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Werner Höra

Optimierung der Produktion undAufarbeitung von Glucose-6-phosphatDehydrogenase und Hexokinase ausBäckerhefe

Diplomarbeit

Medizin

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Werner Höra

Optimierung der Produktion und Aufarbeitung vonGlucose-6-phosphat Dehydrogenase und Hexokinaseaus Bäckerhefe

Diplom.de

ID 5580

Werner Höra

Optimierung der Produktion und Aufarbeitung von Glucose-6-phosphat Dehydrogenase und Hexokinase aus Bäckerhefe Diplomarbeit an der Fachhochschule Jena Fachbereich Medizintechnik 10 Monate Bearbeitungsdauer April 2002 Abgabe

ID 5580 Höra, Werner: Optimierung der Produktion und Aufarbeitung von Glucose-6-phosphat Dehydrogenase und Hexokinase aus Bäckerhefe / Werner Höra - Hamburg: Diplomica GmbH, 2002 Zugl.: Jena, Diplomarbeit, 2002 Dieses Werk ist urheberrechtlich geschützt. Die dadurch begründeten Rechte, insbesondere die der Übersetzung, des Nachdrucks, des Vortrags, der Entnahme von Abbildungen und Tabellen, der Funksendung, der Mikroverfilmung oder der Vervielfältigung auf anderen Wegen und der Speicherung in Datenverarbeitungsanlagen, bleiben, auch bei nur auszugsweiser Verwertung, vorbehalten. Eine Vervielfältigung dieses Werkes oder von Teilen dieses Werkes ist auch im Einzelfall nur in den Grenzen der gesetzlichen Bestimmungen des Urheberrechtsgesetzes der Bundesrepublik Deutschland in der jeweils geltenden Fassung zulässig. Sie ist grundsätzlich vergütungspflichtig. Zuwiderhandlungen unterliegen den Strafbestimmungen des Urheberrechtes.

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Diplomarbeit Werner Höra 1

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung ................................................................................................................................. 4

2 Zielsetzung............................................................................................................................... 5

3 Theoretische Grundlagen ........................................................................................................ 6

3.1 Die Enzyme Glucose-6-phosphat Dehydrogenase und Hexokinase....................................... 6

3.1.1 Eigenschaften der Enzyme Glucose-6-phosphat Dehydrogenase und Hexokinase............... 6

3.1.2 Die beiden Coenzyme Nikotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat (NADP+) und

Adenosintriphosphat (ATP) sowie Mg2+-Ionen als Cofaktoren ................................................ 7

3.1.3 Die Methode der Glucosebestimmung mit Hilfe von Glucose-6-phosphat

Dehydrogenase und Hexokinase............................................................................................. 7

3.2 Charakterisierung des Mikroorganismus Bäckerhefe.............................................................. 9

3.2.1 Allgemeine Betrachtung und Physiologie von Hefen sowie taxonomische

Einordnung von S. cerevisiae .................................................................................................. 9

3.2.2 Stoffwechsel von S. cerevisiae .............................................................................................. 10

3.3 Allgemeiner Ablauf des Praktikums zur Herstellung der Enzyme G6P-DH und HK.............. 11

3.4 Theoretische Grundlagen der Satz-, Zulauf- und kontinuierlichen Kultivierung .................... 12

3.4.1 Allgemeine Betrachtungen zur Satz-, Zulauf- und kontinuierlichen Kultivierung................... 12

3.4.2 Gleichungen zur Berechnung der Prozesskenngrößen der Satz-Kultivierungen und

der kontinuierlichen Zellkulturen ............................................................................................ 13

3.5 Praxis der Kultivierung und Aufarbeitung von S. cerevisiae in der Industrie und

Vergleich mit der Kultivierung im Studentenpraktikum .......................................................... 16

3.6 Theoretische Grundlagen der Membranmikrofiltration .......................................................... 17

3.6.1 Allgemeine Charakterisierung der Membranmikrofiltration.................................................... 17

3.6.2 Einsatz und Eigenschaften der Membranmikrofiltration ........................................................ 18

3.7 Theoretische Grundlagen des Zellaufschlusses mit einer Kugelmühle................................. 19

3.7.1 Allgemeine Charakterisierung und Einsatz der Kugelmühle ................................................. 19

3.7.2 Wichtige Parameter bei der Kugelmühle ............................................................................... 20

3.8 Theoretische Grundlagen der Zentrifugation ......................................................................... 21

3.8.1 Allgemeine Charakterisierung und Einsatz der Zentrifugation .............................................. 21

3.8.2 Einflussparameter bei der Zentrifugation............................................................................... 22

3.9 Theoretische Grundlagen der Ionenaustauschchromatographie .......................................... 23

3.9.1 Allgemeine Charakterisierung der Ionenaustauschchromatographie.................................... 23

3.9.2 Einsatz der Ionenaustauschchromatographie ....................................................................... 24

4 Material und Methoden .......................................................................................................... 26

4.1 Mikroorganismus, Chemikalien und Nährmedium................................................................. 26

4.2 Materialien und Methode bei der Vorkultivierung und Kultivierung von S. cerevisiae........... 27


4.3 Materialien und Methode bei der Überdruckfiltration............................................................. 30

4.4 Materialien und Methode beim Zellaufschluss mit der Kugelmühle ...................................... 32

4.5 Materialien und Methode bei der Zentrifugation .................................................................... 34

4.6 Materialien und Methode bei der Anionenaustauschchromatographie ................................. 34

4.7 Bestimmung des Trockenbiomasseanteils der eingesetzten Presshefe ............................... 37

4.8 Bestimmung der Trockenbiomassekonzentration der kultivierten Hefe ................................ 38

4.9 Bestimmung der Glucosekonzentration in der Kulturbrühe ................................................... 41

4.10 Bestimmung der Ethanolkonzentration in der Kulturbrühe .................................................... 43

4.11 Enzymtests zur Bestimmung der G6P-DH- und HK-Aktivität ................................................ 44

4.12 Bestimmung der volumenbezogenen Enzymaktivität von G6P-DH während der

Kultivierung ............................................................................................................................ 46

4.13 Bestimmung der Proteinkonzentrationen des Rohextraktes und eluierter Fraktionen

mit Bradford-Reagenz............................................................................................................ 46

5 Ergebnisse des Herstellungsprozesses von G6P-DH und HK.............................................. 48

5.1 Ergebnisse der Vorkultivierungen und der Kultivierungen..................................................... 48

5.1.1 Messgrößen der ersten Satz-Kultivierung (Satz-1)................................................................ 49

5.1.2 Messgrößen der zweiten Satz-Kultivierung (Satz-2) ............................................................. 50

5.1.3 Messgrößen der ersten Satz-Kultivierung mit impulsweiser Zufütterung (IZ-Satz-1)............ 52

5.1.4 Messgrößen der zweiten Satz-Kultivierung mit impulsweiser Zufütterung (IZ-Satz-

2) ............................................................................................................................................ 54

5.1.5 Messgrößen der Zulauf-Satz-Kultivierung mit nachfolgender kontinuierlicher

Prozessführung (IZ-Satz-Konti) ............................................................................................. 56

5.1.6 Messgrößen der kontinuierlichen Kultivierung (Konti-1) sowie Säureverbrauch und

zudosierte Antischaummittelvolumen aller Kultivierungen .................................................... 58

5.1.7 Charakteristische Prozesskenngrößen der Kultivierungen im Vergleich............................... 60

5.2 Ergebnisse der Fest/Flüssig-Trennung mit einer Filtrationsanlage ....................................... 61

5.2.1 Fest/Flüssig-Trennung mit Papierfiltern................................................................................. 61

5.2.2 Fest/Flüssig-Trennung mit Membranfiltern ............................................................................ 62

5.3 Ergebnisse des Zellaufschlusses mit der Kugelmühle .......................................................... 66

5.3.1 Vorversuche mit und ohne Sand............................................................................................ 66

5.3.2 Vorversuche mit Sand mit Hilfe eines klassischen Versuchsplans ....................................... 67

5.3.3 Ergebnisse des Faktorenversuchsplans................................................................................ 69

5.4 Ergebnisse der Zentrifugation................................................................................................ 71

5.5 Ergebnisse der Anionenaustauschchromatographie............................................................. 71

5.5.1 Anionenaustauschchromatographie mit Proteinlösung aus Trockenhefe mit Hilfe

eines linearen Gradienten (Chroma-1) .................................................................................. 72


5.5.2 Anionenaustauschchromatographie mit Proteinlösung aus kultivierter Hefe mit Hilfe

eines linearen Gradienten (Chroma-2) .................................................................................. 72

5.5.3 Anionenaustauschchromatographie mit Proteinlösung aus Presshefe mit Hilfe

eines Stufengradienten (Chroma-3) ...................................................................................... 74

5.5.4 Anionenaustauschchromatographie mit Proteinlösung aus kultivierter Hefe mit Hilfe

eines Stufengradienten (Chroma-4) ...................................................................................... 76

5.6 Ergebnisse und Diskussion der Lagerung von G6P-DH und HK .......................................... 78

6 Diskussion der Ergebnisse der Teilverfahren des Herstellungsprozesses ........................... 80

6.1 Diskussion der Ergebnisse der Vorkultivierungen und der Kultivierungen............................ 80

6.2 Diskussion der Ergebnisse der Mikrofiltration........................................................................ 82

6.3 Diskussion der Ergebnisse des Zellaufschlusses.................................................................. 83

6.4 Diskussion der Ergebnisse der Zentrifugation ....................................................................... 84

6.5 Diskussion der Ergebnisse der Chromatographieversuche .................................................. 84

6.6 Gesamtbilanz des Prozesses in Bezug auf G6P-DH............................................................. 86

6.7 Ergebnisse und Diskussion des selbst hergestellten Glucosetestes im Vergleich

mit dem Glucosetest von Roche............................................................................................ 87

7 Vorschlag zur Durchführung eines Praktikums...................................................................... 95

8 Kostenvergleich des zweiten selbst hergestellten Glucosetestes mit dem gekauften

Glucosetest von Roche.......................................................................................................... 98

9 Zusammenfassung und Ausblick......................................................................................... 100

10 Chemikalien- und Verbrauchsmaterialienliste sowie Geräteliste......................................... 102

10.1 Chemikalien- und Verbrauchsmaterialienliste ..................................................................... 102

10.2 Geräteliste............................................................................................................................ 103

11 Literaturverzeichnis.............................................................................................................. 104

12 Verzeichnis der Symbole und Indizes.................................................................................. 108

13 Abkürzungsverzeichnis ........................................................................................................ 111

14 Abbildungsverzeichnis ......................................................................................................... 112

15 Tabellenverzeichnis ............................................................................................................. 116

16 Antrag auf Ausgabe des Diplomthemas .............................................................................. 118

17 Erklärung.............................................................................................................................. 120

18 Anhang................................................................................................................................. 121

18.1 Versuchsanleitung zur Durchführung des Praktikums......................................................... 121

18.2 Musterprozess mit Prozesskenngrößen in Kurzform........................................................... 132

18.3 Definition der Enzymaktivität................................................................................................ 134

18.4 Rohdaten und Datenblätter.................................................................................................. 134


1 Einleitung

Diese Diplomarbeit entstand im Rahmen meiner Ausbildung im Studiengang Medizintechnik,

Fachrichtung Biotechnologie, die ich von Oktober 1996 bis Mai 2002 an der Fachhochschule Jena

absolvierte.

In der Zeit meines Studiums gab es einen Aufschwung der Biowissenschaften, darunter auch der

Biotechnologie. Insgesamt gibt es zur Zeit ca. 1200 Biotechnologieunternehmen in Deutschland

[Mietzsch, A.; 2001] und der Trend zur Unternehmensgründung ist steigend. Zu Recht wird die

Biotechnologie als eine der Schlüsseltechnologien des 21. Jahrhunderts bezeichnet. Unter anderem

erhofft man sich von ihr die Linderung und Heilung von bislang unheilbaren Krankheiten wie z.B. von

Chorea Huntington, Mukoviszidose und Krebs.

„Unter Biotechnologie versteht man die Herstellung oder Veränderung von chemischen Verbindungen mit

Hilfe lebender Organismen oder Teilen von Organismen im Rahmen industrieller Verfahren. Darunter

fallen beispielsweise die Herstellung und Konservierung von Nahrungs- und Genussmitteln wie Brot,

Sauerkraut, Käse, Bier und Wein aber auch von Arzneimitteln wie Antibiotika (z.B. Penicilline),

Vitaminen, Blutprodukten (z. B. Serumalbumin, Blutgerinnungsfaktoren, Immunoglobuline). Weiterhin

zählen zur Biotechnologie die Produktion von chemischen Vor- und Zwischenprodukten wie

Zitronensäure, Aminosäuren oder Ethylalkohol und die Herstellung von Enzymen“ [Folienserie des Fonds

der Chemischen Industrie, 1996].

Enzyme gehören chemisch betrachtet zu den Proteinen und wirken als biochemische Katalysatoren, das

heißt, sie beschleunigen eine chemische Reaktion. Sie sind an nahezu allen Umsetzungen im

Stoffwechsel von Organismen beteiligt. Durch ihre hohe Substratspezifität hat ihre Bedeutung in

enzymatischen Analysenmethoden stark zugenommen.

Folgende Enzyme werden unter anderem mit Hilfe der Biotechnologie mittlerweile industriell gewonnen.

Tabelle 1 : Wichtige industrielle Enzyme [Folienserie des Fonds der Chemischen Industrie, 1996]

Enzym Rohstoffe Anwendung

Protease Bacillus Waschmittel-, Mehl-Zusätze, Getränke-

Aspergillus industrie, Käseherstellung, Medizin

α - Amylase Bacillus Stärkeverzuckerung, Textil- und Papier-

Aspergillus verarbeitung, Back- und Maischprozesse,

Pankreas Verdauungshilfe

Glucose-Isomerase Streptomyces Stärkesirup-Herstellung

Lipase Candida sp. Fettspaltung, Verdauungsförderung

Peroxidasen Pilz, Pflanzen Textilbleiche, Polymerisationen

Penicillin-Amidasen E. coli Antibiotika-Herstellung

Glucose-6-phosphat E. coli Glucosebestimmung

Dehydrogenase

Hexokinase S. cerevisiae Glucosebestimmung


2 Zielsetzung

Das Ziel dieser Diplomarbeit war es, ein Verfahren zur Herstellung der Enzyme Glucose-6-phosphat

Dehydrogenase (G6P-DH) und Hexokinase (HK) aus Bäckerhefe (Saccharomyces cerevisiae) für die

Anwendung zur Glucoseanalytik innerhalb eines Studentenpraktikums zu optimieren.

G6P-DH und HK werden z.B. zur quantitativen Glucosekonzentrationsbestimmung in Kulturbrühen oder

zur Ermittlung des Blutzuckergehaltes und des Zuckergehaltes in Lebensmitteln eingesetzt.

In dem Studentenpraktikum sollen G6P-DH und HK von den Studierenden selbständig aus

Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) gewonnen werden, um damit den Einkauf dieser Enzyme

einzusparen. Die isolierte G6P-DH und HK soll dann zur Glukosekonzentrationsbestimmung in der im

folgenden Praktikum benutzten Kulturbrühe eingesetzt werden. Die Messung der Glucosekonzentration

einer Zellkultur ist notwendig, um den Substratverbrauch und damit den Substratausbeutekoeffizienten zu

ermitteln.

Weiterhin soll den Studierenden ein Vefahren zur Herstellung und Aufarbeitung von Enzymen im Rahmen

ihrer Ausbildung vermittelt werden.

Für das Praktikum werden Geräte verwendet, die der Fachhochschule Jena bereits zur Verfügung

standen.

Zu beachten war, dass bei der Optimierung Aufwand und Kosten der Versuche in einem vernünftigen

Verhältnis zu dem Nutzen in Beziehung standen. Um das Verfahren zu optimieren wurde es zunächst mit

aus der Literatur oder empirisch gewonnenen Parametern durchgeführt. Dann wurde versucht den oder

die „bottlenecks“ zu beseitigen. Hierzu wurden nacheinander die Stellen, die den größten Verlust an

Enzym verursachten, optimiert. Dabei durfte jedoch das ideale Kosten-Nutzen-Verhältnis nicht aus den

Augen verloren werden.

Vor Beginn der eigentlichen Versuche wurden die Optimierungsrandbedingungen festgelegt. Dies waren

zum einen die Anzahl der Versuche, die so niedrig wie möglich gehalten werden sollten, um ein geringes

Kosten-Nutzen-Verhältnis zu erreichen. Zum anderen spielt die Dauer der Versuche im Rahmen des

Praktikums eine Rolle. Für die einzelnen Versuche steht nur eine begrenzte Zeit zur Verfügung. Weiterhin

ist es wichtig, dass die einzelnen Schritte und Verfahren von den Studierenden soweit wie möglich

selbständig durchgeführt werden können, um einen höheren Lerneffekt zu gewährleisten. Kann der

Student die Aufgabe nicht allein durchführen, muss das wissenschaftliche Hochschulpersonal dies tun.

Nachdem die Optimierungsrandbedingungen festgelegt wurden, konnten bei denjenigen

Verfahrensschritten, wo es sinnvoll erschien, die hierbei wesentlichen Parameter mit Hilfe einer

faktoriellen Versuchsplanung optimiert werden.

Die Diplomarbeit ist in sechs Kapitel unterteilt. Im 3. Kapitel der Arbeit werden die theoretischen

Grundlagen der Enzyme G6P-DH und HK und des Mikroorganismus Bäckerhefe sowie der einzelnen

Teilverfahren des Herstellungsprozesses dargestellt. Auf die verwendeten Materialien und Methoden wird

im 4. Kapitel eingegangen. Das 5. Kapitel beschreibt die Ergebnisse der Versuche der einzelnen

Teilverfahren. Im 6. Kapitel werden diese Ergebnisse zusammen mit einem selbst hergestellten

Glucosetest diskutiert. Mit einem Vorschlag zur Durchführung eines Praktikums beschäftigt sich der 7.

Abschnitt. Im 8 Kapitel wird ein Kostenvergleich zwischen selbst hergestelltem und gekauftem

Glucosetest angestellt.


3 Theoretische Grundlagen

3.1 Die Enzyme Glucose-6-phosphat Dehydrogenase und Hexokinase

3.1.1 Eigenschaften der Enzyme Glucose-6-phosphat Dehydrogenase und Hexokinase

G6P-DH und HK sind Biokatalysatoren, das heißt, sie beschleunigen chemische Reaktionen ohne das

chemische Gleichgewicht zu verändern, wobei sie nicht verbraucht werden und am Ende der Reaktion

unverändert vorliegen. Sie setzen die Aktivierungsenergie der Reaktion herab, so dass eine

thermodynamisch mögliche Reaktion bei Zimmertemperatur ablaufen kann. Enzymkatalysierte

Reaktionen laufen um den Faktor 108-1020 mal schneller ab als nichtkatalysierte Reaktionen [Schlee, D./

Kleber, H.-P.; 1991]. Ihre Wirkungsweise beruht darauf, dass eine katalytische Reaktion am aktiven

Zentrum des Enzymmoleküls, das aus bestimmten Teilen der Polypeptidkette durch eine besondere

Faltung entsteht, stattfindet. Dabei wird das Substrat am aktiven Zentrum durch Wasserstoff-Brücken,

Ionenanziehung und kovalente Wechselwirkungen gebunden. Emil Fischer beschrieb vor ca. 100 Jahren,

dass Enzym und Substrat räumlich wie Schlüssel und Schloss zusammenpassen [Karlson, P. et al.;

1994].

Die Aktivität eines Enzyms kann, muss aber nicht spezifisch gegenüber einem einzigen Substrat sein.

G6P-DH (EC 1.1.1.49) wirkt hochspezifisch (absolute Substratspezifität), da es nur Glucose-6-phosphat

in Gluconat-6-phosphat umsetzt. Weniger spezifisch reagiert HK (EC 2.7.1.1) (relative Substratspezifität),

das mehrere Monosaccharide (Hexosen) wie Glucose, Fructose und Mannose mit Hilfe des Coenzyms

ATP in die entsprechenden Monosaccharid-6-phosphate umwandelt.

Beide Proteine gehören zu den intrazellulären, konstitutiv gebildeten Enzymen, die nicht ins Nährmedium

ausgeschleust werden [Silva, D.P. /Pessoa, A. et al.; 1994].

G6P-DH wurde Anfang der 30er Jahre von O. Warburg erstmals aus Erythrozyten und Hefe isoliert. Es

kommt in allen Eukaryonten und einigen Bakterien vor und katalysiert im Pentose-Phosphat-Zyklus die

erste biochemische Reaktion, indem es Glucose-6-phosphat in Gluconolacton-6-phosphat (6-Phospho-

gluconolacton) umsetzt. Dieses wird wiederum durch Hydratisierung in Gluconat-6-phosphat (6-Phospho-

gluconat) umgewandelt.

G6P-DH zählt zur Klasse der Oxidoreduktasen, die bei einer katalytischen Reaktion Wasserstoff und

Elektronen übertragen. Es besitzt NADP-frei ein Molekulargewicht von 102 kDa [Yue, R.H. et al.; 1967]

und besteht aus 2 Untereinheiten. Sein isoelektrischer Punkt liegt beim NADP-freien Enzym bei 6,05

[Roche Diagnostics GmbH, 2001]. Heute wird G6P-DH überwiegend aus Saccharomyces cerevisiae, aus

Leuconostoc mesenteroides oder aus rekombinanten E. coli-Zellen gewonnen. In dieser Diplomarbeit

wird nur das Enzym aus Bäckerhefe betrachtet, da es eine größere Substrataffinität zu Glucose-6-

phosphat besitzt als das Enzym aus Leuconostoc mesenteroides [Fritz, U.; 1999].

HK gehört zu den Transferasen, die Gruppenübertragungen katalysieren, und besteht aus 485

Aminosäuren [Internet, Swiss Prot: Protein Data Bank; 2001]. Es wird hauptsächlich aus S. cerevisiae

gewonnen und transferiert in der Glykolyse (Embden-Meyerhof-Abbauweg) im ersten Schritt eine

Phosphatgruppe von ATP auf Glucose.


HK besitzt ein Molekulargewicht von 57 kDa in Citrat/Phosphatpuffer. Es kann unter anderen

Pufferbedingungen Dimere bilden [Roche Diagnostics GmbH; 2001]. Sein isoelektrischer Punkt beträgt

4,7 [Gerhartz, W.; 1990]. Bei der HK aus Saccharomyces cerevisiae können 3 verschiedene

Enzymformen (Isoenzyme: P I, P II und Glucokinase) auftreten.

3.1.2 Die beiden Coenzyme Nikotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat (NADP+) und Adenosin-triphosphat (ATP) sowie Mg2+-Ionen als Cofaktoren

Coenzyme sind niedermolekulare Verbindungen, die bei enzymatisch katalysierten Reaktionen eine

Übertragungsrolle spielen. Sie werden im Gegensatz zu Enzymen während der Reaktion chemisch

verändert und sind somit nicht als Cokatalysatoren anzusehen, sondern als Cosubstrate. Jedoch

unterscheiden sie sich von den Substraten dadurch, dass sie in einem kurzen Zyklus, das heißt meist in

einem Reaktionsschritt, regeneriert werden. Coenzyme treten in 2 unterschiedlichen Formen auf. Wenn

sie dauerhaft binden, werden sie als prosthetische Gruppe bezeichnet, wenn sie nur vorübergehend

reversibel und nicht-kovalent mit dem Enzym reagieren, gelten sie als eigentliche Cosubstrate.

Coenzyme können auch als Carrier (Transportmittel) auftreten. Bei der Glucoseanalytikmethode mit G6P-

DH und HK wirken NADP+ (EC 1.1.1.119) und ATP als solche Coenzyme im Sinne von Cosubstraten

[Fritz, U. ;1999].

Damit der Glucosetest mit den Enzymen G6P-DH und HK funktioniert, brauchen die Enzyme zur

größtmöglichen Aktivitätsentwicklung ferner Magnesium-Ionen in einer Konzentration zwischen

insgesamt 4 und 10 mmol/l, die auch als Cofaktoren bezeichnet werden [Fritz, U.; 1999].

3.1.3 Die Methode der Glucosebestimmung mit Hilfe von Glucose-6-phosphat Dehydrogenase

und Hexokinase

Das Verfahren der enzymatischen Glucosebestimmung beruht auf einem gekoppelten optischen Test.

Zuerst wird die D-Glucose durch das Enzym HK unter Bildung von ADP aus ATP zu Glucose-6-phosphat

(G6P) phosphoryliert. Dann wird G6P durch das Enzym G6P-DH oxidiert und NADP+ wird als

Protonenakzeptor zu NADPH reduziert. Die gebildete Menge an NADPH ist der zu messenden

Glucosemenge direkt proportional [Lottspeich, F./Zorbas, H.; 1998]. Unten sind die entsprechenden

Reaktionsgleichungen angegeben.

HK+Mg2+

1. D-Glucose + ATP ↔ Glucose-6-phosphat + ADP

(Messreaktion)

G6P-DH + Mg2+

2. Glucose-6-phosphat + NADP+ ↔ Gluconat-6-phosphat + NADPH+ + H+

(Indikatorreaktion)


Die durch die Reduktion entstandenen Strukturunterschiede zwischen NADP+ und NADPH ergeben eine

Änderung der Lichtabsorption im nahen UV-Bereich. NADPH zeigt bei 260 nm und bei 340 nm ein

Absorptionsmaximum. NADP+ weist bei 340 nm fast keine Absorption auf [Weide, H.; Pàca, J.; Knorre,

W. A.; 1991].

Abbildung 1 : Absorptionsspektren von NADP+ und NADPH [Fritz, U.; 1999]

Wird nun mit einem Spektralphotometer die Extinktion bei einer Wellenlänge von 340 nm über einen be-

stimmten Zeitraum (ca. 10-30 min) gemessen, kann über die NADPH-Zu- bzw. Abnahme die Glucose-

konzentration bestimmt werden. Mit Hilfe der unten stehenden Formel des Testkites Gluco-quant,

Nummer 1447513 (Roche Diagnostics GmbH) kann die Glucosekonzentration ermittelt werden:

c = 2,89 * ∆E * Verdünnung [1]

∆ E = EProbe - ELeerwert

Unter der Extinktion wird hierbei der Logarithmus aus dem Verhältnis von einfallendem Licht zu

durchgelassenem Licht verstanden.

]2[)Gesetzsches`BeerLambert(dcIIlogE 0 −⋅⋅ε==


3.2 Charakterisierung des Mikroorganismus Bäckerhefe

3.2.1 Allgemeine Betrachtung und Physiologie von Hefen sowie taxonomische Einordnung von S. cerevisiae

Als Mikroorganismus zur Herstellung der Enzyme G6P-DH und HK wurde Bäckerhefe, lat.

Saccharomyces cerevisiae (wörtlich übersetzt „Zuckerpilz“) (Abbildung 2), gewählt. Hefen spielen in der

Biotechnologie eine äußerst wichtige Rolle. Sie werden zur Backhefe-, Wein- und Ethanolherstellung

benutzt. Weiterhin werden viele Enzyme wie zum Beispiel Invertase, G6P-DH, HK oder die

rekombinanten Proteine Insulin, Albumin und Interferon aus ihnen gewonnen.

Hefen sind 5-10 µm groß, rund oder oval und besitzen eine feste Zellwand. Ihre Vermehrung erfolgt

asexuell durch Knospung (Sprossung) oder sexuell durch Teilung. Die Zellen leben einzeln oder in

kleinen Gruppen. Sie können aerob oder anaerob wachsen, auch auf einfachsten Substraten (z.B. Zucker

und Kohlenwasserstoffe, plus Stickstoff). Sie gedeihen ebenfalls bei sehr hohen osmotischen Drücken

und können dadurch den Verderb zuckerhaltiger Produkte verursachen. Hefen wachsen noch bei

niedrigen pH-Werten, wo Bakterien wenig Konkurrenz für sie darstellen. Weiterhin können sie als

Sprosszelle oder Hyphe wachsen. Diese Fähigkeit wird als Dimorphismus bezeichnet [Wainwright, M.;

1992].

Die Hefen zählen zu den Eukaryonten und zu den bis jetzt bestuntersuchtesten Mikroorganismen. Sie

gehören zu den Pilzen und die meisten, darunter auch S. cerevisiae, werden zur Abteilung der

Ascomycota (Schlauchpilze) gerechnet. Hefen sind weiterhin mit sehr wenigen Ausnahmen nicht

pathogen für den Menschen [Sonnleitner, B.; 1997].

Abbildung 2 : S. cerevisiae im Lichtmikroskop, aufgenommen mit einem

Zeiss Axioskop mit einer CCD-Kamera [Internet; 2001]


3.2.2 Stoffwechsel von S. cerevisiae

S. cerevisiae greift zur Energiegewinnung auf die Atmung oder die Gärung zurück. Sie kann je nach

Verfügbarkeit von Sauerstoff zwischen anaerobem und aerobem Abbau des Substrates wechseln

(fakultativer Aerobier). Deshalb benutzt die Fermentationsindustrie S. cerevisiae auch für zwei

verschiedene Produktionsprozesse, zum einen anaerob zur Umwandlung von Zuckern zu Ethanol und

aerob zur Erzeugung von Biomasse [Muttzall, K.; 1993]. Der aerobe Abbauweg ist für die Hefe

energetisch weitaus günstiger und führt zu wesentlich höheren Biomasseausbeuten. Der Vorgang

verläuft schematisch nach folgender biotransformatorischen Gleichung:

αCsHtOu + βO2 + γNvHw → CHxOyNz + δCO2 + εH2O + ∆H [3] Substrat + Sauerstoff + Stickstoff → Biomasse + Kohlendioxid + Wasser + Wärme

Der Prozess der Atmung läuft hierbei folgendermaßen ab:

1) C6H12O6 + 6 O2 → 6 CO2 + 6 H2O -∆H° = -15,6 kJ/g [4] Glucose + Sauerstoff → Kohlendioxid + Wasser

Dabei werden pro Mol Glucose 38 Mol ATP gewonnen. Dies bedeutet eine Energieausbeute von 40 %.

Bei der aeroben Kultivierung entstehen pro kg Glucose 540 g Hefe-Trockenmasse (YX/S = 0,54) mit 8 %

Asche [Mutzall, K.; 1993].

Bei ungenügender Versorgung der Hefezellen mit Sauerstoff schalten die Zellen sofort auf den

anaeroben Abbau der Glucose (Gärung) und bilden Ethanol. Dieser Effekt wird auch nach dem Entdecker

Pasteur (1861) als Pasteur-Effekt bezeichnet.

Bei der anaeroben alkoholischen Gärung, die schematisch nach der Gleichung

2) C6H12O6 → 2 C2H5OH + 2 CO2 -∆H° = -0,46 kJ/g [5] Glucose → Ethanol + Kohlendioxid

abläuft, werden je mol Glucose nur 2 Mol ATP für die Zelle gewonnen. 92 % der freien Enthalpie

verbleiben im Stoffwechselprodukt Ethanol, etwa 6 % werden als Reaktionswärme abgegeben. Für das

Zellwachstum verbleiben nur 2,1 %. Damit ist das anaerobe Wachstum ein sehr unökonomischer Prozess

für die Zelle.

Der Ausbeutekoeffizient für das Produkt Ethanol YE/S beträgt bei der Gärung 0,47. Ein Teil des Substrates

wird nicht zu Ethanol, sondern zu Biomasse und Nebenprodukten, umgesetzt. Für YX/S ergibt sich hierbei

der Wert 0,075 [Muttzall, K.; 1993].

Weiterhin können Hefen bei genügender Versorgung mit Sauerstoff auch auf Ethanol als Substrat

wachsen. Diese Affinität zu zwei verschiedenen Substraten wird als Diauxie bezeichnet.


Es ergeben sich bei Ethanol als Substrat folgende stöchiometrischen Verhältnisse:

3) C2H5OH + 3 O2 → 2 CO2 + 3 H2O -∆H° = -29,7 kJ/ g [6]

Ethanol + Sauerstoff → Kohlendioxid + Wasser

Der Ausbeutekoeffizient (YX/E) hierbei beträgt 0,7 [Muttzall, K.; 1993].

Darüber hinaus wird bei ausreichender Versorgung mit Sauerstoff bei hohen Glucosekonzentrationen

(über 0,1 g/l) nicht nur Biomasse, sondern auch Ethanol, gebildet. Dieser Sachverhalt wird auch

Crabtree-Effekt genannt [Brammer, U.; 1990].

Die Umsatzgleichung hierfür lautet:

4) C6H12O6 + 0,25 O2 → 1,92 C2H5OH + 2,16 CO2 + 0,25 H2O -∆H° = -1,08 kJ/g [7] Glucose + Sauerstoff → Ethanol + Kohlendioxid + Wasser

3.3 Allgemeiner Ablauf des Praktikums zur Herstellung der Enzyme G6P-DH und HK

Um intrazelluläre Enzyme aus Mikroorganismen zu gewinnen, muss der Mikroorganismus, in diesem Fall

die Bäckerhefe, zuerst in Zellkultur vermehrt werden. Dies geschieht bei der industriellen Herstellung von

Enzymen zumeist submers in einem Bioreaktor. Danach folgen mehrere Aufarbeitungsschritte wie z. B.

eine erste Fest/Flüssigtrennung, ein Zellaufschluss, eine weitere Fest/Flüssigtrennung und eine

Feinreinigung der Enzyme. Der Ablauf des Herstellungsprozesses der beiden Enzyme im

Studentenpraktikum mit den der Fachhochschule zur Verfügung stehenden Geräten ist im folgenden

Grundfließbild dargestellt.


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Abbildung 3 : Grundfließbild des Herstellungsprozesses der Enzyme G6P-DH und HK

im Studentenpraktikum

3.4 Theoretische Grundlagen der Satz-, Zulauf- und kontinuierlichen Kultivierung

3.4.1 Allgemeine Betrachtungen zur Satz-, Zulauf- und kontinuierlichen Kultivierung

Am Anfang des Herstellungsprozesses von G6P-DH und HK steht die Kultivierung von S. cerevisiae. Drei

häufig angewandte Prozessführungen in der Biotechnologie zur Gewinnung von Enzymen und Biomasse

sind die Satz-, Zulauf- und kontinuierliche Kultivierung.

Eine Satz-Kultivierung ist eine Betriebsweise bei der während des Zellkulturprozesses weder Substrat

noch Biomasse zu- oder abgeführt werden. Zur Zeit t = 0 wird im Fermenter die sterilisierte Nährlösung

mit einer Reinkultur von Mikroorganismen beimpft und anschließend unter optimalen Wachstums-

bedingungen gehalten. Dabei werden bei aeroben Prozessen Sauerstoff, wenn notwendig Lauge oder

Säure zur Regelung des pH-Wertes und gegebenenfalls Antischaummittel hinzugegeben. Nach

Beendigung der Kultivierung wird entleert und gereinigt, wonach der Bioreaktor für die nachfolgende

Charge zur Verfügung steht. Durch den Stoffwechsel der Zellen ändern sich die Biomasse- und

Metabolitkonzentrationen und die Substratzusammensetzung ständig. Obwohl sich bei der Satz-

Kultivierung der Bäckerhefe

(Gerät: Bioreaktor: Arbeitsvolumen von 2 Litern)

Abtrennung der Hefe von der Kulturbrühe mit Hilfe der Membranmikrofiltration

(Gerät: Überdruckfiltrationsanlage)

Zellaufschluss

(Gerät: Labor-Planeten-Kugelmühle)

Abtrennung der Zellbruchstücke von den Enzymen mit Hilfe der Zentrifugation

(Gerät: Laborzentrifuge)

Feinreinigung der Enzyme mit Hilfe der Anionenaustauschchromatographie

(Gerät: Niederdruckchromatographieanlage)

Lagerung der Enzyme


Kultivierung eine niedrige Produktivität ergibt und der Zellkulturprozess von der vorgelegten Substrat-

konzentration abhängig ist, werden viele industrielle Bioprozesse im Satz-Betrieb ausgeführt, da die

relativ einfache, robuste und flexible Apparatur und die minimale erforderliche Prozessregelung günstige

Prozesskosten ermöglichen und der Einsatz von frischem Impfgut für jede Charge das Infektionsrisiko auf

niedrigem Niveau hält.

Einige Nachteile des Satz-Betriebes können beim sog. Zulauf-Betrieb verringert werden. Hierbei wird im

Anschluss an eine Kultivierungsphase im Satz-Betrieb beim Erreichen einer gewünschten minimalen

Substratkonzentration frisches steriles Substrat stoßweise oder kontinuierlich zugegeben. Im Vergleich

zum Satzprozess wird, falls keine Wachstumsinhibition durch Stoffwechselprodukte auftritt, im gleichen

Zeitraum eine höhere Endbiomassekonzentration und damit eine höhere Produktivität erreicht, da der

Mikroorganismus nicht die Übergangsphase zur stationären Phase durchläuft, in der das Substrat

limitierend wirkt.

Bei einer kontinuierlichen Kultivierung wird dem Fermenter Substrat mit andauernder Zufuhrrate F (t)

zugegeben und gleichzeitig wird ein ebenso großer Strom von der Kulturbrühe entfernt. Es wird

vereinfachend davon ausgegangen, dass der Fermenterinhalt durch gleichmäßige Verteilung von

Substrat und Biomasse homogen gemischt ist. Dadurch ist die Zusammensetzung des Produktstromes

aus dem Bioreaktor identisch mit dem Fermenterinhalt. Mit dem Produktstrom verlässt neben Biomasse

auch nicht umgesetztes Substrat den Bioreaktor, was nachteilig ist und dadurch umgangen werden kann,

dass das Substrat zurückgeführt wird [Muttzall, K.; 1993].

3.4.2 Gleichungen zur Berechnung der Prozesskenngrößen der Satz-Kultivierungen und der kontinuierlichen Zellkulturen

Im nächsten Abschnitt werden die Gleichungen aufgeführt, die zur Berechnung der Prozesskenngrößen

der Kultivierungen notwendig sind. Bei einem unstrukturierten Modell, in dem die Wachstums-

geschwindigkeit der Zellen proportional zur Zellmasse ist, ergibt sich im Satz-Betrieb aus der Gleichung

für die Wachstumsgeschwindigkeit:

Xr

dtdX

X ⋅= [g/(l*h)] [8]

durch Integration das folgende Wachstumsgesetz:

)tr(0

XeXX ⋅⋅= [g/l] [9]

Die Gleichung zeigt das Prinzip des exponentiellen oder logarithmischen Wachstums auf. Solch ein

ungebremstes Wachstum ist nur für ein begrenztes Intervall möglich, da durch äußere Einflüsse (z.B.

Substratverbrauch, gebildete Hemmstoffe, Beeinträchtigung des Stofftransportes durch zu hohe

Biomassekonzentration) nach einiger Zeit die Wachstumsrate abnimmt und sich schließlich ein Stillstand

des Wachstums einstellt.


Die Auflösung der obigen Gleichung nach der spezifischen Wachstumsrate liefert:

t

)XXln(

r 0X = [h-1] [10]

Für den Satz-Betrieb gilt bei optimaler Sauerstoffsättigung die Monod-Kinetik, mit:

]S[K

]S[rrS

max,XX +⋅= [h-1] (Monod - Gleichung) [11]

Hierbei ist die spezifische Wachstumsrate rX einer homogenen Kultur konstant und maximal, solange die

erforderlichen Nährstoffe (Substrat, Nährsalze, Spurenelemente) im Überschuss vorliegen. Ist die

Verfügbarkeit eines Substrates begrenzt (limitierendes Substrat), so verringert sich die spezifische

Wachstumsrate gemäß der Gleichung [11]. Wenn das gesamte Substrat verbraucht ist und auch keine

alternativen Nährstoffe zur Verfügung stehen, wird rX = 0, das Wachstum kommt zum Stillstand.

Der Substratverbrauch im Satz-Betrieb kann über die spezifische Substratverbrauchsrate ermittelt

werden:

XrdtdS

S ⋅−= [g/(l*h)] [12]

Die Zeitdauer bis zum Verbrauch des Substrates errechnet sich aus:

X

0

S/X0

r

)1X

Y)SS((lnt

+⋅−

= [h] [13]

Der Ertragskoeffizient (Ausbeutekoeffizient) im Satzbetrieb wird aus dem Verhältnis der spezifischen

Wachstumsrate zur spezifischen Substratverbrauchsrate bestimmt:

S

XS/X r

rY = [-] [14]

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