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Aus der Klinik für Pferde der Tierärztlichen Hochschule Hannover Nachweis der Konzentration von Tulathromycin im Plasma und in der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit beim Fohlen mittels Hochdruckflüssigkeitschromato- graphie mit zweifacher Massenspektroskopie nach i.m. Applikation, mit und ohne Kombination von Rifampicin INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN (Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover Vorgelegt von Nina Höhensteiger aus Siegburg Hannover 2005
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Aus der Klinik für Pferde
der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Nachweis der Konzentration von Tulathromycin im
Plasma und in der bronchoalveolären Lavageflüssigke it
beim Fohlen mittels Hochdruckflüssigkeitschromato-
graphie mit zweifacher Massenspektroskopie nach i.m .
Applikation, mit und ohne Kombination von Rifampici n
INAUGURAL – DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer
DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Nina Höhensteiger
aus Siegburg
Hannover 2005
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. E. Klug
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. E. Klug
2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. E. Töpfer-Petersen
Tag der mündlichen Prüfung: 23.11.05
Meinen Eltern und Großeltern
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 11
2 Literaturübersicht 12
2.1 Makrolide 12
2.1.1 Geschichte der Entwicklung 12
2.1.2 Stoffklasse 12
2.1.3 Struktur 13
2.1.4 Vertreter 14
2.1.4.1 Erythromycin 14
2.1.4.2 Azithromycin 19
2.1.4.3 Clarithromycin 23
2.1.4.4 Tilmicosin 25
2.1.4.5 Tylosin 27
2.1.4.6 Spiramycin 28
2.1.4.7 Kitasamycin 29
2.1.4.8 Tulathromycin 30
2.1.5 Wirkspektrum der Makrolide 30
2.1.6 Wirkmechanismus der Makrolide 31
2.1.7 Anwendungsgebiete der Makrolide 32
2.1.8 Pharmakokinetik der Makrolide 32
2.1.9 Pharmakodynamik der Makrolide 34
2.1.10 Nebenwirkungen 35
2.1.11 Resistenzen 36
2.2 Tulathromycin 37
2.2.1 Struktur 37
2.2.2 Wirkmechanismus und Wirkspektrum 39
2.2.3 Studien zu Tulathromycin 39
2.2.4 Dosierung 46
2.2.5 Nebenwirkungen 46
2.2.6 Resistenzen 47
Inhaltsverzeichnis
2.3 Rifampicin 47
2.4 Rhodococcus equi-Pneumonie 49
2.4.1 Der Erreger 49
2.4.2 Klinische Symptomatik 50
2.4.3 Pathogenese 51
2.4.4 Problematik bei Therapie der Rhodokokkose 52
3 Material und Methode 54
3.1 Probanden 54
3.1.1 Allgemeine Bedingungen 55
3.1.2 Bedingungen für die Aufnahme in die Studie 55
3.1.3 Einteilung der Fohlen in Gruppen 55
3.2 Methode 56
3.2.1 Untersuchung der Fohlen 56
3.2.1.1 Spezielle Untersuchung des Respirationstraktes 56
3.2.1.2 Bestimmung der Leukozytenzahl im Blut 56
3.2.1.3 Weiterführende Untersuchungen 57
3.2.2 Klinische Durchführung der Studie 57
3.2.2.1 Studiengangübersicht 57
3.2.2.2 Blutprobenentnahme 63
3.2.2.3 Entnahme der bronchoalveolären Lavage (BAL) für die Konzentrationsbestimmung von Tulathromycin im Überstand und in der Zellfraktion 64
3.2.2.4 Abschlussuntersuchung 65
3.2.3 Analytische Untersuchung der Proben zur Bestimmung der Konzentration von Tulathromycin 66
3.2.3.1 Aufbereitung der BAL-und Plasmaproben 66
3.2.3.2 Aufbereitung der Kalibriergeraden 67
3.2.3.3 Festphasenextraktion 67
3.2.3.4 Flüssigkeitschromatographie (LC-System) und zweifache Massenspektroskopie (MS/MS-System) 67
3.2.3.5 Auswertung der Detektionsergebnisse zur Bestimmung der Tulathromycinkonzentrationen 68
4 Ergebnisse 70
Inhaltsverzeichnis
4.1 Etablierung des Assays 70
4.2 Konzentration von Tulathromycin im Blutplasma beim F ohlen 73
4.2.1 Verlauf der Tulathromycinkonzentration nach einmaliger i.m. Applikation 73
4.2.2 Verlauf der Tulathromycinkonzentration nach Vorbehandlung mit Rifampicin und zusätzlicher Verabreichung von Rifampicin 76
4.2.3 Verlauf der Tulathromycinkonzentration nach zweiwöchiger Behandlung der Fohlen mit Tulathromycin und Rifampicin und zusätzlicher Verabreichung von Rifampicin 79
4.2.4 Vergleich der Plasmakonzentration von Tulathromycin der 1., 2. und 3. Kinetik 82
4.3 Gesamtzellgehalte, Menge der Rückspülflüssigkeit und Zellfraktionen in der bronchoalveolären Lavageflüss igkeit 84
4.4 Konzentration von Tulathromycin in der bronchoalveol ären Lavageflüssigkeit 86
4.4.1 Konzentration von Tulathromycin in der bronchoalveolären Lavage nach einmaliger i.m. Applikation 86
4.4.2 Konzentration von Tulathromycin in der bronchoalveolären Lavage nach Vorbehandlung mit Rifampicin 87
4.4.3 Konzentration von Tulathromycin in der bronchoalveolären Lavage nach zweiwöchiger Behandlung mit Tulathromycin und Rifampicin 88
4.5 Ergebnisse der Blutchemie 91
4.6 Auftreten von Nebenwirkungen 93
5 Diskussion 96
5.1 Probanden 96
5.2 Nachweisbarkeit und Pharmakokinetik von Tulathromyc in 97
5.2.1 Verlauf der Tulathromycinkonzentration nach einmaliger Injektion 97
5.2.2 Verlauf der Tulathromycinkonzentration nach Vorbehandlung mit Rifampicin 100
5.2.3 Verlauf der Tulathromycinkonzentration nach zweiwöchiger Behandlung mit Tulathromycin und Rifampicin 102
5.3 Akzeptanz und Nebenwirkungen der verabreichten Arzneim ittel 102
5.4 Beeinträchtigung der Fohlen durch die bronchoalveol äre Lavage 103
5.5 Mögliche Aussagen zur Dosierung von Tulathromycin be im Fohlen 104
Inhaltsverzeichnis
5.6 Schlussfolgerungen 105
6 Zusammenfassung 107
7 Summary 109
8 Literaturverzeichnis 111
9 Anhang 123
9.1 Abbildungsverzeichnis 146
9.2 Tabellenverzeichnis 147
Verzeichnis der Abkürzungen
Abb. Abbildung
ALT Alanin-Amino-Transferase
AST Aspartat-Amino-Transferase
AUC area under the curve
AUC0-t area under the curve Zeitpunkt 0 bis zu einem festgelegten
Zeitpunkt (196 Stunden)
AUCt-∞ area under the curve von einem festgelegten Zeitpunkt bis
unendlich
Aqua bidest. zweifach destilliertes Wasser
BAL bronchoalveoläre Lavage
c Konzentration
c0 Ordinatenschnittpunkt der Eliminationskurve
cA Ordinatenschnittpunkt der ab Cmax berechneten Kurve
Cmax Maximalkonzentration
d Tag
D Dosis
Diss. Dissertation
g Gramm
GGT Gamma-Glutamyl-Transferase
GLDH Glutamat-Dehydrogenase
h Stunde
HPLC/MS/MS Hochdruckflüssigkeitschromatographie mit zweifacher
Massenspektroskopie
i.m. intramuskulär
IS Interner Standard
i.v. intravenös
kel Eliminationskonstante
KM Körpermasse
kg Kilogramm
l Liter
ln natürlicher Logarithmus
Lnn. Lymphknoten
LVL Landesveterinär- und Lebensmitteluntersuchungsamt
m Meter
M Muskel
MHK Minimale Hemmstoffkonzentration
min Minute
ml Milliliter
MLS Makrolide Lincosamide und Streptogramine Gruppe
mm Millimeter
mg Milligramm
MW Mittelwert
ng Nanogramm
Nr. Nummer
µg Mykrogramm
µl Mykroliter
µm Mykrometer
PBS phosphat buffered saline
PELF pulmonary epithelial lining fluid
p.o. per os
ppm parts per million
Rifa Rifampicin
s.c. subkutan
SD Standardabweichung
SDH Sorbit-Dehydrogenase
SN Stutennummer des Betriebes
t1/2 Halbwertszeit
Tab. Tabelle
tmax Zeitpunkt der Maximalkonzentration
Vc Verteilungsvolumen nach simulierter intravenöser Injektion
Einleitung
11
1 Einleitung
Tulathromycin ist ein für das Rind und Schwein seit 2004 zugelassenes Antibiotikum.
und ist als 10%ige Injektionslösung unter dem Handelsnamen Draxxin® auf dem Markt.
Das Wirkspektrum umfasst alle relevanten bakteriellen Pathogene, die bei
respiratorischen Erkrankungen von Rind und Schwein nachgewiesen werden. Eine
Dosierung von 2,5 mg Tulathromycin je kg Körpergewicht wird angegeben. Das
entspricht 1 ml Draxxin® pro 40 kg Körpergewicht (TRAEDER u. GROTHUES, 2004).
Draxxin® wird für eine einmalige parenterale Applikation bei Rind und Schwein zur
Prophylaxe und Behandlung von Atemwegserkrankungen empfohlen (BENCHAOUI et
al., 2004).
Atemwegserkrankungen stellen beim Fohlen zwischen zwei bis sechs Monaten
Lebensalter neben Durchfall die häufigste Erkrankung in der Aufzuchtsphase dar. Der
häufigste Erreger von schweren Pneumonien beim Fohlen ist Rhodococcus equi.
Durch den therapeutischen Einsatz von Erythromycin und Rifampicin seit nunmehr fast
20 Jahren konnte die Überlebensrate von 20% auf fast 90% gesteigert werden
(HILLIDGE, 1987). Seit kürzerer Zeit ist die Kombination Azithromycin und Rifampicin
das erfolgreichste Behandlungsprotokoll bei dieser Erkrankung. Diese Wirkstoffe sind
jedoch sehr teuer und müssen täglich verabreicht werden. Da der Erreger fakultativ
intrazellulär wächst und pyogranulomatöse Pneumonien verursacht, muß das
Antibiotikum zur Behandlung der Rhodokokkose besondere Eigenschaften aufweisen.
In einer 2005 von KERTH durchgeführten klinischen Studie konnte die Wirksamkeit des
Medikamentes bereits nachgewiesen werden. Untersuchungen zur Konzentration von
Tulathromycin im Plasma und der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit beim Fohlen,
sowie mögliche Aussagen zur Pharmakokinetik und Dosierung des Medikamentes bei
dieser Spezies standen jedoch noch aus.
Da zur Pharmakokinetik von Tulathromycin beim Fohlen noch keine Erkenntnisse
vorliegen, sollten in der vorliegenden Studie die ersten Daten erhoben werden. Dafür
wurde in der vorliegenden Arbeit bei 18 lungengesunden Fohlen Tulathromycin mit und
ohne Kombination von Rifampicin verabreicht. Hierbei wurde die gleiche Dosierung,
wie die von TRAEDER u. GROTHUES (2004) für das Schwein und Rind
vorgeschlagenen 2,5 mg/kg Körpergewicht Tulathromycin verwendet.
Literaturübersicht
12
2 Literaturübersicht
2.1 Makrolide
2.1.1 Geschichte der Entwicklung
Erythromycin wurde als erstes Makrolid-Antibiotikum entdeckt und ist seit 1952 in den
USA im Einsatz (PERITI et al., 1993). Das Antibiotikum zeigte sich wirkungsvoll gegen
grampositive Kokken und die dadurch entstehenden atypischen Pneumonien. Es stellt
eine gute Alternative für auf Penicillin allergische Patienten in der Behandlung von
Erkrankungen des oberen und unteren Respirationstraktes, sowie von
Weichteilinfektionen dar. Bis Mitte der 80er Jahre wurden keine bemerkenswerten
Entdeckungen auf diesem Gebiet entwickelt. Das Interesse an den Makroliden wuchs
1975 für die Behandlung von Legionella, einem intrazellulär wachsenden Bakterium,
welches durch die Erkrankung AIDS stark an Bedeutung gewann (CHARLES u.
SEGRETI, 1997). Zunächst wurde Erythromycin aus Streptomyces erythreus isoliert.
Später wurden die Makrolide halb- oder vollsynthetisch hergestellt (FREY u.
LÖSCHER, 2002). Mittlerweile stellen die Makrolide eine alte und gut erforschte
Gruppe antimikrobieller Substanzen dar. Sie machen 10–15% der weltweit oral
angewendeten Antibiotika aus (KIRST, 1991).
2.1.2 Stoffklasse
Die Makrolide gehören zu den Chemotherapeutika. Es handelt sich um lipophile
Substanzen (BURROWS, 1980), welche durch Anknüpfung von glykosidisch
gebundenen Neutral- oder Aminozuckern basische Eigenschaften erhalten. Sie sind
somit im sauren Milieu instabil. Um die Bioverfügbarkeit und Wasserlöslichkeit dieser
Strukturen zu verbessern, werden in der Therapie verschiedene Salze und Ester
eingesetzt. In der Veterinärmedizin sind insbesondere Tilmicosin, Erythromycin,
Tylosin, Spiramycin (GALER et al., 2004) und Kitasamycin von Bedeutung.
Clarithromycin und Roxithromycin werden hauptsächlich in der Humanmedizin
verwendet (FREY u. LÖSCHER, 2002).
Literaturübersicht
13
2.1.3 Struktur
Makrolide zeichnen sich durch einen makrozyklischen Laktonring mit zwei oder mehr
Zuckerresten aus (PRESCOTT u. BAGGOT, 1993). Diese Neutral- oder Aminozucker
sind glykosidisch angeknüpft und verleihen dem Makrolid einen basischen Charakter.
Man unterscheidet drei Gruppen, welche sich durch einen 14-, 15- und 16gliedrigen
Laktonring auszeichnen. Zur ersten Gruppe gehören als natürliche Vertreter
Erythromycin A-F, Oleandomycin und Sporeamicin. Weitere 14gliedrige Makrolide,
Roxithromycin, Flurithromycin, Clarithromycin, Dirithromycin und Davercin werden
synthetisch hergestellt. Azithromycin besteht aus einem 15gliedrigen Laktonring
(CARBON, 1998). Tilmicosin und Tylosin besitzen einen 16gliedrigen Laktonring
(FREY u. LÖSCHER, 2002). Zu den natürlichen Vertretern der 16gliedrigen Makrolide
gehören Josamycin, Kitasamycin, Spiramycin und Midecamycin. Halbsynthetisch
werden von dieser Gruppe Rokitamycin und Miokamycin hergestellt (CARBON, 1998).
Die Entwicklung neuer 16- und 18gliedriger Makrolide resultiert in einer verstärkten
antimikrobiellen Aktivität, sowie pharmakokinetischen Vorteilen gegenüber den
anderen Makrolid-Antibiotika (PRESCOTT u. BAGGOT, 1993). Azithromycin weist ein
Nitrogenatom an dem 15gliedrigen Laktonring auf. Wie Dirithromycin und
Roxithromycin ist es am C9 modifiziert. Clarithromycin ist am C6 methyliert (CHARLES
u. SEGRETI, 1997) (siehe Abb. 1).
Literaturübersicht
14
Makrolide
15-gliedrigerRing
16-gliedriger Ring14-gliedriger Ring
semisynthetischenatürliche Azithromycin natürliche semisynthetische
Erythromycin
Oleandomycin
Sporamicin
Roxithromycin
Dirithromycin
Flurithromycin
Clarithromycin
Davercin
Josamycin
Kitasamycin
Spiramycin
Midecamycin
Rokitamycin
Miokamycin
Abb. 1: Makrolide, die in den letzten Jahren entwick elt wurden (nach
BRYSKIER et al., 1993)
Eine neue Untergruppe der halbsynthetischen Makrolide stellen die Triamilide dar.
Diese unterscheiden sich von Azaliden und Makroliden durch das hinzufügen von drei
Aminogruppen. Ein Vertreter dieser Gruppe ist Tulathromycin (TRAEDER u.
GROTHUES, 2004). Dieses Triamilid liegt zu 10% als 13gliedriger Laktonring und zu
90% als 15gliedriger Laktonring vor (BENCHAOUI et al., 2004; GALER et al., 2004;
NOWAKOWSKI et al., 2004).
2.1.4 Vertreter
2.1.4.1 Erythromycin
Erythromycin ist das älteste Mitglied der Makrolide. Es besitzt einen 14gliedrigen
Laktonring mit zwei Zuckerresten (EWING et al., 1994) und ist veterinärmedizinisch von
Bedeutung (FREY u. LÖSCHER, 2002) (siehe Abb. 2).
Literaturübersicht
15
Abb. 2: Strukturformel von Erythromycin (nach STAHL MANN u. LODE, 2001)
Da die Wirkungsweise von Erythromycin bakteriostatisch ist, ist der Effekt von sich
vermehrenden Bakterien abhängig. Die bakterizide Wirkung hängt von der Sensitivität
des Bakteriums und der Konzentration des Antibiotikums ab (HAIGHT u. FINLAND,
1952). Es handelt sich um eine schwache Base, die schnell durch die Magensäure
inaktiviert wird. Um die Säurestabilität für die orale Verabreichung zu verbessern,
wurden chemische Modifikationen in Form von Estern und Salzen hergestellt.
Erythromycin-Estolate und Erythromycin-Ethylsuccinate werden als inaktive Formen
vom Duodenum absorbiert und zur aktiven Form hydrolysiert. Erythromycin-Stearat und
Erythromycin-Phosphat hingegen dissoziieren im Duodenum und werden bereits als
aktive Form resorbiert (CHOW, 1984). Wie EWING et al. (1994) berichten, werden mit
den Erythromycinsalzen (Erythromycin-Stearat, -Phosphat) höhere
Plasmakonzentrationen erreicht als nach Verabreichung der Erythromycinester
(Erythromycin-Estolat, -Ethylsuccinat). Des Weiteren ist in Pferden die Halbwertszeit
von Erythromycin-Ethylsuccinat oder Estolat größer als bei der Phosphat- oder
Stearatform. Trotzdem beschreiben EWING et al. (1994), dass Erythromycin-Estolat
genauso wie das preisgünstigere Erythromycin-Phosphat oder –Stearat für die
Behandlung von Rhodococcus equi-Pneumonien eingesetzt werden kann.
LAKRITZ et al. (1999) stellten in ihrer Studie eine Halbwertszeit für Erythromycin von
einer Stunde fest und das Verteilungsvolumen lag bei 2,66 ± 0,2 l/kg. Nach oraler
Verabreichung von 25 mg/kg wurde der MHK (minimale Hemmstoffkonzentration) von
Rhodococcus equi in allen Fohlen für mindestens vier Stunden erreicht (LAKRITZ et
al., 1999). Für die parenterale Injektion ist Erythromycin als Base, Glucoheptonat oder
Literaturübersicht
16
Lactobionat verfügbar. Erythromycin weist eine gute Wirksamkeit (MHK <0,5 µg/ml)
gegen grampositive aerobe Bakterien wie Bacillus sp., Corynebacterium sp.,
Erysipelothrix rhusiopathiae, Listeria sp., Staphylokokken und Streptokokken auf. Bei
gramnegativen Aeroben sind Actinobacillus sp., Brucella sp., Campylobacter sp. und
Leptospira sp. sensibel. Gegen anaerobe Bakterien ist das Medikament bei
Actinomyces sp., Bacteroides sp. (außer B. fragilis), Clostridium sp., einige
Fusobakterien und anaerobe Kokken wirksam (PRESCOTT u. BAGGOT, 1993). Für
Rhodococcus equi wird ein MHK von <0,25 µg/ml angegeben (PRESCOTT, 1981).
Erythromycin ist das Mittel der Wahl für die Behandlung oder Prophylaxe von
Campylobacter jejuni-Diarrhoen oder -Aborten und Rhodococcus equi-Pneumonien bei
Fohlen. Für die Rhodokokkose sollten kombinierte Behandlungen mit Ampicillin oder
Rifampicin erfolgen. Bei Fohlen ist Erythromycin eine Alternative zu Penicillin G oder
Trimethoprim-Sulfonamiden für die Behandlung von Infektionen mit Staphylokokken
und Streptokokken (PRESCOTT u. BAGGOT, 1993). Weitere Anwendungsgebiete
stellen Mastitiden, Atemwegserkrankungen, Leptospirosen und Mykoplasmosen, sowie
Clostridieninfektionen beim Geflügel da (FREY u. LÖSCHER, 2002).
Auch die Dosierung von 37,5 mg/kg per os alle 12 Stunden wird für die Behandlung
von Pneumonien durch Rhodococcus equi vorgeschlagen (EWING et al., 1994).
LAKRITZ et al. (1997) schlagen eine Dosierung von 25 mg/kg per os (p.o.) ebenfalls
alle 12 Stunden vor. PRESCOTT und BAGGOT (1993) favorisieren eine Dosierung von
25 mg/kg, jedoch im Unterschied zu LAKRITZ et al. (1997) 4x täglich. HILLIDGE (1987)
hält die gleiche Dosierung, jedoch 3x täglich am sinnvollsten. Erythromycin-Lactobionat
sollte langsam intravenös (i.v.) verabreicht werden mit einer Dosierung von 3-5 mg/kg
alle 8-12 Stunden. Die Behandlung sollte nicht länger als drei Tage erfolgen
(PRESCOTT u. BAGGOT, 1993). GIGUÈRE und PRESCOTT (1997) geben eine i.v.
Dosierung von 5 mg/kg als langsame Infusion alle sechs Stunden an. Ein bis zwei
Stunden nach oraler Aufnahme und ein bis drei Stunden nach i.m. Applikation hat das
Medikament die höchste Serumkonzentration erreicht (BURROWS, 1980).
Während der Behandlung mit Erythromycin wurde eine herabgesetzte Chemotaxis und
Adhärenz von neutrophilen Granulozyten festgestellt (NELSON et al., 1987). Dieser
immunsuppremierende Effekt ist zum einen gegen Entzündungsreaktionen hilfreich,
zum anderen werden Superinfektionen durch Erythromycin resistente Keime und
gramnegative Bakterien begünstigt (NELSON et al., 1987; LAKRITZ et al., 1997).
Literaturübersicht
17
Beispiele für solche Keime sind Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae,
Proteus mirabilis, Staphylococcus aureus (NELSON et al., 1987) und Pneumocystis
carnii (LAKRITZ et al., 1997). Diese immunsuppressive Wirkung von Erythromycin ist
laut NELSON et al. (1987) dosisabhängig. Je größer die verabreichte Dosis von
Erythromycin ausfiel, desto stärker wurde die Chemotaxis von Makrophagen zum
Infektionsherd gehindert. Eine Beeinträchtigung der Makrophagenfunktion oder der im
Blut zirkulierenden intravaskulären Makrophagen konnte hingegen nicht festgestellt
werden (NELSON et al., 1987). NELSON et al. (1987) vermuten als Grund für die
Fehlfunktionen der Abwehrzellen ein Eingreifen in die intrazelluläre
Kalziummobilisation, sowie eine Unterbrechung normaler Zytoskelettfunktionen.
LAKRITZ et al. (1997) konnten bei klinisch relevanten Dosen von Erythromycin keine
immunsuppremierende Wirkung auf die Abwehrzellen der Atemwege feststellen.
Eine weitere Problematik bei der Behandlung mit Erythromycin stellt das Risiko einer
schweren Colitis bei erwachsenden Pferden dar (BÅVERUD et al., 1998). Die Autoren
stellten bei Untersuchungen an Fohlen, die mit Erythromycin behandelt wurden drei
oder vier Tage nach Behandlungsbeginn bei den Mutterstuten wässrigen,
pseudomembranösen Durchfall fest. Weitere Symptome waren Fieber und Depression.
Als Folgen der Colitis traten schwere Dehydration, metabolische Azidose, Hypovolämie
und Toxämie auf (GUSTAFSSON et. al., 1997; BÅVERUD et al., 1998). Trotz
intensiver Therapie starben neun von elf Mutterstuten. Als Hypothese für die Ätiologie
der entstehenden Colitiden nahmen BÅVERUD et al. (1998) die versehentliche
Aufnahme kleiner Mengen des Antibiotikums durch die Mutterstuten an. Dies kann
entweder durch Aufnahme von mit Erythromycin belastetem Fohlenkot oder anderem
kontaminiertem Material, wie z.B. Stroh, entstehen. Dadurch entstand eine Inbalance
der intestinalen Flora, die zu einer fatalen Colitis führen kann. Von mehreren anderen
Autoren (BURROWS, 1980; PRESCOTT und BAGGOT, 1993; GUSTAFSSON et al.,
1997) wurden gastrointestinale Störungen nach Erythromycingabe bei adulten Pferden
beobachtet. Nur EWING et al. (1994) konnten keine gastrointestinalen
Unverträglichkeiten feststellen. Als Erklärung hierfür nehmen GUSTAFSSON et al.
(1997) Unterschiede in der Mikroflora des Dickdarms, An- oder Abwesenheit von
potentiell pathogenen Erregern und deren Antibiotikaresistenzen an. BÅVERUD et al.
(1997) beschrieben Clostridium difficile als möglichen Colitiserreger bei Mutterstuten,
deren Fohlen mit Antibiotika behandelt werden. In ihren Untersuchungen wurden bei
Literaturübersicht
18
40% der erwachsenen Pferde, welche eine Antibiotika induzierte akute Colitis
aufwiesen, Clostridium difficile oder dessen Zytotoxin nachgewiesen. GUSTAFSSON et
al. (1997) fanden hohe Konzentrationen von Clostridium perfringens in der Darmflora
eines Versuchspferdes, nachdem es durch Erythromycin induzierten Durchfall auffiel.
Auch Fohlen, die mit Antibiotika behandelt werden, können ein potentielles Reservoir
für Clostridium difficile darstellen. Alle getesteten Clostidium difficile Stämme waren
resistent gegenüber Erythromycin, wodurch die Vermehrung des Bakteriums
begünstigt wurde. Aufgrund der häufigen Verwendung von Antibiotika ist Clostridium
difficile wahrscheinlich mehr in Tierkliniken als in Privatställen vertreten. Aus diesem
Grund wurde in Schweden in manchen Tierkliniken Erythromycin durch Gentamicin
ersetzt (BÅVERUD et al., 1998). Bei Fohlen wurden von STRATTON-PHELPS et al.
(2000) Nebenwirkungen wie Durchfall, Hyperthermie und Atemnot beschrieben. Diese
traten meist in den ersten fünf Tagen der Behandlung auf. Die Diarrhoe entsteht zum
einen durch die medikamentös bedingte Störung der Darmflora (STRATTON-PHELPS
et al., 2000), sowie durch die Motilin ähnliche Wirkung von Erythromycin auf die
Darmmotilität (PEETERS et al., 1989). Das Medikament induziert bei Pferden
Kontraktionen des Magens, Blinddarms, der rechten ventralen Colonlängslage, sowie
des Dünndarms (PEETERS et al., 1989; OTTERSON u. SARNA, 1990). OTTERSON
und SARNA (1990) berichten, dass bei höheren klinisch effektiven Dosen die Motilität
steigernde Wirkung nicht mehr eintritt. Sie postulieren des Weiteren, dass die
gesteigerte Darmaktivität nicht nur von der intravaskulären Konzentration von
Erythromycin, sondern auch durch dessen direkt reizende Wirkung nach oraler
Verabreichung resultiert. Als positiver Effekt durch die Motilin ähnliche Wirkung von
Erythromycin ist die schnellere Magenentleerung und somit raschere Aufnahme durch
den Darm zu nennen (OTTERSON u. SARNA, 1990). Insgesamt wird die Häufigkeit
gastrointestinaler Störungen von PERITI et al. (1993) mit 28,5% angegeben. Im Falle
einer schweren Diarrhoe kann die orale Verabreichung von Erythromycin auf eine
intravenöse Applikation umgestellt werden. Obwohl das Medikament nach i.v.
Verabreichung durch die Galle ausgeschieden wird, hört bei vielen Fohlen der Durchfall
auf (GIGUÈRE u. PRESCOTT, 1997). Die Hyperthermie entsteht durch das Eingreifen
des Medikamentes in die Thermoregulation. Dies wird durch hohe Außentemperaturen
und direktem Aussetzen der Sonne verstärkt. Hyperthermie verschärft wiederum das
Auftreten von Atemnot. Todesfälle, bedingt durch Hyperthermie und Dyspnoe unter
Literaturübersicht
19
Erythromycinbehandlung bei heißem Wetter, wurden bei Fohlen festgestellt
(STRATTON-PHELPS et al., 2000). Weitere Nebenwirkungen, die durch Erythromycin
hervorgerufen werden sind Schwindel und Bauchkrämpfe, bei anderen Tierarten
außerdem Erbrechen (OTTERSON u. SARNA, 1990). Auch von Hepatotoxizität und
vorübergehender Taubheit wurde berichtet (PERITI et al., 1993). Erythromycin
verursacht kleine Leberläsionen mit leicht erhöhten Transaminasewerten (PERITI et al.,
1993). Durch Interaktion mit dem Zytochrom P450 wird die Wirkung von Antipyrin,
Theophyllin und Methylprednisolon verlängert (PESSAYRE, 1983). Die gleichzeitige
Verabreichung von Erythromycin und Digoxin führt zu erhöhten Digoxinkonzentrationen
im Serum (PETERS et al., 1992). Intramuskuläre Verabreichungen führen zu lokalen
Gewebsreaktionen (HILLIDGE, 1987; PRESCOTT u. BAGGOT, 1993), intravenöse
Applikationen zu Phlebitiden (PRESCOTT u. BAGGOT, 1993). Aufgrund der lokal
irritierenden Eigenschaften von Erythromycin vermutet HILLIDGE (1987), dass sich
nach oraler Verabreichung auf leeren Magen eine Gastritis entwickeln könnte.
Resistent gegenüber Erythromycin (MHK >8 µg/ml) sind Enterobacteriaceae,
Pseudomonas sp., Nocardia sp., Mycoplasma sp., Chlamydia psittaci und
Mycobacterium sp. (PRESCOTT u. BAGGOT; 1993).
2.1.4.2 Azithromycin
Azithromycin wird halbsynthetisch hergestellt. Es besteht aus einem 15gliedrigen
Laktonring, der ein methyl-substituiertes Nitrogenatom an Position 9a des
Aglykonringes eingefügt hat (LALAK u. MORRIS, 1993) (siehe Abb. 3).
Literaturübersicht
20
Abb. 3: Strukturformel von Azithromycin (nach STAHLM ANN u. LODE, 2001)
Azithromycin ist der Prototyp einer neueren Makrolid-Struktur, den Azaliden (PERITI et
al., 1993). Azithromycin weist eine größere Säurestabilität als Erythromycin auf
(PETERS et al., 1992; PRESCOTT u. BAGGOT, 1993). Es hat zusätzlich eine größere
Bioverfügbarkeit, höhere Anreicherung im Lungengewebe und längere Halbwertszeit
als Erythromycin (NOWAKOWSKI et al., 2004). Die modifizierte Struktur erlaubt des
Weiteren eine verstärkte Wirksamkeit im Vergleich zu Erythromycin gegen
gramnegative aerobe und anaerobe Bakterien, bei gleichbleibender Aktivität gegenüber
grampositiven aeroben und anaeroben Erregern (DAVIS et al., 2002). Die Wirksamkeit
wird durch ß-Laktamase produzierende Stämme nicht herabgesetzt (PETERS et al.,
1992). Azithromycin ist wirksam gegen Rhodococcus equi, Staphylococcus sp.,
Streptococcus sp., Haemophilus sp., Pasteurella sp., Clostridium sp., Bacteroides sp.,
Mycoplasma sp., Toxoplasma sp. und andere Pathogene. Resistent gegenüber
Azithromycin verhalten sich Klebsiella sp., Enterobacter sp., Citrobacter sp., Protheus
sp., Serratia sp. und Pseudomona sp. (NEU, 1991). Dabei geht NEU (1991) von einem
MHK <2 µg/ml für sensible Keime und von einem MHK von >8 µg/ml für resistente
Erreger aus.
Beim Menschen wird Azithromycin zur Behandlung von Erkrankungen des
Respirationstraktes, der Haut und des Weichteilgewebes, sowie bei Infektionen mit
dem Mycobacterium avium-Komplex eingesetzt (PETERS et al., 1992). Es hat sich
Literaturübersicht
21
durch Einmalbehandlung für die Therapie einer genitalen Chlamydiosis beim
Menschen bewährt (PRESCOTT u. BAGGOT, 1993).
Das Medikament weist einen postantibiotischen Effekt gegenüber einigen
grampositiven und gramnegativen Bakterien auf, welche häufig bei Infektionen des
Respirationstraktes anzutreffen sind (PETERS et al., 1992). Des Weiteren haben
Azalide verbesserte pharmakokinetische Eigenschaften, wie eine hohe und lang
anhaltende Gewebskonzentration, sowie eine verlängerte Halbwertszeit (LALAK u.
MORRIS, 1993). Zusätzlich ist die Proteinbindung von Azithromycin geringer als die
von Erythromycin, wodurch höhere Konzentrationen von freiem Wirkstoff für die
Verteilung im entzündlichen Gewebe vorliegen (PETERS et al., 1992). In
polymorphkernigen Leukozyten, Fibroblasten, Monozyten und Alveolarmakrophagen
werden schnell hohe Azithromycinkonzentrationen erreicht (LALAK u. MORRIS, 1993).
In Anbetracht der weiten Verteilung von Fibroblasten im Körper könnten diese Zellen
ein Reservoir für die langsame Freisetzung von Azithromycin darstellen (PETERS et
al., 1992). Azithromycin gelangt Dank seines dibasischen und amphophilen Charakters
durch passive Diffusion, sowie durch aktiven Transport in die Zelle. Die intrazelluläre
Anreicherung ist am stärksten in den ersten 24 Stunden und hält bis zu 72 Stunden an.
Die Azithromycinkonzentrationen beeinträchtigen nicht die Zellfunktion von
Phagozyten. Im Vergleich zu Erythromycin ist die Abgabe des Medikaments von den
Phagozyten langsamer, aber verstärkt, wenn die Zellmembran Bakterien ausgesetzt
wird (LALAK u. MORRIS, 1993). Azithromycin wird auch im Vergleich zu Clarithromycin
langsamer aus den Zellen freigegeben (NIGHTINGALE, 1997). In bronchoalveolären
Zellen und in PELF (pulmonary epithelial lining fluid) wurden in einer Studie an Fohlen
15-170fach und 1-16fach höhere Azithromycinkonzentrationen als im Serum
festgestellt. Damit wurde die MHK 90 (1 µg/ml) von 60 Rhodococcus equi Isolaten
übertroffen. 48 Stunden nach der letzten oralen Verabreichung waren die
Konzentrationen von Azithromycin in der PELF und bronchoalveolären Zellen immer
noch hoch (JACKS et al., 2001). In der Studie von DAVIS et al. (2002) war vier bis
zwölf Stunden nach der oralen Medikamenteneingabe die Azithromycinkonzentration in
polymorphkernigen Neutrophilen 89-200 mal größer als in der korrespondierenden
Plasmakonzentration. Sie stellten eine persistierende Wirkstoffkonzentration in den
polymorphkernigen Neutrophilen für 120 Stunden fest mit einer Halbwertszeit von 49
Stunden. Damit war 120 Stunden nach Medikamentenverabreichung die
Literaturübersicht
22
Azithromycinkonzentration in den Neutrophilen viermal größer als der MHK von
Rhodococcus equi. Die Plasmahalbwertszeit betrug hingegen 16-18 Stunden. DAVIS
et al. (2002) konnten Azithromycin nicht in der bronchoalveolären Flüssigkeit
feststellen. Bei Fohlen stellten JACKS et al. (2001) nach intragastraler Applikation von
10 mg/kg Körpergewicht nach 1,8 Stunden die höchste Serumkonzentration des
Medikamentes fest. Die Bioverfügbarkeit lag bei 56%. DAVIS et al. (2002) stellten bei
gleicher Dosierung eine Bioverfügbarkeit von 39 ± 20% fest. Nach intravenöser
Verabreichung wurde in der Studie von JACKS et al. (2001) die Halbwertszeit mit 20,3
Stunden festgelegt. Sie ist somit um ein Vielfaches höher, als die beschriebene
Halbwertszeit von Erythromycin, die mit einer Stunde angegeben wird (LAKRITZ et al.,
1999). Die Bodyclearance lag bei 10,4 ml/Minute x kg, und das Verteilungsvolumen
wurde mit 18,6 l/kg beschrieben. DAVIS et al. (2002) ermittelten ein
Verteilungsvolumen von 12,4 l/kg. Bei JACKS et al. (2001) fiel die Absorption des
Medikamentes bei hungernden und gefütterten Fohlen gleich aus. DAVIS et al. (2002)
bezeichneten die Absorption nach oraler Applikation als moderat. Der Applikationsweg
zeigte keinen Unterschied in Verteilung und Elimination des Medikamentes. Die relativ
geringe maximale Konzentration von Azithromycin im Blut wird auf die schnelle und
intensive Aufnahme des Medikamentes aus der Zirkulation in das Gewebe erklärt
(PETERS et al., 1992). Als Nachteil der geringen Konzentration im Blut nennen
PETERS et al. (1992) den möglichen Durchbruch einer Bakteriämie.
Zur Behandlung einer Rhodococcus equi-Infektion schlagen JACKS et al. (2001) eine
tägliche orale Dosis von 10 mg/kg für fünf Tage und anschließend alle 48 Stunden vor.
Auch DAVIS et al. (2002) favorisieren eine Dosierung von 10 mg/kg p.o. einmal täglich.
Diese Dosierung stellt eine wesentliche Erleichterung gegenüber Erythromycin dar, das
zwei- bis viermal täglich verabreicht werden soll (DAVIS et al., 2002). Auch GIGUÈRE
et al. (2004) begrüßten die nur einmal tägliche Verabreichung von Azithromycin,
konnten jedoch ansonsten keine Vorteile der Kombination Azithromycin-Rifampicin
gegenüber der traditionellen Behandlung der Rhodococcus equi-Pneumonie mit
Erythromycin-Rifampicin beobachten.
Keine Nebenwirkungen stellten sich nach oraler Verabreichung von Azithromycin ein.
Nach i.v. Injektionen wurden Gähnen, Zittern, Ataxie und Schwäche beobachtet
(JACKS et al., 2001). DAVIS et al. (2002) konnten in ihren Untersuchungen weder
nach p.o. noch nach i.v. Applikationen von Azithromycin Nebenwirkungen feststellen. In
Literaturübersicht
23
der Untersuchung von GIGUÈRE et al. (2004) trat bei 5% der Fohlen nach oraler
Verabreichung des Medikamentes Durchfall auf. PETERS et al. (1992) sprechen von
der Häufigkeit gastrointestinaler Unvertäglichkeiten von 9,6%, sowie von 1,3% mit
Nebenwirkungen, die das zentrale oder periphere Nervensystem betreffen.
Azithromycin sollte nicht bei vorhandenen Leberschäden oder bei Patienten mit Leber-
und Niereninsuffizienz eingesetzt werden. Eine Verabreichung bei einer Makrolid-
Überempfindlichkeit ist kontraindiziert. Bei gleichzeitiger Behandlung mit Digoxin sollten
die Serumkonzentrationen von Digoxin überwacht werden (PETERS et al., 1992). Die
Verabreichung von Azithromycin bei tragenden Tieren führte zu keiner
Beeinträchtigung von Fötus oder Muttertier (CHARLES u. SEGRETI, 1997).
2.1.4.3 Clarithromycin
Clarithromycin wird hauptsächlich in der Humanmedizin eingesetzt (JACKS et al.,
2002; FREY u. LÖSCHER, 2002). Das Medikament wird halbsynthetisch aus
Erythromycin hergestellt. Es besteht aus einem 14gliedrigen Laktonring, mit einer
Methoxylgruppe an dem C6 Molekül. Clarithromycin kann auch als 6-O-methyl-
Erythromycin bezeichnet werden (PERITI et al., 1993), da es ein Derivat von
Erythromycin ist (PRESCOTT u. BAGGOT, 1993) (siehe Abb. 4).
Abb. 4: Strukturformel von Clarithromycin (nach STA HLMANN u. LODE, 2001)
Clarithromycin besitzt Dank seiner verbesserten Bioverfügbarkeit und Säurestabilität
eine hohe therapeutische Bedeutung, ist allerdings sehr teuer (CHARLES u. SEGRETI,
1997; FREY u. LÖSCHER, 2002). Es weist des Weiteren eine höhere Verteilung in das
Lungengewebe und eine verlängerte Halbwertszeit gegenüber Erythromycin auf
Literaturübersicht
24
(NOWAKOWSKI et al., 2004). Das Medikament wird in der Leber durch das Cytochrom
P450 metabolisiert. Der entstehende 14-Hydroxyl-Metabolid stellt die mikrobiologisch
aktive Komponente dar.
Das Medikament hat eine verbesserte Aktivität gegenüber grampositiven Kokken im
Vergleich zu Erythromycin (CHARLES u. SEGRETI, 1997). PRESCOTT und BAGGOT
(1993) beschreiben Clarithromycin als doppelt so wirksam gegenüber Bakterien im
Vergleich zu Erythromycin. Es ist das wirksamste Medikament gegen Legionella
pneumophila. Auch gegen Chlamydia pneumoniae und Chlamydia trachomatis ist
Clarithromycin verstärkt wirksam (WILLIAMS u. SEFTON, 1993). Zusätzlich wurde
gegenüber Mycobacterium avium eine gute Wirksamkeit festgestellt (PRESCOTT u.
BAGGOT, 1993).
Die Eliminationshalbwertszeit lag in Untersuchungen beim Fohlen bei 4,8 Stunden
(JACKS et al., 2002). Sie ist somit länger, als die beschriebene Halbwertszeit von
Erythromycin von einer Stunde, jedoch kürzer, als die von Azithromycin von 20
Stunden (LAKRITZ et al., 1999; JACKS et al., 2001). Wie bei den anderen Makroliden
wurde auch bei Clarithromycin eine höhere Konzentration im Gewebe und in den
Makrophagen, als im Serum festgestellt (JACKS et al., 2002). Nach einer einmaligen
oralen Verabreichung von 10 mg/kg lag die Serumkonzentration des Medikamentes für
zwölf Stunden über dem MHK 90 von 0,12 µg/ml von Rhodococcus equi. Basierend auf
dieser Erkenntnis, schlugen JACKS et al. (2002) eine Dosierung von Clarithromycin zur
Behandlung einer Rhodococcus equi-Pneumonie beim Fohlen von 7,5 mg/kg alle zwölf
Stunden vor. Die maximalen Serumkonzentrationen waren in dieser Studie höher, als
die Konzentrationen, die nach Azithromycinverabreichung erreicht wurden (JACKS et
al., 2001). Da Azithromycin in der Studie von JACKS et al. (2001) einen hohen
Wirkstoffspiegel in der PELF und den Alveolarmakrophagen erreichte, gehen die
Autoren GIGUÈRE et al. (2004) auch bei Clarithromycin von hohen Wirkstoffspiegeln in
der Lunge aus. In einer Untersuchung stellten GIGUÈRE et al. (2004) fest, dass die
Kombination von Clarithromycin mit Rifampicin, den Kombinationen Erythromycin mit
Rifampicin und Azithromycin mit Rifampicin zur Behandlung einer Rhodococcus equi-
Pneumonie beim Fohlen besser geeignet ist. Gerade bei Fohlen mit auffälligen
röntgenologisch feststellbaren Lungenveränderungen zeigte die Studie, dass
Clarithromycin-Rifampicin gegenüber Azithromycin-Rifampicin bessere therapeutische
Ergebnisse erzielt. Von einer möglichen verstärkten Wirkung von Clarithromycin in
Literaturübersicht
25
Kombination mit Rifampicin oder Minocyclin wird berichtet (PRESCOTT u. BAGGOT,
1993).
In den Versuchen von GIGUÈRE et al. (2004) traten bei 28% der Fohlen, die mit
Clarithromycin behandelt wurden Durchfall auf. Bei Azithromycin dagegen, zeigten nur
5% der Fohlen diese Nebenwirkung und 17% der Probanden, die mit Erythromycin
behandelt wurden, entwickelten unter der Therapie eine Diharroe. CHARLES u.
SEGRETI (1997) beschreiben, dass Clarithromycin besser als Erythromycin vertragen
wird und weniger gastrointestinale Störungen auftreten. JACKS et al. (2002) stellten
nach oraler Verabreichung von Clarithromycin an Fohlen keine Nebenwirkungen fest.
Von einer verlängerten Prothrombinzeit, Hyperbilirubinämie, Hepatomegalie und
erhöhten Leberenzymen wird berichtet. Die Verabreichung hoher Dosen von
Clarithromycin an tragende Tiere führte zu Wachstumshinderung bei Affen,
Gaumenspalte bei Mäusen und kardiovaskulären Anormalitäten bei Ratten (CHARLES
u. SEGRETI, 1997).
2.1.4.4 Tilmicosin
Tilmicosin ist ein chemisch modifiziertes Makrolid. Es besitzt einen 16gliedrigen
Laktonring und kann auch als 20-deoxo-20-(3,5-dimethylpiperidin-1-yl) Desmycosin
bezeichnet werden (PRESCOTT u. BAGGOT, 1993; FREY u. LÖSCHER, 2002) (siehe
Abb. 5).
Literaturübersicht
26
Abb. 5: Strukturformel von Tilmicosin (nach FREY u. LÖSCHER, 2002)
Die antibakteriellen Eigenschaften liegen zwischen Erythromycin und Tylosin
(PRESCOTT u. BAGGOT, 1993). Es ist des Weiteren gegen Mycoplasma sp. wirksam
(PRESCOTT u. BAGGOT, 1993; FREY u. LÖSCHER, 2002). Tilmicosin wurde für die
Behandlung von Erkrankungen des Respirationstraktes bei Rindern entwickelt, da es
wirksam gegen Mannheimia haemolytica, Arcanobacterium pyogenes, Haemophilus
somnus und Mycoplasma sp. ist. Nach einer einmaligen subkutanen (s.c.)
Verabreichung von 10 mg/kg wird eine Konzentration im Lungengewebe erreicht, die
72 Stunden über dem MHK von Mannheimia haemolytica bleibt (PRESCOTT u.
BAGGOT, 1993). Tilmicosin ist somit das einzige Makroloid neben Tulathromycin,
welches nach einmaliger Applikation ausreichend wirksame therapeutische Effekte
aufweist (NOWAKOWSKI et al., 2004). Im Serum von Kälbern wird nach einer Stunde
bei gleicher Dosierung eine Konzentration von 1-2 mg/ml erreicht, wobei die
Konzentrationen in der Lunge 8-96 Stunden nach Verabreichung des Medikamentes
bis 45fach höher liegen. Die Lungenkonzentration erreicht ihr Maximum nach 24
Stunden (FREY u. LÖSCHER, 2002).
Zur Behandlung von Lungen- und Atemwegsinfektionen beim Rind, hervorgerufen
durch Pasteurella multocida und Mannheimia haemolytica, empfehlen FREY und
LÖSCHER (2002) eine einmalige s.c. oder i.m. Injektion von 10 mg/kg. Für die
Literaturübersicht
27
Verwendung von Tilmicosin beim laktierenden Rind haben noch keine abschließenden
Untersuchungen stattgefunden (PRESCOTT u. BAGGOT, 1993). Zur Metaphylaxe
beim Ferkel und Mastschwein wurde Tilmicosinphosphat als Arzneimittelvormischung
zugelassen, wenn die Erkrankung durch Actinobacillus pleuropneumoniae,
Mycoplasma hyopneumoniae und Pasteurella multocida hervorgerufen wurde (FREY u.
LÖSCHER, 2002).
Das Medikament wird aufgrund seiner starken Kardiotoxizität nicht bei Mensch, Hund,
Pferd, Schaf oder Ziege eingesetzt. Tilmicosin kann fatale Folgen nach i.m. Applikation
beim Schwein haben und Vorsicht ist bei der versehentlichen Injektion von Menschen
geboten (PRESCOTT u. BAGGOT, 1993).
2.1.4.5 Tylosin
Das nur in der Veterinärmedizin eingesetzte Tylosin gehört auch zur Gruppe der
16gliedrigen Makrolid-Antibiotika und wird von Streptomyces fradiae gewonnen
(PRESCOTT u. BAGGOT, 1993; FREY u. LÖSCHER, 2002). Es befinden sich zwei
Zuckerreste am C5 Atom des Laktonringes (PERITI et al., 1993). Das Medikament
besteht aus einem Gemisch, das neben Tylosin zu ingesamt 20% noch Desmycosin,
Marosin und Relomycin enthält (FREY u. LÖSCHER, 2002) (siehe Abb. 6).
Abb. 6: Strukturformel von Tylosin (nach FREY u. LÖ SCHER, 2002)
Es hat ein ähnliches Wirkungsspektrum wie Erythromycin. Dabei ist es weniger aktiv
gegen Bakterien, außer Treponema hyodysenteriae, aber stärker wirksam gegen eine
breite Auswahl von Mykobakterien (BURROWS, 1980; PRESCOTT u. BAGGOT,
1993). Ähnlich den anderen Makroliden ist auch Tylosin eine schwache Base und sehr
lipidlöslich (PRESCOTT u. BAGGOT, 1993). Bei pH-Werten über acht weist es eine
Literaturübersicht
28
höhere Wirksamkeit gegenüber gramnegativen Bakterien auf (BURROWS, 1980). Bei
Hunden und Rindern wird eine Halbwertszeit von einer Stunde und ein
Verteilungsvolumen von 1,7 bzw. 1,1 l/kg angegeben (PRESCOTT u. BAGGOT, 1993).
Tylosin stellt die erste Wahl für die Behandlung von durch Mykobakterien verursachte
Erkrankungen dar (BURROWS, 1980). Obwohl in vitro keine synergistischen Effekte
ersichtlich sind, werden Tylosin-Sulfonamid Kombinationen zur Behandlung von
Erkrankungen des Respirationstraktes in der Kleintiermedizin eingesetzt. Tylosin-
Sulfonamid Kombinationen sind effektiv in der Prävention und Behandlung von
proliferativer haemorrhagischer Enteropathie. Tylosin findet beim Schwein des
Weiteren zur Behandlung von Erysipelen und bei Infektionen mit Arcanobacterium
pyogenes und Anaeroben Verwendung. Bei Rindern wird Tylosin zur Behandlung von
Pneumonien, Fußräude, Metritis und durch grampositive Kokken bedingte Mastitis
eingesetzt. Eine weitere Verwendung findet Tylosin zur Behandlung von Arthritiden
beim Kalb und gegen Campylobacter-Infektionen beim Schaf (FREY u. LÖSCHER,
2002). Bei Ziegen wird das Medikament zur Behandlung einer Mykoplasma-
Pneumonie, verursacht durch Mycoplasma mycoides ssp. capri eingesetzt. Beim
Geflügel findet Tylosin zur Bekämpfung von Mykoplasma-Infektionen und gegen
Spirochäten Verwendung (PRESCOTT u. BAGGOT, 1993; FREY u. LÖSCHER, 2002).
Tylosin wird zur i.m. Applikation, zur intramammären Verabreichung und als
Futtersubstitution angeboten (PRESCOTT u. BAGGOT, 1993). Tylosin wird als Tarat
oder Phosphat für die orale Verwendung hergestellt (FREY u. LÖSCHER, 2002). Dabei
wird Tylosin-Tarat schnell vom Darm resorbiert, Tylosin-Phosphat hingegen wird nur
schlecht von Interstitium aufgenommen (PRESCOTT u. BAGGOT, 1993). In
Injektionslösungen ist das Medikament als Base enthalten (FREY u. LÖSCHER, 2002).
Zum Teil hohe Resistenzen gegenüber Tylosin müssen bei Mycoplasma gallisepticum
und Staphylococcus aureus beachtet werden (FREY u. LÖSCHER, 2002).
2.1.4.6 Spiramycin
Spiramycin gehört zu den natürlich hergestellten Vertretern der 16gliedrigen Makrolide
(PERITI et al., 1993) (siehe Abb. 7).
Literaturübersicht
29
Abb. 7: Strukturformel Spiramycin (nach FREY u. LÖS CHER, 2002)
Spiramycin ist weniger aktiv gegen Bakterien als Erythromycin. Es hat ein ähnliches
Wirkspektrum wie die anderen Makrolide, ist jedoch gegen Mykoplasmen weniger
wirksam als Tilmicosin oder Tylosin. Es hat eine hohe Wirksamkeit gegen intrazelluläre
Organismen. Aus diesem Grund wird es in der Humanmedizin zur Behandlung von
akuten Toxoplasma-Infektionen eingesetzt und ist wahrscheinlich auch bei der
Kryptosporidiose wirksam (PRESCOTT u. BAGGOT, 1993).
Anwendungsgebiete beim Tier sind Arthritiden, Atemwegserkrankungen und
Mykoplasmose beim Geflügel. Weitere Indikationen für die Behandlung mit Spiramycin
sind Mundhöhlenerkrankungen beim Hund (FREY u. LÖSCHER, 2002). Das
Medikament wird erfolgreich in der Behandlung der kontagiösen bovinen
Pleuropneumonie verwendet (PRESCOTT u. BAGGOT, 1993). Spiramycin wird bei
Mastitiden, die durch die Erreger Streptokokken, Staphylokokken und Mykoplasmen
verursacht werden eingesetzt (FREY u. LÖSCHER, 2002). Beim Schwein hat
Spiramycin ähnliche Anwendungsgebiete wie Tylosin (PRESCOTT u. BAGGOT, 1993).
Spiramycin erreicht 25-60fach größere Gewebs- als Serumkonzentrationen.
2.1.4.7 Kitasamycin
Kitasamycin hat ein ähnliches Wirkspektrum wie Erythromycin, Spiramycin und Tylosin.
Es gibt wenige Untersuchungen für den Einsatz von Kitasamycin in der
Veterinärmedizin, obwohl das Medikament schon lange in Japan eingesetzt wird
(PRESCOTT u. BAGGOT, 1993).
Literaturübersicht
30
Mittlerweile wird Kitasamycin zur Behandlung von Dysenterien und Pneumonien beim
Schwein eingesetzt. Beim Geflügel wird das Medikament zur Bekämpfung von
Mykoplasma-Infektionen verwendet.
Beim Schwein wird eine Dosierung von 20 mg/kg auf oralem oder parenteralem Weg
empfohlen. Dem Geflügel werden 50 mg/kg über das Trinkwasser verabreicht (FREY u.
LÖSCHER, 2002).
2.1.4.8 Tulathromycin
Tulathromycin stellt den ersten Vertreter der Triamilid-Antibiotika dar (TRAEDER u.
GROTHUES, 2004). Die Triamilide sind eine Untergruppe der Makrolide
(NOWAKOWSKI et al., 2003; GALER et al., 2004). Tulathromycin ist als 10%ige
Injektionslösung unter dem Handelsnamen Draxxin® auf dem Markt.
Es ist für die Behandlung von Atemwegserkrankungen bei Rind und Schwein
zugelassen. Das Wirkspektrum umfasst alle relevanten bakteriellen Pathogene, die bei
respiratorischen Erkrankungen bei diesen Tierarten nachgewiesen werden.
Eine Dosierung von 2,5 mg Tulathromycin je kg Körpergewicht wird angegeben. Das
entspricht 1 ml Draxxin® pro 40 kg Körpergewicht (TRAEDER u. GROTHUES, 2004).
Tulathromycin wurde für eine einmalige parenterale Administration bei Rind und
Schwein entwickelt (BENCHAOUI et al., 2004).
Als einzige Nebenwirkung wurde nach subkutaner Applikation beim Rind von einer
Schwellung an der Injektionsstelle berichtet (TRAEDER u. GROTHUES, 2004). Auf
Tulathromycin wird detailliert im Abschnitt 2.2 eingegangen.
2.1.5 Wirkspektrum der Makrolide
Makrolide haben eine schwache in vitro Aktivität gegen Enterobacteriaceae und
gramnegative Bakterien (WILLIAMS u. SEFTON, 1993). Sie wirken hauptsächlich
gegen grampositive Bakterien (BURROWS, 1980) und pyogene Erreger, wie zum
Beispiel Streptokokken und Staphylokokken. Auch anaerobe Bakterien, sowie teilweise
Mikroorganismen der Mundflora und einige grampositive Bazillen fallen in ihr
Wirkspektrum. Viele gramnegative Bazillen sind hingegen von Natur aus resistent, da
die Makrolide nicht die äußere Zellwand durchdringen können (CHARLES u. SEGRETI,
1997). Die Aktivität der Makrolide gegen gramnegative Bakterien steigt im alkalischen
Bereich (pH-Wert >8) deutlich an (BURROWS, 1980). Die neueren Makrolide weisen
Literaturübersicht
31
zusätzlich eine Aktivität gegen opportunistische Keime, wie Mycobacterium avium
intracellulare, Pneumocystis carinii und Toxoplasma gondii auf (WILLIAMS u. SEFTON,
1993). Des Weiteren sind sie gegen die meisten Pneumonieerreger, wie Streptococcus
pneumoniae, Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis, Mycoplasma
pneumoniae, Legionella pneumophila und Chlamydia pneumoniae wirksam (CHARLES
u. SEGRETI, 1997). Keiner der derzeitigen Makrolide ist wirksam gegen Methilin
resistente Staphylokokken oder Enterokokken (CHARLES u. SEGRETI, 1997).
2.1.6 Wirkmechanismus der Makrolide
Damit Antibiotika wirksam werden können, müssen drei Kriterien erfüllt werden. Der
wirksame Metabolid muß an eine spezifische Stelle an oder in der Bakterienzelle
binden können. Bei Makroliden ist dies die 50s-Untereinheit der bakteriellen
Ribosomen. Weiterhin muß das Medikament eine ausreichende Anzahl dieser
Bindungsstellen besetzen, muß also in ausreichender Konzentration vorliegen.
Schließlich muss eine ausreichend lange Therapiezeit eingehalten werden, um eine
Genesung des Patienten zu erreichen (NIGHTINGALE, 1997). Der einfachste Weg,
über den die Makrolide in die Phagozyten gelangen, ist die Diffusion. Auch Pinozytose
und der Eintritt über Transportproteine sind möglich. Aufgrund ihres basischen
Charakters gelangen sie anschließend in die Lysosomen. Dort werden sie protoniert
und können die Lysosomen oder Endosomen nicht mehr verlassen. Durch die Fusion
von Endosomen oder Lysosomen mit Phagosomen kommen die intrazellulären
Makrolide mit den phagozytierten Bakterien in Kontakt. Durch Stoffe wie Probenecid
wird der Efflux anorganischer Anionen aus der Zelle gehemmt und intrazelluläre
Konzentration der Antibiotika erhöht (DONOWITZ, 1994). Der Angriffspunkt der
Makrolide an der Bakterienzelle stellen die ribosomalen 50s-Untereinheiten dar. Durch
kovalente Bindung an das Peptidyltransferase-Zentrum wird die bakterielle
Proteinsynthese gehemmt (FREY u. LÖSCHER, 2002). Sie unterdrücken die
Verlängerung der Proteinkette und stören die Translokation der Peptidyl-RNA von der
Akzeptor- zur Donorstelle. Makrolide können bei jedem Zyklusschritt der
Proteinsynthese an die Ribosomen binden. Die Hemmung der bakteriellen
Proteinsynthese ist reversibel (VANUFFEL u. COCITO, 1996).
Literaturübersicht
32
2.1.7 Anwendungsgebiete der Makrolide
In der Veterinärmedizin sind Antibiotika die am meisten verwendeten Medikamente.
Der größte Teil dieser Stoffgruppe wird zur Behandlung respiratorischer Erkrankungen
eingesetzt (LARSON, 1980). Hierbei sind insbesondere Tilmicosin, Erythromycin,
Tylosin, Spiramycin (GALER et al., 2004) und Kitasamycin von Bedeutung (FREY u.
LÖSCHER, 2002). Makrolid-Antibiotika sind 2. Wahl gegen grampositive Bakterien und
werden Dank ihrer hohen Gewebskonzentration bei Pneumonien und Mastitiden
eingesetzt (BURROWS, 1980). Mittel der Wahl stellen sie hingegen für die Behandlung
von Infektionen des oberen und unteren Respirationstraktes, sowie von Haut und
Weichteilerkrankungen dar. Sie sind eine gute Alternative zu Penicillin, wenn eine
Allergie gegen dieses Medikament vorliegt (CARBON, 1998). Bei Schwein und Rind
werden vor allem Erythromycin, Tylosin, Spiramycin und Tilmicosin eingesetzt
(BENCHAOUI et al., 2004; NOWAKOWSKI et al., 2004). Diese Medikamente stehen
für die Prophylaxe, Kontrolle und Behandlung von bakteriell bedingten respiratorischen
Erkrankungen beim Schwein meist in Form von Futter- oder Wasserzusätzen zur
Verfügung (BENCHAOUI et al., 2004). Für Rinder liegen die Makrolide meist als
Injektionslösungen vor (NOWAKOWSKI et al., 2004). Um therapeutische Erfolge zu
erzielen, muß die Behandlung mit Makrolid-Antibiotika einige Tage erfolgen
(BENCHAOUI et al., 2004; GALER et al., 2004). Die Medikation sollte mindestens drei
Tage und ein bis zwei Tage nach Abklingen der klinischen Symptomatik weiter
verabreicht werden (LARSON, 1980). Bei Rindern ist Tilmicosin das einzige
Medikament neben dem neu zugelassenen Tulathromycin, welches zur erfolgreichen
Therapie von Erkrankungen des Respirationstraktes nur einmalig appliziert werden
muß (GALER et al., 2004). Die neu entwickelten 14-, 15-, und 16gliedrigen Makrolide
weisen eine verbesserte klinische Wirksamkeit als die älteren Vertreter dieser Gruppe,
wie z.B. Erythromycin auf (NOWAKOWSKI et al., 2004).
2.1.8 Pharmakokinetik der Makrolide
Die neu entwickelten 14gliedrigen Makrolide weisen ein ähnliches antimikrobielles
Spektrum wie Erythromycin auf, teilen aber nicht dessen Säureinstabilität, geringe
intestinale Absorption, kurze Eliminationshalbwertszeit und gastrointestinale
Unverträglichkeit (CHARLES u. SEGRETI, 1997). Auch die großen interindividuellen
Literaturübersicht
33
sowie intraindividuellen Variationsbreiten und hohe Bindungsaffinität zu
Serumproteinen sind bei den neueren Makroliden zurückgegangen (CARBON, 1998).
Nach oraler Aufnahme werden die Antibiotika absorbiert und gelangen über die Vena
porta in die Leber. Ein kleiner Teil des absorbierten Medikamentes wird inaktiviert, der
weitaus größere Teil wird über die Galle in den Darm entlassen. Im Darm wird das
Makrolid dann reabsorbiert und gelangt in den enterohepatischen Kreislauf (WILLIAMS
u. SEFTON, 1993). Die in Form verschiedener Salze oder Ester vorliegenden
Makrolide werden hydrolytisch oder enzymatisch in die aktive Form umgewandelt,
welche sich aufgrund ihrer basischen Eigenschaften im Gewebe anreichert. Dadurch
wird in bestimmten Geweben wie Lunge, Leber und Euter das drei- bis zehnfache der
Serumkonzentrationen erreicht (WILLIAMS u. SEFTON 1993; FREY u. LÖSCHER,
2002). Das Medikament reichert sich außerdem in Niere, Milz und Reproduktionstrakt
an. Geringe Mengen konzentrieren sich in der Skelettmuskulatur (BURROWS, 1980).
CARBON (1998) und NIGHTINGALE (1997) berichten sogar, dass Makrolide nicht nur
in die Lunge gelangen, sondern sich am Ort der Infektion anreichern, da sie aus den
umliegenden Gewebezellen freigesetzt werden. Die Mikroorganismen werden somit
hohen Antibiotikakonzentrationen ausgesetzt. Nur der Anteil des Medikamentes, der
nicht in den Organen zurückgehalten wird, gelangt in die peripheren Venen und kann
dann im Serum nachgewiesen werden (WILLIAMS u. SEFTON, 1993). Alle Makrolide
akkumulieren intrazellulär, vornehmlich in polymorphkernigen Leukozyten und
Makrophagen (CARBON, 1998). Die Exkretion findet hauptsächlich über die Galle statt
(WILLIAMS u. SEFTON, 1993). Ein weiterer Teil wird in aktiver Form über den Urin
ausgeschieden (BURROWS, 1980) (siehe Abb. 8).
Literaturübersicht
34
Gastro-intestinal-
trakt
LeberBilliäre
Exkretion
HerzLunge
Gewebe
Zellen
Portalvene
Lebervene
Systemische Arterien
Periphere Venen
MilzMuskelLeberNiere
UrinäreExkretion
Abb. 8: Absorption von Makrolid-Antibiotika nach or aler Verabreichung (nach
WILLIAMS u. SEFTON, 1993)
2.1.9 Pharmakodynamik der Makrolide
In den meisten Fällen ist der Effekt der Makrolid-Antibiotika bakteriostatisch
(BURROWS, 1980). In hohen Konzentrationen sind sie bakterizid (NEU, 1991;
PRESCOTT u. BAGGOT, 1993). Makrolide weisen eine zeitabhängige bakterizide
Wirkung hauptsächlich gegen Streptokokken auf. Steigende Konzentrationen der
Makrolide haben einen geringen Einfluss auf die Beschleunigung des bakteriziden
Effektes. Sie werden daher auch als konzentrationsunabhängige Antibiotika
bezeichnet. Hat die Serumkonzentration des Medikamentes einmal das zwei- bis
Literaturübersicht
35
vierfache des MHK erreicht, bleibt die bakterielle Elimination konstant und die
Abhängigkeit von der Serumkonzentration wird kleiner. Je länger die Einwirkzeit, desto
größer ist die antimikrobielle Aktivität. Ziel bei der Behandlung mit
konzentrationsunabhängigen Wirkstoffen ist es, eine längstmögliche Wirkzeit der
Medikamente zu garantieren (NIGHTINGALE, 1997). Die optimale Wirksamkeit liegt bei
einem pH-Wert von acht vor. Bei einem geringeren pH-Wert von <6 findet eine
signifikante Reduktion der Wirksamkeit statt (BURROWS, 1980). Den Makroliden ist
ein postantibiotischer Effekt eigen, der länger gegen grampositive Kokken und
Streptokokken, als gegen Haemophilus influenzae und Staphylokokken anhält. Dabei
lässt sich eine lineare Beziehung zwischen der Dauer des postantibiotischen Effektes
und der Konzentration oder der Einwirkungszeit des Makrolids feststellen (CARBON,
1998).
2.1.10 Nebenwirkungen
Makrolide sind Antibiotika, die selten schwere Nebenwirkungen verursachen (PERITI et
al., 1993; WILLIAMS u. SEFTON, 1993). Die häufigsten Nebenwirkungen sind
gastrointestinale Störungen. Sie treten besonders dann auf, wenn das Medikament in
hohen Dosen verwendet wird (SHANSON et al., 1984). Da Makrolide stark mit der
Galle in den Darm ausgeschieden werden und dort hohe Konzentrationen erreichen,
kann es zur Beeinträchtigung der intestinalen Mikroflora und einem Überwuchern von
resistenten und unempfindlichen Keimen kommen. Ein solcher Erreger ist Clostridium
difficile, der zu pseudomembranösen Colitiden bei Mensch und Hund führen kann
(PERITI et al., 1993). Makrolide haben stimulierende Effekte auf die Darmmotilität
(PERITI et al., 1993), ähnlich den Wirkungen des endogen freigesetzten Motilin
(PEETERS et al., 1989; OTTERSON u. SARNA, 1990). Diese Eigenschaft ist
insbesondere den 14- und 15gliedrigen Makroliden eigen, wohingegen die 16gliedrigen
keine Kontraktionen des Gastrointestinaltraktes auslösen (PERITI et al., 1993). Des
Weiteren scheinen sie zusätzlich zu den Motilinrezeptoren im Darm auch mit den P450
Rezeptoren der Leber und einigen Gehörrezeptoren zu interferieren (WILLIAMS u.
SEFTON, 1993; CHARLES u. SEGRETI, 1997). Durch Interaktion mit dem Zytochrom
P450 der Leber kann es zu hohen Terfenadinekonzentrationen kommen (CHARLES u.
SEGRETI, 1997). Generell ist das hepatotoxische Potential der Makrolide als gering
einzustufen (PERITI et al., 1993). Durch Makrolide ausgelöstes Erbrechen wird
Literaturübersicht
36
wahrscheinlich durch Interaktion mit 5-Hydroxitryptamin-Rezeptoren ausgelöst, da die
Verabreichung eines Rezeptorantagonisten das Erbrechen signifikant reduziert
(WILLIAMS u. SEFTON, 1993). Da Makrolide stark reizend sind, produzieren sie eine
entzündliche Gewebsreaktion nach intramuskulärer Verabreichung. Daher sollte eine
Injektion mit Vorsicht und tief in größere Muskelmassen erfolgen. Intravenöse
Injektionen können zu Thrombophlebitiden, sowie Periphlebitiden führen und sollten
nur wenn unbedingt nötig durchgeführt werden (PRESCOTT u. BAGGOT, 1993).
2.1.11 Resistenzen
Resistenzen entstehen schrittweise durch Mutation und Selektion von bestimmten
Stämmen der Erreger oder durch die Übertragung von Plasmiden. Erstere sind häufig
unstabil und können während der Behandlung auftreten. Plasmide hingegen können
sich vermehren und in andere Bakterienzellen transferiert werden. Die Vermehrung
resistenter Plasmide wird durch subtherapeutische Antibiotikakonzentrationen
begünstigt (VANNUFFEL u. COCITO, 1996). Auch Kreuzresistenzen zwischen den
Makroliden sind festgestellt worden (PRESCOTT u. BAGGOT, 1993). Folgende
Mechanismen sind bei der Resistenzentwicklung von Bedeutung: Enzymatische
Methylierung des Bindungsortes am Ribosom, wodurch die Proteinsynthese durch die
Antibiotika nicht mehr gehemmt werden kann. Auch die Inaktivierung durch
enzymatische Spaltung des Laktonringes, sowie Ausschleusung aus der Bakterienzelle
durch energieverbrauchende Prozesse führen zu verminderter Wirksamkeit des
Antibiotikums. Eine herabgesetzte Penetration des Wirkstoffes in die Zelle stellt einen
weiteren Mechanismus zur Resistenzentwicklung dar (BURROWS, 1980; VANNUFFEL
u. COCITO, 1996; FREY u. LÖSCHER, 2002). Diese Resistenz schließt die
sogenannte MLS-Gruppe ein, da Makrolide, Lincosamide und Streptogramine
einbezogen sind (FREY u. LÖSCHER, 2002). Es besteht generell eine Kreuzresistenz
zwischen 14- bis 17gliedrigen Makroliden (TRAEDER u. GROTHEUS, 2004). Der
langanhaltende Wirkspiegel über der minimalen Hemmkonzentration (MHK) der
Pathogene verhindert eine Resistenzselektion bei Tulathromycin (TRAEDER u.
GROTHUES, 2004).
Literaturübersicht
37
2.2 Tulathromycin
2.2.1 Struktur
Tulathromycin wird als Fermentationsprodukt durch organische Synthese gewonnen.
Es gehört somit zu den halbsynthetischen Makrolid-Antibiotika. Im Unterschied zu den
anderen Vertretern dieser Gruppe sind an Tulathromycin drei Aminogruppen angefügt
(BENCHAOUI et al., 2004). Aus diesem Grund wird diese Makrolid-Untergruppe, zu der
Tulathromycin gehört, als Triamilide bezeichnet (TRAEDER u. GROTHUES, 2004).
Dieser Wirkstoff besteht aus einem Gemisch von einem 13- und einem 15gliedrigen
Laktonring, welche in einem Verhältnis von 10 zu 90 vorliegen (BENCHAOUI et al.,
2004). Tulathromycin wird unter dem Handelsnamen Draxxin® als 10%ige Lösung zur
Injektion beim Schwein und Rind angeboten (TRAEDER u. GROTHUES, 2004) (siehe
Abb. 9).
Literaturübersicht
38
Abb. 9: Strukturformel von Tulathromycin (nach NOWA KOWSKI at al., 2004)
Literaturübersicht
39
2.2.2 Wirkmechanismus und Wirkspektrum
Wie die anderen Makrolid-Antibiotika greift Tulathromycin in die Proteinsynthese der
Bakterien ein. Daraus folgt eine bakteriostatische Wirkungsweise. Das Medikament
gehört zu den zeitabhängig wirksamen Antibiotika (NOWAKOWSKI et al., 2004;
TRAEDER u. GROTHUES, 2004). Daher muß eine therapeutisch wirksame
Konzentration während der gesamten Therapiedauer ununterbrochen höher als der
MHK 90 des Erregers sein (TRAEDER u. GROTHUES, 2004). Tulathromycin ist
aufgrund seiner verlängerten Halbwertszeit und starken Anreicherung im Gewebe ein
idealer Vertreter dieser Gruppe, da bereits nach einmaliger Applikation lange Zeit der
MHK Wert der Pathogene überschritten wird (NOWAKOWSKI et al., 2004). Der hohen
Wirksamkeit von Tulathromycin liegen zum einen die drei Aminogruppen zugrunde, die
die Penetration der äußeren Membran von gramnegativen Bakterien erhöht. Ein
weiterer Effekt hierfür ist die geringe Affinität zur bakteriellen Effluxpumpe. Auf diese
Weise kann Tulathromycin in der Bakterienzelle kumulieren und einen therapeutischen
Spiegel, der mehr als das vierfache des MHK 90 Wertes des Erregers betragen kann,
erreichen. Dadurch ist es wirksam gegen Tilmicosin resistente Bakterien. Das
Medikament weist ein breites Wirkungsspektrum gegen Erreger, die bei
respiratorischen Erkrankungen gefunden werden, auf. Diese Bakterien sind gegenüber
Tulathromycin hoch empfindlich (TRAEDER u. GROTHUES, 2004). Die strukturellen
Modifikationen des Medikamentes zielen auf verstärkte Gewebsverteilung, verlängerte
Eliminationshalbwertszeit und Optimierung der antibakteriellen Wirksamkeit ab.
Tulathromycin wird als einmalig parenterale Applikation bei Rind und Schwein mit
hoher klinischer Effektivität gegen respiratorische Erkrankungen, sehr geringer
Manipulation der Tiere und maximaler Verträglichkeit eingesetzt (BENCHAOUI et al.,
2004).
2.2.3 Studien zu Tulathromycin
NOWAKOWSKI et al. (2003) stellten die lange Wirkstoffkonzentration von Triamiliden
und somit die Möglichkeit des Einsatzes dieser Stoffgruppe für die lang anhaltende
Behandlung von respiratorischen Erkrankungen fest. In dieser Studie wurden Mäusen
und Rindern subkutan 20 mg/kg des zu testenden Agents einmalig verabreicht.
Intensive Absorption und schnelle Verteilung in das Lungengewebe der Maus mit
Literaturübersicht
40
Maximalkonzentration nach ein bis zwei Stunden wurden festgestellt. Beim Rind lag die
Halbwertszeit der Lunge nach subkutaner Verabreichung von fünf oder 2,5 mg/kg
zwischen 54 und 110 Stunden. Die maximale Plasmakonzentration wurde 0,25–1
Stunde nach Injektion erreicht. Die Plasmahalbwertszeit lag zwischen 27 und 48
Stunden. In gesammelten Lungenproben konnten Wirkstoffkonzentrationen von 900–
6000 ng/g festgestellt werden (NOWAKOWSKI et al., 2003).
TRAEDER und GROTHUES (2004) beschreiben beim Rind nach subkutaner und beim
Schwein nach intramuskulärer Injektion eine hohe Bioverfügbarkeit von Tulathromycin.
Diese beträgt 90% beim Rind und 88% beim Schwein. Die Eliminationshalbwertszeit
der Lunge wird beim Rind mit acht Tagen und beim Schwein mit sechs Tagen
angegeben. Des Weiteren ist der AUC Wert (Area under the curve) des
Lungenparenchyms beim Schwein über 60 mal und beim Rind über 73 mal größer als
der AUC Wert im Blutplasma. Tulathromycin kumuliert in Leukozyten und
Makrophagen. Dies führt zu einer Erhöhung der Wirkstoffkonzentration am
Infektionsort, da diese Zellen verstärkt zum entzündeten Gewebe wandern. Eine
weitere Anreicherung findet daher gegenüber Lungenhomogenat gesunder Tiere statt.
Hier wird von einer 4,1–4,8fachen Tulathromycinkonzentration im erkrankten Gewebe
berichtet. Dies lässt eine stärkere in vivo Aktivität erwarten als die in vitro ermittelten
MHK Werte zugrunde legen. Tulathromycin wird zu weniger als 10% in der Leber durch
N-Oxydation oder N-Desmethylisation metabolisiert. Zu ca. 90% wird es in aktiver Form
über die Galle und anschließend mit den Fäzes ausgeschieden.
Über die Wirksamkeit und Verträglichkeit von Draxxin® wurden in Europa sechs
kontrollierte Blindstudien beim Rind durchgeführt. Tiere mit respiratorischen
Symptomen und einer rektalen Körpertemperatur von über 40° Celsius wurden
einmalig subkutan mit 2,5 mg Tulathromycin je kg Körpergewicht behandelt. Als
positive Kontrolle wurde Tilmicosin verwendet. Die Heilungsrate betrug für Draxxin®
92,3% und für Tilmicosin 89,1%. In der Draxxin® Gruppe stellten sich bereits ab dem
zweiten Tag normale Körpertemperaturwerte ein. Die klinischen Symptome gingen
rasch zurück. In einer weiteren Untersuchung, in der der Erfolg des metaphylaktischen
Einsatzes in Betrieben, in denen mindestens 10% der Tiere klinisch erkrankt waren
getestet wurde, wurden durch Draxxin® 100% und durch Tilmicosin 93% vor einer
Literaturübersicht
41
Erkrankung geschützt. Im Rahmen einer zwei wöchigen Beobachtung wurde zusätzlich
eine Gewichtszunahme der Tiere festgestellt.
In Studien in Frankreich und Italien wurde die gute Schutzwirkung von Tulathromycin
durch den langanhaltenden Wirkspiegel deutlich. In der französischen Studie blieben
bei metaphylaktischem Einsatz über 14 Tage 71% der Draxxin® behandelten Tiere
gegenüber 20% der Kontrolltiere geschützt. In Italien blieben über den gleichen
Zeitraum 95% gegenüber 71% vor Erkrankungen verschont. Nach einer künstlichen
Infektion mit Mycoplasma hyopneumoniae beim Schwein wurden nach Draxxin®
Behandlung bei 8,8% der Probanden, im Gegensatz zu 17,2% bei unbehandelten
Tiere, pathologische Befunde in Form von Lungenschädigungen festgestellt. Nach
Infektion mit Actinobacillus pneumoniae erkrankten 80% der Kontrolltiere, 44% der mit
Draxxin® behandelten Tiere und 44% der Probanden, die mit Ceftiofur (Excenel®) in
einer Dosierung von 3 mg/kg an drei aufeinander folgenden Tagen behandelt wurden.
Bei den Kontrolltieren wurden 29,1 Lungenläsionen festgestellt, Draxxin® und Ceftiofur
erreichten Werte von 10,1 und 10. Die Gewichtszunahme der Kontrolltiere betrug im
Durchschnitt 1,42 kg, mit Draxxin® behandelte Schweine kamen auf 4,23 kg
Gewichtszunahme und mit Ceftiofur behandelte Tiere nahmen 4,25 kg zu.
Des Weiteren wurden fünf Feldstudien in Europa durchgeführt. Draxxin® wurde mit
Tiamulin, das in einer Dosierung von 15 mg/kg an drei aufeinander folgenden Tagen
verabreicht wurde, verglichen. Nach 14 Tagen waren 81% der Schweine, die einmalig
Draxxin® erhalten hatten geheilt, hingegen nur 60% der Probanden, die Tiamulin
verabreicht bekamen. Auch eine schnellere Einpendelung in den Bereich der normalen
Körpertemperatur zeichnete sich nach der Behandlung mit Draxxin® gegenüber
Tiamulin ab.
Je nach Sensibilität des Erregers wird der therapeutische Wirkspiegel von
Tulathromycin von fünf Tagen (Pasteurella multocida beim Schwein) bis zu 15 Tagen
(Pasteurella multocida beim Rind und Mycoplasma hyopneumoniae beim Schwein)
aufrechterhalten (TRAEDER u. GROTHUES, 2004).
BENCHAOUI et al. (2004) verabreichten 56 gesunden Schweinen, welche
vorberichtlich noch nicht mit Makroliden behandelt worden waren, einmalig 2,5 mg/kg
Körpergewicht Tulathromycin intramuskulär oder intravenös. Acht Tiere dienten als
Kontrolltiere. Nach Applikation wurden bis zu sieben Tage nach der Behandlung
Literaturübersicht
42
Blutproben entnommen. Die Schweine wurden nach der letzten Blutentnahme getötet
und Lungenproben wurden entnommen. Zu Kontrollzwecken wurde Plasma und
Lungengewebe von den unbehandelten Tieren mit untersucht. Das Blut wurde in
heparinisierte Röhrchen gefüllt. Nachdem das Plasma durch Zentrifugation abgetrennt
worden war, wurden die Proben bei -20°C tiefgefrore n. Die Lungen wurden vollständig
von jedem Tier entfernt und homogenisiert, nachdem die Trachea abgelöst war. Auch
sie wurden bei -20°C tiefgefroren. Anschließend wurden Plasma- und
Lungengewebsproben durch eine HPLC (high pressure liquid chromatography) mit
zweifacher Massenspektroskopie (LC-MS/MS) analysiert. Darauf folgte eine
Festphasenextraktion. Ein Deuteral-Analog von Tulathromycin wurde als Standard
verwendet.
BENCHAOUI et al. (2004) stellten bei intramuskulärer Applikation nach 0,25 Stunden
eine maximale Plasmakonzentration von 116 ng/ml fest. Die Halbwertszeit betrug 75,6
Stunden. 168 Stunden nach der Behandlung betrug die Tulathromycinkonzentration in
der Lunge 1380 ng/g und nach 360 Stunden 778 ng/g. Nach intravenöser Applikation
stellten die Autoren eine erstgemessene Konzentration im Plasma zum Zeitpunkt t0 von
9680 ng/ml fest. Die Eliminationshalbwertszeit wurde mit 67,5 Stunden festgelegt. Die
Lungenkonzentrationen betrugen nach der intravenösen Verabreichung nach 168
Stunden 1440 ng/g und 774 ng/g nach 360 Stunden. Nach intramuskulärer
Verabreichung betrug die Bioverfügbarkeit von Tulathromycin zwischen 87,7 und
110%. Mit Hilfe statistischer Analysen konnten keine signifikanten Unterschiede in der
Lungenkonzentration zwischen intramuskulärer und intravenöser Verabreichung
festgestellt werden. Zwischen den Geschlechtern konnten BENCHAOUI et al. (2004)
ebenfalls keine auffallenden Unterschiede feststellen.
In einer weiteren Untersuchungsgruppe stellten die gleichen Autoren nach i.m
Applikation von 2,5 mg/kg Tulathromycin eine Plasmakonzentration von 581 ng/ml eine
halbe Stunde nach Behandlung fest. Die Halbwertszeit betrug in dieser Gruppe 91
Stunden. Im Lungengewebe wurden zwölf Stunden nach i.m. Applikation 2840 ng/g
Tulathromycin festgestellt. Die höchste Konzentration der Lunge betrug 3470 ng/g und
wurde 24 Stunden nach Applikation gemessen. Sechs Tage nach Verabreichung
konnte im Lungengewebe eine Konzentration von 1700 ng/g und nach zehn Tagen von
immer noch >1000 ng/g vorgefunden werden. Die Eliminationshalbwertszeit der Lunge
beträgt somit 142 Stunden (6 Tage).
Literaturübersicht
43
BENCHAOUI et al. (2004) weisen darauf hin, dass das homogenisierte Lungengewebe
ein Konglomerat aus intra- und extrazellulärer Anreicherung des Medikamentes
darstellt. Diese Versuchsergebnisse lassen auf eine hohe Wirksamkeit von
Tulathromycin in der Behandlung von bakteriell einschließlich durch Mykoplasmen
bedingte Lungenerkrankungen beim Schwein schließen (BENCHAOUI et al., 2004).
Auch GALER et al. (2004) führten eine Studie zu Tulathromycin durch, in der sie neben
20 Schweinen auch 20 Kälber einbezogen. Dabei erhielten die Kälber 2,5 mg/kg
subkutan in die rechte Halsseite. Eine Gruppe bekam eine einmalige Injektion
verabreicht, eine weitere Gruppe erhielt zwei Injektionen. Die Schweine wurden
einmalig intramuskulär in die rechte Halsseite gespritzt. Aus der Jugularvene wurden
bei jedem Tier Blutproben entnommen. Wie bei BENCHAOUI et al. (2004) wurde auch
bei GALER et al. (2004) das Blut in heparinisierten Röhrchen abgenommen und
anschließend zentrifugiert. Das separierte Plasma wurde eingefroren. Am siebten Tag
wurden die Tiere euthanisiert, ausgeblutet und ausgeweidet. Lungenproben von allen
Lungenlappen, ca. 500 g vom Rind und ca. 250 g vom Schwein, wurden gesammelt,
homogenisiert und eingefroren.
Die maximalen Konzentrationen in Rinder- und Schweineplasma waren in dieser
Studie 1740 und 2440 ng/ml. Die geringsten gemessenen Konzentrationen waren 14,7
ng/ml beim Rind und 2,92 ng/ml beim Schwein. Die Eliminationshalbwertszeit vom
Plasma betrug 44 Stunden beim Schwein und 110 Stunden beim Rind. Die am siebten
Tag gemessenen Lungenkonzentrationen betrugen beim Rind zwischen 1210 und
6490 ng/g. Beim Schwein kamen Werte zwischen 414 und 2250 ng/g zum Vorschein.
Die Konzentration von Tulathromycin in der Lunge war somit beim Rind 80 mal größer
als im Plasma. Beim Schwein erreichten die Lungenkonzentrationen 130 mal größere
Werte als im Plasma (GALER et al., 2004).
NOWAKOWSKI et al. (2004) führten eine Studie über Tulathromycin an Rindern durch.
Hierbei erhielten von 50 Kälbern 42 das Medikament subkutan verabreicht und von 22
Kälber bekamen 18 den Wirkstoff intravenös appliziert. Die übrigen Tiere galten als
Kontrolltiere. Anschließend wurden die Plasma- und Lungenkonzentrationen von
Tulathromycin bestimmt. Die vorberichtliche Verabreichung von Makroliden war in
dieser Studie nicht bekannt. Tulathromycin wurde subkutan in einer vorläufigen
Literaturübersicht
44
Injektionslösung verabreicht, die 10% Tulathromycin, Wasser, Zitronensäure,
Monothioglyzerol und Phenol enthielt. Die Tiere, die den Wirkstoff i.v. erhielten und
eine weitere Gruppe, die das Medikament subkutan erhalten sollten, bekamen eine
ähnliche zusammengesetzte Formulierung ohne Phenol appliziert. Die Dosierung lag
bei allen Tieren bei 2,5 mg Tulathromycin pro kg Körpergewicht. Die Kontrolltiere
blieben unbehandelt. Die subkutane Applikation erfolgte am Hals und die intravenöse
Injektion an der Vena jugularis. Alle Tiere wurden während der Studie klinisch
überwacht. Wie in den vorherigen Studien beschrieben, wurde das Blut in 10 ml
heparinisierten Röhrchen abgenommen und nach Zentrifugation das Plasma
tiefgefroren. Nach der letzten Blutentnahme wurden die Tiere per Bolzenschuß betäubt
und ausgeblutet. Von jedem Tier wurden von jedem Lungenlappen Proben gesammelt,
homogenisiert und tiefgefroren. Die Proben wurden anschließend durch eine
Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) mit anschließender zweifacher
Massenspektometrie (LC-MS/MS) analysiert (NOWAKOWSKI et al., 2004). Darauf
folgte eine Festphasenextraktion (GALER et al., 2004).
Als Ergebnisse erhielten NOWAKOWSKI et al. (2004) in der Gruppe, die das
Medikament subkutan inklusive Phenol verabreicht bekam, die höchste
Plasmakonzentration von 2450 ng/ml nach einer halben Stunde und eine geringste
Plasmakonzentration von 3,6 ng/ml nach 360 Stunden. Die maximal erreichte
Lungenkonzentration von Tulathromycin betrug 4620 ng/g nach 24 Stunden und die
geringste 795 ng/g nach 360 Stunden. Die maximale Konzentration der Lunge war
somit 73,7 mal größer als die gemessene Plasmakonzentration. Am Ende der Studie
nach 360 Stunden oder 15 Tagen war die gemessene Konzentration in der Lunge 220
mal größer als die gemessenen Plasmawerte. In der Gruppe, in der Tulathromycin
ohne Phenol subkutan verabreicht wurde, wurde die höchste Plasmakonzentration
nach 25 Minuten mit 782 ng/ml festgelegt. Die Halbwertszeit im Plasma betrug zwei
Tage für Tiere, die am siebten Tag euthanasiert wurden und vier Tage für die Kälber,
die am 15. Tag getötet wurden. Die gemessenen Lungenkonzentrationen betrugen
2400 ng/g am siebten und 1200 ng/g am 15. Tag. Nach der intravenösen
Verabreichung erhielten NOWAKOWSKI et al. (2004) eine maximale
Plasmakonzentration von 2360 ng/ml mit einem Mittelwert von 2000 ng/ml am
Zeitpunkt t0, also direkt nach Applikation. Die Halbwertzeit im Plasma wird mit drei
Tagen angegeben. Die Mittelwerte der Lungenkonzentration betrugen 2190 ng/g am
Literaturübersicht
45
siebten und 700 ng/g am 15. Tag. Die Bioverfügbarkeit lag zwischen 91,3 und 93,6%.
Keine gravierenden Unterschiede wurden zwischen den Geschlechtern gefunden,
allerdings wurden signifikante Differenzen zwischen subkutaner und intravenöser
Verabreichung bezüglich der Maximalkonzentration festgestellt. Auch NOWAKOWSKI
et al. (2004) stellten somit eine schnelle Absorption, eine hohe Bioverfügbarkeit und
eine verlängerte Halbwertszeit von Tulathromycin fest. Nach subkutaner Injektion
wurde eine intensive Verteilung ins Lungengewebe festgestellt. Bei einzelnen Tieren
war die Lungenkonzentration des Wirkstoffes 11–325 mal größer als die erreichten
Werte im Plasma. Das Verteilungsvolumen nach i.v. Verabreichung war 11 l/kg. Die
Halbwertszeit betrug acht Tage.
In einer Studie von KERTH (2005) wurden 70 Warmblutfohlen, bei denen
ultrasonographisch Lungenabszesse festgestellt wurden vergleichend mit
Tulathromycin und Rifampicin, sowie Azithromycin in Kombination mit Rifampicin,
behandelt. 37 Fohlen erhielten Draxxin® in einer Dosierung von 1 ml pro 40 kg alle
sieben Tage intramuskulär. Um Reaktionen an der Injektionsstelle zu vermeiden,
wurde das Medikament mit Wasser für Injektionszwecke 1:0,5 verdünnt. Die 33 Fohlen
der Kontrollgruppe erhielten in der ersten Woche täglich 10 mg/kg Azithromycin p.o.,
sowie zweimal täglich 10 mg/kg Rifampicin p.o.. Ab der zweiten Woche wurde
Azithromycin nur noch jeden zweiten Tag, Rifampicin weiterhin zweimal täglich
gegeben.
Von den 37 Fohlen, die Tulathromycin erhielten, musste bei sechs Fohlen die Therapie
umgestellt werden, da eine Verschlechterung der klinischen und/oder der
ultrasonographischen Befunde vorlag. Ein Fohlen verstarb an akuter interstitieller
Pneumonie. Im Schnitt lag die Therapiedauer bei 57 Tagen. Nach Therapieende
konnte bei zwölf Fohlen wieder ein Abszess in der Lunge festgestellt werden. In der
Kontrollgruppe, in der 33 Fohlen mit Azithromycin und Rifampicin behandelt wurden,
musste bei zwei Probanden wegen Verschlechterung der Ultraschallbefunde die
Therapie umgestellt werden. Die mittlere Therapiedauer lag im Schnitt bei 38 Tagen.
31 Fohlen wurden bis zum Therapieende mit der Kombination Azithromycin und
Rifampicin behandelt. Bei dieser Gruppe trat bei 13 Tieren nach Therapieende wieder
ein Abszess in der Lunge auf.
Literaturübersicht
46
2.2.4 Dosierung
Die empfohlene Dosierung liegt für Schwein und Rind bei 2,5 mg/kg Tulathromycin
(GALER et al., 2004; TRAEDER u. GROTHUES, 2004). Das entspricht 1 ml Draxxin®
pro 40 kg Körpergewicht.
2.2.5 Nebenwirkungen
In Versuchen an Hund und Ratte zeigten sich milde gastrointestinale Störungen, sowie
eine Veränderung der Leberenzyme Aspartat-Amino-Transferase (AST), Alanin-Amino-
Transferase (ALT) und Sorbit-Dehydrogenase (SDH) (TRAEDER u. GROTHUES,
2004). Generell ist das hepatotoxische Potential der Makrolide als gering einzustufen
(PERITI et al., 1993). Für Tulathromycin konnten weder ein genotoxisches, allergisches
oder kanzerogenes Potential, noch eine Beeinflussung der Immunabwehr festgestellt
werden. Des Weiteren verursacht das Medikament mit der behördlich zugelassenen
Formulierung keine Kardiotoxizität. Die zehnfache Dosierung von Draxxin® führte beim
Rind lediglich zu lokalen Reaktionen wie Schwellung und Schmerz an der
Injektionsstelle. Bei 14% der behandelten Tiere trat auch nach der empfohlenen
Dosierung von 2,5 mg/kg einmalig subkutan eine Schwellung an der Injektionsstelle
auf. Beim Schwein führte die zehnfache Dosierung zu mikroskopisch nachzuweisenden
pathologischen Gewebsreaktionen an der Injektionsstelle. Wurde die drei- fünffache
Dosis dreimal im Abstand von jeweils einer Woche verabreicht, zeigten die Tiere
Schmerzreaktionen, Lahmheit und eine Beeinträchtigung des Allgemeinbefindens. Im
Gegensatz zum Rind stellten sich beim Schwein nach Verabreichung der empfohlenen
Dosis keine Reaktionen an der Injektionsstelle ein. 87,5% der Lokalreaktionen waren
14 Tage nach der Applikation nicht mehr nachweisbar. In histologischen
Untersuchungen konnten nach 35 Tagen keine Veränderungen mehr festgestellt
werden. Systemisch wurde eine zehnfache Überdosierung bei Rind und Schwein gut
vertragen (TRAEDER u. GROTHUES, 2004). Auch BENCHAOUI et al. (2004) konnten
weder nach i.v. Applikation noch nach i.m. Verabreichung beim Schwein
Nebenwirkungen feststellen. In der Studie von NOWAKOWSKI et al. (2004) konnten
ebenfalls beim Rind weder nach subkutaner, noch nach intravenöser Injektion
Nebenwirkungen notiert werden. Im Gegensatz zu Tilmicosin beinhaltet Draxxin® kein
Risiko für den Anwender (TRAEDER u. GROTHUES, 2004).
Literaturübersicht
47
2.2.6 Resistenzen
Der langanhaltende Wirkspiegel über der MHK der Pathogene verhindert eine
Resistenzselektion (TRAEDER u. GROTHUES, 2004). Trotzdem schlägt KERTH
(2005) eine eventuelle Kombination von Tulathromycin mit Rifampicin vor, um der
Entstehung von Resistenzen bei Rhodococcus-equi gänzlich vorzubeugen.
2.3 Rifampicin
Rifampicin gehört zur Gruppe der Ansamycin-Antibiotika. Es ist ein halbsynthetisches
Hydrazinderivat von Rifamycin B, welches aus den Kulturen von Streptomyces
mediterranei gewonnen wird (FURESZ, 1970). Rifampicin kann auch als 3-[[(4-Methyl-
1-piperazinyl)imino]methyl]rifamycin bezeichnet werden (siehe Abb. 10).
Abb. 10: Strukturformel von Rifampicin (nach STAHLM ANN u. LODE, 2001)
Die Wirkungsweise von Rifampicin ist bakterizid, mit einem breitem Spektrum gegen
grampositive und einige gramnegative Keime (FURESZ, 1970; FARR u. MANDELL,
1982). Das Medikament greift in die RNA- und Eiweißsynthese der Bakterien ein,
indem es die DNA-abhängige RNA-Polymerase in den Bakterienmitochondrien hemmt
(MANDELL, 1983). Rifampicin wird in der Humanmedizin zur Behandlung der
Tuberkulose und beim Pferd zur Therapie der Rhodokokken-Pneumonie eingesetzt
(FARR u. MANDELL, 1982). Das Medikament weist einen stark lipophilen Charakter
auf. Die Konzentrationen des Antibiotikums sind in Lunge, Leber, Galle und Urin höher,
als im Blut (FURESZ, 1970). Rifampicin kann intrazelluläre Keime abtöten und in
Literaturübersicht
48
septische Herde, Abszesse und Phagozyten eindringen (MANDELL, 1973, 1983;
PROKESCH u. HAND, 1982).
Da Rifampicin ein Enzyminduktor ist, kann die Therapie mit einem Kombinationspartner
versagen (SIEGMUND u. WEITSCHIES, 2002), da dessen Elimination beschleunigt
wird (SIEGMUND et al., 2003a). Rifampicin vermehrt die Synthese des Enzyms, indem
es an intrazelluläre Rezeptoren bindet. Diese werden nach Translokation in den
Zellkern und Dimerisierung mit anderen Kernrezeptoren an der entsprechenden
Promotorregion des jeweiligen Gens gebunden und erhöhen auf diese Weise die
Transkription. Die Bindung der Kernrezeptorkomplexe an die Promotorbindungsstelle
ist nicht unbedingt spezifisch. Ein hiervon besonders betroffenes Enzym ist das P-
Glykoprotein. Dieses Protein ist an der luminalen Seite von Endothel- und Epithelzellen
lokalisiert und transportiert Stoffe aus dem Zytoplasma aktiv zurück ins Lumen. P-
Glykoprotein ist funktioneller Bestandteil der Bluthirnschranke und der Plazentabarriere
und behindert den Übertritt von Wirkstoffen ins Gehirn oder den fetalen Kreislauf
(SIEGMUND et al., 2003a). Das Protein wird des Weiteren in den Enterozyten des
Dünn- und Dickdarmes angetroffen. Auf diese Weise kann die orale Absorption von
Arzneimitteln behindert werden. Das Antibiotikum Rifampicin verstärkt diese Effekte,
Makrolide hingegen haben eine hemmende Wirkung auf diese Enzyme (SIEGMUND et
al., 2003a; SIEGMUND et al., 2003b). Besonders Erythromycin und Clarithromycin
weisen einen stark hemmenden Charakter auf (SIEGMUND et al., 2003a).
Beim Pferd wird nach oraler Applikation von Rifampicin laut WILSON et al. (1988) ca.
70% resorbiert. PRESCOTT und SWEENEY (1985) empfehlen zur Behandlung einer
Rhodokokken-Pneumonie beim Fohlen 10 mg/kg Rifampicin per os zweimal täglich in
Kombination mit Erythromycin. Auf diese Weise wird eine Plasma- und
Gewebskonzentration von 1 µg/kg des Wirkstoffes erreicht. Die minimale
Hemmstoffkonzentration von Rhodococcus equi liegt bei 0,05 µg/ml (PRESCOTT u.
SWEENEY, 1985). HILLIDGE (1987) und SWEENEY et al. (1987) schlagen eine orale
Dosierung von 5 mg/kg zweimal täglich vor.
Nach der Verabreichung von Rifampicin kann es beim Menschen zu einer Rotfärbung
von Urin und anderen Körperflüssigkeiten, wie Speichel und Tränen kommen. Das
Medikament wird über einen längeren Zeitraum gut vertragen (GIGUÈRE u.
PRESCOTT, 1997). Da sich bei der Langzeittherapie mit Rifampicin schnell
Resistenzen entwickeln können, sollte das Medikament nur in Kombination mit anderen
Literaturübersicht
49
Antibiotika eingesetzt werden (BARONTI u. LUKINOVICH, 1968; FARR u. MANDELL,
1982; NORDMANN u. RONCO, 1992).
2.4 Rhodococcus equi-Pneumonie
2.4.1 Der Erreger
Das Bakterium wurde erstmals 1923 von MAGNUSSON isoliert. Bei dem Erreger
Rhodococcus equi handelt es sich um einen saphrophytischen und opportunistischen
Erdbewohner (ROONEY, 1966; BARTON u. HUGHES, 1980; ELLENBERGER u.
GENETZKY, 1986), der fakultativ intrazellulär wächst (BARTON u. HUGHES, 1980;
PRESCOTT, 1981; PRESCOTT u. SWEENEY, 1985; ELLENBERGER u. GENETZKY,
1986; SWEENEY et al., 1987; HONDALUS u. MOSSER, 1994; HONDALUS, 1997).
Aufgrund der Fähigkeit, sich in Makrophagen zu vermehren und diese zu zerstören,
weist der das Bakterium eine hohe Pathogenität auf (PRESCOTT u. SWEENEY, 1985;
PRESCOTT u. HOFFMAN, 1993; HONDALUS u. MOSSER, 1994; MEIJER u.
PRESCOTT, 2003). Das Bakterium ist grampositiv, wobei in älteren Kulturen auch
gramnegative Formen nachgewiesen werden (BARTON u. HUGHES, 1980), nicht
beweglich und bildet keine Sporen (SIPPEL et al., 1968; SMITH u. ROBINSON, 1981;
HILIDGE, 1986). Trotz der Abwesenheit von Sporenbildung weist der Erreger eine
hohe Widerstandskraft gegenüber Umwelteinflüssen auf. Toxinproduktion wurde nicht
nachgewiesen. Die Bakterien haben eine Größe von 1 µm x 2 µm (ELLENBERGER u.
GENETZKY, 1986), bzw. 0,5-1 µm x 1-2 µm (BARTON u. HUGHES, 1980). Durch
Agglutination von Antiseren lassen sich vier verschiedene serologische Gruppen
unterscheiden (SMITH u. ROBINSON, 1981). Das Wachstum in der Kultur ist von
Acetat, Proprionat und Butyrat abhängig. Diese kurzkettigen Fettsäuren sind auch in
Caecum und Colon von Pferden anzutreffen (HUGHES u. SULAIMAN, 1987). Für die
Diagnose der Rhodococcus equi-Pneumonie stellt die kulturelle Anzüchtung mit
anschließender zytologischer Beurteilung der Bakterien von Tracheobronchialsekret
den Goldstandard dar (GIGUÈRE u. PRESCOTT, 1997). Der Erreger hat in Struktur,
Resistenz und Pathogenese Ähnlichkeiten zu den Mykobakterien (ELLENBERGER u.
GENETZKY, 1986).
Literaturübersicht
50
2.4.2 Klinische Symptomatik
Die häufigste Erkrankung, die von Rhodococcus equi verursacht wird, ist eine
chronische Bronchopneumonie, bei der die Fohlen multiple Abszesse im
Lungenparenchym entwickeln (BARTON u. HUGHES, 1980; PRESCOTT u.
HOFFMAN, 1993). Da sich die Pneumonie langsam entwickelt (ELLENBERGER u.
GENETZKY, 1986) und die Verluste des Lungengewebes zunächst gut kompensiert
werden, ist eine frühe Diagnose der Rhodoccus equi-Pneumonie schwierig
(PRESCOTT u. HOFFMAN, 1993; GIGUÈRE u. PRESCOTT, 1997). Auch das
Körpergewicht und das Fell der Fohlen zeigen gewöhnlich keine Auffälligkeiten
(PRESCOTT u. HOFFMAN, 1993; AINSWORTH, 1999). Die frühen klinischen
Erscheinungen stellen Fieber bis 41°C, Lethargie und De pression dar. Die Fohlen
beginnen teilweise zu husten und verlieren trotz saufen an Körpergewicht. Im
Gegensatz zu anderen bakteriellen Lungenerkrankungen wird mukopurulenter
Nasenausfluß bei Rhodococcus equi-Pneumonien nicht immer beobachtet. Die
regionalen Lymphknoten können vergrößert (ELLENBERGER u. GENETZKY, 1986)
und abszediert sein und die Trachea oder größeren Bronchien einengen (PRESCOTT
u. HOFFMAN, 1993). Bei der Auskultation sind im Anfangsstadium ohne intensive
Atemprovokation keine pathologischen Befunde auszumachen (PRESCOTT u.
HOFFMAN, 1993). Im fortgeschrittenen Stadium sind Rasselgeräusche (ROONEY,
1966) und laute Atemgeräusche, oft mit Knacken und Giemen, zu hören (MARTENS et
al., 1982; ELLENBERGER u. GENETZKY, 1986; PRESCOTT u. HOFFMAN, 1993).
Bleibt die Pneumonie unentdeckt bis große Lungenbereiche durch Abszesse und
Ödeme in Mitleidenschaft gezogen sind, zeigen die Fohlen Tachypnoe (40-80
Atemzüge pro Minute) mit Nüsternblähen und abdominalem Atemtyp, sowie Zyanose
der gingivalen Schleimhäute und einen erhöhten Puls (MARTENS et al., 1982;
FALCON et al., 1985; HILLIDGE, 1986; PRESCOTT u. HOFFMAN, 1993).
In manchen Fällen stellt sich nach den respiratorischen Symptomen noch Durchfall ein.
Dieser entwickelt sich nach Invasion des Erregers in den Darm und der Entstehung von
schweren Mukosaulzerationen.
Eine zweite Form der Rodococcus equi-Pneumonien entsteht plötzlich mit schweren
respiratorischen Symptomen mit deutlichen Rasselgeräuschen und
Flüssigkeitsansammlungen, die bei der Auskultation zu hören sind. Der Tod tritt bei
Literaturübersicht
51
dieser Form gewöhnlich 24-48 Stunden nach Beginn der Symptome ein (ROONEY,
1966). Die Fohlen werden bei dieser auch als subakuten Rhodococcus equi-
Pneumonie bezeichneten Form entweder schon tot aufgefunden oder sie zeigen akute
Atemnot mit Tachypnoe und Nüsternblähen, sowie hohem Fieber, ohne vorher klinisch
aufgefallen zu sein (GIGUÈRE u. PRESCOTT, 1997; AINSWORTH, 1999). Bei der
röntgenologischen Untersuchung werden dichte Herde, die auf eine Abszessbildung
hinweisen, sowie konsolidierte Gebiete und diffuse interstitielle und peribronchiale
Verschattung sichtbar (SMITH u. ROBINSON, 1981; PRESCOTT u. SWEENEY, 1985;
ELLENBERGER u. GENETZKY, 1986).
66% der Fohlen, die an einer Rhodococcus equi-Pneumonie leiden, weisen zusätzlich
extrapulmonale Erkrankungsformen auf (CHAFFIN u. MARTENS, 1997), die sich in
Enteritiden, nervalen Störungen und je nach Abszesslokalisation verschiedener
Symptomatik äußern können (CIMPRICH u. ROONEY 1977; CHAFFIN et al., 1995;
HOLDSTOCK, 2003).
2.4.3 Pathogenese
Erkrankungen durch Rhodococcus equi sind in einigen Pferdebetrieben endemisch, in
anderen sporadisch und in den meisten Betrieben noch unbekannt (PRESCOTT u.
HOFFMAN, 1993; GIGUÈRE u. PRESCOTT 1997; MEIJER u. PRESCOTT, 2003).
Diese Unterschiede entstehen durch unterschiedliche klimatische Verhältnisse. Die
Erkrankung tritt häufiger in Gebieten mit hohen Temperaturen auf. Ein weiterer
Unterschied stellt der pH-Wert im Boden dar, der für das bakterielle Wachstum von
Bedeutung ist. Des Weiteren spielt das Management des Betriebes eine entscheidende
Rolle für die Häufigkeit der Rhodococcus equi Erkrankungen (PRESCOTT u.
HOFFMAN, 1993; MEIJER u. PRESCOTT, 2003). Staubige Paddocks, von denen Mist
nicht entfernt wird, stellen eine starke Infektionsquelle dar. Auch Betriebe, in denen seit
mehreren Jahren staubige, graslose Paddocks von Pferden genutzt werden, bieten
dem Erreger die Möglichkeit sich massiv anzureichern (WOOLCOCK et al., 1980;
PRESCOTT u. HOFFMAN, 1993). Ein weiterer Faktor spielt das Vorhandensein von
einer größeren Anzahl virulenter, als avirulenter Stämme, sowie eine hohe Anfälligkeit
der Fohlen (SWEENEY et al., 1987; TAKAI, 1997; MEIJER u. PRESCOTT, 2003).
TAKAI et al. (1987) sehen im Kot der Mutterstuten und im Boden eine entscheidende
Rolle für die Erstbesiedlung oder Infektion der Fohlen mit dem Erreger durch Ingestion
Literaturübersicht
52
und Inhalation. Da Rhodococcus equi aerob ist, findet keine oder nur eine geringe
Vermehrung des Erregers im Darm statt. Im Dung hingegen multipliziert sich das
Bakterium in großen Zahlen (1000fach und mehr) (BARTON u. HUGHES, 1984;
HUGHES u. SULAIMAN, 1987). Die größte Infektionsquelle stellen infizierte Fohlen
dar, die den Erreger in großer Anzahl ausscheiden und ihre Umgebung kontaminieren
(TAKAI, 1997).
Das typische Erkrankungsalter der Fohlen liegt zwischen 30 und 60 Tagen (SIPPEL,
1968), bzw. zwei bis sechs Monaten (BARTON u. HUGHES, 1980; ELLENBERGER u.
GENETZKY, 1986; ZERTUCHE u. HILLIDGE, 1987) oder zwei bis vier Monaten
(BARTON u. HUGHES, 1980; SWEENEY et al., 1987; PRESCOTT u. HOFFMAN,
1993). Die Erkrankung hat eine Mortalität von 40-70%. In den Sommermonaten Mai bis
August finden 81% der jährlichen Infektionen statt (ZINK et al., 1986; SWEENEY et al.,
1987), mit einem Höhepunkt im Juli (ZINK et al., 1986). Zu dieser Zeit werden die
Fohlen hohen Erregerkonzentrationen, bei gleichzeitiger Anfälligkeit durch Abnahme
der maternalen Antikörper und noch nicht voll entwickelter eigener zellulärer
Immunantwort ausgesetzt, die für die Abwehr der Erkrankung von entscheidender
Bedeutung zu sein scheint (BARTON u. HUGHES, 1980; ELLENBERGER u.
GENETZKY, 1986; YAGER, 1987; PRESCOTT u. HOFFMAN, 1993). Zusätzlich findet
das Bakterium in dieser warmen Jahreszeit optimale Bedingungen vor (HANDALUS,
1997) und die Staubentwicklung und damit die Inhalation kontaminierter Partikel wird
begünstigt (MEIJER u. PRESCOTT, 2003).
Als Infektionswege werden orale Aufnahme, Inhalation, der Transport vom Darm durch
wandernde Parasitenlarven, Infektion über den Nabel und die intrauterine Infektion
genannt (WILSON, 1955; SIPPEL et al., 1968; BARTON u. HUGHES, 1980).
Faktoren, die das Immunsystem schwächen, wie z.B. Endoparasitenbefall,
Transportstress, Herdenumstellungen oder zu große Besatzdichte und andere
Erkrankungen, begünstigen eine Infektion durch Rhodococcus equi (PRESCOTT u.
HOFFMAN, 1993).
2.4.4 Problematik bei Therapie der Rhodokokkose
Durch den therapeutischen Einsatz von Erythromycin und Rifampicin seit nunmehr fast
20 Jahren konnte die Überlebensrate von 20% auf fast 90% gesteigert werden
(HILLIDGE, 1987). Seit kürzerer Zeit ist die Kombination Azithromycin und Rifampicin
Literaturübersicht
53
im Einsatz. Auch Clarithromycin wird zur Therapie herangezogen. Diese Medikamente
sind jedoch sehr teuer und müssen täglich verabreicht werden. Des Weiteren ist die
Therapie zum Teil insuffizient und es treten häufig Nebenwirkungen auf. Da der
Erreger fakultativ intrazellulär wächst und polygranulomatöse Pneumonien verursacht,
muß das Antibiotikum zur Behandlung der Rhodokokkose besondere Eigenschaften
aufweisen. Somit ist die Auswahl einer alternativen Therapie stark eingeschränkt.
Daher stellt Tulathromycin eine attraktive Alternative zur Behandlung der Rhodococcus
equi-Pneumonien dar.
Material und Methode
54
3 Material und Methode
Das Ziel dar vorliegenden Studie bestand darin, die Tulathromycinkonzentration im
Plasma und in der broncioalveolären Lavage beim Fohlen nach einmaliger i.m.
Verabreichung von 2,5 mg/kg Tulathromycin zu bestimmen. Zusätzlich sollte eine
Beeinflussung der Wirkstoffkonzentration durch die Vorbehandlung und zusätzliche
Gabe von Rifampicin untersucht werden.
In der vorliegenden Studie wurden 18 Fohlen einer Tulathromycin- und
Rifampicinbehandlung unterzogen und zu festgelegten Zeitpunkten wurden Blutproben
entnommen, sowie bronchoalveoläre Lavagen durchgeführt. Alle Fohlen bekamen in
dem ersten Protokoll (erste Kinetik) einmalig Tulathromycin intramuskulär verabreicht.
Anschließend wurden in regelmäßigen Abständen über acht Tage Blutproben
entnommen. Nach 24 Stunden und am achten Tag wurde eine bronchoalveoläre
Lavage durchgeführt. Anschließend wurden die Fohlen sechs Tage nur mit Rifampicin
behandelt. Das zweite Protokoll (zweite Kinetik) wurde nach dem gleichen
Beprobungsschema wie die erste Kinetik durchgeführt. Der Unterschied bestand darin,
dass die Fohlen mit Rifampicin vorbehandelt waren und auch während der Kinetik mit
dem Medikament behandelt wurden. Tulathromycin wurde wieder nur zu Beginn der
Kinetik einmal verabreicht. Bei zwölf Pferden wurde anschließend eine zweiwöchige
Behandlung mit einmal pro Woche Tulathromycin intramuskulär und zweimal täglich
Rifampicin per os durchgeführt. Daraufhin wurde bei diesen Probanden die dritte und
letzte Kinetik angeschlossen.
3.1 Probanden
In der Zeit von Mitte Februar bis Ende Juni 2005 wurden auf einem Warmblutgestüt in
Norddeutschland insgesamt 18 Fohlen in die Studie aufgenommen. Von diesen
Probanden wurden sechs einem kurzen und zwölf einem langen Versuchsprotokoll
unterzogen.
Es handelte sich um Warmblutfohlen aus dem Oldenburger Zuchtgebiet.
Da es sich bei der Untersuchung um einen Tierversuch handelte, wurde diese am
24.11.2004 beim Landesveterinär- und Lebensmitteluntersuchungsamt (LVL) von
Material und Methode
55
Mecklenburg - Vorpommern angezeigt. Das Eingangsdatum bei der LVL war der
30.11.2004 und das Aktenzeichen lautet LVL M-V/TSD/7221.3-2.1-021/04.
3.1.1 Allgemeine Bedingungen
Die Untersuchungen wurden in einem privaten Gestüt durchgeführt. Die Stuten werden
regelmäßig gegen EHV 1 und 4, Influenza (zweimal jährlich) und Tetanus (alle zwei
Jahre) mit Duvaxyn® EHV1,4, Duvaxyn® IE plus bzw. Duvaxyn® IE-T plus (Ford Dodge,
Mönchengladbach) geimpft, sowie regelmäßig entwurmt (viermal jährlich).
3.1.2 Bedingungen für die Aufnahme in die Studie
In die Studie wurden 18 Fohlen, neun Stut- und neun Hengstfohlen, aufgenommen, die
zwischen 50-70 Tagen alt waren. Alle Fohlen waren klinisch gesund.
Ultrasonographisch sollten keine Lungenabszesse festzustellen sein. Die Fohlen
durften nicht mit Antibiotika vorbehandelt sein.
3.1.3 Einteilung der Fohlen in Gruppen
Gruppe 1 (kurzes Protokoll)
Bei den sechs Fohlen dieser Gruppe wurden zwei Konzentrationsverläufe von
Tulathromycin gemessen. Zu Beginn jeder Kinetik bekamen die Probanden einmalig
2,5 mg/kg Tulathromycin i.m. verabreicht. Anschließend wurden in den ersten zwölf
Stunden in zu Beginn 20 Minuten- über ein, zwei bis vier Stundenabständen
Blutproben entnommen. Bis zum achten Tag wurden die Probanden einmal täglich
beprobt. 24 Stunden und am achten Tag nach der Medikamentenapplikation wurde
eine bronchoalveoläre Lavage durchgeführt, insgesamt also viermal. Nach der ersten
und während der zweiten Beprobungsperiode wurden die Probanden mit Rifampicin
behandelt. Der Versuch dauerte drei Wochen.
Gruppe 2 (langes Protokoll)
Bei diesen zwölf Probanden wurden drei Konzentrationsverläufe von Tulathromycin
gemessen. Die Versuchsabläufe der ersten beiden Kinetiken waren mit denen der
ersten Gruppe identisch. Sie bekamen zu Beginn jeder Kinetik einmalig 2,5 mg/kg
Tulathromycin i.m. gespritzt und anschließend wurden in den ersten zwölf Stunden in
zu Beginn 20 Minuten- über ein, zwei bis vier Stundenabständen Blutproben
Material und Methode
56
entnommen. Auch hier wurden bis zum achten Tag die Probanden einmal täglich
beprobt. 24 Stunden und am achten Tag nach Applikation wurde eine bronchoalveoläre
Lavage durchgeführt, insgesamt also sechsmal. Da die Fohlen vor der dritten Kinetik
zwei Wochen mit Tulathromycin und Rifampicin behandelt wurden, dauerte der
Versuch in dieser Gruppe sechs Wochen. Zum Versuchsende wurde bei den Fohlen
eine Allgemeinuntersuchung und ein Lungenultraschall durchgeführt.
3.2 Methode
3.2.1 Untersuchung der Fohlen
Die Fohlen wurden vor dem Beginn der Studie, sowie wöchendlich während der
Versuche einer klinischen Allgemeinuntersuchung unterzogen. Hierbei wurde die
rektale Körpertemperatur gemessen, Verhalten, Haltung und Saugverhalten
(Euterfüllung der Mutterstuten) beurteilt. Eine Blutprobe zur Bestimmung der
Leukozytenzahl wurde genommen. Nabel, Gelenke und Kotkonsistenz wurden beurteilt
(siehe Abb. 27 im Anhang).
3.2.1.1 Spezielle Untersuchung des Respirationstrakt es
Ebenfalls zu Beginn der Studie und anschließend einmal wöchendlich wurden an den
Probanden einer Untersuchung des Respirationstraktes vorgenommen. Hierbei wurden
Nasenausfluss, Größe und Konsistenz der Mandibularlymphknoten, Husten, sowie mit
einem Stethoskop Atemgeräusche von Lunge und Trachea beurteilt. Die Auskultation
der Lunge fand auf der linken und rechten Seite des Thorax an drei verschiedenen
Punkten statt: cranio-ventral, Mitte, caudo-dorsal. Sowohl Trachea als auch die
verschiedenen Lungenfelder wurden über mindestens zwei Atemzyklen auskultiert. Es
wurde der Grad der Verschärfung physiologischer Atemgeräusche bzw. das Auftreten
von Nebengeräuschen (Rasseln, Giemen) beurteilt (siehe Abb. 27 im Anhang).
3.2.1.2 Bestimmung der Leukozytenzahl im Blut
Im Rahmen der Untersuchung wurden den Fohlen ca. 1 ml Blut entnommen. Dafür
wurde die Vena jugularis externa mit einer Kanüle (Terumo®, 1,2 x 40 mm, Nueolus)
punktiert und das austretende Blut in mit Kalium-EDTA beschichteten Probenröhrchen
(EDTA K, Sarstedt, Nümbrecht) aufgefangen. Anschließend wurde mit Hilfe eines
Material und Methode
57
automatischen Hämatologie-Analysators (Sysmex KX-21N, Sysmex, Kobe, Japan) die
Anzahl der Leukozyten nach dem Widerstandsmessprinzip bestimmt.
3.2.1.3 Weiterführende Untersuchungen
3.2.1.3.1 Sonographische Untersuchung der Lunge
Die sonographische Lungenuntersuchung wurde mit dem tragbaren, akkubetriebenen
„Sonovet 2000“ (Kretztechnik AG, Tiefenbach, Österreich) und einem Linearscanner
mit einer Frequenz von 7,5 MHz durchgeführt. Der Schallkopf wies eine Länge von 6,5
cm und eine Breite von nur 1,7 cm (Schallfläche: 4,8 x 1,2 cm) auf, um auch gut in den
schmalen Interkostalräumen der kleineren Fohlen untersuchen zu können. Das
Untersuchungsfeld wurde beiderseits dorsal von der Stammmuskulatur (M. longissimus
dorsi), nach cranial durch das Schulterblatt mit seiner Muskulatur (M. triceps brachii, M.
tensor fasciae antebrachii) und nach ventral durch das Sternum begrenzt. Es wurden
alle Intercostalräume vom vierten bis zum zwölften sonographisch untersucht. Zur
Vorbereitung der Untersuchung wurde das Untersuchungsfeld mit einer
Schermaschine (Equi Clip Akku, Lister, Lüdenscheid) geschoren. Anschließend wurde
der Bereich entfettet und dort ein Transmissionsgel (BLR Sonic Ultraschallgel,
Diagonal, Waldeck, Münster) aufgetragen. Beginnend dorsal im zwölften
Intercostalraum wurde fortlaufend von dorsal nach ventral und von caudal nach cranial
untersucht. Ausschließlich Fohlen ohne sonographische Befunde wurden in die
vorliegende Studie aufgenommen und in regelmäßigen Abständen kontrolliert (siehe
Abb. 26 im Anhang).
3.2.2 Klinische Durchführung der Studie
3.2.2.1 Studiengangübersicht
3.2.2.1.1 Studienübersicht der Gruppe 1 (kurzes Prot okoll, n = 6) und Gruppe 2
(langes Protokoll, n = 12)
Eine Tabelle der Studiengangübersicht der Gruppe 1 und 2 ist in Tab. 2 dargestellt.
Material und Methode
58
Allgemeinuntersuchung der Fohlen (n = 18) und Sonographie der Lunge Vorbereitung
Tag -1 und -2
Vor Beginn der Studie wurden die Probanden einer klinischen Allgemeinuntersuchung,
sowie einer Sonographischen Untersuchung der Lunge unterzogen. Die
medikamentöse Vorgeschichte des Tieres wurde überprüft. Im Blut jedes Probanden
wurden die Leukozyten gezählt.
Einen Tag vor Beginn der Medikamentenapplikation und Probennahme wurden die
Fohlen mit der Mutterstute in eine Einzelbox verbracht. Das Fell über einer Vena
jugularis wurde rasiert.
Blutprobenentnahme und bronchoalveoläre Lavage nach einmaliger
Tulathromycininjektion i.m. (2,5 mg/kg) beim Fohlen (n = 18)
Studientag t0 - t8
Am Tag 0 der Studie bekamen die Fohlen eine Braunüle (Vygonüle T, 2,1 x 45 mm,
Vygon Aachen) in die vorbereitete Vena jugularis gelegt.
Das Tulathromycin (Draxxin®, Pfizer, Karlsruhe) wurde in einer Dosierung von 2,5
mg/kg in die lange Sitzbeinmuskulatur der Fohlen gespritzt. Vor und nach Applikation
von Tulathromycin wurden in festgelegten Abständen Blutproben über die Braunüle
entnommen. Eine separate Blutprobe zur Bestimmung von biochemischen
Blutparameter wurde vor der Applikation gewonnen.
Nach 24 Stunden und am achten Tag nach der Injektion erfolgte eine bronchoalveoläre
Lavage (BAL). Separate Blutproben zur Bestimmung der Blutchemie wurden
entnommen. (siehe Tab. 1)
Material und Methode
59
Tab. 1: Zeitpunkte der Blutentnahme und der broncho alveolären Lavage (BAL)
Zeitpunkt nach
Applikation Handlung
0 min Injektion von Tulathromycin,
Blutentnahme
20 min Blutentnahme
40 min Blutentnahme
1 Std. Blutentnahme
2 Std. Blutentnahme
4 Std. Blutentnahme
6 Std. Blutentnahme
8 Std. Blutentnahme
12 Std. Blutentnahme
24 Std. Blutentnahme und BAL
48 Std. Blutentnahme
8 Tage Blutentnahme und BAL
Vorbehandlung der Fohlen (n = 18) mit Rifampicin (10 mg/kg) per os
Studientag t9 - t13
Die Fohlen wurden zweimal täglich mit 10 mg/kg KGW Rifampicin (Rifa® 600, Grünthal,
Aachen) oral behandelt. Die Tabletten wurden hierfür in Wasser aufgelöst und mit einer
35 ml Spritze ins Maul eingegeben.
Blutprobenentnahme und bronchoalveoläre Lavage nach Tulathromycininjektion i.m.
(2,5 mg/kg) und Rifampicinverabreichung beim Fohlen (n = 18) nach Vorbehandlung
der Fohlen mit Rifampicin (10 mg/kg) per os
Studientag t14
Am 14. Tag wurde erneut eine Braunüle in die kontrolaterale Vena jugularis gelegt und
die Fohlen erhielten 2,5 mg/kg KGW Tulathromycin intramuskulär, sowie Rifampicin (10
Material und Methode
60
mg/kg KGW) per os. Es wurden wie bereits beschrieben Blutproben zur Bestimmung
der Plasmakonzentration von Tulathromycin und der Blutchemie entnommen.
Studientag t15
Eine BAL wurde vorgenommen, Blutproben wurden zur Bestimmung der
Plasmakonzentration von Tulathromycin und der Blutchemie gewonnen. Die Fohlen
erhielten weiterhin 10 mg/kg KGW Rifampicin per os.
Studientag t16 - t21
Es wurden Blutproben gewonnen und Rifampicin zweimal täglich oral verabreicht.
Studientag t22
Die Fohlen erhielten Rifampicin, Blutproben wurden zur Bestimmung der
Plasmakonzentration von Tulathromycin und der Blutchemie genommen und eine BAL
wurde durchgeführt.
Material und Methode
61
Tab. 2: Studienübersicht der Gruppe 1 (kurzes Protok oll, n = 6) und Gruppe 2
(langes Protokoll, n = 12)
Gruppe 1 (kurzes Protokoll, n = 6)
Gruppe 2 (langes Protokoll, n = 12)
Studientag (t) -2 -1 0 1 2-7 8 9-12 13 14 15 16-21 22
Voruntersuchung
und Sonographie
der Lunge
x
Braunüle legen x x
Tulathromycingabe x x
Blutproben-
entnahme x x x x x x x x
Bestimmung der
Blutchemie x x x x x x
Bronchoalveoläre
Lavage x x x x
Rifampicingabe x x x x x x
3.2.2.1.2 Studienübersicht der Gruppe 2 (langes Pro tokoll, n = 12)
Eine Tabelle der Studiengangübersicht der Gruppe 2 ist in Tab. 3 dargestellt.
Zweiwöchige Behandlung der Fohlen (n = 12) mit zweimal täglich Rifampicin oral (10
mg/kg KGW) und einmal wöchentlich Tulathromycin (2,5 mg/kg KGW) intramuskulär
Studientag t23
Die Fohlen bekamen zweimal täglich Rifampicin oral (10 mg/kg KGW) und einmal
wöchentlich Tulathromycin (2,5 mg/kg KGW) intramuskulär.
Studientag t24 - t29
Die Fohlen bekamen zweimal täglich 10 mg/kg KGW Rifampicin oral verabreicht.
Material und Methode
62
Studientag t30
Die Fohlen bekamen zweimal täglich 10 mg/kg KGW Rifampicin und einmal
wöchentlich 2,5 mg/kg KGW intramuskulär Tulathromycin.
Studientag t31 - t36
Die Fohlen bekamen zweimal täglich Rifampicin in der gleichen Dosierung.
Blutprobenentnahme und bronchoalveoläre Lavage nach Tulathromycininjektion i.m.
(2,5 mg/kg) und Rifampicinverabreichung beim Fohlen (n = 12) nach zweiwöchiger
Behandlung der Probanden mit Tulathromycin und Rifampicin
Studientag t37
Die Probanden bekamen eine Braunüle gelegt. Tulathromycin wurde intramuskulär und
Rifampicin zweimal täglich 10 mg/kg KGW oral verabreicht. Blutproben wurden zur
Bestimmung der Plasmakonzentration von Tulathromycin und der Blutchemie
gewonnen.
Studientag t38
Blut wurde zur Bestimmung der Plasmakonzentration von Tulathromycin und der
Blutchemie entnommen und eine BAL durchgeführt. Rifampicin wurde weiterhin
verabreicht.
Studientag t39 - t44
Blutproben wurden zur Bestimmung der Plasmakonzentration von Tulathromycin
entnommen und Rifampicin zweimal täglich 10 mg/kg KGW oral appliziert.
Studientag t45
Eine BAL wurde vorgenommen, Blutproben wurden zur Bestimmung der
Plasmakonzentration von Tulathromycin und der Blutchemie gesammelt und Rifampicin
verabreicht.
Material und Methode
63
Klinische Abschlußuntersuchung mit Sonographie der Lunge
Studientag t46
Die Probanden wurden klinisch untersucht und eine Sonographie der Lunge wurde
durchgeführt.
Tab. 3: Studienübersicht der Gruppe 2 (langes Proto koll, n = 12)
Gruppe 2 (langes Protokoll, n = 12)
Studientag (t) 23 24-29 30 31-35 36 37 38 39-44 45 46
Nachuntersuchung
und Sonographie
der Lunge
x
Braunüle legen x
Tulathromycingabe x x x
Blutproben-
entnahme x x x x
Bestimmung der
Blutchemie x x x
Bronchoalveoläre
Lavage x x
Rifampicingabe x x x x x x x x x
3.2.2.2 Blutprobenentnahme
3.2.2.2.1 Blutprobenentnahme für die Konzentrationsb estimmung von
Tulathromycin im Plasma
Die Blutentnahme erfolgte die ersten acht Stunden über eine Braunüle (Vygonüle T,
2,1 x 45 mm, Vygon Aachen), die in eine Vena jugularis gelegt wurde. Die
nachfolgenden Blutproben wurden durch direkte Punktion der Vene mit einer Kanüle
(Terumo®, 1,2 x 40 mm, Nueolus) durchgeführt. Das Blut wurde in einem Heparin-
Lithium Röhrchen (Monovette®, 4,5 ml LH, Sarstedt) aufgefangen. Die Röhrchen
wurden mit Stutennummer, Datum und Probennummer beschriftet. Nach der
Material und Methode
64
Blutentnahme wurden die Röhrchen unmittelbar mit 2100 U/min für 10 Minuten
zentrifugiert (Hettich Zentrifuge Universal 32). Anschließend wurde das Plasma in je
zwei Nalgene® Cryo Röhrchen (Cryoware™, 2 ml, Rochester, NY) abpippetiert. Diese
wurden mit Datum, Stutennummer und Probennummer beschriftet. Schließlich wurden
die Proben in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zum Transport in einem
Stickstoffkontainer (Taylor-Wharton, 34 HC) aufbewahrt. Der Transport der Proben
erfolgte auf Trockeneis.
3.2.2.2.2 Blutprobenentnahme für die Bestimmung bio chemischer Blutparameter
Zum Zeitpunkt t0, nach 24 Stunden und am achten Tag wurde eine zusätzliche
Blutprobe zur Bestimmung der Blutchemie gewonnen. Die Plasmaproben für die
Blutchemie wurden bei -20°C gelagert. Der Transport i ns Labor erfolgte in
Styroporkisten, die mit Kühlakkus ausgestattet waren. Im Labor der Pferdeklinik der
Tierärztlichen Hochschule Hannover wurden diese Proben mit Hilfe der Trockenchemie
auf den Harnstoff- (Vitros System Chemestry DT 60 II, Ortho-Clinical Diagnostics,
Johnson-Johnson Company), auf den Gamma-Glutamyl-Transferase- (GGT) und
Kreatiningehalt (DTSC II Module) untersucht. Mit der Naßchemie wurden in den Proben
die Werte von Glutamat-Dehydrogenase (GLDH) (Eppendorf PCP 6121) bestimmt.
3.2.2.3 Entnahme der bronchoalveolären Lavage (BAL) für die
Konzentrationsbestimmung von Tulathromycin im Überst and und in der
Zellfraktion
24 Stunden und am achten Tag nach der Medikamentenapplikation wurde bei den
Fohlen eine bronchoalveoläre Lavage zur Bestimmung der Tulathromycinkonzentration
im Überstand und in den Zellen der Spülproben durchgeführt.
Die Probanden wurden mit Xylazin (0,8 mg/kg i.v.) sediert und drei bis fünf Minuten
später mit Ketamin (2,2 mg/kg i.v.) und Diazepam (0,2 mg/kg i.v.) in Narkose gelegt.
Die Fohlen wurden mit Hilfe von Sandsäcken in Brustlage verbracht. Eine Person
fixierte den Kopf. Bei jedem Fohlen wurde eine der Nüstern mit einem Tupfer gereinigt.
Die BAL erfolgte transendoskopisch mit einem flexiblen Fiberskop (60512 VG Storz)
der Firma Karl Storz (Tuttlingen). Der Außendurchmesser dieses Endoskops betrug 8,4
mm, die Arbeitslänge lag bei 1,50 m. Das Endoskop war direkt an eine Lichtquelle
angeschlossen (Xenon Nova 20131520, Karl Storz, Tuttlingen), die eine manuelle
Material und Methode
65
Einstellung der Lichtintensität erlaubte. Auch die Spülung der Optik über den Spülkanal
mit steriler NaCl-Lösung (0,9% NaCl, B. Braun, Melsungen) erfolgte manuell. Zur
Schleimhautanästhesie wurde eine 1,70 m lange sterile Plastiksonde in den
Arbeitskanal des Bronchoskops eingeführt, auf deren äußeren Ende eine sterile 20 ml
Spritze zur Applikation von 10 ml 10%igem Lidocain aufgesetzt wurde. Das Endoskop
wurde unter Sichtkontrolle über den ventralen Nasengang in die Trachea eingeführt
und bis in die zweite Tubusgeneration vorgeschoben, bis der Bronchus abgedichtet
wurde. Dann erfolgten nacheinander zwei Spülschritte des abgedichteten
bronchoalveolären Bereiches mit jeweils 100 ml ca. 30°C w armer PBS-Lösung
(Phosphat Buffered Saline).
Die rückgewonnene Flüssigkeit beider Spülvorgänge wurde gemischt und das
Gesamtvolumen wurde bestimmt. In der Nativlösung fand unmittelbar nach
Probenentnahme eine Zellzählung mittels einer Neubauer Zählkammer unter dem
Mikroskop (Laboval 4, Zeiss Jena) bei einer 40er Vergrößerung statt. Die Nativlösung
wurde anschließend in einer Zentrifuge (Hettich Zentrifuge Universal 32) mit 1680
U/min für 10 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde abpipettiert und der Zellboden
beider Spülproben in 1 ml PBS resuspendiert. Überstand und Zellsuspension wurden in
separate 2 ml Nalgene® Cryo Röhrchen verbracht und in flüssigem Stickstoff bis zum
Transport konserviert. Der Transport erfolgte auf Trockeneis.
Bei jeder BAL wurden aus dem Zellsediment zwei Ausstriche für eine
Zelldifferenzierung angefertigt. Diese wurden im Labor der Klinik für Pferde der
Tierärztlichen Hochschule Hannover nach May Grünwald gefärbt und anschließend
unter dem Mikroskop (Zeiss III RS) mit Hilfe der Ölimmersion (Immersol®, 519N Zeiss)
betrachtet. Als Auszählhilfe wurde der Leucodiff 600 (Boscamp Gmbh) verwendet.
3.2.2.4 Abschlussuntersuchung
Bei den Fohlen der Gruppe 2 (langes Protokoll) erfolgte nach der letzten BAL am 46.
Studientag eine Allgemeinuntersuchung mit einem anschließenden Sonographie der
Lunge, um eine eventuelle Beeinträchtigung der Lunge durch die bronchoalveoläre
Lavage zu überprüfen.
Material und Methode
66
3.2.3 Analytische Untersuchung der Proben zur Bestim mung der
Konzentration von Tulathromycin
Die analytische Untersuchung der Proben wurde in dem Institut der klinischen
Pharmakologie der Ernst-Moritz-Arndt Universität in Greifswald durchgeführt. Die in der
Analytik verwendeten Reagenzien sind im Anhang in Tab. 30 aufgeführt.
3.2.3.1 Aufbereitung der BAL-und Plasmaproben
Die Proben der BAL-Zellsuspension wurden zur Bestimmung der
Tulathromycinkonzentration im Eisbad aufgetaut und anschließend durch vortexen, d.h.
starkes Durchmischen, (Monomixer, Janke & Kunkel, IKA-Labortechnik, Staufen,
Deutschland) homogenisiert. 500 µl der BAL-Zellsuspension wurden zusammen mit 25
µl Internem Standard (IS, Roxithromycin) (c = 5 µg/ml) und 50 µl gesättigter
Natriumcarbonat-Lösung in Eppendorf-Gefäße pipettiert. Nach Zugabe von 1 ml Aqua
bidest. wurden die Proben 10 Minuten im Ultraschallbad (Qualilab, Merck Eurolab
GmbH, Bruchsal, Deutschland) bis zur Zelllysis behandelt und anschließend 10
Minuten zentrifugiert (Eppendorf Zentrifuge Abbott, Darmstadt, Deutschland). 0,5 ml
des wässrigen Überstandes wurden abgehoben und aufbewahrt. Zu den Proben
wurden 0,5 ml Acetonitril zur Proteinfällung und weiteren Stoffextraktion gegeben. Die
Proben wurden wiederholt ultrabeschallt und 10 Minuten zentrifugiert. 0,75 ml des
organischen Überstandes wurden abgehoben, mit dem wässrigen Überstand vereint
und gemischt. Von dieser Mischung wurden 0,65 ml für die Festphasenextraktion
(Gilson ASPEC XL, Abimed, Langenfeld, Deutschland) verwendet.
Von den BAL-Überstände wurden nach Vortexen 500 µl der Probe mit 50 µl gesättigter
Natriumcarbonat-Lösung und 25 µl Internem Standard (c = 5 µg/ml) in
Festphasenextraktionsröhrchen pipettiert, gemischt und für die Festphasenextraktion
verwendet.
500 µl der Plasmaproben wurden mit 50 µl gesättigter Natriumcarbonat-Lösung und 25
µl IS (c = 5 µg/ml) in ein Festphasenextraktionsröhrchen pipettiert. Prophylaktisch
wurden 500 µl Aqua bidest. zu den Proben gegeben, um eine für die
Festphasenextraktion geeignete Viskosität zu erreichen.
Material und Methode
67
3.2.3.2 Aufbereitung der Kalibriergeraden
Zur Erstellung der Kalibriergeraden wurde Plasma und eine bronchoalveoläre Lavage
von einem Pferd, welches nicht mit Tulathromycin behandelt worden war, aufgestellt.
Hierfür wurden den Leerproben definierte Konzentrationen von Tulathromycin
zugegeben. Es wurden Kalibriergeraden von 6 ng/ml bis 800 ng/ml für Plasma, von 100
ng/ml bis 4000 ng/ml für die BAL-Proben und von 6 ng/ml bis 100 ng/ml für die BAL-
Überstände hergestellt. Als Matrix dienten Leerplasma vom Pferd sowie BAL-
Spülflüssigkeit. Die BAL-Spülflüssigkeit für die Kalibriergeraden von 100 bis 4000 ng/ml
wurde vor der Festphasenextraktion wie die BAL-Proben behandelt.
3.2.3.3 Festphasenextraktion
Die Aufreinigung der Proben und Extraktion des Arzneistoffs erfolgte mit Hilfe der
Festphasenextraktion (Gilson ASPEC XL, Abimed, Langenfeld, Deutschland). Das
Gerät wurde mit der „735 Sampler Software“ bedient. Da Tulathromycin ebenso wie der
interne Standard Roxithromycin basische Stoffe sind, wurde als Extraktionssäule die
„Waters Oasis MCX 1cc“ (Milford, USA) verwendet. Waters Oasis MCX 1cc ist ein
Kationenaustauscher, der besonders für die Extraktion von Basen geeignet ist. Zu
Beginn wurden die Säulen mit 1 ml Acetonitril und 1 ml 5 mM KH2PO4 (pH 6,2) (pH-
Meßgerät, Windaus Laborbedarf-Labortechnik-Labor, Clausthal-Zellerfeld,
Deutschland) konditioniert. Der automatische Probengeber brachte die Proben (0,65
ml) auf die Säulen auf. Anschließend wurden die Proben mit Luft durch die Matrix der
Säule gedrückt. Daraufhin wurden die Proben mit je 1ml 5 mM KH2PO4 (pH 6,8) und
Aqua bidest. gewaschen, um z.B. Proteinrückstände der biologischen Matrices zu
entfernen. Das Eluieren der Arzneistoffe in Glasröhrchen erfolgte einmal mit 1 ml und
zweimal mit je 0,5 ml 5%igem ammoniakalischen Acetonitril. Die Extrakte wurden bei
50-55°C zur Trockne eingedampft, mit 100 µl mobiler Ph ase aufgenommen, in Vials
überführt und mittels LC-MS/MS vermessen.
3.2.3.4 Flüssigkeitschromatographie (LC-System) und zweifache
Massenspektroskopie (MS/MS-System)
Für die chromatographische Bestimmung von Tulathromycin und Roxithromycin
wurden verschiedene Trennsäulen getestet mit dem Ergebnis, dass keine der Säulen
gute und reproduzierbare Ergebnisse brachte und damit für Tulathromycin geeignet
Material und Methode
68
war. Aus diesem Grund wurde auf den Gebrauch einer Säule verzichtet, da eine
chromatographische Trennung von Tulathromycin und Roxithromycin bei Detektion
mittels MS/MS nicht zwingend notwendig ist. Um den Massenspektrometer vor zu
starker Verunreinigung zu bewahren, wurden zwei 0,5 µm PEEK Mikrofilter verwendet.
Der Autosampler (Series 200 Autosampler mit Peltier-Kühlung, Perkin Elmer,
Böblingen, Deutschland) wurde auf 15°C temperiert. Da s Fließmittel mit der
Zusammensetzung 30% Formiatpuffer (pH 3) und 70% Acetonitril wurde mit einer
Flussrate von 300 µl/min durch das System gepumpt. Vor Nutzung des Formiatpuffers
wurde dieser durch Ultrabeschallung unter einem angelegten Vakuum
(Membranpumpe MZ 2C/2,4 Diaphragm“Pump“, Vacuubrand, Wertheim, Deutschland)
entgast. Zusätzlich war der LC-Pumpe ein Entgaser (Series 1100 Degasser, Hewlett
Packard, Böblingen, Deutschland) vorgeschaltet.
Von jeder Probe wurden 20 µl injiziert. Die Injektionsnadel wurde vor und nach jeder
Injektion mit je 1 ml eines Wasser/Methanol-Gemisches gespült. Die Probenlaufzeit
betrug 2 Minuten, wobei nach 1,5 Minuten das Eluat verworfen wurde.
Zusätzlich waren dem LC-System ein Säulenofen (Merck T6300/2, Darmstadt,
Deutschland), der auf 25°C temperiert war und eine LC -Pumpe (Series 1100 Bin
Pump, Hewlett Packard, Böblingen, Deutschland) zugeschaltet.
Die Proben wurden bei 350°C mit dem Heated Nebulizer APCI-Interface (API 2000,
Heated Nebulizer, Applied Biosystems, Darmstadt, Deutschland) ionisiert und dem
Massenspektrometer (API 2000 LC/MS/MS system, Applied Biosystems, Darmstadt,
Deutschland) zugeführt. Die nach der Detektion von Tulathromycin entstehenden
Signale wurden in Peaks auf den zugehörigen Rechner dargestellt.
3.2.3.5 Auswertung der Detektionsergebnisse zur Best immung der
Tulathromycinkonzentrationen
Alle Chromatogramme wurden nach der internen Standardmethode über die jeweiligen
Peakflächen ausgewertet. Die Berechnung der Konzentrationen erfolgte über die Peak
Area Ratios (PAR) mit 1/x gewichteter linearer Regression online mit der LC-MS
Software „Analyst 1.2“.
Aus den erhaltenen Konzentrationen im Plasma wurden verschiedene pharmako-
kinetische Parameter berechnet.
Material und Methode
69
Die maximale Plasmakonzentration (Cmax) und der Zeitpunkt an dem die maximale
Plasmakonzentration (tmax) erreicht wird, konnten den Konzentrations-Zeitkurven der
einzelnen Versuchstiere entnommen werden.
Die Halbwertzeit von Tulathromycin (t1/2) ist die Zeitspanne, in der die Konzentration
eines Pharmakons um die Hälfte gesunken ist. Sie wurde nach folgender Formel
berechnet.
el1/2 k
ln2t =
t1/2 = Halbwertszeit (h)
kel = Eliminationskonstante (h-1)
Die Berechnung der AUC (area under the curve) erfolgte mittels der Trapezregel. Die
Gesamt-AUC (AUC0-∞) setzt sich aus den Teil-AUCs (AUC0-t und AUCt-∞) zusammen:
∞−−∞− += tt00 AUCAUCAUC
AUCt-∞ wird dabei mit Hilfe der Eliminationskonstanten kel berechnet, während AUC0-t
mit Hilfe der gemessenen Konzentrationen zu definierten Zeitpunkten ermittelt wird.
Für die AUC im steady-state wird die AUC0-τ (τ = Dosierungsintervall) ermittelt.
Das Verteilungsvolumen wurde nach der folgenden Formel berechnet.
A0c cc
KMDV
+∗=
Vc = Verteilungsvolumen (l)
D = Dosis (mg/kg)
KM = Körpermasse (kg)
c0 = Ordinatenschnittpunkt der Eliminationskurve (ng/ml)
cA = Ordinatenschnittpunkt der ab Cmax berechneten Kurve (ng/ml)
Unterschiede zwischen den Kinetiken wurden mittels WILCOXON-Test erfasst. Dabei
wurde eine Signifikanzschwelle von p < 0,05 festgelegt.
Ergebnisse
70
4 Ergebnisse
4.1 Etablierung des Assays
Die chromatographische Quantifizierung von Tulathromycin im Plasma, den Zellen,
sowie des Überstandes der bronchoalviolären Lavage erfolgte mit einer
Flüssigchromatographischen Methode gekoppelt mit Massenselektiver Detektion (LC-
MS). Die Messungen erfolgten dabei mittels einer im Institut für Pharmakologie der
Universität Greifswald in Anlehnung an die von Galer et. al. (2004) adaptierte und für
Plasma, Zellen und Überstand validierte Bestimmungsmethode (Diplomarbeit Spieker,
2005) entsprechend den geltenden internationalen Richtlinien.
Als Quantifizierungslimit wurde 6 ng/ml für beide Matrices definiert, Präzision und
Richtigkeit waren für diesen Konzentrationswert mit deutlich < 15% erfüllt.
Die Linearität manifestierte sich in beiden untersuchten Matrices mit Korrelations-
koeffizienten ≥ 0,99 sowie einer homoskedastischen Verteilung der Residuen.
Die Wiederfindung (extrahierte Proben in den jeweiligen Matrices im Vergleich zu
eingewogenen nichtextrahierten Proben) wurde im unteren, mittleren und oberen
Segment des jeweiligen Kalibrierbereiches bestimmt. Dabei wurden im Plasma
Wiederfindungen für den Analyten von 49% – 68% sowie von 43% – 48% in der
bronchoalveolären Spülflüssigkeit bestimmt.
Die Präzision (within-day und between-day; ausgedrückt als Variationskoeffizient in %)
und Richtigkeit (between-day; ausgedrückt als relativer Fehler in %) als wesentliche
Qualitätsparameter wurden sowohl über die Qualitätskontrollproben wie auch über die
Kalibratoren bestimmt. Die within-day Präzision über alle Qualitätskontrollproben wurde
mit 3,8% – 14,6%, die within-day Richtigkeit mit - 10,0% – 12,8% bestimmt. Die
between-day Richtigkeit über alle Qualitätskontroll- und Kalibratorproben konnte mit -
12,1% – 10,1%, die between-day Präzision mit 1,0% – 13,7% ermittelt werden.
Alle im Rahmen der hier durchgeführten analytischen Untersuchungsergebnisse
befinden sich in Übereinstimmung mit den geltenden internationalen Richtlinien für die
Validierung bioanalytischer Methoden.
Ergebnisse
71
0.2 0.4 0.60.0
2000.0
4000.0
6000.0
8000.0
1.0e4
1.2e4
1.4e4
1.6e4
1.8e4
2.0e4
2.2e4
2.4e4
2.6e4
2.8e4
3.0e4
3.2e4
3.4e4
3.6e4
3.8e4
4.0e4
4.2e4
4.4e4
0.16 0.22 0.37 0.450.10 0.890.860.640.48 0.79
Abb. 11 Beispielchromatogramm für eine Leerplasmapr obe mit internem
Standard
Ergebnisse
72
Abb. 12 Beispielchromatogramm für eine Plasmaprobe gespiked mit 200 ng/ml
Tulathromycin und 250 ng/ml IS
0.2 0.4 0.60.00
5000.00
1.00e4
1.50e4
2.00e4
2.50e4
3.00e4
3.50e4
4.00e4
4.50e4
5.00e4
5.50e4
6.00e4
6.50e4
7.00e4
7.50e4
8.00e4
8.50e4
9.00e4
9.50e4
1.00e51.03e5 0.16
Ergebnisse
73
4.2 Konzentration von Tulathromycin im Blutplasma be im Fohlen
Um den schnellen Anstieg von Tulathromycin im Blut, sowie der langanhaltenden
Wirksamkeit des Medikamentes zu beschreiben, werden die Plasmakonzentrationen
nach 20 Minuten, sowie am achten Tag angegeben. Zusätzlich wird auf die bei den
Fohlen individuell unterschiedlich erreichten Maximalkonzentrationen eingegangen.
Schließlich werden die pharmakokinetischen Parameter der Probanden aufgezeigt.
Die Einzelwerte der Konzentration von Tulathromycin im Plasma sind im Anhang in
Tab. 13 bis Tab. 15 erfasst.
4.2.1 Verlauf der Tulathromycinkonzentration nach ei nmaliger i.m.
Applikation
Die Ausgangswerte lagen bei 0 auf der x-Achse und bei 10 ± 7,2 auf der y-Achse.
20 Minuten nach intramuskulärer Tulathromycinapplikation, dem ersten
Blutabnahmezeitpunkt, wurde bei 17 Fohlen im Plasma im Mittel eine Konzentration
von 516 ng/ml mit einer Standardabweichung von 327 erreicht. Am achten Tag,
nachdem das Medikament intramuskulär verabreicht wurde, war im Plasma im Mittel
35,5 ng/ml mit einer Standardabweichung von 16,7 nachweisbar.
Von den sechs Fohlen des kurzen Protokolls (Gruppe 1) wurde die maximale
Plasmakonzentration bei zwei Probanden mit Werten von 764 und 490 ng/ml nach 20
Minuten erreicht. Bei drei Patienten wurden die höchsten Werte mit 225, 272 und 318
ng/ml nach 40 Minuten und bei einem Probanden mit dem Ergebnis von 336 ng/ml
nach acht Stunden erreicht.
Ein Fohlen des langen Protokolls fiel in der Studie durch Kolikerscheinungen nach
Tulathromycinverabreichung auf. Da die gemessenen Werte dieses Probanden starke
Abweichungen zu allen anderen Ergebnissen aufwiesen, werden sie gesondert zum
Schluß dieses Abschnittes betrachtet.
Bei den übrigen elf Fohlen des langen Protokolls (Gruppe 2) wurde bei sechs
Probanden am ersten Blutentnahmezeitpunkt, also nach 20 Minuten die höchste
Plasmakonzentration des Antibiotikums erreicht. Es wurden Konzentrationen von 757,
595, 1470, 814, 215 und 531 ng/ml ermittelt. Bei zwei Fohlen wurde die maximalen
Plasmawerte nach 40 Minuten mit 686 und 758 ng/ml gemessen. Drei Probanden
Ergebnisse
74
wiesen ihre größte Menge Tulathromycin nach einer Stunde im Plasma auf. Hier
wurden Werte von 547, 691 und 402 ng/ml ermittelt (siehe Abb. 13 und Abb. 14).
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13Zeit in h
Tul
athr
omyc
inko
nzen
trat
ion
in
ng/m
l
Abb. 13: Plasmakonzentration nach einmaliger i.m. I njektion von Tulathromycin
(2,5 mg/kg) beim Fohlen (n = 17) (in Mittelwert und
Standardabweichung angegeben)
Ergebnisse
75
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
0 24 48 72 96 120 144 168 192Zeit in h
Tul
athr
omyc
inko
nzen
trat
ion
in
ng/m
l
Abb. 14: Plasmakonzentration nach einmaliger i.m. I njektion von Tulathromycin
(2,5 mg/kg) beim Fohlen (n = 17) (in Mittelwert und
Standardabweichung angegeben)
Die Kinetik nach einmaliger Tulathromycingabe ergibt bei allen 17 Probanden, eine
maximale Plasmakonzentration von 584 ± 302 ng/ml nach 0,67 Stunden. Die
errechnete Halbwertszeit lag bei 129 ± 46 Stunden. Das Ergebnis der area under the
curve lag bei 20000 ± 4268 ng x h/ml. Die AUC0-t erreichte Werte von 14776 ± 3340 ng
x h/ml und für die AUCt-∞ wurden Daten von 26,1 ± 8,3% ermittelt. Das
Verteilungsvolumen lag bei 577 ± 348 l (siehe Tab. 4).
Ergebnisse
76
Tab. 4: Pharmakokinetische Parameter von Tulathromy cin im Plasma beim
Fohlen (n = 17) nach einmaliger i.m. Gabe von Tulat hromycin (2,5
mg/kg)
nach einmaliger Tulathromycin-
applikation
AUC [ng×h/ml] 20000 ± 4268
AUC0-t [ng×h/ml] 14776 ± 3340
AUCt-∞∞∞∞ [%] 26.1 ± 8.3
Cmax [ng/ml] 584 ± 302
tmax [h] 0,67 (0,33; 8)
t½ [h] 129 ± 46
Vc [l] 577 ± 348
tmax angegeben als Median (Minimum; Maximum), alle anderen Werte sind als
Mittelwert ± Standardabweichung angegeben
4.2.2 Verlauf der Tulathromycinkonzentration nach Vo rbehandlung mit
Rifampicin und zusätzlicher Verabreichung von Rifampi cin
Nachdem die Fohlen der Gruppe 1 und 2 (n = 18) sechs Tage mit Rifampicin
vorbehandelt worden waren, wurde die zweite Kinetik durchgeführt.
Die Ausgangswerte lagen bei 0 auf der x-Achse und bei 14 ± 2,7 auf der y-Achse.
Bei diesem Studienabschnitt wurde nach 20 Minuten eine mittlere Plasmakonzentration
von 513,7 ng/ml mit einer Standardabweichung von 410,4 ermittelt. Am achten Tag
nach Tulathromycininjektion betrug die bestimmte Plasmakonzentration 29,4 ng/ml mit
einer Standardabweichung von 6,5.
Nachdem die Fohlen sechs Tage mit 10 mg/kg Rifampicin per os zweimal täglich
vorbehandelt worden waren, erreichten fünf Fohlen des kurzen Protokolls (Gruppe 1)
nach einmaliger Applikation von 2,5 mg/kg Tulathromycin i.m., ihre maximale
Plasmakonzentration nach 20 Minuten. Die gemessenen Werte betrugen hier 635, 282,
Ergebnisse
77
848, 702 und 461 ng/ml. Ein Proband wies die höchste Plasmakonzentration nach
sechs Stunden mit einem Wert von 206 ng/ml auf.
Die sechs Tage mit Rifampicin vorbehandelten Fohlen des langen Versuchsprotokolls
(Gruppe 2) erreichten ihre maximalen Plasmakonzentrationen nach 20 Minuten bis
zwei Stunden nach einmaliger Tulathromycininjektion. Hierbei entfielen drei
Maximalwerte auf die erste Beprobung nach 20 Minuten mit Werten von 615, 611 und
413 ng/ml. Fünf Probanden wiesen die höchsten Werte im Plasma nach 40 Minuten
auf. Die gemessenen Konzentrationen lagen bei 632, 467, 430, 1190 und 258 ng/ml.
Zum nächsten Blutentnamezeitpunkt nach einer Stunde zeigten zwei Pferde ihre
Maximalwerte mit 348 und 274 ng/ml. Die letzte Maximalkonzentration wurde nach
zwei Stunden mit einem Wert von 386 ng/ml erreicht (siehe Abb. 15 und Abb. 16).
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13Zeit in h
Tul
athr
omyc
inko
nzen
trat
ion
in
ng/m
l
Abb. 15: Plasmakonzentration nach i.m. Injektion vo n Tulathromycin (2,5 mg/kg)
und zusätzlicher Verabreichung von Rifampicin (10 m g/kg) zweimal
täglich p.o. nach Vorbehandlung über sechs Tage mit Rifampicin beim
Fohlen (n = 17) (in Mittelwert und Standardabweichu ng angegeben)
Ergebnisse
78
0100200300400500600700800
9001000
0 24 48 72 96 120 144 168 192Zeit in h
Tul
athr
omyc
inko
nzen
trat
ion
in
ng/m
l
Abb. 16: Plasmakonzentration nach i.m. Injektion vo n Tulathromycin (2,5 mg/kg)
und zusätzlicher Verabreichung von Rifampicin (10 m g/kg) zweimal
täglich p.o. nach Vorbehandlung über sechs Tage mit Rifampicin beim
Fohlen (n = 17) (in Mittelwert und Standardabweichu ng angegeben)
Bei den 17 Probanden der zweiten Kinetik wurde die maximale Plasmakonzentration
von Tulathromycin von 557 ± 389 ng/ml nach 0,33 Stunden erreicht. Die Halbwertszeit
lag bei zusätzlicher Verabreichung von Rifampicin bei 129 ± 47 Stunden. Der Wert der
AUC lag bei 20039 ± 3796 ng x h/ml. Für die AUC0-t wurden 14368 ± 2262 ng x h/ml
ermittelt. Die AUCt-∞ kam in dieser Kinetik auf 27,2 ± 9,9%. Das Verteilungsvolumen
lag bei 587 ± 290 l (siehe Tab. 5).
Ergebnisse
79
Tab. 5: Pharmakokinetische Parameter von Tulathromy cin im Plasma beim
Fohlen (n = 17) nach i.m. Injektion von Tulathromyc in (2,5 mg/kg) und
zusätzlicher Verabreichung von Rifampicin (10 mg/kg) zweimal täglich
p.o. nach Vorbehandlung über sechs Tage mit Rifampi cin
nach Vorbehandlung mit Rifampicin
AUC [ng×h/ml] 20039 ± 3796
AUC0-t [ng×h/ml] 14368 ± 2262
AUCt-∞∞∞∞ [%] 27.2 ± 9.9
Cmax [ng/ml] 557 ± 389
tmax [h] 0,33 (0,33; 12)
t½ [h] 129 ± 47
Vc [l] 587 ± 290
tmax angegeben als Median (Minimum; Maximum), alle anderen Werte sind als
Mittelwert ± Standardabweichung angegeben
4.2.3 Verlauf der Tulathromycinkonzentration nach zwe iwöchiger
Behandlung der Fohlen mit Tulathromycin und Rifampi cin und
zusätzlicher Verabreichung von Rifampicin
Die Ausgangswerte lagen bei 0 auf der x-Achse und bei 48,3 ± 10,9 auf der y-Achse.
Nach zweiwöchiger Behandlung der Fohlen mit Tulathromycin einmal pro Woche und
Rifampicin zweimal täglich wurde bei elf Probanden die dritte Kinetik bestimmt. Zum
ersten Blutentnahmezeitpunkt nach 20 Minuten wurde eine durchschnittliche
Konzentration von 558,7 ng/ml mit einer Standardabweichung von 308,4 nach
einmaliger Tulathromycingabe bestimmt. Am achten Tag nach
Tulathromycinapplikation betrug die Konzentration 48,4 ng/ml mit einer
Standardabweichung von 12,4.
Die maximale Plasmakonzentration erreichten sieben Probanden nach 20 Minuten mit
Werten von 671, 488, 627, 815, 1160, 873 und 319 ng/ml. Ein Pferd wies die höchste
Konzentration von 462 ng/ml nach einer Stunde auf. Ein weiterer Proband erreichte
Ergebnisse
80
nach zwei Stunden das Plasmamaximum mit einem Wert von 399 ng/ml. Zwei
Probanden zeigten die höchste Konzentration von Tulathromycin im Plasma nach zwölf
Stunden. Die Werte lagen bei 288 und 132 ng/ml (siehe Abb. 17 und Abb. 18).
0100200300400500600700800900
1000
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13Zeit in h
Tul
athr
omyc
inko
nzen
trat
ion
in
ng/m
l
Abb. 17: Plasmakonzentration nach i.m. Injektion vo n Tulathromycin (2,5 mg/kg)
und zusätzlicher Verabreichung von Rifampicin (10 m g/kg) zweimal
täglich p.o. nach zuvor zweiwöchiger Behandlung mit Rifampicin und
Tulathromycin beim Fohlen (n = 11) (in Mittelwert u nd
Standardabweichung angegeben)
Ergebnisse
81
0100200300400500600700800900
1000
0 24 48 72 96 120 144 168 192Zeit in h
Tul
athr
omyc
inko
nzen
trat
ion
in
ng/m
l
Abb. 18: Plasmakonzentration nach i.m. Injektion vo n Tulathromycin (2,5 mg/kg)
und zusätzlicher Verabreichung von Rifampicin (10 m g/kg) zweimal
täglich p.o. nach zuvor zweiwöchiger Behandlung mit Rifampicin und
Tulathromycin beim Fohlen (n = 11) (in Mittelwert u nd Standard-
abweichung angegeben)
Die maximale Plasmakonzentration nach einmaliger i.m. Injektion von Tulathromycin
(2,5 mg/kg) und zuvor zweiwöchiger Behandlung mit Rifampicin (10 mg/kg) zweimal
täglich p.o. und Tulathromycin von 567 ± 299 ng/ml wurde bei diesen elf Probanden
nach 0,33 Stunden erreicht. Die Halbwertszeit von Tulathromycin lag in dieser Kinetik
bei 173 ± 77 Stunden. Die AUC wurde mit 31500 ± 8173 ng x h/ml errechnet. Die
AUC0-t lag bei 19716 ± 4186 ng x h/ml. Die AUCt-∞ erreichte Werte von 36 ± 13,5%.
Das Verteilungsvolumen lag bei 605 ± 382 l (siehe Tab. 6)
Ergebnisse
82
Tab. 6: Pharmakokinetische Parameter von Tulathromy cin im Plasma beim
Fohlen (n = 11) nach i.m. Injektion von Tulathromyc in (2,5 mg/kg) und
zusätzlicher Verabreichung von Rifampicin (10 mg/kg) zweimal täglich
p.o. nach zuvor zweiwöchiger Behandlung mit Rifampici n und
Tulathromycin
nach zweiwöchiger Behandlung mit
Tulathromycin und Rifampicin
AUC [ng×h/ml] 31500 ± 8173
AUC0-t [ng×h/ml] 19716 ± 4186
AUCt-∞∞∞∞ [%] 36.0 ± 13.5
Cmax [ng/ml] 567 ± 299
tmax [h] 0,33 (0,33; 6)
t½ [h] 173 ± 77
Vc [l] 605 ± 382
tmax angegeben als Median (Minimum; Maximum), alle anderen Werte sind als
Mittelwert ± Standardabweichung angegeben
4.2.4 Vergleich der Plasmakonzentration von Tulathro mycin der 1., 2. und
3. Kinetik
Die maximale Plasmakonzentration der dritten Kinetik von 567 ± 299 ng/ml ist
signifikant niedriger als zu den Werten ohne Rifampicin von 584 ± 302 ng/ml. Die AUC
der dritten Kinetik von 31500 ± 8173 ng x h/ml ist signifikant höher, als die AUC der
ersten 20000 ± 4268 ng x h/ml und zweiten 20039 ± 3796 ng x h/ml Kinetik. Vergleicht
man nun die AUC der ersten und zweiten Kinetik von 20000 ± 4268 und 20039 ± 3796
ng x h/ml, erhält man einen ähnlichen Wert wie die AUC0-t von 19716 ± 4186 ng x h/ml
der dritten Kinetik. Das Verteilungsvolumen der dritten Kinetik ist signifikant höher als in
der ersten Kinetik (siehe Abb. 19 und Abb. 20, sowie Tab. 7).
Ergebnisse
83
0
100
200
300
400
500
600
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13Zeit in h
Tul
athr
omyc
inko
nzen
trat
ion
in
ng/m
l
1. Kinetik ohne Rifa
2. Kinetik mit Rifa
3. Kinetik mit Rifa
Abb. 19: Vergleichende Darstellung der Plasmakonzen tration nach i.m. Injektion
von Tulathromycin bei Fohlen mit und ohne Kombinati on von
Rifampicin
0
100
200
300
400
500
600
0 24 48 72 96 120 144 168 192Zeit in h
Tul
athr
omyc
inko
nzen
trat
ion
in
ng/m
l
1. Kinetik ohne Rifa
2. Kinetik mit Rifa
3. Kinetik mit Rifa
Abb. 20: Vergleichende Darstellung der Plasmakonzen tration nach i.m. Injektion
von Tulathromycin bei Fohlen mit und ohne Kombinati on von
Rifampicin
Ergebnisse
84
Tab. 7: Vergleich der pharmakokinetischen Parameter von Tulathromycin im
Plasma von Fohlen
nach einmaliger
Tulathromycin-
applikation
nach
Vorbehandlung
mit Rifampicin
nach
zweiwöchiger
Behandlung mit
Tulathromycin und
Rifampicin
AUC [ng×h/ml] 20000 ± 4268* 20039 ± 3796† 31500 ± 8173*†
AUC0-t [ng×h/ml] 14776 ± 3340 14368 ± 2262 19716 ± 4186
AUCt-∞∞∞∞ [%] 26,1 ± 8,3 27,2 ± 9,9 36,0 ± 13,5
Cmax [ng/ml] 584 ± 302* 557 ± 389 567 ± 299*
tmax [h] 0,67 (0,33; 8) 0,33 (0,33; 12) 0,33 (0,33; 6)
t½ [h] 129 ± 46 129 ± 47 173 ± 77
Vc [l] 577 ± 348* 587 ± 290 605 ± 382*
* Werte signifikante Unterschiede † Werte signifikante Unterschiede
tmax angegeben als Median (Minimum; Maximum), alle anderen Werte sind als
Mittelwert ± Standardabweichung angegeben
4.3 Gesamtzellgehalte, Menge der Rückspülflüssigkeit und
Zellfraktionen in der bronchoalveolären Lavageflüss igkeit
Die Gesamtzellzahl in der ersten bronchoalveolären Lavage lag im Mittel bei 15,1 ± 6
G/l. Der Mittelwert der zweiten Lavage lag bei 14,1 ± 5,3 G/l. Ein Wert von 16,4 G/l mit
einer Standardabweichung von 6,1 wurde für die dritte und ein Mittel von 18,4 G/l mit
einer Abweichung von 7,6 für die vierte Rückspülflüssigkeit bestimmt. Die Werte der
fünften und sechsten bronchoalveolären Lavage lagen bei 21,4 G/L mit einer
Standardabweichung von 10,5 und 27,4 G/l mit einer Abweichung von 18,5 (siehe Tab.
22 im Anhang).
Die erwartete Rückspülmenge der bronchoalveolären Lavage liegt bei 60%. Dies sind
bei 200 ml, die in den Lungenabschnitt verbracht wurden 120 ml. In der vorliegenden
Ergebnisse
85
Studie wurden im Mittel 125,5 ± 28,5 ml zurückgewonnen. Die Einzelwerte der
rückgewonnenen Lavageflüssigkeiten sind tabellarisch im Anhang auf Seite
aufgeführt.
Von jeder der durchgeführten bronchoalveolären Lavage wurde aus dem Sediment ein
Ausstrich angefertigt und eine Zelldifferenzierung durchgeführt. Im Mittel entfielen 69,5
± 14,8% auf die Makrophagen. Der höchste ausgezählte Wert dieser Zellen lag bei
93,5%, der niedrigste bei 17%. Die Lymphozyten waren im Durchschnitt zu 23,2 ±
15,5% vertreten. Hier erreichte der höchste Anteil 81% und der geringste Anteil lag bei
1,5%. Die Mastzellen waren zu 0,2 ± 0,5% im Ausstrich auszuzählen. Ihre Werte
reichten von 0–4,5%. Der Mittelwert der neutrophilen Granulozyten lag bei 3,3 ± 3,4%.
Der Anteil variierte in den einzelnen Ausstrichen von 0–23,5%. Des Weiteren waren
durchschnittlich 2,5 ± 4,1% Epithelzellen auszuzählen. Ihre Werte schwankten
zwischen 0 und 23%. Die Riesenzellen waren im Mittel zu 1,3 ± 1,1% vertreten, mit
einem Maximum von 5% und einem Minimum von 0% (siehe Tab. 8).
Die Erythrozyten wurden nicht berücksichtigt, da ihr Auftreten in der Spülprobe auf die
leichte Traumatisierung der Schleimhaut durch das Endoskop zurückzuführen ist und
sie normalerweise keinen Anteil in den rückgespülten Zellen der bronchoalveolären
Lavage ausmachen würden.
Ergebnisse
86
Tab. 8: Prozentualer Anteil der einzelnen Zelltypen a n den BAL-Zellen bei
Fohlen der Gruppe 1 (n = 6) und Gruppe 2 (n = 12)
nach einmaliger
Tulathromycin-
applikation
nach
Vorbehandlung
mit Rifampicin
nach
zweiwöchiger
Behandlung mit
Tulathromycin
und Rifampicin
1. BAL 2. BAL 3. BAL 4. BAL 5. BAL 6. BAL
Normwerte
Makrophagen 74,2 71,1 69,9 62,9 78,0 60,8 45-70
Lymphozyten 18,6 19,4 23,4 28,o 16,9 33,0 30-50
Mastzellen 0,2 0,2 0,7 0,1 0,1 0,1 0-5
Neutrophile 4,6 4,7 2,4 3,3 2,9 1,9 0-8
Epithelzellen 1,3 3,3 2,3 4,3 0,8 2,8 0-5
Riesenzellen 1,2 1,4 1,4 1,4 1,4 1,3 0-5
4.4 Konzentration von Tulathromycin in der bronchoal veolären
Lavageflüssigkeit
Die gemessenen Konzentrationen wurden auf ng/109 Zellen berechnet. Bei 16 von 18
Probanden wurde zusätzlich die Tulathromycinkonzentration im Überstand der
rückgewonnenen Lavageflüssigkeit bestimmt.
4.4.1 Konzentration von Tulathromycin in der broncho alveolären Lavage
nach einmaliger i.m. Applikation
Der niedrigste in der ersten Kinetik gemessene Wert 24 Stunden nach
Tulathromycinapplikation lag in den Zellen bei 128,3 ng. Der höchste Wert betrug 548,5
ng. Insgesamt lag der Mittelwert nach 24 Stunden bei 246,2 ng mit einer
Standardabweichung von 97,9.
Die im Überstand zu ermittelnden Konzentrationen lagen zwischen 20,4 und 80,4
ng/ml. Der Mittelwert lag bei 37,1 ± 19 ng/ml.
Ergebnisse
87
Am achten Tag nach Injektion von Tulathromycin betrug der kleinste in den Zellen zu
messende Wert 158,9 ng. Der höchste Wert lag bei 1234,6 ng. Der Mittelwert lag zu
diesem Zeitpunkt bei 392,8 ng mit einer Standardabweichung von 250,5 ng.
In den Überständen wurde von den Proben am achten Tag als geringste Konzentration
4,1 und als höchste Konzentration 36,9 ng/ml gemessen. Der Mittelwert lag hier bei
12,4 ± 7,7 ng/ml (siehe Tab. 9).
Die Ergebnisse der ersten BAL sind nach WILCOXON ausgerechnet signifikant
niedriger, als die Werte der zweiten BAL, sowie der zweiten und dritten Kinetik.
Tab. 9: Konzentrationen von Tulathromycin in den BAL -Zellen und im
Überstand beim Fohlen (n = 18) nach einmaliger Tula thromycingabe
(2,5 mg/kg) (in Mittelwert ±±±± Standardabweichung angegeben)
Tulathromycinkonzentration
24 h nach
Tulathromycingabe
8 t nach
Tulathromycingabe
in BAL-Zellen [ng/10 9 Zellen] 246,2 ± 97,9 392,8 ± 250,5
im BAL-Überstand [ng/ml] 37,1 ± 19,0 12,4 ± 7,7
4.4.2 Konzentration von Tulathromycin in der broncho alveolären Lavage
nach Vorbehandlung mit Rifampicin
Die Werte dieser Kinetik lagen nach 24 Stunden im Mittel bei 349,9 ng in einer Milliarde
Zellen mit einer Standardabweichung von 124,9. Der kleinste zu verzeichnende Wert
betrug 140,9 ng, der höchste 607,5 ng.
Die Konzentrationen im Überstand betrugen zu diesem Zeitpunkt im Mittel 27 ± 10,5
ng/ml. Die hier ermittelte geringste Konzentration lag bei 12,4, die höchste bei 39,4
ng/ml.
Am achten Tag konnten in den Zellen durchschnittlich 335 ng mit einer
Standardabweichung von 135,6 und einem Minimalwert von 131,7 und einem
Maximalwert von 608,9 ng nachgewiesen werden.
In den Überständen wurden Werte von duchschnittlich 10,3 ± 5,5 ng/ml nachgewiesen.
Die höchste Konzentration lag hier bei 18,4, die geringste bei 2,2 ng/ml (siehe Tab. 10).
Ergebnisse
88
Tab. 10: Konzentrationen von Tulathromycin in den BA L-Zellen und im
Überstand beim Fohlen (n = 18) nach Tulathromycinga be (2,5 mg/kg)
und zusätzlicher Gabe von Rifampicin (10 mg/kg) nach Vorbehandlung
mit Rifampicin über sechs Tage (in Mittelwert ±±±± Standardabweichung
angegeben)
Tulathromycinkonzentration
24 h nach
Tulathromycingabe
8 t nach
Tulathromycingabe
BAL-Zellen [ng/10 9 Zellen] 349,9 ± 124,9 335,0 ± 135,6
BAL-Überstand [ng/ml] 27,0 ± 10,5 10,3 ± 5,5
4.4.3 Konzentration von Tulathromycin in der broncho alveolären Lavage
nach zweiwöchiger Behandlung mit Tulathromycin und R ifampicin
Bei den Probanden des langen Protokolls erreichte die Tulathromycinkonzentration in
den BAL-Zellen nach 24 Stunden einen Wert zwischen 1919,3 ng und 334,2 ng/109
Zellen. Der Mittelwert betrug 981 ng/109 Zellen und die Standardabweichung 425,8.
In den Überständen wurden Werte von 8,4 bis 72,2 ng/ml gemessen. Der Mittelwert
betrug 37,7 ± 17,8 ng/ml.
Am achten Tag nach einmaliger Tulathromycingabe wiesen die Zellen Konzentrationen
von 341,8 bis 1187,4 ng in 109 Zellen auf. Im Mittel beliefen sich die Werte auf 723,8 ng
mit einer Standardabweichung von 259,9.
Im Überstand ließen sich Messwerte von minimal 4,6 ng/ml und maximal 21,9 ng/ml
feststellen. Der errechnet Mittelwert betrug 11,6 ± 5,2 ng/ml (siehe Tab. 11).
Die Ergebnisse sind nach WILCOXON ausgerechnet signifikant höher, als die Werte
der ersten und zweiten Kinetik.
Ergebnisse
89
Tab. 11: Konzentrationen von Tulathromycin in den BA L-Zellen beim Fohlen
und im Überstand beim Fohlen (n = 18) nach Tulathro mycingabe (2,5
mg/kg) und zusätzlicher Gabe von Rifampicin (10 mg/kg ) zweimal
täglich p.o. nach zweiwöchiger Behandlung mit Tulath romycin und
Rifampicin (in Mittelwert ±±±± Standardabweichung angegeben)
Tulathromycinkonzentration
24 h nach
Tulathromycingabe
8 t nach
Tulathromycingabe
BAL-Zellen [ng/10 9 Zellen] 981,0 ± 425,8 723,8 ± 259,9
BAL-Überstand [ng/ml] 37,7 ± 17,8 11,6 ± 5,2
Ergebnisse
90
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1. BAL 2. BAL 3. BAL 4. BAL 5. BAL 6. BALTul
athr
omyc
inko
nzen
trat
ion
in n
g/10
9 Zel
len
Abb. 21: Konzentrationen von Tulathromycin in den BA L-Zellen bei Fohlen (in
Mittelwert + Standardabweichung angegeben)
1. BAL: 24 h nach Tulathromycingabe
2. BAL: 8 t nach Tulathromycingabe
3. BAL: 24 h nach Tulathromycingabe und zusätzliche Rifampicingabe nach Vor
behandlung mit Rifampicin über sechs Tage
4. BAL: 8 t nach Tulathromycingabe und zusätzliche Rifampicingabe nach Vor
behandlung mit Rifampicin über sechs Tage
5. BAL: 24 h nach Tulathromycingabe und zusätzliche Rifampicingabe nach
zweiwöchiger Behandlung mit Tulathromycin und Rifampicin
6. BAL: 8 t nach Tulathromycingabe und zusätzliche Rifampicingabe nach zwei
wöchiger Behandlung mit Tulathromycin und Rifampicin
Ergebnisse
91
0
10
20
30
40
50
60
1. BAL 2. BAL 3. BAL 4. BAL 5. BAL 6. BAL
Tul
athr
omyc
inko
nzen
trat
ion
in n
g/m
l
Abb. 22: Konzentrationen von Tulathromycin in den BA L-Überständen bei
Fohlen (in Mittelwert + Standardabweichung angegebe n)
1. BAL: 24 h nach Tulathromycingabe
2. BAL: 8 t nach Tulathromycingabe
3. BAL: 24 h nach Tulathromycingabe und zusätzliche Rifampicingabe nach Vor
behandlung mit Rifampicin über sechs Tage
4. BAL: 8 t nach Tulathromycingabe und zusätzliche Rifampicingabe nach Vor
behandlung mit Rifampicin über sechs Tage
5. BAL: 24 h nach Tulathromycingabe und zusätzliche Rifampicingabe nach
zweiwöchiger Behandlung mit Tulathromycin und Rifampicin
6. BAL: 8 t nach Tulathromycingabe und zusätzliche Rifampicingabe nach zwei
wöchiger Behandlung mit Tulathromycin und Rifampicin
4.5 Ergebnisse der Blutchemie
Um negative Einflüsse von Tulathromycin und Rifampicin auf die Leber- und
Nierenfunktion zu überprüfen, wurden Blutbroben zur Bestimmung biochemischer
Blutparameter genommen.
Ergebnisse
92
Bei den zwölf Probanden des langen Protokolls wurden für alle drei Kinetiken vor
Beginn und nach Beendigung der Medikamentengabe Parameter zur Bestimmung der
Leber- und Nierenfunktion untersucht. Als für diese Organe aussagekräftige
Blutparameter wurden für die Leber Gamma-Glutamyl-Transferase (GGT) und
Glutamat-Dehydrogenase (GLDH) und für die Niere Harnstoff und Kreatinin bestimmt.
Der mittlere Wert für die Gamma-Glutamyl-Transferase betrug 16,9 U/l. Für Glutamat-
Dehydrogenase wurde im Durchschnitt ein Wert von 3,9 U/l erreicht. Die Nierenwerte
zeigten Ergebnisse von 2,4 mmol/l für Harnstoff und 76,1 Umol/l für Kreatinin. Keiner
der gemessenen Werte für Glutamat-Dehydrogenase, Harnstoff und Kreatinin lag
außerhalb deren Referenzwerten von <8 U/l für Glutamat-Dehydrogenase, <6,7 mmol/l
für Harnstoff und <176 Umol/l für Kreatinin. Ein Wert lag außerhalb des Referenzwertes
der Gamma-Glutamyl-Transferase von 12–25 U/l mit einem Ergebnis von 31 U/l.
Allerdings war der Zeitpukt dieser Plasmaprobe vor der ersten Kinetik, so dass bis
dahin dem Probanden weder Tulathromycin noch Rifampicin verabreicht worden war.
Die anschließenden Gamma-Glutamyl-Transferase Werte dieses Fohlens befanden
sich wieder im Normbereich. Statistisch sind die Unterschiede der Mittelwerte über die
drei Richtwerte nach WILCOXON nicht signifikant (siehe Tab. 12).
Ergebnisse
93
Tab. 12: Ergebnisse der biochemischen Blutparameter bei den Fohlen des
langen Studienprotokolls (n = 12)
nach
einmaliger
Tulathromycin-
applikation
nach
Vorbehandlung
mit Rifampicin
nach
zweiwöchiger
Behandlung
mit
Tulathromycin
und
Rifampicin
Norm-
werte
GGT [U/l] 18,1 16,3 16,4 12-25
GLDH [U/l] 4,3 3,7 3,6 bis 8
Harnstoff [mmol/l 2,0 2,4 2,8 bis 6,7
Kreatinin [Umol/l] 68,3 79,3 80,7 bis 176
4.6 Auftreten von Nebenwirkungen
In der Studie wurden sowohl auf systemische, wie auch lokale Nebenwirkungen von
Tualthromycin geachtet. Das intramuskulär zu injizierende Tulathromycin schien nicht
schmerzhaft während oder nach der Applikation zu wirken. Seltene
Abwehrbewegungen wurden wenn direkt beim Einstechen der Kanüle beobachtet.
Während der anschließenden Injektion wurde keine Schmerzhaftigkeit deutlich.
Bei nur einem Probanden der gesamten Studie konnte klinisch eine unerwünschte
Reaktion auf die Applikation von Tulathromycin festgestellt werden. Dieses Fohlen Nr.
8 begann ca. 40 Minuten nach jeder Wirkstoffverabreichung zu koliken. Beim ersten
Auftreten dieser Symptome erhielt der Patient eine Ampulle Solu-Decortin® H (Wirkstoff
Prednisolon 186,7 mg) und 9 ml Vetalgin® N (Wirkstoff Metamizolum natricum 500 mg)
intravenös. Bei den folgenden Tulathromycininjektionen bekam der Proband weiterhin
9 ml Vetalgin® N. Dieses Fohlen wies zusätzlich nach der ersten Injektion eine lokale
Schwellung an der Einstichstelle auf.
Die Plasmakonzentration von Tulathromycin dieses Fohlens verhielt sich anders, als
bei den restlichen Probanden der Studie. Sie erreichte ihr Maximum von 844 ng nach
20 Minuten. Am achten Tag der ersten Kinetik war im Plasma eine Konzentration von
Ergebnisse
94
34,6 ng nachzuweisen. In der zweiten Kinetik wurde der Maximalwert von 328 ng nach
24 Stunden verzeichnet. Zum ersten Messzeitpunkt nach 20 Minuten lag die
Konzentration bei 285 ng, zum letzten Messzeitpunkt am achten Tag bei 92,5 ng. Die
geringste Konzentration wurde in dieser Kinetik am siebten Tag mit 30,3 ng gemessen.
In der dritten Kinetik betrug die Plasmakonzentration nach 20 Minuten 67,9 ng und am
achten Tag 34,7 ng. Das Maximum lag bei dieser Kinetik bei acht Stunden mit einem
Wert von 259 ng (siehe Abb. 23 und Abb. 24).
Die Einzelwerte sind im Anhang (Tab. 13 bis Tab. 15) tabellarisch aufgeführt.
Ergebnisse
95
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13Zeit in h
Tul
athr
omyc
inko
nzen
trat
ion
in
ng/m
l
1. Kinetik ohne Rifa2. Kinetik mit Rifa3. Kinetik mit Rifa
Abb. 23: Konzentration von Tulathromycin vor und na ch Aufsättigung mit
Rifampicin im Plasma von Fohlen 8
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
0 24 48 72 96 120 144 168 192Zeit in h
Tul
athr
omyc
inko
nzen
trat
ion
in
ng/m
l
1. Kinetik ohne Rifa2. Kinetik mit Rifa3. Kinetik mit Rifa
Abb. 24: Konzentration von Tulathromycin vor und na ch Aufsättigung mit
Rifampicin im Plasma von Fohlen 8
Diskussion
96
5 Diskussion
Ziel der Arbeit war es, durch Messung der Tulathromycinkonzentration im Plasma und
in der bronchoalveolären Lavage Aussagen über die Pharmakokinetik und
Abschätzungen über die beim Fohlen notwendige Dosierung treffen zu können, da
solche Daten bisher nur über Schwein und Rind vorliegen. Zusätzlich sollte eine
Beeinflussung der Pharmakokinetik von Tulathromycin durch eine kombinierte
Verabreichung von Rifampicin untersucht werden. Auch eventuelle Unverträglichkeiten
sollten dokumentiert werden.
5.1 Probanden
Zur Feststellung der pharmakologischen Eigenschaften von Tulathromycin und dessen
eventueller Beeinflussung durch die zusätzliche Gabe von Rifampicin, ist auf die
Vergleichbarkeit der Probanden und der Versuchsbedingungen zu achten. Mit 18
Probanden, von denen bei zwölf Fohlen ein längeres Protokoll durchgeführt wurde, ist
eine aussagekräftige Gruppengröße gewählt worden. Die Tiere wurden auf einem
Betrieb gehalten, auf dem sie im Zeitraum von Anfang Januar bis Ende März 2005
auch geboren worden sind. Alle Probanden wurden mit ihren Mutterstuten in
Laufställen gehalten. Lediglich zur Blutentnahme während der ersten 24 Stunden und
zu den bronchoalveolären Lavagen wurden Stute mit Fohlen in Boxen untergebracht.
Da die Studie von Mitte Februar bis Ende Juni 2005 durchgeführt wurde, konnte die
jahreszeitlich unterschiedliche Witterung keinen störenden Einfluss auf die
gemessenen Tulathromycinkonzentrationen und somit auf die Ergebnisse der Studie
nehmen. In die Studie wurden neun Stut- und neun Hengstfohlen aufgenommen. Es
liegt somit eine gleiche Geschlechterverteilung vor. Das Alter der Fohlen lag zwischen
50 und 70 Tagen, da die Entwicklung der Organsysteme zu diesem Zeitpunkt
ausgereift ist. Somit wurde die Tulathromycinkonzentration in Plasma und
bronchoalveolärer Lavage nicht durch einen unreifen Metabolismus verändert.
Außerdem erkranken häufig Fohlen ab zwei Monaten an dem Erreger Rhodococcus
equi, so dass das gewählte Alter das der Zielgruppe der zu behandelnden Fohlen
entspricht.
Diskussion
97
5.2 Nachweisbarkeit und Pharmakokinetik von Tulathr omycin
5.2.1 Verlauf der Tulathromycinkonzentration nach ei nmaliger Injektion
Nach intramuskulärer Applikation konnte Tulathromycin bei allen Probanden im Plasma
nachgewiesen werden. Als Dosierung wurde 1 ml auf 40 kg Körpergewicht Draxxin®,
das entspricht 2,5 mg/kg Tulathromycin, gewählt. Diese Dosierung wurde auch in der
Literatur von TRAEDER und GROTHUES (2004), sowie GALER et al. (2004) für
Schwein und Rind angegeben.
BENCHAOUI et al. (2004) verabreichten 56 gesunden Schweinen, welche
vorberichtlich noch nicht mit Makroliden behandelt worden waren, einmalig 2,5 mg/kg
Körpergewicht Tulathromycin intramuskulär oder intravenös. Nach Applikation wurden
bis zu sieben Tage nach der Behandlung Blutproben gewonnen. Die Schweine wurden
nach der letzten Blutentnahme getötet und Lungenproben wurden entnommen.
BENCHAOUI et al. (2004) stellten bei intramuskulärer Applikation nach 0,25 Stunden
eine maximale Plasmakonzentration von 116 ng/ml fest. Die Halbwertszeit betrug 75,6
Stunden. 168 Stunden nach der Behandlung betrug die Tulathromycinkonzentration in
der Lunge 1380 ng/g und nach 360 Stunden 778 ng/g.
Die maximale Plasmakonzentration wird beim Fohlen somit 0,42 Stunden später als
beim Schwein erreicht. Der Mittelwert der maximalen Plasmakonzentration ist dafür
beim Fohlen mit 584 ± 302 ng/ml bei gleicher Dosierung von Tulathromycin fünfmal
größer, als die von BENCHAOUI et al. (2004) gemessene Konzentration beim
Schwein. Die errechnete Halbwertszeit beim Fohlen von 129 ± 46 Stunden ist ebenfalls
deutlich höher, als der von BENCHAOUI et al. (2004) angegebene Wert von 75,6
Stunden. Die gemessenen Tulathromycinkonzentrationen in der Lunge sind schwer
miteinander zu vergleichen, da in dieser Studie kein Lungengewebe, sondern lediglich
die rückgewonnene Lavageflüssigkeit analysiert wurde. Der in dieser Studie
gemessene Wert nach 196 Stunden von durchschnittlich 392,8 ng/109 Zellen, mit
einem Maximalwert von 1234,6 ng lässt beim Fohlen auf einen weitaus größeren
Wirkstoffgehalt im gesamten Lungengewebe schließen. Die Konzentration von
Tulahtromycin im Lungengewebe ist somit vergleichbar, wenn nicht noch höher, als der
von BENCHAOUI et al. (2004) gemessene Wert von 1380 ng pro Gramm
Lungengewebe 168 Stunden nach Tulathromycinapplikation. BENCHAOUI et al. (2004)
Diskussion
98
weisen außerdem darauf hin, dass das homogenisierte Lungengewebe ein
Konglomerat aus intra- und extrazellulärer Anreicherung des Medikamentes darstellt.
In einer weiteren Untersuchungsgruppe beim Schwein stellten BENCHAOUI et al.
(2004) nach i.m Applikation eine Plasmakonzentration von 581 ng/ml eine halbe
Stunde nach Behandlung fest. Die Halbwertszeit betrug in dieser Gruppe 91 Stunden.
Im Lungengewebe wurden zwölf Stunden nach i.m. Applikation 2840 ng/g
Tulathromycin festgestellt. Die höchste Konzentration der Lunge betrug 3470 ng/g und
wurde 24 Stunden nach Applikation gemessen. Sechs Tage nach Verabreichung
konnte im Lungengewebe eine Konzentration von 1700 ng/g und nach zehn Tagen von
immer noch >1000 ng/g vorgefunden werden.
Die Plasmakonzentration ist mit dem durchschnittlichen Wert in der vorliegenden
Studie beim Fohlen von 516 ng/ml nach 20 Minuten mit dem Wert von 581 ng/ml eine
halbe Stunde nach Behandlung bei BENCHAOUI et al. (2004) vergleichbar. Die
Halbwertszeit lag beim Fohlen mit 129 ± 46 Stunden höher. Die Lungenkonzentration
beim Schwein weist ähnliche Konzentrationen nach sechs Tagen von 1700 ng/g und
zehn Tagen von immer noch >1000 ng/g, wie die Werte beim Pferd nach acht Tagen
von 158,9 bis 1234,6 ng/109 Zellen auf. Die Tulathromycinkonzentration in einer Probe
des gesamten Lungengewebes dürfte auch hier wesentlich größere Konzentrationen
als die beim Schwein gemessenen Werte ergeben.
Auch GALER et al. (2004) führten eine Studie zu Tulathromycin durch, in der sie neben
20 Schweinen auch 20 Kälber einbezogen. Dabei erhielten die Kälber 2,5 mg/kg
subkutan in die rechte Halsseite. Eine Gruppe bekam eine einmalige Injektion
verabreicht. Die Schweine wurden einmalig intramuskulär gespritzt. Am siebten Tag
wurden die Tiere euthanisiert. Lungenproben von allen Lungenlappen, ca. 500 g vom
Rind und ca. 250 g vom Schwein wurden gesammelt, homogenisiert und eingefroren.
Die maximalen Konzentrationen in Rinder- und Schweineplasma waren in dieser
Studie 1740 und 2440 ng/ml. Die geringsten gemessenen Konzentrationen waren 14,7
ng/ml beim Rind und 2,92 ng/ml beim Schwein. Die Eliminationshalbwertszeit vom
Plasma betrug 44 Stunden beim Schwein und 110 Stunden beim Rind. Die am siebten
Tag gemessenen Konzentrationen von Tulathromycin im Lungengewebe betrugen
beim Rind zwischen 1210 und 6490 ng/g. Beim Schwein kamen Werte zwischen 414
und 2250 ng/g zum Vorschein.
Diskussion
99
In der vorliegenden Studie belief sich die maximale Plasmakonzentration auf 1470
ng/ml. Der niedrigste Wert lag bei 10,7 ng/ml. Der hier gemessene maximale
Plasmawert ist somit um 940 ng/ml niedriger, als der von GALER et al. (2004)
ermittelte Wert nach intramuskulärer Verabreichung beim Schwein. Dagegen ist die
beim Fohlen die errechnete Halbwertszeit fast dreimal größer, als beim Schwein. Die
bei GALER et al. (2004) ermittelten Lungenkonzentrationen sind höher, als in dieser
Studie, da auch hier Lungengewebe vermessen wurde. Beim Schwein wurden Werte
zwischen 414 und 2250 ng/g Lungengewebe ermittelt. In dieser Studie handelt es sich
um 158,9 bis 1234,6 ng/109 Zellen. Die Konzentration im gesamten Lungengewebe
dürfte auch hier weitaus größer sein.
NOWAKOWSKI et al. (2004) führten eine Studie über Tulathromycin an Rindern durch.
Hierbei erhielten von 50 Kälbern 42 das Medikament subkutan verabreicht und von 22
Kälber bekamen 18 den Wirkstoff intravenös appliziert. Die übrigen Tiere galten als
Kontrolltiere. Anschließend wurden die Plasma- und Lungenkonzentrationen von
Tulathromycin bestimmt. Die Dosierung lag bei allen Tieren bei 2,5 mg Tulathromycin
pro kg Körpergewicht. Nach der intravenösen Verabreichung erhielten NOWAKOWSKI
et al. (2004) eine maximale Plasmakonzentration von 2360 ng/ml mit einem Mittelwert
von 2000 ng/ml am Zeitpunkt t0, also direkt nach Applikation. Die Halbwertszeit im
Plasma wird mit drei Tagen angegeben. Die Mittelwerte der Lungenkonzentration
betrugen 2190 ng/g am siebten und 700 ng/g am 15. Tag. Keine gravierenden
Unterschiede wurden zwischen den Geschlechtern festgestellt, allerdings wurden
signifikante Differenzen zwischen subkutaner und intravenöser Verabreichung
bezüglich der Maximalkonzentration festgestellt. Auch NOWAKOWSKI et al. (2004)
stellten somit eine schnelle Absorption, eine hohe Bioverfügbarkeit und eine
verlängerte Halbwertszeit von Tulathromycin fest. Das Verteilungsvolumen nach
intravenöser Verabreichung lag bei 11 l/kg. Die Halbwertszeit betrug acht Tage.
Die Ergebnisse der eigenen Studie sind schwer mit den Ergebnissen von
NOWAKOWSKI et al. (2004) zu vergleichen, da der Wirkstoff intramuskulär und nicht
wie bei NOWAKOWSKI et al. (2004) intravenös oder subkutan verabreicht wurde. Die
Ergebnisse der Gruppe, in der Tulathromycin ohne Phenol subkutan verabreicht wurde,
weist jedoch vergleichbare maximale Plasmakonzentration nach 25 Minuten von 782
ng/ml auf. In der eigenen Studie wurden Maximalwerte im Plasma von 1470 ng/ml nach
20 Minuten mit einem Mittelwert von 516 ng/ml gemessen. Die Halbwertszeit nach
Diskussion
100
intravenöser Applikation des Wirkstoffes von acht Tagen (192 Stunden) ist mit der am
Fohlen nach intramuskulärer Injektion festgestellten Zeit von 129 ± 46 Stunden
vergleichbar. Auch in dieser Studie konnte eine schnelle Absorption, eine hohe
Bioverfügbarkeit und eine verlängerte Halbwertszeit von Tulathromycin festgestellt
werden.
Die analytische Bestimmung von Tulathromycin wurde nach dem gleichen Protokoll
durchgeführt, dass auch BENCHAOUI et al. (2004), GALER et al. (2004) und
NOWAKOWSKI et al. (2004) verwendet haben. Der einzige Unterschied bestand darin,
dass in dieser Studie auf eine Trennsäule für die chromatographische Bestimmung von
Tulathromycin und Roxithromycin verzichtet wurde, da keine der getesteten Säulen
reproduzierbare Ergebnisse lieferte und sie für eine chromatographische Trennung von
Tulathromycin und Roxithromycin bei Detektion mittels MS/MS nicht zwingend
notwendig ist.
5.2.2 Verlauf der Tulathromycinkonzentration nach Vo rbehandlung mit
Rifampicin
Nachdem die erste Kinetik am achten Tag nach Tulathromycinapplikation
abgeschlossen war, wurden die Fohlen sechs Tage zweimal täglich mit Rifampicin
behandelt. Darauf folgte die zweite Kinetik, während der die Probanden zusätzlich, zum
einmalig am Zeitpunkt t0 verabreichten Tulathromycin, Rifampicin erhielten.
In der Praxis erfolgt die Kombinationstherapie von Rifampicin, da bei Monotherapien
die Gefahr einer Resistenzentwicklung besteht. Da die Konzentrationen des
Antibiotikums in Lunge, Leber, Galle und Urin höher, als im Blut sind (FURESZ, 1970)
und Rifampicin intrazelluläre Keime abtöten und in septische Herde, Abszesse und
Phagozyten eindringen kann (MANDELL, 1973, 1983; PROKESCH u. HAND, 1982),
wird Rifampicin in der Humanmedizin zur Behandlung der Tuberkulose und beim Pferd
zur Therapie der Rhodokokken-Pneumonie eingesetzt (FARR u. MANDELL, 1982).
In dieser Studie war von Interesse, ob bei Vorbehandlung und Einsatz von Rifampicin
eine Veränderung der gemessenen Plasma- und bronchoalveolären
Lavageflüssigkeitskonzentrationen von Tulathromycin eintritt, da Rifampicin ein
Enzyminduktor ist. Daher kann die Therapie mit einem Kombinationspartner versagen
(SIEGMUND u. WEITSCHIES, 2002), da dessen Elimination beschleunigt wird. Ein
hiervon besonders betroffenes Enzym ist das P-Glykoprotein. Dieses Protein ist an der
Diskussion
101
luminalen Seite von Endothel- und Epithelzellen lokalisiert und transportiert Stoffe aus
dem Zytoplasma aktiv zurück ins Lumen. P-Glykoprotein ist funktioneller Bestandteil
der Bluthirnschranke und der Plazentabarriere und behindert den Übertritt von
Wirkstoffen ins Gehirn oder den fetalen Kreislauf (SIEGMUND et al., 2003a). Das
Protein wird des Weiteren in den Enterozyten des Dünn- und Dickdarmes angetroffen.
Auf diese Weise kann die orale Absorption von Arzneimitteln behindert werden. Das
Antibiotikum Rifampicin verstärkt diese Effekte, Makrolide hingegen haben eine
hemmende Wirkung auf diese Enzyme (SIEGMUND et al., 2003a; SIEGMUND, et al.,
2003b). Besonders Erythromycin und Clarithromycin weisen stark hemmenden
Eigenschaften auf (SIEGMUND et al., 2003a).
Vergleicht man nun die Ergebnisse der ersten und zweiten Kinetik miteinander, so
bleiben die erwarteten niedrigeren Konzentrationen von Tulathromycin in den Proben,
durch die vermeindliche Enzyminduktion durch Rifampicin und die dadurch bedingte
schnellere Elimination des Medikamentes, aus. Die Konzentrationen nach einmaliger
Tulathromycingabe der ersten bronchoalveolären Lavageflüssigkeit sind sogar
signifikant niedriger, als die Werte der zweiten Lavage, sowie die Ergebnisse des
zweiten, mit zusätzlicher Gabe von Rifampicin und nach Vorbehandlung mit Rifampicin,
und dritten , mit zusätzlicher Gabe von Rifampicin und nach zweiwöchiger Behandlung
mit Tulathromycin und Rifampicin, Protokolls. Ein Grund hierfür könnte sein, dass die
Vorbehandlung mit Rifampicin über einen längeren Zeitraum hätte erfolgen müssen,
um eine optimale Enzyminduktion zu gewährleisten. Ein weiterer Erklärungsversuch für
dieses Ergebnis ist, dass Rifampicin zwar eine aktivierende Wirkung auf
Enzymsysteme hat, Makrolide hingegen haben eine hemmende Wirkung auf diese
Enzyme (SIEGMUND et al., 2003a; SIEGMUND et al., 2003b). Möglicherweise ist aus
diesem Grund der erwartete Effekt kompensiert worden. In der Literatur ist auch eine
geringe Affinität von Tulathromycin zur bakteriellen Effluxpumpe beschrieben, wodurch
sich das Medikament stark in den Bakterien anreichern kann (TRAEDER u.
GROTHUES, 2004). Man könnte daher eventuell auf ein ebensolches Verhalten in
somatischen Zellen schließen. Auf diese Weise würde selbst eine gesteigerte
Enzymaktivität die Konzentration des Wirkstoffes nicht beeinflussen. Des Weiteren ist
eine Enzyminduktion durch Rifampicin beim Pferd bisher noch nicht beschrieben, so
dass als Begründung für das eingetretene Resultat Speziesunterschiede verantwortlich
gemacht werden könnten.
Diskussion
102
5.2.3 Verlauf der Tulathromycinkonzentration nach zwe iwöchiger
Behandlung mit Tulathromycin und Rifampicin
Nach der zweiten Kinetik wurden zwölf Fohlen für zwei Wochen mit Tulathromycin und
Rifampicin behandelt. Im Anschluß wurde die dritte Kinetik durchgeführt. Elf Probanden
wurden berücksichtigt, da ein Fohlen (Nr.8) klinisch abnorm reagierte und dessen
Werte als Außreißer im Vergleich zu den restlichen Probanden galten.
Vergleicht man nun die Ergebnisse der ersten und zweiten Kinetik mit den Werten der
dritten Kinetik, so fällt auf, dass in dieser letzten Versuchsreihe in der
bronchoalveolären Lavage höhere Konzentrationen von Tulathromycin erreicht werden.
Die Konzentration in der Lavageflüssigkeit ist sogar signifikant höher, als bei der ersten
und zweiten Kinetik. Die maximale Plasmakonzentration ist signifikant niedriger als zu
dem Wert ohne Rifampicin. Die AUC der dritten Kinetik ist signifikant höher, als die
AUC der ersten und zweiten Kinetik. Vergleicht man nun die AUC der ersten und
zweiten Kinetik von 20000 ± 4268 und 20039 ± 3796 ng x h/ml, erhält man einen
ähnlichen Wert wie die AUC0-t von 19716 ± 4186 ng x h/ml der dritten Kinetik. Dieses
Ergebnis spricht dafür, dass sich das Tulathromycin während der dritten Kinetik im
sogenannten steady state befindet. Der Wirkstoff ist somit nach vier Injektionen, die
jeweils nur einmal pro Woche verabreicht wurden, akkumuliert und befindet sich im
Gleichgewicht. Das Verteilungsvolumen ist signifikant höher als in der ersten Kinetik.
5.3 Akzeptanz und Nebenwirkungen der verabreichten Ar zneimittel
Fast alle Probanden nahmen nach einer kurzen Eingewöhnungsphase das zweimal
täglich oral zu verabreichende Rifampicin freiwillig. Dabei wurden die Tabletten ohne
Zusatz von Zucker oder anderen Geschmacksstoffen in der für die Applikation
vorgesehenen Spritze aufgelöst.
Das intramuskulär zu injizierende Tulathromycin schien nicht schmerzhaft während
oder nach der Applikation zu wirken. Seltene Abwehrbewegungen wurden wenn direkt
beim Einstechen der Kanüle beobachtet. Während der anschließenden Injektion wurde
keine Schmerzhaftigkeit deutlich.
Tulathromycin schien klinisch weder in Monotherapie, noch in Kombination mit
Rifampicin Nebenwirkungen zu verursachen. Lediglich eins der 18 Fohlen begann 40
Minuten nach jeder Tulathromycininjektion mit Koliksymptomen zu reagieren. Diese
Diskussion
103
Erscheinung war schnell und nachhaltig mit einer intravenösen Verabreichung von
Vetalgin® N (Wirkstoff Metamizolum natricum 500 mg) zu beheben. Es muß daher nach
Tulathromycininjektion mit vereinzelten individuellen Unverträglichkeiten gerechnet
werden.
Im Labor wurde bei den zwölf Probanden der langen Studie für alle drei Kinetiken zum
Zeitpunkt t0 Parameter zur Bestimmung der Leber- und Nierenfunktion mittels Naß- und
Trockenchemie untersucht. Als für diese Organe aussagekräftige Werte wurden für die
Leber Gamma-Glutamyl-Transferase (GGT) und Glutamat-Dehydrogenase (GLDH)
und für die Niere Harnstoff und Kreatinin bestimmt.
Da für keinen der gemessenen Blutparameter Abweichungen von den Normwerten
festgestellt werden konnte, sind durch die Medikamente Tulathromycin und Rifampicin
keine Veränderungen in den Funktionen von Leber und Niere aufgetreten. Ein Wert lag
außerhalb des Referenzwertes der Gamma-Glutamyl-Transferase von 12–25 U/l mit
einem Ergebnis von 31 U/l. Allerdings war der Zeitpukt dieser Plasmaprobe vor der
ersten Kinetik, so dass bis dahin dem Probanden weder Tulathromycin noch Rifampicin
verabreicht worden war. Die anschließenden Gamma-Glutamyl-Transferase Werte
dieses Fohlens befanden sich wieder im Normbereich.
5.4 Beeinträchtigung der Fohlen durch die bronchoal veoläre Lavage
Die Gesamtzellzahl in der rückgewonnenen Lavageflüssigkeit nimmt von der ersten bis
hin zur letzten Lavage zu. Der letzte Wert ist im Mittel um 12,3 G/l höher, als der in der
ersten Probe bestimmte Zellwert. Betrachtet man nun aber die einzelnen Zellfraktionen
so fällt auf, dass die prozentuale Verteilung aller ausgezählten Zellfraktionen relativ
konstant bleibt. Es ist somit kein Entzündungsreiz durch die durchgeführten Lavagen
gesetzt worden, da nicht die neutrophilen Granulozyten den Anstieg der
Gesamtzellzahl ausmachen. Auch in der bei allen Fohlen durchgeführten Zwischen-
und Abschlussuntersuchungen mit Lungenultraschall konnten keine pathologischen
Veränderungen festgestellt werden.
Diskussion
104
5.5 Mögliche Aussagen zur Dosierung von Tulathromyci n beim
Fohlen
Vergleicht man die Ergebnisse, der schon publizierten Veröffentlichungen über
Tulathromycin mit den Resultaten der vorgelegten Studie, lässt sich beim Fohlen eine
vergleichbare, wenn nicht höhere Plasmakonzentration nach intramuskulärer
Tulathromycinapplikation als beim Schwein feststellen. Die Halbwertszeit lag weit über
den bisher publizierten Werten. Die Konzentration in der Lunge ist schwer mit den
angegebenen Werten zu vergleichen, da hier eine bronchoalveoläre Lavage
vermessen wurde und beim Schwein das gesamte Lungengewebe zur Verfügung
stand. In Anbetracht dieser Tatsache erscheint die gemessene Konzentration in den
Zellen sehr hoch. Im Lungengewebe des Fohlens dürfte somit eine höhere
Anreicherung von Tulathromycin als beim Schwein stattfinden. Ein weiteres Indiz dafür,
dass sich das Medikament beim Pferd stark intrazellulär anreichert, zeigen die
gemessenen Konzentrationen in den Überständen der bronchoalveolären Lavage.
Diese weisen nach 24 Stunden bei jeder Kinetik wesentlich höhere Werte, als am
achten Tag auf. Das läßt darauf schließen, dass das Medikament vom Extra- in den
Intrazellulärraum diffundiert.
In einer Studie von KERTH (2005) wurden 70 Warmblutfohlen, bei denen
ultrasonographisch Lungenabszesse festgestellt wurden, vergleichend mit
Tulathromycin und Rifampicin, sowie Azithromycin in Kombination mit Rifampicin,
behandelt. 37 Fohlen erhielten Draxxin® in einer Dosierung von 1 ml pro 40 kg alle
sieben Tage intramuskulär. Die Mindestbehandlungsdauer war auf vier Wochen
festgelegt. In dieser Studie zeigte sich Tulathromycin als klinisch wirksam zur
Behandlung der Rhodokokken-Pneumonie beim Fohlen.
TRAEDER und GROTHUES (2004) beschreiben, dass Tulathromycin in Leukozyten
und Makrophagen kumuliert. Dies führt zu einer Erhöhung der Wirkstoffkonzentration
am Infektionsort, da diese Zellen verstärkt zum entzündeten Gewebe wandern. Eine
weitere Anreicherung findet gegenüber Lungenhomogenat gesunder Tiere statt. Hier
wird von einer 4,1 – 4,8fachen Tulathromycinkonzentration im erkrankten Gewebe
berichtet. Dies lässt eine stärkere in vivo Aktivität erwarten, als die in vitro ermittelte
MHK-Werte zugrunde legen. Ein weiterer Effekt hierfür ist die geringe Affinität zur
bakteriellen Effluxpumpe. Auf diese Weise kann Tulathromycin in der Bakterienzelle
Diskussion
105
kumulieren und einen therapeutischen Spiegel, der mehr als das 4fache des MHK 90
Wertes des Erregers betragen kann, erreichen (TRAEDER u. GROTHUES, 2004).
Tulathromycin überschreitet aufgrund seiner verlängerten Halbwertszeit und starken
Anreicherung im Gewebe nach einmaliger Applikation lange Zeit den MHK-Wert der
relevanten Lungenpathogene bei Rind und Schwein (NOWAKOWSKI et al., 2004). Der
therapeutische Wirkspiegel beträgt je nach Sensibilität des Erregers zwischen fünf
(Pasteurella multocida beim Schwein) und 15 Tagen (Pasteurella multocida beim Rind
und Moraxella hyopneumoniae beim Schwein) (TRAEDER u. GROTHUES, 2004).
Leider ist bisher die minimale Hemmstoffkonzentration für Rhodococcus equi von
Tulathromycin nicht bekannt. Es wird jedoch eine ähnliche, wenn nicht gleiche
Hemmstoffkonzentration wie bei anderen Vertretern der Makrolide für dieses Bakterium
angenommen. Der MHK-Wert für Rhodococcus equi von Erythromycin wird mit <0,25
µg/ml angegeben (PRESCOTT, 1981). Azithromycin weist laut JACKS et al. (2001)
eine MHK von 1 µg/ml auf. Eine MHK 90 von 0,12 µg/ml gegen Rhodococcus equi,
wurde für Clarithromycin postuliert (JACKS et al., 2002).
Nimmt man die minimalen Hemmstoffkonzentrationen der Makrolide für Rhodococcus
equi von 0,12-1 µg/ml als Vorlage, so ist dieser sowohl 24 Stunden nach
Tulathromycinapplikation, als auch am achten Tag nach Verabreichung des
Medikamentes alleine in den 109 Zellen mit Konzentrationen von durchschnittlich
0,2462 und 0,392 µg erreicht. Die Konzentration im erkrankten Lungengewebe würde
noch beträchtlich größer sein. In der dritten Kinetik, in der sich das Medikament im
steady state befand, wurden sogar im Mittel Werte von 0,981 µg nach 24 Stunden und
0,7238 µg am achten Tag in einer Milliarde Zellen gemessen.
Die Ergebnisse der bisher publizierten Studien und die klinische Wirksamkeit von
Tulathromycin lassen demnach darauf schließen, dass 2,5 mg/kg dieses Wirkstoffes
oder 1 ml pro 40 kg Körpergewicht Draxxin® einmal wöchentlich verabreicht, für die
Behandlung der Rhodokokken-Pneumonie des Fohlens ausreichend sind. Die gute
Verträglichkeit des Medikamentes stellt neben der geringen Manipulation der Tiere
einen weiteren positiven Effekt für den Einsatz von Tulathromycin beim Fohlen dar.
5.6 Schlussfolgerungen
Die Ergebnisse der vorliegenden Studie lassen darauf schließen, dass die von
TRAEDER u. GROTHUES (2004) angegebene Dosierung für Rind und Schwein von
Diskussion
106
einmal wöchentlich 2,5 mg/kg Tulathromycin intramuskulär auch zur Therapie von
Lungenerkrankungen beim Fohlen ausreichend ist.
Genauere Daten zur minimalen Hemmstoffkonzentration von Rhodococcus equi
gegenüber diesem Wirkstoff könnten die Abschätzung, ob genügend Medikament im
Lungengewebe vorhanden ist, vereinfachen.
Die Verträglichkeit der Medikamente war hoch. Es wurden keine Abwehrbewegungen
während der intramuskulären Injektion von Tulathromycin bei den Fohlen beobachtet.
Das oral zu verabreichende Rifampicin wurde von den meisten Fohlen freiwillig
genommen. Weitere Untersuchungen bezüglich der in dieser Studie festgestellten
guten lokalen wie auch systemischen Verträglichkeit sollten in Anbetracht des
Probanden, der auf Tulathromycin zu koliken begann, noch weiter untersucht werden.
Ob Rifampicin tatsächlich wie in dieser Studie festgestellt, die Pharmakokinetik von
Tulathromycin unbeeinflusst lässt, sollte ebenfalls in weiteren Studien untersucht
werden. Insbesondere sollte hier eine längere Vorbehandlung der Fohlen mit
Rifampicin vor dem Einsatz von Tulathromycin erfolgen.
Zusammenfassung
107
6 Zusammenfassung
Nina Höhensteiger: Nachweis der Konzentration von Tulathromycin im Plasma und in
der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit beim Fohlen mittels
Hochdruckflüssigkeitschromatographie mit zweifacher Massen-
spektroskopie nach i.m. Applikation, mit und ohne Kombination von
Rifampicin
Ziel der vorgelegten Untersuchung war die Bestimmung der Konzentration von
Tulathromycin im Plasma und in der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit beim acht
Wochen alten Fohlen und damit mögliche Aussagen über die Pharmakokinetik,
Dosierung und Applikationshäufigkeit treffen zu können. Dies erfolgte nach einmaliger
i.m. Applikation des Wirkstoffes und Nachweis der Konzentration im Plasma und in der
bronchoalveolären Lavageflüssigkeit mittels HPLC/MS/MS. Zusätzlich sollte eine
Beeinflussung der Pharmakokinetik von Tulathromycin durch eine kombinierte
Verabreichung von Rifampicin untersucht werden.
Die Untersuchungen wurden an 18 Fohlen auf einem privaten Gestüt in
Norddeutschland durchgeführt.
Alle Fohlen bekamen in dem ersten Protokoll einmalig Tulathromycin (2,5 mg/kg KM)
intramuskulär verabreicht. Anschließend wurden in den ersten zwölf Stunden in zu
Beginn 20 Minuten- dann über ein, zwei bis vier Stundenabständen und ab dem
zweiten Tag einmal täglich bis zum achten Tag Blutproben entnommen. Nach 24
Stunden und am achten Tag wurde eine bronchoalveoläre Lavage durchgeführt.
Anschließend wurden die Fohlen sechs Tage nur mit Rifampicin (10 mg/kg KM per os,
zweimal täglich) behandelt. Die zweite Kinetik wurde nach dem gleichen
Beprobungsschema wie beim ersten Protokoll durchgeführt. Der Unterschied bestand
darin, dass die Fohlen sechs Tage mit Rifampicin vorbehandelt waren und auch
während dieser Studie mit dem Medikament behandelt wurden. Tulathromycin wurde
wieder nur zu Beginn des Protokolls einmal verabreicht. Bei zwölf Pferden wurde
anschließend eine zweiwöchige Behandlung mit einmal pro Woche Tulathromycin (2,5
mg/kg KM) intramuskulär und zweimal täglich Rifampicin (10 mg/kg KM) per os
durchgeführt. Daraufhin wurde bei diesen Probanden die dritte Kinetik ermittelt. Die
Zusammenfassung
108
Analytik der Proben wurde im Institut für klinische Pharmakologie der Ernst-Moritz-
Arndt Universität in Greifswald mittels HPLC/MS/MS durchgeführt.
Die maximalen Plasmakonzentrationen waren in der ersten Kinetik mit 584 ± 304 ng/ml
nach 0,67 Stunden erreicht. In der zweiten Kinetik wurden die höchsten Werte von 557
± 389 ng/ml nach 0,33 Stunden erreicht. Die Werte der dritten Kinetik waren 567 ± 299
ng/ml nach 0,33 Stunden. Die Konzentrationen der bronchoalveolären Lavage der
ersten Kinetik lag nach 24 Stunden bei 246,2 ± 97,9 ng/109 Zellen und bei 37,1 ± 19
ng/ml im Überstand. Am achten Tag lagen die Werte bei 392,8 ± 250,5 ng in den Zellen
und bei 12,4 ± 7,7 ng/ml in dem Überstand. In der zweiten Kinetik erreichte die
Wirkstoffkonzentration in den Zellen 349,9 ± 124,9 ng nach 24 Stunden und 335 ±
135,6 ng am achten Tag. Im Überstand waren Werte von 27 ± 10,5 ng/ml nach 24
Stunden und 10,3 ± 5,5 ng/ml nach acht Tagen zu messen. In den Zellen wurden die
höchsten Konzentrationen in der dritten Kinetik von 981 ± 425,8 ng zum Zeitpunkt der
ersten bronchoalveolären Lavage und 723,8 ± 259,9 ng bei der zweiten Beprobung
festgestellt. Die Werte der dazugehörigen Überstände lagen bei 37,7 ± 17,8 und 11,6 ±
5,2 ng/ml.
Die im Pferdeplasma gemessenen Konzentrationen waren mit den fürs Schwein
publizierten Werten von BENCHAOUI et al. (2004) und GALER et al. (2004)
vergleichbar. Die Konzentrationen im Lungengewebe waren schwer miteinander zu
vergleichen, da in dieser Studie nur die Rückspülflüssigkeit der bronchoalveolären
Lavage zur Verfügung stand. Die darin gemessenen Konzentrationen waren jedoch so
hoch, dass von höheren Werten im Lungengewebe beim Pferd, als beim Schwein
ausgegangen werden kann. Die Halbwertszeit lag mit 129 bis 173 Stunden weit über
den für das Schwein ermittelten Werten.
Die Ergebnisse der vorliegenden Studie lassen darauf schließen, dass die von
TRAEDER u. GROTHUES (2004) angegebene Dosierung von Tulathromycin für Rind
und Schwein von 2,5 mg/kg einmal wöchentlich intramuskulär auch zur Therapie von
Lungenerkrankungen beim Fohlen ausreichend ist. In dieser Studie war kein Einfluss
von Rifampicin auf die Konzentration von Tulathromycin zu erkennen. Das Draxxin®
wurde lokal wie systemisch gut vertragen. Lediglich ein Fohlen bekam eine kurzfristige
lokale Schwellung an der Injektionsstelle und begann etwa 40 Minuten nach jeder
Tulathromycinapplikation zu koliken. Diese Symptomatik war mit einer einmaligen
Injektion von Metamizol-Na+ gut in den Griff zu bekommen.
Summary
109
7 Summary
Nina Höhensteiger: Determination of tulathromycin levels in plasma and
bronchoalveolar lavage fluid from foals by means of high-pressure
liquid chromatography tandem quadrupole mass spectrometry after
an intramuscular injection of tulathromycin followed by and/or in
combination with rifampicin
The objective of this study was to determine the concentration of tulathromycin in the
plasma and bronchoalveolar lavage fluids from eight-week-old foals in order to make
predictions about the pharmacokinetics, dosage and frequency of application of that
substance. After a single intramuscular injection, the concentration of tulathromycin
was determined in plasma and in bronchoalveolar lavage fluid by means of
HPLC/MS/MS. Another aim was to determine whether application of the drug in
combination with rifampicin would affect the pharmacokinetics of tulathromycin.
These studies were conducted on 18 foals at a private stud in northern Germany.
In the first trial, all foals were given a single intramuscular injection of tulathromycin (2.5
mg/kg BW). In the first twelve hours after injection, blood samples were taken every 20
min, then every two to four hours, and from day 2 until day 8, once daily. A
bronchoalveolar lavage was conducted after 24 h and on day 8. Then the foals were
treated only with rifampicin (10 mg/kg BW, twice daily orally). The second trial was
conducted after sampling as in the first trial with the difference that the foals had been
pretreated for six days with rifampicin and also continued to receive this drug during the
trial. Again, tulathromycin was administered only once at the beginning of the trial. In
the third trial, twelve horses were treated for two weeks with both tulathromycin (2.5
mg/kg BW, injected intramuscularly once a week) and rifampicin (10 mg/kg BW, orally,
twice daily), and samples were taken as before. All samples were analysed by
HPLC/MS/MS conducted at the Department of Clinical Pharmacology of the Ernst-
Moritz-Arndt University of Greifswald, Germany.
Maximum plasma concentrations of 584 ± 304 ng/ml were found after 0.67 h in the first
trial. In the second, the maximums of 557 ± 389 ng/ml were reached after 0.33 h, and in
the third, 567 ± 299 ng/ml, also after 0.33 h. The following changes were determined in
the concentrations in the fluid from bronchoalveolar lavage conducted for the three
Summary
110
trials at 24 h and on day 8: In the first trial, the concentrations were 246.2 ± 97.9 ng/109
cells and 37.1 ± 19 ng/ml supernatant after 24 h; on day 8, 392.8 ± 250.5 ng/109 cells,
and 12.4 ± 7.7 ng/ml supernatant. In the second trial, cell concentrations were 349.9 ±
124.9 ng after 24 h and 335 ± 135.6 ng on day 8. Concentrations in the supernatant
were 27 ± 10,5 ng/ml after 24 h and 10.3 ± 5.5 ng/ml on day 8. The highest
concentrations in lavage fluid were found in the third trial: 981 ± 425.8 and 723.8 ±
259.9 on day 8; the corresponding concentrations in the supernatant were 37.7 ± 17.8
(24 h) and 11.6 ± 5.2 ng/ml (day 8).
The plasma concentrations determined for horses are comparable to those published
for swine by BENCHAOUI et al. (2004) und GALER et al. (2004). However, it is difficult
to compare the concentrations in bronchoalveolar fluid, as only lavage fluid was
available in the present study. The concentrations were so high in the fluid that it must
be assumed that levels in lung tissue were higher in the horse than in swine.
Furthermore, the half-life of between 129 and 173 h was much higher than that
reported for swine.
The results of the present study indicate that a weekly dosage of 2.5 mg/kg
tulathromycin injected intramuscularly as recommended for cattle and swine by
TRAEDER and GROTHUES (2004) is also sufficient for the treatment of lung diseases
in foals. The results of this study did not show any influence of rifampicin on the
concentration of tulathromycin. Draxxin® was tolerated well both locally and
systemically. There was temporary local swelling at the site of injection in one foal,
which began to show signs of colic about 40 min after each application of
tulathromycin. These symptoms were successfully treated with a single injection of
metamizol sodium.
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Anhang
123
9 Anhang
Tab. 13: Plasmakonzentration von Tulathromycin (2,5 mg/kg KM) beim Fohlen nach einmaliger i.m. Gabe
Fohlen Nr. 0 h 0,33 h 0,67 h 1 h 2 h 4 h 6 h 8 h 12 h 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h 144 h 168 h 192 h
1 13,9 97,1 225,0 220,0 164,0 191,0 240,0 227,0 172,0 168,0 71,5 51,8 42,0 41,1 26,9 26,4 24,2
2 7,7 764,0 531,0 551,0 398,0 304,0 227,0 206,0 230,0 145,0 84,1 64,7 59,7 44,8 40,0 42,7 29,1
3 6,8 490,0 457,0 388,0 352,0 282,0 229,0 226,0 170,0 161,0 115,0 79,5 53,8 59,9 42,3 40,1 38,8
4 17,1 268,0 272,0 235,0 236,0 306,0 252,0 312,0 275,0 205,0 96,4 113,0 64,6 58,5 44,5 36,3 37,9
5 8,8 298,0 318,0 268,0 286,0 182,0 253,0 206,0 191,0 236,0 97,3 81,9 46,9 42,1 33,4 28,8 24,9
6 7,7 130,0 204,0 231,0 243,0 253,0 268,0 336,0 281,0 237,0 120,0 57,7 68,6 49,3 45,5 34,6 38,8
7 3,6 519,0 517,0 691,0 234,0 232,0 223,0 195,0 191,0 66,9 70,2 45,1 39,7 30,2 29,1 25,5 21,7
9 11,9 595,0 471,0 408,0 288,0 123,0 69,3 203,0 110,0 53,8 91,0 24,9 30,4 31,8 19,7 25,6 19,2
10 13,6 598,0 686,0 571,0 464,0 394,0 200,0 189,0 177,0 130,0 89,4 73,7 46,9 49,6 31,2 35,0 86,2
11 4,4 757,0 565,0 408,0 422,0 257,0 257,0 292,0 92,5 81,6 58,6 64,3 55,5 49,5 33,0 26,4 26,7
12 5,1 472,0 543,0 547,0 475,0 387,0 267,0 204,0 212,0 134,0 92,0 66,2 62,6 58,4 46,6 39,9 37,2
13 2,3 461,0 758,0 652,0 532,0 318,0 225,0 235,0 201,0 163,0 90,4 43,9 39,1 62,4 169,0 36,3 26,9
14 23,2 1470,0 1190,0 1120,0 527,0 329,0 234,0 196,0 148,0 94,1 82,9 62,4 51,4 38,5 38,5 32,3 30,1
15 5,6 814,0 569,0 489,0 342,0 332,0 257,0 267,0 205,0 174,0 129,0 77,9 51,6 47,3 49,6 39,4 35,3
16 7,3 215,0 204,0 181,0 177,0 147,0 143,0 103,0 143,0 81,3 50,4 33,8 27,0 21,0 21,7 17,8 65,7
17 28,0 293,0 316,0 402,0 321,0 250,0 228,0 201,0 162,0 124,0 64,6 47,3 37,7 32,2 28,2 25,6 32,0
18 3,6 531,0 417,0 530,0 420,0 299,0 233,0 177,0 138,0 140,0 222,0 42,3 39,3 34,8 10,7 26,2 28,9
MW 10,0 516,0 484,9 464,2 345,9 269,8 223,8 222,1 182,3 140,9 95,6 60,6 48,0 44,2 41,8 31,7 35,5
SD 7,2 327,0 245,6 230,3 116,3 77,1 49,5 55,1 50,7 54,7 38,8 21,2 11,9 11,8 34,4 7,0 16,7
RSD [%] 71,5 63,4 50,6 49,6 33,6 28,6 22,1 24,8 27,8 38,8 40,6 35,0 24,9 26,8 82,5 22,0 47,2
8 18,4 844,0 737,0 489,0 395,0 285,0 252,0 207,0 192,0 115,0 91,5 63,9 51,4 41,9 40,4 35,7 34,6
Anhang
124
Tab. 14: Plasmakonzentration von Tulathromycin (2,5 mg/kg KM) beim Fohlen nach einmaliger i.m. Gabe und zusätzlicher
Gabe von Rifampicin (10 mg/kg KM p.o., zweimal tägli ch) nach Vorbehandlung mit Rifampicin (6 Tage)
Fohlen Nr. 0 h 0,33 h 0,67 h 1 h 2 h 4 h 6 h 8 h 12 h 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h 144 h 168 h 192 h
1 14,4 282,0 246,0 258,0 186,0 208,0 212,0 221,0 225,0 149,0 75,9 61,8 43,4 44,2 32,0 28,6 23,3
2 18,6 635,0 631,0 612,0 460,0 307,0 276,0 225,0 169,0 205,0 84,4 61,3 59,1 52,7 49,4 36,4 42,0
3 18,9 171,0 151,0 170,0 170,0 189,0 206,0 158,0 128,0 128,0 73,4 53,0 32,4 38,8 33,6 35,0 27,4
4 18,6 702,0 584,0 523,0 473,0 507,0 309,0 241,0 224,0 126,0 111,0 84,2 59,7 54,5 53,0 42,1 33,9
5 13,1 461,0 377,0 308,0 263,0 296,0 187,0 204,0 201,0 136,0 79,8 75,0 51,0 48,0 45,2 28,7 34,2
6 17,4 848,0 676,0 768,0 641,0 336,0 228,0 292,0 295,0 162,0 112,0 71,2 40,6 41,7 44,3 37,7 29,6
7 12,8 428,0 467,0 316,0 241,0 256,0 236,0 219,0 193,0 142,0 85,9 53,5 50,3 39,1 36,6 32,4 31,5
9 13,2 487,0 632,0 365,0 396,0 326,0 179,0 134,0 143,0 90,6 53,5 43,9 35,4 38,7 38,5 39,8 24,3
10 15,7 220,0 228,0 348,0 238,0 214,0 194,0 126,0 152,0 143,0 79,5 114,0 55,5 53,4 45,4 48,6 34,8
11 12,4 615,0 510,0 307,0 311,0 215,0 147,0 201,0 169,0 128,0 70,9 55,8 115,0 27,0 21,7 27,5 24,5
12 14,9 611,0 398,0 465,0 323,0 283,0 258,0 175,0 196,0 127,0 70,5 54,2 49,7 39,6 41,6 31,8 35,0
13 14,6 157,0 430,0 219,0 297,0 170,0 177,0 150,0 151,0 76,7 102,0 65,2 45,9 42,9 38,6 31,2 23,7
14 13,9 1900,0 1190,0 877,0 523,0 282,0 196,0 188,0 154,0 96,3 76,1 60,2 54,9 61,4 46,1 40,1 30,7
15 14,7 413,0 348,0 288,0 247,0 220,0 196,0 203,0 252,0 172,0 96,4 76,9 67,1 52,0 61,0 34,8 36,9
16 9,6 238,0 258,0 213,0 189,0 216,0 134,0 113,0 93,8 191,0 46,8 38,3 30,8 26,9 21,7 18,4 15,9
17 11,8 243,0 218,0 274,0 242,0 245,0 203,0 189,0 183,0 113,0 73,3 68,7 51,2 42,0 35,2 25,0 22,3
18 11,4 322,0 349,0 309,0 386,0 253,0 202,0 170,0 139,0 95,4 79,6 73,9 47,7 36,5 28,2 38,0 30,1
MW 14,5 513,7 452,5 389,4 328,6 266,1 208,2 188,8 180,5 134,2 80,6 65,4 52,3 43,5 39,5 33,9 29,4
SD 2,7 410,4 248,3 198,6 132,8 78,6 43,7 45,4 49,4 35,0 17,5 17,4 18,9 9,4 10,5 7,2 6,5
RSD [%] 18,6 79,9 54,9 51,0 40,4 29,5 21,0 24,0 27,3 26,1 21,7 26,6 36,1 21,5 26,5 21,2 22,2
8 274,0 285,0 216,0 233,0 214,0 253,0 236,0 206,0 145,0 328,0 55,2 52,2 44,0 45,0 35,0 30,3 92,5
Anhang
125
Tab. 15: Plasmakonzentration von Tulathromycin (2,5 mg/kg KM) beim Fohlen nach einmaliger i.m. Gabe und zusätzlicher
Gabe von Rifampicin (10 mg/kg KM p.o., zweimal tägli ch) nach zweiwöchiger Behandlung mit Tulathromycin u nd
Rifampicin
Fohlen Nr. 0 h 0,33 h 0,67 h 1 h 2 h 4 h 6 h 8 h 12 h 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h 144 h 168 h 192 h
7 36,6 627,0 478,0 412,0 356,0 306,0 254,0 224,0 188,0 147,0 106,0 71,4 65,2 66,5 50,6 46,1 39,9
9 62,8 671,0 546,0 401,0 406,0 318,0 262,0 240,0 199,0 137,0 104,0 76,4 63,2 52,3 42,9 44,3 39,0
10 43,3 488,0 383,0 462,0 403,0 315,0 324,0 322,0 253,0 171,0 135,0 101,0 97,7 68,7 53,3 56,8 39,0
11 50,0 252,0 219,0 254,0 205,0 207,0 237,0 228,0 288,0 260,0 138,0 84,9 110,0 70,5 65,0 54,0 48,5
12 62,6 450,0 454,0 462,0 384,0 373,0 361,0 326,0 387,0 230,0 99,9 144,0 103,0 104,0 74,3 63,0 67,0
13 41,5 815,0 667,0 636,0 502,0 362,0 313,0 222,0 222,0 151,0 131,0 85,1 90,6 61,7 63,2 59,2 61,7
14 56,3 1160,0 991,0 729,0 647,0 396,0 423,0 178,0 331,0 170,0 131,0 106,0 84,8 67,6 55,1 67,3 50,9
15 57,3 873,0 638,0 601,0 450,0 364,0 310,0 265,0 215,0 184,0 136,0 116,0 97,1 80,1 68,8 69,5 66,6
16 28,0 98,1 99,1 87,8 116,0 103,0 116,0 119,0 132,0 95,7 55,8 60,5 44,7 34,7 33,7 33,0 28,6
17 47,9 393,0 342,0 324,0 399,0 334,0 290,0 270,0 211,0 146,0 115,0 79,6 75,5 57,9 58,2 51,5 42,6
18 44,5 319,0 294,0 308,0 264,0 265,0 232,0 232,0 208,0 156,0 90,8 72,9 75,2 60,7 54,7 54,4 48,4
MW 48,3 558,7 464,6 425,2 375,6 303,9 283,8 238,7 239,5 168,0 113,0 90,7 82,5 65,9 56,3 54,5 48,4
SD 10,9 308,4 244,9 183,9 143,8 85,3 79,3 59,1 71,6 44,9 25,2 24,1 19,7 17,2 11,6 10,7 12,4
RSD [%] 22,7 55,2 52,7 43,3 38,3 28,1 27,9 24,7 29,9 26,7 22,3 26,6 23,9 26,1 20,6 19,6 25,6
8 40,8 67,9 86,1 101,0 184,0 187,0 160,0 259,0 193,0 149,0 102,0 301,0 64,8 50,0 52,3 46,4 34,7
Anhang
126
Tab. 16: Tulathromycinkonzentration in 10 9 BAL-Zellen beim Fohlen
BAL 1 2 3 4 5 6
Fohlen Nr .
nach einmaliger
Tulathromycin-
applikation
nach
Vorbehandlung
mit Rifampicin
nach
zweiwöchiger
Behandlung mit
Tulathromycin
und Rifampicin
1 128,3 343,5 485,0 292,2 - -
2 - 530,6 607,5 444,3 - -
3 280,9 1234,6 451,5 496,6 - -
4 328,6 302,5 443,0 309,6 - -
5 248,9 576,1 140,9 131,7 - -
6 246,2 641,5 181,5 608,9 - -
7 228,1 264,6 376,9 253,8 334,2 506,6
8 233,3 259,5 402,2 185,5 628,9 741,8
9 220,6 279,4 262,1 322,5 868,3 731,8
10 149,1 158,9 192,7 241,6 680,2 606,3
11 275,3 458,4 486,9 494,2 1919,3 1187,4
12 548,5 467,9 450,7 500,0 1472,8 993,9
13 285,3 260,3 339,8 94,6 777,6 341,8
14 163,1 219,0 266,7 275,3 1232,6 836,1
15 200,0 304,6 355,0 300,0 1046,7 579,3
16 195,9 235,1 281,8 358,9 1208,9 1067,8
17 140,3 335,4 237,0 340,2 828,2 418,1
18 312,0 197,9 336,4 380,2 774,1 674,3
MW 246,2 392,8 349,9 335,0 981,0 723,8
SD 97,9 250,5 124,9 135,6 425,8 259,9
RSD [%] 39,8 63,8 35,7 40,5 43,4 35,9
Anhang
127
Tab. 17: Tulathromycinkonzentration in den BAL-Übers tänden beim
Fohlen
BAL 1 2 3 4 5 6
Fohlen Nr .
nach
einmaliger
Tulathromycin-
applikation
nach
Vorbehandlung
mit Rifampicin
nach
zweiwöchiger
Behandlung
mit
Tulathromycin
und Rifampicin
3 22,3 36,9 13,3 14,1 - -
4 60,1 18,0 24,1 13,4 - -
5 27,8 19,5 33,9 14,9 - -
6 49,3 10,5 38,4 18,4 - -
7 20,9 13,9 37,2 6,4 43,7 12,9
8 67,1 8,9 33,1 14,2 62,4 11,8
9 25,0 8,9 15,2 9,0 29,2 4,8
10 41,1 9,8 16,9 15,7 33,2 16,1
11 20,4 12,0 36,3 14,7 72,2 14,1
12 37,1 9,7 12,4 15,4 46,1 9,9
13 63,0 11,7 39,4 2,2 31,1 5,6
14 42,6 10,2 21,3 2,78 15,5 4,6
15 33,0 6,6 39,0 5,8 30,2 12,1
16 23,9 5,6 30,7 4,0 42,7 21,9
17 23,3 4,1 13,5 3,1 8,4 13,7
18 80,4 12,5 34,8 12,1 36,3 17
MW 37,1 12,4 27,0 10,3 37,7 11,6
SD 19,0 7,7 10,5 5,5 17,8 5,2
Anhang
128
Tab. 18: Ergebnisse der Blutchemie: Gamma-Glutamyl- Transferase
(GGT) in U/l
Fohlen Nr.
nach
einmaliger
Tulathromycin-
applikatio n
nach
Vorbehandlung
mit Rifampicin
nach
zweiwöchiger
Behandlung
mit
Tulathromycin
und
Rifampicin
7 19,0 17,0 14,0
8 14,0 15,0 13,0
9 31,0 22,0 18,0
10 14,0 13,0 14,0
11 17,0 18,0 17,0
12 15,0 16,0 13,0
13 23,0 21,0 24,0
14 14,0 15,0 19,0
15 20,0 17,0 17,0
16 15,0 14,0 16,0
17 16,0 12,0 14,0
18 19,0 15,0 18,0
Mittelwert 18,1 16,3 16,4
Anhang
129
Tab. 19: Ergebnisse der Blutchemie: Glutamat-Dehydr ogenase (GLDH) in
U/l
Fohlen Nr.
nach
einmaliger
Tulathromycin-
applikation
nach
Vorbehandlung
mit Rifampicin
nach
zweiwöchiger
Behandlung
mit
Tulathromycin
und
Rifampicin
7 5,8 6,9 2,2
8 4,0 2,6 2,2
9 5,5 5,5 4,0
10 1,8 5,5 6,2
11 2,9 1,8 2,2
12 4,0 2,2 2,9
13 5,1 1,8 2,9
14 1,8 4,7 3,3
15 2,9 4,7 2,9
16 6,6 2,9 5,8
17 4,4 2,2 4,0
18 7,2 3,7 4,7
Mittelwert 4,3 3,7 3,6
Anhang
130
Tab. 20: Ergebnisse der Blutchemie: Harnstoff in mm ol/l
Fohlen Nr.
nach
einmaliger
Tulathromycin-
applikation
nach
Vorbehandlung
mit Rifampicin
nach
zweiwöchiger
Behandlung
mit
Tulathromycin
und
Rifampicin
7 1,2 1,8 2,2
8 1,4 1,0 2,3
9 1,8 1,9 2,6
10 2,3 3,0 3,2
11 2,3 2,4 2,7
12 2,0 1,9 2,1
13 2,3 3,2 3,3
14 3,1 3,3 3,9
15 2,7 3,0 3,1
16 1,9 2,8 3,2
17 1,9 2,4 2,9
18 1,1 1,7 2,6
Mittelwert 2,0 2,4 2,8
Anhang
131
Tab. 21: Ergebnisse der Blutchemie: Kreatinin in Um ol/l
Fohlen Nr.
nach
einmaliger
Tulathromycin-
applikation
nach
Vorbehandlung
mit Rifampicin
nach
zweiwöchiger
Behandlung
mit
Tulathromycin
und
Rifampicin
7 44 57 55
8 47 48 46
9 39 49 46
10 51 48 55
11 50 60 61
12 46 50 58
13 83 100 103
14 85 94 100
15 120 137 136
16 84 111 110
17 90 99 100
18 80 98 98
Mittelwert 68,3 79,3 80,7
Anhang
132
Tab. 22: Gesamtzellzahl der BAL in G/l beim Fohlen
1. BAL 2. BAL 3. BAL 4. BAL 5. BAL 6. BAL
Fohlen Nr.
nach einmaliger
Tulathromycin-
applikation
nach
Vorbehandlung
mit Rifampicin
nach
zweiwöchiger
Behandlung mit
Tulathromycin
und Rifampicin
1 22,4 10,9 9,9 12,7 - -
2 - 9,8 15,6 8,9 - -
3 13,9 16,2 18,4 20,6 - -
4 24,0 11,9 15,3 28,8 - -
5 17,2 14,2 31,1 24,0 - -
6 25,3 23,7 22,9 24,4 - -
7 8,3 9,8 16,4 11,7 29,5 27,9
8 8,0 13,9 13,0 20,4 21,2 23,8
9 22,7 23,9 28,0 33,8 24,4 23,4
10 15,3 18,0 21,8 26,7 47,5 18,5
11 14,5 23,4 15,8 23,1 20,2 18,8
12 9,1 14,0 14,7 17,5 11,3 17,0
13 14,1 15,1 9,9 22,8 30,2 84,4
14 13,3 11,6 14,0 15,2 17,8 31,8
15 7,2 6,5 12,1 8,0 12,5 21,7
16 20,3 14,4 12,8 12,4 15,1 17,7
17 13,1 8,4 14,6 10,1 10,6 20,9
18 8,2 7,7 8,3 10,5 15,9 22,7
Mittelwert 15,1 14,1 16,4 18,4 21,4 27,4
SD 6,0 5,3 6,1 7,6 10,5 18,5
Anhang
133
Tab. 23: Rückgewonnene Lavageflüssigkeit der BAL in ml
1. BAL 2. BAL 3. BAL 4. BAL 5. BAL 6. BAL
Fohlen Nr.
nach einmaliger
Tulathromycin-
applikation
nach
Vorbehandlung mit
Rifampicin
nach zweiwöchiger
Behandlung mit
Tulathromycin und
Rifampicin
1 80,0 90,0 130,0 90,0 - -
2 - 115,0 90,0 110,0 - -
3 125,0 60,0 130,0 130,0 - -
4 105,0 140,0 140,0 120,0 - -
5 130,0 130,0 140,0 50,0 - -
6 100,0 75,0 70,0 70,0 - -
7 155,0 135,0 105,0 130,0 125,0 150,0
8 135,0 115,0 105,0 125,0 150,0 145,0
9 105,0 130,0 115,0 100,0 160,0 160,0
10 125,0 115,0 130,0 135,0 130,0 60,0
11 145,0 110,0 130,0 120,0 130,0 155,0
12 125,0 120,0 80,0 20,0 140,0 145,0
13 95,0 130,0 140,0 115,0 155,0 130,0
14 155,0 150,0 150,0 125,0 165,0 170,0
15 150,0 150,0 125,0 155,0 120,0 140,0
16 125,0 140,0 155,0 160,0 155,0 100,0
17 135,0 115,0 50,0 140,0 95,0 45,0
18 145,0 145,0 130,0 130,0 130,0 130,0
Mittelwert 125,6 120,3 117,5 112,5 137,9 127,5
SD 22,1 24,8 28,8 35,7 20,2 39,3
Anhang
134
Tab. 24: Anteil der Makrophagen in % der Gesamtzellf raktion der BAL
1. BAL 2. BAL 3. BAL 4. BAL 5. BAL 6. BAL
Fohlen Nr.
nach einmaliger
Tulathromycin-
applikation
nach
Vorbehandlung
mit Rifampicin
nach
zweiwöchiger
Behandlung mit
Tulathromycin
und Rifampicin
1 60,0 86,0 62,0 83,0 - -
2 - 67,5 74,0 72,0 - -
3 43,0 61,5 70,5 59,5 - -
4 63,5 65,5 57,5 67,0 - -
5 42,0 53,0 65,0 41,0 - -
6 63,5 74,5 46,5 50,0 - -
7 69,0 82,5 72,5 46,0 69,0 73,5
8 87,0 82,5 75,5 48,0 74,5 85,0
9 77,5 79,5 65,5 58,0 88,5 78,0
10 87,0 79,5 52,5 65,5 78,5 83,0
11 90,0 58,5 63,5 61,0 72,0 72,0
12 89,5 93,0 90,0 59,0 77,5 71,5
13 86,5 80,5 90,0 89,0 77,5 62,5
14 59,0 68,5 63,0 57,5 68,5 67,5
15 89,0 77,0 75,0 71,5 92,5 17,0
16 82,5 68,0 85,5 72,5 90,0 17,0
17 79,0 77,5 71,0 65,0 64,5 56,0
18 93,5 24,0 78,0 66,5 83,5 46,5
Mittelwert 74,2 71,1 69,9 62,9 78,0 60,8
SD 16,5 15,6 11,9 12,4 9,0 23,1
Anhang
135
Tab. 25: Anteil der Lymphozyten in % der Gesamtzellfr aktion der BAL
1. BAL 2. BAL 3. BAL 4. BAL 5. BAL 6. BAL
Fohlen Nr.
nach einmaliger
Tulathromycin-
applikation
nach
Vorbehandlung
mit Rifampicin
nach
zweiwöchiger
Behandlung mit
Tulathromycin
und Rifampicin
1 32,0 12,0 35,0 14,5 - -
2 - 24,5 20,0 20,0 - -
3 47,5 6,0 21,5 34,0 - -
4 34,0 13,0 36,0 22,0 - -
5 46,0 41,5 25,5 56,5 - -
6 13,0 25,5 44,5 43,5 - -
7 27,0 12,0 14,5 44,5 28,0 20,0
8 9,5 8,5 15,5 49,5 22,0 12,0
9 18,5 13,5 29,5 38,5 6,5 20,0
10 11,5 14,5 45,0 32,0 21,5 7,5
11 4,5 39,5 33,5 36,5 20,0 19,0
12 4,5 5,0 7,5 18,0 19,5 21,0
13 7,0 9,0 1,5 4,5 18,0 25,0
14 17,0 24,5 28,0 40,5 27,5 27,0
15 5,5 5,5 20,0 8,5 3,0 81,0
16 14,0 16,0 11,0 10,0 4,0 79,0
17 19,5 8,5 26,0 17,0 28,0 33,5
18 4,5 71,0 7,5 14,5 4,5 51,5
Mittelwert 18,6 19,4 23,4 28,0 16,9 33,0
SD 14,1 16,8 12,6 15,6 9,7 24,6
Anhang
136
Tab. 26: Anteil der Mastzellen in % der Gesamtzellfra ktion der BAL
1. BAL 2. BAL 3. BAL 4. BAL 5. BAL 6. BAL
Fohlen Nr.
nach einmaliger
Tulathromycin-
applikation
nach
Vorbehandlung
mit Rifampicin
nach
zweiwöchiger
Behandlung mit
Tulathromycin
und Rifampicin
1 0,0 0,0 0,0 0,0 - -
2 - 0,0 0,0 0,0 - -
3 0,0 0,0 1,5 0,0 - -
4 0,0 0,5 4,5 0,0 - -
5 0,0 0,0 4,5 0,0 - -
6 0,0 0,0 0,0 1,0 - -
7 1,0 1,5 0,5 0,0 0,0 0,0
8 0,0 0,5 0,0 0,5 0,0 0,0
9 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
10 0,0 1,0 0,0 0,0 0,0 0,0
11 0,5 0,0 0,0 0,5 1,0 0,0
12 0,5 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
13 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
14 0,0 0,0 0,5 0,0 0,0 0,0
15 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
16 0,0 0,0 0,5 0,0 0,0 1,0
17 1,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,5
18 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
Mittelwert 0,2 0,2 0,7 0,1 0,1 0,1
SD 0,4 0,4 1,4 0,3 0,3 0,3
Anhang
137
Tab. 27: Anteil der Neutrophilen in % der Gesamtzell fraktion der BAL
1. BAL 2. BAL 3. BAL 4. BAL 5. BAL 6. BAL
Fohlen Nr.
nach einmaliger
Tulathromycin-
applikation
nach
Vorbehandlung
mit Rifampicin
nach
zweiwöchiger
Behandlung mit
Tulathromycin
und Rifampicin
1 8,0 1,5 3,0 1,5 - -
2 - 7,5 5,0 5,0 - -
3 9,0 9,5 0,0 4,5 - -
4 1,5 10,0 1,0 0,0 - -
5 10,5 3,5 3,0 1,5 - -
6 0,0 0,0 0,0 4,0 - -
7 2,0 1,0 2,5 7,0 1,0 3,5
8 2,0 4,5 1,0 1,0 3,0 0,0
9 1,5 4,0 5,0 2,5 2,5 0,0
10 1,0 3,0 0,5 0,5 0,0 1,5
11 1,0 2,0 1,0 1,5 2,0 1,0
12 3,0 0,0 1,0 19,0 0,0 1,5
13 6,0 5,5 2,0 1,5 3,5 5,5
14 23,5 7,0 5,0 0,0 0,5 2,0
15 4,0 2,0 2,0 3,5 3,0 2,0
16 2,5 14,5 1,0 0,0 4,0 1,0
17 0,0 4,5 2,0 0,0 7,5 3,5
18 2,0 4,0 7,5 5,5 7,5 1,0
Mittelwert 4,6 4,7 2,4 3,3 2,9 1,9
SD 5,8 3,8 2,1 4,5 2,5 1,6
Anhang
138
Tab. 28: Anteil der Epithelzellen in % der Gesamtzell fraktion der BAL
1. BAL 2. BAL 3. BAL 4. BAL 5. BAL 6. BAL
Fohlen Nr.
nach einmaliger
Tulathromycin-
applikation
nach
Vorbehandlung
mit Rifampicin
nach
zweiwöchiger
Behandlung mit
Tulathromycin
und Rifampicin
1 0,0 0,0 0,0 0,0 - -
2 - 0,0 0,0 0,0 - -
3 0,0 23,0 5,0 1,5 - -
4 0,0 8,0 0,0 11,0 - -
5 0,0 0,0 0,0 0,0 - -
6 20,0 0,0 4,5 1,5 - -
7 0,0 0,0 8,5 0,5 0,5 3,0
8 0,0 0,0 7,0 0,0 0,0 0,0
9 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 1,5
10 0,0 0,0 1,5 0,0 0,0 7,5
11 1,5 0,0 0,0 0,0 4,0 5,5
12 0,5 0,0 0,0 1,0 0,0 5,0
13 0,0 3,0 6,5 0,0 0,0 5,0
14 0,0 0,0 1,0 2,0 0,5 1,0
15 0,0 15,5 1,5 16,0 0,0 0,0
16 0,0 0,0 1,5 16,0 0,0 1,0
17 0,0 8,5 0,0 15,5 0,0 4,5
18 0,0 1,0 4,5 12,5 4,0 0,0
Mittelwert 1,3 3,3 2,3 4,3 0,8 2,8
SD 4,8 6,5 2,9 6,4 1,5 2,6
Anhang
139
Tab. 29: Anteil der Riesenzellen in % der Gesamtzellf raktion der BAL
1. BAL 2. BAL 3. BAL 4. BAL 5. BAL 6. BAL
Fohlen Nr.
nach einmaliger
Tulathromycin-
applikation
nach
Vorbehandlung
mit Rifampicin
nach
zweiwöchiger
Behandlung mit
Tulathromycin
und Rifampicin
1 0,0 0,5 0,0 1,0 - -
2 - 0,5 1,0 3,0 - -
3 0,5 0,0 1,5 0,5 - -
4 1,0 3,0 1,0 0,0 - -
5 1,5 2,0 2,0 1,0 - -
6 3,5 0,0 4,5 0,0 - -
7 1,0 3,0 1,5 2,0 1,5 0,0
8 1,5 4,0 1,0 1,0 0,5 3,0
9 2,5 3,0 0,0 1,0 2,5 0,5
10 0,5 2,0 0,5 2,0 0,0 0,5
11 2,5 0,0 2,0 0,5 1,0 2,5
12 2,0 2,0 1,5 3,0 3,0 1,0
13 0,5 2,0 0,0 5,0 1,0 2,0
14 0,5 0,0 2,5 0,0 3,0 2,5
15 1,5 0,0 1,5 0,5 1,5 0,0
16 1,0 1,5 0,5 1,5 2,0 1,0
17 0,5 1,0 1,0 2,5 0,0 2,0
18 0,0 0,0 2,5 1,0 0,5 1,0
Mittelwert 1,2 1,4 1,4 1,4 1,4 1,3
SD 1,0 1,3 1,1 1,3 1,1 1,0
Anhang
140
Tab. 30: In der Analytik verwendete Reagenzien
Hersteller
Tulathromycin Pfizer, Karlsruhe, Deutschland
Roxithromycin Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland
Ammoniumformiat Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland
Ameisensäure Merck, Darmstadt, Deutschland
Natriumcarbonat Merck, Darmstadt, Deutschland
Acetonitril LC-MS CHROMASOLV® Sigma-Aldrich, Seelze, Deutschland
Acetonitril J. T. Baker, Deventer, Holland
Kaliumdihydrogenphosphat Merck, Darmstadt, Deutschland
Ammoniak 32 % Merck, Darmstadt, Deutschland
Kaliumhydroxid Merck, Darmstadt, Deutschland
Anhang
141
Gruppe 1 kurz ( ) G ruppe 2 lang ( )
Standort:
Stutennummer:
Spenderstute:
Geburtsdatum des Fohlens:
Geburtskomplikationen:
Signalement:
Geschlecht:
Immunglobulingehalt:
Klinische Befunde:
Sonographische Befunde:
Blut/Leukozyten:
Gewicht:
Applikationsmenge:
Applikationszeitpunkt:
Applikationsstelle:
Lokale Reaktionen:
Systemische Reaktionen:
Sonstige Behandlungen:
BAL 1 BAL 2 BAL 3
Zellzahl:
Rückgewonnene Lavageflüssigkeit:
BAL 4 BAL 5 BAL 6
Zellzahl:
Rückgewonnene Lavageflüssigkeit:
Abb. 25: Formblatt der Datenerfassung für Fohlen
Anhang
142
Abb. 26: Befundbogen für die sonographische Untersu chung der Lunge
Anhang
143
o.b.B. verschärft rasseln giemen o.b.B. rasseln ohne serös seromukös purulent o.b.B. vergrößert ohne auslösbar spontan0 0 2 2 0 2 0 1 1 2 0 1 0 1 2
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Datum T Leukos Sono
Untersuchungsblatt Stute Nr. ____________
Lunge Trachea Nasenausfluss Lymphknoten HustenWoche
Abb. 27: Untersuchungsblatt für Fohlen
Anhang
144
Stutennummer: Standort: Braunüle:
Blutentnahme: 0 min. 20 min. 40 min. 1 Std. 2 Std. 4 Std. 6 Std. 8 Std. 12 Std.
Probennummer: 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Uhrzeit:
Blutchemie:
Entnahme-Datum:
Zeit bis Zentrifugation:
Blutentnahme: 1 T. 2 T. 3 T. 4 T. 5 T. 6 T. 7 T. 8 T.
Probennummer: 10 11 12 13 14 15 16 17
Uhrzeit:
Blutchemie:
Entnahme-Datum:
Zeit bis Zentrifugation:
Bal: 24 Std. 8 T. 24 Std. 8 T. 24 Std. 8 T.
Probennummer: 1 2 3 4 5 6
Entnahme-Datum:
Lungenseite:
Rückspülmenge:
Zellzahl:
Zellzahl in …… ml:
Zeit bis Zentrifugation:
Abb. 28: Formblatt für Blutentnahme und BAL
Anhang
145
Abb. 29: Klinischer Score
Anhang
146
9.1 Abbildungsverzeichnis
Abb. 1: Makrolide, die in den letzten Jahren entwickelt wurden (nach BRYSKIER et al., 1993) 14
Abb. 2: Strukturformel von Erythromycin (nach STAHLMANN u. LODE, 2001) 15
Abb. 3: Strukturformel von Azithromycin (nach STAHLMANN u. LODE, 2001) 20
Abb. 4: Strukturformel von Clarithromycin (nach STAHLMANN u. LODE, 2001) 23
Abb. 5: Strukturformel von Tilmicosin (nach FREY u. LÖSCHER, 2002) 26
Abb. 6: Strukturformel von Tylosin (nach FREY u. LÖSCHER, 2002) 27
Abb. 7: Strukturformel Spiramycin (nach FREY u. LÖSCHER, 2002) 29
Abb. 8: Absorption von Makrolid-Antibiotika nach oraler Verabreichung (nach WILLIAMS u. SEFTON, 1993) 34
Abb. 9: Strukturformel von Tulathromycin (nach NOWAKOWSKI at al., 2004) 38
Abb. 10: Strukturformel von Rifampicin (nach STAHLMANN u. LODE, 2001)47
Abb. 11 Beispielchromatogramm für eine Leerplasmaprobe mit internem Standard 71
Abb. 12 Beispielchromatogramm für eine Plasmaprobe gespiked mit 200 ng/ml Tulathromycin und 250 ng/ml IS 72
Abb. 13: Plasmakonzentration nach einmaliger i.m. Injektion von Tulathromycin (2,5 mg/kg) beim Fohlen (n = 17) (in Mittelwert und Standardabweichung angegeben) 74
Abb. 14: Plasmakonzentration nach einmaliger i.m. Injektion von Tulathromycin (2,5 mg/kg) beim Fohlen (n = 17) (in Mittelwert und Standardabweichung angegeben) 75
Abb. 15: Plasmakonzentration nach i.m. Injektion von Tulathromycin (2,5 mg/kg) und zusätzlicher Verabreichung von Rifampicin (10 mg/kg) zweimal täglich p.o. nach Vorbehandlung über sechs Tage mit Rifampicin beim Fohlen (n = 17) (in Mittelwert und Standardabweichung angegeben) 77
Abb. 16: Plasmakonzentration nach i.m. Injektion von Tulathromycin (2,5 mg/kg) und zusätzlicher Verabreichung von Rifampicin (10 mg/kg) zweimal täglich p.o. nach Vorbehandlung über sechs Tage mit Rifampicin beim Fohlen (n = 17) (in Mittelwert und Standardabweichung angegeben) 78
Abb. 17: Plasmakonzentration nach i.m. Injektion von Tulathromycin (2,5 mg/kg) und zusätzlicher Verabreichung von Rifampicin (10 mg/kg) zweimal täglich p.o. nach zuvor zweiwöchiger Behandlung mit
Anhang
147
Rifampicin und Tulathromycin beim Fohlen (n = 11) (in Mittelwert und Standardabweichung angegeben) 80
Abb. 18: Plasmakonzentration nach i.m. Injektion von Tulathromycin (2,5 mg/kg) und zusätzlicher Verabreichung von Rifampicin (10 mg/kg) zweimal täglich p.o. nach zuvor zweiwöchiger Behandlung mit Rifampicin und Tulathromycin beim Fohlen (n = 11) (in Mittelwert und Standardabweichung angegeben) 81
Abb. 19: Vergleichende Darstellung der Plasmakonzentration nach i.m. Injektion von Tulathromycin bei Fohlen mit und ohne Kombination von Rifampicin 83
Abb. 20: Vergleichende Darstellung der Plasmakonzentration nach i.m. Injektion von Tulathromycin bei Fohlen mit und ohne Kombination von Rifampicin 83
Abb. 21: Konzentrationen von Tulathromycin in den BAL-Zellen bei Fohlen (in Mittelwert + Standardabweichung angegeben) 90
Abb. 22: Konzentrationen von Tulathromycin in den BAL-Überständen bei Fohlen (in Mittelwert + Standardabweichung angegeben) 91
Abb. 23: Konzentration von Tulathromycin vor und nach Aufsättigung mit Rifampicin im Plasma von Fohlen 8 95
Abb. 24: Konzentration von Tulathromycin vor und nach Aufsättigung mit Rifampicin im Plasma von Fohlen 8 95
Abb. 25: Formblatt der Datenerfassung für Fohlen 141
Abb. 26: Befundbogen für die sonographische Untersuchung der Lunge 142
Abb. 27: Untersuchungsblatt für Fohlen 143
Abb. 28: Formblatt für Blutentnahme und BAL 144
Abb. 29: Klinischer Score 145
9.2 Tabellenverzeichnis
Tab. 1: Zeitpunkte der Blutentnahme und der bronchoalveolären Lavage (BAL) 59
Tab. 2: Studienübersicht der Gruppe 1 (kurzes Protokoll, n = 6) und Gruppe 2 (langes Protokoll, n = 12) 61
Tab. 3: Studienübersicht der Gruppe 2 (langes Protokoll, n = 12) 63
Tab. 4: Pharmakokinetische Parameter von Tulathromycin im Plasma beim Fohlen (n = 17) nach einmaliger i.m. Gabe von Tulathromycin (2,5 mg/kg) 76
Tab. 5: Pharmakokinetische Parameter von Tulathromycin im Plasma beim Fohlen (n = 17) nach i.m. Injektion von Tulathromycin (2,5 mg/kg) und zusätzlicher Verabreichung von Rifampicin (10 mg/kg) zweimal täglich p.o. nach Vorbehandlung über sechs Tage mit Rifampicin 79
Anhang
148
Tab. 6: Pharmakokinetische Parameter von Tulathromycin im Plasma beim Fohlen (n = 11) nach i.m. Injektion von Tulathromycin (2,5 mg/kg) und zusätzlicher Verabreichung von Rifampicin (10 mg/kg) zweimal täglich p.o. nach zuvor zweiwöchiger Behandlung mit Rifampicin und Tulathromycin 82
Tab. 7: Vergleich der pharmakokinetischen Parameter von Tulathromycin im Plasma von Fohlen 84
Tab. 8: Prozentualer Anteil der einzelnen Zelltypen an den BAL-Zellen bei Fohlen der Gruppe 1 (n = 6) und Gruppe 2 (n = 12) 86
Tab. 9: Konzentrationen von Tulathromycin in den BAL-Zellen und im Überstand beim Fohlen (n = 18) nach einmaliger Tulathromycingabe (2,5 mg/kg) (in Mittelwert ± Standardabweichung angegeben) 87
Tab. 10: Konzentrationen von Tulathromycin in den BAL-Zellen und im Überstand beim Fohlen (n = 18) nach Tulathromycingabe (2,5 mg/kg) und zusätzlicher Gabe von Rifampicin (10 mg/kg) nach Vorbehandlung mit Rifampicin über sechs Tage (in Mittelwert ± Standardabweichung angegeben) 88
Tab. 11: Konzentrationen von Tulathromycin in den BAL-Zellen beim Fohlen und im Überstand beim Fohlen (n = 18) nach Tulathromycingabe (2,5 mg/kg) und zusätzlicher Gabe von Rifampicin (10 mg/kg) zweimal täglich p.o. nach zweiwöchiger Behandlung mit Tulathromycin und Rifampicin (in Mittelwert ± Standardabweichung angegeben) 89
Tab. 12: Ergebnisse der biochemischen Blutparameter bei den Fohlen des langen Studienprotokolls (n = 12) 93
Tab. 13: Plasmakonzentration von Tulathromycin (2,5 mg/kg KM) beim Fohlen nach einmaliger i.m. Gabe 123
Tab. 14: Plasmakonzentration von Tulathromycin (2,5 mg/kg KM) beim Fohlen nach einmaliger i.m. Gabe und zusätzlicher Gabe von Rifampicin (10 mg/kg KM p.o., zweimal täglich) nach Vorbehandlung mit Rifampicin (6 Tage) 124
Tab. 15: Plasmakonzentration von Tulathromycin (2,5 mg/kg KM) beim Fohlen nach einmaliger i.m. Gabe und zusätzlicher Gabe von Rifampicin (10 mg/kg KM p.o., zweimal täglich) nach zweiwöchiger Behandlung mit Tulathromycin und Rifampicin 125
Tab. 16: Tulathromycinkonzentration in 109 BAL-Zellen beim Fohlen 126
Tab. 17: Tulathromycinkonzentration in den BAL-Überständen beim Fohlen 127
Tab. 18: Ergebnisse der Blutchemie: Gamma-Glutamyl-Transferase (GGT) in U/l 128
Tab. 19: Ergebnisse der Blutchemie: Glutamat-Dehydrogenase (GLDH) in U/l 129
Tab. 20: Ergebnisse der Blutchemie: Harnstoff in mmol/l 130
Anhang
149
Tab. 21: Ergebnisse der Blutchemie: Kreatinin in Umol/l 131
Tab. 22: Gesamtzellzahl der BAL in G/l beim Fohlen 132
Tab. 23: Rückgewonnene Lavageflüssigkeit der BAL in ml 133
Tab. 24: Anteil der Makrophagen in % der Gesamtzellfraktion der BAL 134
Tab. 25: Anteil der Lymphozyten in % der Gesamtzellfraktion der BAL 135
Tab. 26: Anteil der Mastzellen in % der Gesamtzellfraktion der BAL 136
Tab. 27: Anteil der Neutrophilen in % der Gesamtzellfraktion der BAL 137
Tab. 28: Anteil der Epithelzellen in % der Gesamtzellfraktion der BAL 138
Tab. 29: Anteil der Riesenzellen in % der Gesamtzellfraktion der BAL 139
Tab. 30: In der Analytik verwendete Reagenzien 140
Danksagung
Herrn Prof. Dr. E. Klug möchte ich für die Überlassung des sehr interessanten
Dissertationsthemas danken.
Herrn Prof. Dr. W. Siegmund danke ich für die kooperative Zuasmmenarbeit.
Frau PhD. Dr. M. Venner danke ich sehr herzlich für die jederzeit gewährte
Unterstützung und das sie mir, trotz ihres vollen Terminkalenders, bei den BALs
geholfen hat.
Herrn P. Schockemöhle danke ich für die finanzielle Unterstützung und die gute
Zusammenarbeit.
Der Firma Pfizer und Dr. L. Goossens danke ich für ihr großes Interesse und
die finanzielle Unterstützung.
Dr. E. Scheuch, Janina und Danilo danke ich für die großartige Unterstützung.
Ihr wart spitze.
Den Mitarbeitern des Gestüts Lewitz, besonders Herrn P. Baumgart und F.
Pieper, gilt mein Dank für die Durchführung der Arbeit.
Roberto und Isabell Sanchez danke ich dafür, dass sie mich in ihrem Labor
haben arbeiten lassen und immer sehr freundlich zu mir waren.
Ganz besonders möchte ich Eric danken, der mir in schwierigen Situationen
Händchen gehalten hat und immer für mich da war.
Den „Doktoranden“ möchte ich für ihre jederzeit gewährte Hilfe danken. Ohne
Euch wäre die Durchführung gar nicht möglich gewesen.
Ein weiterer Dank gilt Kasia, die wärend der gesamten Studie meine Fohlen
zweimal täglich behandelt hat.
Frau A. Seemann-Jensen und Ihren Kolleginnen des Labors der Pferdeklinik
der tierärztlichen Hochschule Hannover danke ich für die geduldigen
Unterweisungen und die freundliche Betreuung.
Ein großer Dank gilt Holger, der mir stundenlang beim Formatieren geholfen
hat. Ohne Dich wäre ich wohl verzweifelt.
Frau PhD. McAlister-Hermann danke ich recht herzlich, dass sie mir so
kurzfristig bei der englischen Übersetzung zur Seite stand.
Des Weiteren möchte ich meiner lieben Nachbarin Frau E. Peter danken, die
sich während meiner Abwesendheit um meine Wohnung gekümmert und
unermüdlich meine Blumen gegossen hat.
Der größtmögliche Dank gilt meinen Eltern und Großeltern, die mir mein
gesamtes Studium und die Dissertation überhaupt erst möglich gemacht haben
und immer an mich geglaubt haben. Ihre Hilfe und ihr Verständnis standen mir
jederzeit zur Verfügung.
Bei den 18 Fohlen und ihren Mutterstuten möchte ich mich für die meist mehr,
selten weniger kooperative Mitarbeit bedanken. Dank ihnen hat die Arbeit zu
großen Teilen viel Freude bereitet. Bleibt gesund und geratet einmal in gute
Hände.
