478

AB006960

U06119

AB006960

AI747133

J03520

AI851255

Gen

eBan

k ac

cess

ion

num

ber

- fold change

Ergebnisse 69

Wachstumsfaktoren und deren Rezeptoren In der Gruppe der Wachstumsfaktoren zeigte die IGF-Familie ein besonders

interessantes Verhalten. Vor allem IGF2 (X71922) und der dazugehörige

Rezeptor (U04710) wurde nach der Differenzierung wesentlich weniger von den

WT-Zellen als von den PBX1-K.O.-ES-Zellen produziert. Einige andere

Wachstumsfaktoren wurden hochreguliert wie z.B. Interferon-induced 15-KDa

Protein (X56602), TGF β1 (L22482) und Cyclin dependent kinase inhibitor 1C

(U22399), andere wurden herunterreguliert wie z. B. Dlk1-like homologe

(Z12171) und der Prostaglandin F Rezeptor (D17433) (Abb. 4-28).

Abb. 4-28: Expressionsmuster der Wachstumsfaktoren und deren Rezeptoren.Ergebnisse der Microarray-Analyse. Ein Diagramm vergleicht jeweils die WT- und die PBX1-K.O.-Zellen im differenzierten Stadium. Das Expressionsmuster der WT-Zelllinie dient als Baseline. Der in der X-Achse erfasste Faktor gibt an, um welchen Wert das Gen im PBX1-K.O.-Klon höher (+) bzw. niedriger (-) exprimiert wird als in den WT-Zellen. Jedem Gen sind zwei Balken zugeordnet. Der erste Balken (rot) gibt den Wert von PBX1(-/-)-Klon 1 und der zweite Balken (blau) gibt den Wert von PBX1(-/-)-Klon 2 wieder. GeneBank accession numbers (Diagrammbalken von unten nach oben): X56602 Interferon-induced 15-KDa Protein U43084 Interferon-induced protein tetratricopeptide repeats L22482 TGF β1 U22399 Cyclin dependent kinase inhibitor 1C Z12171 Dlk1-like homologe D17433 Prostaglandin F Rezeptor U04710 IGF2-Rezeptor X71922 IGF2

15,98,4

11,64,1

2,12

-2-3,4

-2,1-2,8

-3-5,1

-9,5-12,4

-97,7-109,8

-120 -100 -80 -60 -40 -20 0 20 40

X56602

U43084

L22482

U22399

Z12171

D17433

U04710

X71922 I

Gen

eBan

k ac

cess

ion

num

ber

- fold change

Ergebnisse 70

Transkriptionsfaktoren Viele Transkriptionsfaktoren unterschieden sich in ihrer Expressionsrate

zwischen WT- und PBX(-/-)-Zellen nach der Differenzierung. Folgende

Trankriptionsfaktoren wurden von beiden PBX1(-/-)-Klonen mehr exprimiert als

von den WT-Klonen: Cysteine rich protein (D88793 und AI837625), LRG-21

(U19118), regulatory factor X-associated (AV328604) und HNF 3 Alpha

(U44752) (Abb. 4-29).

Andere Transkriptionsfaktoren wurden mehr von den WT-ES-Zelllinien

exprimiert als von beiden PBX(-/-)-Klonen: p8 Protein (AI852641), CRABPII

(M35523), Sorbin (AV359416), Sine oculis-related homebox2 (X80338),

stimulated by retinoic acid gene 6 (AF062476), mSox7 (AB023419), SRY-box

containing gene 10 (AW125812) und Myeloblastosis ongene-like2 (X70472)

(Abb. 4-29).

Ergebnisse 71

Abb. 4-29: Expressionsmuster der Transkriptionsfaktoren. Ergebnisse der Microarray-Analyse. Ein Diagramm vergleicht jeweils die WT- und die PBX1-K.O.-Zellen im differenzierten Stadium. Das Expressionsmuster der WT-Zelllinie dient als Baseline. Der in der X-Achse erfasste Faktor gibt an, um welchen Wert das Gen im PBX1-K.O.-Klon höher (+) bzw. niedriger (-) exprimiert wird als in den WT-Zellen. Jedem Gen sind zwei Balken zugeordnet. Der erste Balken (rot) gibt den Wert von PBX1(-/-)-Klon 1 und der zweite Balken (blau) gibt den Wert von PBX1(-/-)-Klon 2 wieder. GeneBank accession numbers (Diagrammbalken von unten nach oben): AV328604 Regulatory factor X-associated U44752 Hepatocyte nuclear factor 3 Alpha U19118 Transcription factor LRG-21 D88793 Cysteine rich protein AI837625 Cysteine rich protein AI852641 nuclear protein, p8 Protein M35523 Cellular retinoic acid binding protein II AV359416 Sorbin and SH3 domain containing 1 X80338 Sine oculis-related homebox2 AF062476 stimulated by retinoic acid gene 6 AB023419 mSox7 () AW125812 SRY-box containing gene 10 X70472 Myeloblastosis ongene-like2 .

5,12,7

3,42

32,4

2,82,5

2,72,3

-2-3,6

-2,2-2,9

-2,3-2,7

-2,3-3,5

-2,9-6,3

-2,9-2,4

-3,1-3,4

-3,7-5,2

-8 -6 -4 -2 0 2 4 6

AV328604

U44752

U19118

D88793

AI837625

AI852641

M35523

AV359416 S

X80338

AF062476

AB023419

AW125812

X70472

Gen

eBan

k ac

cess

ion

num

ber

- fold change

Ergebnisse 72

Enzyme Viele Enzyme wurden unterschiedlich von WT-ES-Zellen und PBX1(-/-)-Zellen

nach zellulärer Differenzierung reguliert. Zu den Enzymen, die mehr von den

PBX1(-/-)-Zellen exprimiert wurden, zählen: Cytochrome P450 (Y12657),

Inhibitor of cAMP-dependent protein kinase (M63554), Creatinin kinase

(Z13969), Annexin III (AJ001633), Prostacyclin synthase (AB001607) und

Polymerase gamma (U53584). Zu den Enzymen, die mehr von den WT-ES-

Zellen exprimiert wurden zählen: Endothel-specific receptor tyrosine kinase

(X72426), Fatty acid Coenzyme A ligase (A1838021), Lysosomal alpha-N-

acetylglucosaminidase (U85247), Protein tyrosine phosphatase receptor type B

(X58289), Murine MAP kinase 6c (U39066), Glutamyl aminopeptidase (M

29961), Sialtansferase (D28941), Galacosyltransferase (A1841494),

Acetylchoinesterase (X56518) und Colipase (AA710635) (Abb. 4-30).

Besonders auffallend war das Ergebnis von Colipase, die in beiden PBX1(-/-)-

Klonen erheblich weniger exprimiert wurde als von den WT-Zellen (Abb. 4-30).

Ergebnisse 73

Abb. 4-30: Expressionsmuster der Enzyme. Ergebnisse der Microarray-Analyse. Ein Diagramm vergleicht jeweils die WT- und die PBX1-K.O.-Zellen im differenzierten Stadium. Das Expressionsmuster der WT-Zelllinie dient als Baseline. Der in der X-Achse erfasste Faktor gibt an, um welchen Wert das Gen im PBX1-K.O.-Klon höher (+) bzw. niedriger (-) exprimiert wird als in den WT-Zellen. Jedem Gen sind zwei Balken zugeordnet. Der erste Balken (rot) gibt den Wert von PBX1(-/-)-Klon 1 und der zweite Balken (blau) gibt den Wert von PBX1(-/-)-Klon 2 wieder. GeneBank accession numbers (Diagrammbalken von unten nach oben): Y12657 Cytochrome P450, 26, retinoic acid M63554 Inhibitor of cAMP-dependent protein kinase Z13969 Creatinin kinase, mitochondrial 1 AJ001633 Annexin III AB001607 Prostacyclin synthase U53584 Polymerase gamma X72426 Endothel-specific receptor tyrosine kinase A1838021 Fatty acid Coenzyme A ligase U85247 Lysosomal alpha-N-acetylglucosaminidase X58289 Protein tyrosine phosphatase receptor type B U39066 Murine MAP kinase 6c M29961 Glutamyl aminopeptidase D28941 Alpha-2,3-Sialyltansferase A1841494 Beta-1,3-Galactosyltransferase X56518 Acetylcholinesterase AA710635 Colipase

5,24,7

3,42,1

3,42,1

3,32,3

3,12,4

32,2

-2-2,1

-2,1-2,2

-2,2-2,4

-2,3-2,7

-2,3-2,9

-2,4-3,5

-2,5-2,6

-3,1-3,9

-3,3-6,9

-55,5 -45,9

-60 -50 -40 -30 -20 -10 0 10

Y12657

M63554

Z13969

AJ001633

AB001607

U53584

X71426

AI838021

U85247

X58289

U39066

M29961

D28941

AI841494

X56518

AA710635

Gen

eBan

k ac

cess

ion

num

ber

- fold change

Ergebnisse 74

4.2.4 Northern Blot Analyse

Die Expression mit dem größten Wert in „- fold change“ wurden durch Northern

Blots bestätigt (Abb. 4-31).

OCT3/4 wurde im undifferenzierten Zustand von allen Zelllinien (WT-, PBX1(+/-

)- und PBX1 (-/-)), in ausgeprägtem Maß exprimiert und während der zellulären

Differenzierung bei allen Zelllinien stark herunterreguliert.

Besonders interessant war das genotypabhängige Verhalten während der

Differenzierung von IGF1 und 2 und deren Rezeptoren IGF1R und IGF2R, H19

und Colipase (Abb. 4-31):

• IGF1R wurde im undifferenzierten Stadium („0“) von allen Zelllinien

exprimiert. Während der Differenzierung wurde es von der WT-Zelllinie

herunterreguliert, von den PBX1(+/-)- und PBX1(-/-)-Zelllinien aber weiter

hochreguliert („9“).

• IGF1 wurde im undifferenzierten Stadium („0“) von keiner Zelllinie

exprimiert. Es wurde nach der Differenzierung von PBX1(+/-) und PBX1(-

/-)-Zellen mehr exprimiert als von den WT-Zellen („9“).

• IGF2R wurde im undifferenzierten Stadium („0“) von allen Zelllinien

exprimiert. Auf der anderen Seite wurde es aber während der

Differenzierung der WT-Zelllinie hochreguliert, während der

Differenzierung von PBX1(+/-)- und PBX1(-/-)-Zelllinien wurde es

erheblich herunterreguliert („9“).

• IGF2 wurde im undifferenzierten Stadium („0“) von keiner Zelllinie

exprimiert. Es wurde nach der Differenzierung kaum von PBX1(+/-)- und

PBX1(-/-)-Zelllinien exprimiert, aber während der Differenzierung der

WT-Zelllinien stark hochreguliert („9“).

• H19 wurde im undifferenzierten Stadium („0“) von allen Zelllinien

exprimiert. H19 dagegen wurde von den PBX1(+/-)- und PBX1(-/-)-

Zelllinien nach der Differenzierung stärker hochreguliert („9“).

• Colipase unterschied sich im Expressionsmuster zwischen den WT- und

PBX1-K.O.-Zelllinien. Es wurde im undifferenzierten Zustand („0“) und

nach der Differenzierung nur von den WT-Zelllinien gebildet („9“).

Ergebnisse 75

Abb. 4-31: Ergebnisse der Northern Blot Analyse. „0“ bedeutet undifferenzierte ES-Zellen und „9“ bedeutet differenzierte ES-Zellen (9dpi). Zellen wurden mit 100 nM ATRA während der Differenzierung behandelt. Man sieht jeweils im Vergleich PBX1(+/+), PBX1(+/-) und PBX1(-/-) Klon 1 und Klon 2.

IGF1R

H19

Colipase

IGF2

IGF2R

Tag

EtBr

OCT3/4

IGF1

PBX1-Genotyp

Diskussion 76

5 Diskussion

Das Ziel dieser Arbeit war es, zunächst ein in-vitro-Differenzierungssystem

embryonaler Stammzellen (ES-Zellen) in Richtung der neuronaler Zellen zu

etablieren. In einem weiteren Schritt sollten die WT-, die PBX1(+/-) und die

PBX1(-/-)-ES-Zelllinien parallel neuronal differenziert werden und die

Auswirkungen der verschiedenen Genotypen auf molekularer Ebene verglichen

werden. Aus den Ergebnissen dieser Experimente lassen sich drei

Schlussfolgerungen ziehen:

Erstens konnte gezeigt werden, dass nicht nur WT-ES-Zellen, sondern auch

PBX1-K.O.-ES-Zellen in der Lage sind, neuronal zu differenzieren (Kap. 5-1).

Zweitens begünstigte die Inaktivierung von PBX1 die neuronale und

mesodermale Differenzierung (Kap. 5-2).

Drittens traten während der zellulären Differenzierung unterschiedliche

Genexpressionsmuster in WT- und PBX1-K.O.-Zellen auf, die Hinweis auf

potentielle PBX1-Zielgene geben (Kap. 5-3).

Jeder dieser Punkte wird im Folgenden diskutiert. Aus den Ergebnissen leiten

sich Fragestellungen für eine Reihe von Anschlussprojekten ab. Exemplarisch

werden einige mögliche Projekte zur Diskussion gestellt (Kap 5-4).

5.1 Neuronale Differenzierung der embryonalen Stammzellen in vitro

Bei der Etablierung des in-vitro-Differenzierungssystems embryonaler

Stammzellen wurden bereits publizierte Differenzierungsprotokolle (Bain et al.,

1995; Gajovic et al., 1997) zugrundegelegt und modifiziert. Unsere Arbeit zeigte

erstmals, dass es möglich war, PBX1(+/-)- und PBX1(-/-)-ES-Zellen in

neuronale Zellen zu differenzieren.

Es ist zwar bekannt, dass die PBX1-Expression essentiell für die

Embryogenese ist, die PBX1-K.O.-Maus stirbt jedoch sehr früh während der

embryonalen Entwicklung am Tag E 15 - 16 mit Aplasie und Hypoplasie

multipler Organsysteme (Kap. 1.4). Die in-vitro-Differenzierung erlaubte das

Problem der frühen Letalität von PBX1-K.O.-Mäusen zu umgehen, indem die

Auswirkung des Verlustes von PBX1 auf zellulärer Ebene untersucht wurde.

Diskussion 77

Abb. 5-1: Strukturformel von All-trans Retinsäure (http://www.serva.de)

5.1.1 Etablierung des neuronalen in-vitro-Differenzierungssystems

Die Anzahl der neuronalen Zellen konnte durch Anwendung ein spezielles

Differenzierungsprotokoll gesteigert werden (Kap 3.2.1.6).

Es wurde bereits publiziert, dass die Anzahl der neuronalen Zellen während der

Differenzierung durch den Gebrauch von 1% FCS gesteigert werden kann (Bain

et al., 1995; Gajovic et al., 1997). Diese Beobachtung konnte durch unsere

Untersuchungen bestätigt werden. Unter Anwendung morphologischer Kriterien

brachte der Gebrauch von 1% FCS im Vergleich zu 10% FCS bessere

Ergebnisse. Die Anzahl an neuronalen Zellen konnte bei 1% FCS im Vergleich

zu 10% FCS erhöht werden und die Anzahl an sich spontan kontrahierenden

Herzzellen konnte erheblich reduziert werden.

ATRA steigert den Anteil an neuronalen Zellen in der Kultur, indem ATRA eine

entsprechende Genexpressionskaskade induziert (Gajovic et al., 1997). Die

Anwesenheit von ATRA in vitro hat zwei deutliche phänotypische Effekte: Zum

einen bilden die Aggregate nach Behandlung mit ATRA Neuriten im höheren

Ausmaß, zum anderen wird ein höherer Anteil an neuronalen Zellen gebildet

(Bain et al., 1995). Diese bereits publizierten Effekte konnten auch in unseren

Untersuchungen bestätigt werden. Die ES-Zellen, die mit ATRA Behandlung

differenziert wurden, zeigten ein höheres Ausmaß an neuronalen Zellen als die

ES-Zellen, die nicht mit ATRA behandelt wurden. Diese Beobachtung konnte

sowohl morphologisch als auch bei den RT-PCR Untersuchungen gemacht

werden.

Die Mechanismen der Differenzierung durch ATRA in unserem Zellsystem war

zwar nicht Gegenstand unserer Untersuchungen, doch gibt es zahlreiche

Untersuchungen, die die Wirkung von ATRA bei Regenerations- und

Differenzierungsvorgängen beleuchten.

ATRA (Abb. 5-1) ist essentiell für die

normale Entwicklung eines Embryos und

für die Beibehaltung der Differenzierung

in adulten Organismen. ATRA ist die

aktive Form von Vitamin A und ist über

Retinoidrezeptoren in zahlreiche

Signaltransduktionswege involviert (Zile,

Diskussion 78

1998). Es ist bekannt, dass ATRA über zwei Rezeptorklassen wirkt: die retinoic

acid receptors (RARs) und die retinoid X receptors (RXRs). Die Subtypen der

beiden Rezeptorklassen werden in charakteristischer Weise und nur zum Teil

überlappend während der Embryogenese exprimiert (Ross et al., 2000).

ATRA hat einen Einfluss auf die Zellreifung, wovon therapeutisch Gebrauch

gemacht wird: Isoretinoin® und Accutane® werden bei der akuten myeloischen

Leukämie des FAB-Subtyps M3 bzw. Psoriasis und Akne bereits eingesetzt,

gelten allerdings als sehr teratogen. Sowohl bei Vitamin A Mangel als auch

einem Überangebot an ATRA kommt es zu schwerwiegenden Störungen in der

Embryonalentwicklung bei Mensch und Tier. Retinoidrezeptor-K.O.-Modelle

haben gezeigt, das ATRA für die Entwicklung von Herz, embryonalem Kreislauf

und ZNS benötigt wird (Ross et al., 2000).

Im embryonalen ZNS spielt ATRA eine wichtige Rolle in der Segmentierung der

anteroposterioren und dorsoventralen Achse und reguliert die Entwicklung von

Interneuronen. ATRA fördert in vitro die Replikations- und Überlebensrate von

Neuralleisten-Vorläuferzellen und steigert die Differenzierungsrate dieser Zellen

(Henion and Weston, 1994). ATRA stimuliert auch die Regeneration von

auditorischen Haarzellen, eine hoch spezialisierte Sinneszellform im Corti-

Organ der Kochlea (Chardin and Romand, 1995). Außerdem reguliert ATRA die

Produktion von Neurotransmittern von postmitotischen Neuronen in vitro

(Berrard et al., 1993) und begünstigt die Differenzierung von Vorläuferzellen der

Retina zu Photorezeptoren (Kelley et al., 1999).

Bei verschiedenen neuronalen Erkrankungen (Morbus Parkinson,

Motoneuronerkrankungen und Schizophrenie) scheint der Defekt des

Retinoidsignalsystems eine Rolle zu spielen, so dass es möglich erscheint,

dass ATRA in Zukunft als Therapeutikum bei neurologischen Erkrankungen

eingesetzt wird (Maden, 2002; Ross et al., 2000; Werner and Deluca, 2002).

5.1.2 Bestätigung der neuronalen in-vitro-Differenzierung

Ein großer Anteil der ES-Zellen mit WT-, PBX1(+/-)- und PBX1(-/-)-Genotyp

zeigte nach ATRA-induzierter Differenzierung Eigenschaften neuronaler Zellen.

Embryoidkörperchen, die durch diesen Prozess induziert wurden, entwickelten

neuronale Auswüchse und ähnelten primären Kulturen von Gehirnzellen.

Diskussion 79

Unsere immunzytochemischen Untersuchungen zeigten, dass diese Aggregate

β-Tubulin Klasse III stark exprimierten.

Verschiedene neuronale Gene wurden in allen Zelllinien, WT-, PBX1(+/-) und

PBX1(-/-), während der zellulären Differenzierung hochreguliert: PAX6, Nestin,

OTX1 und OTX2, N-cam und GFAP. Einige dieser Gene wurden bereits von

undifferenzierten ES-Zellen exprimiert (OTX2, BMP4), andere wurden während

der frühen Differenzierung (WNT1, FGF15, PAX6, Nestin, OTX1) und weitere

erst während der späten Differenzierung (OTX2, GFAP, N-cam) hochreguliert.

Zum Teil wurde das Expressionsmuster dieser Gene in vitro schon in anderen

publizierten neuronalen Differenzierungssystemen beschrieben. Für unsere

Experimente dienten diese Genexpressionsmuster in den WT-ES-Zellen als

Kontrolle für die erfolgreiche Etablierung des neuronalen

Differenzierungssystems.

Bain et al. hat die Expressionsmuster von WNT1 (Bain et al., 1996) und GFAP

(Bain et al., 1995) während der zellulären Differenzierung gezeigt. Gajovic et al.

hat das Expressionsmuster von PAX6 während der frühen Differenzierung

gezeigt (Gajovic et al., 1997). Lee et al. hat die Expressionsmuster für Nestin,

OTX1 und OTX2 beschrieben (Lee et al., 2000). Diese publizierten

Expressionsmuster stimmen mit den von uns gezeigten Expressionsmustern

überein. Zusätzlich zeigten unsere Untersuchungen, dass auch N-cam und

FGF15 während der zellulären Differenzierung hochreguliert wurden.

Kelly et al. hat eine Microarray Analyse von undifferenzierten WT-ES-Zellen und

ATRA-induzierten differenzierten WT-ES-Zellen am Tag 3 nach Readhäsion

durchgeführt (Kelly and Rizzino, 2000). Wir haben die dort vorgenommene

Klassifikation der Gene als Leitfaden für unsere eigene Klassifikation genutzt.

Das Expressionsmuster vieler dort beschriebener Gene aus unterschiedlichen

funktionellen Gruppen deckte sich mit den Expressionsmustern unserer WT-

ES-Zellen, so z.B. IGF2 (Wachstumsfaktor), Keratin 18 und 19 (Zytoskelett) und

Cathepsine (Proteasen).

Unsere Arbeit zeigt erstmals die Kombination des in-vitro-

Differenzierungssytems in Kombination mit dem Knock-out-System. Darüber

hinaus zeigten wir erstmals, dass es möglich ist, auch PBX1(+/-)-Zellen und

PBX1(-/-)-Zellen neuronal zu differenzieren.

Diskussion 80

5.1.3 Vergleich der Differenzierung in vitro mit der Entwicklung in vivo

Die ES-Zellen entsprechen in vivo den Zellen der inneren Zellmasse der

Mausblastozyste in der Phase der Präimplantation. Zu dieser Zeit werden

bereits verschiedene Zellschichten erkannt: eine äußere Hülle, das

Trophoektoderm, aus der später das extraembryonale Gewebe entsteht, und

eine innere Zellmasse, aus der sich u.a. der Embryo entwickelt. Durch den

Prozess der Gastrulation bilden sich die drei Zellschichten: das Endoderm, das

Ektoderm und das Mesoderm (Rohwedel, 2001). Das axiale Mesoderm

induziert im anliegenden Ektoderm die Differenzierung des Neuroektoderms.

Aus dem Neuroektoderm entwickelt sich das Neuralrohr, das zum ZNS und

Rückenmark wird (Abb. 5-2).

Obwohl einige Zellen sich in vitro in den Embryoidkörperchen in

epithelähnlichen Strukturen anordnen, werden die Komplexität und die

hochorganisierten Interaktionen zwischen den Zellen eines dreikeimblättrigen

Embryos, wie sie in vivo vorherrschen, niemals erreicht.

Dennoch fand bei unseren Untersuchungen eine substantielle neuronale

Differenzierung in vitro statt, was den Schluss zulässt, dass es

Abb. 5-2: Schema der primären Neurulation. Nähere Erläuterungen siehe Text. (http://www.macalaster.edu)

Diskussion 81

Differenzierungswege von ES-Zellen zu neuronalen Zellen gibt, die nicht auf die

zellulären Interaktionen eines intakten Embryos angewiesen sind. Allerdings

darf nicht außer Acht gelassen werden, dass unsere Microarray Analyse zeigte,

dass einige ES-Zellen auch mesodermal differenzierten. Es könnte also sein,

dass die Zellen, die in die neuronale Zelllinie differenzieren, den Kontakt zu den

mesodermalen Zellen oder deren Sekretionsprodukte nutzen (Bain et al., 1995).

Bei Drosophila wurde bereits gezeigt, dass das Ektoderm auch ohne Interaktion

mit dem Mesoderm zur neuronalen Differenzierung fähig ist (Rao et al., 1991).

Zumindest von einigen der in vitro gezeigten Differenzierungsprozesse ist

bekannt, dass sie in vivo sehr ähnlich sind:

Zum Beispiel wurde in unseren Experimenten WNT1 während der zellulären

Differenzierung in vitro früh exprimiert und anschließend herrunterreguliert.

Dieses transiente Expressionsmuster ist auch bereits in vivo gezeigt worden

(Mastick et al., 1996; McMahon et al., 1992). Bain et al. konnten allerdings die

transiente Expression von WNT1 in vitro nicht zeigen (Bain et al., 1996), was

wahrscheinlich damit zusammenhängt, dass die Differenzierung an Tag 5 nach

Readhäsion abgebrochen wurde, wogegen in unserer Arbeit die RNA auch an

Tag 9 kontrolliert wurde.

Auch Nestin wurde in vitro in unseren Untersuchungen und wird in vivo

transient exprimiert. Hierzu passende in vivo-Daten liegen in der Literatur vor:

Nestin wird in vivo hauptsächlich in den Stammzellen des ZNS im Neuralrohr

gebildet. Am Ende der neuronalen Differenzierung wird die Expression von

Nestin verringert und später durch Neurofilament ersetzt (Yang et al., 2001).

PAX6 wurde in vitro früh hochreguliert und wird auch in vivo während der

embryonalen Entwicklung früh exprimiert, zunächst am E 8 im Vorderhirn und

Hinterhirn (Gajovic et al., 1997).

OTX2 wird in vivo zunächst im Epiblast produziert und später wird die

Expression auf das anteriore Neuroektoderm begrenzt, wo es für das Vorder-

und Mittelhirn benötigt wird. OTX1 wird zunächst im Neuroektoderm im

dorsalen Telencephalon exprimiert, und die Interaktionen der beiden OTX Gene

bewirken die Spezifizierung der Entwicklung von Mittelhirn und Hinterhirn

(Acampora et al., 1999). Dieses Verhalten könnte sich in unserem in-vitro-

Modell wieder spiegeln: OTX1 wurde während der späten Differenzierung

Diskussion 82

hochreguliert. OTX2 wurde von den undifferenzierten ES-Zellen und während

der späteren zellulären Differenzierung gebildet.

Gajovic et al. hat die Genexpression nach in-vitro-Differenzierung (d5) mit E

11,5 alten Embryos in vivo verglichen. Dabei zeigte sich, dass die meisten

Gene, die in vitro exprimiert werden auch in vivo aktiv sind (Gajovic et al.,

1998).

Wir können daher davon ausgehen, dass die von uns in vitro aufgedeckten

unterschiedlichen Genexpressionsmuster mit großer Wahrscheinlichkeit auf ein

Mausmodell übertragbar sind.

5.2 Auswirkung der Inaktivierung von PBX1 in embryonalen Stammzellen auf die in-vitro-Differenzierung

Interessant war im Anschluss an die Etablierung des in-vitro-

Differenzierungssystems der Vergleich zwischen den WT- und den PBX1-K.O.-

Zelllinien.

Unsere Untersuchungen haben gezeigt, dass alle Zelllinien, WT-ES-Zelllinie,

PBX1(+/-)-Zelllinie und beide PBX1(-/-)-Zelllinien in der Lage waren,

morphologisch gleichaussehende Embryoidkörperchen zu bilden. Diese

Beobachtung war nicht überraschend, da PBX1 von den undifferenzierten WT-

ES-Zellen nicht gebildet wurde und die Expression erst während der zellulären

Differenzierung hochreguliert wurde.

Im differenzierten Zustand zeigten sich Unterschiede zwischen den WT-Zellen

und den PBX1-K.O.-Zellen. Morphologisch zeigten die PBX1-K.O.-Zellen ein

ausgeprägtes Netzwerk neuronaler Fortsätze. Dieses Netzwerk unterschied

sich im Aufbau von den WT-Zelllinien. Bei den WT-Zelllinien wurden die

neuronalen Auswüchse strangförmig angeordnet und die neuronalen Fortsätze

begannen proximal an den Embryoidkörperchen. Bei den PBX1-K.O.-ES-Zellen

waren die neuronalen Fortsätze zwar vermehrt sichtbar, aber ungeordneter und

eher flächenhaft deckend. Immunzytochemische Untersuchungen zeigten, dass

sich in den PBX1-K.O.-Zelllinien mehr β-Tubulin positive Neurone entwickelten

als in den WT-Zelllinien. Die RT-PCR Ergebnisse bestätigten diese

Beobachtung dadurch, dass die neuronalen Marker nach der zellulären

Differenzierung der PBX1-K.O.-Zelllinien mehr exprimiert wurden als der WT-

Diskussion 83

Zelllinien. Auch die Microarray Analyse konnte diese Hypothese unterstützen.

Bei den PBX1-K.O.-Zelllinien wurden mehr neuronale Gene während der

zellulären Differenzierung hochreguliert als bei den WT-Zelllinien. Somit können

wir die Schlussfolgerung ziehen, dass die Inaktivierung des PBX1 Gens in den

ES-Zellen einen neuroektodermalen Shift während der zellulären

Differenzierung bewirkt.

Unsere Untersuchungen zeigten auch, dass alle ES-Zelllinien unterschiedlichen

Genotyps zum Teil in Muskelzellen differenzierten. Ähnlich wie bei den

neuronalen Markern wurden interessanterweise die myogenen Marker stärker

von den beiden PBX1-K.O.-Zelllinien exprimiert als von den WT-Zelllinien.

Andere endodermale Marker, wie z.B. Aquaporin wurden von den WT-Zelllinien

stärker hochreguliert als von den PBX1-K.O.-Zelllinien.

Viele Gene wurden aus verschiedenen funktionellen Gruppen von den WT- und

PBX1-K.O.-Zellen unterschiedlich exprimiert. Die Anzahl dieser Gene betrug in

unseren Mikroarray-Untersuchungen ca. 260. Aus jeder Gengruppe wurden

einige Vertreter von den WT-Zelllinien und andere von den PBX1-Zelllinen

stärker exprimiert, so dass eine gruppeninterne Analyse nicht möglich war.

Folgende funktionelle Gruppen zeigten unterschiedliche Expressionsmuster

zwischen den WT- und PBX1-K.O.-Zelllinien:

• Zytoskelett und extrazelluläre Matrix: Diese Gene werden während

der frühen Differenzierung hochreguliert und sind wichtig für die

Stabilität, Motilität und Apoptose von Zellen (Evans, 1998; Oshima et al.,

1996).

• Proteasen und Proteaseinhibitoren: Diese Gene spielen eine wichtige

Rolle in der Entwicklung der Maus, indem sie die extrazelluläre Matrix

modulieren, sowie zelluläre Migration und Invasion regulieren (Afonso et

al., 1997; Hamilton et al., 1991).

• Wachstumsfaktoren und deren Rezeptoren: Diese Gene üben

essentielle Funktionen während des embryonalen Wachstums und der

Entwicklung aus und werden auch in den differenzierten Zellen induziert.

Sie sind wichtige Regulatoren der Zellproliferation und Differenzierung

(Kelly et al., 1990; Mummery et al., 1990).

• Transkriptionsfaktoren: Viele dieser Gene sind in die zelluläre

Differenzierung involviert (McGinnis and Krumlauf, 1992).

Diskussion 84

• Enzyme: Diese Gene decken sehr unterschiedliche, aber vielfältige

Aufgabenbereiche.

Die Entwicklung der sich differenzierenden Stammzellen hängt von einer

Großzahl an Faktoren ab, wie z.B. Wachstumsfaktoren, Signalmolekülen und

extrazellulären Matrixproteinen. Die Funktionen dieser Faktoren und ihre

wechselseitige Interaktionen sind noch nicht vollkommen verstanden. Es war im

Rahmen der vorliegenden Arbeit nicht möglich, im einzelnen auf alle Gene

einzugehen. Die auffälligsten unterschiedlichen Genexpressionsmuster

zwischen WT- und PBX1-K.O.-Zelllinien werden in Kapitel 5.3 näher diskutiert.

Wir können schlussfolgern, dass die PBX1(-/-)-Zellen mehr als die

Wildtypzelllinien neuroektodermal und mesodermal differenzierten und dass bei

den PBX1-K.O.-Zellen der endodermale Differenzierungsweg supprimiert

wurde. Eine mögliche Erklärung für dieses Phänomen ist, dass durch die

Inaktivierung von PBX1 in den PBX1-K.O.-Zelllinien während der

Differenzierung andere Genaktivierungskaskaden stimuliert wurden als in den

WT-Zelllinien.

5.3 Vergleichende Charakterisierung der Genexpressionsmuster in WT und PBX1-K.O.-Zellen zur Identifikation von potentiellen Zielgenen

Wir können davon ausgehen, dass diejenigen Gene, die von den WT-Zelllinien

und von den PBX1-K.O.-Zelllinien unterschiedlich reguliert wurden, als

potentielle PBX1-Zielgene in Frage kommen. Um nach unterschiedlichen

Genexpressionsmustern zu fahnden, wurden RT-PCR Untersuchungen und

Genexpressionsanalysen durchgeführt.

Bei den RT-PCR Untersuchungen war das Genexpressionsmuster in PBX1-

K.O.-Zelllinien von WNT1, BMP4 und FGF15 interessant. Diese Befunde

werden im Kapitel 5.3.1 und 5.3.2 näher diskutiert.

Bei der vergleichenden Genexpressionsanalyse zwischen differenzierten WT-

Zelllinien und differenzierten PBX1(-/-)-Zelllinien war der Wert des Faktor („-fold

change“) bei der IGF-Familie und Colipase mit Abstand am höchsten. Diese

beiden Genfamilien werden deshalb in Kapitel 5.3.3 und 5.3.4 näher diskutiert.

Die Ergebnisse unsere RT-PCR Untersuchungen und Mikroarray-Analyse

Diskussion 85

machen es sehr wahrscheinlich, das die in den folgenden Kapiteln

beschriebenen Gene von PBX1 reguliert werden. Unser in-vitro-Modell erlaubt

allerdings keine Schlussfolgerungen über die Form der Regulation. Ziel der

nachstehende Kapitel ist es, diese Gengruppen vorzustellen und spekulativ die

Rolle der PBX1-Regulation in diesen Gengruppen darzustellen.

5.3.1 WNT1 und BMP4

Die Ergebnisse unserer RT-PCR Untersuchungen zeigten, dass die WNT1-

Expression zwar in den PBX1-K.O.-Zelllinien zeitgleich mit den WT-Zelllinien

induziert wurde, aber im Spätstadium der zellulären Differenzierung nicht wie

bei den WT-Zelllinien herrunterreguliert, sondern weiter hochreguliert wurden.

BMP4 verhielt sich bezüglich des Genexpressionsmusters gegenläufig zu

WNT1. Unsere PCR Ergebnisse weisen daraufhin, dass WNT1 und BMP4

gegenläufig von PBX1 reguliert werden.

Die gegensätzliche Wirkungsweise von WNT1 und BMP4 wurde auch in vivo in

der frühen Mausentwicklung beobachtet, wo BMP4 die Entwicklung des

Mesoderms steuert und WNT1 die Bildung des Neuroektoderms determiniert

(Czyz and Wobus, 2001). Analysen von mutanten Allelen von WNT1, entweder

spontan generiert (Thomas et al, 1991) oder durch homologe Rekombination

(Thomas and Capecchi, 1990; McMahon and Bradley, 1990) haben gezeigt,

dass WNT1 v.a. für die Entwicklung des Mittelhirns wichtig ist (Thomas and

Capecchi,1990; McMahon and Bradley, 1990; Thomas et al, 1991; McMahon et

al.1992). Die Inaktivierung von BMP4 führt zur frühen embryonalen Letalität

aufgrund mesodermaler Defekte (Mishina et al., 1995). Die genauen

Mechanismen der biochemischen Kaskaden von WNT1 und BMP4 sind noch

nicht bekannt. Der momentan angenommene Signaltransduktionsweg von

WNT1 ist in Abbildung 5-3 dargestellt. Es ist schwer abschätzbar, wie PBX1 in

die Regulation dieser Kaskade eingreift. Weitere Untersuchungen müssen

hierzu durchgeführt werden.

In Drosophila allerdings gehört die WNT und BMP-Familie bereits zu den

Zielgenen von Extradenticle (Exd), dem Homolog von PBX1 (Rauskolb and

Wieschaus, 1994). Wegen der Homologie zu Drosophila (71% Homologie

zwischen Exd und PBX) kann erwartet werden, dass PBX1 diese Zielgene auch

bei den Mammalien reguliert.

Diskussion 86

Abb. 5-3: Wnt-Signaltransduktion. WNT1 interagiert mit Frizzle class Rezeptoren an der Zelloberfläche und aktiviert somit sogenannte „dishevelled“ Proteine, die die Glykogen Synthase Kinase (GSK-3) inhibieren. Die Inhibition führt zu einer Stabilisierung und Akkumulation von unphosphoryliertem β-Catenin (Gradl et al., 1999). β-Catenin tritt in den Nukleus und interagiert mit verschiedenen Transkriptionfaktoren: TCF, LEF, Smad4 und triggert damit die Transkription von Zielgenen wie Brachyury und Connexin 43 (Ai et al., 2000; Yamaguchi et al., 1999). In der Abwesenheit von WNT wird β-Catenin durch die Glykogen Synthase Kinase (GSK-3) phosphoryliert und daraufhin abgebaut (Cadigan and Nusse, 1997; Gradl et al., 1999; Nusse, 1999). AG Hecht, IMMZ, Freiburg

In unseren Untersuchungen führte die Inaktivierung von PBX1 zur Verhinderung

der Differenzierungs-assoziierten Repression von WNT1. Diese Beobachtung

könnte die verstärkte Neuronalisierung der PBX1-K.O.-ES-Zellen erklären, denn

WNT1 induziert in vivo die Differenzierung ins Neuroektoderm und die PBX1-

K.O.-Zellen exprimierten während der späten Differenzierung mehr WNT1 als

die WT-Zellen. Allerdings gibt es noch keine Erklärung für die Beobachtung,

dass die PBX1 Inaktivierung nicht zu einer Repression myogener Marker führt.

Man könnte erwarten, dass die vermindert Produktion von BMP4 zur

Repression myogener Marker führt. Allerdings spielen bei dem

Differenzierungsweg viele Faktoren eine Rolle und die Mikroarray-Analyse

zeigte, dass die PBX1-Inaktivierung die Expressionsmuster von mehreren

funktionell unterschiedlichen Gengruppen veränderte. Ein interessantes

Anschlussprojekt wäre es somit, zu untersuchen, ob PBX1 WNT1 oder BMP4

direkt reguliert.

Diskussion 87

5.3.2 FGF15

Die Ergebnisse der RT-PCR Untersuchungen zeigten, dass das

Expressionsmuster von FGF15 in WT- und PBX1-K.O.-Zelllinien während der

zellulären Expression unterschiedlich war. In den PBX1-K.O.-Zelllinien wurde

die Expression von FGF15 zwar zeitgleich mit den WT-Zelllinien induziert, aber

wurde im Spätstadium der zellulären Differenzierung nicht wie bei den WT-

Zelllinien herrunterreguliert, sondern weiter hochreguliert.

FGF15 wird in vivo während der Embryogenese nur im fetalen Gehirn gebildet

und spielt eine wichtige Rolle in der Regulation von Zellteilung und

Segmentierung in spezifischen Regionen im embryonalen Gehirn, Rückenmark

und sensorischen Organen (McWhirter et al., 1997). Die Expression von FGF15

erscheint auch in vivo während der frühen embryonalen Entwicklung: zunächst

am E 7,5 im Neuroektoderm, später im Mittelhirn und Dienzephalon (E8,5-E9),

dann im Mesencephalon und Bulbus olfactorius (E9,5-E12) (McWhirter et al.,

1997).

Interessanterweise reguliert E2A-PBX1 direkt die Transkription von FGF15

reguliert (McWhirter et al., 1997). Es bleibt jedoch unklar, ob diese Regulation

auf der Fusion von PBX1 zu E2A beruht oder auch die normale Funktion von

PBX1 reflektiert. Die Ergebnisse unserer RT-PCR Untersuchungen lassen

vermuten, dass FGF15 von PBX1 reguliert wird. Die direkte Regulation der

FGF15-Expression durch PBX1 muss jedoch noch in zukünftigen

Untersuchungen erst nachgewiesen werden.

5.3.3 IGF-Familie

Die Fehlregulation der IGF-Familie während der zellulären Differenzierung von

homozygoten PBX1-K.O.-ES-Zellen scheint uns von besonderem Interesse zu

sein. Während IGF1 und der IGF1R von den PBX1-K.O.-ES-Zellen nach der

zellulären Differenzierung etwas höher reguliert wurden als von den WT-Zellen,

wurden IGF2 und IGF2R nach der zellulären Differenzierung von PBX1-K.O.-

ES-Zellen fast gar nicht exprimiert. Die Ergebnisse sind sehr eindrucksvoll, da

die Genexpressionsmuster stark unterschiedlich zu denen der WT-Zellen

waren, und lassen auf eine PBX1-Regulierung schließen, die weiter untersucht

werden sollte.

Diskussion 88

Salmon and Daughaday haben gezeigt, dass das Somatotropin über

Somatomedine (IGF1/Somatomedin C und IGF2/Somatomedin A) und Insulin

wirkt (Salmon and Daughaday, 1990). Somatomedine weisen untereinander

eine hohe Sequenzhomologie auf und haben ein ähnliches Spektrum an

biologischen Funktionen. Sie spielen eine große Rolle beim präadolescenten

Wachstum, bei metabolischer Regulationen und beeinflussen die fetale

Zellteilung und Differenzierung. Sie spielen eine wichtige Rolle in der

embryonalen Entwicklung und sind an der Zellproliferation und Differenzierung

vieler Organe und Gewebearten beteiligt. Sie wirken über drei Zellrezeptoren

und ihre Funktion wird durch sechs Bindungsproteine beeinflusst. Die Aufgabe

der Bindungsproteine ist wahrscheinlich, die IGFs an den Rezeptor zu führen

und ihre Aktivitäten zu modulieren. IGFs werden hauptsächlich in der Leber

gebildet, aber auch in anderen Geweben und in fast allen Geweben werden

autokrine oder parakrine Aktivitäten gefunden. Der Rezeptor Typ1 vermittelt die

meisten biologischen Effekte von IGF1 und IGF2. Der IGF2 Rezeptor ist in die

IGF2 Degradation involviert (O'Dell and Day, 1998).

IGF1 und IGF2 und die Rezeptoren werden durchweg während der

Embryogenese des ZNS exprimiert (Ayer-le Lievre et al., 1991).

Die genaue Verteilung von IGF1-, IGF2- und Insulin-Rezeptoren im Rattenhirn

während der Entwicklung bis zum Erwachsenenalter sind in der Literatur

beschrieben (Kar et al., 1993). IGF1 und 2 scheinen eine Rolle bei der DNA

Synthese und Zellproliferation fetaler Gehirnzellen, bei der

Oligodendrozytendifferenzierung, bei der Bildung von Axonen, der Regulation

von Neurotransmittern und der Hormonausschüttung zu spielen. Das

Expressionsniveau von Gen, Protein und Rezeptor ist während der Entwicklung

höher als im Erwachsenenalter. Insulin partizipiert in der Regulation und

Reifung des Gehirns und spielt als Neuromodulator im ZNS eine Rolle. Die

höchste Expressionsrate dieser Liganden wird im Bulbus olfactorius, Kortex,

Hippocampus, Plexus choroideus und im Cerebellum gefunden. In all diesen

Regionen verteilen sich die einzelnen Rezeptoren auf distinkte Subareale. Zum

Beispiel wird im Cerebellum der IGF2R im Stratum granulosum, der Insulin-

Rezeptor im Stratum moleculare und IGF1R in beiden Zellschichten gefunden.

Die höchste Expressionsrate zeigt sich in der späten embryonalen und frühen

postnatalen Entwicklung, die dann bis ins Erwachsenenalter allmählich absinkt.

Diskussion 89

Beim Menschen bleibt im Gegensatz zur Maus die IGF2-Expression postnatal

erhalten. In der adulten Maus ist die Expression auf den Plexus choroideus und

die Leptomeningen reduziert (Kar et al., 1993).

5.3.3.1 IGF1

Unsere Northern-Blot-Analyse bestätigte das Mikroarray-Ergebnis, dass IGF1

während der zellulären Differenzierung von den PBX1-K.O.-Zellen höher

hochreguliert wurde als von den WT-K.O.-Zellen.

Die IGF1-Expression ist in vivo in der Ratte am höchsten während der

embryonalen Entwicklung des ZNS, wird aber auch noch endogen im adulten

Gehirn produziert, z. B. im Hippocampus, Bulbus olfactorius und im Cerebellum.

Hinzu kommt, dass IGF1 die Blut-Hirn-Schranke passiert. Deswegen wird das

ZNS zusätzlich von zirkulierendem IGF1 mitbeeinflusst (Anderson et al., 2002).

IGF1 spielt eine Rolle bei der Neurogenese, wobei sein Einfluss auf die

Entwicklung des ZNS gut untersucht ist. Es zeigten sich Effekte auf

verschiedende Stadien der Entwicklung, wie z.B. Zellproliferation,

Differenzierung und Überlebensrate (Anlar et al., 1999). IGF1-K.O.-Mäuse

entwickeln weniger neuronale Zellen in vivo (Beck et al., 1995). Mäuse, die

IGF1 überexprimieren, entfalten ein größeres Gehirn (Ye et al., 1995; Ye et al.,

1996). Es ist belegt, dass IGF1 mitogen auf sympathische Neuroblasten wirkt

und das Wachstum sympathischer neuronaler Fortsätze stimuliert (Caroni and

Grandes, 1990; DiCicco-Bloom and Black, 1988; Mill et al., 1985). Es fördert

außerdem die Differenzierung postmitotischer Neurone auch in vitro

(Arsenijevic and Weiss, 1998; Drago et al., 1991; Hughes et al., 1993).

IGF1 beeinflusst sowohl die frühe bzw. die späte Entwicklung des ZNS, wobei

die molekularen Mechanismen noch nicht bekannt sind (Arsenijevic and Weiss,

1998; D'Ercole et al., 2002).

Passend zu den oben zitierten Literaturbefunden könnte also die von uns

beobachtete IGF1-Hochregulierung der PBX1-K.O.-ES-Zellen ein Grund dafür

sein, dass die PBX1-K.O.-ES-Zellen mehr neuronale Zellen produzieren und

dass diese Zellen mehr neuronale Auswüchse hervorbringen.

Diskussion 90

5.3.3.2 IGF1R

Unsere Northern-Blot-Analyse zeigte, dass IGF1R während der zellulären

Differenzierung von den PBX1-K.O.-Zellen höher hochreguliert wurde als von

den WT-K.O.-Zellen (Abb. 4-31).

IGF1R wirkt sowohl in vitro als auch in vivo mitogen und kann Zellen vor

apoptotischen Signalen schützen. Es induziert Zelldifferenzierung und spielt

eine wichtige Rolle in der Transformation von Zellen. Der IGF1R ist aber auch

in der Lage, das Wachstum zu inhibieren (Baserga, 2000).

IGF1R-K.O.-Mäuse sterben kurz nach der Geburt aufgrund respiratorischen

Versagens und weisen Muskelhypoplasien, verspätete Ossifikation und

Hautverdünnung auf (Liu et al.1993).

Die Tatsache, dass IGF1R in unserem in-vitro-Modell hochreguliert wurde

könnte damit zusammenhängen, dass IGF2 selbst nur wenig produziert wird.

IGF2 wirkt während der embryonalen Entwicklung hauptsächlich über den

IGF1R. Eine geringere Konzentration an IGF2 könnte die Produktion von IGF1R

stimulieren.

5.3.3.3 IGF2

Unsere Northern-Blot-Analyse bestätigte, das IGF2 sowohl im undifferenzierten

Stadium als auch während der zellulären Differenzierung kaum von den PBX1-

K.O.-Zellen exprimiert wurde, wogegen IGF2 während der zellulären

Differenzierung von den WT-ES-Zellen sehr stark hochreguliert wurde.

Die IGF2-Expression unterliegt im Mausembryo in vivo dem genomic imprinting

und wird deshalb nur von einem Allel abgelesen. Die Expression von IGF2

erfolgt nur während der embryonalen und frühen postnatalen Entwicklung,

Ausnahmen sind der Plexus choroideus und die Leptomeningen, in denen die

Expression biallel und lebenslang erfolgt (Stylianopoulou et al., 1988). IGF2

wird vom väterlichen Allel exprimiert und H19 vom mütterlichen Allel. Sie zeigen

reziproke topische und zeitliche Spezifitäten. Das humane IGF2 Gen wird von

vier Promotoren transkribiert. Im Erwachsenen wird IGF2 von Promotor 1 (P1)

biallel transkribiert. In der Maus und der Ratte gibt es den humanen P1

Promotor nicht, und die Promotoren P2-P4 werden an Stelle von den

Promotoren P1-P3 genutzt (Vu and Hoffman, 1994). In der Maus ist allerdings

ein neuer Promotor beschrieben worden (P0), welcher zur paternalen

Diskussion 91

Expression eines Transkripts von Exon 4-6 führt, das spezifisch in der Plazenta

gebildet wird (Moore et al., 1997). IGF2 beeinflusst das Wachstum und die

Funktion der Plazenta (Constancia et al., 2002).

Während der frühen Entwicklung wird in der Maus IGF2 mRNA und Protein

zunächst im primitiven Endoderm (E 6,5), später im extraembryonalen

Mesoderm (E 7) und dann im anterior-proximalen und lateralen Mesoderm

produziert. Später wird es vor allem stark in Mesoderm Derivaten exprimiert

(Lee et al., 1990).

IGF2(+/-)-K.O.-Mäuse zeigen eine signifikante fetale Wachstumsretardierung.

Die Wachstumsretardierung tritt vor dem 16. embryonalen Tag auf und

persisiert nach der Geburt. Möglicherweise ist sie durch verschlechterte

trophische Funktionen der Plazenta zu erklären. Die Mäuse sind lebensfähig

und fertil (DeChiara et al., 1990). Transgene Mäuse, die IGF2 konstitutiv

überexprimieren, zeigen keine ZNS Veränderungen (D'Ercole et al., 2002).

Nach verschiedenen in-vitro- und in-vivo-Untersuchungen an murinen ES-

Zellen wurde ein funktionelles Modell vorgeschlagen, in dem IGF2 über IGF1R

an der Oberfläche von mesodermalen Vorläuferzellen die Bildung von

Mesodermzellen stimuliert (Morali et al., 2000).

Die Regulation von IGF2 ist sehr komplex. Die Tatsache, dass IGF2 in unseren

Untersuchungen den Marker mit dem auffälligsten Unterschied zwischen den

PBX1-K.O.-ES-Zellen und den WT-Zellen darstellt, sollte in weiteren

Untersuchungen Anlass sein, die PBX1-Regulation näher zu untersuchen, da

unsere Ergebnisse zwar Korrelationen zeigen, doch nicht eindeutig belegen,

dass PBX die IGF-Familie direkt reguliert.

In diesem Zusammenhang wäre es auch interessant zu untersuchen, in

welchen Zelltypen PBX1 das IGF-System beeinflusst.

5.3.3.4 IGF2R

Unsere Northern-Blot-Analyse bestätigte, dass IGF2R zwar im undifferenzierten

Stadium von den PBX1-K.O.-Zellen exprimiert wurde, aber während der

zellulären Differenzierung stark herunterreguliert wurde, wogegen IGF2R

während der zellulären Differenzierung von den WT-ES-Zellen hochreguliert

wurde.

Diskussion 92

IGF2R-K.O.-Mäuse sterben perinatal aufgrund gravierender kardialer

Abnormalitäten. Sie sind 25%-30% größer als die WT-Mäuse und haben

erhöhte IGF2 und IGF-BP Konzentrationen (Lau et al., 1994).

Die Hauptaufgabe von IGF2R besteht in der Degradation von IGF2 und damit in

der Kontrolle des IGF2 Spiegels. Warum IGF2R in unserem Versuchssystem

von den PBX1-K.O.-ES-Zellen während der zellulären Differenzierung so stark

herunterreguliert wurde, bleibt unklar. Eine mögliche Erklärung ist, dass die

geringe Konzentration, die an IGF2 noch vorhanden ist, durch

Herrunterregulation von IGF2R vor einem Abbau durch Internalisation geschützt

wird.

5.3.3.5 H19

Unsere Northern-Blot-Analysen zeigten, dass H19 stärker von den PBX1-K.O.-

Zellen als von den WT-Zellen während der zellulären Differenzierung

hochreguliert wurde.

H19 und IGF2 werden während der fetalen und frühen postnatalen Phase in

vivo reziprok exprimiert und zeigen reziproke topische und zeitliche

Genexpressionsmuster (Kaffer et al., 2001). Hierzu passt unsere Beobachtung,

dass die Herunterregulierung von IGF2 in den PBX1-K.O.-Zellen bei unserem

Differenzierungssystem mit einer Hochregulierung von H19 einhergeht.

Das aktuelle Modell (Reik and Murrell, 2000; Thorvaldsen and Bartolomei,

2000) zum genomic imprinting von IGF2 und H19 besagt, dass die Expression

von diesen Genen durch Konkurrenz von verschiedenen Promotern um eine

gemeinsame Gruppe von Enhancern reguliert wird. Die Expression des

Monoallels des jeweiligen Gens hängt von einem gemeinsamen cis-acting

element – ICE (imprinting control element) ab. ICE liegt upstream von dem H19

Promoter. Sequenzen innerhalb dieser Region sind hypermethyliert, vor allem

auf dem paternalen Allel. Differentiell methylierte Regionen (DMR) sind

identifiziert worden. Auf dem paternalen Allel wird die Expression von IGF2

ermöglicht, weil die H19 Transkription durch DNA-Methylierung inaktiviert wird.

Beim maternalen Allel wird die Aktivität des Enhancers bevorzugt zum

unmethylierten H19 Promotor gesteuert. Hier scheint es sich mehr um eine

Enhancer Konkurrenz zu handeln. Die Expression von IGF2 wird reprimiert,

aber keinem vollständigen Silencing unterworfen. Die bevorzugte Expression

Diskussion 93

von H19 lässt sich wahrscheinlich dadurch erklären, dass die Enhancer näher

an H19 als an IGF2 liegen. Der Methylierunsgrad von DMR unterscheidet sich

in den verschiedenen Gewebetypen und Entwicklungsphasen und wird

während der frühen Embryogenese festgelegt (Kaffer et al., 2001; Kaffer et al.,

2000).

Die durch die Inaktivierung von PBX1 bedingte Fehlregulation der IGF-Familie

ist eine interessante Neuentdeckung, die mit Sicherheit Gegenstand der

Forschung bleiben wird und evtl. mögliche Erklärungsansätze für den Phänotyp

der PBX1-K.O.-Maus bietet (Kap. 5.4).

5.3.4 Colipase

Auch die Colipase gehört zu den Genen, die in unseren Untersuchungen eine

Fehlregulation in PBX1-K.O.-Zellen aufwiesen. Colipase wurde während der

zellulären Differenzierung nur in geringen Mengen von den PBX1-K.O.-Zellen

im Vergleich zu den WT-Zellen hochreguliert.

Colipase wird in vivo im Pankreas, Magen und Darm produziert. Pankreatische

Colipase ist ein 12-kD Polypeptid Kofaktor für pankreatische Lipase, ein Enzym,

das essentiell für die Fettresorption ist (Lowe, 1994). Die Colipase-K.O.-Maus

zeigt, dass Colipase aber auch von der Lipase unabhängige Funktionen haben

muss (D'Agostino et al., 2002). In vitro stellt Colipase die Aktivität der

pankreatischen Lipase auch in Anwesenheit von Inhibitoren wie Gallensäuren,

Phospholipiden und Speiseproteinen wieder her. Colipase wird aus einer

Proform, Procolipase, synthetisiert. Procolipase(-/-)-K.O.-Mäuse zeigen eine

reduzierte postnatale Überlebensrate, reduzierten Gewichtsgewinn, Stearrhö

nach fettreicher Nahrung und auch reduziertes Körpergewicht nach fettarmer

Nahrung (D'Agostino et al., 2002).

Die Regulation von Colipase durch PBX1 ist bisher noch nicht in der Literatur

beschrieben und bietet möglicherweise auch neue Erklärungsansätze für den

Phänotyp der PBX1-K.O.-Maus.

Diskussion 94

5.3.5 Zusammenfassende Darstellung potentieller Zielgene von PBX1

Die im in-vitro-Modell gezeigten unterschiedlichen Genexpressionsmuster

zwischen den WT-ES-Zellen und den homozygoten PBX1-K.O.-Zellen sind sehr

interessant, weil verschiedene publizierte Arbeiten gezeigt haben, das PBX1 mit

HOX-Proteinen und Meis-Proteinen interagiert und Zielgene reguliert (Popperl

et al., 1995; Rauskolb and Wieschaus, 1994) (Kap. 1.4). PBX1 ist in der Lage,

sowohl die Bindungsaffinität und Spezifität zur DNA, als auch ihre

Transkriptionsaktivität zu erhöhen. Beispielsweise erkennt die Mehrheit der

HOX-Monomere das DNA-Motiv TAAT, während HOX-PBX und PBX-Meis viel

längere DNA-Motive erkennen, was in höherer Affinität und Spezifität von

möglichen DNA-Bindungen resultiert (Knoepfler et al., 1997).

Es ist bisher wenig bekannt über die direkten Zielgene von PBX1. Am besten

charakterisiert sind als Zielgene die HOX-Gene selber. Es ist bekannt, das

HOX-Gene sich selbst regulieren. So enthält beispielsweise HOXb1 ein

autoregulatives Element (ARE) mit drei Bindungsstellen für PBX1 (McWhirter et

al., 1997).

Saleh et al. konnten zeigen, dass diese HOX-PBX-Komplexe durch bestimmte

Signale von Repressoren in Aktivatoren umgewandelt werden können und

diese Umwandlung auch in zelltypspezifischer Weise erfolgt. Unter bestimmten

zellulären Bedingungen überwiegen die Korepressoren gegenüber Aktivatoren

und der Komplex wird repressiv. Allerdings kann sich unter der Wirkung von

Proteinkinase A, Zellaggregation, Anstieg der Koaktivatoren und/oder

Verringerung der Korepressoren die Balance verschieben. Der Komplex bewirkt

dann eine Aktivierung der Zielgene (Abb. 5-4) (Saleh et al., 2000). Die oben

beschriebenen Gene (WNT1, FGF15, IGF und Rezeptoren, Colipase) könnten

als Zielgene dieses Komplexes eine Rolle spielen.

Abb. 5-4: Vereinfachte Darstellung der Regulation der Zielgenexpression durch HOX- und PBX-Gene. Nähere Erläuterungen im Text. „AD“= HOX activation domain „RD“= PBX repression domain (modifiziert nach Saleh et al., 2000)

Diskussion 95

5.4 Korrelation des zuvor beschriebenen in-vitro-Differenzierungssystems mit einem in vivo PBX1-K.O.-Maus-Modell

M. Kolanczyk etablierte in unserer Arbeitsgruppe PBX1-Knock-out-Mäuse. Die

Analyse dieser PBX1-K.O.-Mäuse erfolgte parallel zu den Untersuchungen des

in-vitro-Differenzierungssystems. Obwohl die Charakterisierung des Phänotyps

dieser PBX1-K.O.-Mäuse zum Teil bereits publiziert wurde (Kap. 1.4), fehlt noch

das molekulare Verständnis über die Ursachen der Entstehung des Phänotyps.

Die Korrelation der Daten des in-vitro-Systems mit dem in-vivo-Modell könnte

daher interessante Ergebnisse liefern. Zunächst sollten die unterschiedlichen

Genexpressionsmuster in vivo bestätigt werden. Die unterschiedlichen

Expressionsmuster können dann bestimmte Aspekte des Phänotyps erklären.

Ein mögliches Anschlussprojekt wird in Kapitel 5.4.1 exemplarisch vorgestellt.

Die in unserer Arbeitsgruppe etablierten PBX1-K.O.-Mäuse zeigen bisher den in

der Literatur bereits beschriebenen Phänotyp (DiMartino et al., 2001; Kim et al.,

2002; Selleri et al., 2001), obwohl bei unseren PBX1-K.O.-Mäusen selektiv die

PBX1-Homöodomäne eliminiert wurde. Die Mäuse mit einem totalen PBX1-K.O.

sterben während der embryonalen Entwicklung zwischen E 15,5 und E 16,5 mit

schweren Hypoplasien und Aplasien multipler Organsysteme

.

5.4.1 Rolle von PBX1 in der Entwicklung des Pankreas und in der Pathogenese des Diabetes

In bereits veröffentlichten Arbeiten wurde gezeigt, dass der Phänotyp von

PBX1-K.O.-Embryos eine Pankreashypoplasie und Defekte im exokrinen und

endokrinen Teil des Pankreas aufweist. In diesen Embryos ist die Expression

von ISL1 und ATOH5, zwei wichtigen Pankreasmarkern, reduziert, wohingegen

die Expression von PDX1, einen für die die Entwicklung des Pankreas

unentbehrlichen Transkriptionsfaktor, dagegen unverändert zum WT ist. Die

Expression von Glukagon und Insulin ist ebenfalls reduziert (Kim et al., 2002).

Interessanterweise zeigen auch die hetereozygoten Mäuse einen Phänotyp.

PBX1(+/-) Mäuse weisen eine Pankreasmalformation, eine pathologische

Glukosetoleranz und verminderte Insulinwerte auf. Diese Veränderungen sind

Diskussion 96

Konditionen, die mit dem Beginn von Diabetes mellitus assoziiert sind (Kim et

al., 2002).

Es ist bekannt, dass PBX1 die Aktivität von PDX1 reguliert (Dutta et al., 2001).

PDX1 spielt eine entscheidende Rolle in der Entwicklung des Pankreas und in

der Homöostase der Glukose. PDX1(-/-)-K.O.-Mäuse haben kein Pankreas

(Jonsson et al., 1994). PDX1(+/-)-Mäuse entwickeln sich zunächst normal,

zeigen aber im adulten Stadium eine Glukoseintoleranz (Ahlgren et al., 1998).

PDX1 wird hauptsächlich in β-Zellen exprimiert, ist aber auch in Azinuszellen

aktiv (Ahlgren et al., 1998). PDX1 beteiligt sich an der Aktivierung von

mindestens einem Azinus spezifischen Gen–Elastase I (Swift et al., 1998).

PDX1 ist alleine aktiv, aber auch als PDX-PBX-Komplex. PDX1 enthält das

entsprechende TGATTAAT Motiv, das die kooperative DNA-Bindung mit PBX1

ermöglicht. PBX1b und Meis2b können im Komplex mit PDX1 seine

transkriptionale Aktivität verändern. In Azinuszellen wirkt PDX1 im Komplex (bei

der Aktivierung von Elastase I), in β-Zellen jedoch allein (Liu et al., 2001;

MacDonald and Swift, 1998). PDX1PBX1-Komplexe sind während der

Entwicklung und der Regeneration des Pankreas essentiell für die Organisation

und Proliferation von duktalen, endokrinen und azinären Zelllinien (Dutta et al.,

2001).

Immunzytochemische Analysen zeigen eine teilweise Überschneidung von

PBX1- und PDX1-Expression im Pankreas der embryonalen und adulten Maus.

Diese Beobachtung zeigt auch, dass PBX1 sowohl PDX1-abhängige als auch

PDX1-unabhängige Pankreasfunktionen hat, die jedoch bisher nicht näher

charakterisiert sind (Kim et al., 2002).

Hier könnte die von uns beschriebene Fehlregulation von IGF nach PBX Verlust

eine große Rolle spielen. Der Diabetes mellitus Typ2 ist eine komplexe

metabolische Erkrankung, die durch eine verschlechterte Insulinwirkung im

peripheren Gewebe und eine gestörte Pankreas β-Zellfunktion charakterisiert ist

(White, 2002). Obwohl diese beiden Abnormalitäten miteinander einhergehen,

ist noch nicht klar, ob sie die gleiche Pathogenese haben. Insulin und dem IGF

Signalsystem wird im zunehmenden Maße eine Rolle für den Metabolismus des

Pankreas zugeschrieben. In der Entwicklung des Pankreas ist IGF2 für die

Regulation von Inselzellgröße und Differenzierung verantwortlich (Han et al.,

Diskussion 97

1988). IGF2 ist in den β-Zellen des Pankreas mit Insulin kolokalisiert (Maake

and Reinecke, 1993).

IGF2 wird eine zunehmende Bedeutung auch in der Pathogenese des Diabetes

mellitus Typ 2 zugeschrieben. Serradas et al. konnten zeigen, dass im Goto-

Kakizaki (GK) Fetus von Ratten, ein Modell für Diabetes mellitus Typ 2, die

IGF2-Expression in Leber, Pankreas und Serum reduziert ist. Die reduzierte

Expression von IGF2 im Pankreas von GK Feten könnte eine entscheidende

Rolle für Anomalität der β-Zellmasse in den fetalen GK Ratten spielen

(Serradas et al., 2002).

Die kombinierte Inaktivierung von Insulinrezeptor und IGF1 Rezeptor, aber

keine von beiden Mutationen allein, führt zu eine 90%igen Reduktion der Größe

des exokrinen Pankreas. Der Phänotyp wird bereits am E12,5 sichtbar. Daher

wird dieser Effekt wahrscheinlich auf IGF2 zurückzuführen sein (Kido et al.,

2002).

Die näheren Funktionen von PBX1 in der Entwicklung des Pankreas und der

Pathogenese des Diabetes mellitus soll in Folgeprojekten der vorliegenden

Arbeit in Kooperation mit dem Deutschen Diabetes Institut in Düsseldorf

untersucht werden. Die folgenden Experimente sind in Planung:

1. Bestimmung der Expression von β-Zell-Progenitormarkern in der

vorhandenen cDNA unserer differenzierten neuronalen Zellen

2. Differenzierung unserer PBX1(+/-)- und PBX1(-/-)-ES-Zellen zu β-Zellen

3. Untersuchung des Effekts von Überexpression von PBX1 in β-Inselzellen

4. Analyse der Expression von Progenitormarkern im Pankreas der PBX1-

K.O.-Mäuse

5. Elektronenmikroskopie von Inselzellen in den PBX1(+/-)-Mäusen

6. Etablierung einer konditionalen PBX1-K.O.-Maus

Diskussion 98

5.4.2 Rolle von PBX1 in der Hämatopoese

Die Hämatopoese

beinhaltet die Produktion

von unterschiedlichen

Reihen reifer Blutzellen

und wird durch

verschiedene

regulatorische Proteine

kontrolliert. Die Tatsache,

dass PBX1 im Rahmen

der prä-B akuten

lymphatischen Leukämie

mit der Translokation

t(1;19) identifiziert wurde,

suggeriert, dass auch

PBX1 eine Rolle bei der Regulation der Hämatopoese spielen könnte

(DiMartino et al., 2001).

Akute Leukämien sind maligne Erkrankungen unreifer hämatopoetischer

Progenitorzellen. Sie sind durch eine fehlende Ausreifung und unregulierte

Proliferation dieser Zellen gekennzeichnet. Bei ca. 75% der Patienten mit ALL

finden sich in den Leukämiezellen spezifische genetische Veränderungen, die

die Ursache für die Entstehung der malignen Erkrankung darstellen und die

Einteilung in Risikogruppen mitbestimmen (Abb. 5-5) (Koletzko and von

Harnack, 2000). Diese Veränderungen führen zu einer aberranten

Genexpression und beeinflussen dadurch die Proliferation, die Differenzierung

und die Überlebensrate der Zellen (Look, 1997).

In prä-B-Zell-Leukämien mit der Translokation t(1;19) wird PBX1 mit der

Aktivierungsdomäne des bHLH Transkriptionsfaktors E2a fusioniert (Carroll et

al., 1984). Patienten mit dieser Translokation gehören in die

Hochrisikokategorie und müssen mit einer aggressiveren Therapie behandelt

werden (Crist et al., 1990). E2A-PBX1 behält die Fähigkeit, an DNA zu binden

und mit HOX-Proteinen zu interagieren. Es wird vermutet, dass die E2A-PBX1

Fusion zum Teil die Transkriptionsfaktoren reguliert, die auch von PBX1

Abb. 5-5: Chromosomenveränderungen bei ALL. (aus Look, 1997)

Diskussion 99

reguliert werden. E2A-PBX1 verliert die Fähigkeit, mit Meis zu interagieren, so

dass es wahrscheinlich zur aberranten Expression von PBX/HOX Zielgenen

kommt (Knoepfler et al., 1997; Look, 1997).

McWhirter et al. zeigten, dass FGF15 zwar direkt von E2A-PBX1 reguliert wird,

allerdings nicht in t(1;19) positiven prä-B-Zelllinien. Dort bindet E2A-PBX1 nicht

an den Promotor und die Transkription von FGF15 wird auch nicht induziert. Es

wird vermutet, dass der Kofaktor, der für die FGF15 Induzierung notwendig ist,

nicht in prä-B Zellen exprimiert wird (McWhirter et al., 1997).

Bei der Übertragung der Zielgene von PBX1 auf t(1;19) positive prä-B ALL-

Zelllinien muß beachtet werden, dass zum einen die Fusion mit E2A zu

aberranten Funktionen führen kann und zum anderen Kofaktoren

unterschiedlich in verschiedenen Geweben exprimiert werden (McWhirter et al.,

1997). Eine direkte Übertragung unserer Ergebnisse auf Zellen mit E2A-PBX1

positive Zellen ist daher nicht möglich.

Hinzu kommt, dass die Mikroarray-Analyse von prä-B ALL mit der Translokation

t(1;19) keine signifikante Fehlregulation von IGF2 aufgedeckt hat (Yeoh et al.,

2002). Dies kann zum einen daran liegen, dass IGF2 kein Zielgen von E2a-

PBX1 ist, zum anderen daran, dass in der prä-B-Zelllinie andere Kofaktoren

eine Rolle spielen.

PBX1(-/-) Mäuse weisen eine Hypoplasie der fetalen Leber und eine starke

Anämie auf (DiMartino et al., 2001). Es sind allerdings sowohl kernhaltige als

auch entkernte Erythrozyten vorhanden. Eine definitive Hämatopoese findet

demnach statt, kann aber mit dem Wachstum des embryonalen Fetus nicht

mithalten. Ursachen dafür liegen in quantitativen und qualitativen Defekten in

verschiedenen Phasen der Hämatopoese. Die Anzahl als auch die Aktivität der

hämatopoetischen Stammzellen sind verringert. Dies gilt auch für die common

myeloid progenitors und die megakaryocyte / erythrocyte committed

progenitors. PBX1 wird also für die Erhaltung und nicht für die Initiierung der

definitiven Hämatopoese benötigt. PBX1 stimuliert die mitotische Amplifikation

der Vorläuferzellen und erzeugt damit reife Blutzellen (DiMartino et al., 2001).

Die Ursache auf molekularer Ebene ist nicht bekannt. Vielleicht spielt hier die

von uns dokumentierte Fehlregulation von IGF oder den HOX-Proteinen eine

Rolle.

Diskussion 100

Die IGF-Familie reguliert Proliferation und Differenzierung hämatopoetischer

Zellen (Zumkeller, 2002). IGF wirkt über spezifische Rezeptoren auf wachsende

und sich differenzierende Blutzellen. Das IGF System ist sehr komplex, es kann

sowohl aktivierend als auch inhibierend über die Interaktion mit IGF und IGF

Bindungsproteinen wirken. IGF stimuliert Erythrozyten und Lymphozyten, aber

steigert auch die leukämische hämatopoetische Zellproliferation (Zumkeller,

2002). IGF1 und 2 sind mitogene Faktoren, die von malignen Zellen sezerniert

werden. IGF2 wird während der Entwicklung im Knochenmark biallel abgelesen,

wobei die Expression im peripheren Blut weiterhin nur vom paternalen Allel

transkribiert wird (Morison et al., 2000). IGF1 reguliert prä-B-Zelldifferenzierung

(Landreth et al., 1992).

HOX-Proteine werden während der Hämatopoese in einem spezifischen

topischen und zeitlichen Muster exprimiert (Lawrence and Largman, 1992).

Mindestens 22 von 39 HOX-Genen werden in verschiedenen Subpopulationen

der CD34+ Progenitorzellen im Knochenmark exprimiert (Sauvageau et al.,

1994). Jedes dieser HOX-Gene hat einen eigenständigen Effekt z.B. führt die

HOXB4 Überexpression zu einer selektiven Expansion von primitiven

hämatopoetischen Stammzellen, die die Fähigkeit zur Differenzierung

beibehalten (Sauvageau et al., 1995). Mäuse, die HOXB3 überexprimieren,

weisen Defekte in der frühen B Zelldifferenzierung und myeloproliferative

Erkrankungen auf, die sich durch eine Splenomegalie und eine Expansion von

klonalen myeloiden Progenitorzellen zeigen (Sauvageau et al., 1997). Die

Pathogenese auf molekularer Ebene ist nicht bekannt.

Ein interessantes Anschlussprojekt an die vorliegene Arbeit wäre es, die Rolle

von PBX1 in der Hämatopoese zu untersuchen, auch hinsichtlich der von uns

gewonnenen Microarray Daten.

5.5 Schlussfolgerung und Perspektiven

Unsere Anwendung des neuronalen in-vitro-Differenzierungssystems an WT-,

PBX1(+/-)- und PBX1(-/-)-ES-Zellen erlaubte es uns, das Problem der frühen

Letalität von PBX1-K.O.-Mäusen zu umgehen, das bei in vivo-Versuchen die

Analyse der Auswirkung des Verlustes von PBX1 auf zellulärer Ebene

unmöglich macht. Aus den Ergebnissen der vergleichenden Charakterisierung

der Zelllinien unterschiedlichen Genotyps folgern wir, dass die Inaktivierung des

Diskussion 101

PBX1-Gens zu einer verstärkten mesodermalen und neuronalen

Differenzierung führt. Eine Erklärung hierfür könnte die fehlende Repression

von WNT und FGF15 nach der zellulären Differenzierung in den PBX1(-/-)-

Zelllinien dienen.

Die unterschiedlichen Genexpressionsmuster während der zellulären

Differenzierung von WT- und PBX1(-/-)-ES-Zellen deuten auf potentielle

Zielgene von PBX1 hin. Die oben beschriebenen, differenziell regulierten Gene

(WNT1, FGF15, IGF und Rezeptoren, Colipase) könnten als Zielgene eine

Rolle spielen. Aus den hier beschriebenen Untersuchungen alleine können

allerdings noch keine Aussagen über direkte Regulationsvorgänge abgeleitet

werden, dazu müssen weitere Untersuchungen angeschlossen werden.

Im in-vitro-in-vivo-Vergleich können die Ergebnisse unserer Untersuchungen

herangezogen werden, um Aspekte des Phänotyps der PBX1(-/-) und PBX1(+/-

)-Mäuse zu verstehen. So erklärt die fehlende Induktion von IGF2

möglicherweise die Fehlentwicklung des Pankreas und die Pathogenese des

Diabetes mellitus, möglicherweise auch die Störung der Hämatopoese in den

PBX1-K.O.-Mäusen.

Unser in vitro-System könnte in weiterführenden Untersuchungen sowohl auf

andere Differenzierungswege von PBX1-K.O.-ES-Zellen, z.B. die

Differenzierung zu β-Inselzellen, als auch auf andere K.O.-ES-Zellen

übertragen werden. So könnte das System einen wesentlichen Beitrag zum

tieferen Verständnis der Pathophysiologie des Diabetes mellitus und anderer

Erkrankungen sowie der Funktionsanalyse ausgeschalteter Gene liefern,

insbesondere in Situationen, wo ein Gen-Knock-out sich embryonal letal

auswirkt.

Zusammenfassung 102

6 Zusammenfassung

Die Expression des PBX1-Gens ist essentiell für die normale Embryogenese. PBX1 wird in

Regionen aktiver Neurogenese exprimiert. Somit war das Ziel dieser Arbeit die Etablierung

eines neuronalen in-vitro-Differenzierungssystems embryonaler Stammzellen (ES-Zellen),

das das Problem der frühen Letalität von PBX1-K.O.-Mäusen umgeht und so die Analyse

der Auswirkungen des Verlustes von PBX1 während der neuronalen Differenzierung auf

zellulärer Ebene erlaubt.

Unter Verwendung des CreLox-Systems wurden Einzel- und Doppelallel-PBX1-K.O.-ES-

Zellen aus Wildtyp (WT) murinen embryonalen Stammzellen erzeugt. Nach der Etablierung

des in-vitro-Differenzierungssystems wurden die Zelllinien der verschiedenen Genotypen

neuronal differenziert und untereinander in unterschiedlichen Differenzierungsstadien

morphologisch, immunzytochemisch und auf molekularer Ebene verglichen.

Lichtmikroskopisch-morphologische Analysen und immunzytochemische Untersuchungen

zeigten, dass die beiden PBX1-K.O.-Zelllinien mehr neuronalisierten als die WT-Zelllinien.

Die semiquantitativen RT-PCR-Ergebnisse und die Mikroarray-Genexpressionsanalyse

bestätigten diese Beobachtung insofern, als die neuronalen Marker nach der zellulären

Differenzierung von den PBX1(-/-)-Zelllinien stärker exprimiert wurden als von den WT-

Zelllinien. Zusätzlich zeigte die Mikroarray-Analyse, dass die PBX1(-/-)-Zellen im Vergleich

zu den WT-Zellen mehr mesodermale Marker und weniger endodermale Marker

exprimierten. Während der zellulären Differenzierung traten bei WNT1, FGF15, IGF1, IGF2,

IGF1R, IGF2R und Colipase besonders große Unterschiede im Vergleich der

Genexpressionsmuster von PBX1(+/+)-, PBX1(+/-)- und PBX1(-/-)-ES-Zellen auf.

Die Ergebnisse unserer Untersuchungen lassen den Schluss zu, dass PBX1(-/-)-Zellen

während der zellulären Differenzierung neuroektodermal und mesodermal differenzieren,

während der endodermale Differenzierungsweg supprimiert wird. Die neuronale

Differenzierung der PBX1-K.O.-Zellen in vitro erlaubt auch Rückschlüsse auf potentielle

Zielgene von PBX1. So könnten die zwischen PBX1-K.O.-Zellen und WT-Zellen differenziell

exprimierten Gene (insbesondere WNT1, FGF15, IGFs und ihre Rezeptoren, sowie

Colipase) als Zielgene von PBX1 eine Rolle spielen.

Die vorliegende Arbeit zeigt erstmals, dass eine Kombination des neuronalen in-vitro-

Differenzierungssytems mit einem Knock-out-System möglich ist. Das hier beschriebene

Verfahren könnte zukünftig sowohl auf andere Differenzierungswege, als auch auf andere

ES-Zellen mit anderen K.O.s übertragen werden und so die Funktionsanalyse verschiedener

ausgeschalteter Gene auf zellulärer Ebene in spezifischen

Differenzierungszusammenhängen ermöglichen.

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Anhang 113

8 Anhang

8.1 Herstellung der Embryonalen Stammzellen mit einem PBX1-Knock-out

8.1.1 Konstrukt des Vektors

Der Vektor zur Herstellung eines K.O.-Allels wurde von Dr. Jürgen Scheele

hergestellt. Es handelt sich um ein Konstrukt, das auf dem pFLOX Vektor

basiert, ein sequenzspezifisches Cre/lox P Rekombinationssystem aus dem

Bakteriophagen P1 (Austin et al., 1981). Das zu untersuchende PBX1-Gen

wurde in ES-Zellen von loxP Sequenzen flankiert.

Die gewünschte Zielsequenz wurde zwischen den Basenpaaren 1192 und 1356

der PBX1a mRNA-Sequenz lokalisiert. Diese Region kodiert den C –terminalen

Teil der PBX1-Homöodomäne, die die Helices α-3, 3-10 und α-4 einschließt,

welche für die PBX1 Interaktion mit HOX-Proteinen und DNA verantwortlich

sind (Abb. 8-1).

Abb. 8-1: Die Zielsequenz für die funktionale Elimination des PBX1-Gens. (Piper et al., 1999)

Anhang 114

Die Integration von drei loxP Sequenzen ermöglichte die Entfernung der

Selektionskassette durch die transiente Expression der Cre-Rekombinase in

den ES.

8.1.2 Homologe Rekombination

M. Kolanczyk führte in unserer Arbeitsgruppe die Herstellung des Einzel-Allel-

Knock-outs (PBX1(+/-)) als auch die Herstellung des totalen Knock-outs

(PBX1(-/-)) durch.

Erste homologe Rekombination Das Konstrukt (Abb. 8-2 A) wurde in die E14-ES-Zelllinie elektroporiert. Es

erfolgte eine positive Selektion durch die Gabe von G418. Die homologen

Rekombinanten konnten durch Southern Blot Analyse nach Hind III Verdau

identifiziert werden Es wurde ein Shift von 8 zu 16 kb nach dieser ersten

homolgen Rekombination des 1. Allels gefunden (Abb. 8-3 A). Die Häufigkeit

der homologen Rekombination betrug 1-10%. 500 Kolonien wurden analysiert.

Die Ergebnisse des Southern Blots wurden durch Long-Range-PCR an der

5´Region (8kb) und Standard-PCR an der 3`Region (2kb) des Vektors bestätigt

(Abb. 8-3 B). Ein Primer wurde immer außerhalb des Vektors angesetzt.

Nach Selektion und Expansion dieser Klone wurde die CRE Rekombinase

eingesetzt. 20 µg des Expressionsvektors für die CRE Rekombinase wurde für

die Transfektion des Klons E9 verwendet. Eine große Verdünnung von

elektroporierten Zellen erlaubte eine Selektion von Einzelzellkolonien. 500

Zellkolonien wurden durch Southern Blot analysiert. Die Bande lag bei 11 kb, da

die Selektionskassette und Zielsequenz fehlten (Abb. 8-3 C). Auf diese Weise

wurde der Klon G5 selektioniert. Dieser Klon hat durch die Behandlung mit dem

CRE-Enzym sowohl die beiden Selektionskassetten als auch die Zielsequenz

verloren (non conditional knock-out clone) (Abb. 8-2 B). G 5 wurde expandiert

und für eine homologe Rekombination mit dem 2. Allel vorbereitet.

Zweite homologe Rekombination Diesmal wurde eine modifizierte Variante des pFlOX Vektors verwendet, wobei

die Zielsequenz zwischen den Lox Schnittstellen durch Bam H1 Verdau und

anschließender Re-Ligation herausgeschnitten wurden (Abb. 8-2 C). Ein auf

dieser Weise verkleinerter Vektor führt nach Integration zu einer Verzerrung des

Locus, so dass eine folgende Runde von CRE Rekombination nicht notwendig

Anhang 115

war. 500 Klone wurden mit Southern Blot analysiert. Diesmal wurde ein Shift

von 8 kb auf 15 kb erhalten, da dem modifizierten Vektor die PBX1-Zielsequenz

fehlt und das Konstrukt nur über die flankierenden genomischen Sequenzen

verfügt. Zur gleichen Zeit kann das erste modifizierte Allel an der 11 kb Bande

erkannt werden, so dass den Klonen anhand der Banden in Abb. 8-3 C der

Genotyp zugeordnet werden kann. Auf diese Weise wurden sowohl ES-Zellen

mit einem Einzel-Allel-Knock-out (G5) als auch ES-Zellen mit einem Doppel-

Allel-Knock-out (H7, C10, H5) erzeugt, die für in-vitro-Experimente genutzt

werden konnten.

Abb. 8-2: Strategie der homologen Rekombination. A: PBX1-Konstrukt, das auf dem pFlOX Vektor basiert. „target ex 6“ = PBX1-Zielsequenz ist von loxP-Sequenzen flankiert. B: PBX1-Konstrukt nach CRE-Rekombinase Behandlung. Beide Selektionskassetten und die Zielsequenz fehlen. C: PBX1-Konstrukt nach Bam H1-Verdau: dadurch wurde die Zielsequenz eliminiert.

Anhang 116

Abb. 8-3: Strategie des Nachweises der homologen Rekombination A: Southern Blot Analyse nach Hind III-Verdau: Shift von 8 zu 16 kb in clone 1,2 und 3 nach 1. homologer Rekombination. B: RT-PCR Ergebnisse nach 1.homologer Rekombination. Long-Range-PCR an der 5`Region (8kb) und Standard-PCR an der 3`Region (2kb). C: Southern Blot Analyse nach HindII-Verdau nach 2. homologer Rekombination: Anhand der Bden konnte den Klonen der Genotyp zugordnet werden.

Abkürzungen 117

9 Abkürzungen

A Ab Antibody

Abb. Abbildung

Amp Ampicillin

AS Aminosäure

B bp Basenpaar

BSA Bovine Serum Albumin (Rinderserumalbumin)

bzw. beziehungsweise

C cDNA komplemtentäre Desoxyribonukleinsäure

Cre cyclization recombination

D d Tag

dATP Desoxy-Adenosintriphosphat

dCTP Desoxy-Cytosintriphosphat

dGTP Desoxy-Guanosintriphosphat

dH2O deionisiertes H2O

DMEM Dulbecco’s Modifiziertes Eagle Medium

DMSO Dimethylsulfoxid

DNS Desoxyribonukleinsäure

dNTP 2’-Desoxynukleosid-5’-triphosphat

dTTP Desoxy-Thymidintriphosphat

E E. coli Escherichia coli

E Embryonaltag

EB embroid body (Embryoidkörperchen)

EDTA Ethylendiamin-N,N,N’,N’-tetraessigsäure

ES-Zellen embryonale Stammzellen

et al. et alii (lat.: und andere)

F FBS Fötales Rinderserum

Abkürzungen 118

FITC fluorecein isothiocyanate

FSC forward scatter

G GAPDH Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase

I i.d.R. in der Regel

IPTG Isopropyl-b-D-thiogalaktosid

K K.O. Knock-out

kb kilobase

L LB Luria-Bertani

LIF Leukämie-inhibierender Faktor

loxP locus of cross-over of P1

N nt Nukleotid

P p.c. post coitum

PBS Phosphatgepufferte Salzlösung

PCR Polymerase-Kettenreaktion

PI Propidium Iodid

R ATRA all- trans retinoic acid (Retinsäure)

RNS Ribonukleinsäure

rpm Umdrehungen pro Minute

RT Raumtemperatur

S SDS Natriumdodecylsulfat

sec Sekunde(n)

ssDNA (salmon sperm DNA) = Lachssperma-DNS

SSC side scatter

T TBE Tris-Borat-EDTA-Puffer

TE Tris-EDTA-Puffer

Abkürzungen 119

TEMED N,N,N’,N’-Tetramethyl-ethylendiamin

Tris a,a,a,-Tris-(hydroxymethyl)-methylamin

U U Unit, Einheit

u.a. unter anderem

UV Ultraviolett

V Vol. Volumen

W Wildtyp Wildtyp

X X-Gal 5-Brom-4

Die chemischen Elemente wurden mit den üblichen Symbolen abgekürzt.

Verwendete Vorsilben für Potenzen der Zahl 10: p = Piko (10-12), n = Nano

(1x10-9), µ = Mikro (1x10-6), m = Mikro (1x10-3), k = Kilo (1x103), M = Mega

(1x106). Zeitbegriffe: d = Tag, min = Minute, sec = Sekunde.

Bei einigen Begriffen wurden die englischen Fachtermini verwendet wie Blot,

Knock-out usw., da auch in der deutschsprachigen Fachliteratur eine

Übersetzung dieser Begriffe unüblich und unzureichend ist.

Danksagung 120

10 Danksagung

Mein besonderer Dank gilt Prof. Dr. med. Roland Mertelsmann, ärztlicher Direktor,

Abteilung Innere Medizin I, Hämatologie/Onkologie, für die Betreuung dieses Projektes

und für die vielen anspornenden Diskussionen und auch für die nette und lehrreiche

Integration von Studierenden in die Klinik.

Dr. med. Jürgen Scheele, dem Leiter unserer Arbeitsgruppe, danke ich für die

interessante Themenstellung, vielen Diskussionen und seine freundliche

Unterstützung.

Ohne Mateusz Kolanzcyk, biologischer Doktorand in unserer Arbeitsgruppe, wäre die

Arbeit in dieser Form sicherlich nicht entstanden. Ich danke für die Einführung in die

Methodik. Er war jederzeit mit Rat und Tat zur Stelle und sorgte mit seiner

ausgeglichenen, freundschaftlichen Art dafür, dass das Arbeiten Spaß gemacht hat.

Mateusz Kolanzcyk, meinem „personal supervisor“ gilt besonderer Dank.

Allen Mitgliedern der AG Scheele, AG Otto, AG Lübbert und AG Trepel danke ich für

die kollegiale Zusammenarbeit und Hilfsbereitschaft, die die angenehme

Arbeitsatmosphäre im Labor wesentlich geprägt haben.

Dr. Martin Trepel danke ich besonders für die Durchsicht dieses Manuskriptes.

Michael Behrens danke ich für seine kompetente und jederzeit verfügbare Beratung in

EDV Fragen.

Ich danke Prof. Dr. med. Stefan Burdach, Direktor der Universitätsklinik und Poliklinik

für Kinder- und Jugendmedizin, und Uwe Hattenhorst, biologischer Doktorand, von der

Martin-Luther-Universität Halle-Witteberg für die Möglichkeit, Genexpressionsanalysen

mit Mikroarrays in Halle durchführen zu können. Wir hatten freundlicherweise die

Möglichkeit, die Methode der Mikroarray-Analyse selbst zu erlernen und diese Methode

dabei an unseren Proben anzuwenden.

Ich möchte mich auch bei allen Freunden und Bekannten bedanken, die zum Gelingen

dieser Arbeit beigetragen haben.

Ich danke Michael und meiner Familie, insbesondere meinen Eltern, – für alles.

Veröffentlichungen 121

11 Veröffentlichungen

11.1 Abstracta

Scheele, J.S., Juergens, A., Sykes, D, Kamps, M.P. and Kolanczyk, M.

In-Vitro Differentiation of Homozygous Pbx1 Knock-out ES Cells Reveals a Role of

Pbx1 in Transcriptional Regulation of Genes Potentially Relevant for Brain

Development.

Blood 98, A 4372, 2001.

Juergens, A., Kolanczyk, M. and Scheele, J.S.

In-vitro differentiation of homozygous pbx1-knock-out ES cells: a system to identify and

study potential target genes of the pbx1-homeoboxprotein during cellular differentiation.

Onkologie 25, Suppl 4, A 492, 2002.

Scheele, J.S., Juergens, A., Zemojtel, T., Sykes, D, Kamps, M.P. and Kolanczyk, M.

Identification of IGF2 as a potential target gene of the pbx1-homeobox protein by in-

vitro differentiation of homozygous pbx1 knock-out ES cells.

Blood 100, A 2118, 2002.

11.2 Tagungsbeiträge

Anne S. Jürgens, Mateusz K. Kolanczyk and Jürgen S. Scheele

„In-Vitro Differentation of Homozygous PBX1 Knock-out ES Cells: A Potential System

to Study Structure Function Relationship to the PBX1-Homeoboxprotein in Cellular

Differentiation.”

Vortrag, 9th EuCC Meeting Clinical and Experimental Oncology, Basel, Friday, June 7th

2002

Jürgens A.S., Kolanczyk M.K., Scheele J.S., Freiburg

„In-Vitro Differenzierung von homozygoten Pbx1 Knock-out embryonalen Stammzellen:

Ein System zur Identifikation und zum Studium potentieller Zielgene des Pbx1 -

Homeoboxproteins während der zellulären Differenzierung.“

Vortrag in der Sitzung „Best Abstracts“, Gemeinsame Jahrestagung der Deutschen und

Österreichischen Gesellschaft für Hämatologie und Onkologie, München, 27.-30.

Oktober 2002

Veröffentlichungen 122

Jürgen S. Scheele, Anne S. Jürgens ,Tomasz C. Zemojtel, *David B. Sykes, *Mark P.

Kamps and Mateusz K. Kolanczyk

„Identification of IGF2 as a Potential Target Gene of the Pbx1- Homeobox Protein by

In-Vitro Differentiation of Homozygous Pbx1 Knock-out ES Cells.”

Poster bei “The American Society of Hematology 44th Annual Meeting”, Philadelphia,

Pennsylvania, December 6-10, 2002

11.3 Seminarvorträge

Anne S. Jürgens

„Funktionelle Genomik von PBX1 in der neuronalen Differenzierung.“

Seminarvortrag im Rahmen der „Wissenschaftlichen Kolloquium des Universitäts-

klinikums für Kinder- und Jugendmedizin." an der Martin-Luther-Universität in Halle-

Wittenberg, 21.11.2001

Anne S. Jürgens

„In-Vitro Differenzierung von murinen homozygoten Pbx1 Knock-out embryonalen

Stammzellen: Ein System zur Identifikation und zum Studium potentieller Zielgene des

Pbx1-Homeoboxproteins waehrend der zellulaeren Differenzierung."

Seminarvortrag am Deutschen Diabetes-Forschungsinstitut, Düsseldorf, 16.12.2002

Lebenslauf 123

12 Lebenslauf

Persönliche Daten: Name: Anne Siobhain JÜRGENS Adresse: Christophstr. 21 40225 Düsseldorf Telefon: 0211 3160870

e-mail: [email protected] Geburtsdatum: 08.07.1977 Geburtsort: Neuss Familienstand: ledig Staatsangehörigkeit: Deutsch

Schulbildung: 1984 - 1988 Grundschule, Düsseldorf 1988 - 1991 Görres-Gymnasium, Düsseldorf 1991- 1997 Gymnasium Paulinum, Münster 1994 Auslandsaufenthalt: St. Leonard’s Mayfield School,

East Sussex 1997 Abitur

Leistungsfächer: Biologie, Englisch, Mathematik and Geographie

Studium: seit 10/1997 Albert-Ludwigs-Universtät Freiburg

Physikum: September 1999 1.Staatsexamen: September 2000 2.Staatsexamen: September 2003 3.Staatsexamen: November 2004

Beruf: seit 01/2005 Assistenzärztin für Humangenetik, Uniklinikum Düsseldorf Tätigkeiten:

07-08/1997 Pflegepraktikum in Royal Victoria Infirmary in Newcastle/England 03/2000 Famulatur in Flinders University in Adelaide / Australien (Radiologie) 09/2001 Famulatur im Diakoniekrankenhaus in Freiburg (Innere Medizin) 09/2002 Famulatur im St. Vincent Hospital in Indianapolis / USA (Neurologie) 2002 POL – Gruppenleiterin für 2.Semester Studenten

Freiburg, den 07.06.2005 Anne Jürgens

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