Optimierung und Anwendung des Ligandenfischens an...

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Optimierung und Anwendung des Ligandenfischens an antiplasmoidalen Targets (DXR und GDH) und Thrombin Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) dem Fachbereich Pharmazie der Philipps-Universität Marburg vorgelegt von Pia Konstanze An aus Berlin Marburg/Lahn 2006

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Optimierung und Anwendung des

Ligandenfischens an antiplasmoidalen Targets

(DXR und GDH) und Thrombin

Dissertation

zur

Erlangung des Doktorgrades

der Naturwissenschaften

(Dr. rer. nat.)

dem

Fachbereich Pharmazie

der Philipps-Universität Marburg

vorgelegt von

Pia Konstanze An

aus Berlin

Marburg/Lahn 2006

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Vom Fachbereich Pharmazie

Der Philipps-Universität Marburg/Lahn

Als Dissertation angenommen am: 23.05.2006

Tag der mündlichen Prüfung: 24.05.2006

Erstgutachter: Prof. Dr. R. Matusch

Zweitgutachter: Prof. Dr. W. Hanefeld

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Die vorliegende Arbeit entstand am Fachbereich Pharmazie im Institut für

Pharmazeutische Chemie der Philipps-Universität Marburg auf Anregung und unter

Leitung von

Herrn Prof. Dr. Rudolf Matusch

Für die interessanten Themengebiete, seine stets großzügige sowohl finanzielle als auch

persönliche Unterstützung, die Vermittlung seines analytischen Wissens sowie die

Aufnahme in seinen Arbeitskreis möchte ich ihm an dieser Stelle sehr herzlich danken.

Weitere Danksagungen

Der Firma Jomaa Pharmaka GmbH, vor allem aber Frau Silke Sanderbrand, Frau Ann-

Kristin Kollas und Herrn Dr. Jochen Wiesner danke ich für die gute Zusammenarbeit

und die Durchführung von Aktivitätsassays mit DXR.

Christof Werner, AG Klebe der Philipps-Universität Marburg, danke ich für die

Durchführung von Aktivitätsassays mit GDH.

Christof Gerlach, AG Klebe der Philipps-Universität Marburg, möchte ich für viele

interessante Anregungen sowie ihm und Christian Sohn für die Durchführung diverser

Aktivitätsassays mit Thrombin und Trypsin danken.

Christian Rack danke ich für die ausführliche Einarbeitung in das amidolytische

Testsystem und das komplexe Themengebiet Thrombin, die unzähligen Gespräche und

wertvollen Anregungen, seine Unterstützung bei der Erstellung sowie das

Korrekturlesen von Teilen dieser Arbeit.

Allen Mitarbeitern und Mitarbeiterinnen der Philipps-Universität Marburg danke ich für

die Unterstützung bei der Erstellung dieser Arbeit.

Floris van Elsäcker, Reiner Müller und Radostan Riedel danke ich für Ihre ständige

Hilfsbereitschaft und fröhliche Stunden im Labor.

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Meinen Literaturarbeitern und Wahlpflichtpraktikanten Bettina Nauth und Mike Kring,

Margarethe Müller und Claus Freitag, Nan-Si Chan und Annett Fischer sowie Uta Bauer

und Duc Hop Tran möchte ich für ihre engagierte Mitarbeit und viele angenehme

Stunden danken.

Meinen aktuellen und ehemaligen Kollegen und Kolleginnen im Arbeitskreis und im

Institut danke ich für die gute Zusammenarbeit im und die abwechslungsreiche

Freizeitgestaltung außerhalb des Labors. Dabei möchte ich besonders Tanja Buß,

Jarmila Jedelská, Sonja Schleich, Sascha Illgner, Tim Larsen, Khaled Shannoon und

Oliver Wachsmuth sowie die AG Diederich und ihre Kaffeemaschine erwähnen.

Daniela Heller möchte ich für viele anregende Diskussionen sowie das nette und

unkomplizierte WG-Leben danken.

Meinen Geschwistern Jennifer An und Sebastian An danke ich für das Korrekturlesen

von Teilen dieser Arbeit.

Meinen Eltern Jeong-Ja An und Haing-Kil An, meinen Geschwistern Jennifer An und

Sebastian An sowie Jean-Christophe L’Hermite bin ich für den Rückhalt und die nie

endende, liebevolle Unterstützung in allen Phasen der Arbeit von Herzen dankbar.

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Für meine Eltern und Geschwister

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„Zwei Dinge sind zu unserer Arbeit nötig:

Unermüdliche Ausdauer

und

die Bereitschaft,

etwas, in das man viel Zeit und Arbeit gesteckt hat,

wieder wegzuwerfen.“

Albert Einstein

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Inhaltsverzeichnis I

Inhaltsverzeichnis

THEORETISCHER TEIL

1 Einleitung und Aufgabenstellung ............................................................................. 1

1.1 Einleitung ......................................................................................................... 1

1.2 Aufgabenstellung ............................................................................................. 3

2 Verwendete Testsysteme .......................................................................................... 5

2.1 Ligandenfischen ............................................................................................... 5

2.1.1 Ligandenfischen allgemein .............................................................................. 5

2.1.2 Durchführung ................................................................................................... 6

2.1.2.1 Inkubation......................................................................................................... 6

2.1.2.2 Filtration ........................................................................................................... 6

2.1.2.3 Waschung ......................................................................................................... 6

2.1.2.4 Freisetzung ....................................................................................................... 6

2.1.2.5 Schematische Darstellung ................................................................................ 7

2.1.2.6 Graphische Darstellung .................................................................................... 8

2.2 Amidolytischer Aktivitätsassay...................................................................... 10

2.3 Gerbstofffällungsassay ................................................................................... 11

2.3.1 Gerbstofffällungsassay allgemein .................................................................. 11

2.3.2 Durchführung ................................................................................................. 11

2.3.2.1 Inkubation....................................................................................................... 11

2.3.2.2 Waschung ....................................................................................................... 12

2.3.2.3 Freisetzung ..................................................................................................... 12

2.3.2.4 Schematische Darstellung .............................................................................. 13

2.3.2.5 Graphische Darstellung .................................................................................. 13

3 Untersuchte Pflanzen .............................................................................................. 14

3.1 Apiaceaen ....................................................................................................... 14

3.1.1 Apiaceaen allgemein ...................................................................................... 14

3.1.2 Anis ................................................................................................................ 14

3.1.3 Fenchel ........................................................................................................... 15

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II Inhaltsverzeichnis

3.1.4 Koriander ........................................................................................................15

3.1.5 Kümmel ..........................................................................................................16

3.1.6 Gartenpetersilie...............................................................................................16

3.2 Gartenkresse ...................................................................................................17

3.3 Knoblauch.......................................................................................................17

TEIL I

4 Malaria ....................................................................................................................19

4.1 Malaria allgemein ...........................................................................................19

4.2 Malariazyklus .................................................................................................21

4.2.1 Ungeschlechtlich.............................................................................................21

4.2.2 Geschlechtlich.................................................................................................21

4.3 Krankheitsverlauf ...........................................................................................21

4.4 Behandlung und Vorbeugung der Malaria .....................................................23

4.4.1 Antimalariamittel ............................................................................................23

4.4.2 Immunisierung................................................................................................25

4.4.3 Vektorkontrolle...............................................................................................25

5 Verwendete Targets.................................................................................................27

5.1 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-reduktoisomerase .......................................27

5.1.1 DXR allgemein ...............................................................................................27

5.1.1.1 Mevalonat-abhängiger Isoprenoidbiosyntheseweg ........................................27

5.1.1.2 Methyl-Erythritol-Phosphat-Stoffwechselweg (MEP): ..................................28

5.1.2 Struktur und Funktion der DXR .....................................................................30

5.1.2.1 Struktur ...........................................................................................................30

5.1.2.2 Funktion..........................................................................................................31

5.2 Glutamatdehydrogenase .................................................................................32

5.2.1 Glutamatdehydrogenase allgemein.................................................................32

5.2.2 Struktur und Funktion.....................................................................................32

5.2.2.1 Struktur ...........................................................................................................32

5.2.2.2 Funktion..........................................................................................................34

6 Untersuchung der Wirkung von Clomazone auf einfache Gartenkresse

bezüglich seines Einflusses auf den alternativen Isoprenoidbiosyntheseweg.........36

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Inhaltsverzeichnis III

6.1 Einleitung ....................................................................................................... 36

6.2 Herstellung der Kresseextrakte ...................................................................... 37

6.2.1 Gesamtextrakt................................................................................................. 37

6.2.2 Selektive Extrakte .......................................................................................... 37

6.2.3 Analytische Extrographie............................................................................... 38

6.3 Vergleich der Inhaltsstoffe von behandelter mit unbehandelter Kresse ........ 38

6.4 Fischen in Kresseextrakten............................................................................. 39

6.4.1 Fischbedingungen........................................................................................... 39

6.4.2 Fischen im Gesamtextrakt .............................................................................. 40

6.4.3 Fischen in den selektiven Extrakten............................................................... 42

6.4.4 Fischen in Fraktionen der analytischen Extrographie .................................... 42

6.5 Aktivitätsassay ............................................................................................... 43

6.6 Zusammenfassung und Diskussion ................................................................ 43

6.7 Ausblick ......................................................................................................... 44

7 Mögliche antiplasmoidale Inhaltsstoffe von Knoblauch ........................................ 46

7.1 Einleitung ....................................................................................................... 46

7.2 Fischen aus einem methanolischen Knoblauchgesamtextrakt ....................... 46

7.3 Fischen aus den selektiven Knoblauchextrakten............................................ 49

7.4 Aktivitätsassay der GDH................................................................................ 51

7.5 Expression von GDH ..................................................................................... 51

7.6 Fischen mit DXR............................................................................................ 51

7.7 Zusammenfassung und Diskussion ................................................................ 51

TEIL II

8 Blutstillung.............................................................................................................. 55

8.1 Blutstillung allgemein .................................................................................... 55

8.2 Primäre Hämostase......................................................................................... 55

8.2.1 Vaskuläre Blutstillung.................................................................................... 55

8.2.2 Zelluläre Blutstillung (Plättchenadhäsion)..................................................... 56

8.3 Sekundäre Hämostase (Plasmatische Blutgerinnung).................................... 57

8.3.1 Allgemein ....................................................................................................... 57

8.3.2 Intrinsisches (endogenes, intravaskuläres) System ........................................ 57

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IV Inhaltsverzeichnis

8.3.3 Extrinsisches (exogenes, extravaskuläres) System.........................................58

8.4 Inhibition der Blutgerinnung ..........................................................................60

8.5 Fibrinolyse ......................................................................................................62

8.5.1 Aktivierung .....................................................................................................62

8.5.2 Hemmung .......................................................................................................64

9 Atherosklerose.........................................................................................................65

9.1 Allgemeines ....................................................................................................65

9.2 Rolle des LDL.................................................................................................65

9.3 Thrombose ......................................................................................................66

10 Fettsäuren ................................................................................................................67

10.1 Fettsäuren allgemein.......................................................................................67

10.1.1 Struktur und Eigenschaften.............................................................................67

10.1.2 Fettsäurebiosynthese.......................................................................................68

10.1.3 Fettsäureabbau ................................................................................................68

10.2 Ungesättigte Fettsäuren ..................................................................................68

10.2.1 Allgemeines ....................................................................................................68

10.2.2 Biosynthese der ω6-Fettsäuren ausgehend von Linolsäure ............................70

10.2.3 Biosynthese der ω3-Fettsäuren ausgehend von α-Linolensäure.....................71

10.2.4 Physiologische Bedeutung der ungesättigten Fettsäuren im Allgemeinen.....71

10.2.4.1 Effekte auf die Membranstruktur und -funktion.............................................71

10.2.4.2 Einfluss auf die Eicosanoide...........................................................................72

10.2.5 Physiologische Bedeutung der ungesättigten Fettsäuren bei Herz-

Kreislauferkrankungen ...................................................................................74

10.2.5.1 Senkung des Plasmalipidspiegels ...................................................................75

10.2.5.2 Atherosklerose ................................................................................................76

10.2.5.3 Thrombose ......................................................................................................76

11 Thrombin.................................................................................................................78

11.1 Thrombin allgemein........................................................................................78

11.2 Struktur und Funktion.....................................................................................78

11.2.1 Struktur ...........................................................................................................78

11.2.1.1 Allgemein .......................................................................................................78

11.2.1.2 Fibrinogenerkennungsregion ..........................................................................80

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Inhaltsverzeichnis V

11.2.1.3 Heparinbindestelle.......................................................................................... 80

11.2.2 Funktion von Thrombin ................................................................................. 81

12 Antikoagulanzien .................................................................................................... 84

12.1 Vitamin-K-Antagonisten (VKA).................................................................... 84

12.2 Heparine ......................................................................................................... 84

12.3 Direkte Thrombin Inhibitoren ........................................................................ 85

12.4 Faktor-Xa-Inhibitoren .................................................................................... 87

12.5 Neuere Entwicklungen ................................................................................... 87

12.5.1 TF/FVIIa-Komplex ........................................................................................ 87

12.5.2 Aktiviertes Protein C (aPC)............................................................................ 88

12.5.3 Thrombomodulin (TM) .................................................................................. 88

13 Optimierung der Testsysteme für Thrombin .......................................................... 89

13.1 Ligandenfischen mit humanem Thrombin im Vergleich zu Fischen mit

Rinderthrombin .............................................................................................. 89

13.1.1 Einleitung ....................................................................................................... 89

13.1.2 Ligandenfischen von Reinsubstanzen ............................................................ 90

13.1.3 Ligandenfischen aus einem Inhibitorgemisch................................................ 93

13.1.4 Ligandenfischen aus einer Substanzbibliothek .............................................. 95

13.2 Optimierung des Aktivitätsassays für humanes Thrombin ............................ 97

13.2.1 Einleitung ....................................................................................................... 97

13.2.2 Einfluß der Enzymkonzentration ................................................................... 98

13.2.3 Einfluss des Serumalbumins ........................................................................ 100

13.3 Zusammenfassung........................................................................................ 101

14 Hemmwirkung von Apiaceaen auf Thrombin ...................................................... 103

14.1 Einleitung ..................................................................................................... 103

14.2 Herstellung der Apiaceaenfrüchte-Extrakte ................................................. 104

14.3 Destillation von ätherischem Öl aus Apiacean ............................................. 104

14.4 Aktivitätsassay mit den selektiven Extrakten ............................................... 104

14.5 Aktivitätsassay mit dem ätherischen Öl........................................................ 106

14.6 Untersuchung weiterer Extrakte................................................................... 107

14.7 Aktivitätsassay mit den identifizierten Fettsäuren ....................................... 111

14.8 Hydrolyse des Petersilienfrüchteextraktes ................................................... 112

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VI Inhaltsverzeichnis

14.9 Ligandenfischen in Apiaceaenfrüchteextrakten ...........................................113

14.10 Gerbstofffällungsassay des Korianderextraktes ...........................................114

14.11 Zusammenfassung und Diskussion...............................................................116

15 Hemmwirkung weiterer Substanzen auf Thrombin ..............................................119

15.1 Einleitung......................................................................................................119

15.2 Aktivitätsassay verschiedener Fettsäuren und -derivate...............................120

15.3 Aktivitätsassay mit Arachidonoyl-p-Nitroanilin ..........................................122

15.4 Aktivitätsassay verschiedener COX-Inhibitoren ..........................................123

15.5 Zusammenfassung und Diskussion...............................................................124

16 Zusammenfassung.................................................................................................126

EXPERIMENTELLER TEIL

1 Allgemeine Methoden und Materialien.................................................................129

1.1 Geräte............................................................................................................129

1.2 HPLC Bedingungen......................................................................................132

1.2.1 Analytische HPLC:.......................................................................................132

1.2.2 Kapillar HPLC:.............................................................................................133

1.3 Drogen ..........................................................................................................135

1.4 Chemikalien..................................................................................................135

1.5 Puffer, Lösungen und Medien ......................................................................137

1.5.1 DXR..............................................................................................................137

1.5.2 GDH..............................................................................................................138

1.5.3 Thrombin: .....................................................................................................139

1.6 Materialien....................................................................................................140

2 Extrakte .................................................................................................................141

2.1 Gesamtextrakte .............................................................................................141

2.1.1 Kresse ...........................................................................................................141

2.1.2 Knoblauch.....................................................................................................141

2.1.3 Apiaceaenfrüchte ..........................................................................................141

2.2 Selektive Extrakte.........................................................................................141

2.2.1 Kresse ...........................................................................................................141

2.2.2 Knoblauch.....................................................................................................142

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Inhaltsverzeichnis VII

2.2.3 Koriander...................................................................................................... 142

2.2.4 Kümmel........................................................................................................ 143

2.3 Analytische Extrographie............................................................................. 143

2.3.1 Kresse ........................................................................................................... 143

2.4 Ätherisches Öl .............................................................................................. 144

2.4.1 Allgemeines.................................................................................................. 144

2.4.2 Koriander...................................................................................................... 144

2.4.3 Kümmel........................................................................................................ 144

2.5 Methanol-Pentan-Extrakte ........................................................................... 144

2.5.1 Koriander...................................................................................................... 144

3 Ligandenfischen.................................................................................................... 145

3.1 Allgemeines.................................................................................................. 145

3.2 Optimierung für DXR .................................................................................. 145

3.3 Fischen in Kresseextrakten........................................................................... 146

3.3.1 Gesamtextrakte............................................................................................. 146

3.3.2 Selektive Extrakte ........................................................................................ 147

3.3.3 Analytische Extrographie Fraktionen........................................................... 147

3.4 Fischen in Knoblauchextrakten.................................................................... 148

3.4.1 Gesamtextrakt............................................................................................... 148

3.4.2 Selektive Extakte.......................................................................................... 148

3.5 Vergleich von Fischen mit humanem Thrombin gegen Rinderthrombin .... 149

3.5.1 Inhibitoren einzeln........................................................................................ 149

3.5.2 Substanzbibliothek ....................................................................................... 150

3.5.3 Inhibitoren im Gemisch................................................................................ 151

3.6 Fischen im Korianderextrakt ........................................................................ 151

4 Aktivitätsassays .................................................................................................... 153

4.1 GDH.............................................................................................................. 153

4.1.1 Hinreaktion ................................................................................................... 153

4.1.2 Rückreaktion................................................................................................. 153

4.2 Thrombin ...................................................................................................... 154

4.2.1 Allgemeines .................................................................................................. 154

4.2.2 Optimierung des Assays für humanes Thrombin ......................................... 155

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VIII Inhaltsverzeichnis

4.2.3 Apiaceaenfrüchteextrakte .............................................................................155

4.2.4 Ätherisches Öl ..............................................................................................155

4.2.5 Fettsäuren......................................................................................................156

4.2.6 Cyclooxygenasehemmer...............................................................................156

4.2.7 Selektivität ....................................................................................................156

5 Gerbstofffällungsassay ..........................................................................................157

5.1 Allgemeines ..................................................................................................157

5.2 Anwendungen ...............................................................................................157

6 Expression der GDH .............................................................................................158

6.1 Vorkultur.......................................................................................................158

6.2 Expression.....................................................................................................158

6.3 Aufreinigung.................................................................................................158

7 Identität der Fettsäuren..........................................................................................160

ANHANG

Anhänge ......................................................................................................................161

Literaturverzeichnis.......................................................................................................171

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Abkürzungen und Akronyme IX

Abkürzungen und Akronyme

AA Arachidonsäure

Abb. Abbildung

ACT Artemisinin-based Combination Treatments

ADP Adenosindiphosphat

aPC Aktiviertes Protein C

Arg L-Arginin

BSA Bovines Serumalbumin

CapLC Kapillarhochleistungsflüssigchromatographie

CoA Coenzym A

COX Cyclooxygenase

CYP Cytochrom P

Da/kDa Dalton/ Kilodalton

DDT Dichlordiphenyltrichlorethan

DHA Docosahexaensäure

DMAPP Dimethylallylpyrophosphat

DNA Desoxyribonukleinsäure

DXR 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-reduktoisomerase

EI Elektronenstoss-Ionisation

EPA Eicosapentaensäure

EU Europäische Union

FRS Fibrinogenerkennungsregion

G6PD Glucose-6-phosphatdehydrogenase

GC Gaschromatographie

GDH Glutamatdehydrogenase

GFA Gerbstofffäallungsassay

Gly L-Glycin

GP Glykoprotein

GR Glutathionreduktase

GSH Glutathion (reduziert)

GSSH Glutathiondisulfid

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X Abkürzungen und Akronyme

HBS Heparinbindestelle

HDL High Density Lipoprotein

His L-Histidin

HMG-CoA Hydroxymethylglutaryl-CoA

HMWK High Molecular Weight Kininogene

HPLC Hochleistungsflüssigchromatographie

HSA Humanes Serumalbumin

HTS High Throughput Screening

IE Internationale Einheiten

IPP Isopentenylphosphat

Ki Geschwindigkeitskonstante der enzymatischen Reaktion in

Gegenwart eines Inhibitors

LDL/ ox LDL Low Density Lipoprotein/ oxidierte Form

LOX Lipoxygenase

MeOH Methanol

MEP-Weg Methylerythritolphosphat-Weg der Isoprenoidbiosynthese

MS Massenspektrometrie

NADP Nicotinamid Adenin Dinucleotid Phosphat

NFκB Nuclear Factor κB

NIH-U Einheiten des National Institut of Health, Bethesda (USA)

NMR Nuclear Magnetic Resonance (Spectroscopy)

NMWL Norminal Molecular Weight Limits

PAF Blutplättchenaktivierender Faktor

PAR Protease Aktivierter Rezeptor

PDA Photodiodenarray

PfEMP1 Plasmodium falciparum Erythrozyten Membranprotein 1

pH Negativer dekadischer Logarithmus der Protonenkonzentration

p-NA para-Nitroanilin

PPAR Peroxisome Proliferator Activated Receptor

Pro L-Prolin

PVP Polyvinylpyrrolidon

sp. Species, Art

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Abkürzungen und Akronyme XI

ssp. Subspecies, Unterart

TF Tissue Factor

TFPI Tissue Factor Pathway Inhibitor

TFA Trifluoressigsäure

TM Thrombomodulin

Tos para-Toluensulfonat

tR Retentionszeit

TRIS Tris-hydroxymethyl-aminomethan

UV Ultraviolett

VLDL Very Low Density Lipoprotein

vWF von Willebrand Faktor

WHO World Health Organisation

ZNS Zentrales Nervensystem

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THEORETISCHER

TEIL

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Theoretischer Teil - 1 Einleitung und Aufgabenstellung 1

1 Einleitung und Aufgabenstellung

1.1 Einleitung

Alle 30 Sekunden stirbt in Afrika ein Kind an Malaria. Damit ist es eines von weltweit

über eine Million Todesopfern, die diese Krankheit jährlich fordert. Malaria ist nach

AIDS die zweithäufigste Todesursache in den Entwicklungsländern, denn die meisten

Infizierten beider Krankheiten leben in den ärmsten Regionen der Welt [1]. Aber auch

in den Industrienationen ist die Malaria wieder auf dem Vormarsch, was sowohl durch

Reisende ohne ausreichenden Malariaschutz, als auch durch Moskitos im Reisegepäck

zustande kommt. Man spricht hier auch von der so genannten Airport-Malaria. Jährlich

infizieren sich laut der WHO etwa 30.000 Touristen weltweit [2]. Auf Grund der

mittlerweile hohen Resistenz gegen die vorhandenen Wirkstoffe besteht ein ständiger

Bedarf an neuen Antimalariamitteln. Hinzu kommt, dass die am schwersten betroffenen

Länder auch diejenigen sind, die sich keine eigene Forschung leisten können. Weltweit

wird zwar ununterbrochen an neuen Antimalariamitteln gearbeitet, jedoch stellt

Schwarzafrika keinen lukrativen Absatzmarkt dar. Die Forschung ist somit auf

alternative Finanzierungen beispielsweise durch karitative oder internationale

Organisationen wie der WHO angewiesen [3]. Im Mittelpunkt der Entwicklungsarbeiten

stehen vor allem das Auffinden und Erforschen neuer Targets, für die es noch keinen

Wirkstoff und damit auch noch keine Resistenz gibt.

Während die Bevölkerung in Entwicklungsländern hauptsächlich an

Infektionskrankheiten wie Malaria oder AIDS leidet, treten in Ländern ab einem

gewissen Entwicklungsstand Herz-Kreislauferkrankungen in den Vordergrund [4]. Die

Verbesserung von Ernährung und Hygienebedingungen resultiert im Allgemeinen in

einer verbesserten Lebensqualität und damit -verlängerung, jedoch führt eine solche

Entwicklung auch zu erhöhten Blutfettwerten und daraus folgend zu kardiovaskulären

Beschwerden. Die Gründe hierfür liegen in einer falschen Ernährung, zu geringer

körperlicher Aktivität und Rauchen. Ohne diese Risikofaktoren sind thrombosebedingte

Sterbefälle selten [5, 6]. In den westlichen Nationen stellt die häufigste Todesursache

die Thrombose als Hauptkomplikation der Atherosklerose dar [7]. Abgesehen von

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2 Theoretischer Teil - 1 Einleitung und Aufgabenstellung

Schwarzafrika werden im Jahr 2020 ischämische Herzkrankheiten und cerebrovaskuläre

Erkrankungen die weltweite Haupttodesursache sein [4]. Laut dem Statistischen

Bundesamt lassen sich im Jahr 2004 in der Bundesrepublik 45% der Todesfälle auf die

Folgen von Erkrankungen des Herz-Kreislaufsystems zurückführen [8]. Die derzeit zur

Verfügung stehenden Antikoagulantien erfordern auf Grund eines schmalen

therapeutischen Fensters eine individuelle Dosierung bei gleichzeitigem Monitoring

oder weisen eine ungünstige Applikationsart auf. Somit sind sie nicht unbedenklich in

der breiten Masse anwendbar. Mit Ximelagatran wurde zwar im Juni 2004 in

Deutschland der erste oral applizierbare Thrombininhibitor zugelassen, in der

Langzeitstudie EXTEND hat er sich jedoch nicht bewähren können. In einem Fall kam

es vor kurzem zu einer schweren, glücklicherweise reversiblen Leberschädigung,

woraufhin sich der Hersteller entschloss, den Arzneistoff vom Markt zu nehmen [9].

Nach wie vor herrscht also ein Bedarf an Antikoagulantien, vor allem an oral

verfügbaren Thrombinhemmern.

Obwohl volkstümlich verwendete Pflanzen ehemals eine große Rolle in der Auffindung

neuer Leitstrukturen spielten, wandten sich die großen Firmen zu Beginn der 1990er

Jahre der weniger komplizierten und automatisierbaren kombinatorischen Chemie zu.

Da diese den Anforderungen, viele neue Leitstrukturen zu liefern, nicht gerecht wurde,

wird ihr heute eher im Bereich der Strukturoptimierung eine führende Rolle

zugesprochen. Bei der Suche nach neuen Leitstrukturen dagegen wird der Fokus derzeit

vermehrt auf Naturstoffe gelegt [10, 11]. Diese werden definiert als chemische

Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht, die von biologischen Organismen

gebildet werden [12]. Nach der Sequenzierung des menschlichen Genoms ist der

biologische Strukturraum, der die Proteinbindungsstelle darstellt, noch immer

größtenteils unbekannt. Somit ist es auch nicht möglich, Verbindungen gezielt zu

synthetisieren. Um dennoch Bibliotheken mit einer höheren Trefferwahrscheinlichkeit

zu erhalten, eignen sich Naturstoffe als gute Startpunkte, da sie eine ungeahnte

Diversität beinhalten, die in rein chemischen Bibliotheken nicht vorstellbar ist. Zudem

sind sie biologisch bereits validiert. Oftmals verfügen sie auch über privilegierte

Strukturen, das heißt sie können mit verschiedenartigen Proteinrezeptorbindungsstellen

Wechselwirkungen eingehen. Sie werden von Proteinen synthetisiert oder modifiziert

und somit an diese gebunden, während sie auf Grund ihrer eigenen biologischen

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Theoretischer Teil - 1 Einleitung und Aufgabenstellung 3

Funktion auch an andere Proteine binden können [11-13]. Aber auch Pflanzen als

Bibliotheken sind von steigendem Interesse. Die Datenbank NAPRALET katalogisiert

ethnomedizinische Berichte über etwa 14.300 Pflanzen, von denen 58% bislang noch

nie untersucht wurden. Obwohl die Indikation von 74% der Arzneistoffe, die aus

Pflanzeninhaltstoffen entwickelt wurden und heute medizinisch eingesetzt werden,

ihren ethnopharmakologischen Verwendungen folgt, gibt es derzeit keine große Firma

in den Industrienationen, die in ihrer Suche nach neuen Leitstrukturen auch

ethnopharmakologische Aspekte berücksichtigt [14]. Dabei könnten Pflanzen auf Grund

traditioneller Erfahrungen oder ihrer Toxizität für bestimmte Fragestellungen gezielt

ausgewählt werden, was ehemals schon viele Wirkstoffe hervorgebracht hat. Es ist also

zu erwarten, dass in Zukunft wieder Pflanzen und Naturstoffe zur Findung neuer

Leitstrukturen in den Vordergrund treten [15].

1.2 Aufgabenstellung

Im Rahmen dieser Arbeit werden mit der Methode des Ligandenfischens verschiedene

Pflanzen im Hinblick auf mögliche antiplasmoidale und Thrombinhemmende

Inhaltsstoffe untersucht. Dabei stehen für Malaria folgende Targets, die unterschiedliche

Ansatzpunkte verfolgen, zur Verfügung:

Die 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-reduktoisomerase (DXR) ist ein kürzlich

entschlüsseltes Enzym des erst spät entdeckten Mevalonat-unabhängigen

Isoprenoidbiosynthesewegs [15a]. Da dieser nicht im tierischen Organismus vorkommt,

jedoch im Plasmodium falciparum für dessen Überleben notwendig ist, stellt es ein sehr

gutes Target gegen die Malaria dar, ohne den Menschen zu schädigen. Dafür wurde mit

der Gartenkresse eine Pflanze ausgewählt, die gegen das Herbizid Clomazone

empfindlich ist. Dieses Herbizid stellt zwar keinen direkten Inhibitor der DXR dar, aber

es greift dennoch in den alternativen Isoprenoidbiosyntheseweg ein. Es sollte deshalb

mittels des Ligandenfischens untersucht werden, ob ein gegen DXR wirksamer

Metabolit entsteht.

Die Glutamatdehydrogenase (GDH) ist ebenfalls erst seit kurzem strukturell aufgeklärt.

Im Plasmodium falciparum dient sie der Bereitstellung des vermehrt benötigten

NADPHs. Ohne dieses Coenzym ist der Parasit nicht in der Lage zu wachsen. Weiterhin

können vermehrt anfallende zytotoxische Metaboliten nicht abgebaut werden und

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4 Theoretischer Teil - 1 Einleitung und Aufgabenstellung

führen damit zum Untergang des Plasmodiums. Da die Glutamatdehydrogenase

strukturell nur sehr geringe Ähnlichkeit mit der menschlichen GDH aufweist, stellt auch

sie ein Erfolg versprechendes Target dar. Auf Grund neuer Hinweise auf die

antiplasmoidale Wirksamkeit pflanzlicher Disulfide aus Knoblauch, die vermutlich auf

einem Eingriff in die Redox-Homöostase der Zellen beruht, wurde Knoblauch für

Untersuchungen mit der GDH ausgewählt.

Weiterhin stand zur Auffindung von Thrombininhibitoren das humane Thrombin der

Firma Aventis zur Verfügung. Die Sequenzhomologie zwischen humanem und

Rinderthrombin beträgt für die biologisch relevanten Bereiche in der aktivierten Form

87%. Trotz allem lassen sich die Ergebnisse nicht ohne weiteres aufeinander übertragen.

Da Thrombin mit einer Vielzahl an unterschiedlichen Molekülen Wechselwirkungen

eingehen kann, die mitunter einen erheblichen Einfluss auf Struktur und/oder Aktivität

haben, wurde das mit Rinderthrombin etablierte Ligandenfischen mit humanem

Thrombin optimiert.

Auf Grund der gezeigten inhibitorischen Aktivität in einem Screening [16] wurden

Apiaceaenfrüchte untersucht. Dabei stellte sich heraus, dass Fettsäuren das wirksame

Prinzip in Apiaceaen darstellen. Weitere Untersuchungen mit Fettsäuren ergaben eine

Notwendigkeit der Carboxylfunktion für eine Wechselwirkung mit der katalytischen

Triade. Schließlich wurden auf Grund der Überlegung, dass Arachidonsäure auf der

einen Seite ein Substrat der Cyclooxygenasen darstellt, andererseits aber auch eine

Thrombininhibition zeigt, auch COX-Hemmer einem Test unterzogen. Im Resultat

zeigte lediglich Indometacin eine gewisse Hemmung.

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Theoretischer Teil - 2 Verwendete Testsysteme 5

2 Verwendete Testsysteme

2.1 Ligandenfischen

2.1.1 Ligandenfischen allgemein

Auf der Suche nach neuen Leitstrukturen stellt das Auffinden von wirksamen

Komponenten aus komplexen Bibliotheken einen sehr zeitaufwendigen Faktor dar.

Solche komplexen Bibliotheken können z.B. durch kombinatorische Chemie

synthetisch erstellte Bibliotheken oder auch Naturstoffextrakte sein, deren Inhaltsstoffe

sich durch eine hohe Diversität auszeichnen.

Das Screening auf biologische Aktivität dieser umfangreichen Bibliotheken erfolgt in

der Regel mit Hochdurchsatzscreening (HTS), welches nicht nur mit einem großen

apparativen Aufwand verbunden ist, sondern auch viel Zeit und ein hohes Budget

erfordert. Sämtliche Faktoren sind zumeist nicht an einer Hochschule gegeben. Somit

stellt das Ligandenfischen [17], im Folgenden auch als Fischen bezeichnet, eine

sinnvolle, insbesondere hochschulgeeignete Alternative dar. Es handelt sich dabei um

eine schnelle und hochsensitive Methode, bindende Liganden in komplexen

Substanzbibliotheken aufzufinden, auch ohne Kenntnis der Protein- und/oder

Inhibitorstruktur. Ebenso wenig ist eine Markierung durch beispielsweise Fluoreszenz

oder Radioaktivität notwendig. Ein weiterer Vorteil dieser Methode gegenüber

herkömmlichen Verfahren ist die Möglichkeit der Entdeckung von Wirkstoff-

Kombinationen, die einen synergistischen Effekt aufweisen [18], bzw. nach dem

„induced-fit“-Modell inhibieren. Im regulären HTS würden solche Compounds

womöglich in verschiedene Fraktionen getrennt werden und so bei erneuter Testung

keine Wirkung mehr aufweisen.

Für die Durchführung des Ligandenfischens werden lediglich Ultrafiltrationseinheiten,

eine normale Zentrifuge und eine analytische HPLC-Anlage benötigt.

Das Fischen selbst besteht aus insgesamt vier Schritten, die nachfolgend im Detail

erläutert und anschließend auch schematisch dargestellt werden.

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6 Theoretischer Teil - 2 Verwendete Testsysteme

2.1.2 Durchführung

2.1.2.1 Inkubation

Beim Ligandenfischen wird das Target gleich der Substanzbibliothek zugeführt. Unter

optimalen Bedingungen für das Protein wird diese Inkubationslösung dann eine Stunde

lang bei mehrmaligem Schütteln stehengelassen.

2.1.2.2 Filtration

Während der Inkubation bilden „passende“ niedermolekulare Verbindungen der

Substanzbibliothek entsprechend des „Schlüssel-Schloß-Prinzips“ Protein-Ligand-

Komplexe. Diese werden mittels Ultrafiltrationseinheiten von den nicht bindenden

Liganden abgetrennt. Die Ausschlussgrenze der Ultrafiltrationseinheiten wird dabei so

gewählt, dass der gebildete Protein-Ligand-Komplex sicher auf der Filtermembran

verbleibt, die ungebundenen, niedermolekularen Substanzen jedoch den Filter passieren.

2.1.2.3 Waschung

Neben der Bindung in der Bindetasche können Substanzen auch unspezifisch an das

Protein oder den Filter binden. Um diese zu entfernen, wird 2x mit kaltem Puffer

gewaschen. Dieser Waschschritt wird noch ein zweites Mal durchgeführt, da

erfahrungsgemäß nicht alle unspezifisch gebundenen Substanzen beim ersten Mal

erfasst werden.

2.1.2.4 Freisetzung

Im letzten Schritt des Fischens wird das Freisetzungsreagenz dem auf der

Filtermembran verbliebenen Komplex zugesetzt. Diese Lösung bewirkt eine

Konformationsänderung des Proteins, wodurch die gebundenen Substanzen frei werden.

Weiterhin ist durch die sauren Eigenschaften auch eine Spaltung eventuell entstandener

kovalenter Bindungen möglich. Nach erneutem Abfiltrieren erhält man schließlich im

Idealfall nur die bindenden Liganden im Filtrat.

Zu jedem Fischansatz mit Protein wird ein Blindversuch durchgeführt, bei dem statt mit

Protein nur mit Puffer inkubiert wird. Durch den direkten Vergleich mit dem

Blindversuch soll verhindert werden, dass eine unspezifisch gebundene Substanz, die

durch das Waschen nicht entfernt wurde, jedoch beispielsweise kovalent an die

Filtermembran oder den Filter im Allgemeinen gebunden hat, als falsch positives

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Theoretischer Teil - 2 Verwendete Testsysteme 7

Ergebnis erkannt wird. Nach jedem Fischschritt wird das erhaltene Filtrat mittels

Kapillar-HPLC vermessen. Pro Fischansatz erhält man somit neun Chromatogramme:

1. Substanzbibliothek, 2. Filtrat der Filtration, 3. Filtrat der Filtration des Blindversuchs,

4. Filtrat der ersten Waschung, 5. Filtrat der ersten Waschung des Blindversuchs,

6. Filtrat der zweiten Waschung, 7. Filtrat der zweiten Waschung des Blindversuchs,

8. Filtrat der Freisetzung und 9. Filtrat der Freisetzung des Blindversuchs

2.1.2.5 Schematische Darstellung (Abb. 2.1)

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8 Theoretischer Teil - 2 Verwendete Testsysteme

2.1.2.6 Graphische Darstellung

In den neun erhaltenen Chromatogrammen werden die relevanten Peaks integriert und

anschließend in ein Diagramm übertragen, um die Ergebnisse optisch sichtbar zu

machen. Im Folgenden ist das Fischen eines bekannten Inhibitors mit humanem

Thrombin aus einer Substanzbibliothek dargestellt.

Abb. 2.2 zeigt das Chromatogramm der Substanzbibliothek mit einem Inhibitor.

Abb. 2.2: Chromatogramm einer Substanzbibliothek mit Inhibitor V1 (Pfeil)

Mit dieser Substanzbibliothek ist nach Zugabe von humanem Thrombin das Fischen

nach obigem Schema durchgeführt worden. In den folgenden Darstellungen ist oben das

Fischen mit Thrombin und unten der dazugehörige Blindversuch abgebildet. Da in den

Waschschritten nur eine Abnahme aller Substanzen zu erkennen ist und dies nicht dem

Verständnis dient, sind diese hier nicht abgebildet worden.

In den Chromatogrammen der Probe sieht man deutlich, dass der Inhibitor, hier mit V1

der stärkste, der uns zur Verfügung stand (Ki= 0,0021 µmol/l), im Filtrat des

Filtrationsschritts nicht mehr vorhanden ist, also vollständig gebunden wurde und nach

Behandlung mit dem Freisetzungereagenz im Filtrat wieder gefunden werden konnte.

Die Chromatogramme des Blindversuchs, bei dem statt des Enzyms Puffer zugegeben

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Theoretischer Teil - 2 Verwendete Testsysteme 9

Filtration

Freisetzung

Filtration

Freisetzung

Abb. 2.3: Chromatogramme der Filtration und Freisetzung des Fischens von

Inhibitor V1 aus einer Substanzbibliothek

Filtration

Freisetzung

Abb. 2.4: Chromatogramme der Filtration und Freisetzung der Blindprobe des

Fischens von Inhibitor V1 aus einer Substanzbibliothek

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10 Theoretischer Teil - 2 Verwendete Testsysteme

worden ist, zeigen hingegen keine Abnahme der Inhibitormenge im Filtrat nach

Inkubation und keine Zunahme der Inhibitorkonzentration nach Behandlung mit dem

Freisetzungsreagenz.

Nach Integration des Peaks von Inhibitor V1 in jedem Chromatogramm werden diese

Flächen in ein Diagramm eingetragen, welches im Folgenden dargestellt ist.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

Filtration 1. Waschung 2. Waschung Freisetzung

AU

(M

io)

V1 Blind

Abb. 2.5: Fischdiagramm von Inhibitor V1 aus einer Substanzbibliothek mit humanem

Thrombin

Abb. 2.5 zeigt deutlich, dass beim Blindversuch der Inhibitor V1, der sich unspezifisch

an den Filter angelagert hat, lediglich herunter gewaschen wird. Im Hauptversuch, bei

dem humanes Thrombin zugegeben wurde, ist dagegen erst im Filtrat der Freisetzung

Inhibitor V1 nachweisbar. Sind die Ergebnisse nicht so eindeutig, wie im vorliegenden

Fall, so ist diese graphische Darstellung eine große Hilfe dabei, zu erkennen, ob eine

Substanz gefischt wurde oder nicht.

2.2 Amidolytischer Aktivitätsassay

Bei dem amidolytischen Aktivitätsassay, im Folgenden auch als Thrombinassay

bezeichnet, handelt es sich um ein wässriges Testsystem bei pH = 8, das auf der

Messung einer Absorptionszunahme pro Zeiteinheit beruht. Chromozym TH wird

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Theoretischer Teil - 2 Verwendete Testsysteme 11

hierbei als Substrat verwendet und von Thrombin in einen Peptidrest und 4-Nitroanilin,

welches bei 405nm sein Absorptionsmaximum hat, gespalten.

Tos-Gly-Pro-Arg-4-Nitroanilid + H2O Tos-Gly-Pro-Arg + 4-Nitroanilin

Bei einer definierten Substrat- und Enzymkonzentration findet also eine definierte

Absorptionszunahme innerhalb einer festgelegten Zeiteinheit statt. Wird das Enzym nun

durch Zugabe eines Inhibitors an der Spaltung des Substrates gehindert, wird weniger

Substrat umgesetzt und die Absorptionskurve nimmt einen flacheren Verlauf an. Um

dieses auch erkennen zu können, wird immer parallel ein Blindversuch aufgenommen,

mit welchem die Steigung verglichen werden kann. Die Inhibition wird prozentual

berechnet, wobei der Blindversuch, bei dem der Assay ohne Inhibitor durchgeführt

wird, mit 0% Inhibition als Bezug genommen wird.

2.3 Gerbstofffällungsassay

2.3.1 Gerbstofffällungsassay allgemein

Bei dem Gerbstofffällungsassay (GFA) handelt es sich um einen Assay, der in unserem

Arbeitskreis entwickelt wurde [16]. Dabei wird die Eigenschaft von Gerbstoffen,

Proteine zu fällen, ausgenutzt. Im Prinzip ähnelt er dem Ligandenfischen, benötigt aber

keinen Filter mehr, sondern kommt mit einer Zentrifuge und einer HPLC-Anlage aus.

2.3.2 Durchführung

2.3.2.1 Inkubation

Analog zum Ligandenfischen wird in einem ersten Schritt das Protein der

Substanzbibliothek präsentiert und unter optimalen Bedingungen für eine bestimmte

Zeit, in diesem Fall 15 min. inkubiert. In dieser Zeit bilden sich die Enzym-Ligand-

Komplexe aus, die mit Gerbstoffen gefällt werden. Der entstandene Enzym-Ligand-

Gerbstoff-Komplex wird nun abzentrifugiert.

Thrombin

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12 Theoretischer Teil - 2 Verwendete Testsysteme

2.3.2.2 Waschung

Um unspezifisch an das Protein bzw. den Enzym-Ligand-Gerbstoff-Komplex

gebundene Substanzen abzutrennen, wird ein bis zweimal in kaltem Puffer

resuspendiert und wiederum abzentrifugiert.

2.3.2.3 Freisetzung

Der als Kuchen verbleibende Komplex wird wieder in Puffer resuspendiert und die

Gerbstoffe durch Fällung mit Polyvinylpyrrolidon (PVP) vom Enzym entfernt.

Anschließend wird der bindende Ligand durch ein Freisetzungsreagenz losgelöst. Man

chromatographiert wieder alle entstandenen Lösungen. Ein Blindversuch ist in diesem

Fall unnötig, da kein Filter vorhanden ist, an den unspezifisch gebunden werden könnte.

Um jedoch auszuschließen, dass eine Substanz lediglich mit den Gerbstoffen in

Wechselwirkung tritt und so falsch positiv erscheint, wird dennoch ein Blindversuch

ausgeführt.

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Theoretischer Teil - 2 Verwendete Testsysteme 13

2.3.2.4 Schematische Darstellung (Abb. 2.6)

2.3.2.5 Graphische Darstellung

Auch die graphische Darstellung entspricht der des Ligandenfischens, wobei in diesem

Fall auf die Darstellung des Blindversuchs verzichtet wird. Man erhält jedoch den

charakteristischen Konzentrationsverlauf und kann erkennen, ob eine Substanz nur

unspezifisch gebunden hat und daher herunter gewaschen wird, oder ob tatsächlich eine

Wechselwirkung vorliegt.

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14 Theoretischer Teil - 3 Untersuchte Pflanzen

3 Untersuchte Pflanzen

3.1 Apiaceaen

3.1.1 Apiaceaen allgemein

Die Familie der Apiaceae, früher auch Umbelliferae genannt, umfasst in der Regel

einjährige oder ausdauernde Kräuter. Die Blätter mit großen Blattscheiden sind

überwiegend geteilt oder zusammengesetzt und die Stängel häufig grob behaart. Die

Blütenstände sind familientypisch und führten daher auch zu der Bezeichnung

Umbelliferae, die Doldenträger. Als Frucht wird eine trockene Spaltfrucht entwickelt,

wobei Frucht- und Samenschale miteinander verwachsen sind. Jede Teilfrucht weist

dabei charakteristische Rippen auf. Als Inhaltsstoffe der Samen sind die ätherischen Öle

von besonderer Bedeutung, die vielfach die Ursache für ihre offizinelle Verwendung

sind. Als Besonderheit der Apiaceaen ist in den Samen meist auch Petroselinsäure als

unübliche Fettsäure vertreten. Da in vorliegender Arbeit nur mit den Früchten gearbeitet

wurde, sollen im Folgenden auch nur diese beschrieben werden [20, 23, 24].

3.1.2 Anis

Der Anis ist vermutlich im östlichen Mittelmeergebiet und Westasien beheimatet, wird

jedoch auch in Südeuropa und dem Mediterrangebiet angebaut. Die Stammpflanze ist

Pimpinella anisum L. Die Früchte sind graugrün bis graubraun, etwa 2 mm lang und in

ihrer Form verkehrt birnenförmig. Es handelt sich um gestielte, zweizeilige

Spaltfrüchte, die fein behaart sind und deren Teilfrüchte fünf gerade Rippen aufweisen.

Eine Verwechslung ist nur mit den Schierlingsfrüchten möglich, jedoch durch einen

einfachen Test mit Kalilauge erkennbar. Weiterhin besteht eine große Ähnlichkeit mit

Petersilienfrüchten, die jedoch von geringerer Größe sind und keine Behaarung

aufweisen.

Auf Grund der sekretolytischen, spasmolytischen und sekretomotorischen Wirkungen

des ätherischen Öls wird Anis als Karminativum bei dyspeptischen Beschwerden

innerlich und als Expektorans bei Katarrhen der Luftwege sowohl innerlich, als auch

äußerlich, vor allem in der Pädiatrie angewandt. Weiterhin wirkt Anisöl insektizid,

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Theoretischer Teil - 3 Untersuchte Pflanzen 15

fungizid, antimikrobiell und antikonvulsiv. Die Hauptkomponente des ätherischen Öls,

trans-Anethol, zeigte in vitro zudem auch antiinflammatorische und anticancerogene

Effekte.

Neben dem ätherischen Öl ist in den Samen ein Anteil von ungefähr 30% fettem Öl zu

finden, wobei Ölsäure zu 9%, Petroselinsäure zu 65% und die Linolensäure zu 3,8%

enthalten sind. [22, 23, 24].

3.1.3 Fenchel

Der Fenchel kommt ehemals aus dem Mittelmeergebiet und wird heute auch in Europa,

Asien und Teilen Afrikas sowie Südamerikas angebaut. Im DAB sind zwei

Fenchelmonographien enthalten, zum einen der bittere Fenchel mit der Stammpflanze

Foeniculum vulgare MILLER ssp. vulgare var. vulgare (MILLER) THELLING und zum

anderen der süße Fenchel mit der Stammpflanze Foeniculum vulgare MILLER ssp.

vulgare var. dulce (MILLER) THELLING. Beide Varietäten sind schon vor Jahrhunderten

aus dem heute noch wild vorkommenden Pfefferfenchel Foeniculum vulgare ssp.

piperitum (UCRIA) COUTINHO hervorgegangen. Offizinell wird in der Regel der bittere

Fenchel eingesetzt und so wurden in der vorliegenden Arbeit ebenfalls die Samen des

bitteren Fenchels verwendet. Die Spaltfrüchte sind 3-12 mm lang, 2-4 mm breit und

somit die größten unter den hier betrachteten Apiaceaenfrüchten. Gelegentlich hängen

die kahlen, gelblich-grün bis gelbbraun gefärbten Teilfrüchte noch zusammen.

Das ätherische Öl wirkt sekretolytisch, sekretomotorisch, spasmolytisch und auch

antiseptisch. Es wird daher als Expektorans sowie als Spasmolytikum und

Karminativum bei krampfartigen gastrointestinalen und dyspeptischen Beschwerden

eingesetzt. Die Wirksamkeit bei Magen-Darmstörungen beruht dabei eher auf

motilitätsfördernden Eigenschaften.

Fettes Öl ist in den Fenchelfrüchten in einem Anteil von etwa 9-21% enthalten. Dabei

entfallen auf Ölsäure 20-30%, Petroselinsäure 45-60%, Linolsäure 15% und

Palmitinsräure 5% [21, 23, 24].

3.1.4 Koriander

Ursprünglich im östlichen Mittelmeergebiet und vorderen Orient beheimatet, wird

Koriander heute als Gewürzpflanze weltweit kultiviert. Die Stammpflanze ist

Coriandrum sativum L. var. vulgare ALEF. bzw. var. microcarpum DC. Die Früchte sind

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16 Theoretischer Teil - 3 Untersuchte Pflanzen

recht kugelig und weisen einen Durchmesser von 1,5-5 mm auf. Dabei handelt es sich

um strohgelbe bis bräunliche Doppelachänen, die meist nicht in Teilfrüchte zerfallen.

Die zehn geschlängelten, wenig hervortretenden und die acht geraden, deutlich

hervortretenden Rippen treten erst beim Trocknen auf.

Das ätherische Öl weist sekretolytische und spasmolytische Eigenschaften auf und wird

daher als Stomachikum, Spasmolytikum und Karminativum eingesetzt. Daneben konnte

in vitro auch eine bakterizide und fungizide Wirkung festgestellt werden.

Weiterhin enthält der Samen zu 13-21% fettes Öl, wovon 37% auf Ölsäure, 38% auf

Petroselinsäure und ca. 14% auf Linolensäure entfallen [20, 23, 24].

3.1.5 Kümmel

Kümmel stammt ursprünglich aus Eurasien, in Kulturen wird er jedoch auch in Europa,

vor allem Polen, Holland und Ostdeutschland angebaut. Die Stammpflanze ist

Carum carvi L. Die Früchte sind 3-6 mm lang und etwa 1 mm dick. Sie sind graubraun,

meist etwas sichelförmig gekrümmt, an beiden Enden zugespitzt und kahl. Auf der

gewölbten Seite befinden sich drei, auf der gegenüberliegenden Seite zwei Rippen.

Verwechslungen kommen praktisch nicht vor.

Auch Kümmel wird wegen der sekretolytischen und spasmolytischen Eigenschaften

seines ätherischen Öls als Stomachikum und als Karminativum bei dyspeptischen

Beschwerden eingesetzt. Das ätherische Öl weist weiterhin antimikrobielle und stark

fungizide Eigenschaften auf.

In den Kümmelfrüchten sind 10-18% fettes Öl enthalten. Im Speziellen sind es dabei

Ölsäure mit 29-30%, Petroselinsäure mit 40-50%, Palmitinsäure mit 5%, Stearinsäure

mit ca. 1%, Eicosansäure mit < 1% und schließlich die Linolensäure mit 0,6-2,3%

[20, 23, 24].

3.1.6 Gartenpetersilie

Die Heimat der Petersilie wird im Mittelmeergebiet vermutet. Heute wird es in

verschiedenen Sorten fast weltweit angebaut. Die Stammpflanze ist Petroselinum

crispum (MILLER) NYMAN EX. A. W. HILL. Die Früchte sind rundlich eiförmige bis

birnenförmige von der Seite her stark zusammengedrückte Doppelachänen, die leicht in

die schwach sichelförmig gekrümmten Teilfrüchte auseinander fallen. Sie sind 2 mm

lang und 1-2 mm breit sowie grünlichgrau bis graubraun gefärbt.

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Theoretischer Teil - 3 Untersuchte Pflanzen 17

Das ätherische Öl der Petersilienfrüchte wirkt spasmolytisch und uteruserregend aber

auch als starkes Diuretikum, was auf die Reizwirkung des ätherischen Öls und der

Flavonoide auf das Nierenparenchym zurückgeführt wird. Petersilienfrüchte werden

daher bei Beschwerden des Magen-Darm-Trakts und der ableitenden Harnwege sowie

zur Verdauungsförderung verwendet. Wegen den aus dem Gehalt an Apiol und

Myristicin herrührenden Risiken, die hier nicht näher behandelt werden sollen, sind

Petersilienfrüchte von der Kommission E als negativ bewertet worden.

Die Früchte schließlich enthalten ca. 20% fettes Öl mit 2,5-28% Ölsäure, 60-80%

Petroselinsäure, 1-16% Linolsäure und 2-7% Palmitinsäure [22, 23, 24].

3.2 Gartenkresse

Die Gartenkresse mit der Stammpflanze Lepidium sativum L. aus der Familie der

Brassicaceae ist ein weltweit verbreitetes Kraut und wird 20-40 cm hoch. Es wird

jedoch meist als frisches Küchenkraut verwendet und daher nach nur kurzem Wachstum

bis ca. 5 cm bereits eingesetzt. Die Blätter sind hellgrün und dünn, wobei die

Grundblätter meist leierförmig-fiederschnittig sind. In vorliegender Arbeit wurde der

Kresse nicht mehr Wachstumszeit als eine Woche gewährt, so dass sie das Stadium der

Grundblätter nie verlassen hat.

Hauptinhaltsstoffe sind Glucosinolate und Vitamin C (bis 37%), weshalb Kresse

volksmedizinisch auch bei Husten und Vitamin C Mangel eingesetzt wird.

Als pharmakologische Wirkung ist aber vor allem die antimikrobielle Wirkung, bedingt

durch den Gehalt an Senfölen, zu nennen, wobei die antibakteriellen Eigenschaften

stark vom Alter der Pflanzen abhängen. [24]

3.3 Knoblauch

Als ursprüngliches Herkunftsgebiet gilt das zentrale bis südliche Asien. Heute jedoch

wird Knoblauch auf der ganzen Welt angebaut. Die Stammpflanze ist Allium sativum L.

und gehört zu der Familie der Alliaceae. Es handelt sich dabei um eine 25-70 cm hohe,

ausdauernde Pflanze, von der in dieser Arbeit nur die Zwiebeln betrachtet wurden.

Diese besteht aus einer Hauptzwiebel und mehreren rundlich-eiförmigen

Nebenzwiebeln, die in eine Haut eingeschlossen sind.

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18 Theoretischer Teil - 3 Untersuchte Pflanzen

Die Hauptinhaltsstoffe sind Alliine und deren γ-Glutamylkonjugate, daneben sind aber

auch Fructosane und Steroidsaponine enthalten. Die Alliine gehen beim Zerkleinern

durch fermentativ initiierte Umwandlungen in Lauchöle über, die den charakteristischen

Geruch bewirken. Diese schwefelhaltigen Verbindungen wirken sich hemmend auf

Arteriosklerose begünstigende Faktoren aus. Der Einfluss von Knoblauchzubereitungen

auf die Blutfettwerte und Thrombozytenaggregation wird als schwach positiv bewertet,

wobei die Hemmnung der Thrombozytenaggregation und -adhäsion aber in einer

doppelblinden Studie eindeutig nachgewiesen werden konnte. Weiterhin wirkt

Knoblauch sowohl antibakteriell als auch antiviral und auf Grund der

immunstimulierenden und antioxidativen Wirkung wird auch eine krebsprotektive

Wirkung diskutiert. Wegen dieses Wirkprofils und diversen Studien empfiehlt die

Kommission E die Anwendung von Knoblauchzubereitungen bei einer Erhöhung der

Blutfettwerte als Unterstützung diätetischer Maßnahmen und zur Vorbeugung

altersbedingter Gefäßveränderungen. Das Nutzen-Risiko-Verhältnis kann dabei als

positiv beurteilt werden, da schwerwiegende Nebenwirkungen nicht zu erwarten sind

[20, 23, 24].

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TEIL I

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Theoretischer Teil - 4 Malaria 19

4 Malaria

4.1 Malaria allgemein

Malaria (ital. mala aria „schlechte Luft“) ist eine Sammelbezeichnung für Infektionen,

die durch die weibliche Anopheles-Mücke übertragen und durch Protozoen der Gattung

Plasmodium ausgelöst werden. Je nach Art des Plasmodiums dauert die Inkubationszeit

ein bis vier Wochen. Auch die Intervalle zwischen den Fieberschüben hängen vom

Erreger ab. Es gibt drei Arten von Malaria, die von unterschiedlichen Plasmodien

ausgelöst werden. Die „Malaria quartana“, die von Plasmodium malariae ausgelöst

wird, ist die leichteste Form der Malaria mit Fieberschüben alle vier Tage. Die „Malaria

tertiana“ wird ausgelöst durch Plasmodium vivax und Plasmodium ovale. Sie weist zwar

einen schweren Verlauf auf, ist aber nur selten lebensbedrohend und durch

Fieberschübe in dreitägigem Rhythmus charakterisiert. Die „Malaria tropica“

schließlich, ausgelöst durch Plasmodium falciparum, führt unbehandelt bei etwa jedem

dritten Infizierten zum Tod. Bei dieser Form der Malaria treten die Fieberschübe in

unregelmäßigen Abständen auf.

Malaria ist die häufigste Tropenkrankheit. In Europa, Nordamerika und Australien ist

sie so gut wie ausgerottet. Dieses kann jedoch nicht für die meisten tropischen und

subtropischen Länder gesagt werden. Für sie stellt Malaria nach wie vor eine der

größten Gesundheitsgefahren dar. Die WHO schätzt, dass sich jedes Jahr über 300

Millionen Menschen mit Malaria infizieren und mindestens eine Millionen dieser

Krankheit auch erliegen [1]. 90% der Erkrankten leben dabei auf dem afrikanischen

Kontinent. Jedoch infizieren sich zunehmend immer mehr Menschen aus malariafreien

Ländern, die sich auf einer Reise angesteckt haben. Aber auch ohne eigenen

Reisetätigkeit besteht die Gefahr, sich mit der so genannten Airport-Malaria zu

infizieren, da durch die stetig wachsende Mobilität der Gesellschaft auch vermehrt

Moskitos im Gepäck mitgebracht werden. Allein aus Deutschland werden mittlerweile

jährlich fast 1000 Malaria-Erkrankungen gemeldet [24]. Abb. 4.1 zeigt, wie viele

Malariafälle 2003 in der EU und der Türkei verzeichnet wurden. Dabei liegt

Deutschland mit dem dritten Platz zwar weit hinter Frankreich und dem Vereinigten

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20 Theoretischer Teil - 4 Malaria

Königreich zurück, jedoch liegt es trotzdem weit vor der restlichen EU. Obwohl im

letzten Jahr die Zahl der Neuerkrankungen in Deutschland einen Tiefpunkt erreichte

[24], ist die Malaria weltweit gesehen wieder auf dem Vormarsch.

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Abb. 4.1: Importierte Malariafälle 2003 in der EU und der Türkei, Daten aus [25]

Die Gründe hierfür liegen größtenteils in der Resistenzentwicklung sowohl der

Plasmodien gegenüber den existierenden Therapie- und Prophylaxemitteln, als auch der

Mücken gegenüber den Insektiziden. Darüber hinaus verbessern sich die

Überlebensbedingungen der Anopheles-Mücke durch menschliche Eingriffe in die

Natur, wie Rodungen, vermehrte Slumbildungen in den Großstädten und schlecht

geplante Bewässerungsprojekte. Auch der Treibhauseffekt und die damit verbundene

globale Erwärmung, die ebenfalls die Fortpflanzung des Überträgers unterstützt, ist auf

den Menschen zurückzuführen [26]. Auf Grund der hohen Resistenz gegenüber den

vorhandenen Antimalariamittel und der erneuten Verbreitung der Krankheit ist die

Entwicklung neuer Wirkstoffe noch immer ein aktuelles Thema weltweit.

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Theoretischer Teil - 4 Malaria 21

4.2 Malariazyklus

4.2.1 Ungeschlechtlich

Die Vermehrung der Plasmodien erfolgt über Generationswechsel verbunden mit einem

Wirtswechsel. Dabei findet die ungeschlechtliche Vermehrung im Menschen statt

(Abb. 4.2). Diese wird unterteilt in die präerythrozytäre und die erythrozytäre

Schizogenie. Präerythrozytäre Schizogenie (Leberschizogenie): Die durch den Biss

einer Anopheles-Mücke eingebrachten Sporozoiten dringen in Leberparenchymzellen

ein, verwandeln sich in Trophozoiten und wachsen zu Schizonten heran, die Merozoiten

enthalten. Durch Zerstörung der Leberzellen werden diese ins Blut freigesetzt. Dieses

Stadium ist noch symptomlos. Einige Sporozoiten von Plasmodium vivax und

Plasmodium ovale können als Ruheformen (Hypnozoiten) in der Leber verbleiben und

auch nach Jahren noch durch sekundäre Schizonten Rezidive auslösen. Erythrozytäre

Schizogenie (Blutschizogenie): Die freigesetzten Merozoiten dringen in die

Erythrozyten ein und wachsen zunächst als Trophozoiten, dann als Schizonten heran die

wiederum Merozoiten enthalten. Durch Lyse der Erythrozyten gelangen sie in die

Blutbahn und befallen erneut Erythrozyten. Diese Erythrozytenlyse geht mit einem

Fieberschub einher. Die Entwicklungsdauer der Merozoiten bestimmt also die Zeit bis

zum nächsten Fieberschub.

4.2.2 Geschlechtlich

Bei einem Biss nimmt die Anopheles-Mücke zusammen mit dem Blut auch die

Plasmodien wieder auf. Hier findet die geschlechtliche Vermehrung des Erregers statt.

Man unterscheidet dabei die Gamogenie und die Sporogonie. Gamogenie: Ein Teil der

Merozoiten wächst nicht zu Schizonten, sondern zu geschlechtlich differenzierten

männlichen Mikro- und weiblichen Makrogamonten heran, die sich nur im Darm der

Mücke weiterentwickeln können. Der Makrogamont wird zum kugeligen

Makrogameten, der Mikrogamont zu vier bis acht wurmförmigen Mikrogameten, die

den Makrogameten befruchten. Es bilden sich Ookineten, die sich an der

Darmaußenwand anlagern. Sporogonie: Nach Reduktionsteilung (R!) wachsen die

Ookineten zu Oozysten heran, in denen zahllose Sporozoiten entstehen. Diese werden

durch Platzen der Zellwand frei, gelangen in die Speicheldrüse und werden beim

nächsten Stich wieder auf den Menschen übertragen [27].

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22 Theoretischer Teil - 4 Malaria

Abb. 4.2: Entwicklungszyklus des Plasmodiums.

Erläuterungen im Text, entnommen aus [27]

4.3 Krankheitsverlauf

Das klinische Bild der Krankheit wird allein durch die erythrozytären Phasen geprägt.

Die Erythrozytenlyse bewirkt einerseits neben einer Freisetzung von Merozoiten auch

die Freisetzung der plasmodialen Stoffwechselprodukte, die stark immunogen wirken

und Auslöser für Fieber, Schüttelfrost und Gliederschmerzen sind und andererseits bei

ständiger Wiederholung auch eine hämolytische Anämie hervorrufen. Bei der Malaria

tropica, der gefährlichsten Form der Malaria, können sich unbehandelt in wenigen

Tagen schwer wiegende, meist tödliche Komplikationen entwickeln. Bei einem Befall

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Theoretischer Teil - 4 Malaria 23

mit Merozoiten ändert sich die Oberflächenbeschaffenheit der roten Blutkörperchen so,

dass sie klebrig werden und dadurch an der Oberfläche feinster Blutkapillaren haften

bleiben. Diese adhäsiven Eigenschaften werden durch das so genannte Plasmodium

falciparum-Erythrozyten-Membranprotein1 (PfEMP1) ausgelöst, die der Parasit auf der

Membranoberfläche der Erythrozyten exprimiert. Die daraus resultierende

Immunantwort des Wirtes ist erfolglos, da das Plasmodium falciparum in der Lage ist,

die antigenen Eigenschaften jedes Mal aufs Neue zu ändern. Daher kommt aber die

gewisse Immunität, die Überlebende nach einer Infektion aufweisen. In der Folge der

anhaftenden Erythrozyten ist ein Gefäßverschluss möglich, was eine Unterversorgung

mit Sauerstoff im umgebenden Gebiet verursachen kann. Es kommt zu

Funktionsstörungen aller innerer Organe, die besonders schwerwiegend sind, wenn

Gehirn, Leber, Niere und Lunge betroffen sind. „Malaria tropica“ beginnt wie viele

andere Tropenkrankheiten auch mit plötzlichem sehr hohem Fieber, Schüttelfrost,

Magen-Darm-Beschwerden, Übelkeit sowie Kopf- und Gliederschmerzen. Eine Leber-

und Milzschwellung sowie Anämie treten schon früh auf. Unbehandelt kann die Malaria

innerhalb von Stunden nach Auftreten der ersten Symptome auf das Gehirn übergreifen

("zerebrale Malaria") und nach anfänglicher Benommenheit zu Krampfanfällen,

Bewusstseinsstörungen und schließlich zu Koma und Tod führen [26]. Bei jedem dritten

Erkrankten führt eine Infektion mit „Malaria tropica“ zum Tod, wenn sie nicht oder zu

spät behandelt wird. Eine „Malaria tertiana“ oder „Malaria quartana“ dagegen heilt

meist auch unbehandelt vollständig aus, allerdings können auf Grund der Hypnozoiten

(vgl. 4.2.1) schwere Rückfälle auftreten. Todesfälle sind dabei sehr selten [28].

4.4 Behandlung und Vorbeugung der Malaria

4.4.1 Antimalariamittel

Lange Zeit war Chloroquin das Mittel der ersten Wahl bei der Behandlung der

unkomplizierten Malaria tropica. Dabei handelt es sich, wie auch bei Mefloquin,

Primaquin, Halofantrin und Lumefantrin, um Abkömmlinge der Chinarinden-Alkaloide

Chinin und Chinidin. Sie alle gehören in die Gruppe der kationisch-amphiphilen

Wirkstoffe, die hemmend auf die Häm-Polymerase wirken und durch eine Blockade des

Hämoglobinabbaus eine vermehrte Freisetzung toxischer Metaboliten bewirken [29].

Leider versagte Chloroquin auf Grund der gebildeten Resistenzen nach einiger Zeit

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24 Theoretischer Teil - 4 Malaria

nahezu überall. Als Ersatz-Medikation wurde dann Sulfadoxin/ Pyrimethamin

eingesetzt. Pyrimethamin gehört wie Proguanil in die Gruppe der Hemmer der

Nukleinsäure-Synthese. Die Hemmung der Synthese von Thymin und Purinbasen durch

Inhibition der Dihydrofolat-Reduktase behindert die erythrozytäre Entwicklung des

Parasiten. Sulfadoxin wird meistens unterstützend als anderer Hemmstoff der

Folsäuresynthese mit Pyrimethamin gekoppelt [29]. Diese Kombination war zwar sehr

viel versprechend, ein großer Nachteil ist jedoch die rasche Resistenzentwicklung,

weshalb heute auf andere Wirkstoffe zurückgegriffen werden muss. Artemisinin und

Artemeter aus dem einjährigen Beifuß Artemisia annua L. sind Endoperoxide, deren

homolytische Spaltung durch das Häm-gebundene Eisen katalysiert wird und zu freien

Kohlenstoffradikalen führt. Diese sind in der Lage, neben Häm auch Enzyme zu

alkylieren, welche für das Überleben des Parasiten notwendig sind [30, 31]. Die

Artemisinin-Derivate zeichnen sich vor allem durch die bis vor kurzem fehlende

Resistenz und geringe Toxizität aus. Weiterhin weisen sie einen schnelleren

Wirkungseintritt auf und sind auch gegen Gametozyten, die für die Infektion der

Anopheles-Mücke und damit für die Transmission verantwortlich sind, wirksam. Neue

Ansätze stellen Kombinationstherapien mit unterschiedlichen Wirkmechanismen dar,

um eine Resistenzentwicklung möglichst zu vermeiden. Dabei wird meistens ein

Artemisinin-Derivat mit einem bereits bekannten Wirkstoff gekoppelt. Die am

weitesten verbreiteten Kombinationen sind heute also die so genannten ACT’s

(Artemisinin-based combination treatments). Folgende Zusammenstellungen werden

derzeit in fixen Kombinationen eingesetzt:

Artemether/Lumefantrin,

Artesunat/Amodiaquin,

Dihydroartemisinin/Piperaquin,

Artesunat/Mefloquin,

Artesunat/Sulfadoxin/Pyrimethamin,

Dihydroartemisinin/Naphthoquinon/Trimethoprim.

Die Kombination aus Artemether und Lumefantrin ist dabei die einzige, die

international lizenziert ist. Sie ist 2002 von der WHO als Coartem® für die dritte Welt

in die Liste der essentiellen Heilmittel aufgenommen worden und als Riamet® auf dem

europäischen Markt zugelassen. Beim Einsatz der ACT’s ist zu bedenken, dass eine

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Theoretischer Teil - 4 Malaria 25

Kombinationstherapie aus einem Artemisininderivat und einem Wirkstoff, der in einem

Gebiet bereits versagt hat, nur zu einem Misserfolg führen kann. Obgleich die Auswahl

an ACT’s derzeit noch sehr übersichtlich ist, sieht die Zukunft auf Grund von

Entwicklungen neuer Arzneistoffe sehr viel versprechend aus. Hervorgehoben haben

sich dabei die Kombinationen Dihydroartemisinin/Piperaquin, die sich in Südostasien

als sehr effektiv erwiesen hat, aber für den afrikanischen Markt zu teuer sein dürfte, und

Artesunat/Chlorproguanil/Dapson, die sowohl billig, als auch erfolgreich ist [32].

Derzeit weisen die ACT’s noch einen hohen Kostenfaktor auf, so dass die

Fälschungsrate hoch ist. Eine synthetische Bereitstellung, an deren Entwicklung derzeit

noch geforscht wird, könnte die Kosten senken [28]. Im vergangenen Dezember ist nun

erstmals über Resistenzen gegen Artemether berichtet worden. Die entdeckten

Resistenzen stammen dabei alle aus Gebieten, in denen Artemisininderivate

unkontrolliert und mitunter illegal importiert auch als Monopräparat in der

Selbstmedikation eingesetzt werden [33].

4.4.2 Immunisierung

In Europa sind derzeit noch keine Impfstoffe gegen Malaria zugelassen. Es gibt jedoch

klinische Prüfungen mit Vakzinen, die auf DNA-Fragmenten oder rekombinanten

Proteinen von Plasmodium falciparum basieren. Zum Teil werden diese Impfstoffe in

Endemiegebieten bereits an Freiwilligen getestet. In einer klinischen Studie mit dem

Impfstoff RTS,S/AS02A, an der mehr als 2.000 Kinder im Alter zwischen 1 und 4

Jahren teilnahmen, konnte das Risiko von Fieberschüben und die Schwere der

Erkrankung signifikant reduziert werden. Dabei handelt es sich um eine Vakzine, die

gegen die Präerythrozytäre Schizogenie gerichtet ist und einen Befall der

Leberparenchymzellen verhindern, bzw. infizierte Zellen zerstören soll [34]. Eine

weitere Prophylaxe-Variante ist die Impfung mit gentechnisch veränderten Malaria-

Erregern, denen das Gen uis3 fehlt, ohne welches sich Sporozoiten nicht zu Schizonten

entwickeln können und so die Transmission verhindert wird. Sie wird zurzeit an

Versuchstieren getestet [35].

4.4.3 Vektorkontrolle

Seit den 50er Jahren wird versucht, die übertragenden Anopheles-Mücken in den

Endemiegebieten mit DDT und anderen Insektiziden zu dezimieren. Der Erfolg dieser

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26 Theoretischer Teil - 4 Malaria

Maßnahmen wird ebenso kontrovers diskutiert wie die potentielle Umweltbelastung

durch die breitflächige Ausbringung dieser Substanzen, die nach wie vor in einigen

südafrikanischen Ländern im Haus versprüht werden. Der Einsatz von Moskitonetzen,

die mit Insektiziden imprägniert sind, ist zwar sehr viel versprechend, jedoch scheitert

es daran, dass sich nicht jeder ein Netz kaufen kann [28]. Neuere Ansätze der

Vektorkontrolle basieren auf Pilzen, mit denen die Mücken infiziert werden können.

Dazu zählen u. a. Beauveria bassiana und Metarhizium anisopliae. Diese Erreger sind

für den Menschen ungefährlich und können so gegebenenfalls zu einer biologisch

verträglicheren Kontrolle der Malaria-Überträger eingesetzt werden [36].

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Theoretischer Teil - 5 Verwendete Targets 27

5 Verwendete Targets

5.1 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-reduktoisomerase

5.1.1 DXR allgemein

5.1.1.1 Mevalonat-abhängiger Isoprenoidbiosyntheseweg

Lange Zeit war es eine vorherrschende Annahme, Isoprenoide könnten nur auf einem

Wege, und zwar dem Mevalonat-abhängigen Weg, synthetisiert werden, denn im

tierischen Organismus kommt nur dieser Weg nachweislich vor. Dabei wird, wie in

Abb. 5.1 dargestellt, zunächst aus 2 Molekülen Acetyl-CoA (1) Acetacetyl-CoA (2)

gebildet, aus welchem mit einem dritten Acetyl-CoA-Molekül 3-Hydroxy-3-methyl-

glutaryl-CoA (HMG-CoA) (3) entsteht. Unter Abspaltung eines CoA-Restes führt die

Reduktion einer Carboxylgruppe dann zur Mevalonsäure (4). Über

Mevalonsäurepyrophosphat (5) entsteht schließlich nach Decarboxylierung Isopent-3-

en-1-ylphosphat (IPP (6)), welches im Gleichgewicht mit 3,3-Dimethylallyl-

pyrophosphat (DMAPP (7)) steht. Beide Hemiterpene stellen das so genannte „aktive

Isopren“ dar, aus welchem durch Addition von weiteren Isoprenen alle Terpen-

Grundgerüste gebildet werden. Es wird angenommen, dass Terpene, obwohl noch nicht

vollständig nachgewiesen, in allen Lebewesen vorkommen. Einige Beispiele für ihre

Vielfältigkeit sind Carotinoide als lichtschützende Pigmente oder Sterole, die

regulatorische Funktionen in der Zellmembran übernehmen. Weiterhin wirken viele

Terpenoide im Pflanzenreich als Insektizide oder als Insekten anziehende Substanzen.

Das hat zur Folge, dass Terpenoide häufig im Interesse der Pharmazeutischen Industrie

stehen. So ist z.B. das Paclitaxel, welches in der Onkologie eingesetzt wird, ein

Diterpen [37]. Auch im menschlichen Körper sind IPP und DMAPP Grundbausteine für

diverse Verbindungen wie Sexualhormone oder Cholesterin. In der Therapie der

Hypercholesterinämie werden daher beispielsweise HMG-CoA-Reduktasehemmer

verwendet.

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28 Theoretischer Teil - 5 Verwendete Targets

Abb. 5.1 Mevalonat-abhängiger Isoprenoidbiosyntheseweg

Erläuterungen im Text, modifiziert nach [38]

5.1.1.2 Methyl-Erythritol-Phosphat-Stoffwechselweg (MEP):

In den späten 1980er bzw. Anfang der 1990er Jahre gelang man zu der Erkenntnis, dass

es neben dem herkömmlichen auch einen zweiten, Mevalonat-unabhängigen Weg der

Isoprenoidbiosynthese gibt [39]. Da dieser über Methylerythritol verläuft, wird er auch

kurz als MEP-Weg bezeichnet. Dabei entsteht, wie in Abb. 5.2 dargestellt, aus D-

Glyceraldehyd-3-phosphat (9) und Pyruvat (8) mittels der 1-Deoxy-D-xylulose-5-

phosphatsynthase (DXS) unter CO2-Abspaltung 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat

(DOXP (10)). Durch die 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-reduktoisomerase (DXR oder

2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat-synthase, ispC) entsteht dann 2C-Methyl-D-

erythritol-4-phosphat (MEP (11)), welches anschließend über zwei weitere Enzyme zu

2C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclodiphosphat (12) umgewandelt wird. Unter Einsatz von

zwei weiteren Enzymen entsteht über 1-Hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl-4-diphosphat

wiederum IPP (6) bzw. DMAPP (7). Im Gegensatz zu dem herkömmlichen

Biosyntheseweg, der im Cytosol vorkommt, ist der MEP-Syntheseweg in den Plastiden

lokalisiert. Er kommt nur in einigen höheren Pflanzen und in Mikroorganismen, so auch

im Plasmodium falciparum, dem Erreger der „Malaria tropica“, nicht jedoch im

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Theoretischer Teil - 5 Verwendete Targets 29

tierischen Organismus vor. Belegt wird

das durch das Fehlen der Gene für die

Biosynthese auf dem MEP-Weg in

höheren Organismen [38].

Da dieser Weg bis dahin unbekannt war,

wurden viele pflanzliche Terpene erneut

auf ihren biosynthetischen Ursprung

untersucht. Interessanterweise werden

die Sterole meistens über den

bekannten, Mevalonat-abhängigen Weg

synthetisiert, wohingegen die meisten

Mono- und Diterpene hauptsächlich

über den MEP-Weg generiert werden,

allerdings sind auch Überschneidungen

möglich [40, 41].

Ein Hinweis auf die Existenz des

alternativen Isoprenoidbiosynthesewegs

im Plasmodium falciparum war die

Identifizierung der Gene für die Enzyme

dieses Weges in der DNA-Sequenz des

Parasiten. Dieses führte schließlich zur

Entwicklung einer aktiven, rekombi-

nanten DXR [42]. Im Plasmodium

falciparum ist dieser MEP-Stoff-

wechselweg im Apicoplasten lokalisiert,

der sich vermutlich aus einer

endosymbiontischen Alge entwickelt

hat. Bei der Endosymbiose handelt es

sich um eine lebensnotwendige Form

des Zusammenlebens zweier Organis-

men, wobei einer im Körper des anderen

lebt. Dieser Hypothese nach sind

Abb. 5.2: Mevalonat-unabhängiger

Isoprenoidbiosyntheseweg.

Erläuterungen im Text, modifiziert

nach [38]

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30 Theoretischer Teil - 5 Verwendete Targets

bestimmte Zellorganellen aus einer Endosymbiose hervorgegangen, wie z.B. die

Mitochondrien und möglicherweise auch die Chloroplasten. Da das Plasmodium keine

Alternative zum MEP-Stoffwechselweg hat, kann er ohne den Apicoplasten nicht

überleben [43].

5.1.2 Struktur und Funktion der DXR

Abb. 5.3: Struktur der DXR mit Fosmidomycin in der Bindetasche

erstellt mit PyMOL [62]

5.1.2.1 Struktur

Die DXR (EC 1.1.1.267) liegt im Kristall als Homodimer vor und besteht aus drei

Domänen, die ein V-artiges Molekül bilden. Die N-terminale Domäne, die ein Schenkel

des V’s bildet, zeigt dabei die charakteristische Struktur eines Dinukleotidbindenden

Restes und ist verantwortlich für die Bindung von NADP(H). Die C-terminale Domäne

bildet den zweiten Arm des V’s, während die dritte Domäne das Verbindungsteil

darstellt und die Ausrichtung des Dimers beeinflusst. In diesem V liegt eine breite tiefe

Spalte, in der sich die Bindestelle für den Cofaktor und das Substrat befinden und auch

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Theoretischer Teil - 5 Verwendete Targets 31

das katalytische Zentrum. An diesem befindet sich eine Reihe von aciden Resten, die im

Verdacht stehen, mit Mn2+ einen Komplex einzugehen, da dieses zweiwertige Kation

für die katalytische Aktivität notwendig ist. Einige Eigenschaften wie die enorme

Flexibilität des Proteins weisen darauf hin, dass während der Bindung eine

Konformationsänderung eintritt, die wiederum ein Hinweis auf eine Bindung nach dem

„induced-fit“-Modell sein kann. Dafür spricht auch, dass zunächst NADPH und

Mangan binden, bevor das Substrat bindet. Weiterhin existiert eine flexible Schleife, die

sich nach Substratbindung über die „active-site“ legt und so die Solventumgebung

völlig abschirmt. Dabei ist wichtig, dass die Schleife das His209 beherbergt, für

welches eine Beteiligung an der Substratbindung nachgewiesen ist [44, 45].

5.1.2.2 Funktion

Die DXR katalysiert eine Neuanordnung des Kohlenstoffgerüsts des Deoxy-

xylulosephosphats (10) zu Methylerythritolphosphat (11). Dabei wird das C-4-Atom in

einem intramolekularen Prozess an C-2 angelagert (vgl. Abb. 5.4). Als Cofaktoren

können Mn2+ und Mg2+ dienen. Bei geringeren Konzentrationen ist jedoch Mangan

besser geeignet. Als weiterer Cofaktor wird NADPH benötigt.

Abb. 5.4: Intramolekulare Reaktion katalysiert durch DXR, modifiziert nach [38]

Ein bereits bekannter Inhibitor der DXR ist das Fosmidomycin (Formel s. Anhang B,

S. 162), das ursprünglich in den 1980er Jahren als Antibiotikum entwickelt worden ist.

Nach den ersten viel versprechenden Tests gegen gram-negative Organismen, konnte es

jedoch den Erwartungen nicht gerecht werden, da es sich als ungenügend wirksam

gegenüber rezividierenden Erkrankungen der ableitenden Harnwege erwies, obgleich es

selbst in hohen Dosen nicht toxisch für den Menschen ist [46, 47]. Da Fosmidomycin

sowohl die Menachinon- als auch die Carotinoidbiosynthese in Micrococcus luteus

hemmt, wurde angenommen, dass die antibakterielle Wirkung auf einer Hemmung des

Terpenoidbiosyntheseweges beruht. Kuzuyama et al. haben 1998 bewiesen, dass diese

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32 Theoretischer Teil - 5 Verwendete Targets

Hemmung via des MEP-Weges erfolgt [48]. Fosmidomycin und seine Abkömmlinge,

mit FR900098 (Formel s. Anhang B, S. 162) als bisher stärkstem unter Ihnen, stellen

die potentesten bekannten Inhibitoren dar [49]. Da Antimalariamittel noch immer

dringend benötigt werden und der MEP-Weg nicht in tierischen Organismen vorkommt,

aber im Plasmodium falciparum lebensnotwendig ist, bietet er einen idealen

Ansatzpunkt für die Entwicklung neuer Antimalariamittel. Derzeit wird überall nach

Inhibitoren dieses Biosyntheseweges gesucht, was kürzlich zur Entdeckung des

3,4-Dichlorphenyl-derivates an α-Position des Fosmidomycins (Formel s. Anhang B,

S. 162) als dreimal stärkerem Inhibitor als FR900098 führte [50]. Ebenso könnte dieser

Weg aber auch ein Ausgangspunkt für die Entwicklung neuer Herbizide und Antibiotika

sein, die für den Menschen unschädlich sind.

5.2 Glutamatdehydrogenase

5.2.1 Glutamatdehydrogenase allgemein

Die Glutamatdehydrogenase (GDH, EC 1.4.1.2) kommt in den Mitochondrien aller

Gewebe vor. Sie ist spezifisch auf L-Glutamat eingestellt und ist im Aminosäure-

Stoffwechsel von besonderer Bedeutung, wobei sie die Schnittstelle zwischen dem

Stickstoff- und dem Kohlenstoffmetabolismus darstellt. Die meisten GDHs liegen als

Hexamere mit einem Molekulargewicht von rund 300.000 Da vor [51].

5.2.2 Struktur und Funktion

5.2.2.1 Struktur

Die Glutamatdehydrogenase von Plasmodium falciparum ist ein Homohexamer aus

sechs identischen Untereinheiten, wobei jede Subeinheit, dargestellt in Abb. 5.5, ein

Molekulargewicht von 49.500 Da aufweist. Jedes Monomer kann durch eine tiefe

Spalte, in der sich die Substrat- und Cofaktor-Bindestellen befinden, in zwei Domänen

unterteilt werden. Im Allgemeinen führt eine Substrat- und Cofaktorbindung bei GDHs

zu einer großen Konformationsänderung, die ihrerseits dazu führt, Substrat und

Cofaktor in einer katalytisch günstigen Position einzuschließen [52]. Die Sequenz-

anordnung der plasmoidalen GDH deutet an, dass es sich um ein sehr altes Protein

handelt, welches in enger Beziehung zu Eubakterien und Hefen steht, jedoch weit

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Theoretischer Teil - 5 Verwendete Targets 33

entfernt von höheren Eukaryoten ist. Dies zeigt auch die eher marginale Sequenz-

übereinstimmung mit der menschlichen GDH [53].

Abb. 5.5: : Struktur eines Monomers der Glutamatdehydrogenase von P. falciparum,

erstellt mit PyMOL [62]

Die parasitäre GDH ist N-terminal um 30 Aminosäuren länger als die humane. Die

Funktion dieser Verlängerung, die in bisher keiner anderen charakterisierten GDH

entdeckt worden ist, ist bisher noch nicht geklärt [52, 53]. Wie die kürzlich

veröffentlichte Kristallstruktur zeigt, sind die Substrat-Bindestellen humaner und

parasitärer GDH sehr stark konserviert. Dafür unterscheiden sich jedoch die

Wechselwirkungen der Untereinheiten zueinander signifikant [52].

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34 Theoretischer Teil - 5 Verwendete Targets

5.2.2.2 Funktion

Die Aminogruppe der meisten Aminosäuren wird durch eine Transaminierung auf

2-Oxoglutarat übertragen, wobei Glutamat entsteht. Die GDH katalysiert die in Abb. 5.6

dargestellte reversible oxidative Desaminierung von Glutamat (Hinreaktion), wobei

wiederum 2-Oxoglutarat entsteht und Ammoniak freigesetzt wird. Das dabei hydrierte

Nicotinamid-Coenzym kann den Wasserstoff auf die Atmungskette oder andere

Systeme übertragen. Der entstandene Ammoniak wird dann als Harnstoff gebunden und

in dieser Form über den Harnstoffzyklus ausgeschieden. Während die tierische GDH

sowohl NAD+ als auch NADP+ als Coenzyme nutzen kann, ist die GDH von

Mikroorganismen dagegen nur für jeweils eins von beiden spezifisch [51]. Im Fall der

plasmoidalen GDH ist es das NADP+ [54].

Abb. 5.6: Reaktion der Glutamatdehydrogenase

Im menschlichen Organismus dient die Glucose-6-phosphatdehydrogenase (G6PD) als

Hauptlieferant für NADPH. Im Plasmodium falciparum dagegen wird die GDH als

wahrscheinlich größte NADPH-Quelle angesehen, da die Aktivität der G6PD des

Plasmodiums im Vergleich zu der des Wirtes nur mäßig ist [54]. Die parasitäre GDH ist

außerdem ein Marker-Enzym für den Befall mit Plasmodien, da menschliche

Erythrozyten über keine eigene GDH verfügen [55]. Dabei zeigen western-blot

Analysen, dass die GDH in allen intraerythrozytären Stadien des Erregers zu finden ist.

Die Bereitstellung des L-Glutamats erfolgt scheinbar über L-Glutamin, worauf die

verstärkte Glutaminaufnahme nach Erythrozyteninfektion hinweist. Unter Verbrauch

von einem Molekül NADPH können aus L-Glutamin über die parasitäre

Glutamatsynthase zwei Moleküle L-Glutamat entstehen, aus denen wiederum über die

GDH ein NADPH pro L-Glutamat, also im Endeffekt zwei, generiert werden. Zusätzlich

könnte dieses Coenzym in infizierten roten Blutkörperchen dazu dienen, Desoxy-

ribonukleotide, die Vorstufen der DNA-Synthese, zu bilden [53]. Die Hauptaufgabe

jedoch besteht darin, Glutathion (GSH) in der reduzierten Form zu halten, da dieses eine

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Theoretischer Teil - 5 Verwendete Targets 35

große Rolle bei der Detoxifikation reaktiver Sauerstoff-verbindungen spielt und so

oxidationsempfindliche SH-Gruppen von Enzymen, Hämoglobin und der

Erythrozytenmembran schützt. Die Glutathionreduktase (GR) katalysiert die Reduktion

von Glutathiondisulfid (GSSH) zu GSH und bekleidet daher eine Schlüsselposition in

der zellulären Redox-Homöostase. Im Plasmodium wirken sich oxidierende

Bedingungen nachteilig auf das Wachstum aus. Für das Überleben der Plasmodien sind

sowohl die humane, als auch die parasitäre GR wichtig, da die Malariaerreger

empfindlicher gegenüber oxidativem Stress sind als ihre Wirtszellen [56-59].

Durch die Hemmung der GDH wird dem Parasiten die NADPH-Quelle entzogen.

Interessanter Weise führt schon die mangelnde Bereitstellung des Coenzyms durch den

Wirt zu einer schlechten Vermehrung des Parasiten. Daher besitzen Menschen mit

einem Glucose-6-phosphatdehydrogenase-Mangel eine erhöhte Resistenz gegen Malaria

[60]. In Kombination mit der geringen Übereinstimmung zwischen humaner und

plasmoidaler GDH stellt dies einen aussichtsreichen therapeutischen Ansatzpunkt dar.

Dazu kommt, dass das rote Blutkörperchen keine eigene GDH enthält, nach einer

Infektion mit Malaria aber durchlässig für anionische Compounds wird und die

Substrate für die GDH anionisch sind [53, 61].

Bei der von uns verwendeten GDH handelt es sich um die GDH von Escherichia coli,

welches sich zwar geringfügig von der des Plasmodium falciparums unterscheidet,

jedoch sehr viel besser zu handhaben ist.

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36 Theoretischer Teil - 6 Untersuchung der Wirkung von Clomazone

6 Untersuchung der Wirkung von Clomazone auf

einfache Gartenkresse bezüglich seines Einflusses

auf den alternativen Isoprenoidbiosyntheseweg

6.1 Einleitung

Clomazone (Dimethazone, Formel s. Anhang B S.161) ist ein Herbizid, welches

bevorzugt über die Wurzeln aufgenommen wird und danach systemisch in die

Syntheseprozesse von Chlorophyll und Carotinoiden eingreift [63], wodurch Unkräuter

ausbleichen und absterben [64]. Bisher ist nicht bekannt, auf welche Art und Weise

Clomazone wirkt [65], jedoch ist die verminderte Chlorophyllproduktion ein Zeichen

dafür, dass es in den Isoprenoidstoffwechsel eingreift. Die meisten höheren Pflanzen

besitzen nur den Mevalonat-abhängigen Isoprenoidbiosyntheseweg, welcher durch

Clomazone nicht gehemmt wird [66]. Besitzen sie jedoch beide Biosynthesewege, so

wird der MEP-Weg hauptsächlich für die Bereitstellung der Terpene verwendet, wozu

auch eine Seitenkette des Chlorophylls und die Carotinoide gehören, während der

herkömmliche Mevalonat-abhängige Weg größtenteils für die Synthese der Sterole

verantwortlich ist [67]. Sollte Clomazone in den MEP-Weg eingreifen, wäre das eine

Erklärung dafür, weshalb nicht alle Pflanzen nach Clomazonezugabe mit einer

Entfärbung der Blätter reagieren. Der Aktivitätsassay mit Clomazone auf DXR zeigte

keine Inhibition [67a], so dass sich die Frage stellte, ob es nach Aufnahme in die

Pflanze zu einem wirksamen Liganden für DXR derivatisiert wird. Mit der Methode des

Ligandenfischens mit DXR als Target sollte eine Möglichkeit existieren nachzuprüfen,

ob aus Clomazone in der Pflanze ein Metabolit entsteht, der in der Lage ist, das Target

zu inhibieren [67b]. Für diese Untersuchung wurde eine Pflanze gesucht, die günstig in

der Anschaffung, möglichst schnell wachsend, einfach in der Anzucht und empfindlich

gegen Clomazone ist. Die Gartenkresse weist eine sehr kurze Keimzeit auf und wird

daher in der Forschung oft bei physiologischen Experimenten verwendet. Die

Keimlinge stellen hier den Indikator bei der Testung von wachstumshemmenden und

allgemeintoxischen Wirkungen chemischer Verbindungen jeglicher Art dar. Da die

Gartenkresse alle Kriterien erfüllte, wurde sie für die folgenden Versuche ausgewählt.

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Theoretischer Teil - 6 Untersuchung der Wirkung von Clomazone 37

Aus dem wässrigen Extrakt der mit Clomazone behandelten Kresse wurde mit DXR

gefischt. Dabei konnte ein inhibierender Metabolit ermittelt werden. Leider waren die

Mengen so gering, dass eine Strukturermittlung nicht gelang.

6.2 Herstellung der Kresseextrakte

6.2.1 Gesamtextrakt

Die Samen der einfachen Gartenkresse wurden auf Baumwollwatte verteilt und mit

herkömmlichem Leitungswasser gegossen, bis die Watte gut durchtränkt war. Nach 24-

stündigem Quellen wurde eine Clomazone-Lösung zugegeben. Im Vergleich zu

unbehandelter Kresse wurde diese nicht grün, sondern weiß und blieb kleinwüchsig.

Eine Woche nach der Behandlung wurden die Pflanzen geerntet und unter Zugabe von

flüssigem Stickstoff im Mörser zermahlen. Die so zerkleinerte Pflanzenmasse wurde

mit Wasser versetzt und die noch enthaltenen Zellen mittels Ultraschallstab dreimal

1 min. lang lysiert. Nach Abzentrifugieren wurde der Überstand unter vermindertem

Druck getrocknet. Der Rückstand stellte den Gesamtextrakt der Kresse dar. Parallel

dazu wurde auch unbehandelte Kresse nach einer Woche geerntet und wie die

behandelte Kresse zu einem Extrakt verarbeitet.

6.2.2 Selektive Extrakte

Nach den viel versprechenden Ergebnissen des ersten Fischens aus dem Gesamtextrakt

wurden selektive Extrakte hergestellt. Dafür wurde Kresse wieder nach 24 Stunden mit

Clomazone behandelt und nach einer Woche geerntet. Durch Zugabe von flüssigem

Stickstoff wurde die Kresse schockgefroren, dann im Mörser zermalen und

anschließend in Hexan mit einem Ultra-Turrax weiter zerkleinert. Die so erhaltene

Suspension wurde in eine leere, präparative HPLC-Säule gefüllt. Nach Ablassen des

Hexans verblieb die zerkleinerte Kresse in der Säule und wurde weiter erschöpfend,

zunächst mit Hexan und dann mit Lösungsmitteln steigender Polarität extrahiert. Auf

Hexan folgte Dichlormethan, dann Methanol, Methanol/Wasser und schließlich Wasser.

Die so erhaltenen Lösungen wurden unter vermindertem Druck von den jeweiligen

Lösungsmitteln befreit. Während der Extraktion mit Dichlormethan wurde Wasser vom

Lösungsmittel mitgeschleppt, welches aus der Pflanze selber kam, da die Kresse vorher

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38 Theoretischer Teil - 6 Untersuchung der Wirkung von Clomazone

nicht getrocknet wurde. Diese wässrige Phase wurde abgetrennt und ebenfalls unter

vermindertem Druck vom Lösungsmittel befreit.

6.2.3 Analytische Extrographie

Pflanzenextrakte stellen im Allgemeinen ein sehr komplexes Gemisch vieler

Verbindungen dar. Um in einem ersten Schritt bereits sehr selektive Fraktionen zu

erhalten, wird das Verfahren der Extrographie als Weiterentwicklung der von Halász

erarbeiteten Methode der Fraktionierung von Erdöldestillationsrückständen [68, 69] seit

langem in unserem Arbeitskreis angewendet. Dafür wurde der Gesamtextrakt in

Methanol gelöst und auf Kieselgel aufgezogen. Anschließend wurde eine

semipräparative HPLC-Säule zunächst mit unbehandeltem Kieselgel und zum Schluss

mit dem beladenen Material trocken gepackt. Mit einem geeigneten

Lösungsmittelgradienten wurden Fraktionen erhalten, die nach Zeit aufgefangen, nach

Zusammengehörigkeit vereint und vom Lösungsmittel befreit wurden.

6.3 Vergleich der Inhaltsstoffe von behandelter mit unbehandelter

Kresse

Die hergestellten Gesamtextrakte aus behandelter (bK) und unbehandelter (uK) Kresse

wurden kapillarflüssigchromatographisch auf einer Umkehrphase vermessen. Vergleicht

man die erhaltenen Chromatogramme (s. Abb. 6.1), so sind bei einer Retentionszeit von

etwa 14 min. und 19 min. Zunahmen der Peakflächen im Chromatogramm der mit

Clomazone behandelten Kresse (oberes Chromatogramm) und bei ca. 18 min. eine

Abnahme der Peakfläche im Chromatogramm der unbehandelten Kresse zu erkennen.

Dabei stimmen die UV-Spektren nur für den Peak bei ca. 19 min. überein.

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Theoretischer Teil - 6 Untersuchung der Wirkung von Clomazone 39

6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00Time-13

100

%

-13

100

%

KRESSE_CLOMA_24H_18_06_0(1) Diode Array TIC

9.80e624.93

21.2320.2319.09

9.36

6.995.897.88

16.13

11.29 14.1115.76

16.86

18.0123.51

KRESSE_18_06_01_ACN-H2O_1 Diode Array TIC

9.80e625.29

18.16

16.219.21

6.835.74

7.68 11.19

15.7914.09

16.98

20.48

20.26

21.46

23.88

Abb. 6.1: Chromatogramme der Wasserextrakte aus mit Clomazone behandelter(oben)

und unbehandelter (unten) Kresse

6.4 Fischen in Kresseextrakten

6.4.1 Fischbedingungen

Zunächst mussten die Bedingungen für das Fischen mit DXR optimiert werden.

Fosmidomycin wurde als bereits bekannter Inhibitor verwendet, wobei 1 nmol/ml

Fosmidomycin 1 µg/ml Enzym hemmen. Die Nachweisgrenze für Fosmidomycin liegt

bei 2 nmol und das UVmax bei λ = 238 nm. Das Enzym selber ist in einem TRIS-Puffer

mit pH=8 bei +4°C ungefähr 14 Tage stabil. Tiefgefroren ist es einige Monate haltbar.

Dafür wird es in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -45°C aufbewahrt.

Da das Fosmidomycin an den Filter oder die Filtermembran aus regenerierter Cellulose

bindet, war eine Optimierung des Fischens mit DXR nicht möglich. Auch die

Verwendung einer Filtermembran aus Polyethersulfon brachte kein positives Ergebnis.

Trotz allem wurde mit DXR gefischt, da die Möglichkeit besteht, dass der potentielle

Inhibitor in der Kresse nicht an den Filter bindet. Es wurde bei 37°C inkubiert und in

einem wässrigen Aktivitätspuffer bei pH = 7,5 gearbeitet.

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40 Theoretischer Teil - 6 Untersuchung der Wirkung von Clomazone

6.4.2 Fischen im Gesamtextrakt

Es wurden sowohl der Extrakt aus der behandelten (bK) als auch der Extrakt aus der

unbehandelten Kresse (uK) für die Fischexperimente verwendet. Eingesetzt wurden

dabei Lösungen mit einer Gesamtextraktkonzentration von c = 5 mg/ml. Die folgende

Abbildung (Abb. 6.2) zeigt die Chromatogramme der Freisetzungen des Fischens mit

dem bK-Extrakt. Dabei ist oben das Chromatogramm der Probe und darunter das der

Blindprobe dargestellt. Bei tR = 19.82 min. der Probe ist im Vergleich zur Blindprobe

ein Peak erkennbar.

6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00Time-97

100

%

-114

100

%

41C Diode Array TIC

6.97e517.12

14.83

7.52

16.5825.4819.8220.40

41D Diode Array TIC

7.24e517.84

17.4715.65

7.60

25.79

20.9427.22

Abb. 6.2: Chromatogramme der Freisetzungen des Fischens mit DXR im Wasserextrakt

aus mit Clomazone behandelter Kresse. Oben Probe, unten Blindprobe.

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Theoretischer Teil - 6 Untersuchung der Wirkung von Clomazone 41

Abb. 6.3: Fischen mit DXR in Wasserextrakten unbehandelter (links) und mit

Clomazone behandelter (rechts) Kresse. Oben jeweils die Probe, unten

jeweils die Blindprobe.

Dies passt zur gefundenen Zunahme des Peaks bei etwa 19 min. des

Übersichtschromatogramms (vgl. Abb. 6.1). Sieht man sich den gleichen Bereich in den

Chromatogrammen der Freisetzungen des Fischens im uK-Extrakt an, so ist der

interessante Peak weder in der Probe, noch in der Blindprobe zu finden (s. Abb. 6.3).

Links ist das Fischen im nK-Extrakt, rechts das Fischen im bK-Extrakt dargestellt,

wobei das obere jeweils die Probe und das untere jeweils die Blindprobe ist. Man sieht

eine leichte Verschiebung der Peaks in der Blindprobe der Freisetzung des bK-Extrakts,

jedoch ist auf Grund der Spektren der Peak bei 20.92 min. eindeutig als der bei

20.40 min. der Freisetzung der Probe und als der vordere des Doppelpeaks bei den

Chromatogrammen der Freisetzungen des nK-Extrakts zuzuordnen (mit Stern

gekennzeichnete Peaks). Somit stammt im rechten oberen Chromatogramm der Peak bei

19.82 min von einem Clomazonemetaboliten, der mit DXR eine relativ starke

Wechselwirkung aufweist.

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42 Theoretischer Teil - 6 Untersuchung der Wirkung von Clomazone

6.4.3 Fischen in den selektiven Extrakten

Da der gefischte Peak nicht im Chromatogramm des Filtrationsschrittes zu finden war,

konnte von einer guten Wechselwirkung ausgegangen werden. Es wurden nun selektive

Extrakte hergestellt und die einzelnen Extrakte unterschiedlicher Polarität in einer

Konzentration von 5 mg/ml zum Fischen eingesetzt. Dabei wurden im Methanol-

Extrakt drei Substanzen gefischt, wovon die eine nach dem UV-Spektrum der bereits

vorher gefischten Substanz zugeordnet werden kann. Nach Überprüfung der restlichen

selektiven Extrakte durch Fischen und Freisetzen kann gesagt werden, dass die größte

Konzentration an „fischbaren Metaboliten“ im Methanol-Extrakt (vgl. Abb. 6.4) zu

finden ist.

20.00 20.50 21.00 21.50 22.00 22.50 23.00 23.50 24.00 24.50 25.00Time35

100

%

35

100

%

159d neu Diode Array TIC

8.99e522.28

21.93

20.85

22.90

24.10

158d Diode Array TIC

8.99e5

23.97

Abb. 6.4: Chromatogramme der Freisetzungen des Fischens mit DXR im selektiven

Methanol-Extrakt von Kresse, die mit Clomazone behandelt wurde. Oben die

Probe, unten die Blindprobe.

6.4.4 Fischen in Fraktionen der analytischen Extrographie

Der übliche Weg – über Aktivitätsassays den wirksamen selektiven Extrakt zu ermitteln

– konnte nicht beschritten werden, da die optische Dichte aller Extrakte bei der

entsprechenden Wellenlänge viel zu hoch war. Deshalb wurde zunächst der selektive

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Theoretischer Teil - 6 Untersuchung der Wirkung von Clomazone 43

wässrige Extrakt chromatographisch in Unterfraktionen geteilt in der Hoffnung, dass

Wirkung und optische Dichte nicht parallel einhergehen. In den rein wässrigen

Fraktionen der analytischen Extrographie konnten zwei Substanzen gefischt werden (s.

Abb. 6.5), wobei eine Konzentration von 1 mg/ml eingesetzt worden ist.

20.00 20.50 21.00 21.50 22.00 22.50 23.00 23.50 24.00 24.50 25.00Time45

100

%

66

100

%

126d Diode Array TIC

4.95e5

22.26

21.93

127d Diode Array TIC

4.95e5

Abb. 6.5: Chromatogramme der Freisetzungen des Fischens mit DXR in einer

wässrigen Fraktion der analytischen Extrographie. Oben die Probe, unten die

Blindprobe.

6.5 Aktivitätsassay

Der bei unserem Kooperationspartner durchgeführte Aktivitätsassay der analytischen

Extrographiefraktion ergab eine ungefähre Inhibition um 40 % bei einer Konzentration

von 0,1 mg/ml. Würde es sich um eine Reinsubstanz handeln, so entspräche dies einer

sehr mäßigen Inhibition. Im vorliegenden Fall jedoch, handelt es sich um eine Fraktion,

also ein Substanzgemisch mit unterschiedlichen Einzelsubstanzkonzentrationen, so dass

keine Aussage über die Potenz der enthaltenen Substanzen gemacht werden kann.

6.6 Zusammenfassung und Diskussion

Es konnte gezeigt werden, dass nach Clomazonebehandlung offensichtlich neue

Substanzen in Kresse entstehen. Der Vergleich mit unbehandelter Kresse zeigt, dass

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44 Theoretischer Teil - 6 Untersuchung der Wirkung von Clomazone

zwei Substanzen durch Clomazonebehandlung neu gebildet werden, die Bildung einer

dritten Substanz aber unterdrückt wird. Das Fischen aus der mit Clomazone behandelten

Kresse setzte eine Verbindung frei, die zur gleichen Zeit eluiert wie die vermutete neue

Substanz. Weiterhin taucht dieser Peak im Fischen mit DXR in unbehandelter Kresse

nicht auf. Ein Aktivitätsassay scheiterte, da die optische Dichte zu hoch war. Nach

entsprechend hoher Verdünnung war keine Aktivität mehr nachweisbar. Das mag an der

aus der Verdünnung resultierenden, sehr geringen Konzentration des potentiellen

Liganden liegen. Weiterhin sind im Filtrat des Gesamtextrakts noch zu viele Substanzen

enthalten, was einmal zu der hohen optischen Dichte führt und zum anderen das

Auffinden der gefischten Substanz im Chromatogramm des Filtrats erschwert. Deshalb

wurden selektive Extrakte hergestellt und zum Fischen verwendet. Das Fischen aus den

lipophileren Extrakten brachte kein Ergebnis. In Methanol-, Methanol/Wasser- und dem

ersten Wasserextrakt, der aus dem Dichlormethan gewonnen wurde, wurden zwei bzw.

drei Substanzen gefischt, wobei deren Gehalt im Methanol-Extrakt am höchsten war.

Der letzte Wasserextrakt enthielt keinen potentiellen Liganden mehr. Auch die optische

Dichte der selektiven Extrakte erwies sich als noch zu hoch für Aktivitätsassays. Die

extrographisch durchgeführte Trennung führte zu wässrigen Fraktionen, aus denen sich

wieder die auch vorher schon erfassten Substanzen fischen ließen. Der Aktivitätsassay

lieferte eine moderate Inhibition bei einer relativ hohen Substanzmenge. Da es sich bei

diesen Fraktionen noch um Substanzgemische mit unterschiedlichen

Einzelsubstanzkonzentrationen handelt, können keine weiteren Schlüsse gezogen

werden.

6.7 Ausblick

An dieser Stelle wurde das Projekt abgebrochen, da der Kooperationspartner durch

Insolvenz arbeitsunfähig war. Das viel versprechende Ergebnis konnte nicht bis zu einer

Strukturaufklärung weiterverfolgt werden. Weiterhin war auch die Herstellung des

Pflanzenmaterials ein Problem. Die Kresse ist zwar sehr genügsam und keimt und

wächst sehr schnell, da aber nach Clomazone-Zugabe die Chlorophyllproduktion

verhindert wird, ist die Kresse auch nach einer Woche nicht sehr groß. Die

ursprüngliche Aufgabenstellung jedoch konnte im positiven Sinne erfüllt werden. Wir

konnten zeigen, dass durch Clomazonebehandlung in der einfachen Gartenkresse

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Theoretischer Teil - 6 Untersuchung der Wirkung von Clomazone 45

Derivate entstehen, die DXR inhibieren, worauf die Fischergebnisse mit dem Protein

hindeuten. Auf Grund der UV-Spektren vermuten wir, dass es sich bei diesen Derivaten

um Metabolite des Clomazones handelt.

Auch Lange und Mitarbeiter haben einen unbekannten Metaboliten nach

Clomazonebehandlung von sekretorischen Zellen der Öldrüsen von Mentha x piperita L.

entdeckt [65]. In der gleichen Veröffentlichung im September 2001 bestätigen sie DXR

als Target für Fosmidomycin, machen jedoch keine Aussage bezüglich einer Inhibition

durch Clomazone oder einen Metaboliten. Die von uns gezeigte Wechselwirkung

zwischen den entstandenen Metaboliten und DXR kann demnach auch zu folgender

Überlegung führen: Neben Inhibitoren der DXR könnten die entstandenen Metabolite

falsche Substrate für das Enzym darstellen, die das Protein zwar nicht inhibieren, jedoch

zu falschen Zwischenprodukten führen. Diese wären dann wiederum keine Substrate

mehr für das nächste Enzym im MEP-Weg, wodurch in der Folge auch keine

Terpenoide mehr entstehen könnten.

Da Clomazone definitiv in den MEP-Weg der Isoprenoidbiosynthese eingreift, sind

seine Metaboliten denkbar für den Einsatz gegen Plasmodien. Eine Aufklärung des

Wirkmechanismus ist jedoch bis heute noch nicht erfolgt.

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46 Theoretischer Teil - 7 Mögliche antiplasmoidale Inhaltsstoffe von Knoblauch

7 Mögliche antiplasmoidale Inhaltsstoffe von

Knoblauch

7.1 Einleitung

Auf der 50.Jahrestagung der American Society of Tropical Medicine and Hygiene (10.

– 15.11.2001) stellte Ian Crandall von der Universität of Toronto Daten vor, laut denen

Knoblauch einen Schutzeffekt vor Malaria bietet. Er und seine Mitarbeiter testeten elf

verschiedene Disulfide auf ihre Wirkung an mit Malaria infizierten Zellen. Die

positiven unter ihnen erwiesen sich auch als wirksam gegen Krebszellen. Sie nehmen

daher an, dass in beiden Fällen der gleiche Wirkmechanismus dafür verantwortlich ist

und vermuten, dass die Disulfide in die Glutathionregulation eingreifen [70].

Da die GDH zwar nicht direkt, aber indirekt über die NADPH-Bereitstellung ebenfalls

die Redox-Homöostase mittels Glutathion beeinflusst, stellte sich die Frage, ob die

antiplasmoidale Wirkung eventuell über eine Hemmung dieses Enzyms verlaufen

könnte. Daher haben wir mit GDH in einem Gesamtextrakt aus Knoblauch gefischt. Es

ist zwar gefischt worden, jedoch konnten nicht alle Peaks eindeutig zugeordnet werden.

Daher wurden selektive Extrakte hergestellt und in diesen nochmals mit GDH gefischt.

Die Fischergebnisse aus dem Gesamtextrakt konnten bestätigt werden, jedoch fehlte uns

für eine Aktivitätsbestimmung und Strukturaufklärung mehr Enzym. Der sich daraus

folgend anschließende Versuch, die Glutamatdehydrogenase selber zu exprimieren,

verlief negativ.

7.2 Fischen aus einem methanolischen Knoblauchgesamtextrakt

Da uns kein Inhibitor der GDH zur Verfügung stand, konnten die Fischbedingungen

vorher nicht optimiert werden. Es wurde im wässrigen Milieu und bei 30°C gearbeitet.

Ein methanolischer Gesamtextrakt aus Knoblauch wurde zunächst für die ersten

Fischversuche verwendet. Es wurde eine wässrige Lösung mit einer Konzentration von

5 mg/ml hergestellt. Mit dieser wurde in zwei unterschiedlichen Mengen gefischt,

einmal 50 µl pro Ansatz und parallel 100 µl pro Ansatz. Wie folgende Abbildung vom

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Theoretischer Teil - 7 Mögliche antiplasmoidale Inhaltsstoffe von Knoblauch 47

Ansatz mit 50 µl Knoblauchlösung zeigt, ist in der Probe (oben) der Peak bei 16.15 min.

deutlich höher, als der dazugehörige im Blindansatz bei 16.10 min.

Abb. 7.1: Chromatogramm der Freisetzungen für Fischen mit GDH in Knoblauch.

Oben Probe, unten Blindprobe

Ebenso ist eine sichtbare Freisetzung für den Peak bei 19.33 min. zu erkennen. In der

Blindprobe dagegen ist der Peak nur zu erahnen. Der Peak bei 29 min., bzw. 28 min. in

der Blindprobe dagegen, ist sehr gut in beiden Freisetzungslösungen zu sehen, wobei in

der Probe mehr freigesetzt wurde. Auch der Fischansatz mit der größeren Menge an

Knoblauchlösung zeigte eine Flächenzunahme der betrachteten Peaks in der Freisetzung

der Probe. Um das Ganze zu verdeutlichen, wurden anschließende Diagramme für den

Versuch mit 50µl Knoblauchlösung erstellt.

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48 Theoretischer Teil - 7 Mögliche antiplasmoidale Inhaltsstoffe von Knoblauch

0

20

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60

80

100

120

Filtration 1. Waschung 2. Waschung Freisetzung

AU

in T

ause

nd

Probe Blind

Abb. 7.2: Diagramm für den Peak bei ca. 16 min. des Fischens mit GDH aus

Knoblauch

0

20

40

60

80

100

120

Filtration 1. Waschung 2. Waschung Freisetzung

AU

in

Tau

send

Probe Blind

Abb. 7.3: Diagramm für den Peak bei ca. 19 min. des Fischens mit GDH aus

Knoblauch

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Theoretischer Teil - 7 Mögliche antiplasmoidale Inhaltsstoffe von Knoblauch 49

In Abb. 7.2 kann man sehr gut erkennen, dass die betrachtete Substanz bei ca. 16 min.

im Filtrat des Filtrationsschrittes im Überschuss vorliegt, der unspezifisch gebundene

Anteil in den Waschschritten entfernt wird und nach der Freisetzung im Vergleich zur

Blindprobe eine mehr als doppelt so große Menge in der Probe auftritt. Für die zweite

gefischte Substanz (Peak bei ca. 19 min. vgl. Abb. 7.3) ist nur eine Freisetzung in der

Probe erkennbar. Im Filtrationsschritt der Blindprobe ist die Substanz nicht zu finden.

Für den dritten Peak bei ca. 29 min. wurde kein Diagramm erstellt, da die Substanz in

einem zu hohen Überschuss vorlag, so dass zwar optisch in der Freisetzung der Probe

mehr detektiert wurde als im Blindversuch, jedoch im Vergleich zu den einzelnen

Fischschritten nur ein Herunterwaschen zu erkennen ist. Da aber nicht ausgeschlossen

werden kann, dass es sich dabei um eine bindende Substanz handelt, wird auch diese in

den selektiven Extrakten betrachtet.

7.3 Fischen aus den selektiven Knoblauchextrakten

Um dem Enzym weniger Substanzen mit höherer Konzentration zu präsentieren und

damit bessere Fischergebnisse zu erzielen, wurden selektive Extrakte aus

Knoblauchpulver hergestellt. Zum Fischen wurde aus jedem Extrakt nach Zugabe von

5% Ethanol eine wässrige Lösung mit einer Konzentration von 5mg/ml hergestellt. Von

diesen Lösungen wurden je Fischansatz 100µl verwendet. Der Peak bei tR~16 min. wird

nur im Ethanolextrakt eindeutig gefischt, wie Abb. 7.4 deutlich macht. Wie man

weiterhin sieht, ist nicht soviel freigesetzt worden, wie beim Fischen aus dem

Gesamtextrakt. Der Peak bei ca. 29 min. konnte im Ansatz mit dem

Dichlormethanextrakt gefischt werden (vgl. Abb. 7.5). Dabei ist in etwa soviel gefischt

worden, wie auch aus dem Gesamtextrakt.

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50 Theoretischer Teil - 7 Mögliche antiplasmoidale Inhaltsstoffe von Knoblauch

0

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120

Filtration 1. Waschung 2. Waschung Freisetzung

Au

in T

ause

nd

Probe Blind

Abb. 7.4: Diagramm für den Peak bei ca. 16 min. des Fischens mit GDH aus dem

selektiven Knoblauch-Ethanolextrakt

0

20

40

60

80

100

120

Filtration 1. Waschung 2. Waschung Freisetzung

AU

in T

ause

nd

Probe Blind

Abb. 7.5: Diagramm für den Peak bei ca. 29 min. des Fischens mit GDH aus dem

selektiven Knoblauch-Dichlormethanextrakt

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Theoretischer Teil - 7 Mögliche antiplasmoidale Inhaltsstoffe von Knoblauch 51

7.4 Aktivitätsassay der GDH

Um die Annahme zu bestätigen, dass Knoblauch auf die GDH inhibierend wirkt, wurde

ein Aktivitätsassay durchgeführt. Als Testsystem wurde dabei die Hinreaktion der GDH

verwendet. Zunächst wird ein Leerwert vermessen, der zeigen soll, ob das Enzym noch

genug Aktivität aufweist. Leider war in unserem Fall die Absorptionszunahme zu flach,

also die Aktivität der GDH nicht mehr sehr hoch. Der Test, der trotzdem mit einer

Lösung von 5mg/ml des Gesamtextraktes durchgeführt wurde, verlief negativ, da die

optische Dichte zu hoch war. Nach einer 1:100 Verdünnung war keine Aktivität

feststellbar. Der Gesamtextrakt wurde gewählt, da nicht mehr viel Protein vorhanden

war.

7.5 Expression von GDH

Da zu wenig Enzym vorhanden war, um weitere Aktivitätstests, bzw. weitere

Fischversuche durchführen zu können, musste die GDH neu exprimiert werden, was

jedoch misslang.

7.6 Fischen mit DXR

Da wir über ein weiteres Target gegen Plasmodium falciparum verfügen, wurde auch

mit diesem, der DXR, im Knoblauch-Gesamtextrakt gefischt. Dieses gab jedoch keine

positiven Ergebnisse.

7.7 Zusammenfassung und Diskussion

In diesem Kapitel ist gezeigt worden, dass im Knoblauch Substanzen enthalten sind, die

über eine Interaktion der GDH potentiell antiplasmoidal wirken könnten. Es wurden

drei Substanzen gefunden, die gefischt und in größeren Mengen auch freigesetzt

wurden. Zwei von ihnen sind auch eindeutig im Filtrat des Filtrationsschrittes zu finden,

obgleich sie nicht ganz rein vorliegen, wie Vergleiche der UV-Spektren zeigen.

Die Substanz mit einer Retentionszeit von ungefähr 16 min. konnte in den drei

lipophileren selektiven Extrakten in der Freisetzung nachgewiesen werden, eindeutig

gefischt wird sie allerdings nur im Ethanolextrakt. Die Substanz mit der Retentionszeit

von ca. 19 min ist in keinem der selektiven Extrakte gefischt worden, so dass es sich

dabei eventuell um eine synergistisch wirkende Komponente handelt, deren Partner sich

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52 Theoretischer Teil - 7 Mögliche antiplasmoidale Inhaltsstoffe von Knoblauch

nicht im gleichen selektiven Extrakt befand. Die Verbindung mit der Retentionszeit bei

etwa 29 min konnte im Gesamtextrakt nicht eindeutig gefischt werden. Zwar war in der

Freisetzung der Probe mehr detektiert worden, als in der Freisetzung des Blindversuchs,

im Gesamtüberblick mit allen vier Fischschritten jedoch war nur ein Herunterwaschen

zu erkennen. Wie Spektrenvergleiche zeigen, lag unter dem betrachteten Peak jedoch

mindestens noch ein zweiter, was eine Erklärung für die hohe Substanzmenge und den

Effekt des Herunterwaschens ist. Diese Verbindung konnte nach Fischen in den

selektiven Extrakten im Dichlormethanextrakt gefischt werden.

Vergleicht man von der Substanz bei tR~16 min. die freigesetzten Mengen aus dem

Gesamtextrakt mit den freigesetzten Mengen im selektiven Extrakt, so ist erheblich

mehr beim Fischen aus dem Gesamtextrakt freigesetzt worden. Der Grund dafür könnte

die nachgewiesene, verminderte Aktivität des Enzyms sein, da auf Grund der

Herstellung der selektiven Extrakte einige Zeit zwischen den Fischexperimenten lag.

Ein Test auf die inhibierende Aktivität des Knoblauchgesamtextrakts verlief negativ,

was an der 1:100 Verdünnung liegen kann. Eine potentiell inhibierende Substanz könnte

nach der Verdünnung in so geringer Konzentration vorliegen, dass sie keine

inhibierende Wirkung mehr zeigt.

Auf Grund der niedrigen Aktivität des Enzyms musste dieses neu exprimiert werden.

Diverse Expressionsversuche verliefen negativ, was auf das Alter der transfizierten

Zellen zurückzuführen war. Da uns leider keine neu transfizierten Zellen zur Verfügung

standen, war es uns auf Grund des fehlenden Enzyms nicht möglich, dieses Projekt

weiter zu verfolgen.

Für die gefischte Substanz bei einer Retentionszeit von etwa 16 min. könnte es sich auf

Grund der frühen Elution um Allicin handeln. Diesem wird ein antioxidativer Effekt

nachgesagt, dabei handelt es sich eigentlich um ein Prooxidans. Im Blut wird es sofort

zu Allylmercaptan umgesetzt [71]. Jedoch ist bei weiterer Allicinzufuhr eine Oxidation

von Hämoglobin zu Methämoglobin zu beobachten [72], was für die oxidative Wirkung

spricht. Ein weiteres Indiz für Allicin als mögliche hemmende Verbindung ist die

größere Wiederfindung in der Freisetzung des methanolischen Gesamtextrakts, im

Gegensatz zur Freisetzung des selektiven Ethanolextrakts, da das Allicin in Methanol

stabiler ist [72]. Der selektive Ethanolextrakt ist aber aus der Droge gewonnen worden,

nachdem diese bereits erschöpfend mit Hexan und Dichlormethan extrahiert worden ist.

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Theoretischer Teil - 7 Mögliche antiplasmoidale Inhaltsstoffe von Knoblauch 53

Neben Allicin besitzt Knoblauch noch eine Reihe weiterer Disulfide, die auf einer RP-

18-Säule ebenfalls bei kleineren Retentionszeiten eluieren und daher in Betracht

kommen könnten, die GDH zu hemmen. Weiterhin eluieren in diesem Bereich auch

Alliin, Deoxyalliiin, Glutamylallylcystein, Glutamylpropenylcystein und

Glutamylphenylalanin [73]. Bis auf die letzten beiden Verbindungen weisen alle

anderen keine charakteristischen Spektren auf, was durch das Fehlen chromophorer

Strukturen begründet ist. In der Praxis werden diese Substanzen daher

massenspektrometrisch detektiert. Wird jedoch ein UV-Gerät für die Detektion

verwendet, so wird in einem Bereich von λ = 208-220 nm detektiert [73, 74].

Wie eingangs erwähnt, vermuten Crandall und Mitarbeiter Disulfide als verantwortlich

für den antiplasmoidalen Effekt des Knoblauchs. Mit den Ergebnissen dieser Arbeit

kann diese Aussage zum gewissen Teil gestützt werden. Obwohl auf Grund des

Proteinmangels keine ausreichenden Versuche gemacht werden konnten, sprechen doch

einige Indizien dafür, dass Wechselwirkungen zwischen der Glutamatdehydrogenase

und den Disulfiden stattfinden.

Bei einer Retentionszeit von etwa 29 min. könnte im Dichlormethanextrakt ein

Vinyldithiin gefischt worden sein. Diese entstehen üblicherweise in Gegenwart von

Dichlormethan [75]. Bei den Vinyldithiinen handelt es sich um 2-Vinyl[4H]-1,3-dithiin

und 3-Vinyl[4H]-1,2-dithiin, die aus einer spontanen Dimerisierung von Thioacrolein

entstehen. Thioacrolein wiederum entsteht durch β-Eliminierung am Allicin. Bisher ist

noch keine antiplasmoidale Wirkung der Vinyldithiine beschrieben worden.

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TEIL II

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Theoretischer Teil - 8 Blutstillung 55

8 Blutstillung

8.1 Blutstillung allgemein

Blut nimmt in der Funktionsweise des Organismus eine zentrale Rolle ein und so lässt

sich in der Blutstillung eine besondere Schutzfunktion des Körpers beobachten. Die

Blutstillung, auch Hämostase genannt, ist ein Zusammenspiel von vaskulären,

zellulären und plasmatischen Vorgängen. Sie umfasst im Wesentlichen zwei Phasen, die

ineinander übergreifen: die primäre Hämostase und sekundäre Hämostase, welche durch

die Gerinnselretraktion abgeschlossen werden. An die Blutstillung schließt sich die

Fibrinolyse an, die Voraussetzung für die Rekanalisierung und Heilung von Gefäßen ist.

In gesunden Lebewesen muss die Blutgerinnung folgende Anforderungen erfüllen: Sie

muss im Falle einer Verletzung hinreichend schnell aktiviert werden können und zu

einem Blutungsstopp führen, auf den Bereich der Verletzung beschränkt bleiben und in

einer angemessenen Zeit gestoppt werden.

Durch den Einsatz verschiedener aktivierender Systeme, durch positive und negative

Rückkopplung sowie durch inaktivierende Mechanismen werden diese Anforderungen

gewährleistet und reguliert.

In den folgenden Abschnitten werden die einzelnen Abläufe der Blutgerinnung genauer

erläutert [76-79] und in Abb. 8.1 auch graphisch dargestellt.

8.2 Primäre Hämostase

8.2.1 Vaskuläre Blutstillung

Nach einer Verletzung kommt es durch die Reizung glatter Muskulaturen zu einer

reflektorischen Gefäßkontraktion, die etwa 60 Sekunden dauert. Sie wird durch die

Freisetzung vasokonstriktorischer Mediatorstoffe, wie ADP, Serotonin oder Adrenalin

aus den Thrombozyten und des verletzten Endothels unterstützt. Es erfolgt eine

Verlangsamung des Blutstroms, die die folgenden Blutstillmechanismen begünstigt.

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56 Theoretischer Teil - 8 Blutstillung

8.2.2 Zelluläre Blutstillung (Plättchenadhäsion)

Im Normalfall verkleben Thrombozyten weder untereinander, noch bleiben sie am

Gefäßendothel hängen, welches bei Intaktheit eine nichtthrombogene Oberfläche

darstellt. Ist jedoch das Endothel zerrissen, so kommen die Thrombozyten mit den

darunterliegenden Matrixproteinen, wie z. B. Kollagen, in Berührung und gehen

Wechselwirkungen mit ihnen ein, da Thrombozyten über spezifische Membran-

rezeptoren für diese verfügen. Es bildet sich ein Thrombozytenbelag, der durch den

von-Willebrand-Faktor (vWF) wegen seiner hohen Affinität zu dem Rezeptor

Glykoprotein (GP) Ib/IX auf der Thrombozytenoberfläche fest an die Zellwand

gebunden wird. Daneben befindet sich auch der Rezeptor GP Ia/IIa auf der

Thrombozytenoberfläche, durch dessen Kontakt mit Kollagen die Thrombozyten

aktiviert werden. In der Folge ändern sie ihre Form und Inhaltsstoffe, wie ADP,

Thromboxan A2 und blutplättchenaktivierender Faktor PAF werden aus der Granula

freigeben, wodurch weitere Thrombozyten aktiviert werden und die Thrombozyten-

aggregation eingeleitet wird. Mit der Plättchenaktivierung wird auch die sekundäre

Hämostase ausgelöst, welche zur Bildung der Thrombozytenaktivatoren

Thromboxan A2 und Thrombin führt. Durch die Plättchenadhäsion wird die

plasmatische Blutgerinnung dann beschleunigt, da Faktor V an die Thrombozyten-

membran bindet und dadurch zum wichtigen Cofaktor der Thrombinbildung aktiviert

wird.

Durch die Bindung des vWF an den Rezeptor GP Ib/IX erfolgt außerdem eine

Konformationsänderung des Thrombozyten und damit die Aktivierung eines weiteren

Glykoproteins, des Rezeptors GP IIb/IIIa. Damit ist der Thrombozyt in der Lage

Fibrinogen zu binden. Über Fibrinogenbrücken schließlich verbinden sich die Plättchen

irreversibel miteinander zu einem Pfropf (weißer Thrombus). Der gebildete

Thrombozytenpfropf kann das Gefäß erst dann dauerhaft verschließen, wenn durch den

Fibrineinbau im Rahmen der plasmatischen Blutgerinnung eine genügende Festigkeit

erlangt wird.

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Theoretischer Teil - 8 Blutstillung 57

8.3 Sekundäre Hämostase (Plasmatische Blutgerinnung)

8.3.1 Allgemein

Im Wesentlichen besteht der Gerinnungsvorgang aus drei Schritten:

Gerinnungsaktivierung, Thrombinbildung und Fibrinbildung.

Das klassische Konzept der Blutgerinnung, an dem vier Gerinnungsfaktoren beteiligt

sind, wurde von Paul Morawitz entwickelt. Dieses klassische Konzept besitzt zwar nach

wie vor seine Gültigkeit, jedoch wurde es weiter ausdifferenziert und um einige

wesentliche Faktoren ergänzt. Neben dem extrinsischen System, welches von Morawitz

beschrieben wurde, existiert auch ein intrinsisches System. Für beide Systeme ist die

Aktivierung einzelner Faktoren an der Oberfläche von Zellmembranen wichtig, da nur

so eine Beschränkung der Gerinnung auf den Ort der Gewebeverletzung gewährleistet

ist. Im menschlichen Körper werden die Gerinnungsfaktoren als inaktive

Vorläuferstufen, so genannte Zymogene, synthetisiert. Erst die proteolytische

Entfernung eines Abschnitts aus der Aminosäurekette überführt das Vorläuferprotein

irreversibel in die aktive Form. Dabei handelt es sich bei diesen Gerinnungsfaktoren um

Serinproteasen, die alle die gleiche katalytische Triade und einen ähnlichen Aufbau

vorweisen. Zu denen gehören neben den Faktoren XI und XII auch die Faktoren II, VII,

IX und X sowie Protein C, die Vitamin-K-abhängig gebildet werden (s. Kapitel 11.1).

Obwohl je nach Auslösemechanismus zwischen extrinsischer und intrinsischer

Gerinnungskaskade unterschieden wird, liegen Querverbindungen zwischen beiden

Wegen, so dass eine strikte Trennung eigentlich nicht möglich ist, den Ablauf der

einzelnen Reaktion aber besser veranschaulicht. Ab Faktor X nehmen beide Systeme

den gleichen Verlauf.

8.3.2 Intrinsisches (endogenes, intravaskuläres) System

Im Anfangsstadium der endogenen Gerinnung treten zunächst die so genannten

Kontaktphasefaktoren in Aktion. Dazu gehören neben den Zymogenen Faktor XI und

Faktor XII auch Präkallikrein und das hochmolekulare Kininogen (High molecular

weight kininogene, HMWK), wobei letzteres als Bindungsprotein und Cofaktor

fungiert. Nach Kontakt mit einer negativ geladenen Oberfläche kommt es durch

Konformationsänderung zur Autoaktivierung von Faktor XII. Dieses bewirkt eine

Aktivierung von Präkallikrein zu Kallikrein, welches über einen positiven

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58 Theoretischer Teil - 8 Blutstillung

Rückkopplungsmechanismus zu einer weiteren Aktivierung von Faktor XII führt.

Daneben aktiviert Faktor XIIa in Gegenwart von Ca2+ den Faktor XI, welcher im

Plasma an HMWK gebunden vorliegt und durch die dadurch vorhandene

Oberflächenbindungsstelle auch an Thrombozyten gebunden werden kann. Faktor XIa

aktiviert dann Faktor IX. Dieser kann jedoch auch durch Faktor VIIa (s. u.) aktiviert

werden und nimmt daher eine Schlüsselposition im Gerinnungssystem ein. Faktor IXa

schließlich bildet mit Faktor VIIIa in Gegenwart von Calciumionen membrangebunden

den intrinsischen Tenase-Komplex, der Faktor X zu Faktor Xa aktiviert.

8.3.3 Extrinsisches (exogenes, extravaskuläres) System

Nach einer Verletzung wird Gewebethromboplastin (tissue factor, TF, Faktor III)

freigesetzt. Dabei handelt es sich um ein Membranprotein, dessen extrazellulärer Anteil

den Rezeptor für Faktor VII darstellt. Durch die Bindung von Faktor VII wird der

Gerinnungsfaktor zu Faktor VIIa aktiviert. Es bildet sich in Anwesenheit einer

Phospholipidoberfläche ein Komplex aus TF, Faktor VIIa sowie Ca2+, die so genannte

extrinsische Tenase, die neben Faktor IX auch Faktor X aktiviert. Dieser Schritt gilt als

primärer Initiator der plasmatischen Gerinnungskaskade.

Faktor X steht an zentraler Stelle im plasmatischen Gerinnungsablauf, da hier der

exogene und der endogene Weg der Gerinnungskaskade zu einer gemeinsamen

Endstrecke zusammenfließen. Mit dem aktivierten Faktor X (Xa) wird ein

Prothrombinase-Komplex gebildet, bestehend aus den Faktoren Va, Xa sowie

Prothrombin (Faktor II). Durch proteolytische Spaltung von Prothrombin, wird dessen

Aktivierung zu Thrombin (Faktor IIa) bewirkt. Faktor Va, der hierbei als Cofaktor

wirkt, erhöht die Reaktionsgeschwindigkeit um ein vielfaches. Da Faktor Va jedoch von

Thrombin aktiviert wird, stellt sich die Frage, wie der Cofaktor bei der intrinsischen

Kaskade bereitgestellt wird. Offenbar ist Faktor Xa in der Lage durch eine

„Initialzündung“ geringe Mengen membrangebundenen Faktor V in Faktor Va zu

überführen, der dann im Prothrombinase-Komplex als Cofaktor dienen kann, um

Thrombin zu generieren, wodurch dann in einer positiven Rückkopplung wiederum

Faktor Va freigesetzt wird.

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Theoretischer Teil - 8 Blutstillung 59

Abb. 8.1: Die Blutgerinnungskaskade, Erläuterungen im Text, übernommen aus [80]

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60 Theoretischer Teil - 8 Blutstillung

Der Gerinnungsfaktor IIa, das Thrombin, spaltet Fibrinogen (Faktor I) in Fibrin-

monomere, die zunächst nichtkovalent in einer Seit-zu-Seit-Anlagerung aggregieren.

Unter dem Einfluss von durch Thrombin aktivierter Plasmatransglutaminase (Faktor

XIIIa), werden die Fibrinmonomere polymerisiert, indem kovalente Bindungen

zwischen Lysyl- und Glutaminylresten der γ-Seitenkette verschiedener Fibrinmonomere

geknüpft und mit den vorhandenen Thrombozytenaggregaten quervernetzt werden. Es

ensteht das faserförmige Fibrin (Faktor Ia). Fibrinogen und Fibrin besitzen außerdem

Bindungsepitope für andere Proteine, so dass es zu einer Quervernetzung mit

Blutplättchen und anderen Zellen kommt. Weiterhin aktiviert Thrombin die Faktoren

VIII und XI sowie Faktor V (s.o.), wirkt als Plättchenaktivator und kann über die

Aktivierung von Protein C auch antikoagulierend wirken (s. u.).

Angestoßen durch eine Gefäßverletzung induziert die extrinsische Tenase also eine

erste schnelle Faktor Xa Anhäufung, welches eine ausreichende Thrombinkonzentration

vor Ort garantiert. Dadurch kommt es zu einer lokalen Thrombozytenaggregation sowie

zur Aktivierung der Cofaktoren VIII und V durch Thrombin. Ferner kann Faktor Xa

seinerseits Faktor VII in Faktor VIIa überführen Diese positive Rückkopplung hat eine

verstärkte Aktivierung von Faktor X zur Folge. Schließlich kommt es durch eine

Retraktion der Fibrinfäden zu einer Annäherung der Wundränder und Verfestigung des

Fibringerinnsels.

8.4 Inhibition der Blutgerinnung

Neben einer Verstärkung der Blutgerinnung durch positive Rückkopplung an vielen

Stellen der Kaskade wird durch negative Rückkopplung über die Proteine C und S auch

eine Hemmung bewirkt. Dabei stellt neben Antithrombin III das Protein C den

wichtigsten Inhibitor der Blutgerinnung dar.

Durch Bindung an den endothelialen Rezeptor Thrombomodulin wird überschüssiges

Thrombin in seine langsame Form überführt, die hauptsächlich das Zymogen Protein C

aktiviert (s. Kapitel 11.2.2). Im aktivierten Zustand spaltet Protein C (aPC) die Faktoren

Va und VIIIa an einem Arginylrest, wodurch sie inaktiviert werden und nicht mehr als

Cofaktoren zur Verfügung stehen. Aber auch Protein C benötigt einen Cofaktor, um

katalytisch tätig zu werden. Dieser wird von Protein S, einem Vitamin K-abhängigen

Glykoprotein, dargestellt. Er beschleunigt die Bindung von aPC an die Phospholipid-

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Theoretischer Teil - 8 Blutstillung 61

oberfläche und macht die Faktoren Va und VIIIa für eine Proteolyse zugänglich. Beim

Abbau des Faktors VIIIa spielt auch die nicht aktivierte Form von Faktor V eine Rolle.

Es entsteht membrangebunden ein Dreierkomplex, in dem Faktor V und Protein S

synergistisch die Funktion von Protein C unterstützen. In Abwesenheit von Protein S

verliert Faktor V seine antikoagulatorischen Eigenschaften.

Als wichtigster Inhibitor der Blutgerinnung gilt heute das Antithrombin III (AT III),

auch Heparin-Cofaktor I genannt, welches mit Thrombin einen Thrombin-Anti-

thrombin III-Komplex (TAT) bildet und es so hemmt. In Anwesenheit von Heparin

kann die Wirkung von AT III bis zum 1000-fachen beschleunigt werden (Sofort-

hemmung). Heparin wird nach erfolgter Komplexierung wieder freigesetzt und kann

dann mit weiteren AT III Molekülen in Wechselwirkung treten. Der Anteil an der

Thrombininhibition beträgt ca. 80%. Dabei ist nicht nur Thrombin Zielmolekül, sondern

auch eine Reihe anderer Serinproteasen, zu denen die Faktoren Xa, XIIa, XIa und IXa

sowie das Kallikrein, Plasmin, Urokinase und auch Trypsin gehören. Der haupt-

sächliche Effekt entfaltet sich jedoch an Thrombin und Faktor Xa. AT III wird als

Präprotein in der Leber synthetisiert, welches aber noch vor Sekretion gespalten wird,

so dass nur das reife Protein in den Blutkreislauf gerät. Basische Aminosäuren

vermitteln die Bindung des negativ geladenen Polysaccharids Heparin an seine

Bindestelle, die räumlich getrennt von derjenigen für die Serinproteasen liegt

(vgl. Kapitel 11.2.1.1). Für eine maximale Hemmaktivität gegenüber Thrombin werden

längere Heparinabschnitte (>17 Saccharide) an der Bindestelle benötigt, da das

Heparinmolekül zusätzlich an Thrombin binden muß, wohingegen für eine Inhibition

von Faktor Xa lediglich eine spezifische Pentasaccharidsequenz erforderlich ist.

AT III weist strukturelle und funktionelle Homologie mit anderen Mitgliedern der so

genannten Serpine (Superfamilie von Serinprotease-Inhibitoren) auf, die vermutlich alle

aus einem gemeinsamen „Ur-Serpin“ entstanden sind. Zu diesen Serpinen gehören

ferner Heparin-Cofaktor II, der auch einen Thrombininhibitor darstellt und das weiter

unten erwähnte Antiplasmin, als Inhibitor des Plasmins.

Ein weiterer Ansatzpunkt für die physiologische Inhibition der Blutgerinnung ist die

extrinsische Tenase, bestehend aus TF, Faktor VIIa sowie Ca2+, die den primären

Initiator der primären Hämostase darstellt. Dieser Komplex wird durch den TFPI (tissue

factor pathway inhibitor) gehemmt. TFPI wird vom mikrovaskulären Endothel gebildet

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62 Theoretischer Teil - 8 Blutstillung

und liegt hauptsächlich an das Endothel gebunden vor. Die antikoagulierende Wirkung

besteht aus zwei Schritten. Zunächst wird zirkulierender Faktor Xa an eine Domäne des

TFPI gebunden und dadurch inaktiviert. Anschließend bindet eine andere Domäne sehr

schnell an einen benachbarten TF/FVIIa-Komplex wodurch eine weitere Aktivierung

von Faktor X verhindert wird. Diese inhibitorischen Eigenschaften von TFPI werden

erheblich verstärkt, wenn Heparin anwesend ist [81].

Daneben gibt es noch andere wichtige Inhibitoren, wie beispielsweise

α2-Macroglobulin, α1-Proteinaseinhibitor und C1-Esteraseinhibitor, die hier nur genannt

werden sollen.

Aber auch das Endothel selber besitzt eine Reihe von Abwehrmechanismen. So

synthetisiert es Substanzen, die die Thrombozytenadhäsion und -aggregation inhibieren

und eine übermäßige Blutplättchenaktivierung verhindern. Die wichtigsten inhibitori-

schen Faktoren sind Prostacyclin I2 und D2 sowie Stickstoffmonoxid (NO). Durch diese

Inhibitoren wird die intrazelluläre cAMP-Konzentration erhöht, wodurch es zu einer

Verlagerung der Ca2+-Ionen in intrazelluläre Speicher kommt. Alle Calcium-abhängigen

Vorgänge werden damit blockiert. Außerdem ist das oben erwähnte Thrombomodulin

ein membranständiger Rezeptor, der eine Strukturänderung von Thrombin bewirkt und

damit seine antikoagulierende Wirkung zur Folge hat. Schließlich befinden sich am

Endothel noch Glykosaminglykane, die heparinähnliche Eigenschaften besitzen und

lokal gebildetes Thrombin hemmen. Dadurch wird eine Gerinnselbildung an der

Gefäßwand unter physiologischen Bedingungen verhindert.

8.5 Fibrinolyse

8.5.1 Aktivierung

Die Fibrinolyse ist ein wichtiger Gegenspieler der Blutgerinnung, die verhindert, dass

sich eine lokale Gerinnung generalisiert. Neben dem langsamen Abbau der Blut-

gerinnsel besitzt die Fibrinolyse die wichtige Aufgabe, das Blut im flüssigen Zustand zu

erhalten. Blutgerinnung und Fibrinolyse sind enzymatisch regulierte Vorgänge, die im

Blut im Gleichgewicht miteinander vorliegen.

Wie bei der Blutgerinnung werden auch für die Fibrinolyse ein intrinsischer und ein

extrinsischer Weg beschrieben. Aktiviert wird der extrinsische Weg durch

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Theoretischer Teil - 8 Blutstillung 63

Plasminogen-aktivatoren, wie Urokinase (u-PA, Uk) und Gewebeplasminogenaktivator

(t-PA). Letzterer kommt in den meisten Geweben vor. Er wird in Endothelzellen

synthetisiert, gespeichert und durch bestimmte Stimuli wie z. B. Thrombin oder aPC

freigesetzt. Im Gegensatz zu allen bekannten Serinproteasen weist t-Pa bereits in der

Proform proteolytische Aktivität auf. Unter dem Einfluss von Plasmin wird das

einkettige Polypeptid gespalten und es entsteht eine zweikettige Form, die deutlich

aktiver ist. Da t-PA eine hohe Affinität zu Fibrin aufweist, wird selektiv dort, wo Fibrin

angelagert ist, oder sich bereits Thromben gebildet haben, das daran gebundene

Plasminogen aktiviert. In Gegenwart von Fibrin binden t-PA und Plasminogen an den

Thrombus, es entsteht ein ternärer Komplex, wobei Fibrin als Cofaktor fungiert, der die

Auslösung, Lokalisierung sowie Begrenzung der Reaktion bestimmt. Die Serinprotease

Plasminogen, das Zymogen von Plasmin, wird dabei proteolytisch aktiviert. Damit wird

eine überwiegend lokale Fibrinauflösung ermöglicht. Plasmin baut nicht nur Fibrin ab,

sondern greift auch Fibrinogen sowie die Faktoren V und VIII an. Die beim Fibrinabbau

entstehenden Spaltprodukte hemmen die Thrombinfreisetzung und die Polymerisation

von Fibrinmonomeren. So wird eine gesteigerte Fibrinolyse durch die gleichzeitige

Gerinnungshemmung unterstützt.

Zirkulierendes freies Plasmin und die freien Aktivatoren stehen unter Kontrolle der

entsprechenden Inhibitoren. Diese bilden inaktive Komplexe mit den ungebundenen

fibrinolytischen Proteasen. Die Bindung an Fibrin jedoch schützt die Enzyme vor einer

Inhibition.

Die intrinsische Plasminogenaktivierung erfolgt über die bereits erwähnte Kontakt-

aktivierung der Blutgerinnung (s. 8.3.2). Das entstandene Kallikrein wandelt Pro-

urokinase in Urokinase um. Die Prourokinase wird von verschiedenen Zelltypen, wie

Endothelzellen, Pneumozyten und auch Epithelzellen sezerniert. Sie kann selbst in sehr

limitiertem Umfang Plasminogen aktivieren, ist jedoch in der zweikettigen Form, der

Urokinase, weitaus aktiver. Außer Kallikrein wandelt auch Plasmin die Prourokinase in

Urokinase um.

Neben den körpereigenen Plasminogenaktivatoren t-PA und u-PA wird noch die aus

Streptokokken gewonnene Streptokinase (Sk) therapeutisch eingesetzt. Dabei handelt es

sich um ein Protein ohne enzymatische Eigenschaften, das zunächst einen Komplex mit

Plasminogen bildet, welches dann weitere Plasminogenmoleküle in Plasmin umwandelt.

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64 Theoretischer Teil - 8 Blutstillung

Ein Nachteil sind dabei nach einer Streptokokkeninfektion behaltene Antikörper, die die

zugeführte Streptokinase inaktivieren können.

8.5.2 Hemmung

Auch die Fibrinolyse unterliegt gewissen Hemmmechanismen, an denen mehrere

Inhibitoren beteiligt sind. Der wichtigste Plasmininhibitor ist das α2-Antiplasmin, das

sehr schnell an Plasmin bindet, wodurch inaktive Plasmin-α2-Antiplasmin (PAP)

Komplexe entstehen. Ferner kann es auch an Plasminogen binden, dadurch die Bindung

an Fibrin verhindern und durch Faktor XIIIa an Fibrin quervernetzt werden.

Plasmin und Plasminogenaktivatoren können weiterhin von α2-Makroglobulin durch

kovalente Bindung inhibiert werden. Daneben existieren noch die Plasminogen-

aktivator-Inhibitoren PAI-1, PAI-2, PAI-3 sowie PAI-4, von denen PAI-1 der

bedeutendste Inhibitor von t-PA und u-PA ist, indem er innerhalb kurzer Zeit mit ihnen

komplexiert und die Fibrinolyse inaktiviert. Die Inaktivierung von PAI-1 durch aPC

spiegelt dabei die enge Verknüpfung zwischen Blutgerinnung und Fibrinolyse wider.

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Theoretischer Teil - 9 Atherosklerose 65

9 Atherosklerose

9.1 Allgemeines

Bei der Atherosklerose handelt es sich um eine Dysfunktion des Endothels, die mit

einem Mangel an bioverfügbarem NO einhergeht. Es entwickelt sich eine Gefäßwand-

verdickung durch Fetteinlagerungen, woraus sich nach längerem Bestehen eine

Verkalkung entwickelt. Im weiteren Verlauf kann es zu einem Einriss der inneren

Wandschicht kommen, der zu einer kompensatorischen Antwort der Hämostase führt.

Es werden Entzündungsmediatoren wie Zytokine und Wachstumsfaktoren gebildet. Die

Bindung von Blutplättchen und Blutgerinnseln an diese Läsion wird gesteigert, wodurch

es zu einer Verengung oder sogar Verstopfung des Blutgefäßes kommen. Je nach Lage

der Verstopfung führt dies zu Ischämien, wie Herzinfarkt oder Schlaganfall [82]. Eine

weitere Gefahr besteht in der Loslösung dieser Thromben, die dann ihren Weg durch

den Körper nehmen und an anderer Stelle feinste Kapillaren verstopfen können.

9.2 Rolle des LDL

Plasmalipoproteine sind an allen Phasen der Plaquebildung beteiligt, jedoch spielt das

LDL (low density lipoprotein) in seiner oxidierten Form (oxLDL) die größte Rolle [83].

Es induziert eine Thromboplastin (TF) Freisetzung, welches durch die Bindung von

Faktor VII die extrinsische Blutgerinnungskaskade aktiviert (vgl. 8.3.3). Dabei

korreliert die Menge an freigesetztem TF mit der Schädlichkeit des Plaques. oxLDL

induziert zudem Apoptose in der Plaqueschicht und fördert damit die Anreicherung von

apoptotischen Zellen in der fortgeschrittenen Läsion, was wiederum Entzündungs-

mediatoren freisetzt. In der atherosklerotischen Schicht wird außerdem LRP (LDL

receptor-related protein) vermehrt gebildet, welches die Aufnahme von oxLDL in die

Macrophagen vermittelt [84]. Dieses führt zur Bildung von Lipidperoxiden, die eine

Konvertierung der Macrophagen zu Schaumzellen durch Akkumulation von

Cholesterolestern erleichtern. Bei einer Atherosklerose sind oft 10-50% der Arterien-

innenwände mit einer Schicht aus Schaumzellen bedeckt. An dieser Stelle könnten

Antioxidantien eingreifen und eine freie Radikalbildung der modifizierten LDL

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66 Theoretischer Teil - 9 Atherosklerose

vermindern [82]. Eine Begleittherapie mit Antioxidantien wird jedoch mittlerweile

kontrovers diskutiert [85].

Lange Zeit wurden zwei offensichtlich widersprüchliche Gedanken aufrechterhalten.

Zum einen, dass die beschriebene Oxidation der Lipoproteine innerhalb der Arterien der

Schlüssel zur Pathogenese der Atherosklerose sei, zum anderen, dass sich Diäten, die

reich an mehrfach ungesättigten Fettsäuren sind, welche in Lipoproteine eingebaut

werden und peroxidiert vorliegen, günstig auswirken. Zudem wird heute körperliche

Betätigung und ein moderater Alkoholkonsum empfohlen, obgleich beides mit einer

gesteigerten Bildung von ROS (reactive oxygen species) einhergeht. Darüber hinaus

haben in ausgedehnten klinischen Studien Antioxidantien versagt, die kardiovaskulären

Risiken im Menschen zu senken. Daher kann eine Supplementierung mit Antioxidantien

nicht mehr, dafür jedoch eine mit ungesättigten Fettsäuren (siehe auch Kapitel 10.2.5)

empfohlen werden [85]. Weiterhin haben Studien gezeigt, dass eine Sekundärprävention

koronarer Herzkrankheiten durch Lebensstilveränderungen die Effektivität einer

medikamentösen Therapie übersteigen kann. Dabei stehen vor allem eine

Einschränkung des Rauchens und die vermehrte körperliche Betätigung im Vordergrund

[86]. Der mediterranen Diät wird ebenfalls ein antiatherogener Effekt nachgesagt. Dies

soll vor allem auf dem positiven Einfluss des Olivenöls hinsichtlich der

Zusammensetzung der Lipoproteine beruhen, die dann weniger anfällig für Oxidationen

sind [87].

9.3 Thrombose

Unter Thrombose versteht man den Verschluss eines Blutgefäßes durch ein

Blutgerinnsel. Dabei sind die tiefen Bein- und Beckenvenen am häufigsten betroffen.

Sitzt ein Thrombus im tiefen Venensystem des Beines, ist die Wahrscheinlichkeit des

Loslösens groß. Mit dem Blutstrom kann das Gerinnsel zum Herzen gelangen und dort

zum Myokardinfarkt führen, der die Hauptkomplikation der koronaren Atherosklerose

darstellt. Aber auch Lungenembolie und Schlaganfall sind auf losgelöste Blutgerinnsel

zurückzuführen. Ist bereits einmal eine Thrombose diagnostiziert worden, so liegt die

Wahrscheinlichkeit bei ca. 30%, innerhalb von 8 Jahren erneut ein Blutgerinnsel zu

entwickeln. Als Hauptkomplikation der Atherosklerose stellt die Thrombose heute in

den Industrienationen die größte Todesursache dar [84].

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Theoretischer Teil - 10 Fettsäuren 67

10 Fettsäuren

10.1 Fettsäuren allgemein

10.1.1 Struktur und Eigenschaften

Fettsäuren sind langkettige aliphatische Monocarbonsäuren, die natürlich vorkommend

meist unverzweigt und von gerader Kohlenstoffanzahl sind. Sie können gesättigt oder

ungesättigt vorliegen, wobei die meisten monoungesättigt sind. Die erste Doppel-

bindung ist mindestens zwei Methylengruppen von der Carboxylgruppe entfernt.

Enthalten sie mehr als eine Doppelbindung, so sind diese methylenunterbrochen. Ein

weiteres Strukturmerkmal natürlicher, ungesättigter Fettsäuren ist die cis-Konfiguration

der Doppelbindungen. Fettsäuren unterscheiden sich also im Allgemeinen in Ketten-

länge und Sättigungsgrad.

Die am häufigsten in Ölfrüchten vorkommenden Fettsäuren bestehen aus 16 oder 18

Kohlenstoffatomen. Der Anteil der vorkommenden Fettsäuren an der gesamten Fett-

säurenmenge einer Ölsaat ist weitgehend genetisch fixiert, jedoch können auch

Umweltfaktoren eine Rolle spielen.

Bis heute sind über 100 verschiedene Fettsäuren bekannt, die hauptsächlich als Bau-

steine von Lipiden in Tieren, Pflanzen und Mikroorganismen dienen. In unveresterter,

freier Form kommen sie nur in sehr geringer Konzentration im Gewebe und in der Zelle

vor und stellen wie Mono- und Diglyceride in der Regel Spaltprodukte des Fettabbaus

dar.

Neben diesen allgemeinen Strukturen kommen in der Natur eine Reihe ungewöhnlicher

Fettsäuren, beispielsweise methylverzweigte Fettsäuren, Hydroxyfettsäuren wie die

Ricinolsäure oder Cyclopropancarbonsäuren u. a. vor.

Niedere Fettsäuren stellen Flüssigkeiten dar, wobei der Schmelzpunkt von Kettenlänge,

Anzahl sowie Position und Konfiguration der Doppelbindungen abhängt. Je länger und

gesättigter eine Fettsäure ist, umso fester ist sie.

Vom Sättigungsgrad hängt auch die Stabilität gegenüber Sauerstoff und anderen, die

Oxidation positiv beeinflussenden Faktoren, wie Licht, Wärme oder Wasser, ab. Je

ungesättigter eine Fettsäure ist, umso schneller tritt die Autoxidation ein. Pflanzliche

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68 Theoretischer Teil - 10 Fettsäuren

Öle enthalten jedoch meist einen hohen Anteil an natürlichen Antioxidantien wie z.B.

Tocopherole und sind dahingehend nicht so anfällig.

10.1.2 Fettsäurebiosynthese

Die Biosynthese von Fettsäuren läuft in allen Organismen ab, besonders jedoch in der

Leber, im Fettgewebe und in den Milchdrüsen höherer Tiere. Im Zytosol wird über

einen Multienzymkomplex der Aufbau aus C2-Einheiten der Essigsäure erreicht. Daher

werden in der Natur überwiegend unverzweigte Fettsäuren mit gerader

Kohlenstoffanzahl gefunden. Bei der Biosynthese wird zunächst Acetyl-CoA durch

HCO3¯ zu Malonyl-CoA carboxyliert. Die anschließende Kettenverlängerung erfolgt

durch sukzessive Kondensation von Malonyl-CoA und Acetyl-CoA, wobei die

Zwischenprodukte über die Thiolgruppe einer Phosphopantotheingruppe an ein Acyl-

Carrier-Protein (ACP) gebunden bleiben. Dieses multifunktionelle Polypeptid, in der

alle beteiligten Enzyme integriert sind, wird auch als Typ-I-Fettsäuresynthase (FAS-I)

bezeichnet. In Pflanzen und den meisten Prokaryoten hingegen werden für die

Biosynthese insgesamt acht verschiedene Enzyme inklusive einem ACP benötigt.

Dieses System wird als Typ-II-Fettsäuresynthase (FAS-II) bezeichnet.

10.1.3 Fettsäureabbau

Der Fettsäureabbau ist als Umkehr der de-novo-Synthese zu sehen, läuft konträr dazu

aber ausschließlich in der Mitochondrienmatrix ab. Es handelt sich hierbei um eine

Reaktionsfolge von vier Schritten, durch die jeweils die beiden ersten Kohlenstoffatome

vom Carboxylende einer aktivierten Fettsäure als Acetyl-CoA abgespalten werden.

Dieser Vorgang wiederholt sich so lange, bis die beiden letzten Kohlenstoffatome des

Methylendes als Acetyl-CoA übrig bleiben. Beim Abbau der cis-ungesättigten

Fettsäuren treten Verbindungen, wie z.B. ∆3-cis-Enoyl-CoA auf, die erst dann weiter in

der Fettsäurespirale abgebaut werden können, wenn die Konfiguration durch eine

Enoyl-CoA-Isomerase katalysiert in eine ∆2-trans-Konfiguration umgewandelt wird.

10.2 Ungesättigte Fettsäuren

10.2.1 Allgemeines

Als mehrfach ungesättigte Fettsäuren (polyunsaturated fatty acids, PUFA) werden in der

Regel solche bezeichnet, die 18 oder mehr Kohlenstoffatome und mindestens zwei

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Theoretischer Teil - 10 Fettsäuren 69

Doppelbindungen enthalten. Demgegenüber stehen die einfach ungesättigten Fettsäuren

(monounsaturated fatty acids, MUFA) mit nur einer Doppelbindung.

In der Fettsäurechemie hat sich eine Kurzschreibweise eingebürgert, die die

Kohlenstoffanzahl sowie Anzahl, Position und Konfiguration der Doppelbindungen

symbolisiert. Dabei bezeichnet die Ziffer vor dem Doppelpunkt die Anzahl der

Kohlenstoffatome und die Ziffer nach dem Doppelpunkt die Anzahl der

Doppelbindungen. Je nachdem, an welchem Kohlenstoffatom (x) sich die letzte

Doppelbindung vom Ende her betrachtet befindet, werden sie als n-x bzw.

ωx-Fettsäuren bezeichnet.

Die Hauptfamilien in Säugetieren sind neben den n-9 Fettsäuren die n-3 und

n-6 Fettsäuren. Die letzten beiden sind essentiell, d.h. sie können von Säugetieren nicht

selber synthetisiert werden. Säuger sind aber in der Lage, aus pflanzlichen Fettsäuren

mehrfach ungesättigte Fettsäuren herzustellen. Dabei werden Doppelbindungen

zwischen einer bereits bestehenden Mehrfachbindung an C9-Position und der

Carboxylgruppe eingefügt. Dieses geschieht durch eine Reihe von Kettenverlängerungs-

und Desaturierungsschritten (Abb. 10.1).

Burr und Burr [88] entdeckten 1929 die lebensnotwendige Bedeutung der Fettsäuren im

Tierreich. Von besonderer Relevanz sind dabei die Linolsäure sowie die α-Linolensäure

und ihre Abkömmlinge. Diese Fettsäuren haben viele physiologische Aufgaben; darüber

hinaus sind einige auch Vorläufer der Eicosanoide, zu welchen die Prostaglandine,

Leukotriene und Thromboxane gehören (Abb. 10.2). Eicosanoide wiederum sind an

einer bemerkenswerten Vielfalt von physiologischen und pathologischen Vorgängen

beteiligt. Leukotriene etwa wirken über transmembranale Rezeptoren sowohl autokrin

als auch parakrin auf verschiedene Zellfunktionen, wie z.B. bei Asthma [89]. Linolsäure

und α-Linolensäure sind also nicht nur essentiell, weil sie mit der Nahrung

aufgenommen werden müssen, sondern auch auf Grund ihrer großen physiologischen

Bedeutung.

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70 Theoretischer Teil - 10 Fettsäuren

Abb. 10.1: Allgemeiner Biosyntheseweg von Fettsäuren in Tieren. Da Tiere keine

∆12

-Desaturase besitzen, müssen Linolsäure und α-Linolensäure zugeführt

werden (modifiziert nach [90])

10.2.2 Biosynthese der ω6-Fettsäuren ausgehend von Linolsäure

Bei der Linolsäure handelt es sich um die 9-cis, 12-cis-Octadecadiensäure, auch kurz

mit 9c, 12c-18:2 bezeichnet. Wie oben erwähnt, kann sie nicht von Tieren, jedoch von

Pflanzen von der Ölsäure (9c-18:1) ausgehend über die ∆12- Desaturase synthetisiert

werden. In Pflanzenölen kommt sie daher ubiquitär vor, so auch in den Ölen, die im

Haushalt verwendet werden, wie Oliven-, Sonnenblumen-, Maiskeim- und Distelöl.

Obwohl die Linolsäure aufgenommen werden muss und folglich essentiell ist, stellt sie

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Theoretischer Teil - 10 Fettsäuren 71

einen großen, meist den höchsten Anteil der Di- bzw. Polyensäuren im tierischen

Organismus dar. Die Biosynthese der ω6-Fettsäuren (Abb. 10.1) findet vorwiegend in

der Leber statt. Über eine ∆6-Desaturase und einen Kettenverlängerungsschritt wird die

Arachidonsäure (AA) generiert, die den wichtigsten Metaboliten von Linolsäure in

Tieren repräsentiert. Durch weitere Elongasen und Desaturasen kommt man zu

längeren, ungesättigteren Ketten, die zwar in nur geringen Mengen vorkommen, trotz

allem jedoch wichtige Phospholipidbestandteile von Hoden, adrenergen Drüsen und der

Netzhaut darstellen.

10.2.3 Biosynthese der ω3-Fettsäuren ausgehend von α-Linolensäure

Bei der α-Linolensäure (ALA) handelt es sich um die 9-cis, 12-cis,

15-cis-Octadecatriensäure (9c, 12c, 15c-18:3). Da sich bei dieser die letzte Doppel-

bindung am drittletzten Kohlenstoffatom befindet, gehört sie zu den 18:3 (n-3), bzw.

18:3ω3 Fettsäuren.

Wie in Abb. 10.1 ersichtlich, wird ALA über mehrere Desaturasen und Elongasen

zunächst in die physiologisch wertvolle Eicosapentaensäure (EPA) und schließlich in

die ebenfalls wichtige Docosahexaensäure (DHA) überführt. Diese Umwandlung von

EPA in DHA verläuft in Eukaryoten und Prokaryoten unterschiedlich. Während in

Säugetieren ein sehr komplexes System, der Syntheseweg nach Sprecher [91] zum

Tragen kommt, gibt es in Eukaryoten andere Möglichkeiten der Konversion. Zum einen

können sie DHA direkt aus ω3-Docosatetraensäure über eine ∆4-Desaturase bilden [92],

zum anderen verfügen einige Mikroalgen, wie z.B. der marine Protist Schizochytrium,

über einen alternativen Biosyntheseweg, der nicht über alternierende Desaturierungs-

und Kettenverlängerungsschritte führt, sondern durch Polyketidsynthasen katalysiert

wird. Dieser alternative Biosyntheseweg ist auch in marinen Prokaryoten, wie

Shewanella sp. entdeckt worden [93].

10.2.4 Physiologische Bedeutung der ungesättigten Fettsäuren im Allgemeinen

10.2.4.1 Effekte auf die Membranstruktur und -funktion

Die Zusammensetzung der Zellmembran spielt eine große Rolle für die Effizienz von

vielen Membrantransportern und Enzymen. Lipid-Rafts sind Domänen in der Zell-

membran, die mit Cholesterol und Sphingolipiden angereichert sind. Sie unterschieden

sich von der restlichen Membran durch eine veränderte Lipid- sowie Protein-

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72 Theoretischer Teil - 10 Fettsäuren

zusammensetzung und sind in einem ständigen Fluss, sich neu zu bilden und wieder

aufzulösen. Daneben existieren Bereiche in diesen Domänen, die zwar makroskopisch

stabil sind, in denen jedoch ein ständiger Fluss von individuellen Lipiden und Proteinen

herrscht. Viele dieser Proteine sind für den Signalempfang und die Signalweiterleitung

zuständig. Der exakte Mechanismus jedoch, wie Lipide die Eigenschaften von Enzymen

und Transportern beeinflussen, ist immer noch unbekannt. Diese Lipid-Rafts lassen sich

leicht durch mehrfach ungesättigte Fettsäuren modifizieren und stellen somit ein gutes

Target für diese dar [94].

Auch Phospholipide können leicht durch mehrfach ungesättigte Fettsäuren modifiziert

werden. Ein Mangel an ω3-Fettsäuren führt beispielsweise zum Verlust von DHA

(22:6ω3) in Phospholipiden des Gehirns, welche im Allgemeinen eine sehr hohe

Konzentrationen an DHA, vor allem als Phosphatidylserin und Phosphatidyl-

ethanolamin, aufweisen. Dieser Mangel korreliert mit einer Abnahme von Phospha-

tidylserin und einem Anstieg der neuronalen Apoptosis und wird durch 22:5ω6

kompensiert, welches sich nur durch die fehlende Doppelbindung am C-19 von DHA

unterscheidet. Diese geringe Strukturänderung reicht aber schon aus, um zu

Gedächtnisverlust und vermindertem Lernvermögen zu führen [95, 96]. Ein Beispiel

dafür ist der beträchtlich verminderte Gehalt an AA, Docosatetraensäure und DHA in

den Phospholipiden der grauen Substanz und des Hippokampus von Alzheimer

Patienten [97]. Für eine normale Entwicklung und Funktion des ZNS wird strikt DHA

benötigt [98].

Das Sehvermögen wird ebenfalls durch einen ω3-Fettsäurenmangel beeinträchtigt, da

auch die Phospholipidfraktion der Retina einen sehr großen Anteil an DHA enthält. Je

mehr DHA als Phospholipidbaustein gebunden ist, desto mehr Rhodopsin, welches ein

Membranprotein des Außensegments der Stäbchen darstellt, wird bei Lichteintritt in die

Konformation überführt, die eine Hyperpolarisation der Außensegmentmembran zur

Folge hat und somit zu einer Reizweiterleitung führt [99]. Ist weniger DHA vorhanden

führt dies also zu weniger Reizen und damit zu einer verminderten Sehschärfe.

10.2.4.2 Einfluss auf die Eicosanoide

Unveresterte mehrfach ungesättigte Fettsäuren, die durch Phospholipase A2 aus der sn-2

Stellung der Membranphospholipide freigesetzt werden, sind direkte Substrate für die

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Theoretischer Teil - 10 Fettsäuren 73

Eicosanoidbiosynthese durch Cyclooxygenasen wie COX1 oder COX2, Lipoxygenasen,

wie 2-, 12- oder 15-LOX oder auch Cytochrom P450 Monooxygenasen (CYP).

Die COX-Produkte aus der Arachidonsäure (20:4 n-6) führen zu Prostanoiden und

Thromboxanen (Abb. 10.2). Sie sind an der antithrombotischen und antientzündlichen

Wirkung und der Homöostase beteiligt, wohingegen die LOX-Produkte, bei denen es

sich um Leukotriene und Hydroxyeicosatetraensäuren (Abb. 10.2) handelt, an der

Gefäßdurchlässigkeit, der Vasokonstriktion und der Bronchokonstriktion partizipiert

sind [100, 101].

Verglichen mit AA sind DHA und EPA schlechte Substrate für COX und LOX. Aus

ihnen generierte Eicosanoide weisen eine schlechtere Bioaktivität auf, als die aus AA

entstandenen Produkte. Weiterhin fördern die n-3 Fettsäuren den peroxisomalen Abbau

der Eicosanoide. Diese Effekte auf die Synthese, Bioaktivität und Metabolisierung der

Eicosanoide sind zumindest zum Teil verantwortlich für die antientzündlichen

Eigenschaften der n-3 Fettsäuren.

Eine dritte Möglichkeit der Eicosanoidbiosynthese schließt die mikrosomalen

Cytochrom P 450 verbundenen Monooxygenasen ein. CYP vermittelte Oxidation der

AA führt zu einer Vielzahl von Eicosanoiden, welche Epoxide, mittelkettige

Hydroxyfettsäuren, ω-Hydroxyfettsäuren und Dihydroxyfettsäuren beinhalten. Von den

Epoxidderivaten der AA wird berichtet, dass sie z.B. Ionenkanäle, Transporter-

funktionen, Bluthochdruck und die Mitose beeinflussen. n-3 Fettsäuren werden sowohl

zu Epoxy-, als auch zu Hydroxyfettsäuren umgewandelt, jedoch ist noch wenig über

ihre Bioaktivität bekannt [101].

Bei abschließender Betrachtung kann zudem noch festgehalten werden, dass

ω6-Fettsäuren die Eicosanoidbiosynthese stimulieren und NFκB aktivieren, woraus sich

die eher entzündlichen Attribute erklären. Die ω3-Fettsäuren dagegen inhibieren diese

und begründen so die antientzündlichen und antithrombotischen Eigenschaften der

ω3-Fettsäuren.

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74 Theoretischer Teil - 10 Fettsäuren

Abb. 10.2: Fettsäuren als Substrat für die Eicosanoidbiosynthese (modifiziert nach

[102])

10.2.5 Physiologische Bedeutung der ungesättigten Fettsäuren bei Herz-

Kreislauferkrankungen

Einen ersten Hinweis auf den positiven Einfluss einfach ungesättigter Fettsäuren gab

1970 die sieben Länder Studie [103], in der gezeigt wurde, dass mediterrane Völker

trotz einer hohen Fettaufnahme in Form von Olivenöl seltener unter koronaren Herzer-

krankungen litten, wofür der geringere Gehalt an gesättigten Fettsäuren verantwortlich

gemacht wurde. Die Nurses’ Health Studie konnte diese Vermutung bestätigen [104].

Weiterhin zeigte sich hierbei auch ein erhöhtes Risiko für Herz-Kreislauferkrankungen

durch gesättigte Fettsäuren und trans-Fettsäuren.

Die einzigartigen Wirkungen der mehrfach ungesättigten Fettsäuren auf koronare

Herzkrankheiten wurden das erste Mal bei der Untersuchung des Gesundheitszustandes

von Eskimos in Grönland entdeckt, die trotz einer hohen Fettaufnahme durch den

Verzehr von Seehunden, Walen und Fischen eine sehr niedrige Rate an koronaren

Herzerkrankungen aufweisen. Weitere Studien zeigten, dass dies am hohen Gehalt an

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Theoretischer Teil - 10 Fettsäuren 75

EPA und DHA in Fischöl lag. ω3-Fettsäuren verhindern durch eine Vielzahl an

Mechanismen, die in etlichen Studien untersucht worden sind, den Tod auf Grund von

koronaren Krankheiten und im speziellen den plötzlichen Herzstillstand. Folgende

Eigenschaften wurden nachgewiesen. Sie [105]:

- wirken antiarrhythmisch [106]

- sind Vorläufer der Prostaglandine und Leukotriene (s. 10.2.4.2)

- besitzen antientzündliche Eigenschaften (s. 10.2.4.2)

- inhibieren die Synthese von Zytokinen und Mitogenen

- stimulieren die NO-Synthase

- senken den Triacylglycerol- und VLDL-Spiegel

- inhibieren die Atherosklerose

- sind antithrombotisch (s. 10.2.4.2)

10.2.5.1 Senkung des Plasmalipidspiegels

Wie ungesättigte Fettsäuren den Plasmalipidspiegel senken, ist noch immer nicht ganz

erfasst. Seit kurzem ist bekannt, dass marine ω3-Fettsäuren über einen neuen Weg, dem

PERPP (post-ER presecretory proteolysis) Weg, den Abbau von neu synthetisiertem

Apolipoprotein B100 anregen, woraus eine geringere Lipoproteinfreisetzung aus den

Leberzellen und damit ein geringeres kardiovaskuläres Risiko resultiert. Apolipoprotein

B100 ist die kritische Proteinkomponente von VLDL, LDL und Lipoprotein (a), die die

bedeutendsten artherogenen Lipoproteine darstellen. Für diesen Abbau werden erhöhte

Mengen an Lipidperoxiden in der Zelle benötigt, die durch Eisenabhängige Lipid-

peroxidationsvorgänge bereitgestellt werden. EPA und DHA stellen auf Grund ihrer

großen Anzahl an Doppelbindungen außerordentlich gute Substrate für die Lipidper-

oxidation dar [107]. Umgekehrt wird PERPP durch Antioxidantien, wie Vitamin E, und

gesättigten Fettsäuren, die unempfindlich gegenüber Lipidperoxidation sind, unter-

drückt. Somit könnte also eine vermehrte Einnahme von Antioxidantien als uner-

wünschte Nebenwirkung einen Anstieg des Plasmalipidspiegels zur Folge haben [108].

Weiterhin sind die Fettsäuren in der Lage, durch Aktivierung von Transkriptions-

faktoren in die Fettsäurereguliergung einzugreifen. Neben der PPAR-Familie, zu denen

beispielsweise die Insulinsensitiser gehören [109], wurden auch SREBP-1c (Sterol

Response Element-Binding Proteine), LXRα (Liver-X-Receptor) und LXRβ, RXRα

(Retinoid-X-Receptor) und NFκB (Nuclear Factor) als Fettsäurerezeptoren identifiziert.

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76 Theoretischer Teil - 10 Fettsäuren

Allen gemeinsam ist, dass sie einen positiven Einfluss auf die Lipidhomöostase haben,

wobei dieser Einfluss eher durch Änderungen auf zellulärer Ebene, als durch

spezifische Effekte bestimmt wird [105]. Mehrfach ungesättigte Fettsäuren regulieren

also die Transkription von Genen herauf, die in den Fettabbau eingreifen, während

Gene, die in den Fettaufbau involviert sind, herunterreguliert werden. Daneben dienen

mehrfach ungesättigten Fettsäuren selber auch als Feedbackregulator der

Fettsäuresynthese [110].

Das Lipidprofil wird positiv beeinflusst und auch das Kardiovaskuläre Risiko sinkt

(s. 10.2.5). Typ 2 Diabetikern wird daher neuerdings neben einer Diät und Gewichts-

reduktion, die Einnahme von Fischöl (DHA/EPA) geraten [111].

Weiterhin wird angenommen, dass Fischöl einen positiven Einfluss auf die

Insulinsensitivität hat, so dass Typ 2 Diabetes verhindert werden könnte. Ist die

Krankheit jedoch bereits eingetreten, kann die Insulinresistenz durch Fischöl nicht mehr

invertiert werden [112].

10.2.5.2 Atherosklerose

Mehrfach ungesättigte Fettsäuren, wie EPA und DHA in Fischöl, verhindern die Ent-

wicklung von Atherosklerose. Die GISSI-Präventionsstudie hat gezeigt, dass eine

Behandlung mit Fischölkapseln einer Behandlung mit Simvastatin ebenbürtig ist [113].

Es gibt Anzeichen dafür, dass neben der Senkung des Plasmalipidspiegels (s. 10.2.5.1)

auch andere Mechanismen, wie eine geringere Zytokinproduktion oder eine gesteigerte

Bildung von NO im Endothel durch mehrfach ungesättigte Fettsäuren stimuliert werden

[114].

10.2.5.3 Thrombose

Wie bereits in 10.2.4.2 erwähnt, besitzen ω3-Fettsäuren antithrombotische Eigen-

schaften. Durch die inhibierende Wirkung auf den Eicosanoidbiosyntheseweg wird auch

die Synthese von Thromboxan A2 aus AA gehemmt. Dieses Prostaglandin bewirkt im

Körper normalerweise eine Plättchenaggregation und Vasokonstriktion. Aus einer

Einnahme von Fischöl resultiert daher auch eine Verlängerung der Blutungszeit.

Viele der Schlüsselenzyme der Hämostase benötigen Biomembranen. Da diese durch

mehrfach ungesättigte Fettsäuren beeinflusst werden können (s. 10.2.4.1), könnten

Fettsäuren dadurch eine wichtige regulatorische Rolle spielen. Das nimmt insofern an

Bedeutung zu, als verschiedene hämostatische und fibrinolytische Faktoren kürzlich als

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Theoretischer Teil - 10 Fettsäuren 77

Risikofaktoren von Herz-Kreislauferkrankungen identifiziert worden sind. Obwohl es

so scheint, als ob postprandiale Lipide eine Rolle in der Aktivierung von Faktor VII

spielen, sind die klinischen Implikationen dieser Beobachtungen noch unklar. Die

koagulierende Aktivität von Faktor VII nimmt mit verminderter Einnahme von

gesättigten Fettsäuren ab, was wahrscheinlich zum günstigen Einfluss einer an

gesättigten Fettsäuren armen Diät beiträgt. Darüber hinaus ist jedoch wenig über die

ergänzenden Einflüsse von Fettsäuren auf die Hämostase und fibrinolytische Aktivitäten

bekannt. In den meisten Fällen liegt dies an den schlechten Konzepten und

Assaymethoden der Studien, wie unangemessene Studiengrößen, Veränderung von

mehreren Variablen auf einmal oder auch ungeeignete Auswahl von Versuchstieren.

Weiterhin ist es schwierig die Ergebnisse zu vergleichen, da Hämostase Assays schwer

durchzuführen sind und die Art des Assays das Ergebnis ebenfalls beeinflusst.

Beispielsweise wird Faktor VII meist mit einem Assay untersucht, der die

Gerinnungszeit misst, in dem aber die Anteile, zu denen Faktor VII und Faktor VII a

beteiligt sind, unbekannt sind [115].

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78 Theoretischer Teil - 11 Thrombin

11 Thrombin

11.1 Thrombin allgemein

Der Gerinnungsfaktor Thrombin (Faktor IIa) ist das entscheidende Enzym der Blut-

gerinnungskaskade (siehe auch Kapitel 8.3.3). Es entsteht durch eine enzymatische

Spaltung aus der inaktiven Vorstufe Prothrombin und gehört zu der Klasse der Trypsin-

ähnlichen Serinproteasen. Neben dieser enzymatischen Funktion weist es auch

wachstumsfaktorartige sowie hormonartige Eigenschaften auf und kann nicht nur

koagulierend, sondern auch antikoagulierend wirken.

Thrombin wird als sein Zymogen Prothrombin (FII) in der Leber synthetisiert. Dieses

Zymogen ist jedoch unbrauchbar, wenn nicht die ersten zehn N-terminalen

Glutamatreste in einer Vitamin K-abhängigen Reaktion mittels einer Carboxylase an

ihrem γ-C-Atom carboxyliert werden. Dadurch wird aus dem schwachen Ca2+-Chelator

Glutamat der starke Chelator γ-Carboxyglutamat. Die Fähigkeit, nun Calcium zu binden

und so an Phospholipidmembranen zu haften, nimmt damit erheblich zu. Die

Aktivierung zu Thrombin selber geschieht durch den Prothrombinasekomplex, der aus

Cofaktor (FVa), Enzym (FXa) und Substrat (FII) besteht und membrangebunden

vorliegt [77]. Innerhalb dieses Komplexes wird Prothrombin proteolytisch gespalten

und es entsteht über das membrangebundene Meizothrombin nach weiterer Spaltung

durch Faktor Xa oder Autokatalyse das α-Thrombin, welches in die Blutgefäße

freigesetzt wird [116].

11.2 Struktur und Funktion

11.2.1 Struktur

11.2.1.1 Allgemein

α-Thrombin (EC 3.4.21.5) gehört zu den Serinproteasen und besitzt eine ellipsoide

Form. Es besteht aus einer kurzen A-Kette (light-chain, l-chain) sowie einer längeren

B-Kette (heavy-chain, h-chain), die über eine Disulfidbrücke miteinander verbunden

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Theoretischer Teil - 11 Thrombin 79

sind. Die B-Kette bildet eine tiefe Furche mit dem aktiven Zentrum aus, an deren Grund

sich die aus His 57, Asp102 und Ser195 bestehende katalytische Triade befindet [116].

Serinproteasen sind eine der am besten untersuchten Proteaseklassen. Im Allgemeinen

spalten Proteasen nicht endständige Peptidbindungen. Alle Serinproteasen verfügen

über die gleiche katalytische Triade, weshalb sie auch einen gemeinsamen

Katalysemechanismus aufweisen. Die Bezeichnung Serinprotease leitet sich daraus ab,

dass bei diesem Mechanismus eine Serinseitenkette eine entscheidende Rolle spielt.

Diese Enzyme sind in vielen Bereichen von großer Bedeutung, wie z. B. bei der

Verdauung von Nahrungsproteinen, im intrazellulären Proteinstoffwechsel oder bei

wichtigen biologischen Prozessen, wie der Blutgerinnung und der Fibrinolyse. Während

Verdauungsenzyme, beispielsweise Trypsin oder Chymotrypsin, natürlicherweise

unspezifische Peptidketten spalten sollen, benötigt Thrombin eine hohe Selektivität, da

es in der Blutgerinnungskaskade eine zentrale Rolle bei der Gewährleistung des

Gleichgewichts zwischen Thrombose, Hämostase und Fibrinolyse einnimmt.

Das Thrombinmolekül unterscheidet sich also von anderen Serinproteasen durch eine

hohe Substratspezifität. Diese wird durch so genannte Insertionloops erreicht, die sich

sowohl in der A-Kette, als auch in der B-Kette befinden. Die A-Kette verläuft dabei auf

der anderen Seite des aktiven Zentrums und spielt somit keine Rolle bei der

katalytischen Aktivität. Die Ketteninsertionen der A-Kette jedoch scheinen in die

strukturelle Stabilität des Moleküls involviert zu sein und beeinflussen dadurch indirekt

einige Enzymaktivitäten [117]. Im Gegensatz dazu haben die Insertionen der B-Kette

einen erheblichen Einfluss auf die Spezifität. Insbesondere der aus diesen Ketten-

insertionen gebildete 60er Loop und der 148er Loop, die sich an gegenüberliegenden

Seiten der Spalte mit der „active-site“ befinden, bewirken eine Verengung und

Vertiefung der Furche, so dass das aktive Zentrum weniger zugänglich für makro-

molekulare Substrate ist [118]. Beispielsweise kann Thrombin erst von typischen

Serinprotease-Inhibitoren (Serpine, s. Kapitel 8.4) gehemmt werden, wenn ein oder

beide Loops mittels Mutagenese entfernt worden sind [119, 120]. Neben den

beschriebenen Insertionloops gibt es, wie in Abb. 11.1 dargestellt, zwei Erkennungs-

domänen, die eine zentrale Bedeutung haben. Dabei handelt es sich einmal um die

Fibrinogenerkennungsregion (FRS) auch Exosite I („anion binding exosite I“) genannt

sowie die Heparinbindestelle (HBS), die auch als Exosite II („anion binding exosite II“)

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80 Theoretischer Teil - 11 Thrombin

bezeichnet wird. Beide Regionen

sind der katalytischen Tasche

zwar fern, aber trotzdem an

der spezifischen Bindung des

Thrombins an zahlreiche Substrate

beteiligt [117]. Weiterhin existiert,

etwa 15 Å vom aktiven Zen-

trum entfernt (s. Abb. 11.1), eine

Bindestelle für Natriumionen

[122]. Diese ist wichtig, da

Thrombin in zwei Formen vor-

liegen kann, einer Natriumge-

bundenen, koagulierenden („fast

form“) und einer Natriumfreien,

antikoagulierenden („slow form“)

[123].

11.2.1.2 Fibrinogenerkennungsregion (fibrinogen recognition site, FRS, Exosite I)

Die FRS befindet sich ca. 20 Å vom katalytischen Zentrum entfernt und beinhaltet

diverse kationische Reste, wodurch ein starkes elektropositives Feld um die exosite

herum gebildet wird. Dieses hat einen großen Einfluss auf die biomolekulare

Assoziation von Thrombin und anderen Liganden. Die FRS stellt die Erkennungs-

domäne für viele makromolekulare Substanzen wie Fibrinogen, TM, PAR1 (protease

activated receptor 1), Heparin-Cofaktor II, Hirudin sowie den Gerinnungsfaktoren V,

VIII und XIII dar. Dabei ist die Unversehrtheit der FRS wichtig für die Erkennung

dieser Substrate. Die Bindung an die FRS an sich stellt einen grundlegenden

Mechanismus dar, die Enzymaktivität über eine Konformationsänderung des 60er loops

und der S3-Tasche zu kontrollieren [117].

11.2.1.3 Heparinbindestelle (heparin binding site, HBS, Exosite II)

Die HBS weist die stärkste positive Oberflächenladung des Moleküls auf. Diese

Domäne ist erheblich an den Wechselwirkungen mit Heparin beteiligt. Durch diese

Wechselwirkungen wird eine starke Beschleunigung der Thrombininaktivierung durch

die Serpine bewirkt. Neben Heparin gehen auch andere makromolekulare Liganden und

Abb. 11.1: B-Kette des humanen Thrombins in der koagulierenden Form. Die katalytischen Reste sind eingezeichnet. (MOLSCRIPT entnommen aus [121])

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Theoretischer Teil - 11 Thrombin 81

Inhibitoren wie beispielsweise das Haemadin, der Glycosaminglykan-Rest von TM oder

der Gerinnungsfaktor VIII Wechselwirkungen mit der HBS ein.

Das Arrangement der Insertionloops und Erkennungsdomänen führen also zu einem

hocheffizienten Enzym. Es ist dadurch in der Lage, mit verschiedenen physiologischen

Substraten und Inhibitoren auf spezifische Art in Wechselwirkung zu treten.

11.2.2 Funktion von Thrombin

Wie bereits erwähnt besitzt Thrombin eine große Substratspezifität. Es spaltet nur

bestimmte, durch einen weiteren strukturellen Kontext festgelegte Arginin-Glycin-

Bindungen, von denen im Fibrinogen vier vorhanden sind. Die Spaltung von Fibrinogen

erfolgt vorzugsweise in der Natriumgebundenen schnellen Form des Thrombins.

Fibrinogen ist ein längliches Protein, das als Dimer vorliegt. Es besteht aus zwei

identischen Untereinheiten mit je drei Paaren homologer Polypeptidketten (A-α, B-β

und γ), wobei die beiden Hälften über drei Disulfidbrücken miteinander verbunden

vorliegen. Nach Shafer [124] spaltet Thrombin zunächst von jeder α-Seitenkette eine

kurze Aminosäurenkette, das so genannte Fibrinopeptid A, ab, wodurch sich Fibrin I

Monomere bilden, welche zu Fibrin I Oligomeren (Protofibrillen) aggregieren. Nach

weiterer Einwirkung von Thrombin kommt es zu einer Abspaltung einer weiteren

Aminosäurenkette, dem Fibrinopeptid B von jeder β-Seitenkette, was jedoch viel lang-

samer erfolgt. Es bilden sich Fibrin II Protofibrillen, welche wieder sehr schnell aggre-

gieren und das Gerinnselgrundgerüst bilden. Die C-terminale Region jeder γ-Seitenkette

eines Fibrinogens oder Fibrins enthält eine „Verknüpfungsdomäne“, an der Faktor XIIIa

die Bildung von γ-Dimeren katalysiert. Neben den Dimeren bilden sich auch Multimere

höherer Ordnung, was zwar recht langsam geschieht, jedoch eine höhere Stabilität und

Resistenz gegenüber der Fibrinolyse durch Plasmin mit sich bringt [125].

Thrombin ist ein allosterisches Enzym, welches in zwei Konformationen vorliegen

kann. Zum einen der Natriumgebundenen, schnellen Form, die vorzugsweise

Fibrinogen spaltet und zum anderen in der Natriumfreien, langsamen Form, die die

Aktivierung von Protein C (PC) begünstigt. Zwischen diesen beiden Formen herrscht

ein Gleichgewicht, welches von der Na+-Konzentration im Blut abhängt [126]. Natrium-

ionen spielen dabei die Rolle eines „passiven“ allosterischen Effektors, der auf-

genommen wird, wenn Fibrinogen bindet und bei Bindung von PC wieder abgegeben

wird. Durch die Bindung von Fibrinogen wird also die Umwandlung in die schnelle

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82 Theoretischer Teil - 11 Thrombin

Form begünstigt und umgekehrt die Überführung in die langsame Form, wenn PC

bindet.

Bei der Regelung der Thrombinfunktion nimmt Thrombomodulin (TM) eine zentrale

Rolle ein. Ist kein TM gegenwärtig, so dominiert die schnelle Form und die

koagulierende Wirkung überwiegt. Ist TM vorhanden, so bindet es, besonders bei

Anwesenheit von Ca2+, bevorzugt an die schnelle Form und unterstützt somit doppelt

die antikoagulierende Wirkung, da Thrombin einerseits der Blutgerinnung als Fibrin-

bildner entzogen wird und andererseits PC aktiviert, was zur Inaktivierung von

wichtigen Faktoren der Gerinnungskaskade führt [123]. Die Bindung von Thrombin an

Thrombomodulin fördert also die katalytische Effizienz der Hydrolyse von PC. Dabei

bindet TM hauptsächlich an die FRS, der Glykosaminglykan-Rest jedoch bindet an die

HBS.

Die Aktivierung von PC durch den Thrombin-Thrombomodulin-Komplex wird durch

den EPCR (endothelial protein C receptor) erheblich beschleunigt und auch die Höchst-

geschwindigkeit wird deutlich erhöht [127].

Neben den Funktionen als Enzym, wirkt Thrombin als potentester physiologischer

Plättchenaktivator. Auf der Plättchenoberfläche existieren diverse G-Protein gekoppelte

Rezeptoren, bekannt als PARs (protease activated receptors) von denen jedoch in Bezug

auf Thrombin nur PAR1 und 4 relevant sind [128]. Eine Plättchenaktivierung erfolgt

erst nach proteolytischer Aktivierung durch Thrombin. Dabei spaltet Thrombin einen

N-terminalen extrazellulären Bereich ab und setzt so eine neue N-terminale Domäne

frei, die daraufhin intramolekular als bindender Ligand mit der zweiten extrazellulären

Schleife des Rezeptors in Wechselwirkung tritt [129, 130]. Für eine Plättchen-

aktivierung ist also proteolytisch aktives Thrombin in seiner schnellen, Natrium-

gebundenen Form erforderlich.

Daneben bindet Thrombin auch an den Rezeptor Glykoprotein Ib-IX-V Komplex. Tests

haben gezeigt, dass die Anwesenheit von GP Ib auf der Membran nötig ist, um eine

volle Plättchenaktivierung durch Thrombin auszulösen. Eine durch Thrombin induzierte

Aktivierung ist also abhängig von Wechselwirkungen sowohl mit den PARs, als auch

mit dem GP Ib-IX-V Komplex [117]. Neben seiner hohen Affinität zum vWF und damit

großen Rolle in der Plättchenadhäsion (s. Kapitel 8.2.2) besitzt GP Ib auch eine hohe

Affinität zum Thrombin, was zur Thrombininduzierten Plättchenaktivierung beiträgt

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Theoretischer Teil - 11 Thrombin 83

[131]. Dafür sind viele basische Reste innerhalb des extrazellulären Bereichs von

GP Ibα, auch Glycocalicin genannt, verantwortlich, die als „heparinartiger“ Ligand

fungieren und mit der HBS in Wechselwirkungen treten. Diese Bindung bewirkt eine

allosterisch bedingte Konformationsänderung der „active-site“ des Thrombins und

damit eine veränderte Aktivität gegenüber seinen physiologischen Substraten [132].

Weitere Tests zeigen, dass bei einer niedrigen Thrombinkonzentration eine Bindung an

den Rezeptor GP Ib das Enzym vor einer Heparin-katalysierten Inhibition durch AT III

schützt [133]. Dieser Mechanismus könnte dazu dienen, dass geringe Mengen

Thrombin am Anfang der primären Hämostase vor einer Inaktivierung geschützt

werden und so koagulierende Aktionen und plättchenvermittelte Zellantworten aufrecht

gehalten werden können, bis genug Thrombin durch positive Rückkopplung

nachgebildet wird.

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84 Theoretischer Teil - 12 Antikoagulanzien

12 Antikoagulanzien

12.1 Vitamin-K-Antagonisten (VKA)

Bei Vitamin K handelt es sich um einen Cofaktor der posttranslationalen

Carboxylierung in der Leber, bei der Glutamatreste in γ-Carboxyglutamat an der

N-terminalen Region der Gerinnungsfaktoren II, VII, IX und X sowie Protein C und S

überführt werden. VKAs verdrängen Vitamin K an der Carboxylase, so dass Faktoren

entstehen, deren Glutamylreste nicht mehr verändert sind. Diese verlieren so ihre

Aktivierbarkeit, da sie nun nicht mehr in der Lage sind, Calcium und Phospholipide zu

binden. Daraus erklärt sich auch, warum VKAs nicht in vitro wirken und dass eine

ausreichende Senkung des Blutspiegels der Gerinnungsfaktoren und damit die volle

Antikoagulation erst nach zwei bis drei Tagen eintritt. Gleiches ist bei Absetzen des

Präparates für die Normalisierung der Blutgerinnung zu beachten. Da die Wirkung von

zahlreichen endogenen und exogenen Faktoren beeinflusst wird, woraus starke inter-

und intraindividuelle Schwankungen resultieren, muss die individuelle Dosierung durch

ein engmaschiges Gerinnungs-Monitoring angepasst werden [134]. Eine Überdosis wird

durch Gabe von Vitamin K behandelt. Der am meisten eingesetzte VKA ist Warfarin.

Daneben wird in Europa häufig auch Phenprocoumon mit einer längeren Halbwertszeit

angewandt.

12.2 Heparine

Heparine werden in Mastzellen der Lunge und der Leber sowie von Granulozyten des

Blutes gebildet. Dabei handelt es sich um ein Gemisch aus Molekülen unterschiedlicher

Kettenlänge. Nach parenteraler Gabe wirken sie nicht direkt, sondern über die Bindung

an Antithrombin III, wodurch es zu einer Beschleunigung der TAT-Bildung und damit

Thrombinhemmung kommt (vgl. Kapitel 8.4). Auch Faktor Xa wird auf diese Art

inaktiviert. Sobald Thrombin bzw. Faktor Xa kovalent gebunden ist, wird das Heparin

wieder freigesetzt und kann mit weiteren AT III Molekülen interagieren. Ein großer

Vorteil von Heparin ist die Sofortwirkung, die durch Gabe von organischen Protein-

kationen, wie beispielsweise Protamin, ebenso schnell wieder aufgehoben werden kann.

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Theoretischer Teil - 12 Antikoagulanzien 85

Unfraktioniertes Heparin (UFH) jedoch bindet an zahlreiche Plasmaproteine und Zellen,

wodurch eine schlechte Bioverfügbarkeit und ein großes Spektrum der anti-

koagulatorischen Wirkung resultiert. Außerdem ist der gerinnungshemmende Effekt

nicht linear, sondern nimmt mit steigender Dosis überproportional zu. Niedermolekulare

Heparine (NMH) dagegen weisen eine 90%ige Bioverfügbarkeit auf und lassen sich in

ihrer Wirkung gut vorhersagen.

Weiterhin gibt es noch andere Glycosaminoglycane wie Danaparoid und Dermatan-

sulfat (DS), wovon nur das erste in Deutschland bei Heparin-induzierter Thrombo-

zytopenie Typ II (HIT II) zugelassen ist. Danaparoid katalysiert die Thrombinhemmung

durch AT III mittels seiner Heparansulfatfraktion und die Bindung an Heparin-

Cofaktor II mittels seines Dermatansulfatanteils. Der Mechanismus der antithrom-

botischen Wirkung von DS ist jedoch noch nicht geklärt.

Auch Pentosanpolysulfat soll noch genannt werden, von dem der Wirkmechanismus

auch noch immer diskutiert wird. In Deutschland ist es zwar zu Thromboseprophylaxe

zugelassen, wird jedoch nicht in den aktuellen Behandlungsrichtlinien aufgeführt [135].

Inaktiviert wird Heparin durch Plättchen Faktor 4 und Heparinase, die beide von

aktivierten Plättchen freigesetzt werden [136].

12.3 Direkte Thrombin Inhibitoren

Ein großer Vorteil von direkten Thrombininhibitoren ist, dass sie neben freiem

Thrombin auch fibringebundenes im Gerinnsel hemmen und darüber hinaus Fibrin vom

Enzym verdrängen. Die direkten Thrombininhibitoren werden unterteilt in natürlich

vorkommende, aber auch in kovalente und nichtkovalente Inhibitoren, die mit der

„active-site“ reagieren sowie Thrombin bindende DNA Aptamere.

Die natürlich vorkommenden direkten Inhibitoren umfassen Hirudin, sein semi-

synthetisches Fragment Bivalirudin (Hirulog) sowie Bothrojacin, Rhodiin, Triabin und

Dipetalin, wobei nur Hirudin und Bivalirudin im Menschen evaluiert worden sind [137].

Rekombinante Hirudine und Bivalirudin binden mit einer hohen Affinität im Verhältnis

1:1 bivalent sowohl an die FRS als auch die „active-site“ des Thrombins, wobei sich

Bivalirudin durch eine reversible Bindung auszeichnet. Weiterhin wird es über endo-

gene Peptidasen abgebaut und kann daher auch bei Patienten mit Nierenfunktions-

störungen sicher angewendet werden [138]. Da Hirudine im Allgemeinen über eine

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86 Theoretischer Teil - 12 Antikoagulanzien

geringere Plasmaeiweißbindung als Heparine verfügen, sind sie in ihrer Wirkung gut

steuerbar. Außerdem kommt es zu keiner Heparin-induzierten Thrombozytopenie

(HIT II).

Nichtkovalente Inhibitoren sind kleine Moleküle, die an die „active-site“ binden und als

kompetitiver Inhibitor wirken. Sie alle leiten sich vom Fibrinopeptid A ab, welches

durch Thrombin vom Fibrinogen abgespalten wird, also einen natürlichen Liganden

darstellt. Über verschiedene Optimierungsschritte kam man zu einer Reihe von

niedermolekularen Strukturen, von denen sich die meisten von der Tripeptidsequenz

D-Phe-Pro-Arg oder dem N-Amidinopiperidin ableiten. Beide Grundstrukturen sind für

die Bindung an die katalytische Triade verantwortlich [139]. Der Prototyp für diese

Klasse ist das Argatroban. Es zeichnet sich durch einen schnellen reversiblen

Wirkungseintritt und fehlende Antikörperbildung aus und ist ebenfalls sicher bei

Nierenpatienten einsetzbar, da es fast vollständig in der Leber metabolisiert wird.

Derzeit ist Argotraban in Deutschland noch nicht zugelassen, spielt jedoch in den USA

bereits eine Rolle sowohl bei der Therapie als auch als Prophylaxe der HIT II [140]. Es

ist jedoch nur parenteral applizierbar, was zwar für die Akuttherapie ein Vorteil ist,

jedoch die Compliance bei einer Langzeittherapie erschwert. Für diese stand bis vor

kurzem noch als erster Vertreter das Ximelagatran, ein oral resorbierbares Prodrug des

Melagatran, auch auf dem deutschen Markt zur Verfügung. Dieses wird nach

Resorption durch die Darmwand im Blut in die Muttersubstanz umgewandelt. Der

therapeutische Bereich ist groß und die Wirkung gut vorhersehbar, so dass eine orale

Langzeitprophylaxe mit einer Standarddosis möglich zu sein schien. Trotz der viel

versprechenden Prognose, hat sich Ximelagatran in der Langzeitstudie EXTEND nicht

bewähren können. Nach einer 35-tägigen Applikation kam es bei einem Fall in den

folgenden Wochen zu einer schweren, jedoch glücklicherweise reversiblen Leber-

schädigung. AstraZeneca hat daraufhin alle Präparate vom Markt genommen und auch

ihre noch laufenden klinischen Studien im Interesse der Patienten abgebrochen, da

alternative Antikoagulantien vorhanden sind [142].

DNA Aptamere sind kurze, einsträngige DNA Fragmente. Aufgrund ihrer dreidimen-

sionalen Struktur können sie ebenso gut an Thrombin binden, wie ein natürlicher

Bindungspartner. Dabei können Aptamere inhibierend auf das Protein wirken. Die

Firma Archemix hat in Kooperation mit der Firma Nuvelo bereits eine Klinische Studie

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Theoretischer Teil - 12 Antikoagulanzien 87

Phase I mit der Substanz ARC183 durchgeführt, die jedoch an dem suboptimalen

Dosierungsprofil des Wirkstoffes scheiterte. Derzeit forschen die Unternehmen daher an

einer günstigeren Struktur für den Einsatz als Thrombininhibitor [143].

12.4 Faktor-Xa-Inhibitoren

Bei den Faktor-Xa-Inhibitoren unterscheidet man ebenfalls zwischen den direkten

Inhibitoren, die direkt an Faktor Xa binden und den indirekten, die AT III für ihre

Wirkung benötigen. Zu den indirekten Faktor-Xa-Inhibitoren gehören die Penta-

saccharide, zu denen auch Fondaparinux gehört. Fondaparinux ist im Gegensatz zu

Heparin ein selektiver Xa-Inhibitor. Er bindet spezifisch mit hoher Affinität an AT III

und beschleunigt die Komplexbildung zwischen Xa und AT III. Thrombin kann nicht

gebunden werden, da dafür eine längere Polysaccharidsequenz erforderlich ist (>17

Monosaccharide). Im Gegensatz zu den Heparinen bindet Fondaparinux nicht

unspezifisch an Plasmaproteine und Zellen. Es ist somit auch nicht in der Lage, eine

HIT II auszulösen [141]. Eine Weiterentwicklung des Fondaparinux ist das Idraparinux,

welches negativer geladen ist und mit einer höheren Affinität an AT III bindet. Daraus

folgt eine höhere Halbwertszeit, was zu einer möglichen wöchentlichen Applikation im

Vergleich zu einer täglichen Applikation von Fondaparinux und den NMH führen

könnte. Derzeit befindet sich Idraparinux in der klinischen Phase III.

Im Gegensatz zu den indirekten Xa-Inhibitoren hemmen direkte Inhibitoren nicht nur

frei vorliegenden Faktor Xa, sondern auch im Prothrombinase-Komplex gebundenen

Faktor Xa. Direkte Xa-Inhibitoren wurden aus Zecken und Blutegeln gewonnen. Zu

diesen gehören beispielsweise Antistasin, Lefaxin und TAP (tick anticoagulant peptide),

welche heute hauptsächlich als Leitstrukturen bei der Entwicklung neuer synthetischer,

niedermolekularer Strukturen dienen [135].

12.5 Neuere Entwicklungen

12.5.1 TF/FVIIa-Komplex

Wie weiter oben erläutert, spielt die extrinsische Tenase eine große Rolle in der Blut-

gerinnung und stellt somit ein gutes Target für neue Antikoagulanzien dar. Tifacogin

ist der rekombinant gewonnene TFPI (tissue factor pathway inhibitor). Wie bereits

erwähnt, findet die Inhibition in zwei Schritten statt. Zunächst wird freier Faktor Xa im

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88 Theoretischer Teil - 12 Antikoagulanzien

Komplex gebunden und inaktiviert. Dieser Komplex inhibiert dann den membran-

gebundenen TF/Faktor VIIa Komplex. Obwohl Phase-II-Studien sehr viel versprechend

waren, scheiterte eine Phase-III-Studie mit Sepsis-Patienten. Trotz allem befindet es

sich noch in klinischen Studien.

NAPc2 wurde ursprünglich aus dem blutsaugenden Hakenwurm isoliert. Es bindet an

die nichtkatalytische Seite von Faktor X/FaktorXa und dieser Komplex inhibiert dann

Faktor VIIa im TF/FVIIa-Komplex. Durch die lange Halbwertszeit wäre eine

Applikation alle zwei Tage möglich. Derzeit befindet sich rNAPc2 in klinischen

Phase-III-Studien.

Bei FVIIai handelt es sich um den rekombinanten Faktor VII, bei dem die Substrat-

bindestelle des Faktors VII blockiert ist. Es konkurriert mit Faktor VII um die Bindung

an TF, woraus inaktive TF/FVIIai-Komplexe resultieren. In einer Phase-II-Studie zeigte

es keine signifikanten Effekte im Vergleich zu Heparin alleine, weshalb weitere

Entwicklungen gestoppt wurden [137, 141].

12.5.2 Aktiviertes Protein C (aPC)

Auch bei aktiviertem Protein C handelt es sich um ein physiologisch vorkommendes

Molekül (vgl. Kapitel 8.4), welches antithrombotische, profibrinolytische und ent-

zündungshemmende Eigenschaften aufweist. Das rekombinante aPC ist als Drotrecogin

seit zwei Jahren für die Behandlung von Patienten mit Sepsis zugelassen. Obgleich es

bereits klinisch in Patienten, die einen genetisch bedingten Protein C-Mangel aufwiesen

und eine tiefe Beinvenenthrombose bzw. Lungenembolie erlitten, eingesetzt wurde,

müssen diese viel versprechenden Ergebnisse noch in klinischen Studien bestätigt

werden [137, 141].

12.5.3 Thrombomodulin (TM)

Thrombomodulin ist ein physiologisch wichtiger Cofaktor für die gerinnungshemmende

Wirkung von Protein C. Es ist theoretisch dem rekombinanten aPC überlegen, da es

physiologisches PC nur dort aktiviert, wo Thrombin gebildet wird. Lösliches TM,

welches seit kurzem genetisch herstellbar ist, wurde erfolgreich in klinischen Studien

zur Verhütung postoperativer Thrombosen getestet. Die lange Halbwertszeit erlaubt

dabei eine subkutane Gabe von zwei Mal die Woche [137, 141].

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Theoretischer Teil - 13 Optimierung der Testsysteme für Thrombin 89

13 Optimierung der Testsysteme für Thrombin

13.1 Ligandenfischen mit humanem Thrombin im Vergleich zu Fischen mit Rinderthrombin

Abb. 13.1: Überlagerung der Strukturen von Rinderthrombin (gelb) und humanem Thrombin (rosa), erstellt mit PyMOL [62]

13.1.1 Einleitung

Das Prinzip des Fischens wurde ursprünglich am Beispiel des Rinderthrombins

entwickelt [144]. Es wurde damals Rinderthrombin verwendet, da es in der

Anschaffung erheblich günstiger als humanes Thrombin ist. Dank einer großzügigen

Spende von Aventis befinden wir uns heute jedoch in der Lage, humanes Thrombin in

ausreichenden Mengen zu besitzen.

Die Sequenzhomologie zwischen humanem und Rinderthrombin beträgt global gesehen

81%, betrachtet man nur die biologisch relevanten Bereiche in der aktivierten Form

(vgl. Abb. 13.1), so kommt man sogar auf 87% [145]. Demnach unterscheiden sich die

Aminosäuresequenzen in mehreren Positionen. Es ist daher nicht sehr verwunderlich,

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90 Theoretischer Teil - 13 Optimierung der Testsysteme für Thrombin

dass sich die Ergebnisse der Experimente mit Rinderthrombin nicht ohne weiteres auf

den Menschen übertragen lassen. Die Bindetaschen sind zwar identisch in der

katalytischen Triade, jedoch zeichnet sich das Thrombin durch eine Vielfalt von

Wechselwirkungen mit unterschiedlichen Molekülen aus (vgl. Kapitel 11.2.2). Diese

sind nicht auf die Bindetasche beschränkt, haben aber dennoch einen erheblichen

Einfluss auf die Aktivität, so dass unter Umständen potentielle Inhibitoren mitunter gar

nicht erst bis in die Bindetasche vordringen könnten. Die Verwendung von humanem

Thrombin ist also von entscheidender Bedeutung für die Relevanz der Ergebnisse in

Bezug auf die Entwicklung neuer Antithrombotika für den Menschen.

Es stellte sich folglich die Frage, ob das Ligandenfischen unter gleichen Bedingungen

auch mit humanem Thrombin möglich ist und dem etablierten Fischen mit

Rinderthrombin ebenbürtig oder sogar überlegen ist.

Als Inhibitoren wurden bekannte Verbindungen aus der 3-Amidinophenylalaninreihe

(Formeln s. Anhang B, S. 163-165) verwendet, die im Folgenden mit V1-4 bezeichnet

werden. Dabei sinkt die Stärke des Inhibitors mit steigender Bezifferung um jeweils

etwa eine Zehnerpotenz.

V1 mit Ki= 0,0021 µmol/l V2 mit Ki= 0,065 µmol/l

V3 mit Ki= 0,34 µmol/l V4 mit Ki= 8,9 µmol/l

Zunächst wurden die Inhibitoren einzeln getestet, dann im Gemisch und schließlich in

einer willkürlich zusammengesetzten Arzneistoffbibliothek. Die Ergebnisse werden im

Folgenden dargestellt.

13.1.2 Ligandenfischen von Reinsubstanzen

Lenz [144] testete Enzym und Inhibitor in einem Verhältnis von 1 nmol zu 4 nmol. Wir

haben dies zwar als Grundlage für die Inhibitorkonzentrationen genommen, haben

jedoch die Enzyme in gleichen Aktivitäten, nämlich 50 IE/ml, eingesetzt. Daraus ergab

sich für das Rinderthrombin eine Konzentration von 1 mg/ml bzw. 2,703 µmol pro

Ansatz und für das humane Thrombin eine Konzentration von 0,16 mg/ml bzw.

0,432 nmol pro Ansatz.

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Theoretischer Teil - 13 Optimierung der Testsysteme für Thrombin 91

In den folgenden Abbildungen werden die Ergebnisse graphisch präsentiert. Dabei stellt

die durchgehende Linie immer das Fischen mit dem jeweiligen Inhibitor und die

unterbrochene Linie den dazugehörigen Blindwert dar.

Als erstes ist im Folgenden das Ergebnis mit dem potentesten Inhibitor (V1) abgebildet.

Es ist deutlich erkennbar, dass von beiden Enzymen jeweils etwa gleiche Mengen des

Inhibitors freigesetzt werden.

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Filtration 1.Waschung 2.Waschung Freisetzung

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in M

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V1 Blind

Abb. 13.2: Fischergebnisse mit dem potentesten Inhibitor (V1) mit einem Ki-Wert von 0,0021 µmol/l. Links humanes Thrombin, rechts Rinderthrombin

Vergleicht man, wie in der folgenden Abbildung dargestellt, die Ergebnisse für den

Inhibitor mit dem zweitstärksten ki-Wert (Inhibitor V2), so ist ersichtlich, dass das

humane Thrombin besser dazu geeignet ist, schwächere Inhibitoren zu fischen, als das

Rinderthrombin.

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Filtration 1.Waschung 2.Waschung Freisetzung

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Filtration 1.Waschung 2.Waschung Freisetzung

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V2 Blind

Abb. 13.3: Fischergebnisse mit Inhibitor V2 mit einem Ki-Wert von 0,065 µmol/l. Links humanes Thrombin, rechts Rinderthrombin

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92 Theoretischer Teil - 13 Optimierung der Testsysteme für Thrombin

Auch in den sich anschließenden Abbildungen Abb. 13.4 und Abb. 13.5, die die

Fischergebnisse mit den schwächeren Inhibitoren V3 und V4 darstellen, ist eine

deutlich höhere Empfindlichkeit beim Fischen mit dem humanen Thrombin zu

erkennen. Bei Inhibitor V4 ist, wie auch schon in der Arbeit von Jana Lenz, kein

Fischen mehr mit dem Rinderthrombin möglich, wohingegen mit humanem Thrombin

noch eine leichte Zunahme der Fläche im Freisetzungsschritt zu sehen ist.

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Filtration 1.Waschung 2.Waschung Freisetzung

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V3 Blind

Abb. 13.4: Fischergebnisse mit Inhibitor V3 mit einem Ki-Wert von 0,34 mmol/l. Links humanes Thrombin, rechts Rinderthrombin

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Filtration 1.Waschung 2.Waschung Freisetzung

AU

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V4 Blind

Abb. 13.5: Fischergebnisse mit Inhibitor 4 mit einem Ki-Wert von 8,9 µmol/l. Links humanes Thrombin, rechts Rinderthrombin

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Theoretischer Teil - 13 Optimierung der Testsysteme für Thrombin 93

13.1.3 Ligandenfischen aus einem Inhibitorgemisch

Um zu beweisen, dass der stärkste Inhibitor als Ligand gefischt wird, wurden die bereits

einzeln getesteten Inhibitoren V1-V4 äquimolar gemischt. Aus dieser sehr kleinen

Bibliothek wurde dann sowohl mit humanem, als auch mit Rinderthrombin gefischt.

Vergleicht man in der folgenden Abbildung (Abb. 13.6) das linke Diagramm, welches

Fischen mit dem humanen Thrombin darstellt, mit dem rechten Diagramm, welches das

Ergebnis für Fischen mit Rinderthrombin wiedergibt, so sieht man, dass wieder beide

Enzyme den Inhibitor V1 etwa gleichstark gefischt haben.

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V1 Blind

Abb. 13.6: Fischen von Inhibitor V1 (Ki= 0,0021 µmol/l) aus einem Inhibitorgemisch. Links humanes Thrombin, rechts Rinderthrombin

An Hand der nachfolgenden Abbildungen, die die Ergebnisse der anderen Inhibitoren

darstellen, ist deutlich zu erkennen, dass Inhibitor V1 als stärkster Inhibitor auch am

besten gefischt wurde.

Wie in Abb. 13.7 ersichtlich, wird Inhibitor V2 von humanem Thrombin noch

erkennbar, von Rinderthrombin dagegen nur noch leicht gefischt.

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94 Theoretischer Teil - 13 Optimierung der Testsysteme für Thrombin

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V2 Blind

Abb. 13.7: Fischen von Inhibitor V2 (Ki= 0,065 µmol/l) aus einem Inhibitorgemisch. Links humanes Thrombin, rechts Rinderthrombin

Abb. 13.8 zeigt das Ergebnis für Inhibitor V3, der nur von humanem Thrombin noch

schwach und von Rinderthrombin aus diesem Gemisch gar nicht mehr gefischt wird.

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Abb. 13.8: Fischen von Inhibitor V3 (ki= 0,34 µmol/l) aus einem Inhibitorgemisch. Links humanes Thrombin, rechts Rinderthrombin

Inhibitor V4 schließlich, mit einem Ki-Wert von 8,9 µmol/l der schlechteste von uns

verwendete Inhibitor, wird aus diesem Inhibitorgemisch gar nicht mehr gefischt, wie die

folgenden Diagramme (Abb. 13.9) zeigen.

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Abb. 13.9: Fischen von Inhibitor V4 (Ki= 8,9 µmol/l) aus einem Inhibitorgemisch. Links humanes Thrombin, rechts Rinderthrombin

13.1.4 Ligandenfischen aus einer Substanzbibliothek

Als letztes wurde noch verglichen, in wie fern das humane Thrombin im Vergleich zum

Rinderthrombin ebenfalls in der Lage ist, einen Inhibitor aus einem Substanzgemisch zu

fischen und wie stark dieser Inhibitor für die gewählte Thrombinkonzentration sein

muss. Dafür wurden folgende 11 Arzneistoffe (Formeln s. Anhang B, S. 165-167), die

keine Inhibitoren darstellen, zufällig nach ihren Retentionszeiten ausgewählt:

Arzneistoff: Retentionszeit: Arzneistoff: Retentionszeit:

Amitriptylin-HCl tR= 37,5 min Metoclopramid-HCl tR= 22,8 min

Bromhexin-HCl tR= 34,9 min Metoprololtartrat tR= 24,4 min

Chlorpromazin-HCl tR= 39,2 min Neostigminmetilsulfat tR= 14,9 min

Diphenhydramin-HCl tR= 32,9 min Orciprenalinsulfat tR= 7,9 min

Homatropin-Br tR= 18,1 min Warfarin-Na tR= 43,4 min

Lidocain-HCl tR= 21,3 min

Für die Erstellung der Substanzbibliotheken (SB) wurden jeweils 4 nmol sowohl der

Arzneistoffe, als auch des jeweiligen Inhibitors eingesetzt, so dass letztendlich vier

Substanzbibliotheken entstanden, SB1 mit Inhibitor 1 bis SB4 mit Inhibitor 4.

Die nachfolgenden Abbildungen der Fischergebnisse zeigen, dass ein Inhibitor sowohl

mit Rinderthrombin, als auch mit humanem Thrombin, ebenso gut aus einer Substanz-

bibliothek mit unterschiedlichen Strukturen gefischt werden kann, wie auch als

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96 Theoretischer Teil - 13 Optimierung der Testsysteme für Thrombin

Reinsubstanz. Erwartungsgemäß hing die Fischbarkeit der Inhibitoren von der Potenz

des jeweiligen Inhibitors ab. Wie die Diagramme der Fischversuche mit SB1

(Abb. 13.10) und SB2 (Abb. 13.10), also mit den Inhibitoren V1 bzw. V2, deutlich

machen, ist das Fischen von Inhibitoren mit einem Ki-Wert im zweistelligen

nanomolaren Bereich noch sehr gut erkennbar. In Abb. 11.12 ist dann zu erkennen, dass

Inhibitor V3 auch noch ausreichend gut von beiden Enzymen aus einer

Substanzbibliothek gefischt wird. Inhibitor V4 dagegen (Abb. 13.13), wie die darauf

folgende Darstellung zeigt, wird weder mit humanem, noch mit Rinderthrombin

gefischt.

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Abb. 13.10: Fischen von Inhibitor V1 (Ki= 0,0021 µmol/l) aus einer Substanzbibliothek. Links humanes Thrombin, rechts Rinderthrombin

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Abb. 13.11: Fischen von Inhibitor V2 (Ki= 0,065 µmol/l) aus einer Substanzbibliothek. Links humanes Thrombin mit 30 I.E./ml, rechts Rinderthrombin mit 50 I.E./ml

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nd

SB+V3 Blind

Abb. 13.12: Fischen von Inhibitor V3 (Ki= 0,34 µmol/l) aus einer Substanzbibliothek. Links humanes Thrombin, rechts Rinderthrombin

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Filtration 1.Waschung 2.Waschung Freisetzung

AU

in T

ause

nd

SB+V9 Blind

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Filtration 1.Waschung 2.Waschung Freisetzung

AU

in T

ause

nd

SB+V9 Blind

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Filtration 1.Waschung 2.Waschung Freisetzung

AU

in T

ause

nd

SB+V9 Blind

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Filtration 1.Waschung 2.Waschung Freisetzung

AU

in T

ause

nd

SB+V9 Blind

Abb. 13.13: Fischen von Inhibitor V4 (Ki= 8,9 µmol/l) aus einer Substanzbibliothek. Links humanes Thrombin, rechts Rinderthrombin

13.2 Optimierung des Aktivitätsassays für humanes Thrombin

13.2.1 Einleitung

Da die existierende Vorschrift für Rinderthrombin erstellt worden ist, im Rahmen dieser

Arbeit jedoch humanes Thrombin verwendet werden sollte, mussten die Bedingungen

zunächst einmal überprüft und gegebenenfalls optimiert werden. Als Prüfsubstanzen

dienten wiederum die Inhibitoren (V1-V4) aus der 3-Amidinophenylalaninreihe.

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98 Theoretischer Teil - 13 Optimierung der Testsysteme für Thrombin

13.2.2 Einfluß der Enzymkonzentration

Zunächst wurde eine Stammlösung des humanen Thrombins mit 100 IE/ml hergestellt.

Diese wurde 1:1 mit Thrombin-Puffer verdünnt, so dass zwei Lösungen resultierten,

eine mit 100 I.E./ml und eine mit 50 I.E./ml. Parallel wurden nun beide Lösungen auf

einer 96er-Microtiterplatte jeweils auf Inhibitor 3 mit einem Ki-Wert von 0,34 µmol/l

und Inhibitor 4 mit einem Ki-Wert von 8,9 µmol/l getestet. Die Inhibitoren lagen dabei

in einer Konzentration von sowohl 10µg/ml als auch 100µg/ml vor.

11,21

72,20

29,18

88,9484,75

97,76 98,12

75,53

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

V4-10µg V3-10µg V4-100µg V3-100µg

Inhi

bitio

n in

%

50 I.E. 100 I.E.

Abb. 13.14: Untersuchung des Einflusses der Enzymkonzentration auf den amidolytischen Assay

Es ist deutlich zu erkennen, dass der Einfluss der Enzymkonzentration stärker ist, je

schwächer der Inhibitor und je geringer die Inhibitorkonzentration ist. Fallen beide

Faktoren zusammen, so wird der Test immer unempfindlicher.

Dieses wird verständlich, wenn man die Absorptionskurven der Blindwerte in der

folgenden Abbildung betrachtet.

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Theoretischer Teil - 13 Optimierung der Testsysteme für Thrombin 99

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30s

AU

Blind 50 I.E. Blind 100 I.E.

Abb. 13.15: Absorptionskurven der Blindwerte bei der Untersuchung des Einflusses der Enzymkonzentration auf den amidolytischen Assay

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30s

AU

50 I.E. V4-10µg 100 I.E. V4-10µg Blind 50 I.E. Blind 100 I.E.

Abb. 13.16: Absorptionskurven der Blindwerte und von Inhibitor 4 bei der Untersuchung des Einflusses der Enzymkonzentration auf den amidolytischen Assay

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100 Theoretischer Teil - 13 Optimierung der Testsysteme für Thrombin

Um die geringere Empfindlichkeit bei schwächeren, bzw. geringer konzentrierten

Inhibitorlösungen zu demonstrieren, sind in Abb. 13.16 die Absorptionskurven des

Inhibitors V4 noch zusätzlich eingezeichnet.

Klar erkennbar ist jetzt, dass die Kurve der geringeren Konzentration (große Quadrate)

sich dem Blindwert angenähert hat und fast ebenso flach verläuft. Die Berechnung der

Inhibition erfolgt jedoch über die Ermittlung der Absorptionssteigung. Je steiler die

Kurve ist, desto schneller wird das Substrat umgesetzt. Verläuft die Kurve zu flach, so

ist der Unterschied zwischen dem Blindwert und der Inhibition zu gering und der Test

wird unempfindlicher. Ist die Kurve dagegen zu steil, erfolgt die Umsetzung des

Substrats zu schnell und es werden zu wenig Datensätze erfasst. Als Resultat wird der

Test ebenfalls unempfindlicher (Abb. 13.16).

Auf Grund dieses Ergebnisses wurde die Entscheidung zugunsten einer Enzym-

konzentration von 100 I.E./ml als Stammlösung gefällt.

13.2.3 Einfluss des Serumalbumins

Da es sich bei dem verwendeten Beriplast um humanes Thrombin handelt, wurde

überprüft, ob bovines oder humanes Serumalbumin den Assay entscheidend beein-

flussen. Als Proteinstammlösung wurden die oben ermittelten 100 I.E./ml gewählt.

Bevor die Enzymlösung in die Reaktionskammern pipettiert wird, wird sie 1:40 mit

einem Serumalbumin enthaltenden Puffer verdünnt. In diesem Fall wurde einmal

HSA-Puffer (humanes Serumalbumin) und einmal BSA-Puffer (bovines Serumalbumin)

dazugegeben. Das Ergebnis ist in der folgenden Abbildung (Abb. 13.17) dargestellt.

Darin ist deutlich zu erkennen, dass mit dem humanen Serumalbumin auch der in dieser

Reihe schwächste Inhibitor mit einem Ki-Wert von 8,9µmol/l noch zu erfassen ist,

während die Empfindlichkeit bei Verwendung von bovinem Serumalbumin stark

abnimmt, bzw. nicht vorhanden ist.

Für die weiteren Tests wurde also der Puffer mit humanem Serumalbumin gewählt.

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Theoretischer Teil - 13 Optimierung der Testsysteme für Thrombin 101

98,59

20,28

87,7296,18

98,59

94,36

81,88

-14,75-20

-10

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

V 1 V 2 V 3 V 4

Inhi

biti

on in

%HSA BSA

Abb. 13.17: Vergleich des Einflusses von humanem zu bovinem Serumalbumin auf die Hemmung von humanem Thrombin

13.3 Zusammenfassung

Wie die Versuche des Ligandenfischens zeigen, ist auch humanes Thrombin sehr gut

geeignet, um in komplexen Bibliotheken nach möglichen Thrombininhibitoren zu

fischen. Dabei zeigte sich, dass humanes Thrombin durchgehend sogar besser geeignet

ist als Rinderthrombin, mit dem dieses Prinzip ursprünglich optimiert worden ist.

Als Reinsubstanzen ließen sich alle vier Inhibitoren von humanem Thrombin erkennbar

fischen, wohingegen mit Rinderthrombin der Inhibitor V4 mit einem Ki-Wert von

8,9 µmol/l nicht mehr fischbar war. Betrachtet man die Fischergebnisse aus dem

Inhibitorgemisch und der Substanzbibliothek, so war in diesen Fällen V4 auch nicht

mehr mit dem humanen Thrombin zu fischen. Da die gefischte Menge mit der

Enzymkonzentration korreliert, ist anzunehmen, dass bei einer Erhöhung der

Proteinkonzentration auch der in dieser Reihe schwächste Inhibitor gefischt werden

könnte. Es ist weiterhin anzunehmen, dass die gefischten Mengen an V4 wahrscheinlich

unter der Nachweisgrenze lagen. Betrachtet man die mit 0,432 nmol pro Ansatz sehr

geringe eingesetzte Menge an humanem Thrombin, so ist eine Erhöhung der

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102 Theoretischer Teil - 13 Optimierung der Testsysteme für Thrombin

Konzentration durchaus denkbar. Als Konsequenz wären auch schwächere Inhibitoren,

die als Anhaltspunkte für die Entwicklung neuer Inhibitoren verwendbar wären, mit

dieser Methode gut auffindbar. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass der potenteste

Inhibitor auch am meisten gefischt wurde. Daraus folgernd wird aus einem Gemisch mit

unterschiedlich starken potentiellen Inhibitoren der stärkste gefischt, auch wenn er in

geringerer Konzentration vorliegt. Ist allerdings der schwache Inhibitor in einer höheren

Konzentration enthalten, wird entsprechend dem Massenwirkungsgesetz auch mehr von

diesem gefischt. Es muss also bedacht werden, dass ein starker Inhibitor, bei einer allzu

hohen Konzentrationsdifferenz zu Gunsten des schwächeren Inhibitors nicht erkannt

wird.

Auch der amidolytische Aktivitätsassay musste zunächst auf Verwendbarkeit geprüft

und anschließend optimiert werden. Dabei konnte gezeigt werden, dass eine

Thrombinkonzentration von 100 I.E./ml (4,32 µmol/l) als Stammlösung optimal war,

sofern humanes Serumalbumin dem Puffer zugesetzt wurde.

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Theoretischer Teil - 14 Hemmwirkung von Apiaceaen auf Thrombin 103

14 Hemmwirkung von Apiaceaen auf Thrombin

14.1 Einleitung

Im Rahmen einer Dissertationsarbeit [16] in unserem Arbeitskreis wurden 78 Arznei-

pflanzen zufällig ausgesucht und mittels amidolytischen Assays auf ihre Aktivität

gegenüber Thrombin getestet. Dabei wurden 12 Hits ermittelt, unter denen sich fünf

Apiaceaenfrüchte befanden. Um zu klären, ob es sich dabei um einen Zufall handelte

oder ob die betrachteten Extrakte ein gemeinsames Wirkprinzip aufweisen, wurden für

weitere Untersuchungen Koriander- und Kümmelfrüchte ausgewählt, da sie die

höchsten Inhibitionen im Screening zeigten.

Da ätherische Öle oftmals die wirksame Komponente in volkstümlich verwendeten

Arzneidrogen darstellen, wurden selektive Extrakte beider Früchte unter Verwendung

von Pentan als lipophilstem Extraktionsmittel hergestellt. Pentan deshalb, weil es sich

aus dem fertigen Extrakt aufgrund seines hohen Dampfdruckes sehr schonend unter

geringer Wärmezufuhr entfernen lässt, so dass die ätherischen Öle im Extrakt

verbleiben.

Der Pentanextrakt beider Apiaceaenfrüchte stellte jeweils mit Abstand den Extrakt mit

der höchsten inhibitorischen Aktivität innerhalb der selektiven Extrakte dar. Die

ätherischen Öle erwiesen sich jedoch im amidolytischen Assay als unwirksam. Da eine

große Fraktion der Pentanextrakte das fette Öl ist, wurde das wirksame Prinzip in ein

oder mehreren Fettsäuren, Mono-, Di- oder Triglyceriden vermutet. Apiaceaen weisen

ein ähnliches Fettspektrum im Samen auf [19]. Daraus leitete sich die Theorie eines

gleichen Wirkprinzips aller wirksamen Apiaceaenfrüchte ab. Um dieses Prinzip zu

ermitteln, wurden aus drei weiteren Apiaceaenfrüchten Hexanextrakte hergestellt.

Hexan wurde statt Pentan verwendet, da es auf Grund des niedrigeren Dampfdrucks in

der Praxis besser zu handhaben ist und dabei keinen Einfluss auf die qualitative

Zusammensetzung des fetten Öls hat. Alle Extrakte wurden mittels amidolytischen

Assays getestet und chromatographisch vermessen, um eventuell schon durch einen

optischen Vergleich auf ein oder mehrere Fettbestandteile schließen zu können, die mit

der Aktivität korrelieren. Es zeigte sich, dass zwei verschiedene Fettsäuren in allen

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104 Theoretischer Teil - 14 Hemmwirkung von Apiaceaen auf Thrombin

wirksamen Extrakten vorkommen. Diese Fettsäuren wurden als Petroselin- und

Linolensäure identifiziert und auf ihre inhibitorische Aktivität auf Thrombin getestet.

Um zu belegen ob beide Fettsäuren oder nur eine von beiden das wirksame Prinzip der

Apiaceaenfrüchte darstellen, wurden mit den Extrakten das Ligandenfischen und der

Gerbstofffällungsassay durchgeführt.

14.2 Herstellung der Apiaceaenfrüchte-Extrakte

Für die Herstellung der selektiven Extrakte aus Kümmelfrüchten und Korianderfrüchten

wurden die pulverisierten Früchtedrogen in Pentan, bzw. Hexan respektive mit einem

Ultra-Turrax zerkleinert und anschließend im Falle der Korianderfrüchte in eine leere

Edelstahlkartusche mit den Maßen 10 cm x 80 cm gefüllt, im Falle der Kümmelfrüchte

in eine Kartusche mit den Maßen 25 mm x 250 mm. Die anschließende Extraktion

erfolgte erschöpfend mit Lösungsmitteln steigender Polarität, in der Reihenfolge Pentan

bzw. Hexan respektive, Dichlormethan, Methanol, Methanol/Wasser und Wasser.

Für die Herstellung der übrigen Extrakte wurden die pulverisierten Früchtedrogen in

Hexan jeweils 3 x 5min. mit Ultraschall behandelt. Auch diese Extraktionen verliefen

erschöpfend.

Die so erhaltenen Lösungen wurden unter vermindertem Druck von den jeweiligen

Lösungsmitteln befreit.

14.3 Destillation von ätherischem Öl aus Apiacean

Für die Destillation wurde eine Apparatur zur Gehaltsbestimmung des ätherischen Öls

nach dem EuAB verwendet, die für den präparativen Maßstab verändert worden war.

Statt Xylol wird Cyclohexan als Vorlage verwendet. Neben dem Kümmel- und

Korianderpulver wird auch der Korianderpentanextrakt zur Gewinnung des ätherischen

Öls verwendet.

14.4 Aktivitätsassay mit den selektiven Extrakten

Im Folgenden ist zunächst das Ergebnis für die selektiven Extrakte aus

Korianderfrüchten (Abb. 14.1) und im Anschluss daran das Ergebnis für die selektiven

Extrakte aus Kümmelfrüchten (Abb. 14.2) bildlich dargestellt. Der amidolytische Assay

wurde mit einer Konzentration von jeweils 5 mg/ml pro Extrakt durchgeführt. Die

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Theoretischer Teil - 14 Hemmwirkung von Apiaceaen auf Thrombin 105

inhibitorische Wirkung des Koriander-Pentanextraktes ist mit 86% am stärksten, es

folgt der Dichlormethanextrakt mit 58%. Daran schließen sich die Extrakte aus

58,02

4,33-0,13

5,22

85,88

-10

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Pentan Dichlormethan Methanol Methanol/Wasser Wasser

Inhi

bitio

n in

%

Abb. 14.1: Inhibition der Korianderextrakte

90,84

8,91

28,2425,70

37,40

-10

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Pentan Dichlormethan Methanol Methanol/Wasser Wasser

Inhi

bitio

n in

%

Abb. 14.2: Inhibition der Kümmelextrakte

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106 Theoretischer Teil - 14 Hemmwirkung von Apiaceaen auf Thrombin

Methanol und aus Wasser an, wobei diese jeweils eine vernachlässigbare Inhibition von

rund 5% aufweisen, während der Methanol/Wasserextrakt überhaupt keine Wirkung

erkennen lässt.

Auch bei Kümmel (vgl. Abb. 14.2) ist die am stärksten wirksame Fraktion der Pentan-

extrakt mit 91%. Es folgen in abnehmender Reihenfolge der Dichlormethanextrakt mit

37%, der Methanol/Wasserextrakt mit 28% und der Methanolextrakt mit 26%. Der

Wasserextrakt schließlich zeigt eine vernachlässigbare Wirkung von nur 9%.

14.5 Aktivitätsassay mit dem ätherischen Öl

Um zu ermitteln, ob die Wirksamkeit der Pentanextrakte auf dem Gehalt von

ätherischem Öl beruht, wurde reines ätherisches Öl aus Kümmel- und Koriander-

früchten auf seine Wirksamkeit getestet. Dabei wurde für Koriander neben industriell

gewonnenem Öl (1) auch selbst destilliertes Öl (2) gestestet, für Kümmel wurde nur das

selbst destillierte Öl getestet. Während für Kümmel ätherisches Öl nur aus dem

Pentanextrakt der Früchte destilliert wurde, wurden für Koriander sowohl der

Pentanextrakt als auch das Korianderpulver einer Wasserdampfdestillation unterzogen.

Dabei ergab sich, dass die Pentanfraktion aus zu ungefähr einem Zehntel aus

ätherischem Öl besteht.

Es zeigt sich, wie in Abb. 14.3 dargestellt, dass die wirksame Komponente nicht das

ätherische Öl sein kann, da das industrielle Öl nur eine sehr geringe Inhibition von rund

8% aufweist, der Pentanextrakt jedoch zu über 80% hemmt. Das selbst destillierte

ätherische Öl, aus der gleichen Pulverdroge wie die selektiven Extrakte hergestellt, zeigt

sogar überhaupt keine Wirksamkeit. Auch das ätherische Öl aus Kümmel zeigt keine

Hemmung. Getestet wurden die ätherischen Öle in einer Konzentration von jeweils

0,5 mg/ml.

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Theoretischer Teil - 14 Hemmwirkung von Apiaceaen auf Thrombin 107

-2,56-4,69

7,58

-10

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Koriander (1) Koriander (2) Kümmel

Inhi

bitio

n in

%

Abb. 14.3: Inhibitorische Wirkung von ätherischem Öl, sowohl industriell gewonnenes

(1) als auch selbst destilliertes (2) aus Koriander sowie selbst destilliertes aus Kümmel.

14.6 Untersuchung weiterer Extrakte

Da fettes Öl eine große Fraktion im Pentanextrakt darstellt, wird vermutet, dass ein oder

mehrere Fettbestandteile für die Inhibition verantwortlich sind. Es wurden daher

Extrakte aus drei weiteren Apiaceaen hergestellt, die sowohl auf ihre inhibitorische

Aktivität getestet, als auch chromatographisch vermessen wurden. Das Ergebnis des

Assays, dargestellt in Abb. 14.4, zeigt mit einer Ausnahme nur geringe Unterschiede in

der hemmenden Wirkung der einzelnen Apiaceaenfrüchte.

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108 Theoretischer Teil - 14 Hemmwirkung von Apiaceaen auf Thrombin

62,38

51,46

3,86

65,29

55,58

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Anis Fenchel Koriander Kümmel Petersilie

Inhi

bitio

n in

%

Abb. 14.4:Inhibitorische Aktivität der Apiaceaenfrüchte-Extrakte

Getestet wurde hier mit einer Extraktkonzentration von 1mg/ml. Dabei zeigen Kümmel-

früchte mit 65% die beste Hemmung vor Anisfrüchten mit 62% und Korianderfrüchten

mit 56%. Mit 51% inhibieren Fenchelfrüchte auch noch sehr deutlich, Petersilienfrüchte

dagegen zeigen mit 4% so gut wie keine Aktivität.

Die folgenden Abbildungen (Abb. 14.5 bis 14.9)geben die Chromatogramme der

getesteten Hexanextrakte wieder. Die Konzentrationen der vermessenen Lösungen

entsprechen denen des Thrombinassays (c = 1mg/ml). Vergleicht man die inhibitori-

schen Aktivitäten der einzelnen Früchte mit den Zusammensetzungen laut den

Chromatogrammen, so erkennt man einen groben Zusammenhang zwischen der Höhe

der Hemmung und dem Gehalt zweier Bestandteile, die durch Pfeile markiert sind.

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Theoretischer Teil - 14 Hemmwirkung von Apiaceaen auf Thrombin 109

Abb. 14.5: Chromatogramm des Hexanextraktes aus Anisfrüchten. c = 1mg/ml

Abb. 14.6: Chromatogramm des Hexanextraktes aus Fenchelfrüchten. c = 1mg/ml

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110 Theoretischer Teil - 14 Hemmwirkung von Apiaceaen auf Thrombin

Abb. 14.7:Chromatogramm des Hexanextraktes aus Korianderfrüchten. c = 1mg/ml

Abb. 14.8: Chromatogramm des Hexanextraktes aus Kümmelfrüchten. c = 1mg/ml

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Theoretischer Teil - 14 Hemmwirkung von Apiaceaen auf Thrombin 111

Abb. 14.9: Chromatogramm des Hexanextraktes aus Petersilienfrüchten. c = 1mg/ml

Das Vorhandensein von C18:1-Fettsäuren wurde gaschromatographisch (GC-MS) in

der AG Glorius des Fachbereichs Organische Chemie (Philipps-Universität Marburg)

bestätigt. Mittels des verwendeten Gradienten war jedoch keine Differenzierung der

Fettsäuren möglich. Daneben wurde eine HPLC-MS selbständig durchgeführt, wodurch

neben ein oder mehrerer C18:1-Fettsäuren auch die Linolensäure als C18:3-Fettsäure

identifiziert werden konnte. Durch Spiken wurden die interessanten Peaks dann als

Linolensäure bei einer Retentionszeit von ca. 44 min und als Petroselinsäure bei einer

Retentionszeit von ca. 48 min identifiziert und bestätigt. Die Petroselinsäure ist dabei

der später eluierende des auftretenden Doppelpeaks. Bei dem kleineren, früher elu-

ierenden Peak mit einer Retentionszeit von ca. 47,5 min. handelt es sich um die Ölsäure.

14.7 Aktivitätsassay mit den identifizierten Fettsäuren

Um zu ermitteln, ob die identifizierten Fettsäuren auch tatsächlich potentielle

Inhibitoren darstellen, wurden sie einem amidolytischen Assay unterzogen. Neben

Linolen- und Petroselinsäure wurde in diesem Rahmen auch die Ölsäure getestet. Um

einen eventuellen Synergismus erkennen zu können, wurde ferner ein Gemisch aus

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112 Theoretischer Teil - 14 Hemmwirkung von Apiaceaen auf Thrombin

diesen drei Fettsäuren in dem Verhältnis hergestellt, in dem sie laut Literatur vorliegen

(Petroselin- und Ölsäure jeweils 3,5 T; Linolensäure 1,5 T).

72,17

76,4776,92

66,52

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Ölsäure Linolensäure Petroselinsäure Gemisch

Inhi

bitio

n in

%

Abb. 14.10: Hemmung der Thrombinaktivität sowohl der reinen Fettsäuren als auch

des Gemisches dieser Fettsäuren im natürlich vorkommenden Verhältnis.

Der amidolytische Assay wurde mit einer Konzentration von 0,25 mg/ml je Fettsäure

durchgeführt. Das Fettsäure-Gemisch wurde dabei so hergestellt, dass die End-

konzentration dieses Gemisches ebenfalls 0,25 mg/ml betrug. 0,25 mg/ml entsprechen

dabei für alle betrachteten Fettsäuren ungefähr 0,8-0,9 mmol/l. Wie das Diagramm in

Abb. 14.10 verdeutlicht, konnte eine inhibitorische Wirksamkeit der Fettsäuren

eindeutig gezeigt werden. Das Gemisch der Fettsäuren war dabei nicht wirksamer, als

die Einzelsubstanzen.

14.8 Hydrolyse des Petersilienfrüchteextraktes

Eigentlich wäre zu erwarten gewesen, dass die Petersilienfrüchte eine hohe

inhibitorische Aktivität zeigen, da sie laut Literatur [21] einen hohen Gehalt an Petro-

selinsäure besitzen. Dies konnte in unserer Arbeit jedoch nicht bestätigt werden.

Betrachtet man im Folgenden (Abb. 14.11) den gedehnten relevanten Ausschnitt des

Chromatogramms der Petersilienfrüchte, vermessen bei einer Konzentration von

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Theoretischer Teil - 14 Hemmwirkung von Apiaceaen auf Thrombin 113

2 mg/ml, so ist deutlich erkennbar, dass nur sehr geringe Mengen Petroselinsäure

(rechter Pfeil) und auch nur wenig Linolensäure (linker Pfeil) enthalten sind.

Abb. 14.11: Chromatogramm des Petersilienfrüchteextraktes

(vergrößerter, relevanter Bereich)

Ein Grund für den niedrigen Gehalt an freien Fettsäuren könnte beispielsweise sein,

dass sie hauptsächlich noch als Triglyceride vorliegen. Es konnten jedoch auch nach

Hydrolyse mit methanolischer NaOH von beiden Fettsäuren keine größeren Mengen

chromatographisch nachgewiesen werden. Dieses korreliert mit dem Ergebnis des

Thrombinassays, der ebenfalls keine Aktivität nach der Hydrolyse zeigte.

14.9 Ligandenfischen in Apiaceaenfrüchteextrakten

Um die identifizierten Fettsäuren als wirksames Prinzip zu belegen, wurde mit

humanem Thrombin in den lipophilen Extrakten der Apiaceaenfrüchte gefischt. Da dies

zu keinem Ergebnis führte, wurde mit reiner Petroselinsäure gefischt, was ebenfalls

keinen Erfolg hatte. Es erwies sich, dass die Fettsäure am Filter hängen blieb und auch

durch das Freisetzungsreagenz nicht zu lösen war.

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114 Theoretischer Teil - 14 Hemmwirkung von Apiaceaen auf Thrombin

14.10 Gerbstofffällungsassay des Korianderextraktes

Für den Beweis, dass die Fettsäuren dennoch spezifisch an das Thrombin binden, wurde

mit dem Korianderextrakt ein Gerbstofffällungsassay (GFA) durchgeführt. Dabei zeigte

sich, dass die Ergebnisse für Linolensäure am deutlichsten sind. In den nachfolgenden

Chromatogrammen der Überstände sind die einzelnen Schritte des GFA verdeutlicht.

Abb. 14.12: Gerbstofffällungsassay mit Thrombin im Korianderfrüchteextrakt.

Überstand nach Fällung des Thrombins.

Abb. 14.12: Nach der Fällung mit Gerbstoffen ist erwartungsgemäß keine Fettsäure

mehr im Überstand zu finden.

Abb. 14.13: Nach der ersten Waschung waren dann Linolen- (tR = ca. 44 min), Öl-

(tR = ca. 47 min.) und Petroselinsäure (tR = ca. 47.5 min) im Überstand nachweisbar.

Der unspezifisch gebundene bzw. mitgefällte Anteil der Fettsäuren wurde also vom

Protein gewaschen.

Abb. 14.14: Vergleicht man die schließlich in der Freisetzung chromatographierten

Mengen mit denen aus der ersten Waschung (Abb. 14.13), so zeigt sich, dass im

Waschschritt schon der Großteil an Petroselin- und Ölsäure (tR = ca. 47 min.)

heruntergewaschen worden ist, diese also nur unspezifisch gebunden haben, bzw.

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Theoretischer Teil - 14 Hemmwirkung von Apiaceaen auf Thrombin 115

mitgefällt worden sind. Der Linolensäureanteil (tR = ca. 44 min.) jedoch steigt nach der

Freisetzung, so dass von einer spezifischen Bindung ausgegangen werden kann.

Abb. 14.13: Gerbstofffällungsassay mit Thrombin im Korianderfrüchteextrakt. Überstand nach der ersten Waschung. Erster Peak Linolensäure, zweiter Peak Ölsäure, dritter Peak Petroselinsäure (Pfeile)

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116 Theoretischer Teil - 14 Hemmwirkung von Apiaceaen auf Thrombin

Abb. 14.14: Gerbstofffällungsassay mit Thrombin im Korianderfrüchteextrakt.

Überstand nach Freisetzung und Fällung der Gerbstoffe. Erster Peak Linolensäure, zweiter Peak Ölsäure, dritter Peak Petroselinsäure

(Pfeile)

14.11 Zusammenfassung und Diskussion

Die Untersuchung von Apiaceaenfrüchten auf eine Hemmung von humanem Thrombin

ergab, dass die inhibitorische Aktivität nicht auf das ätherische Öl zurückzuführen ist.

Dabei zeigte sich eine Diskrepanz in der Wirkung zwischen industriell erworbenem und

selbst destilliertem ätherischen Öl aus Korianderfrüchten. Dieses lässt sich wahr-

scheinlich dadurch erklären, dass die Zusammensetzung des ätherischen Öls von

Koriander herkunftspezifisch variiert und auch vom Reifegrad der Früchte abhängt [19].

Von Kümmel wurde nur das selbst destillierte ätherische Öl getestet, welches ebenfalls

keine inhibitorische Aktivität aufweist.

Als wirksamste Extrakte erwiesen sich bei den verglichenen selektiven Extrakten von

Koriander und Kümmel jeweils die Pentanextrakte. Der Trend, den die weiteren

Extrakte zeigen, ist in beiden Pflanzen abnehmend, je polarer das Extraktionsmittel ist.

Lediglich im Methanol/Wasserextrakt weisen sie einen erheblichen Unterschied auf.

Der Methanol/Wasser-Extrakt des Kümmels zeigt eine sehr viel höhere Aktivität als der

des Korianders. Eine mögliche Erklärung dafür ist, dass die Kümmelfrüchte als

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Theoretischer Teil - 14 Hemmwirkung von Apiaceaen auf Thrombin 117

Pulverdroge nicht fein genug gemahlen vorlagen, so dass eventuell ein höherer Anteil

an noch ganzen Zellbestandteilen enthalten war. Diese fingen bei Wasserzugabe an zu

quellen, platzten in der Folge, wodurch im Inneren enthaltene, womöglich wirksame

Ölkomponenten freigesetzt wurden.

Nach Vergleich der Chromatogramme und Assayergebnisse weiterer Apiaceaenfrüchte

konnten als wirksames Prinzip für die inhibitorische Aktivität dieser Früchte Fettsäuren

mit einer Kettenlänge von 18 Kohlenstoffatomen und unterschiedlichem Sättigungsgrad

ermittelt werden. Als wirksamste Fettsäuren in diesem Zusammenhang haben sich die

Linolensäure (C18:3) und die Petroselinsäure (C18:1) erwiesen. Der anschließend

durchgeführte amidolytische Assay belegt eindeutig die inhibitorische Aktivität dieser

Fettsäuren. Daneben wurde auch ein Gemisch aus Linolen-, Petroselin- und Ölsäure

getestet, das der laut Literatur natürlichen Zusammensetzung im fetten Korianderöl

nachempfunden war. Alle getesteten Fettsäuren zeigen eine ähnliche Hemmung von

rund 70% und auch das Gemisch liegt in diesem Bereich. Da im Gemisch keine stärkere

inhibitorische Wirkung aufgetreten ist, kann ein synergistischer Effekt der Fettsäuren

untereinander ausgeschlossen werden.

Um die identifizierten Fettsäuren als potentielle Inhibitoren von humanem Thrombin zu

belegen, wurde das Ligandenfischen mit Thrombin in den jeweiligen Pentanextakten

durchgeführt. Dabei stellte sich heraus, dass das Fischen mit den von uns verwendeten

Ultrafiltrationseinheiten, die eine Membran aus regenerierter Cellulose besitzen, hierfür

ungeeignet ist, da die Fettsäuren irreversibel an die Filtermembran und/oder den Filter

binden. An Stelle des Fischens wurde daraufhin der Gerbstofffällungsassay durch-

geführt, der ohne Filtereinheiten auskommt. Bei diesem ist die Petroselinsäure lediglich

herunter gewaschen worden, wohingegen die Linolensäure spezifisch an das Thrombin

gebunden hat. Dies weist darauf hin, dass die Linolensäure eine höhere Affinität zum

Thrombin hat. Das Enzym bindet demzufolge mehr Linolensäure, womit die Binde-

tasche schon besetzt ist und die anderen Fettsäuren nicht mehr binden können. Es wird

also nur der potenteste Ligand, in diesem Fall die Linolensäure, erfasst. Ein nur mit

Petroselinsäure durchgeführter Gerbstofffällungsassay zeigte auch für diese eine

Wechselwirkung mit dem Protein.

Als Ausnahme in der Reihe der von uns getesteten Apiaceaenfrüchte konnten im

Hexanextrakt der Petersilienfrüchte weder ausreichende Mengen Linolensäure noch

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118 Theoretischer Teil - 14 Hemmwirkung von Apiaceaen auf Thrombin

Petroselin- oder Ölsäure nachgewiesen werden. Weiterhin konnte Ölsäure, entgegen den

Literaturangaben, in keinem der getesteten Extrakte in größeren Mengen nachgewiesen

werden. Die Gründe für den geringen Gehalt dieser Fettsäuren wurden nicht näher

untersucht. Interessant ist, dass Extrakte, die Linolen- und Petroselinsäure enthielten,

wirksam sind und Extrakte, die weder Petroselin- noch Ölsäure aufwiesen, wie der

Petersilienfrüchteextrakt, nur wenig wirksam sind. Die Wirksamkeit geht also tatsäch-

lich von diesen Fettsäuren aus, was neben dem Ergebnis des Gerbstofffällungsassays

einen weiteren Beweis darstellt. Die schwache Hemmung des Petersilienfrüchte-

extraktes kommt wahrscheinlich durch den geringen Linolensäureanteil zustande.

Bedenkt man den auf Grund der höheren Anzahl an Doppelbindungen höheren

Absorptionskoeffizienten der Linolensäure, so ist verständlich, dass trotz des gut

erkennbaren Signals der Gehalt entsprechend niedriger und somit auch die

inhibitorische Aktivität vernachlässigbar gering ist.

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Theoretischer Teil - 15 Hemmwirkung weiterer Substanzen auf Thrombin 119

15 Hemmwirkung weiterer Substanzen auf

Thrombin

15.1 Einleitung

Auf Grund der Erkenntnisse aus dem vorangegangenen Kapitel wurden neben der

Linolen-, Petroselin- und Ölsäure, die im Rahmen der Apiaceaen-Untersuchungen

bereits getestet wurden, auch andere langkettige Fettsäuren dem amidolytischen Assay

unterzogen. Im Rahmen der erwähnten Dissertation [16] wurden bereits unterschied-

liche Kriterien für die Wirksamkeit, unter anderem die optimale Kettenlänge und die

günstigste Position der Doppelbindungen, ermittelt. Wir haben diese Liste der Kriterien

um die Notwendigkeit einer Carboxylfunktion erweitert. Weiterhin haben wir fest-

gestellt, dass die Fettsäuren auch Trypsin in gleicher Stärke hemmen, also keine

Selektivität bezüglich Thrombin vorliegt.

Kürzlich wurde der Wirkmechanismus von Paracetamol [146] aufgeklärt, bei dem der

Metabolit p-Aminophenol mittels der Fettsäureamidhydrolase (FAAH) an Arachidon-

säure gebunden wird und so als N-Arachidonoyl-phenylamin (AM404) inhibierend auf

COX-1, COX-2 wirkt. Es stellte sich die Frage, ob auch hier für die betrachteten Fett-

säuren auf Grund einer eventuellen Umsetzung von Fettsäure und Substrat in der

Bindetasche des Thrombins ein ähnlicher Wirkmechanismus spekuliert werden könnte.

Ein Indiz dafür war, dass nach Inkubation von Fettsäure mit Substrat und

anschließendem Start der Reaktion durch Thrombinzugabe eine höhere und vor allem

sofortige Hemmwirkung zu verzeichnen war, im Gegensatz zum Verlauf der

Hemmkurve während des regulären Ablaufs des Assays. Diese Theorie jedoch konnte

in unseren Tests nicht bestätigt werden.

Die Arachidonsäure, die laut unseren Ergebnissen einen inhibierenden Effekt auf

Thrombin hat, stellt im Körper das physiologische Substrat der Cyclooxygenase dar.

Eine Überlegung war nun, ob andersherum Cyclooxygenasehemmer auch einen Effekt

auf Thrombin haben. Es wurden daher verschiedene COX-Hemmer getestet, die mit

einer Carboxylfunktion ausgestattet sind. Dabei zeigte das Indometacin eine gewisse

inhibitorische Aktivität.

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120 Theoretischer Teil - 15 Hemmwirkung weiterer Substanzen auf Thrombin

15.2 Aktivitätsassay verschiedener Fettsäuren und -derivate

Es wurden im Folgenden die C18-Säuren (Formeln s. Anhang B, S. 168) Petroselin-,

Öl- und Vaccensäure, die Strukturisomere mit einer Doppelbindung darstellen, neben

Linol-, Linolen- und Stearidonsäure, die sich durch jeweils eine Doppelbindung mehr

auszeichnen, bei einer Konzentration von 0,25 mmol/l getestet.

40,37 41,4737,73

40,6945,21

-1,65

-10

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Petroselinsr. Ölsr. Vaccensr. Linolsr. Linolensr Stearidonsr.

Inhi

biti

on i

n %

Abb. 15.1: Aktivitätsassay verschiedener C18-Fettsäuren

Wie das Ergebnis in Abb. 15.1 deutlich zeigt, liegen die Fettsäuren in ihrer

Hemmwirkung alle im gleichen Bereich, lediglich die Stearidonsäure zeigte keine

Hemmung.

Daneben wurden auch Derivate, bzw. Triglyceride der betrachteten Fettsäuren auf ihre

inhibitorische Aktivität getestet. Leinöl wurde gewählt, da in diesem der

Linolensäureanteil, Olivenöl, da in diesem der Ölsäureanteil sehr hoch ist. Die

Konzentrationen der Fettsäuren und des getesteten Methylesters betrugen dabei

0,25mg/ml, was je nach Fettsäure, bzw. Methylester zwischen 0,8-0,9 mmol/l

entspricht. Die Öle wurden in einer Konzentration von 5 mg/ml getestet. Wie in der

folgenden Abbildung (Abb. 15.2) dargestellt, wirken die Öle sehr viel schlechter als die

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Theoretischer Teil - 15 Hemmwirkung weiterer Substanzen auf Thrombin 121

reinen Fettsäuren. Auch der Methylester der Petroselinsäure zeigt keine nennenswerte

Wirksamkeit.

40,69 41,47 40,37

-2,49

24,53

-0,31

-10

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Linolensäure Leinöl Ölsäure Olivenöl Petroselinsäure Methylpetroselat

Inhi

biti

on i

n %

Abb. 15.2:Aktivitätsassay verschiedener Fettsäuren und Fettsäurederivate

Anschließend wurde getestet, ob eine Selektivität bezüglich Thrombin vorliegt. Als

Fettsäure haben wir Petroselinsäure gewählt und als weiteren Vertreter der Serin-

proteasen das Trypsin. Die Petroselinsäure wurde in einer Konzentration von

0,25 mmol/l eingesetzt. Die Abb. 15.3 stellt das negative Ergebnis bezüglich der

Selektivität dar. Petroselinsäure wirkt auf Thrombin und Trypsin in gleicher Stärke.

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122 Theoretischer Teil - 15 Hemmwirkung weiterer Substanzen auf Thrombin

39,6041,86

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Thrombin Trypsin

Inhi

biti

on in

%

Abb. 15.3: Aktivitätsassay mit Petroselinsäure auf Thrombin und Trypsin im Vergleich

15.3 Aktivitätsassay mit Arachidonoyl-p-Nitroanilin

Die Frage, ob die Fettsäuren durch eine sofortige Bindung in der Bindetasche an das

freigesetzte p-Nitroanilin einen Inhibitor bilden, wurde im folgenden Assay überprüft.

Dafür wurde die Arachidonsäure, die ebenfalls eine Hemmung aufweist, gegen

Arachidonoyl-p-Nitroanilin getestet. Beide Substanzen wurden dabei in einer

Konzentration von 0,5 mmol/l eingesetzt. Wie das Testergebnis in der nächsten

Abbildung (Abb. 15.4) zeigt, kann diese Theorie nicht verifiziert werden.

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Theoretischer Teil - 15 Hemmwirkung weiterer Substanzen auf Thrombin 123

5,34

66,18

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Arachidonsr Arachidonoyl-p-Nitroanilin

Inhi

biti

on i

n %

Abb. 15.4: Aktivitätsassay mit Arachidonsäure und Arachidonoyl-p-Nitroanilin

15.4 Aktivitätsassay verschiedener COX-Inhibitoren

Da die Carbonsäurefunktion sich als essentiell erwiesen hat, wurden nur COX-Hemmer

mit freier Säurefunktion ausgewählt (Formeln s. Anhang B, S. 169-170). Eingesetzt

wurden:

- Acetylsalicylsäure (Salicylsäurederivat),

- Diclofenac (Phenylessigsäurederivat),

- Ibuprofen (Propionsäurederivat),

- Indometacin (Heteroarylessigsäurederivat) und

- Mefenaminsäure (Anthranilsäurederivat)

Dabei wurde das Diclofenac als Natriumsalz und von Ibuprofen auch das Lysinat

getestet. Die Substanzen wurden in einer Konzentration von 4 mmol/l untersucht.

In dieser Reihe zeigte sich nur das Indometacin mit einer Hemmung von rund 50% als

deutlich wirksam (vgl. Abb. 15.5). Alle anderen Arzneistoffe zeigten eine nur geringe

Inhibition von etwa 10%. Das Ibuprofen-Lysinat zeigte sich erwartungsgemäß weniger

wirksam als das Ibuprofen.

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124 Theoretischer Teil - 15 Hemmwirkung weiterer Substanzen auf Thrombin

10,22 9,52 11,06

1,19

51,05

15,80

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Acetylsalicylsäure Diclofenac-Na Ibuprofen Ibuprofen-Lysinat Indometacin Mefenaminsäure

Inhi

biti

on i

n %

Abb. 15.5: Aktivitätsassay auf Thrombin mit ausgewählten COX-Inhibitoren

15.5 Zusammenfassung und Diskussion

Rack [16] hat in seiner Arbeit freie Fettsäuren verschiedener Kettenlängen und

unterschiedlicher Sättigungsgrade getestet und dabei folgende Kriterien für eine

Wirksamkeit festgestellt: eine cis-konfigurierte Doppelbindung in Position 9-12, wobei

die Position an C11 optimal zu sein scheint, eine Kettenlänge von 18 Kohlenstoff-

atomen und eine gewisse Flexibilität des Moleküls. Wie die Ergebnisse des letzten

Kapitels zeigen, konnte jedoch auch eine äquivalente Hemmung durch die Petroselin-

säure, die an der C6-Position eine Doppelbindung aufweist, beobachtet werden. Die

Stearidonsäure, bei der es sich um eine 18:4ω3 Fettsäure handelt, die ebenfalls eine

Doppelbindung in C6 aufweist, wirkt zwar nicht inhibierend, dies könnte aber auch an

der geringen Flexibilität, verursacht durch die 4 Doppelbindungen, liegen. cis-Vaccen-

säure schließlich, die sich in der Arbeit von Rack als stärkste Fettsäure in Bezug auf

Rinderthrombin erwies, konnte für das humane Thrombin nicht als wirksamste

Fettsäure bestätigt werden. Ebenso wenig konnte gegen humanes Thrombin eine

Steigerung der Aktivität von C18-Säuren mit Zunahme der Doppelbindungen

beobachtet werden.

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Theoretischer Teil - 15 Hemmwirkung weiterer Substanzen auf Thrombin 125

Die weiteren Tests mit verschiedenen Fettsäurederivaten wie dem Petroselinsäure-

methylester, aber auch die negativen Testergebnisse der Öle zeigen, dass eine

Carboxylfunktion für die inhibitorische Aktivität wichtig ist.

Durch die Aufklärung des Wirkmechanismus von Paracetamol [146], kam die Idee auf,

die Hemmung der Fettsäuren auch einmal von dieser Seite zu betrachten. Ein mit

Fettsäure gekoppeltes Molekül wäre zum Beispiel das Arachidonoyl-p-Nitroanilin,

welches daher, ebenso wie die reine Arachidonsäure als Vergleich, getestet wurde.

Leider erwies sich diese Theorie zwar als unwahr, die Wichtigkeit der Carboxylfunktion

wurde jedoch dadurch wieder bestätigt. Dieses wird auch durch die kürzliche

Beobachtung von Czodrowski et. al. untermauert [147], wonach das His57 aus der

Bindetasche des Thrombins im Komplex mit dem Inhibitor Napsagatran doppelt

protoniert vorliegt, während die Carboxylfunktion des Napsagatran definitiv

deprotoniert vorliegt. Diese doppelte Protonierung von His57 tritt auch bei Trypsin und

vermutlich bei allen Serinproteasen auf, die nach dem gleichen Mechanismus wirken.

Da Thrombin auf Grund mehrerer loops den engsten Zugang zur Bindetasche aufweist

und die Fettsäuren eine eher mäßige Aktivität zeigen, wurde getestet, ob diese Aktivität

überhaupt Thrombin-selektiv ist. Dies ist nicht der Fall. Trotz allem könnte die

Carboxylfunktion in Zukunft als neues Strukturmerkmal bei der Entwicklung von

Thrombininhibitoren eine Rolle spielen.

Neben dem physiologischen Substrat der Cyclooxygenase, der Arachidonsäure, sind in

der Literatur [148] einige Fettsäuren beschrieben worden, die inhibierend auf diese

wirken. Da Fettsäuren auch auf Thrombin wirken, wurde nun getestet, ob andersherum

auch ein Cyclooxygenasehemmer eine Wirkung auf Thrombin hat. Dabei zeigte als

einziges das Indometacin eine gewisse inhibitorische Aktivität. Jedoch war die getestete

Wirkstoffkonzentration so hoch, dass es wohl nicht von physiologischer Bedeutung ist.

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126 Theoretischer Teil - 16 Zusammenfassung

16 Zusammenfassung

Im Rahmen dieser Arbeit sollte die Technik des Ligandenfischens zur Auffindung

wirksamer Naturstoffe eingesetzt werden. Dafür standen zwei antiplasmoidale Targets

zur Verfügung, die potentiell selektive Wirkstoffe hervorbringen sollten, da sie auf

Stoffwechselwegen basieren, die nicht im menschlichen Organismus vorkommen oder

nicht eng verwandt mit solchen sind. Weiterhin war mit humanem Thrombin ein Protein

vorhanden, das das Schlüsselenzym der Blutgerinnung darstellt.

Das Ligandenfischen stellt zwar im Allgemeinen eine einfach zu bedienende Methode

der Auffindung von Liganden dar, jedoch sollten die Bedingungen für das jeweilige

Enzym angepasst werden, damit ein optimales Ergebnis erzielt wird. Im Rahmen dieser

Arbeit wurde das Ligandenfischen für humanes Thrombin als Target optimiert. Dabei

zeigte sich, dass humanes Thrombin besser geeignet ist als Rinderthrombin, mit dem

dieses Prinzip ursprünglich entwickelt worden ist. Da mit 0,432 nmol pro Ansatz eine

sehr geringe Menge an humanem Thrombin ausreichte um Inhibitoren mit Ki-Werten im

nanomolaren Bereich sichtbar zu fischen, ist es denkbar, durch eine Konzentrations-

erhöhung auch schwächere Inhibitoren aufzufinden. Weiterhin ist gezeigt worden, dass

in einem äquimolaren Gemisch von Inhibitoren unterschiedlicher Potenz der stärkste

Inhibitor gefischt wird. Selbst bei Vorliegen mehrerer Inhibitoren in einem Extrakt wird

also stets der potenteste Inhibitor gefischt.

Die Deoxyxylulosephosphatreduktoisomerase (DXR) ist ein Enzym des alternativen

Isoprenoidbiosynthesewegs. Deshalb sollte ermittelt werden, in wie fern nach Zugabe

des Herbizids Clomazone Substanzen in der Gartenkresse entstehen und ob diese

potentielle Liganden der DXR darstellen. Es konnte gezeigt werden, dass neue

Substanzen in der Gartenkresse entstehen, die vermutlich Metaboliten des Clomazone

darstellen. Das Fischen gab Anhaltspunkte auf eine mögliche Wechselwirkung dieser

Metabolite mit DXR, worauf auch eine leichte Hemmung im Aktiviätsassay hinweist.

Da unser Kooperationspartner auf Grund seiner Insolvenz weder weiteres Enzym noch

genügend Pflanzenmaterial zur Verfügung stellen konnte, musste das Projekt

abgebrochen werden. Eine Aufklärung des Wirkmechanismus ist bis heute noch nicht

erfolgt. Wie gezeigt werden konnte, greift Clomazone vermutlich über ein oder mehrere

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Theoretischer Teil - 16 Zusammenfassung 127

Metaboliten in den MEP-Isoprenoidbiosyntheseweg ein. Da dieser Weg nicht im

menschlichen Organismus vorkommt, könnten die Metaboliten nach Aufklärung viel

versprechende Verbindungen gegen Malaria darstellen.

Die Versuche mit der Glutamatdehydrogenase (GDH) haben einen weiteren Hinweis

auf die bereits bekannte Vermutung geliefert, dass Disulfide aus Knoblauch in die

Redox-Homöostase eingreifen können. Wegen des Alters und der daraus folgenden

geringen Aktivität des Enzyms ist versucht worden, neue Glutamatdehydrogenase zu

exprimieren, was jedoch misslang. Folglich bleibt es bei Spekulationen, welche

Disufide mit der GDH in Wechselwirkung treten. Daneben ist aber auch eine Substanz

gefunden worden, bei der es sich um ein Vinyldithiin handeln könnte, für die bisher

noch keine antiplasmoidalen Hinweise veröffentlicht worden sind.

Das Ligandenfischen mit Thrombin in Apiaceaen war ergebnislos, was auf eine

Bindung der Fettsäuren an die Filter zurückzuführen ist. Um dennoch Fettsäuren als

wirksames Prinzip im Pentanextrakt von Korianderfrüchten zu bestätigen, wurde ein

Gerbstofffällungsassay durchgeführt. Als Ergebnis erhielten wir Linolensäure als

affinste Fettsäure. Da ein Vergleich der Extrakt-Chromatogramme untereinander in

Bezug auf die Hemmung im amidolytischen Assay einen Hinweis sowohl auf

Linolensäure als auch auf Petroselinsäure gab, wurde die Petroselinsäure ebenfalls mit

dem Gerbstofffällungsassay getestet. Es konnte auch eine Wechselwirkung der

Petroselinsäure mit humanem Thrombin gezeigt werden. Das fette Öl der meisten

Apiaceaenfrüchte enthält einen großen Anteil an wirksamen Fettsäuren. Bedenkt man,

dass auch Ölsäure enthalten ist, die ebenfalls hemmend im amidolytischen Assay

gewirkt hat, könnte das Öl aus Apiaceaen nach Aufnahme in den Körper einen

möglichen positiven Effekt auf die Atherosklerose haben.

Des Weiteren wurden verschiedene Verbindungen mittels des amidolytischen Assays

auf eine Hemmung des Thrombins getestet. Dabei stellte sich heraus, dass die

Carboxylfunktion scheinbar notwendig für eine Wechselwirkung mit der katalytischen

Triade ist. Bei Tests auf eine Thrombinhemmung mit verschiedenen Cyclooxygenase-

hemmern, hinter denen die Überlegung stand, dass Arachidonsäure als natürliches

Substrat in beide Bindetaschen passt, konnte für Indometacin ebenfalls eine Hemmung

beobachtet werden. Jedoch liegt die getestete Konzentration in einem physiologisch

nicht erreichbaren Bereich.

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EXPERIMENTELLER

TEIL

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Experimenteller Teil - 1 Allgemeine Methoden und Materialien 129

1 Allgemeine Methoden und Materialien

1.1 Geräte

Analytische HPLC:

Pumpen: Waters MSDS 600, Waters MSDS 600 E, Waters LC Module I plus

Controller: Waters 600, Waters 600 E

Detektor: Photodiodenarraydetektor Waters 991 und 996

Injektionsventil: Rheodyne 7125 (20µl bzw. 300µl Dosierschleife)

Datenverarbeitung: NEC Powermate 386/25 mit Waters 991 Software,

Plantron 386 DX-66 mit Waters 991 Software,

sowie Waters Millenium™ Chromatography Manager

Version 2.15

Schreiber: Graphikplotter Waters 5200

Drogenbearbeitung:

elektrische Kaffeemühle „Aroma Garant“, Firma Tchibo (Hamburg)

Ultra-Turrax Typ T45 mit Werkzeug S50N-G45M, Firma Jahnke & Kunkel IKA-Werk

(Staufen)

Fraktionssammler:

Gilson Abimed Fraction Collector, Model 202 (Villiers le bel, France)

Inkubator:

Thermostat 5320, Firma Eppendorf (Hamburg)

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130 Experimenteller Teil - 1 Allgemeine Methoden und Materialien

Kapillar-HPLC:

Gerät: CapLC mit integriertem Autosampler, Probenrack für 48 Vials, PDA-Detektor,

Säulenofen, Vici-Injektionsventil mit 10 µl-Dosierschleife und Spritzenpumpen,

Firma Waters (USA)

Datenverarbeitung: Dell Optiplex GX 100, Intel Celeron-Prozessor mit Micromass

MassLynx NT Software (Waters) Version 3.5

Schreiber: Epson Stylus Color 600

Massenspektroskopie:

Quadrupol-Particle-Beam-Massenspektrometer MD 800 (Fisons), gekoppelt mit einem

LC Module I Plus HPLC-Gerät (Waters, USA) mit integriertem Autosampler

Die Ionisierungsenergie betrug 700 eV.

Datenverarbeitung und Auswertung mittels MassLab Software, Version 1.3

Membranpumpen:

Vacuubrand MZ20/2.4

ABM 3 EKF 63 cx-4

NMR Spektroskopie:

Spektrometer: JEOL Eclipse+ 500(500 MHz), Firma JEOL GmbH (Eching)

Die Werte der chemischen Verschiebung sind in ppm angegeben und beziehen sich auf

die δ-Skala. Die Kalibrierung erfolgte auf das Lösungsmittelsignal.

Auswertung der Spektren mittels JEOL Delta, Version 4.3.1

Ölpumpe:

Typ AD71KZ4, Firma AEG

Plate Reader:

iEMS Reader MF mit 96 er-Microtiterplatten, Firma Labsystems, Auswertung mittels

iEMS Accent Software und Microsoft Excel 97

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Experimenteller Teil - 1 Allgemeine Methoden und Materialien 131

pH-Meter:

Metrohm 632 und WTW pH 315i mit den jeweils dazugehörigen Elektroden

Probenschüttler:

Vortex REAX 1 DR (200-2400 U/min), Firma Heidolph (Schwabach)

Ultraschallgeräte:

Sonorex Super RK 106 und Super RK 255H, Firma Bandelin (Berlin)

Ultraschallstab Sonifier 250, Firma Branson (USA)

UV/Vis Spektroskopie:

BIO RAD SmartSpec™ 3000 (USA)

Vakuumkonzentrator:

SpeedVac-Concentrator SVC 100 H, Firma Bachofer (Reutlingen)

Zentrifugen:

Für 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäße wurde eine Z230M mit den Festwinkelrotoren

250,56 V (9.981 x g) und 220,59 V (13.360 x g), Firma Hermle Labortechnik GmbH

(Wehingen) verwendet.

Für 10 ml Zentrifugengläser wurden eine Labofuge I Typ 1620+1800 mit einem Rotor

für 4800 rpm sowie eine Digifuge Typ 2100 mit einem Rotor für 6000 rpm der Firma

Heraeus (Langenselbold) verwendet.

Für größere Zentrifugenbehälter wurden eine 3E-1 der Firma Sigma (Osterode) mit

einem Rotor für 5000 rpm, eine Minifuge Typ 4123 der Firma Heraeus Christ

(Osterode) sowie eine Avanti™ J-25 Centrifuge der Firma Beckman Coulter™ (USA)

mit einem Rotor für 10.000 rpm (JA-10) verwendet.

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132 Experimenteller Teil - 1 Allgemeine Methoden und Materialien

1.2 HPLC Bedingungen

1.2.1 Analytische HPLC:

Nr. Stationäre Phase Mobile Phase, Fluss Detektion

A1 Kieselgel Si 60

(15-25 µm) in einer

Edelstahlkartusche

10 x 250 mm,

Probenzone ca. 1 cm

Trennbett ca. 24 cm

A: Dichlormethan

B: Methanol

C: Wasser

Linearer Gradient:

Zeit(min) A% B% C%

0 100 0 0

40 100 0 0

440 0 100 0

500 0 100 0

850 0 0 100

900 0 0 100

PDA

λ = 200-400 nm

A2 Macherey-Nagel

Nucleodur C18 gravity

250 x 4 mm, 5 µm

A: Acetonitril + 0,05 % TFA

B: Wasser + 0,0425 % TFA

1 ml/min, linearer Gradient:

Zeit (min) A % B %

0 5 95

10 5 95

40 100 0

45 100 0

50 5 95

60 5 95

PDA

λ = 200-400 nm

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Experimenteller Teil - 1 Allgemeine Methoden und Materialien 133

Nr. Stationäre Phase Mobile Phase, Fluss Detektion

A3 Macherey-Nagel

Nucleodur C18 gravity

250 x 4 mm, 5 µm

A: Acetonitril + 0,05 % TFA

B: Wasser + 0,0425 % TFA

1 ml/min, isokratisch:

30 % A / 70 % B

PDA

λ = 200-400 nm

A4 Macherey-Nagel

Nucleodur C18 gravity

250 x 4 mm, 5 µm

A: Acetonitril

B: Wasser

1 ml/min, linearer Gradient:

Zeit (min) A % B %

0 5 95

40 100 0

50 100 0

60 5 95

80 5 95

PDA

λ = 200-400 nm

A5 Macherey-Nagel

Nucleodur C18 gravity

250 x 4 mm, 5 µm

A: Acetonitril

B: Wasser

1 ml/min, linearer Gradient:

Zeit (min) A % B %

0 80 20

10 100 0

50 100 0

55 80 20

65 80 20

MS-EI

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134 Experimenteller Teil - 1 Allgemeine Methoden und Materialien

1.2.2 Kapillar HPLC:

Nr. Stationäre Phase Mobile Phase, Fluss Detektion

K1 Macherey-Nagel

Nucleosil 100 C18-HD

150 x 0,3 mm, 3 µm

A: Acetonitril + 0,05 % TFA

B: Wasser + 0,0425 % TFA

5 µl/min, isokratisch, 7 min:

90 % A / 10 % B

PDA

λ = 200-400 nm

K2 Macherey-Nagel

Nucleosil 100 C18-HD

150 x 0,3 mm, 3 µm

A: Acetonitril + 0,05 % TFA

B: Wasser + 0,0425 % TFA

5 µl/min, linearer Gradient:

Zeit (min) A % B %

0 5 95

80 98 2

90 98 2

100 5 95

120 5 95

PDA

λ = 200-400 nm

K3 Macherey-Nagel

Nucleosil 100 C18-HD

150 x 0,3 mm, 3 µm

A: Acetonitril + 0,05 % TFA

B: Wasser + 0,0425 % TFA

5 µl/min, linearer Gradient:

Zeit (min) A % B %

0 5 95

80 98 2

90 98 2

110 5 95

170 5 95

PDA

λ = 200-400 nm

K4 Macherey-Nagel

Nucleosil 100 C18-HD

150 x 0,3 mm, 3 µm

A: Acetonitril + 0,05 % TFA

B: Wasser + 0,0425 % TFA

5 µl/min, isokratisch:

20 % A / 80 % B

PDA

λ = 200-400 nm

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Experimenteller Teil - 1 Allgemeine Methoden und Materialien 135

1.3 Drogen

Bei der einfachen Gartenkresse G 502 handelte es sich um Saatgut der Firma Egesa.

Die weiteren verwendeten Drogen wurden von der Firma Caesar & Loretz (Hilden)

bezogen. Dabei handelte es sich außer bei den Petersilienfrüchten immer um bereits

pulverisiertes Material.

1.4 Chemikalien

Lösungsmittel:

Für die HPLC-Methoden wurden Lösungsmittel der Firmen Merck, Promochem, J. T.

Baker und Baxter in „gradient grade“ Qualität verwendet. Für Extrakte wurden

Lösungsmittel der gleichen Firmen in „pro analysi“ Qualtität eingesetzt.

Wasser wurde für alle Verwendungen über eine mit demineralisiertem Wasser gespeiste

Reinstwasseranlage Seralpur PRO 90 C der Firma Seral gewonnen. Der verwendete

Bakterienmembranfilter Supor® DCF™ CHS92DE mit einer Porenweite von 0,2µm

stammte von der Firma Gelman Sciences. Bei Entnahme lag die Leitfähigkeit des

Wassers unter 0,1 µS/cm.

Proteine:

1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-reduktoisomerase (EC1.1.1.267)

Die DXR wurde uns freundlicherweise von der Firma Jomaa Pharmaka GmbH (Gießen)

zur Verfügung gestellt.

Glutamatdehydrogenase (EC 1.4.1.2)

Die GDH wurde uns freundlicherweise von Herrn Christof Werner, ehemals AG Klebe,

Philipps-Universität Marburg, zur Verfügung gestellt. Eine Expression gelang nicht.

Thrombin (EC 3.4.21.5)

Aus Rinderplasma gewonnenes Thrombin der Firma Merck (Darmstadt) mit 50 NIH-

U/mg sowie humanes Thrombin (Beriplast®) das uns großzügigerweise von der Firma

Aventis Behring (Marburg) zur Verfügung gestellt wurde.

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136 Experimenteller Teil - 1 Allgemeine Methoden und Materialien

Trypsin (EC 3.4.21.4)

Trypsin aus Rinderpankreas mit 10.800 NIH-U/mg, bezogen von der Firma Sigma

(USA).

Albumine:

Albumin aus Rinderserum der Firma Fluka sowie Albumin aus humanem Serum der

Firma Sigma.

Reagenzien:

Acros Organics (Belgien): NADPH

Biomol (Hamburg): Isopropyl-β-Thiogalaktosylpyranidose

Fluka (Schweiz): Ammoniumchlorid

Merck (Darmstadt): Ammoniumcarbonat, Benzamid-HCl, Ethylendiamintetraacetat

MP Biomedicals (Eschwege): NADP

Riedel de Haën (Seelze): Clomazone, Kaliumhydrogenphosphat, Tannin Pulver

Roche Diagnostics (Mannheim): Pefabloc SC, Chromozym TH

Roth (Karlsruhe):Calciumchlorid, Hefeextrakt, Natriumchlorid, Pepton

Serva (Heidelberg): Polyclar AT, TRIS-HCl

Sigma (USA): α-Ketoglutarat, Ampicillin, TRIS-Base

Diverse Firmenspenden an das 5. Semesterpraktikum Pharmazie beinhalteten folgende

Arzneistoffe, die uns freundlicherweise von der Philipps-Universität Marburg zur

Verfügung gestellt wurden: Acetylsalicylsäure, Amitriptylin-HCl, Bromhexin-HCl,

Diclofenac-Na, Diphenhydramin-HCl, Homatropin-HBr, Ibuprofen, Ibuprofen-Lysinat,

Indometacin, Lidocain-HCl, Mefenaminsäure, Metoclopramid-HCl, Metoprololtartrat,

Neostigminmetilsulfat, Orciprenalinsulfat, Warfarin-Na

Die Thrombin-Inhibitoren des 3-Amidinophenylalanintyps wurden uns

großzügigerweise von Prof. Stürzebecher, Klinikum der Friedrich-Schiller-Universität

Jena, zur Verfügung gestellt.

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Experimenteller Teil - 1 Allgemeine Methoden und Materialien 137

Referenzsubstanzen:

Acros Organics (Belgien): Linolensäure, Linolsäure

Aldrich (USA): Ölsäure

Alfa Aesar (Karlsruhe): Elaidinsäure

Apotheker S. Bauer & Co. (München): Ätherisches Korianderöl

Cayman (USA): Arachidonoyl-p-Nitroanilin, Stearidonsäure

Fluka (Schweiz): Arachidonsäure, Linolensäuremethylester, Ölsäuremethylester,

Palmitinsäure, Palmitinsäuremethylester, Petroselinsäuremethylester, Ricinolsäure,

Stearinsäuremethylester, Vaccensäure

ICN Biomedicals (Eschwege): Docosahexaensäure

MP Biomedicals (Eschwege): Eicosapentaensäure

Roth (Karlsruhe): Linolsäuremethylester

Sigma (USA): Eicosatriensäure, Eicosensäure, Erucasäure, Petroselinsäure

1.5 Puffer, Lösungen und Medien

1.5.1 DXR

DXR-Lösung: MR = 45.000 Da

1 mg/ml in DXR-Puffer

DXR-Puffer:

20mM TRIS-Base

100mM Natriumchlorid

eingestellt auf pH = 8, sterilfiltriert

Aktivierungspuffer DXR:

1 mM Manganchlorid

100 mM TRIS-Base

eingestellt auf pH = 8, sterilfiltriert

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138 Experimenteller Teil - 1 Allgemeine Methoden und Materialien

Clomazone-Lösung:

Für die Lösung mit der die Kresse-Keimlinge behandelt werden wird die 1 M

Stocklösung in Aceton verdünnt auf 500 µM.

1.5.2 GDH

GDH-Lösung: MR = 205,1 g/mol

2nM in H2O

Assay-Puffer:

100 mM Kaliumdihydrogenphosphat

1 mM EDTA

eingestellt auf pH = 8

Puffer A:

6,8 g Kaliumdihydrogenphosphat

0,37 g EDTA

Eingestellt auf pH = 8

Assay-Lösungen:

Glutamat-Lösung: 100 mM in Assay-Puffer

NADP-Lösung: 4 mM in Assay-Puffer

NADPH-Lösung: 4 mM in Assay-Puffer

Ketoglutarat-Lösung: 400 mM in Assay-Puffer

Ammoniumchlorid-Lösung: 800 mM in Assay-Puffer

LB-Medium:

10 g Pepton

10 g Natriumchlorid

5 g Hefeextrakt

ad 1 l H2O, eingestellt auf pH = 7,5, autoklaviert (121°C, 30 min)

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Experimenteller Teil - 1 Allgemeine Methoden und Materialien 139

2 x YT-Medium:

40 g Pepton

20 g Hefeextrakt

10 g Natriumchlorid

ad 1 l H2O, eingestellt auf pH = 7,5, autoklaviert (121°C, 30 min)

Ampicillin-Lösung: 10 mg/ml in Wasser

IPTG-Lösung: 100 mM in Wasser

1.5.3 Thrombin:

Substrat-Lösung:

1 mM Chromozym TH in Wasser

Thrombin-Lösung:

Eine Flasche mit humanem Thrombin wurde jeweils in 1 ml Wasser gelöst. Die

benötigten Konzentrationen wurden daraus verdünnt. Meist wurden 100 IE/ml

eingesetzt, für die 40 µl aus der Flasche auf 1 ml verdünnt wurden.

Thrombin-Puffer:

608 mg TRIS-Base

900 mg Natriumchlorid

ad 100 ml H2O, eingestellt auf pH = 8, sterilfiltriert

BSA-Lösung:

1 g Bovines Serum Albumin

0,9 g Natriumchlorid

ad 100 ml H2O, sterilfiltriert

HSA-Lösung:

1 g Humanes Serum Albumin

0,9 g Natriumchlorid

ad 100 ml H2O, sterilfiltriert

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140 Experimenteller Teil - 1 Allgemeine Methoden und Materialien

Tannin-Lösung: 10 mg/ml in isotonischer Natriumchlorid-Lösung

1.6 Materialien

Filter:

Rotilabo® Spritzenfilter steril mit einer Membran aus Zellulosemischester und einer

Porenweite von 0,22µm, Firma Roth (Karlsruhe)

Blaubandfilter, Glasfaser-Vorfilter GF92 sowie Membranfilter RC58, Firma Schleicher

& Schuell (Dassel)

Glasfaserfilter GF/F 0,7 µm, Whatman (UK)

Kieselgel:

Si 60 mit 63 – 200 µm und 15 – 25 µm Durchmesser, Firma Merck (Darmstadt)

Pipettenspitzen:

Firma KMF Laborbedarf (Sankt Augustin)

Reaktionsgefäße:

1,5 ml PP-Gefäße „Rotilabo“ mit Deckel, Firma Roth (Karlsruhe)

Ultrafiltrationseinheiten:

Microcon 10 bzw. 30 (NMWL 10.000 bzw. 30.000 Da) mit einer Filtermembran aus

regenerierter Cellulose sowie Ultrafree 0.5 (NMWL 10.000 Da) mit einer Biomax-10

Filtermembran aus Polyethersulfon, Firma Millipore (Bedford, USA)

Weitere Verbrauchsmaterialien:

Baumwollwatte (Bel Nature)

Frischhaltefolie (Toppas)

Einweg-Spritzen und Kanülen der Firma Braun (Melsungen)

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Experimenteller Teil - 2 Extrakte 141

2 Extrakte

2.1 Gesamtextrakte

2.1.1 Kresse

Die Herstellung des Gesamtextraktes aus Kresse ist bereits im theoretischen Teil

erläutert worden (Kapitel 6.2.1). Anschließend ist er an der Ölpumpe nachgetrocknet

worden.

2.1.2 Knoblauch

Die 100 g der bereits pulverisiert bezogenen Knoblauchzwiebel wurden mit Methanol

versetzt und dreimal je 5 min ins Ultraschallbad gestellt. Mittels einer Filtrationseinheit

mit Glasfaserfritte (Schleicher & Schuell) wurde der Methanolextrakt über einen

Glasfaserfilter (Whatman, 0,7µm) abfiltriert. Die so erhaltene Lösung wurde unter

vermindertem Druck vom Lösungsmittel befreit, welches anschließend weiter für die

Extraktherstellung eingesetzt wurde. Der fertige Extrakt wurde an der Ölpumpe

nachgetrocknet.

2.1.3 Apiaceaenfrüchte

Die Früchte von Anis, Fenchel, Koriander und Kümmel lagen bereits pulverisiert vor.

Petersilienfrüchte wurden als ganze Frucht bezogen und mussten daher zunächst in

einer Kaffeemühle gemahlen werden.

Ungefähr 2 g jeder Droge wurden mit 3 x 20 ml Hexan versetzt und insgesamt 30 min

mit Ultraschall behandelt. Anschließend wurde über einen Blaubandfilter filtriert und

das Hexan unter vermindertem Druck abgezogen. Die erhaltenen Extrakte wurden an

der Ölpumpe nachgetrocknet.

2.2 Selektive Extrakte

2.2.1 Kresse

Für die selektiven Kresseextrakte musste zunächst wieder Kresse gesät, nach 24

stündigem Quellen mit Clomazone-Lösung behandelt und nach einer Woche geerntet

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142 Experimenteller Teil - 2 Extrakte

werden. Bis genug Material beisammen war, wurde die Kresse nach der Ernte unter

Zugabe von flüssigem Stickstoff im Mörser zermahlen und im Tiefkühlschrank bei

-20°C aufbewahrt. Die Kresse wurde dann in Hexan vorliegend mit einem Ultra-Turrax,

wobei auf eine Erdung und ausreichende Kühlung zu achten war, weiter zerkleinert und

in eine leere, präparative Edelstahlkartusche mit den Maßen 25 x 250 mm gefüllt. Zuvor

ist eine dünne Schicht aus Seesand in die Kartusche gefüllt worden. Als Abschluss

wurde wiederum eine dünne Schicht aus Seesand verwendet. Die Säule wurde

anschließend unter Verwendung einer HPLC-Pumpe mit Lösungsmitteln steigender

Polarität erschöpfend extrahiert. Die erhaltenen Lösungen wurden unter vermindertem

Druck von den jeweiligen Lösungsmitteln befreit. Auf diese Weise erhielten wir

Hexan-, Dichlormethan-, Methanol-, Methanol/Wasser- und Wasser-Extrakte.

Weiterhin wurde mit Dichlormethan eine wässrige Phase eluiert, die separat ebenfalls

vom Lösungsmittel befreit wurde.

2.2.2 Knoblauch

Auch für die Herstellung der selektiven Extrakte wurde das von Caelo bezogene Pulver

aus der Knoblauchzwiebel verwendet. Es wurden etwa 1 kg des Pulvers eingesetzt und

mit dem doppelten Volumen Hexan versetzt. Mit einem Ultra-Turrax wurde die

Suspension dreimal 5 min auf höchster Stufe behandelt, wobei wiederum auf eine

Erdung und ausreichende Kühlung geachtet werden musste. Das Hexan wurde

abdekantiert und unter vermindertem Druck abgezogen. Das verbleibende

Knoblauchpulver wurde zwei weitere Male mit Hexan, diesmal aber nicht mit Ultra-

Turrax sondern mit Ultraschall, behandelt und nach dem letzten Mal mittels einer

Filtrationseinheit (Schleicher & Schuell) über Glasfaserfritte und Glasfaserfilter

abgetrennt. Anschließend wurde das Pulver ebenso (Ultraschall) mit Lösungsmitteln

steigender Polarität behandelt. Auf diese Weise erhielten wir Hexan-, Dichlormethan-,

Ethanol-, Ethanol/Wasser- und Wasser-Extrakte.

2.2.3 Koriander

Das Korianderpulver von Caelo wurde in eine leere Edelstahlkartusche mit den Maßen

25 x 250 mm gefüllt, in die zunächst eine Schicht aus Seesand gegeben wurde. Den

oberen Abschluss bildete wiederum Seesand. Anschließend wurde schnell mittels einer

HPLC-Pumpe mit Pentan eingespült und dann mit einem Fluss von 0,5 ml/min

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Experimenteller Teil - 2 Extrakte 143

erschöpfend mit Lösungsmitteln steigender Polarität extrahiert. Die Lösungsmittel

wurden unter vermindertem Druck abgezogen und an der Ölpumpe nachgetrocknet.

Pentan- und Dichlormethan-Extrakt jedoch wurden nicht an die Ölpumpe gehangen, da

zu diesem Zeitpunkt noch nicht sicher war, ob die ätherischen Öle eine Rolle bei der

Hemmung spielen. Auf diese Weise wurden Pentan-, Dichlormethan-, Methanol-,

Methanol/Wasser- und Wasser-Extrakte erhalten.

2.2.4 Kümmel

Das Kümmelpulver wird zunächst mit Pentan versetzt und fünfmal 30 s mit einem

Ultra-Turrax behandelt, wobei auf eine Erdung und ausreichende Kühlung geachtet

werden musste. Anschließend wurde es in eine leere Edelstahlkartusche mit den Maßen

25 x 250 mm gefüllt und wie das Korianderpulver behandelt. Auf diese Weise wurden

Pentan-, Dichlormethan-, Methanol-, Methanol/Wasser- und Wasser-Extrakte erhalten.

2.3 Analytische Extrographie

2.3.1 Kresse

Für die analytische Extrographie musste zunächst der wässrige Gesamtextrakt (s. 2.1.1)

auf Kieselgel mit einer Korngröße von 63-200 µm aufgezogen werden. Dafür wurde der

Extrakt in Methanol gelöst und mit einer fünfmal größeren Menge an Kieselgel versetzt.

Unter vermindertem Druck wurde das Methanol abgezogen. 300 mg dieses

imprägnierten Kieselgels wurde in eine leere, semipräparative Edelstahlkartusche mit

den Maßen 10 x 250 mm überführt, in der sich bereits ein Trennbett aus reinem

Kieselgel (15-25 µm) befand. Dieses Kieselgeltrennbett wurde schichtweise durch

Anpressen mit geeignetem Stampfwerkzeug erstellt. Den Abschluss bildete wiederum

eine dünne Schicht aus reinem Kieselgel. Die Chromatographie wurde nach Methode

A1 durchgeführt.

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144 Experimenteller Teil - 2 Extrakte

2.4 Ätherisches Öl

2.4.1 Allgemeines

Für die Destillation wurde eine Apparatur zur Gehaltsbestimmung des ätherischen Öls

nach dem EuAB verwendet, die für den präparativen Maßstab verändert worden war.

Statt Xylol wird Cyclohexan als Vorlage verwendet.

2.4.2 Koriander

10,0 g des Pentanextraktes aus Koriander wurden mit 200 ml Wasser versetzt und

30 min. im Heizpilz auf mittlerer Stufe erhitzt. Man erhielt 1,4 ml ätherisches Öl.

Weiterhin wurde das Korianderpulver, welches für die Extraktherstellung verwendet

worden war extrahiert, wobei die Ausbeute mit ca. 100 µl sehr gering war.

2.4.3 Kümmel

Von Kümmel wurde ebenfalls der Pentanextrakt extrahiert. Dabei wurden etwa 5 g

abgewogen, mit 100 ml Wasser versetzt und 30 min. im Heizpilz auf mittlerer Stufe

erhitzt. Hier wurden nur 500 µl ätherisches Öl erhalten, wobei man jedoch die geringere

Einsatzmenge beachten muss.

2.5 Methanol-Pentan-Extrakte

2.5.1 Koriander

Dieser Extrakte wurden in Anlehnung an Pietschmann [149] hergestellt. Dabei werden

etwa 300 g Korianderpulver mit 1 l Methanol versetzt und dreimal 15 min im

Ultraschallbad behandelt. Das nun gelbe Lösungsmittel wird abfiltriert und 1:1 mit

Wasser versetzt. Die hellgelbe Emulsion wird mit Pentan ausgeschüttelt. Dieses wird

nach trocknen über Natriumsulfat unter vermindertem Druck entfernt. Der Extrakt wird

schließlich noch an der Ölpumpe nachgetrocknet.

Dieser Extrakt ist etwas konzentrierter an wirksamen Inhaltsstoffen, worauf

Chromatogramm und inhibitorische Aktivität schließen lassen.

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Experimenteller Teil - 3 Ligandenfischen 145

3 Ligandenfischen

3.1 Allgemeines

Inkubation: Zunächst wird das Enzym der Substanzbibliothek (Pflanzenextrakt)

zugeführt und unter optimalen Bedingungen inkubiert, wobei alle 15 min geschüttelt

wird (Vortex). Während der Inkubationszeit werden die Filtrationseinheiten von dem

Membranfeuchthalter Glycerin befreit, welches bei der chromatographischen

Vermessung stören würde. Dafür werden 200 µl H2O durch die Membran zentrifugiert.

Filtration: Anschließend werden die Ansätze jeweils auf die einzelnen Filter gegeben

und einer Ultrafiltration unterzogen, bis das komplette Volumen den Filter passiert hat.

Waschung: Die Waschschritte erfolgten jeweils mit 150 µl kaltem DXR-Puffer und

anschließender vollständiger Ultrafiltration.

Freisetzung: Das Freisetzungsreagenz (FR) besteht aus 49,5 T Methanol / 49,5 T H2O /

1 T TFA und wird jedes Mal frisch hergestellt. Nach dem zweiten Waschschritt wird

jeder Ansatz mit 200 µl FR 10 min lang inkubiert. Anschließend wird erneut

ultrafiltriert, bis sich keine Flüssigkeit mehr auf der Filtermembran befindet.

Alle so erhaltenen Proben (acht je Ansatz) werden im SpeedVac-Concentrator vom

Lösungsmittel befreit und unter Zuhilfenahme von Ultraschall und Vortex in

Anfangsbedingungen für die chromatographische Vermessung gelöst.

Die einzelnen Schritte sind näher in Kapitel 2 (Verwendete Testsysteme) erläutert.

3.2 Optimierung für DXR

Die Bedingungen für das Ligandenfischen sollten mittels des bekannten Inhibitors

Fosmidomycin optimiert werden. Dieses hemmt in einer Konzentration von 1 nmol/ml

eine Enzymkonzentration von 1 µg/ml (0,02 nmol/ml).

Es wurde eine DXR-Lösung von 1 mg/ml und eine Fosmidomycin-Lösung von

10 mg/ml hergestellt. Pro Ansatz wurden jeweils 100 µl DXR (100 µg = 2,22 nmol) und

4,51µl (220 nmol) Fosmidomycin eingesetzt. Das Ganze wurde mit DXR-Puffer auf ein

Volumen von 300 µl je Reaktionsgefäß aufgefüllt.

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146 Experimenteller Teil - 3 Ligandenfischen

Für das Fischen wurden sowohl Microcon 10 (M) als auch Ultrafree 0,5 (U)

Ultrafiltrationseinheiten verwendet. Weiterhin wurde mit (MA) und ohne (OA)

Aktivierungspuffer gefischt.

Folgendes Pipettierschema wurde verwendet:

[µl] OA-M OA-M

Blind

OA-U OA-U

Blind

MA-M MA-M

Blind

MA-U MA-U

Blind

DXR-Lösung 100 ---- 100 ---- 100 ---- 100 ----

DXR-Puffer 195,5 295,5 195,5 295,5 195,5 295,5 195,5 295,5

Fosmidomycin 4,5 4,5 4,5 4,5 4,5 4,5 4,5 4,5

Die Proben wurden 1,5 h bei 37°C inkubiert.

Die erhaltenen Proben in 20 µl 90 ACN/10 H2O gelöst und chromatographisch an der

CapLC (K1) vermessen, wobei das Injektionsvolumen 1 µl betrug.

3.3 Fischen in Kresseextrakten

3.3.1 Gesamtextrakte

Eingesetzt wurden die wässrigen Kresseextrakte aus behandelter (bK) und

unbehandelter Kresse (uK) in einer Konzentration von 5 mg/ml in DXR-Puffer. Da sich

nicht alles löste, wurde vorher abzentrifugiert. Diese Lösungen wurden auch

chromatographisch an der CapLC (K2) vermessen.

Pro Ansatz wurden 40 µl DXR-Lösung (c = 1 mg/ml) eingesetzt, was 40 µg Enzym

entspricht.

Pipettierschema:

[µl] bK bK Blind nK nK Blind

DXR-Lösung 40 ---- 40 ----

Puffer 160 200 160 200

Kresseextrakt 100 100 100 100

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Experimenteller Teil - 3 Ligandenfischen 147

Es wurde 1 h bei 37°C inkubiert.

Die Proben wurden in 5 % ACN / 95 % H2O gelöst und an der CapLC vermessen (K2).

Das Injektionsvolumen betrug 0,15 µl.

3.3.2 Selektive Extrakte

Es wurden folgende Extrakte eingesetzt: Dichlormethan (D), Methanol (M),

Methanol/Wasser (M/W), Wasser (W1) und der Wasserextrakt (W2), der mit dem

Dichlormethan eluiert wurde. Die Lösungen wurden in einer Konzentration von

5 mg/ml hergestellt, wobei der Dichlormethan-Extrakt mit 5% Ethanol des Gesamt-

volumens angelöst wurde. Alle Lösungen wurden abzentrifugiert und der Überstand

sowohl chromatographisch vermessen (K2) als auch für die Fischversuche verwendet.

Der Blindansatz wurde jeweils mit „B“ gekennzeichnet.

Pipettierschema:

[µl] D D B M M B M/W M/W B W1 W1 B W2 W2 B

DXR 100 ---- 100 ---- 100 ---- 100 ---- 100 ----

Puffer 100 200 100 200 100 200 100 200 100 200

Extrakt 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100

Es wurde 1:15 h bei 37°C inkubiert.

Die Proben wurden in 5 % ACN / 95 % H2O gelöst und an der CapLC vermessen (K2).

Das Injektionsvolumen betrug 0,15 µl.

3.3.3 Analytische Extrographie Fraktionen

Für den Fischversuch wurden die wässrigen Fraktionen der analytischen Extrographie

(aE) ausgewählt. Diese wurden in einer Konzentration von 1 mg/ml in DXR-Puffer

gelöst und zunächst auch chromatographisch vermessen (K2).

Die Blindansätze wurden mit „B“ gekennzeichnet.

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148 Experimenteller Teil - 3 Ligandenfischen

Pipettierschema:

[µl] aE1 aE1 B aE2 aE2 B aE3 aE3 B aE4 aE4 B

DXR 100 ---- 100 ---- 100 ---- 100 ----

Puffer 100 200 100 200 100 200 100 200

Extrakt 100 100 100 100 100 100 100 100

Es wurde 1:05 h bei 37°C inkubiert.

Die Proben wurden in 5 % ACN / 95 % H2O gelöst und an der CapLC vermessen (K2).

Das Injektionsvolumen betrug 0,15 µl.

3.4 Fischen in Knoblauchextrakten

3.4.1 Gesamtextrakt

Es wurde ein methanolischer Gesamtextrakt in einer Konzentration von 5mg/ml

eingesetzt. Dabei wurde einmal mit jeweils 50 µl (K50) und einmal mit jeweils 100 µl

(K100) Extraktlösung pro Ansatz gefischt. Die GDH-Lösung lag 2nM vor.

Pipettierschema:

[µl] K50 K50 Blind K100 K100 Blind

GDH-Lösung 250 ---- 250 ----

Wasser ---- 250 ---- 250

Knoblauchextrakt 50 50 100 100

Es wurde 1:15 h bei 30°C inkubiert.

Die Proben wurden in Wasser gelöst und an der CapLC vermessen (K2). Das

Injektionsvolumen betrug 0,15 µl.

3.4.2 Selektive Extrakte

Es wurden folgende Extrakte verwendet: Hexan (H), Dichlormethan (D), Ethanol (E),

Ethanol/Wasser (E/W), Wasser (W). Bis auf den Wasserextrakt wurden alle mit einer

Konzentration von 5 mg/ml eingesetzt. Der Wasserextrakt wurde mit einer

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Experimenteller Teil - 3 Ligandenfischen 149

Konzentration von 4,97 mg/ml eingesetzt. Die Hexan-, Dichlormethan- und Ethanol-

Extrakte wurden zunächst mit 5 % Ethanol des Gesamtvolumens angelöst und

anschließend mit Wasser aufgefüllt. Die restlichen Extrakte wurden in Wasser gelöst.

Die Blindproben sind jeweils mit „B“ gekennzeichnet.

Pipettierschema:

[µl] H H B D D B E E B E/W E/W B W W B

GDH 200 ---- 200 ---- 200 ---- 200 ---- 200 ----

Wasser ---- 200 ---- 200 ---- 200 ---- 200 ---- 200

Extrakt 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100

Es wurde 1:15 h bei 30°C inkubiert.

Die Proben wurden in Wasser gelöst und an der CapLC vermessen (K2). Das

Injektionsvolumen betrug 0,15 µl.

3.5 Vergleich von Fischen mit humanem Thrombin gegen

Rinderthrombin

3.5.1 Inhibitoren einzeln

Für den Vergleich von Fischen mit humanem (h) zu Fischen mit bovinem (b) Thrombin

wurden als Inhibitoren Vertreter der 3-Amidinophenylalaninreihe (V1-4) verwendet

(vgl. Kapitel 13.1.2). Dabei wurden die Inhibitoren in Anlehnung an Lenz [144] in einer

Konzentration von 4 nmol je Ansatz eingesetzt, während die Proteine in gleichen

Aktivitäten von 50 IE/ml verwendet wurden. Die Blindversuche sind mit „B“

gekennzeichnet.

Pipettierschema bovines Thrombin:

[µl] V1 V1 B V2 V2 B V3 V3 B V4 V4 B

Thrombin (b) 130 ---- 130 ---- 130 ---- 130 ----

0,9% NaCl-Lsg. ---- 130 ---- 130 ---- 130 ---- 130

Inhibitor 20 20 20 20 20 20 20 20

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150 Experimenteller Teil - 3 Ligandenfischen

Pipettierschema humanes Thrombin:

[µl] V1 V1 B V2 V2 B V3 V3 B V4 V4 B

Thrombin (h) 130 ---- 130 ---- 130 ---- 130 ----

0,9% NaCl-Lsg. ---- 130 ---- 130 ---- 130 ---- 130

Inhibitor 20 20 20 20 20 20 20 20

Die Inkubation erfolgte jeweils 1 h bei Raumtemperatur.

Alle Proben wurden in Wasser gelöst und an der CapLC vermessen (K3). Das

Injektionsvolumen betrug 0,15 µl.

3.5.2 Substanzbibliothek

Für die Erstellung einer Substanzbibliothek wurden verschiedene Arzneistoffe

analytisch vermessen (A2). Die Auswahl erfolgte dabei willkürlich nach den

Retentionszeiten in diesem System.

Folgende Substanzen wurden ausgewählt (vgl. Kapitel 13.1.4): Amitriptylin-HCl,

Bromhexin-HCl, Chlorpromazin-HCl, Diphenhydramin-HCl, Homatropin-HBr,

Lidocain-HCl, Metoclopramid-HCl, Metoprolotartrat, Neostigminmetilsulfat,

Orciprenalinsulfat, Warfarin-Na.

Aus diesen wurde eine Bibliothek zusammengestellt, in der die Arzneistoffe in einer

Konzentration von 4 nM vorliegen. Es wurden insgesamt vier Substanzbibliotheken

hergestellt, denen jeweils ein Inhibitor zugegeben wurde, ebenfalls in einer

Konzentration von 4 nM (SB 1-4, korrelierend mit der Bezeichnung für die Inhibitoren).

Alle Bibliotheken wurden chromatographisch vermessen (K3). Es ergaben sich

folgende Versuchsanordnungen, bei denen die Blindversuche jeweils mit „B“

gekennzeichnet sind.

Pipettierschema bovines Thrombin:

[µl] SB1 SB1 B SB2 SB2 B SB3 SB3 B SB4 SB4 B

Thrombin (b) 137,5 ---- 137,5 ---- 137,5 ---- 137,5 ----

0,9% NaCl-Lsg. ---- 137,5 ---- 137,5 ---- 137,5 ---- 137,5

Inhibitor 12,5 12,5 12,5 12,5 12,5 12,5 12,5 12,5

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Experimenteller Teil - 3 Ligandenfischen 151

Pipettierschema humanes Thrombin:

[µl] SB1 SB1 B SB2 SB2 B SB3 SB3 B SB4 SB4 B

Thrombin (h) 137,5 ---- 137,5 ---- 137,5 ---- 137,5 ----

0,9% NaCl-Lsg. ---- 137,5 ---- 137,5 ---- 137,5 ---- 137,5

Inhibitor 12,5 12,5 12,5 12,5 12,5 12,5 12,5 12,5

Es wurde jeweils 1:20 h bei Raumtemperatur inkubiert.

Alle Proben wurden in Wasser gelöst und an der CapLC vermessen (K3). Das

Injektionsvolumen betrug 0,15 µl.

3.5.3 Inhibitoren im Gemisch

Auch ein äquimolares Gemisch wurde aus den Inhibitoren (IG) hergestellt, wobei jeder

Inhibitor wiederum in einer Konzentration von 4 nM vorlag. Die analytische chromato-

graphische Vermessung war isokratisch bei 30 % ACN / 70 % H2O optimal (A3),

während die Vermessung auf der CapLC isokratisch bei 20 % ACN / 80 % H2O am

besten geeignet war (K4). Humanes (h) und bovines Thrombin (b) wurden mit 50 IE/ml

eingesetzt. Die Blindansätze sind mit „B“ gekennzeichnet.

Pipettierschema:

[µl] IG b IG b Blind IG h IG h Blind

Thrombin 130 ---- 130 ----

0,9 % NaCl-Lsg. ---- 130 ---- 130

Inhibitor 20 20 20 20

Es wurde 1:20 h bei Raumtemperatur inkubiert.

Alle Proben wurden in Anfangsbedingungen gelöst und an der CapLC vermessen (K4).

Das Injektionsvolumen betrug 0,15 µl.

3.6 Fischen im Korianderextrakt

Verwendet wurde der Methanol-Pentan-Extrakt aus Korianderfrüchten in einer

Konzentration von 5 mg/ml. Weiterhin wurde auch die Petroselinsäure als Einzel-

substanz für die Fischversuche verwendet. Dabei wurde sie in 2 verschiedenen

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152 Experimenteller Teil - 3 Ligandenfischen

Konzentrationen eingesetzt, c = 0,5 mg/ml (P1) und c = 1 mg/ml (P2). Die Blindansätze

sind mit „B“ gekennzeichnet. Das humane Thrombin wurde mit 100 IE/ml eingesetzt.

Pipettierschema:

[µl] K K B P1 P1 B P2 P2 B

Thrombin- 100 ---- 100 ---- 100 ----

Thrombin-Puffer 100 200 100 200 100 200

Extrakt 100 100 100 100 100 100

Es wurde 1:25 h bei Raumtemperatur inkubiert.

Die Proben wurden in Wasser gelöst und an der CapLC vermessen (K3). Das

Injektionsvolumen betrug 0,15 µl.

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Experimenteller Teil - 4 Aktivitätsassays 153

4 Aktivitätsassays

4.1 GDH

4.1.1 Hinreaktion

Messansatz: Glutamat 25 µl

Inhibitor, bzw. Puffer 50 – 200 µl, max. 250 µl

NADP+ 13 µl

Enzym 12 µl

Messbedingungen: Raumtemperatur, pH = 8

60 Messpunkte alle 10 s

Vor Messbeginn wird 30 s bei 600 rpm gemischt (Plate Reader)

Für die Bestimmung der Restaktivität wurde die Hinreaktion verwendet.

Als Inhibitorlösung wurde der methanolische Gesamtextrakt aus Knoblauch in einer

Konzentration von 5 mg/ml in Assay-Puffer verwendet. Da die optische Dichte zu hoch

war, wurde die Lösung 1:100 mit Assay-Puffer verdünnt.

4.1.2 Rückreaktion

Messansatz: Assay-Puffer 915 µl

NADPH 25 µl

Ketoglutarat 5 µl

Zellüberstand 5 µl

Ammoniumchlorid 50 µl

Messbedingungen: Raumtemperatur, pH = 7

36 Messpunkte alle 10 s bei λ = 340 nm

Vor Ammoniumchloridzugabe Blindabgleich (SmartSpec)

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154 Experimenteller Teil - 4 Aktivitätsassays

Für den Aktivitätstest während der Expression werden 1000 µl Zellsuspension

entnommen, bei 14.000 rpm 10 min lang abzentrifugiert und der Überstand verworfen.

Zum Pellet werden 200 µl Assay-Puffer zugesetzt und dreimal 10 s mittels

Ultraschallstab lysiert. Dazwischen wird immer gekühlt. Die Zellbestandteile werden

wiederum abzentrifugiert und der Überstand für den Assay verwendet.

Die Menge (Units) Enzym, die exprimiert wurde lässt sich anschließend aus folgender

Gleichung berechnen: U = ∆A/min x 1000 / εNADPH x 5

εNADPH = 6,2

5 = Volumen an eingesetzem Überstand (5 µl)

Der erhaltene Wert wird mit 2000 multipliziert (2 l) und durch den Faktor 5 geteilt

(1000 µl Enzymlösung werden auf 200 µl eingeengt)

4.2 Thrombin

4.2.1 Allgemeines

Der Aktivitätsassay lehnt sich größtenteils an die Methode von Stürzebecher [150] an.

Messansatz: 200 µl Puffer / Inhibitor

25 µl Substrat

50 µl Enzym

Messbedingungen: Raumtemperatur, pH = 8

60 Messpunkte alle 10 s bei λ = 405 nm

Vor Messbeginn wird 5 s bei 600 rpm geschüttelt (Plate Reader)

Messdurchführung: Zunächst werden die Inhibitor- bzw. Puffer- sowie

Enzymlösungen in die Vertiefungen der Microtiterplatte

pipettiert. Nach 15 minütiger Inkubation wird die Reaktion durch

Substratzugabe mittels Multipette (Eppendorf) gestartet.

Das humane Thrombin wird mit einer Aktivität von 100 IE/ml eingesetzt. Vor Ver-

wendung wird es 1:40 mit einer HSA-Lösung verdünnt.

Das Rinderthrombin wird in einer Aktivität von 50 IE/ml eingesetzt. Dieses wird

ebenfalls vor Gebrauch 1:40 mit einer BSA-Lösung verdünnt.

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Experimenteller Teil - 4 Aktivitätsassays 155

4.2.2 Optimierung des Assays für humanes Thrombin

Für die Untersuchung des Einflusses der Enzymkonzentration wurden das humane und

das bovine Protein in jeweils zwei Aktivitäten vermessen, einmal 50 IE/ml und einmal

100 IE/ml. Das Rinderthrombin stand dabei als Substanz mit 50 IE/mg zur Verfügung.

Ein Behälter mit humanem Thrombin wurde in 1000 µl Wasser gelöst. Davon wurden

40 µl auf 1000 µl verdünnt, was einer Aktivität von 100 IE/ml entsprach. Diese Lösung

wurde 1:1 verdünnt, um die Lösung mit 50 IE/ml zu erhalten. Weiterhin wurde der

Einfluss des Serumalbumins getestet. Dafür wurde das humane Thrombin einmal mit

HSA-Lösung und parallel dazu mit BSA-Lösung verdünnt. Als Inhibitoren wurden

wieder die 3-Amidinophenylalaninderivate von Dr. Stürzebecher verwendet.

4.2.3 Apiaceaenfrüchteextrakte

Aus selektiven Extrakten aus Koriander- und Kümmelfrüchten wurden Lösungen mit

einer Konzentration von 5 mg/ml hergestellt. Dabei wurden die Extrakte zunächst mit

5 % Ethanol des Endvolumens angelöst und anschließend mit Thrombin-Puffer

aufgefüllt. Sowohl die Pentan- als auch bei den Dichlormethanextrakte lösten sich nicht

vollständig, so dass diese vor Einsatz abzentrifugiert wurden.

Um die Apiaceaen untereinander zu vergleichen, wurden Lösungen aus Hexanextrakten

weiterer Apiaceaenfrüchte auf die gleiche Art hergestellt, diesmal in einer

Konzentration von 1 mg/ml. Auf Grund der Trübung wurden diese ebenfalls vor Einsatz

abzentrifugiert.

Die Hydrolyse des Petersiliensamenextraktes erfolgte mittels einer 0,5 N

methanolischen Natriumhydroxid-Lösung. 2 mg des Extraktes wurden mit 2 ml der

NaOH versetzt und in einem hitze- und druckstabilen Gefäß 60 min. im kochenden

Wasserbad erhitzt. Anschließend erfolgte eine chromatographische Vermessung (A4).

4.2.4 Ätherisches Öl

Die ätherischen Öle aus dem Koriander-Pentanextrakt und dem Kümmel-Pentanextrakt

sowie industriell bezogenes ätherisches Öl aus Koriander wurden in einer Konzentration

von 0,5 mg/ml dem Aktivitätsassay unterzogen. Dabei wurden sie auch zunächst in 5 %

Ethanol des Gesamtvolumens angelöst und dann mit Thrombin-Puffer aufgefüllt. Diese

im Gegensatz zu den Tests mit den Pentanextrakten niedrigere Konzentration ist jedoch

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156 Experimenteller Teil - 4 Aktivitätsassays

vergleichbar, da ja auch in etwa nur ein Zehntel des Pentanextraktes aus ätherischem Öl

besteht.

4.2.5 Fettsäuren

Folgende Fettsäuren wurden in einer Konzentration von 0,25 mM auf ihre Aktivität

gestestet:

Arachidonsäure, Docosahexaensäure, Eicosapentaensäure, Eicosatriensäure, Eicosen-

säure, Elaidinsäure, Erucasäure, Linolensäure, Linolsäure, Ölsäure, Palmitinsäure,

Petroselinsäure, Ricinolsäure, Stearidonsäure und Vaccensäure.

Folgende Fettsäurederivate bzw. Öle wurden in einer Konzentration von 0,25 mM auf

ihre Aktivität getestet:

Arachidonoyl-p-Nitroanilin, Erucasäureamid, Leinöl, Olivenöl und Petroselinsäure-

methylester

Die verwendeten Untersuchungslösungen wurden dabei so hergestellt, dass zunächst die

jeweilige Substanz in 5 % des Gesamtvolumens Ethanol angelöst und dann mit

Thrombin-Puffer aufgefüllt wurde.

4.2.6 Cyclooxygenasehemmer

Folgende COX-Hemmer sind in einer Konzentration von 4 mM getestet worden:

Acetylsalicylsäure, Diclofenac, Ibuprofen, Ibuprofen-Lysinat, Indometacin und

Mefenaminsäure.

Die Untersuchungslösungen wurden wiederum unter Anlösen in 5 % Ethanol und

Auffüllen mit Thrombin-Puffer hergestellt.

4.2.7 Selektivität

Für die Untersuchung auf Selektivität wurde Trypsin ausgewählt. Es wurde eine

Stammlösung von 1 mg/ml hergestellt, die 1:1000 verdünnt wurde, so dass eine

Aktivität von 10,8 IE/ml resultierte. Die Verdünnung enthielt 10 mM Calciumchlorid.

Humanes Thrombin wurde ebenfalls verdünnt, so dass eine Aktivität von 12,5 IE/ml

resultierte. Petroselinsäure in einer Konzentration von 0,25 mM wurde beiden

Enzymlösungen parallel zugegeben und auf inhibitorische Aktivität getestet.

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Experimenteller Teil - 5 Gerbstofffällungsassay 157

5 Gerbstofffällungsassay

5.1 Allgemeines

Zunächst wurde das Enzym mit einer Aktivität von 100 IE/ml der Substanzbibliothek,

zugeführt und 5 min inkubiert. Anschließend erfolgte durch Zugabe der Tanninlösung

eine Fällung, die abzentrifugiert wurde. Der Überstand wurde abdekantiert und

chromatographisch vermessen (A4). Der Rückstand wurde in isotonischer

Kochsalzlösung mit 10 % Ethanol resuspendiert und wiederum abzentrifugiert. Der

Überstand wurde wieder abdekantiert und vermessen, während der Rückstand ein

zweites Mal gewaschen wurde. Der daraufhin erhaltene Rückstand wurde in dem

Freisetzungsreagenz, welches auch für das Fischen verwendet wird, resuspendiert, mit

Polyvinylpyrrolidon (Polyclar AT) versetzt und 5 min mit Ultraschall behandelt.

Anschließend erfolgte wieder eine Zentrifugation und der Überstand wurde

chromatographisch vermessen.

5.2 Anwendungen

Der Gerbstofffällungsassay wurde zunächst mit einem bekannten Inhibitor aus der

3-Amidinophenylalaninreihe durchgeführt und dann mit Petroselinsäure als

Reinsubstanz. Anschließend wurde der Methanol-Pentanextrakt aus Koriander getestet.

Alle erhaltenen Lösungen sind chromatographisch (A4) vermessen worden.

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158 Experimenteller Teil - 6 Expression der GDH

6 Expression der GDH

6.1 Vorkultur

Unter einer Laminar-Flow-Box wurden etwa 80 ml sterilen LB-Mediums in einen

500 ml Erlenmeyerkolben gegeben und mit 80 µl Ampicillin-Lösung versetzt. Mit

einem sterilen Zahnstocher wurde eine kleine Menge der Glycerinkultur des

Bakterienstammes PA340/pQE60 entnommen und das Medium damit angeimpft. Dabei

wurde die ganze Zeit neben offener Gasflamme gearbeitet. Das Ganze wurde über

Nacht in einem Brutschrank bei 37°C und einer Geschwindigkeit von 265 rpm bewegt.

6.2 Expression

Am nächsten Tag wurden 4 x 500 ml 2 x YT-Medium nach Zugabe von 500 µl

Ampicillin-Lösung je Erlenmeyerkolben mit Medium mit jeweils 10 ml der Vorkultur

versetzt und bei 37°C und 280 rpm in den Brutschrank gestellt. Jede Stunde wurde die

optische Dichte bei 600 nm gemessen, bis sie ungefähr 0,7 betrug. Dann wurde die

Expression durch Zugabe von 500 µl IPTG-Lösung je Erlenmeyerkolben gestartet.

Nach drei Stunden wurde ein erster Aktivitätstest durchgeführt, wobei die Rückreaktion

bei pH = 7 verwendet wird. Diese ergab zwar eine etwas niedrige Aktivität, jedoch

wurde die Expression weitergeführt. Nach fünf Stunden wurde ein weiterer

Aktivitätstest durchgeführt, der eine sehr niedrige Aktivität zeigte. Trotz allem wurde

weitergearbeitet. Dazu wurden die Zellen bei 4°C und 10.000 rpm 30 min

abzentrifugiert.

6.3 Aufreinigung

Die Zellpelletts wurden in Puffer A resuspendiert und mit 200 µg je ml Lysozym und

20 µg je ml DNAse versetzt und 20 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend

wurden die Zellen dreimal 1 min per Ultraschall lysiert und wieder 30 min abzentri-

fugiert, diesmal bei 20.000 rpm. Der Überstand wurde gesammelt und ein Volumen von

etwa 275 ml ermittelt. Die Menge Ammoniumsulfat für eine 70 %ige Fällung wird

berechnet (MR x M x V/1000 = 122,46 g), abgewogen, im Mörser zermahlen und unter

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Experimenteller Teil - 6 Expression der GDH 159

langsamen Rühren zum Überstand gegeben. Die Lösung trübt sich allmählich, bis sie

zum Schluss ganz milchig aussieht. Die Fällung wird über Nacht bei Raumtemperatur

gelagert und am nächsten Morgen bei 4°C 20 min lang bei 20.000 rpm abzentrifugiert.

Anschließend wird in einer geringen Menge des Überstands resuspendiert und bei

4.400 rpm 1,5 h abzentrifugiert. Mit dem so erhaltenen Enzym wurde erneut ein

Aktivitätsassay durchgeführt, der immer noch viel zu geringe Aktivitäten aufwies.

Nachdem auch ausgeschlossen werden konnte, dass die eingesetzten Reagenzien nicht

mehr geeignet waren, wurden keine weiteren Aufreinigungsschritte mehr durchgeführt.

Die Expression wurde noch zwei weitere Male mit neuen Medien und Reagenzien bzw.

veränderten Mengen und verlängerter Expressionsdauer durchgeführt, jeweils mit dem

gleichen Ergebnis der geringen Aktivität. Durch die Verwendung eines anderen

Spektrometers konnte auch eine geringe Aktivität auf Grund einer Fehlfunktion

desselben ausgeschlossen werden. Da die Vorkulturen schon sehr dünn aussahen, wird

vermutet, dass die Glycerinkultur zu alt war und eine neue Transfektion erfolgen

müsste.

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160 Experimenteller Teil - 7 Identität der Fettsäuren

7 Identität der Fettsäuren

Die Pentan- und Hexanextrakte der Apiaceaenfrüchte wurden chromatographisch mit

einer Konzentration von 1 mg/ml vermessen (A4).

Da Fettsäuren als wirksame Komponente vermutet wurden, wurden die Extrakte

methyliert und gaschromatographisch (GC-MS) in der AG Glorius des Fachbereichs

Organische Chemie der Philipps-Universität Marburg vermessen.

Die Methylierung erfolgte nach der Methode von Morrison [151]. Dafür wurden die

Extrakte zunächst hydrolysiert, indem 1 mg des jeweiligen Extraktes mit 1 ml einer

0,5 N Natriumhydroxid-Lösung in Methanol versetzt und in druck- und hitzestabilen

Gefäßen für 45 min in kochendes Wasser gestellt wurde. Nach Abkühlen auf

Raumtemperatur erfolgte die eigentliche Methylierung, wofür jeweils 1 ml einer

10 %igen Bortrifluorid-Lösung in Methanol zugegeben und erneut 60 min im

kochenden Wasserbad erhitzt wurde. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurden die

Lösungen erst mit 1 ml Wasser versetzt und anschließend mit 2 ml Pentan

ausgeschüttelt. Die Pentanphase wurde vom Lösungsmittel befreit und sofort in 200 µl

Hexan gelöst. Dies stellte die Untersuchungslösung für die gaschromatographische

Vermessung dar. Als Referenzsubstanzen wurden die Methylester der Linolen-, Linol-,

Öl-, Stearin-, Palmitin- und Petroslinsäure ebenfalls gelöst in Hexan vermessen.

Weiterhin wurde auch bei uns im Arbeitskreis eine HPLC-MS durchgeführt (A5). Dafür

wurde der Methanol-Pentanextrakt aus Korianderfrüchten in einer Konzentration von

1 mg/ml in Acetonitril gelöst.

Für das Spiken wurden Lösungen aus den Reinsubstanzen von Linol-, Linolen-, Öl- und

Petroselinsäure in einer Konzentration von 1 mg/ml einer 10%igen Ethanol-Lösung

hergestellt. Es wurden einzeln jeweils 10 µl einer Lösung zum Methanol-Pentanextrakt

aus Korianderfrüchten gegeben und chromatographisch vermessen (A4).

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ANHANG

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Anhang A 161

Anhang A

Aus der vorliegenden Arbeit sind folgende Beiträge hervorgegangen:

„Orale“ Posterpräsentation:

An, P. K., Rack, C., Matusch, R., 2004. Fishing of ligands with human thrombin in

libraries. DPhG Jahrestagung 2004 (Regensburg).

Poster:

An, P. K., Matusch, R., 2005. First hints by fishing of ligands with human thrombin in

plant extracts. DPhG Jahrestagung 2005 (Mainz)

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162 Anhang B

Anhang B

Fosmidomycin:

O

N PO3H

2H

OH

FR900098:

O

N PO3H

2CH3

OH

N-[3-(3,4-Dichlorphenyl)-butyl]-N-hydroxyacetamid:

O

N PO3H

2CH3

Cl

Cl

OH

Clomazone:

N

O

O

CH3

CH3

Cl

Das Enzym DXR, der Inhibitor Fosmidomycin sowie das Herbizid Clomazone sind

freundlicherweise von der Firma Jomaa Pharmaka GmbH, Gießen zur Verfügung

gestellt worden.

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Anhang B 163

Das Enzym GDH wurde freundlicherweise von Christof Werner, ehemals AG Klebe,

Philipps-Universität Marburg zur Verfügung gestellt.

Das Enzym Thrombin (human) wurde freundlicherweise von Dr. Hartmut Landgrebe,

Firma Aventis Behring, Marburg zur Verfügung gestellt.

Die eingesetzten Thrombin-Inhibitoren aus der 3-Amidinophenylalaninreihe wurden

freundlicherweise von Dr. Jörg Stürzebecher, Klinikum der Universität Jena, Erfurt zur

Verfügung gestellt.

Übersicht über die Thrombin-Inhibitoren:

Inhibitor V1: 3-[3-(4-Methansulfonylpiperazin-1-yl)-2-(naphthalen-2-sulfonylamino)-3-

oxo-propyl]-benzamidin-hydrochlorid

Ki = 0,0021 µmol/l

CH2

NH2

NH

C C

H

NH

2 O

N N SO2

ClH*

SO2 CH

3

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164 Anhang B

Inhibitor V2: 3-[2-(Naphthalen-2-sulfonylamino)-3-oxo-3-piperidin-1-yl-propyl]-benz-

amidin-hydrochlorid

Ki = 0,065 µmol/l

CH2

NH2

NH

C C

H

NH

2 O

N

ClH*

SO2

Inhibitor V3: 3-[3-Oxo-3-piperidin-1-yl-2-(toluene-4-sulfonylamino)-propyl]-

benzamidin-hydroiodid

Ki = 0,34 µmol/l

CH2

NH2

NH

C C

H

NH

2 O

N

IH*

SO2

CH3

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Anhang B 165

Inhibitor V4: N-[1-(3-Carbamimidoylbenzyl)-2-oxo-2-piperidin-1-yl-ethyl]-2-toluen-4-

sulfonylamino)-acetamid-hydrochlorid

Ki = 8,9 µmol/l

CH2

NH2

NH

C C

H

NH

O

CCH

2

NH

2 O

N

ClH*

SO2

CH3

Arzneistoffe der Substanzbibliothek:

Amitriptylin

CH CH2 CH2 N(CH3)2

Bromhexin

Br

Br NH2

CH2 N

CH3

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166 Anhang B

Chlorpromazin

N

S

Cl

CH2 CH2 CH2 N(CH3)2

Diphenhydramin

(H5C6)2CH O CH2 CH2 N(CH3)2

Homatropinhydrobromid

N

O C CH

OH

O

C6H5

H3C

H+

-Br

Homatropinhydrobromid

Lidocain

CH3

CH3

NH CO CH2 N(C2H5)2

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Anhang B 167

Metoclopramid

Cl

NH2

OCH3

CO NH (CH2)2 N(C2H5)2

Metoprolol

(CH2)2H3CO O CH2 CH CH2

OH

NH CH CH3

CH3

Neostigmin

O CO N(CH3)2

N(CH3)3+

-OH

Orciprenalin

HO OH

CHHO CH2 NH CH(CH3)2

Warfarin

O O

OH

CH CH2 C CH3

O

C6H5

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168 Anhang B

Betrachtete Fettsäuren:

Petroselinsäure (6c-18:1):

CO2H

Ölsäure (9c-18:1):

CO2H

cis-Vaccensäure (11c-18:1):

CO2H

α-Linolensäure (9c, 12c, 15c-18:3):

CO2H

Stearidonsäure (6c, 9c, 12c, 15c-18:4):

CO2H

Arachidonsäure (5c, 8c, 11c, 14c-20:4):

CO2H

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Anhang B 169

Getestete COX2-Hemmer:

Acetylsalicylsäure:

OH

O

CH3

O

Diclofenac:

OH

O

NH

Cl Cl

Ibuprofen (Racemat):

CH3

O

OH

CH3

CH3

*

O

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170 Anhang B

Indometacin:

N

OH

O

CH3

O

Cl

OCH

3

Mefenaminsäure:

OH

O

NH

CH3

CH3

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Lebenslauf

21.06.1974 Geboren in Berlin

1980 – 1986 Zinnowwald-Grundschule in Berlin

1986 – 1993 Arndt-Gymnasium Dahlem in Berlin

06/1993 Allgemeine Hochschulreife

06/1993 – 09/1993 Koreanisch-Sprachkurs für Fortgeschrittene in Südkorea

04/1995 – 05/1999 Studium der Pharmazie an der Humboldt-Universität zu Berlin

07/1995 – 08/1995 8-wöchige Famulatur in der Sundgau-Apotheke in Berlin

07/1995 – 05/1999 Studiumsbezogene Tätigkeiten in der Sundgau-Apotheke in Berlin

03/1997 1. Abschnitt der Pharmazeutischen Prüfung

08/1996, 09/1998 zwei freiwillige 2-wöchige Praktika in der Krankenhausapotheke des

Krankenhauses Krankenhaus Zehlendorf (ö. B. Heckeshorn) in Berlin

04/1999 2. Abschnitt der Pharmazeutischen Prüfung

05/1999 – 11/1999 Praktisches halbes Jahr in der Krankenhausapotheke des Krankenhauses

Krankenhaus Zehlendorf (ö. B. Heckeshorn) in Berlin

12/1999 – 05/2000 Praktisches halbes Jahr in der Sundgau-Apotheke in Berlin

08/2000 3. Abschnitt der Pharmazeutischen Prüfung

09/2000 Approbation als Apothekerin

10/2000 Beginn der vorliegenden Promotion im Arbeitskreis von

Prof. Dr. R. Matusch an der Philipps -Universität Marburg auf dem

Gebiet der Naturstoffanalytik

10/2000 – 12/2000 Wissenschaftliche Hilfskraft an der Philipps-Universität Marburg;

Betreuung des Praktikums „Instrumentelle Analytik“

01/2001 – 03/2006 Wissenschaftliche Mitarbeiterin an der „Philipps-Universität Marburg“;

Betreuung des Praktikums „Instrumentelle Analytik“ und

organisatorische Leitung des Praktikums von April 2004 bis März 2006