Organellenpräparation aus Saccharomyces cerevisiae Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl,...

ZellfraktionierungOrganellenpräparation aus Saccharomyces

cerevisiae

Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch

Anzucht der Zellen auf unterschiedlichen Nährmedien Ernten Aufschluss der Zellen: enzymatisch und mechanisch Isolierung + Reinigung der Fraktionen

◦ Mitochondrien◦ Mikrosomen

Proteinbestimmung nach Lowry Markerenzymmessungen

◦ NADPH-Cytochrom c-Reduktase (Mikrosomen)◦ Succinatdehydrogenase (Mitochondrien)

Quantitative Bestimmung der Cytochromen


Durchführung

Puffer A (Dithiothreitol)◦ Di-Sulfidbrücken werden dadurch aufgebrochen (Vorbereitung für Zymolyasezugabe)

Puffer B ( Sorbit) & Puffer C ( Mannit)◦ Damit der osmotische Druck stabil bleibt

Zymolyase◦ Enzym zum Abbau von Zellmembran

Phenylmethylsulfonylfluorid◦ Inhibiert proteolytische Abbaureaktionen

Triton X-100◦ Detergenz löst Membranlipide

Phenanzinmethosulfat◦ Mediator zur Wasserstoffübertragung, verstärkt die ReaktionBernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara

Treusch

Reagentien


Messung durcho Aktivitätsenzym, welches nur in spezifischen Organell einer Zelle eine

Reaktion hervorruft

o Immunologische Charakterisierung

o Identifizierung von Zellfraktionen durch charakteristische Proteine mittels Elektrophorese

o Elektronenmikroskopie, Bestimmte Strukturen und Dichte sind spezifisch für das jeweilige Organell.

Aktivitätsmessung


Unterschiede der NährmedienLactat Glucose

Aerob Citratzyklus + Oxidative

Phosphorylierung Mitochondrien Bis zu 12 ATP / Lactat Niedrigere Zellausbeute zu

erwarten

Anaerob, aber auch unter aeroben Bedingungen

Glycolyse + Fermentation zur Energiegewinnung bevorzugt

Cytosol 2 ATP / Glucose Pasteur-Effekt Crabtree-Effekt Höhere Zellausbeute zu

erwarten


Lactat -> Pyruvat liefert keine Energie, deshalb erfolgt keine Fermentation sondern eine aerobe Verstoffwechselung durch den Citratzyklus

Citratcyclus & Fermentation im Vergleich


• Umsetzung von Lactat zu Pyruvat mit Cytochrom b2

Citratcyclus & Fermentation im Vergleich 2


Unterschiede im Zellaufbau

Lactat Glucose

Atmungskette findet in den Mitochondrien statt- dadurch vermehrte Mitochondrien-Bildung

Höherer Anteil an ß-1,6-Glucan (verursacht langsameren Verdau) in der Zellwand◦ 50 min. bei 30°C mit Zymolyase

Fermentation findet im Endoplasmatischen Reticulum statt- dadurch vermehrte Mikrosomen-Bildung

Niedrigerer Anteil an ß-1,6-Glucan◦ 30 min. bei 30°C mit halber

Zymolyase-Menge


Ablesen der Proteinmenge in der Messküvette aus gegebener Kalibrationskurve (c[µg/2,6mL] gegen Absorption)

Proteinbestimmung nach Lowry

Probe [µl] f E546 Blindwert E546

korr. Proteinmenge (Kalibration)

Protein [mg/mL]

Homogenat 15 10 0,212 0,088 0,124 25 16,67

Mitochondrien 15 2 0,221 0,088 0,133 26 3,47

Mikrosomen 15 5 0,231 0,088 0,143 29 9,67


Benötigte Werte:

◦ Aktivität ([ΔE/min], entspricht

der Steigung), in dem Bereich,

in dem die Steigung maximal

ist!- umrechnen in Minuten

◦ Volumen der

Organellenfraktionen

◦ Proteinkonzentration in der

jeweiligen Fraktion

Markerenzymbestimmung

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.60

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

f(x) = 0.0174479876160991 x + 0.0550960533195735R² = 0.999601279646301

f(x) = 0.0234495337650324 x + 0.0792991322849214R² = 0.999659799676429

Aktivitätsbestimmung NCCR Homogenat

[min]

Ab

s


Spezifische Aktivität [(ΔE/min)/mg]

Gesamtaktivität der Fraktion [ΔE/min]

Markerenzyme- Aktivitätsberechnungen


Ausbeute

Anreicherungsfaktor

Kreuzkontamination

Markerenzyme- Reinheitsbestimmung


Mittels Lambert-beer‘schem Gesetz Wellenlängenpaar λBasis/λMax zur Bestimmung von ΔE

Quantitative Cytochrombestimmung

λBasis/λMax [nm] ε [l/(mmol*cm)]

Cytochrom aa3 602/627 24,0

Cytochrom b 562/576 25,5

Cytochrom c/c1 550/533 19,2


Bestimmung erfolgt über Differenzspektrum der α-Banden

ΔE…Extinktionsunterschied zw. λmax und λBasis

Cytochrom- Berechnung

ε Proteinkonzentration[mg/ml] Eλmax,α Ebasis ΔE c (Messlsg.)

[mmol/l]c (Mit.-Susp.)

[nmol/mg]

Cytochrom aa3 24 3,6590,012794

-0,00115 0,0139 5,810E-04 0,1588

Cytochrom b 25,5 3,6940,076551

0,047876 0,0287 1,125E-03 0,3044

Cytochrom c+c1 19,2 3,6590,088646

0,018298 0,0703 3,664E-03 1,0015


Verdünnungen beachten

Einheiten

Taschenrechner

Schummelzettel

Nicht vergessen!


Danke für die Aufmerksamkeit

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