PARTIE III : RESULTATS A/ ETUDE DES REPONSES ANTICORPS...

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PARTIE III : RESULTATS

A/ ETUDE DES REPONSES ANTICORPS LIEES

AUX CANDIDATS VACCINS (TESTS ELISA)

1) Prévalence des candidats vaccins : MSP1p19, MSP4p20, MSP5 et R23

L’objectif de cette thèse est d’étudier la fonctionnalité dans la réponse immunitaire des Ac

associées aux différents candidats vaccins. Cependant, au préalable, il est essentiel d’analyser

la prévalence et les caractéristiques de leurs réponses Ac associées. Ces analyses sont

réalisées pour les sérums de tous les villageois prélevés lors de la série en double transversale.

La répartition des Ac ayant pour cibles les candidats vaccins étudiés doit être analysée en

fonction des paramètres qui seront étudiés dans les tests de fonctionnalité. Il s’agit de

l’influence de la zone d’endémie, l’âge, la parasitémie circulante, l’hémoglobine mais

également la relation avec la protection clinique observée sur le terrain.

Tous les résultats présentés ici sont donc des compléments d’analyses sérologiques

approfondies.

1.1) Prévalence pour toute la population d’étude

La première des observations à faire concerne la validation des densités optiques (DO)

observées et donc des tests ELISA réalisés. Il est usuellement reconnu que pour tester les

réponses Ac contre les candidats vaccins en zone d’endémie, la dilution 1/200 est la plus

appropriée (Aribot, 1996) (Perraut, 2005 A). Cette dilution a donc été utilisée et les DO ainsi

obtenues sont comprises entre 0 et 1,962 pour MSP1p19, 0 et 2,378 pour MSP4p20, 0 et

1,696 pour MSP5 et 0 et 2,112 pour R23. Ces DO sont donc toutes inclues dans une même

gamme de réponse, gamme validant l’utilisation de cette dilution car étant suffisamment large

tout en n’atteignant pas le seuil maximal de détection de 3,5. Les 221 sérums issus des

habitants de Ndiop et les 186 issus de ceux de Dielmo ont été testés en duplicata à cette

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dilution pour ces quatre Ag. Ils ont été également testés contre la GST, les DO obtenues étant

à soustraire à celles de la protéine recombinante R23 afin d’analyser uniquement les réponses

inhérentes au fragment R23 de la construction vaccinale.

Les DO n’étant pas des données standardisées et pouvant fluctuer d’une plaque à l’autre et

d’une série de tests à l’autre, elles sont difficilement analysables en tant que telles. Aussi,

nous avons utilisé des unités basées sur des calculs d’unités arbitraires et de ratios de DO. Les

unités arbitraires permettent de travailler par rapport à une référence positive fixée

arbitrairement à 100 - contrôle positif SHI -. Les ratios de DO (rDO) permettent quant à eux

de standardiser les réponses par rapport à des contrôles négatifs. Cette dernière technique de

standardisation des résultats est largement utilisée sur le plan international et reconnue comme

fiable.

Les résultats globaux obtenus - minimum, maximum, médiane, moyenne - pour les DO, unités

et rDO sont présentés dans le tableau V, ainsi que la prévalence observée et l’analyse

statistique des différences entre les deux villages.

Les unités arbitraires utilisées permettent de pouvoir visualiser le niveau de réponse des

sérums et les classer selon ce critère. On peut constater que, pour chaque candidat vaccin

étudié, on trouve des sérums présentant des taux d’Ac plus élevés que le standard positif SHI.

Un maximum de 130,2 unités arbitraires est observé pour MSP1p19, 131,5 pour MSP4p20,

123,9 pour MSP5 et 166,3 pour R23. Ces unités ont été utilisées, entre autre, pour

sélectionner rapidement les sérums à dépléter : valeur supérieure à 80 et si possible à 100.

Cependant, elles présentent également des inconvénients. Le standard positif n’ayant pas

initialement la même valeur pour les différents candidats vaccins, les unités sont relatives et

ne sont pas comparables d’un Ag à l’autre. Ce phénomène est moins visible avec des ratios de

DO. De plus, l’utilisation d’un contrôle « positif » trop bas par rapport à l’Ag étudié - le SHI a

un taux relativement faible en Ac contre R23 et MSP5 - peut entraîner des résultats d’analyses

statistiques contradictoires avec ceux calculés en rDO. C’est le cas par exemple pour MSP5.

Les moyennes observées dans les 2 villages sont de 24,8 et 32,2 unités et les valeurs obtenues

en unités pour les 2 villages sont statistiquement différentes par le test de Mann Withney -

P <0,0001 -. A l’inverse, les rDO calculés ont une moyenne très proche - 4,31 et 4,30 -, avec

toutefois une médiane différente - 2,71 et 3,31 -. La différence de réponses entre les 2 villages

est finalement non significative - P = 0,07 -.

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Ndiop Dielmo Ndiop Dielmo Ndiop Dielmo Ndiop Dielmo Ndiop Dielmo

médiane 0,805 0,545 1,113 1,196 0,163 0,316 0,053 0,049 0,111 0,133

moyenne 0,858 0,673 1,090 1,132 0,271 0,414 0,211 0,218 0,118 0,144

maximum 1,962 1,720 2,378 2,112 1,462 1,696 1,650 2,112 0,625 0,439

minimum 0,000 0,006 0,000 0,000 0,001 0,007 0,000 0,000 0,000 0,013

médiane 51,4 40,2 62,6 72,2 15,8 24,9 4,9 3,8

moyenne 54,6 47,5 61,7 69,3 24,8 32,2 19,3 17,1

maximum 126,6 130,2 131,3 131,5 123,1 123,9 151,7 166,3

minimum 2,2 0,8 3,0 2,1 1,0 1,3 0,0 0,0

médiane 8,69 5,31 6,76 8,64 2,71 3,31 1,00 1,00

moyenne 9,26 6,68 6,72 8,22 4,31 4,30 2,71 2,34

maximum 19,91 16,91 14,74 14,98 22,83 17,11 18,01 17,62

minimum 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00

prévalence 86% 73% 78% 88% 66% 74% 30% 24%

P (Mann Withney)

NS<0,0001

MSP5 R23 GST

0,0005 NS

MSP4p20

DO

rDO

unités

MSP1p19

Tab

leau

VI :

Réc

apitu

latif

des

DO

, uni

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DO

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ersa

le. (

NS

= n

on s

igni

ficat

if)

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Les unités arbitraires sont donc un outil d’aide à la visualisation des amplitudes de réponses

Ac mais ne permettent la réalisation d’études statistiques que si elles sont déterminées sur la

base d’un contrôle positif commun élevé - ce qui est le cas de MSP4 -.

C’est la raison pour laquelle toutes les analyses présentées dans la suite de cette partie auront

été effectuées à l’aide des rDO. En observant les résultats obtenus dans le tableau VI et leur

représentation en box-plot à la figure 19, il est très clair que tous les Ag candidats vaccins ne

sont pas reconnus de façon similaire par les Ac du système immunitaire de personnes vivant

en zone d’endémie.

Figure 19 : Distribution des valeurs de ratios de DO associés aux quatre candidats vaccins

dans les 2 sites d’étude

Pour ce qui est des MSP, les trois protéines recombinantes testées ont toutes les trois la

caractéristique d’être très bien reconnues par les populations vivant en zone d’endémie, que

ce soit méso- ou holo-endémie. En effet, les prévalences observées sont respectivement pour

Ndiop et Dielmo, de 86% et 73% pour MSP1p19, de 78% et 88% pour MSP4p20 et de 66% et

74% pour MSP5.

Pour deux de ces trois Ag, MSP4p20 et MSP5, le nombre de répondeurs est plus élevé en

zone d’holoendémie. Cette différence est observée de façon significative pour MSP4p20 - P =

0,0005 -. La situation inverse est observée pour MSP1p19, avec une meilleure réponse en

zone de mésoendémie - P < 0,0001 -.

Cependant, malgré ces fortes prévalences, les profils Ac sont différents pour ces trois

constructions vaccinales.

70

MSP1p19, avec une moyenne de rDO de 9,26 à Ndiop, est l’Ag le mieux reconnu en terme

d’intensité de réponse. Cependant, une très nette différence entre Ndiop et Dielmo est

observée. A Dielmo, la moyenne des réponses n’est que de 6,68, valeur nettement plus faible

mais restant tout de même élevée. Cette différence de réponse entre les deux zones est très

significative - P <0,0001 - et évolue dans le même sens que le nombre de répondeurs. Aussi,

il apparaît paradoxalement que les habitants de zone de mésoendémie, dans cette étude,

répondent plus fortement que ceux résidant en zone d’holoendémie à MSP1p19 au même

moment.

Pour MSP4p20, nous observons la situation inverse. Avec une moyenne de 6,72 à Ndiop

contre 8,22 à Dielmo, ce sont les habitants des zones d’holoendémie qui sont les plus forts

répondeurs, ce qui coïncide également avec la prévalence observée. Cette différence de profil

est également très significative - P = 0,0005 -. L’intensité des réponses Ac contre cet Ag est

également très élevée, soulignant MSP4p20 comme un Ag majeur de P. falciparum, de

manière aussi importante que MSP1p19.

Concernant la réponse anti-MSP5, nous n’observons pas de différence de moyenne de

réponses et la répartition est très similaire dans les deux villages. Le test de Mann Withney

donne un résultat non significatif - P = 0,07 - lorsque l’on compare les réponses Ac mesurées

dans les deux zones. La prévalence reste cependant élevée, comme nous l’avons vu mais

l’intensité des réponses est plus faible que pour les deux autres MSP, avec une moyenne de

réponse à 4,3. C’est donc un Ag bien reconnu par les populations des zones d’endémie mais

induisant un niveau de réponse Ac plus modéré.

La réponse anti-R23 est très différente des réponses anti-MSP. En effet, 75% des réponses

sont nulles ou quasi nulles, avec une médiane égale à 1,0 pour les deux villages - ce qui

correspond à la valeur la plus faible possible - et une moyenne de 2,71 à Ndiop et 2,34 à

Dielmo. Ces moyennes sont excessivement faibles sachant que l’on considère un sérum

comme répondeur si son ratio de DO dépasse la valeur de 2. La prévalence observée y est

donc faible, à savoir 30% à Ndiop et 24% à Dielmo. Cependant, on observe un taux assez

important de sérums présentant une très forte réponse anti-R23, allant jusqu'à 18,1. Il

semblerait qu’avec cet Ag on observe deux grands profils de réponse : soit une absence de

production d’Ac anti-R23, correspondant à la très grande majorité des cas, soit au contraire

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Ndiop Dielmo Ndiop Dielmo Ndiop Dielmo

rho 0,39 0,23 0,49 0,4 0,58 0,37

P <0,0001 0,002 <0,0001 <0,0001 <0,0001 <0,0001

rho 0,23 - 0,5 0,44

P 0,0006 NS <0,0001 <0,0001

rho 0,3 0,24

P <0,0001 0,001

MSP1p19

MSP4p20

MSP5

R23 MSP4p20MSP5

une production en quantité importante. Il n’y a pas de différence significative - P = 0,11 -

observée entre les deux zones d’endémie.

Les analyses de colinéarité des réponses Ac associées à ces différents Ag ont été faites en

utilisant le test de corrélation de Spearman et sont résumées sur le tableau VII. Globalement,

les réponses anti-MSP sont liées, avec un pourcentage de corrélation compris entre 37% et

58% selon les Ag et les villages. Nous notons également que R23 induit une réponse Ac

colinéaire avec celles des MSP, sauf avec les IgG anti-MSP4p20 à Dielmo - P = 0,47 -,

Tableau VII: Colinéarités entre les réponses antigéniques liées aux différents

candidats vaccins étudiés

1.2) Impact des classes d’âge sur les réponses anticorps

Après l’analyse des réponses globales pour les deux zones d’endémie étudiées, les taux d’Ac

doivent être étudiés en fonction des caractéristiques des populations.

La première des analyses à réaliser est celle portant sur le lien avec l’âge ou plus précisément,

avec les classes d’âge prédéfinies comme correspondant à des stades d’acquisition de

l’immunité (McGregor, 1952) (Rogier, 1993) (Perraut, 2005 B).

� La classe 1 est celle des plus jeunes - moins de 15 ans à Ndiop et moins de 6 ans à

Dielmo -. L’immunité contre les cas graves de la maladie est en cours d’acquisition.

� La classe 2 correspond quant à elle à des individus plus âgés mais encore relativement

jeunes - 15 à 29 ans à Ndiop et 6 à 14 ans à Dielmo -. Ils ont déjà acquis cette immunité

contre les cas graves et une immunité contre les fortes parasitémies est en train de s’établir.

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Ndiop Dielmo Ndiop Dielmo Ndiop Dielmo Ndiop Dielmo

médiane 3,98 2,86 3,81 8,14 2,34 4,15 1,00 1,00

moyenne 6,34 3,61 5,34 8,18 3,84 4,91 1,85 1,36

prévalence 82% 68% 66% 84% 58% 79% 17% 11%

médiane 11,98 2,04 8,86 10,12 2,61 2,81 1,00 1,00

moyenne 10,37 3,83 8,00 8,86 4,24 3,35 2,55 1,87

prévalence 88% 50% 83% 86% 63% 67% 36% 19%

médiane 13,43 7,30 8,05 8,37 3,05 3,58 1,31 1,00

moyenne 11,76 7,91 7,14 8,05 4,96 4,47 3,93 2,61

prévalence 90% 80% 87% 89% 78% 76% 42% 28%

<0,0001 <0,0001 0,0009 NS NS NS 0,0002 NS

MSP5 R23

classe 1

MSP1p19

classe 2

classe 3

p (Kruskal Wallis)

MSP4p20

� La classe 3 - plus de 30 ans à Ndiop et plus de 15 ans à Dielmo - correspond aux

adultes ayant acquis ces 2 types d’immunité.

Les réponses ELISA obtenues selon ces classes d’âge sont représentées par le tableau VIII et

la figure 20.

Tableau VIII : Réponses Ac (rDO) par village et par classe d’âge

Figure 20 : Répartition des réponses Ac (rDO) par village et par classe d’âge

Deux remarques saillantes peuvent être soulignées d’emblée au vu de ces résultats - ie sans

analyse statistique -.

� Globalement, pour les quatre constructions vaccinales, les plus fortes incidences de

répondeurs sont observées chez les adultes ayant acquis une prémunition (classe 3). Pour

Ndiop et Dielmo respectivement, on observe des taux de réponses positives de 90% et 80%

Dielmo Ndiop

73

pour MSP1p19, 87% et 89% pour MSP4p20, 78% et 76% pour MSP5 et 42% et 28% pour

R23. Mais ils présentent également les plus hautes intensités de réponses, avec des moyennes

qui sont respectivement pour Ndiop et Dielmo de 11,76 et 7,91 pour MSP1p19, de 7,14 et

8,05 pour MSP4p20, de 4,96 et 4,47 pour MSP5 et de 3,93 et 2,61 pour R23. Cela est valable

dans les deux villages pour tous les Ag, à l’exception de MSP5 à Dielmo où les réponses des

classes 1 et 3 sont sensiblement les mêmes. Un avantage pour la classe 1 est même noté, celle-

ci présentant en effet un taux de répondeurs de 79% et une moyenne de 4,91.

� La réponse anti-MSP1p19 augmente très fortement avec l’âge, les classes 1 ayant des

réponses ne dépassant pas 9 et 4,5 dans 75% des cas à Ndiop et Dielmo respectivement, alors

que pour les classes 3 le troisième percentile atteint des valeurs de l’ordre de 17 et 12,5

respectivement.

En utilisant le test de Kruskal-Wallis pour déterminer statistiquement la dépendance de la

réponse par rapport à l’âge, on note que malgré les conclusions que l’on pouvait tirer en

première approche, la dépendance à l’âge observée n’est pas toujours significative.

En ce qui concerne la réponse Ac anti-MSP1p19, la dépendance à l’âge est bien

statistiquement significative - P < 0,0001 pour les 2 villages - et les médianes et moyennes

sont en augmentation notable au fur et à mesure que l’immunité s’acquiert. Mais au lieu de

trois groupes bien distincts, il y en aurait plutôt deux dans les deux villages et ceux-ci ne

seraient pas les mêmes. A Ndiop, la réponse évolue énormément entre la classe 1 et la classe 2

- médiane à 3,98 et 11,98 et moyenne à 6,34 et 10,37 respectivement -, et moins entre la

classe 2 et la classe 3 - médiane à 11,98 et 13,43 et moyenne à 10,37 et 11,76 respectivement -

. A Dielmo, les classes 1 et 2 ont des caractéristiques similaires - médiane à 2,86 et 2,04 et

moyenne à 3,61 et 3,83 respectivement -, mais une très nette différence est observée entre les

classes 2 et 3 - médiane à 2,04 et 7,3 et moyenne à 3,83 et 7,91 respectivement -. Cette

différence de profil est d’autant plus étonnante que si l’on considère l’âge « charnière », il est

le même dans les deux cas, à savoir 15 ans. Cela correspond bien à l’âge défini selon les

critères cliniques pour Ndiop mais pour Dielmo, celui-ci n’est que de 6 ans.

La réponse Ac contre MSP4p20 est quant à elle différente dans les deux villages. A Ndiop, la

dépendance à l’âge est significative - P = 0,0009 - et l’on observe une très nette augmentation

du nombre de répondeurs avec l’âge. Celui-ci passe de 66% pour la classe 1 à 83% pour la

classe 2 et 87% pour la classe 3. Cependant, au niveau des médianes et moyennes, c’est la

74

classe 2 qui présente les intensités les plus élevées avec respectivement 8,86 et 8,00, contre

8,05 et 7,14 pour la classe 3. La classe 3, correspondant à l’acquisition de l’immunité anti-

parasite, semble donc correspondre au pic d’Ac anti-MSP4p20 en zone de mésoendémie. A

Dielmo, la dépendance à l’âge n’est plus considérée comme significative - P = 0,57 - et les

taux de répondeurs et leurs intensités de réponses sont sensiblement les mêmes avec

respectivement pour les trois classes : 84%, 86% et 89% de répondeurs et 8,18, 8,86 et 8,05

de moyenne. Cependant bien que non significatif, le profil observé à Ndiop est valable à

Dielmo avec une classe 2 présentant les plus fortes médianes et moyennes : 10,12 et 8,86,

contre 8,37 et 8,05 respectivement pour la classe 3.

S’agissant des Ac anti-MSP5, la dépendance à l’âge n’est pas significative dans les deux

villages en tenant compte de la correction de Bonferroni qui diminue la valeur seuil à 0,01 -

P = 0,045 à Ndiop et 0,24 à Dielmo -.

Enfin, la réponse anti-R23 présente un profil remarquable à Ndiop. Le taux de répondeurs

passe de 17% à 42% soit un nombre de répondeurs plus que doublé entre la classe 1 et la

classe 3. De plus cette dépendance avec l’âge est statistiquement significative - P = 0,0002 -.

La médiane n’est plus à sa valeur minimale pour la classe 3 - 1,31 - et la moyenne passe de

1,85 à 3,93. En zone de mésoendémie, l’acquisition d’Ac anti-R23 semble donc très nettement

dépendre de l’immunité anti-parasite et non pas de l’immunité anti-formes graves. Le même

profil est observable à Dielmo mais de façon non significative - P = 0,3 -, la médiane ne

décollant jamais de 1,0. Cependant le nombre de répondeurs passe de 11% à 28%, ce qui est

également plus que doublé, bien que restant très faible, et la moyenne de 1,36 pour la classe 1

à 2,61 pour la classe 3.

1.3) Impact de la parasitémie circulante sur les réponses anticorps (Dielmo)

Dans cette analyse, nous avons considéré uniquement les prélèvements des habitants de

Dielmo. Les individus sains ou avec une parasitémie circulante y sont en quantité quasi-

similaire - 54% et 46% respectivement -. A Ndiop, les personnes parasitées sont très

minoritaires - 17% - et les personnes avec une parasitémie relativement élevée quasiment

inexistantes - 2% -, minorant considérablement la représentativité de la variable « parasites

circulants » dans ce village.

Les résultats observés à Dielmo sont présentés sur le tableau IX et la figure 21.

75

MSP1p19 MSP4p20 MSP5 R23

médiane 8,03 8,76 3,99 1,00

moyenne 8,40 8,23 4,60 2,71

prévalence 82% 88% 76% 29%

médiane 4,00 8,37 2,86 1,00

moyenne 4,89 7,66 3,98 2,01

prévalence 67% 86% 75% 20%

médiane 2,47 11,03 2,66 1,00

moyenne 3,89 9,24 4,17 1,43

prévalence 59% 86% 64% 14%

<0,0001 NS NS NSP (Kruskal Wallis)

0

F1+F2

F3+F4+F5

Tableau IX : Réponses anticorps en fonction de l’importance de la parasitémie circulante

asymptomatique à Dielmo.

Figure 21 : Répartition des réponses Ac en fonction de l’importance de la parasitémie

circulante asymptomatique à Dielmo.

Globalement, nous observons une baisse du nombre de répondeurs au fur et à mesure que la

parasitémie circulante augmente. Pour MSP1p19, les personnes non parasitées répondent

avec une prévalence de 82%, contre 67% pour les faiblement parasitées et 59% seulement

pour les personnes avec une parasitémie conséquente. Pour MSP5, nous observons

respectivement une prévalence de 76%, 75% et 64%. Quant à R23, le taux de répondeurs est

respectivement de 29%, 20% et de seulement 14% pour les individus avec une parasitémie de

type F3 et plus. Cependant, ces différences entre les groupes ne sont significatives que pour

MSP1p19 - P < 0,0001 -, le test de Kruskal Wallis ne donnant pas de résultat concluant pour

MSP5 et R23 - P = 0,28 et 0,29 respectivement -. MSP4p20 présente quant à lui la

76

Ndiop Dielmo Ndiop Dielmo Ndiop Dielmo Ndiop Dielmo

médiane 8,73 5,69 6,91 8,82 2,71 3,31 1,00 1,00

moyenne 9,27 6,94 6,68 8,32 4,23 4,35 2,47 2,40

prévalence 86% 74% 78% 89% 64% 74% 27% 25%

médiane 8,67 3,34 6,69 8,88 2,66 3,27 2,18 1,00

moyenne 9,15 5,20 6,98 7,95 4,84 4,11 4,20 2,10

prévalence 90% 64% 77% 86% 73% 71% 53% 14%

NS NS NS NS NS NS 0,002 NS

MSP1p19 MSP4p20 MSP5 R23

Hb AA et AC

Hb AS

P (Mann Withney)

particularité d’avoir un taux de répondeurs qui ne varie pratiquement pas avec la parasitémie -

de 88% à 86% - et aucune dépendance significative avec celle-ci n’est trouvée - P = 0,27 -.

En ce qui concerne les moyennes des réponses obtenues, c’est surtout contre les constructions

vaccinales MSP1p19 et R23 que l’on note une diminution très nette, les moyennes passant de

8,4 et 2,71 respectivement pour les personnes non parasitées à 3,89 et 1,43 pour les individus

avec une parasitémie relativement élevée. Aucune diminution franche n’est observée

concernant la réponse anti-MSP5 - de 4,6 à 4,2 -. En ce qui concerne la réponse Ac anti-

MSP4p20, la moyenne des réponses varie d’un groupe à l’autre de façon non significative

donc ininterprétable.

1.4) Impact de l’hémoglobine AS sur les réponses anticorps

Nous avons vu précédemment (cf partie I § 3.1) que l’hémoglobine des individus

drépanocytaires hétérozygote AS induit une protection naturelle partielle contre l’infection

palustre. Cela est dû, entre autre, à la forme des GR qui lui est liée. Mais cela n’est pas le seul

facteur générateur de protection et tous les autres facteurs contribuant à la résistance observée

ne sont peut être pas encore connus. Il est donc intéressant de visualiser les résultats Ac selon

les profils d’hémoglobine afin de détecter une éventuelle différence de réponse.

Les résultats sont présentés dans le tableau X.

Tableau X : Les taux d’anticorps suivant le type d’hémoglobine :

drépanocytaire hétérozygote AS ou normale

77

Pour les réponses anti-MSP, nous n’observons au vu de ces résultats aucune tendance globale,

les prévalences et intensités de réponses oscillant dans les deux sens suivant les

caractéristiques observées et les villages. Mais surtout, aucune de ces variations n’est

significative.

Pour les réponses Ac anti-R23, les deux villages donnent des résultats contradictoires.

Cependant, une différence significative entre les réponses Ac anti-R23 des individus AS

versus celles des individus « sains » est obtenue pour Ndiop (cf figure 22).

Figure 22 : Répartition des taux d’IgG spécifiques suivant le type d’hémoglobine à Ndiop

Dans ce village, la réponse anti-R23 augmente très fortement, la prévalence passant de 27% à

53% pour les personnes drépanocytaires AS - P = 0,002 -, taux dépassant tous ceux observés

jusqu’à présent pour l’Ag R23. Comme le montre la figure 22, l’augmentation de la réponse

en Ac anti-R23 est très nette. Le profil inverse est observé à Dielmo - diminution de 9% de la

prévalence - mais il n’est pas significatif - P = 0,99 -. Cependant, les profils observés à Ndiop

du point de vue de l’influence du type d’hémoglobine sont plus représentatifs que ceux

observés à Dielmo. En effet, la population drépanocytaire AS étudiée est deux fois plus

importante à Ndiop qu’à Dielmo - 14% contre 7,5% -.

2) Relations avec la protection clinique

Grâce au suivi médical permanent qui avait lieu sur les sites d’étude, les relations entre les

réponses Ac naturelles associées aux candidats vaccins et la protection clinique observée ont

pu être étudiées. Pour ce faire, des régressions de Poisson ont été réalisées afin de déterminer

les risques relatifs de faire des accès palustres sur les 5,5 mois suivant le prélèvement sanguin.

78

Les réponses en rDO liées aux candidats vaccins, l’âge, le type d’hémoglobine, la parasitémie

et le sexe ont été testés et analysés comme cofacteurs dans les modèles de régressions

multiples.

Le cofacteur « type d’hémoglobine » n’a été trouvé comme améliorant le modèle d’étude du

risque relatif de faire des accès palustres que rarement, et uniquement pour les habitants de

Dielmo. Quant aux cofacteurs « parasitémie » et « sexe de l’individu », ils n’ont jamais été

trouvés comme déterminants dans les modèles de Poisson liés aux candidats vaccins.

Les réponses Ac ont été analysées soit comme variable continue, soit dichotomisée, selon des

seuils définis compte tenu de la distribution des données. Pour chaque Ag et chaque zone

d’endémie, le modèle le plus représentatif a été recherché selon les critères d’Akaïké (AIC).

Les corrélations ont été étudiées dans les deux villages.

Cependant, les relations obtenues pour le village de Ndiop sont les plus significatives pour

cette étude. En effet, le nombre d’accès palustres y est plus important et leur répartition plus

large permet une meilleure analyse statistique. A Ndiop, pour 203 personnes répondant aux

critères de suivi régulier, 199 accès palustres ont été recensés, soit une incidence totale

moyenne de 6,64 accès/1000pers/jour - l’incidence est le nombre d’accès palustres divisé par

le nombre de jours de suivi -. A Dielmo, seulement 51 accès palustres ont été répertoriés, pour

163 personnes. Cela représente une incidence de 1,99 accès/1000pers/jour, soit 3,3 fois plus

faible qu’à Ndiop.

2.1) Corrélations observées à Ndiop, zone de mésoendémie

Dans le village de Ndiop, le risque d’accès palustres par tranche d’âge pour les 5,5 mois

étudiés - de mi-juillet à fin décembre 2002 - est réparti comme suit. Les individus âgés de 15 à

29 ans ont un risque 2,75 fois plus important que ceux de plus de 30 ans de faire un accès

palustre - P = 0,004 -. Quant aux enfants de 2 à 14 ans, leur risque est 13,10 fois plus élevé

que pour les adultes de plus de 30 ans - P < 0,001 -.

Tenant compte de cet impact de l’âge, la réponse en Ac anti-MSP1p19 étudiée en continu ou

avec un seuil à 7 a été trouvée associée à la protection clinique (cf tableau XI). Selon les

critères d’AIC, le modèle le plus représentatif est celui dichotomisé à 7 avec, à âge égal, un

risque de faire un accès, si ce seuil d’Ac n’est pas présent, augmenté d’un facteur 1,587.

79

Tableau XI : Régressions de Poisson pour l’étude du risque d’accès palustres

en fonction de la réponse Ac anti-MSP1p19 à Ndiop

(RR : risque relatif, 95%CI : intervalle de confiance, P : significativité)

RR 95%CI P RR 95%CI P

MSP1p19

Continu 1,041 1,012-1,070 0,005

Dichotomisé

≥7 1

<7 1,587 1,168-2,157 0,003

Age (ans) <0,001 <0.001

≥30 1 1

15-29 2,567 1,293-5,097 0,007 2,598 1,309-5,154 0,006

2-14 10,704 5,868-19,527 <0,001 11,124 6,128-20,193 <0.001

Deviance 241,3 240,7

AIC 243,3 242,7

Modèle 1 Modèle 2

En représentant graphiquement la répartition des accès palustres par classe d’âge selon une

dichotomie des niveaux d’Ac anti-MSP1p19 à 7 (cf figure 23), on observe très clairement les

résultats présentés dans le modèle de Poisson. L’échelle des incidences est très nettement

diminuée au fur et à mesure que l’âge augmente. De plus, elle est toujours supérieure pour les

personnes présentant moins d’Ac anti-MSP1p19 - exception faite des deux premiers mois de

suivi dans la classe d’âge ≥ 30 ans -.

Figure 23 : Incidence des accès palustres par classe d’âge et importance de la réponse Ac anti-

MSP1p19 à Ndiop. En noir les réponses < 7 rDO, en gris ≥ 7.

80

En revanche, le modèle s’est révélé non significatif dans le cas d’une dichotomie

répondeur/non répondeur - P = 0,81 -. Il ne suffit donc pas d’avoir des Ac anti-MSP1p19 pour

avoir un risque réduit d’accès palustre. Il faut également en avoir en quantité importante.

Concernant la réponse anti-MSP4p20, aucun des quatre modèles étudiés - continu, seuil à 6, 4

et 2 - n’a permis d’obtenir une relation entre les Ac anti-MSP4p20 et la protection clinique à

5,5 mois. Tous les modèles ont renvoyé des résultats non significatifs.

Les Ac anti-MSP5 sont associés à la protection clinique lorsque le taux est étudié en variable

continue (cf tableau XII). Pour une perte de 5 unités de rDO, le risque de faire un accès

palustre est augmenté d’une valeur de 1,26, selon le calcul 1,047 puissance 5. Cette

corrélation entre la réponse Ac et la protection clinique est significative - P = 0,022 -.

Tableau XII : Régression de Poisson pour l’étude du risque d’accès palustres

en fonction de la réponse Ac anti-MSP5 à Ndiop

RR 95%CI P

MSP5

Continu 1,047 1,007-1,089 0,022

Age (ans) <0,001

≥30 1

15-29 2,649 1,336-5,254 0,005

2-14 12,613 7,010-22,692 <0,001

Deviance 243,8

AIC 245,8

En revanche, la stratification en répondeur/non répondeur, également testée, n’a pas donné de

résultat significatif - P = 0,74 -. Aussi, comme pour MSP1p19, il semblerait qu’il ne suffise

pas d’avoir des Ac anti-MSP5 pour être protégé, encore faudrait-il que ceux-ci soient en

quantité suffisante.

Du point de vue de la répartition des rDO, aucun autre seuil n’a pu être déterminé et donc

étudié, si ce n’est le seuil à 2 représentant les répondeurs/non répondeurs. Il n’était alors pas

possible de réaliser le même type de graphique que pour MSP1p19 afin de visualiser la

protection que confère les Ac anti-MSP5. Des droites moyennes ont donc été tracées, à partir

d’une représentation en nuage de points prenant en compte les rDO et incidences (cf figure

81

y = -0,0008x + 0,0207

y = -0,0001x + 0,0039

y = -4E-05x + 0,0015

0

0,002

0,004

0,006

0,008

0,01

0,012

0,014

0,016

0,018

0,02

0 5 10 15 20 25

anti-MSP5 rDO

inci

denc

e ac

cès

palu

stre

s

Linéaire (IncidJASOND 2-14 ans)

Linéaire (IncidJASOND 15-29 ans)

Linéaire (IncidJASOND ≥30ans)

24). Ces 3 droites, calculées pour les 5,5 mois d’étude, sont toutes décroissantes. Cela

implique que, dans chaque classe d’âge, l’augmentation du taux d’Ac est associée à la baisse

du nombre d’accès palustres. Nous notons également que ceci est encore plus marqué pour la

classe d’âge 1 - 2-14 ans -, et beaucoup moins pour les deux autres classes d’âge.

Figure 24 : Incidence moyenne des accès palustres par classe d’âge et importance de la

réponse Ac anti-MSP5 à Ndiop

Aucune association n’a pu être mise en évidence dans ces modèles de protection clinique pour

les réponses Ac associées à R23, qu’elles soient étudiées en continu ou avec un seuil à 2.

En conclusion, pour le village de Ndiop, les taux d’Ac anti-MSP4p20 et anti-R23 ne sont pas

associés à la protection clinique à long terme en analyse prospective dans la série de 2002. En

revanche, des taux élevés d’Ac anti-MSP1p19 et anti-MSP5 sont associés significativement à

une baisse de la morbidité.

2.2) Corrélations observées à Dielmo, zone d’holoendémie

Concernant le village de Dielmo, le risque d’accès palustre par tranche d’âge pour les 5,5

mois étudiés - de mi-juillet à fin décembre 2002 - est réparti de façon très inégale. En effet,

les enfants de moins de 7 ans présentent 88 fois plus de risque de faire un accès palustre qu’un

individu de plus de 15 ans ! Pratiquement tous les accès palustres sont recensés dans cette

classe d’âge. Pour les 18 individus de cette tranche d’âge, on dénombre 38 accès palustres -

82

RR 95%CI P

MSP1p19

Dichotomisé

≥7 1

<7 5,179 1,194-22,466 0,028

Age (ans) <0.001

≥15 1

7-14 5,525 1,654-18,454 0,006

2-6 41,741 13,975-124,680 <0.001

Hb

AA 1

AS 0,897 0,339-2,375 0,826

scoretest Hb 0,026

Deviance 105,2

AIC 109,2

soit plus de 2 par enfant en moyenne -, contre 9 accès palustres pour les 7-14 ans qui sont au

nombre de 31 - moyenne de 0,29 accès palustre par jeune - et seulement 4 accès palustres

pour les individus de 15 ans ou plus, représentant la plus grande majorité de l’étude avec 114

sujets - moins de 0,04 accès palustre par adulte en moyenne -.

Les analyses de corrélation avec le nombre d’accès palustres obtenues pour Dielmo sont donc

à considérer avec précaution par rapport à celles obtenues pour Ndiop. Un seul adulte de plus

ou de moins faisant un accès répertorié peut éventuellement modifier complètement les

résultats. De plus, le faible nombre d’individus présentant des accès palustres réduit fortement

la puissance du test et donc sa fiabilité.

Concernant le taux d’Ac anti-MSP1p19 en tenant compte de l’âge, nous ne trouvons pas de

relation significative avec la protection clinique s’il est étudié en continu ou avec des seuils à

11, 9, 8, ou 2. Le seuil à 7, identique à celui applicable à l’étude à Ndiop, ne fournit pas non

plus avec l’âge de résultat significatif mais il se trouve à la limite de la signification - P = 0,06

-. Si l’on inclut le type d’hémoglobine dans ce modèle, celui-ci se trouve amélioré - Score test

Hb : P = 0,026 - et présente le meilleur critère d’AIC - 111,2 alors que les autres modèles sont

au minimum à 129,5 -. Une corrélation significative est alors obtenue entre la réponse Ac

anti-MSP1p19 et la protection clinique - P = 0,028 - (cf tableau XIII). Elle est d’ailleurs

relativement élevée car les individus ayant un taux d’Ac inférieur à 7 présentent 5,179 fois

plus de risque de faire un accès palustre que ceux ayant un rDO supérieur ou égal à ce seuil.

Tableau XIII : Régression de Poisson pour l’étude du risque d’accès palustres

en fonction de la réponse Ac anti-MSP1p19 à Dielmo

83

En représentant graphiquement, comme précédemment pour l’étude sur les habitants de

Ndiop, l’incidence des accès palustres en fonction de l’âge et de la réponse anti-MSP1p19

avec un seuil à 7, nous retrouvons le même type de courbes que précédemment (cf figure 25).

L’incidence diminue avec l’âge et avec les taux élevés d’Ac anti-MSP1p19.


MSP1p19 à Dielmo. En noir les réponses < 7 rDO, en gris ≥ 7.

Le nombre d’individus composant les différentes catégories est remarquable :

� Pour les 2-6 ans, sur les 18 enfants, seuls 3 présentent un taux d’Ac supérieur à 7 en

rDO, et sur ces 3 enfants, 2 ont subi des crises de paludisme. 11 des 15 enfants ayant une rDO

inférieure à 7 ont également été malades ;

� Pour les 7-14 ans, 5 individus présentent un taux d’Ac supérieur à 7 et aucun n’a été

malade, alors que 26 individus ont un taux inférieur au seuil, dont 6 ont eu des crises de

paludisme ;

� Pour les personnes de plus de 15 ans, 62 individus présentent un taux d’Ac supérieur à

7, dont 1 ayant eu un accès palustre, contre seulement 52 personnes ayant une réponse

inférieure au seuil, avec 3 personnes ayant souffert du paludisme.

Aussi, passé l’âge « charnière » de 15 ans, plus de la majorité des individus présente un taux

d’Ac anti-MSP1p19 très élevé, résultat observé comme rare chez les jeunes enfants. Nous

notons donc une acquisition tardive de ces Ac.

Concernant la réponse anti-MSP4p20, aucun des quatre modèles étudiés - continu, seuil à 8, 5

et 2 - n’a permis d’obtenir une relation entre les Ac anti-MSP4p20 et la protection clinique à

84

5,5 mois. Cette absence de signification avait déjà été observée lors de l’étude de la protection

clinique à Ndiop.

Concernant la réponse anti-MSP5, en plus des rDO en continu, différents seuils ont été testés

avec des valeurs de 9, 5 et 2. Seul le seuil à 2, correspondant aux répondeurs/non répondeurs a

permis d’obtenir une corrélation significative entre la réponse Ac détectée et la protection

clinique observée - P = 0,031 -. Les individus non répondeurs en Ac anti-MSP5, à Dielmo,

présentent un risque de faire un accès palustre accru d’un facteur 1,905 (cf tableau XIV).

Tableau XIV : Régression de Poisson pour l’étude du risque d’accès palustres

en fonction de la réponse Ac anti-MSP5 à Dielmo

RR 95%CI P

MSP5

Dichotomisé

≥2 1

<2 1,905 1,061-3,419 0,031

Age (ans) <0,001

≥15 1

7-14 8,086 2,489-26,276 <0,001

2-6 89,854 32,058-251,848 <0,001

Deviance 124,9

AIC 126,9

Graphiquement, ces résultats fournissent les courbes d’incidences attendues, avec des

intensités moindres quand l’âge augmente et en présence d’Ac anti-MSP5 (cf figure 26).

Notons que les incidences quasi nulles observées pour les répondeurs ayant plus de 7 ans

peuvent être entièrement ramenées à zéro si l’on considère le seuil à 5. Ce seuil a été trouvé

comme non significatif car dans la classe 1, il ne fournit pas de résultat concluant, les courbes

s’entrecroisant. Cependant, dans les deux autres classes d’âge, plus aucun accès palustre n’est

à déplorer chez les 46 individus ayant atteint ce seuil critique.

85


MSP5 à Dielmo. En noir les réponses < 2 rDO, en gris ≥ 2.

Enfin, concernant la réponse anti-R23, aucune relation n’a été obtenue entre le taux ou la

présence d’Ac et la protection clinique.

En conclusion, nous avons trouvé qu’à Dielmo, zone d’holoendémie, comme à Ndiop, zone

de mésoendémie, une corrélation existe entre la protection clinique et le taux d’Ac anti-

MSP1p19 avec une dichotomie à 7. Nous avons également mis en évidence dans les deux cas

une corrélation avec la réponse Ac anti-MSP5 et la protection clinique. Enfin, aucune

association avec la protection clinique à long terme n’a pu être trouvée concernant les

réponses Ac anti-MSP4p20 et anti-R23, et cela à Dielmo comme à Ndiop.

3) Prévalence des IgG : classe et sous classes

Bien que notre étude concerne les réponses Ac contre des candidats vaccins bien définis, il est

toujours important d’étudier les réponses Ac « globales », classes et sous classes. Les

réponses Ac contre les Ag totaux du mérozoïte ont donc été étudiées.

3.1) Les IgG totales

Il est utile de rappeler que ce travail est basé sur une évaluation d’un « titre ». Celui-ci est

déterminé à partir d’un calcul basé sur une courbe de régression logistique. Elle est obtenue à

partir de : i) sept dilutions du SHI et ii) un titre arbitraire fixé pour ce contrôle positif. Les

86

« unités-titres » ainsi obtenues pour les sérums étudiés sont donc ramenées à la valeur de ce

contrôle. Plus on s’éloigne de la courbe de régression de celui-ci - meilleurs répondeurs que le

standard - et plus les écart-types augmentent. Les moyennes ne sont donc pas exploitables car

influencées par les très grandes valeurs à grande incertitude. Il convient donc de travailler sur

les médianes pour avoir des résultats fiables. Les unités titres obtenues sont en réalité des

classements de hiérarchisation des titres et non pas l’obtention des valeurs réelles. Une très

faible unité titre n’implique donc pas forcément une absence d’IgG mais peut simplement

signifier que comparativement au titre du standart positif, le titre du sérum étudié est très

faible. Cependant, malgré ces précautions, cette hiérarchisation calculée en unité titre est très

profitable. En effet, nous ne travaillons pas sur des unités correspondant à une seule dilution

comme nous l’avons fait précédemment, mais réellement sur des unités prenant en compte le

titre du sérum. Cette stratégie d’analyse présente un avantage significatif car deux valeurs

identiques de DO à une dilution donnée peuvent être associées à des titres différents.

Cette stratégie découle de la standardisation des méthodes pour les essais cliniques au niveau

international, proposée à la suite des réunions de concertation internationale suscitées par

l’OMS (Dr MP Kieny et Z. Reed).

Concernant l’étude ELISA des IgG totales, il était impossible de travailler aux dilutions

habituellement utilisées pour les IgG spécifiques ou les sous-classes, les quantités d’IgG étant

incomparablement plus importantes. Travailler ne serait-ce qu’au 1/1000 revient à saturer la

plaque d’étude - DO à 3,5 - et les résultats demeurent par conséquent ininterprétables. C’est la

raison pour laquelle ce volet de l’étude a été réalisé aux dilutions 1/5000 et plus, afin de

pouvoir obtenir une courbe de régression pour le SHI, indispensable à l’établissement des

unités titres avec la méthode du Dr Remarque. Afin de marquer cette différence d’échelle du

niveau de la réponse, nous avons attribué à la valeur du SHI un titre arbitraire de 1000, en lieu

et place de la valeur de 100 habituellement utilisée.

Aux dilutions choisies, les DO des sérums étudiés en IgG totales varient de 0,198 à 3,159

avec une médiane des réponses à 2,841. La gamme de réponses est donc correcte pour réaliser

l’étude. En unités titres, cela revient à un minimum de 4 et un maximum de 6748, avec une

médiane à 273, et cela pour les 88 personnes de la sous cohorte des habitants de Ndiop non

parasités. Nous pouvons analyser les évolutions de ces résultats en fonction de l’âge, de

l’hémoglobine et étudier les relations avec les Ac des candidats vaccins.

87

3.1.1) Impact de l’âge sur les taux d’IgG

Dans cette sous cohorte d’étude, les 3 groupes d’âges sont représentés dans des proportions

similaires : 34 enfants de 2 à 14 ans - classe 1 -, 26 personnes de 15 à 29 ans - classe 2 - et 28

de plus de 30 ans - classe 3 -. Si l’on observe l’évolution de la médiane en fonction de ces

classes d’âges, on obtient une augmentation importante d’un groupe à l’autre (cf figure 27).

La médiane prend une valeur de 69 pour la classe 1, 372 pour la classe 2 et atteint 756 pour la

classe 3. Cette augmentation significative des réponses avec l’âge - P < 0,0001, test de

Kruskal Wallis -, est parfaitement logique car les classes d’âges ont été stratifiées selon le

statut immun dont dépend le taux d’IgG. Ce résultat valide l’utilisation du modèle des unités

titres.

Figure 27 : Augmentation de la réponse IgG visant le mérozoïte par classe d’âge

3.1.2) Impact de l’hémoglobine AS sur les taux d’IgG

Concernant l’impact de l’hémoglobine drépanocytaire hétérozygote AS sur la réponse IgG

totale, nous n’obtenons rien de concluant, la différence de réponse entre les personnes à profil

AS et les autres n’étant pas significative - P = 0,29, test de Mann Withney -.

3.1.3) Interrelation entre les réponses IgG liées aux candidats vaccins et les taux d’IgG

Le taux de corrélation le plus fort qui a été observé avec les IgG totales ciblant les Ag du

mérozoïte est celui lié aux Ac anti-MSP1p19 - 71% -. La réponse anti-MSP4p20 induit un

taux de corrélation de 65% avec le taux total d’IgG visant le mérozoïte. Pour les Ac anti-

MSP5, celui-ci est de 59%. Les Ac anti-R23, qui sont des Ac du GRp et non pas du

88

mérozoïte, présentent pourtant un taux de corrélation de 54% avec les IgG visant le

mérozoïte. Toutes ces corrélations sont hautement significatives - P ≤ 0,0002, test de

Spearman -.

La valeur élevée trouvée pour la corrélation entre des Ac spécifiques d’un Ag du GRp et le

taux d’IgG total visant les Ag du mérozoïte, montre bien que les réponses Ac dans le cas du

paludisme sont très variées mais également très liées. Les réponses IgG contre le mérozoïte et

contre le GRp ne sont donc pas clairement distinctes. Cela avait déjà été visualisé par l’étude

des colinéarités des réponses Ac dues aux différents Ag (cf § 1.1).

3.1.4) Corrélation entre le taux d’IgG et la protection clinique

Enfin, nous avons étudié à l’aide d’une régression de Poisson le taux d’IgG contre les Ag

totaux du mérozoïte en fonction du nombre d’accès palustres observés dans le village de

Ndiop. Cette étude a été réalisée afin de déterminer si ce taux peut à lui seul expliquer ou non

la protection clinique. Lorsque le test est réalisé en analyse univariée, nous trouvons une

corrélation entre le taux d’IgG et le nombre d’accès palustres - P < 0,001, RR = 1,0001 par

unité titre perdue -. Cependant, quand l’âge est injecté dans le modèle, le taux d’IgG n’est

plus significatif - P = 0,91 -. La protection clinique ne peut donc pas être expliquée

uniquement à partir de la quantité d’IgG visant les Ag du mérozoïte. Elle relève donc d’un

processus plus complexe.

3.2) Les IgG non cytophiles

Nous avons ensuite testé en ELISA les sérums du point de vue de leur réponse en IgG non

cytophiles, les IgG2 et IgG4. Tous les sérums de la sous cohorte d’étude « Ndiop non

parasités » ont donc été analysés en duplicata à la dilution 1/100. Nous avons alors obtenu des

réponses extrêmement faibles, voire bien souvent inexistantes.

Pour les IgG2, le maximum de DO observé au 1/100 est 1,341, avec une médiane à 0,065 et

une moyenne obtenue à 0,123. Ces résultats équivalent à seulement 3 sérums avec des IgG2

détectables à cette dilution, pourtant minimale.

89

En ce qui concerne les IgG4, nous avons trouvé des résultats similaires. Le maximum des

réponses est à 0,869, avec une médiane de 0,036 et une moyenne à 0,089. Seuls 4 sérums ont

des réponses différentes du bruit de fond.

Nous pouvons donc conclure au vu de ces résultats qu’il n’existe pas ou très peu d’IgG non

cytophiles détectables contre les protéines du mérozoïte dans cette étude.

3.3) Les IgG cytophiles

Les IgG cytophiles étant connus comme effecteurs de la réponse Ac protectrice (Garraud,

2003), cette réponse a été étudiée par la technique du Docteur Remarque, à partir de la

dilution 1/200 et avec le SHI fixé à 100 unités titres.

Concernant les IgG1, les réponses obtenues oscillent entre les valeurs de DO de 0,051 et

3,417, avec une médiane à 1,918 et une moyenne de 1,812. Les gammes de dilution sont donc

optimales par rapport à la gamme de DO observée. Les unités titres correspondantes sont

comprises entre 0 et 230, avec une médiane à 22. Quelques sérums contiennent donc plus

d’IgG1 que le SHI mais la grande majorité en présente beaucoup moins. Cependant, à part

quelques exceptions, tous les sérums induisent des DO nettement supérieures au bruit de fond.

Pour les IgG3, nous obtenons des résultats similaires, bien que légèrement plus faibles. Les

DO oscillent entre 0 et 3,313, avec une médiane à 0,631 et une moyenne à 0,954. Là encore, à

quelques exceptions près, tous les sérums induisent des DO nettement supérieures au bruit de

fond. Cependant, le taux d’IgG3 dans le SHI étant proportionnellement encore plus important

que pour les IgG1, les unités titres, variant de 0 à 206, ont une médiane de seulement 6.

Les IgG1 sont donc majoritaires mais les IgG3 sont également très présents dans la réponse

anti-P. falciparum. La très grande majorité des sérums de personnes immunes ou semi

immunes présentent des réponses d’intensité variées mais non négligeables pour ces deux

sous-classes.

90

3.3.1) Impact de l’âge sur les taux d’IgG1 et IgG3

En étudiant l’évolution de ces sous classes en fonction des classes d’âge et donc de

l’acquisition de l’immunité (cf tableau XV et figure 28), nous observons comme attendue une

augmentation importante avec l’âge, et cette dépendance est significative - P < 0,0001 pour

les deux sous classes, test de Kruskal Wallis -. La médiane des réponses augmente de 10 à 55

pour les IgG1 et de 1 à 28 pour les IgG3.

Tableau XV : Visualisation des unités titres des IgG1 et IgG3 visant le mérozoïte

en fonction des classes d’âge

2-14 ans 15-29 ans ≥ 30 ans 2-14 ans 15-29 ans ≥ 30 ans

médiane 10 36 55 1 16 28

maximum 121 215 230 42 206 180

minimum 0 1 1 0 0 0

P (Kruskal Wallis)

IgG1 IgG3

<0,0001 <0,0001

Il est intéressant de noter que dans tous les groupes nous observons des personnes avec de

faibles taux d’IgG1 ou IgG3. Les minimums sont de 0 ou 1 pour tous. Etre prémuni ne

correspondrait donc pas forcément à un fort taux d’IgG1 ou d’IgG3. En étudiant plus

précisément la classe d’âge 1, on note pour les IgG1 un maximum déjà élevé avec une valeur

de 121. En revanche, pour les IgG3, le maximum de la classe 1 n’est que de 42 unités titres.

L’augmentation du taux d’IgG3 semblerait donc mieux liée à l’acquisition de l’immunité que

le taux d’IgG1 mais il ne serait pas suffisant pour autant. Cela semblerait donc être une

combinaison des réponses IgG1 et IgG3 qui permettrait la mise en place d’une prémunition.

91

IgG1 IgG3

72% 71%

P < 0,0001 P < 0,0001

69% 55%

P < 0,0001 P < 0,0001

66% 60%

P < 0,0001 P < 0,0001

48% 48%

P < 0,0001 P < 0,0001

MSP1p19

MSP4p20

MSP5

R23

Figure 28 : Taux d’IgG1 (A) et IgG3 (B) dirigés contre le mérozoïte

selon les classes d’âge

3.3.2) Impact de l’hémoglobine AS sur les taux d’IgG1 et IgG3

Comme pour les IgG totales, nous ne trouvons aucune différence significative due au profil

drépanocytaire AS. Le test de Mann Withney donne des valeurs de P de 0,73 pour les IgG1 et

0,5 pour les IgG3.

3.3.3) Confrontation des réponses IgG contre les candidats vaccins avec les taux d’IgG1 et

IgG3

En étudiant les corrélations avec les candidats vaccins, nous trouvons la même hiérarchisation

que pour les IgG totales, et ce de façon significative - P < 0,0001 pour les différentes

corrélations, test de Spearman - (cf tableau XVI).

Tableau XVI : corrélation des IgG1 et IgG3 avec les candidats vaccins

A B

92

Il est intéressant de noter que les pourcentages de corrélation entre IgG1 et IgG3 n’évoluent

pas forcément dans un sens prévisible.

� MSP1p19, qui induit une réponse majoritairement IgG1, présente le même degré de

corrélation entre ses réponses Ac associées et les deux sous classes d’IgG cytophiles - 72% et

71% -.

� Concernant MSP4p20, qui induit une réponse IgG3 forte, sa réponse Ac associée est

trouvée mieux corrélée aux IgG1 - 69% - qu’aux IgG3 - 55% -. De plus son taux de

corrélation avec les IgG3 est plus faible que celui observé pour MSP1p19 ou MSP5 - 55% vs

71% et 60% respectivement -.

� La réponse anti-MSP5 et la réponse IgG1 sont également mieux reliées entre elles -

66% - que la réponse anti-MSP5 avec celle des IgG3 - 60% -.

� Quant aux Ac anti-R23, le taux de corrélation est le même dans les deux cas, à savoir

48%.

4) Vérification des déplétions

Les différentes analyses ELISA ayant été réalisées, il nous restait une dernière étude à mener :

valider les procédures de déplétions en Ac spécifiques et en quantifier l’efficacité. Cette

information est nécessaire pour l’analyse des réponses obtenues à partir de ces sérums

déplétés dans les tests fonctionnels.

Pour cela, nous avons tout d’abord réalisé des courbes de titration afin de vérifier leur

spécificité et efficacité.

Comme le montre l’exemple sur la figure 29 avec l’analyse en ELISA de la déplétion du SHI

en Ac anti-MSP4p20, les déplétions réalisées « en solution » avec passage sur résine TALON

sont très efficaces du point de vue de la chute du titre et en même temps, très spécifiques. En

effet, seule une légère différence est notée pour les courbes de titration des autres Ac présents

dans le sérum. Comparée à la chute du titre des Ac visée par la déplétion, elle est négligeable.

Nous avons ensuite, par la technique des unités titres du Dr Remarque, quantifié l’importance

de ces déplétions. Les sérums, initiaux et déplétés, ont donc été testés et leurs unités titres

respectives rapportées l’une à l’autre pour en obtenir un pourcentage de déplétion.

93

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

1/200 1/400 1/800 1/1600 1/3200 1/6400 1/12800

dilution

DO

ELISA MSP4p20 SHI

ELISA MSP4p20 SHIdéplété anti-MSP4p20

ELISA MSP1p19 SHI

ELISA MSP1p19 SHIdéplété anti-MSP4p20

Figure 29 : Spécificité et efficacité de la déplétion

Détection en ELISA des Ac anti-MSP4p20 et anti-MSP1p19

avant et après déplétion du SHI en Ac anti-MSP4p20.

Les déplétions réalisées avec MSP1p19 - 20 sérums testés -, sont pratiquement totales, avec

un pourcentage moyen de 99,8%. La médiane des unités titres des sérums diminue d’une

valeur initiale de 511 pour les sérums originaux à 1 pour les sérums déplétés.

Concernant les 11 sérums traités avec MSP4p20, la déplétion est là aussi excellente, avec une

moyenne de déplétion obtenue de 99%. La médiane des unités titres des sérums initiaux

diminue après déplétion de 816 à 8.

En utilisant MSP5, le taux de déplétion est plus faible pour les huit sérums testés, bien que

toujours important, avec une valeur moyenne de 74%, correspondant à une diminution de la

médiane des unités titres de 351 à 90 unités.

94

Enfin, bien que n’ayant pas déplété les Ac anti-R23, ceux-ci ont été saturés par la même

méthode. Les résultats ELISA indiquent que cette saturation est restée efficace, même

plusieurs mois après sa réalisation. Trois mois après, les quatorze sérums testés présentent une

inactivité moyenne des Ac anti-R23 de presque 97%. La médiane des unités titres a diminué

d’une valeur de 395 unités à seulement 13.

Nous avons donc un outil et une procédure efficaces pour évaluer le rôle fonctionnel des

candidats vaccins dans la protection clinique via l’étude des sérums déplétés dans les tests

fonctionnels.

95


B/ ANALYSE DE LA PHAGOCYTOSE

DEPENDANTE DES ANTICORPS PAR

CHIMILUMINESCENCE

Le premier test fonctionnel étudié est le test de phagocytose dépendante des Ac par les

cellules PNN et détectée par chimiluminescence. Ce test mesure la poussée respiratoire

dépendante des Ac fonctionnels. Les termes « test de phagocytose » et « test de

chimiluminescence » sont généralement utilisés pour le qualifier.

Nous avons au préalable vérifié in vitro par microscopie l’existence de la phagocytose des

préparations mérozoïtaires par les PNN. Après 30 minutes d’incubation des PNN avec la

suspension mérozoïtaire préalablement opsonisée par les Ac du sérum contrôle positif SHI,

nous avons observé une ingestion importante de mérozoïtes et d’hémozoïne par les PNN (cf

figure 30). Ce résultat valide le déroulement de la phagocytose in vitro dans nos conditions

d’étude.

Figure 30 : Phagocytose par les PNN des préparations mérozoïtaires (coloration au Giemsa)

Pour réaliser notre étude, nous avons bénéficié d’un précédent travail. Il avait permis de

définir les quantités de sérums, de suspensions mérozoïtaires - établies comme pouvant être

congelées et poolées avant utilisation - et de PNN à utiliser (Corre, 2003).

L’objectif du travail de cette thèse sur ce test a alors été de s’appuyer sur ces résultats

préliminaires très encourageants pour les développer à un niveau méthodologique solide avec

une exploration systématique des différents paramètres - différents protocoles de préparation

96

des mérozoïtes et PNN ont été évalués -. Une fois les mises au point faites, nous avons

appliqué cette méthodologie à un nombre suffisant de sérums. Le but était d’analyser les

résultats d’un point de vue statistique en fonction de différents paramètres clinico-

épidémiologiques tels que la morbidité, mais également de tester l’importance relative des

différents candidats vaccins dans l’induction du phénomène de poussée respiratoire et de

phagocytose par les PNN.

1) Mises au point réalisées

1.1) Purification des mérozoïtes et validation du protocole

1.1.1) Qualité des mérozoïtes isolés par centrifugation

Le protocole utilisé pour les premières mises au point reposait sur une purification par

centrifugation longue et à vitesse élevée du surnageant de culture parasitaire (cf Matériel et

Méthodes, § 5.1). Cette centrifugation permet d’extraire les mérozoïtes qui n’ont pas encore

réenvahi des GR et « flottent » dans le milieu de culture. Cependant, des débris cellulaires et

de l’hémozoïne contaminent cette préparation.

Une étude réalisée en microscopie électronique a permis d’analyser le contenu de cette

préparation mérozoïtaire. Les deux entités recueillies majoritairement sont des mérozoïtes et

des fragments de globules rouges. Les mérozoïtes ont été visualisés comme étant en

relativement bon état malgré la centrifugation à vitesse élevée (cf figure 31).

Figure 31 : Visualisation d’un mérozoïte par microscopie électronique

Afin d’avoir une autre confirmation de l’intégrité relative des mérozoïtes recueillis, nous

avons effectué une culture parasitaire à partir de ces mérozoïtes et de GR sains - 0,2 mL par

97

puits de culture et 40µL de préparation mérozoïtaire -. Ces derniers sont restés deux jours en

contact avec les GR, dans un milieu propice à l’invasion - 1,2 mL de RPMI-Alb 0,5% - et en

quantité semblable à celle définie pour le test de phagocytose. Ensuite, le milieu de culture a

été renouvelé quotidiennement pour favoriser le développement du parasite - 2,3 mL de

RPMI-Alb 0,5% -. Au bout d’une semaine, pour les six puits testés, réalisés avec deux

préparations mérozoïtaires différentes, une parasitémie de l’ordre de 2% a été mise en

évidence. Elle confirme la viabilité et l’intégrité des mérozoïtes recueillis.

1.1.2) Rôle de l’hémozoïne et des débris cellulaires dans la chimiluminescence

Ayant validé la qualité des mérozoïtes obtenus, nous avons vérifié que l’hémozoïne présente

dans la suspension mérozoïtaire, bien qu’en quantité faible, ne soit pas responsable de la

chimiluminescence observée. Pour ce faire, nous avons au préalable centrifugé la moitié du

milieu de culture disponible, pendant 30 min à 50xg. Cette vitesse faible, ne permettant pas de

sédimenter les mérozoïtes, est suffisante pour la sédimentation des débris cellulaires et de

l’hémozoïne. Le milieu de culture semi-décanté a ensuite été traité de la même manière que le

reste du milieu de culture disponible le jour de l’expérience afin d’obtenir, dans les deux cas,

des préparations mérozoïtaires parfaitement semblables à l’exception de la présence

d’hémozoïne et de débris. Les trois culots ainsi préparés - i) hémozoïne et débris, ii)

mérozoïtes et iii) mérozoïtes avec hémozoïne - ont ensuite été testés simultanément dans le

test de phagocytose.

Une perte totale de spécificité de la réponse dans le cas des débris et de l’hémozoïne a été

observée, le sérum de l’individu naïf fournissant une réponse positive en chimiluminescence.

La présence d’hémozoïne et de débris dans la préparation mérozoïtaire, à cause de la non

spécificité qu’elle engendre, entraîne une légère baisse de la réponse spécifique aux

mérozoïtes. Cependant, celle-ci est parfaitement proportionnelle pour les différents sérums,

permettant l’obtention de ratios de réponses similaires pour les deux types de préparations

mérozoïtaires (cf figure 32).

La méthodologie de ce test préconise de ne pas travailler sur l’intensité de luminescence

détectée mais sur la valeur standardisée obtenue par calcul de ratio - l’ADPm -. Il n’est donc

pas nécessaire de pré purifier les préparations mérozoïtaires pour pouvoir les utiliser en

chimiluminescence.

98

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

hémozoïne mérozoïtes prépurifiés

mérozoïtes avechémozoïne

chim

ilum

ines

cenc

e (r

lu)

sans sérum

SHI (contrôle positif)

sérum naïf

Figure 32 : Comparaison de l’impact de l’hémozoïne et débris cellulaires avec celui des

mérozoïtes purifiés dans le test de phagocytose (profil type)

1.1.3) Purification des mérozoïtes par flottaison sur Percoll

Nous avons également testé une méthode plus « performante » pour la qualité des mérozoïtes.

Elle repose sur une purification par flottaison sur Percoll à 75% dans du PBS 10x.

La culture de parasites, traitée dans son intégralité, est déposée sur le Percoll - 7 mL de

culture sur 3 mL de Percoll 75% - et centrifugée 10 min à 700xg. L’utilisation du Percoll

permet l’extraction des mérozoïtes des rosaces et du milieu de culture. Une suspension

mérozoïtaire plus propre est ainsi obtenue. Celle-ci doit être lavée avec du PBS avant d’être

congelée. Le culot globulaire est lavé avec du RPMI 1640 avant d’être remis dans les

conditions de culture.

L’inconvénient majeur de cette méthode est son caractère agressif vis-à-vis de la culture

parasitaire. En effet, ce traitement par Percoll fragilise les GRp et provoque, s’il est répété

régulièrement, une lyse importante. Cette méthode doit donc être utilisée le moins souvent

possible - maximum 1 fois tous les 3 cycles -, sous peine de détruire totalement la culture

parasitaire.

De plus, les quantités de préparations mérozoïtaires recueillies sont nettement plus faibles que

lors d’une purification par centrifugation. Par conséquent, l’utilisation de cette méthode

99

implique un délai très long pour constituer des stocks de mérozoïtes pour les expériences de

chimiluminescence en série. Cependant cette méthode présente l’avantage de fournir des

intensités de luminescence très nettement amplifiées (cf figure 33), dues à une contamination

moindre des préparations mérozoïtaires.

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

0,0

6,5

12,9

19,4

25,8

32,3

38,7

45,2

51,6

58,1

temps (min)

chim

ilum

ines

cenc

e (r

lu)

mérozoïtes extraits parPercoll

mérozoïtes isolés parcentrifugation

Figure 33 : Différence d’intensité de luminescence suivant les méthodes

de préparation des mérozoïtes (profil type)

La technique s’étant révélée trop agressive et la collecte des mérozoïtes trop lente pour la

quantité de tests que nous souhaitions réaliser en un temps donné, nous avons écarté cette

méthode.

Cependant, lors des tests réalisés, le deuxième contrôle positif testé, issu d’un donneur de

sang sénégalais, a obtenu une valeur standardisée d’ADPm similaire avec les deux types de

préparation mérozoïtaire. En effet, bien que les rlu observées soient différentes - 173 et 69

unités -, une fois rapportées à celles du SHI - 487 et 190 - des valeurs d’ADPm de 363 et 355

unités sont obtenues. Cette remarque n’est cependant pas valable pour les sérums naïfs car les

rlu restant similaires et le bruit de fond inchangé, nous notons des valeurs d’ADPm

légèrement plus élevées avec les mérozoïtes issus de la centrifugation - 89 vs 47 -, l’éventail

de réponses étant plus restreint. Néanmoins, ces observations, bien que nécessitant d’être

analysées plus en détail sur un nombre conséquent d’échantillons, relativisent l’importance de

l’utilisation du Percoll.

100

1.1.4) Profils protéiques des préparations mérozoïtaires

Des gels d’acrylamide ont également été réalisés afin de comparer les profils protéiques des

différentes préparations mérozoïtaires. Les gels sont réalisés avec 10 µL de chaque

préparation mérozoïtaire par puits et migrent pendant 6H à 25mA. Un des gels de protéines

réalisé a ensuite été révélé au nitrate d’argent et les autres ont été transférés - 12V, toute la

nuit - sur membrane de cellulose. Ceux-ci ont ensuite été hybridés avec le SHI ou des Ac

spécifiques anti-MSP1p19. Au niveau des gels « western blot » ainsi obtenus, nous ne notons

pas de différence majeure entre les diverses préparations parasitaires (cf figure 34B). En

particulier, MSP1 est présent dans ses différentes formes - MSP1 (190kDa), MSP1p42

(42kDa), MSP1p19 (19kDa) - dans chacune de ces préparations (cf figure 34C).

En revanche, nous notons sur le gel révélé au nitrate d’argent une différence que nous n’avons

pu identifier. Les mérozoïtes recueillis par centrifugation présentent une bande protéique

importante à 50 kDa qui est remplacée dans les mérozoïtes recueillis sur Percoll par une

bande à 45 kDa (cf figure 34A).

Figure 34 : Comparaison des mérozoïtes purifiés par Percoll (lignes 1), par centrifugation sans

(lignes 2) ou avec (lignes 3) hémozoïne, visualisée par :

(A) gel révélé au nitrate d’argent,

(B) gel transféré sur membrane de cellulose et sondés avec SHI

(C) gel transféré sur membrane de cellulose et sondés avec des Ac anti-MSP1p19 spécifiques.

.

En conclusion, la méthode de purification des mérozoïtes par centrifugation unique 20 min à

1500xg que nous avons retenue est une méthode simple, non agressive et permettant d’obtenir

des mérozoïtes de qualité convenable et en quantité correcte.

A B C

101

1.1.5) Vérification des quantités prédéfinies à utiliser dans le test

L’optimisation de la méthode, du point de vue des cibles parasitaires, s’est terminée par la

confirmation du choix de la quantité de 40 µL de préparation mérozoïtaire à utiliser pour le

test de phagocytose.

Nous avons utilisé deux pools différents de mérozoïtes, opsonisés en quantités différentes

avec du SHI. Les courbes effet-dose obtenues (cf figure 35) divergent à leurs extrémités mais

un simili plateau est observable autour des valeurs de 30, 40 et 50 µL. Ces quantités donnent

des rlu d’ordre similaire - environ 200 - pour les deux lots de mérozoïtes.

0

100

200

300

400

500

600

10uL 20uL 30uL 40uL 50uL 60uL

quantité de mérozoïtes

inte

nsité

de

lum

ines

cenc

e (r

lu)

pool 2

pool 1

Figure 35 : Courbes effet dose de la quantité de mérozoïtes utilisée dans le test de

chimiluminescence

Les mérozoïtes ne peuvent pas être dénombrés, même dans un compteur de particules -

procédure essayée sans succès par le précédent expérimentateur -. Aussi, ce pallier observé

confirme le choix de 40 µL pour une meilleure reproductibilité des tests.

1.2) Purification des polynucléaires et conditions d’utilisation

La méthode de purification des mérozoïtes a été optimisée. La purification des effecteurs

cellulaires utilisés dans le test doit l’être de même.

102

1.2.1) Impact des monocytes en chimiluminescence

Les PNN sont par nature très fragiles en dehors du corps humain, avec un temps de demi-vie

très court. Des expériences de chimiluminescence ayant été rapportées avec des PBMC

(Khusmith, 1982), nous avons vérifié que l’usage des PNN était requis. Nous avons purifié,

en parallèle des PNN, les PBMC des donneurs de sang afin de pouvoir les tester

simultanément. Une même centrifugation sur ficoll 1077 permet de purifier ces deux types

d’effecteurs cellulaires (cf Materiel et Methodes, §5.2).

Pour les différents donneurs testés, les PBMC ont toujours fourni une réponse similaire ou

moindre à celle des PNN. Dans un cas, la réponse des PBMC a même été non détectable alors

que les PNN du même donneur fournissaient une réponse correcte.

Dans la majorité des cas testés, l’intensité de luminescence fournie par les PBMC est telle que

le rapport SHI/blanc ne dépasse pas 5, alors qu’il faut environ un ratio de 10 pour obtenir un

éventail de réponses suffisamment large pour permettre une précision suffisante. Il apparaît

donc que, bien que fournissant également une poussée respiratoire, cette dernière est

d’intensité insuffisante par rapport au seuil du bruit de fond de notre appareil. Les PBMC ne

peuvent donc pas être utilisés efficacement dans ce cas présent.

1.2.2) Chimiluminescence et sang total

Les PBMC ne fournissant pas une poussée respiratoire assez puissante, nous avons évalué une

alternative à l’utilisation des PNN isolés. Des articles rapportant des analyses de la poussée

respiratoire évaluée à partir de sang total (Perticarari, 1994), nous ont orienté vers cette voie.

Trois échantillons sanguins ont été étudiés à partir de restes de tests de « numération-formule

sanguine ». Ils ont été prélevés moins de 3H30 avant l’expérience - PNN toujours viables -.

Ils correspondent à : i) un individu à numération normale en PNN (6,49), ii) un individu avec

un taux anormalement élevé de PNN (9,26) et iii) un individu avec un défaut de PNN (1,69).

Ces trois prélèvements ont été testés en chimiluminescence, sous la forme de sang total

(100µL) ou de « sang concentré en globules blancs » (100µL). Ce dernier a été obtenu après

centrifugation du sang 10 min à 700xg et récupération de l’interface GR – sérum. Les

quantités de 100 µL ont été imposées par le volume des puits de la plaque de lecture.

103

Les résultats obtenus n’ont été concluants dans aucun des cas testés, surtout concernant le

sang total. Avec ce dernier, quel que soit le contrôle positif testé et la numération observée, la

luminescence ne sort jamais du bruit de fond. De même, les échantillons de globules blancs

concentrés des deux individus à numération élevée ou faible en PNN ne fournissent pas de

réponse supérieure à 20 rlu, valeur maximale du bruit de fond. En revanche, un début de

réponse est détectable avec les globules blancs concentrés de l’individu ayant un taux normal

de PNN. Le SHI fournit alors une luminescence de 35 rlu. La faible poussée respiratoire alors

observée est maximale au bout de 52 minutes, et non pas instantanément comme pour les

PNN isolés.

Il semble donc important de purifier les effecteurs cellulaires avant de les utiliser dans le test.

1.2.3) Utilisation de polynucléaires de lapin

Une autre solution envisagée pour permettre une homogénéité des effecteurs dans ce test a été

l’utilisation de PNN d’un modèle expérimental. A partir de sérums de lapins vaccinés, nous

avons testé l’utilisation des PNN de lapins. La purification de ceux-ci est identique à celle des

PNN humains (Roth, 1993) et ils génèrent également des radicaux oxygénés tels que le

superoxyde (Windle, 1983). Malgré ces éléments de similitude, pour les deux expériences

réalisées avec des PNN de lapins et des sérums de lapins vaccinés ou différents contrôles

positifs humains, nous n’avons jamais pu obtenir de résultats différents du bruit de fond.

1.2.4) Purification des polynucléaires par double ou simple gradient

N’ayant pas trouvé d’alternative correcte aux PNN humains, nous avons vérifié que la

technique de purification par ficoll hystopaque 1077 était la plus adaptée. Elle a été comparée

à la technique reposant sur un double ficoll 1119 - 5 mL - et 1077 - 5 mL -. Lors de cette

purification, réalisée à une vitesse de 700xg pendant 30 minutes, les PNN sont concentrés à

partir de l’interface des deux ficolls. L’étape de lyse est donc évitée, rendant la méthode

moins agressive. Cependant, des préparations ayant lieu en parallèle selon les deux méthodes

et pour les mêmes donneurs fournissent une quantité moindre de PNN avec la méthode du

double gradient. Cette procédure va à l’encontre de l’obtention d’un maximum de PNN afin

de tester simultanément le plus grand nombre possible de sérums. Avec la technique du

simple ficoll, 6 ou 7 tubes de sang contenant chacun 6 mL environ sont nécessaires - ces tubes

104

de sang pouvant être issus de différents donneurs - pour tester une quarantaine de sérums. Il

est difficile d’envisager une méthode moins productive.

Dans un test utilisant le même volume des deux préparations, nous avons observé une réponse

inférieure pour les PNN issus de la purification par double ficoll (cf figure 36). Cela signifie

que la concentration des PNN purifiés par simple gradient était correcte contrairement à celle

obtenue avec le double gradient malgré une procédure plus douce pour leur isolement. En

d’autre terme la qualité de la préparation ne compense pas son plus faible rendement.

0

50

100

150

200

250

300

350

0,0 4,8 9,5 14,3

19,0

23,8

28,5

33,3

38,0

42,8

47,5

temps (min)

inte

nsité

de

lum

ines

cenc

e (r

lu)

SHI et PNN extrait avec ficoll 1077

SHI et PNN extrait avec ficolls 1119et 1077

Figure 36 : Comparaison des deux méthodes de purification :

importance de la quantité sur la qualité

Il semblerait donc que la quantité des PNN additionnée soit réellement le facteur important et

qu’un minimum de 106 PNN par puits soit indispensable pour l’obtention d’une réponse avec

un seuil interprétable. La méthode d’isolement par double gradient n’a donc pas été retenue.

1.2.5) Optimisation de la réponse des polynucléaires

A partir de la méthode de purification des PNN par simple gradient, l’influence du type de

tube de prélèvement sur la capacité de réponse des PNN a été vérifiée. Nous avons utilisé

différents tubes d’analyses d’un même donneur : i) tube hépariné (LH), ii) tube traité à l’acide

citrique – dextrose (ACD) et iii) tube EDTA-K3. Nous avons constaté que les tubes de

prélèvement sanguin de type LH et ACD permettent d’obtenir la même capacité de

105

0

50

100

150

200

250

300

350

0,0

4,9

9,7

14,5

19,3

24,1

28,9

33,7

38,5

43,3

48,1

52,9

57,7

62,5

67,3

72,1

temps (min)

inte

nsi

té d

e lu

min

esce

nce

(rlu

)

PNN d'un Sénégalais A

PNN d'un Français

pool des PNN de 3 Sénégalais D, E, F

PNN d'un Sénégalais B

PNN d'un Sénégalais C

phagocytose des PNN. En revanche, les tubes de type EDTA-K3 permettent d’obtenir des

PNN induisant une poussée respiratoire plus intense et donc une meilleure intensité lumineuse

dans le test - réponse passant de 100 à 270 rlu -. Tous les prélèvements ont donc par la suite

été effectués avec des tubes EDTA-K3.

1.2.6) Utilisation de tous types de donneurs et de pools de polynucléaires

Pour terminer l’étude sur les PNN, nous avons vérifié deux points :

� les PNN peuvent fournir une poussée respiratoire dans ce test quelle que soit leur

origine ou l’état de santé du donneur;

� les PNN de différents donneurs peuvent être « poolés ».

Pour cela, nous avons étudié des PNN préparés à partir de certains dons volontaires : i) de

trois Sénégalais donneurs de sang à la Banque de sang de l’Hôpital Principal de Dakar - donc

à priori en bonne santé -, ii) d’un Français également en bonne santé et iii) de trois Sénégalais

venant faire un examen médical à l’Institut Pasteur de Dakar - les échantillons sanguins de ces

trois personnes ont été réunis -. Sur ces cinq lots de PNN, quatre ont fourni des réponses

significatives en chimiluminescence, comme on peut l’apprécier sur la figure 37. Un individu

(C) a quant à lui fourni une poussée respiratoire trop faible pour être étudiée.

Figure 37 : Test de chimiluminescence réalisé avec des donneurs d’origines différentes et un

pool de PNN. Profil type de réponse, réalisé avec le SHI.

106

Cet exemple illustre la variation de la poussée respiratoire obtenue. Celle-ci est liée au

donneur indépendamment de l’origine des individus. Elle n’a pas non plus de relation avec

l’état de santé du donneur car les individus faisant des examens médicaux peuvent représenter

de meilleurs donneurs qu’un individu à priori en bonne santé. Cette expérience confirme aussi

que un pool de PNN est utilisable dans ce test pour la mesure d’une réponse en

chimiluminescence.

Nous avons fait le choix par la suite de ne travailler qu’avec des pools de donneurs modulant

les effets de chaque donneur afin d’avoir une réponse moyenne. Ce résultat avait été montré

dans les essais préalables. Ainsi, nous dépendons moins des individus fournissant des

réponses trop faibles. Cependant, il est intéressant de noter que ces « non-réponses » en

chimiluminescence sont généralement observées lors de la saison des pluies. Elles seraient

donc plutôt dues à un phénomène biologique, cette saison correspondant à celle où l’on

recense le plus de maladies en général et de paludisme en particulier.

1.3) Standardisation des résultats

Ayant défini les méthodes à utiliser pour réaliser le test, il faut pouvoir s’assurer de sa

reproductibilité.

Selon les individus prélevés, les poussées respiratoires observées seront d’intensités

différentes. Cette variabilité inhérente aux donneurs de PNN est incontournable car nous

n’avons jamais le même lot de PNN fournissant la même intensité de chimiluminescence.

Cependant, pour tous les lots de PNN, nous observons une constante, à savoir un maximum

de chimiluminescence quasiment instantané : entre 0 et 10 min après le début du test.

Le test de chimiluminescence présente une très bonne reproductibilité intra-essai - coefficient

de variation (CV) ≤ 10% - mais il ne permet pas à partir des résultats bruts exprimés en unités

relatives de luminescence (rlu), d’obtenir une reproductibilité inter-essai suffisante. Il était

donc impératif de standardiser les réponses d’un jour à l’autre et permettre ainsi une

comparaison entre les différents résultats. Cet index a été appelé « ADPm » pour

« Phagocytose des merozoïtes Dépendante des Anticorps» (sigle en anglais). Il correspond à

une homogénéisation des résultats par rapport à un même contrôle positif (SHI) ramené à une

valeur arbitraire de 1000 pour chaque expérience. Cet index permet d’obtenir une très bonne

reproductibilité inter-essai - CV ≤ 20% -.

107

Fig

ure

38

: Diff

éren

ts p

rofil

s de

chi

milu

min

esce

nce

pou

vant

êtr

e ra

men

és à

une

val

eur

d’A

DP

m d

e 11

27 ±

5%

0

50

100

150

200

250

300

350

400

0 5 10 14 19 24 29 33 38 43 48 52 57

durée (min)

lum

ines

cenc

e (r

lu)

sans sérum

SHI : contrôle positif

serum naïf

serum immun

ADPm serum immun = 1126

Expérience du 18 janv 2006

0

50

100

150

200

250

300

350

400

0 5 9 14 18 23 27 32 37 41 46 50 55 60durée (min)

lum

ines

cenc

e (r

lu)

sans sérum


serum naïf

serum immun

Expérience du 20 déc 2005


0

50

100

150

200

250

300

350

400

0 5 10 16 21 27 34 39 44 51 57

durée (min)

lum

ines

cenc

e (r

lu)

sans sérum


serum naïf

serum immun


Expérience du 28 déc 2005

108

L’ADPm étant un index, il est considéré comme un ordre de grandeur de réponse. Aussi, une

très bonne reproductibilité des résultats est obtenue en tenant compte de la variabilité extrême

des paramètres dans les tests fonctionnels liés à P. falciparum.

L’exemple de la figure 38 montre bien cette variabilité de réponse des PNN qui peut être

contournée par le calcul normalisé de l’ADPm.

Nous avons donc au final un test fonctionnel reproductible. Il nous faut maintenant déterminer

le rôle des Ac dans ce test.

2) Les IgG, effecteurs moléculaires de la phagocytose immune

2.1) IgG et chimiluminescence

Afin de démontrer le rôle essentiel des IgG - hors Complément - dans le test de phagocytose

suivi par chimiluminescence, nous avons décomplémenté par chauffage - 20 min à 56°C - ou

déplété en IgG totales sur protéine G, sept sérums à fortes valeurs d’ADPm. Les IgG totales

ont également été purifiées. Ces sept sérums, sous leurs quatre formes d’étude, ont ensuite été

testés en chimiluminescence et la distribution des résultats est présentée sur la figure 39.

Figure 39 : Répartition des réponses ADPm pour 7 sérums testés sous leur forme :

(1) sérum, (2) sérum décomplémenté, (3) sérum déplété en IgG totales,

(4) IgG totales purifiées.

109

Plusieurs informations importantes concernant le test de chimiluminescence ont ainsi pu être

obtenues :

� la décomplémentation préalable des sérums n’est pas nécessaire, la réponse fournie par

un sérum avec ou sans la présence du Complément étant similaire - P = 0,46, test de

Wilcoxon -.

� les IgG purifiées sur protéine G fournissent la même réponse que le sérum dont elles

sont issues, aucune différence significative ne peut être notée - P = 0,4, test de Wilcoxon -.

� les sérums déplétés de leurs IgG fournissent une réponse négligeable comparée à la

réponse initiale du sérum.

Ces trois points prouvent donc que les IgG sont les effecteurs immuns de la réponse dans le

test de chimiluminescence tel qu’il a été développé.

Il est intéressant de mieux définir l’importance des IgG, ceci en utilisant les IgG caractérisées

par les tests ELISA réalisés sur la cohorte « Ndiop Non parasité ». Nous avons préalablement

stratifié la réponse ADPm observée selon cinq grands groupes de répondeurs définis au vu de

la distribution des réponses (cf figure 40A). Les distributions des réponses Ac obtenues en

ELISA sont représentées à la figure 40B en fonction des différentes classes de répondeurs en

ADPm.

Figure 40: A - Distribution de la réponse en ADPm à Ndiop. (n) représente le nombre

d’individus de chaque groupe;

B - Répartition des niveaux d’IgG totales contre les antigènes du mérozoïtes en fonction de la

distribution en ADPm.

Unités titres IgG totales

110

Les analyses ont alors montré qu’entre aucune réponse - groupe (0), ADPm < 100 - et une

mauvaise réponse - groupe (-), 100 ≤ ADPm < 200 -, aucune différence statistique de taux

d’IgG n’est observée - P = 0,39 -. En revanche, nous notons une élévation significative du

niveau d’Ac de mauvais à bons répondeurs - groupe (+), 200 ≤ ADPm < 400 - avec

P ≤ 0,0001, et de bons à très bons répondeurs - groupe (++), 400 ≤ ADPm < 600 -, P = 0,04.

Cependant, le niveau d’IgG reste constant entre les très bons et les forts répondeurs - groupe

(+++), ADPm ≥ 600 -, P = 0,88.

Les valeurs extrêmes d’ADPm, qu’elles soient positives ou négatives, ne sont donc pas

explicables uniquement sur la base des taux d’IgG. Cependant, ces taux permettent de

déterminer trois groupes de répondeurs en ADPm liés aux niveaux de réponses en IgG.

Cette étude a été complétée par des analyses en western blot, hybridés avec des sérums ayant

des valeurs d’ADPm très différentes (cf figure 41).

Figure 41 : Western-blots incluant le marqueur d’échelle (1), les protéines des mérozoïtes non

réduites (2) ou réduites par chauffage (3) et révélés avec : A - un sérum d’individu naïf,

B - le SHI, C à F - des sérums de Ndiop ayant des valeurs d’ADPm de 70 (C), 193 (D),

667 (E) et 1721 (F).

De cette expérience, il est apparu que les sérums présentant une réponse en ADPm nulle

(ADPm de 70, figure 41C), ont des IgG contre les Ag du mérozoïte, à la différence d’un

sérum naïf (figure 41A). Il est également apparu que les protéines de faible poids moléculaire

A B C D E F

1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3

0 +++ 0 - +++ +++

111

ne semblent pas être directement liées à la valeur de l’ADPm, les profils étant indifféremment

similaires ou différents quelles que soient les classes de répondeurs. En revanche, il semble y

avoir plus de protéines de haut poids moléculaire reconnues lorsque le sérum a un fort taux de

réponse en chimiluminescence.

Certaines de ces protéines de haut poids moléculaire seraient-elles particulièrement

importantes pour le système immunitaire et l’activation des PNN ?

2.2) Impact des sous classes d’IgG : IgG1 et IgG3

L’étape suivante a été d’étudier les niveaux de réponses en IgG cytophiles en fonction des

groupes de répondeurs ADPm. Nous avons trouvé des différences significatives entre le

groupe des faibles et bons répondeurs - IgG1 : P = 0,0005 ; IgG3 : P = 0,0002 - et entre les

groupes des bons et très bons répondeurs - IgG1 : P = 0,048 ; IgG3 : P = 0,0048 -. Nous

n’avons pas obtenu de différence significative expliquant les valeurs extrêmes d’ADPm -

IgG1 : P = 0,61 et 0,66 ; IgG3 : P = 0,27 et 0,59 - (cf figure 42).

Figure 42 : Distribution des taux d’IgG1 (A) et d’IgG3 (B)

suivant les groupes de répondeurs en ADPm

Les évolutions des taux d’IgG1 et IgG3 apparaissent donc comme très liées à la réponse en

chimiluminescence.

Unités titre IgG1

Unités titre IgG3

112

Il faut noter qu’il existe des individus isolés avec des taux importants d’IgG1 qui ne répondent

pas en chimiluminescence, ce qui n’existe pas avec les IgG3. Inversement, il existe des

individus isolés avec des taux relativement faibles d’IgG3 qui sont excellents répondeurs, ce

qui n’existe pas avec les IgG1.

Il semblerait donc que l’origine de la forte réponse en ADPm soit due à un rapport d’IgG1 et

d’IgG3, et non pas seulement un type d’IgG cytophiles.

Pour approfondir cette hypothèse, nous avons déterminé les ratios IgG3/IgG1. Ils ont ensuite

été stratifiés en 3 groupes : valeur < 0,5, entre 0,5 et 1, et ≥ 1. Ces groupes ont été comparés à

la valeur de l’ADPm en continue à l’aide d’un test de Spearman. Pour les IgG3/IgG1 < 0,5,

une corrélation significative a été observée - P = 0,0016, rho = 0,40 -. Aucune relation

significative n’a pu être obtenue pour les deux autres groupes - 0,5 ≤ IgG3/IgG1 < 1 :

P = 0,82 ; IgG3/IgG1 ≥ 1 : P = 0,49 -. Ce résultat laisserait supposer que les IgG1 doivent

être en quantité nettement supérieure aux IgG3 pour favoriser la chimiluminescence.

Cependant, cela n’est pas suffisant, la corrélation obtenue n’étant que de 40%.

3) Résultats obtenus avec la cohorte d’étude

3.1) Résultats globaux : comparaison des deux villages

La méthodologie du test de chimiluminescence validé, l’étape suivante a été l’analyse de ses

caractéristiques en tant que marqueur de l’immunité pour les deux zones d’endémie testées.

Nous avons trouvé pour celles-ci des niveaux de réponses statistiquement différents -

P = 0,0019 -. Le niveau de réponse est plus élevé à Dielmo, zone d’holoendémie - 119

individus testés -, qu’à Ndiop, zone de mésoendémie - 114 individus testés -. Le 25ème

percentile de l’un correspond à la médiane de l’autre, comme le montre la répartition des

résultats à la figure 43.

113

Figure 43 : Distribution de la réponse ADPm en fonction de la zone d’endémie

Il semblerait donc que plus le niveau d’immunité des populations est élevé et plus le niveau

d’ADPm obtenu est important.

3.1.1) Corrélation entre l’ADPm et l’âge

Le but de ce test est de pouvoir analyser in vitro le degré d’immunité acquise in vivo.

Les différentes classes d’âges étant définies comme liées à l’immunité clinique de manière

bien stratifiée, il est important de vérifier qu’une corrélation entre les classes d’âge et les

résultats du test de chimiluminescence existe.

Une analyse statistique menée avec le test de Kruskal Wallis a permis de montrer que pour les

deux villages, la valeur d’ADPm est hautement dépendante des strates d’âge - P < 0,0001 -.

Figure 44 : Moyennes d’ADPm observées par classes d’âge et par village

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

Moy

. des

cel

lule

s

ADPm

Nd, 3

Nd, 2

Nd, 1

D, 3

D, 2

D, 1

Diag. en bâtonsEclaté par : Nd/D, stratAgesBarres d’erreurs : ± 1 Erreur(s) standard(s)

Dielmo Ndiop

2-6 7-14 ≥ 15 2-14 15-29 ≥ 30

ADPm

Age (ans)

* *

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

Moy

. des

cel

lule

s

ADPm

Nd, 3

Nd, 2

Nd, 1

D, 3

D, 2

D, 1


Dielmo Ndiop

2-6 7-14 ≥ 15 2-14 15-29 ≥ 30

ADPm

Age (ans)

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

Moy

. des

cel

lule

s

ADPm

Nd, 3

Nd, 2

Nd, 1

D, 3

D, 2

D, 1


Dielmo Ndiop

2-6 7-14 ≥ 15 2-14 15-29 ≥ 30

ADPm

Age (ans)

* *

114

Les moyennes d’âge observées pour les différents groupes sont respectivement à Dielmo et à

Ndiop de 154 et 162 pour la classe 1, de 247 et 307 pour la classe 2 et de 380 et 394 pour la

classe 3 (cf figure 44). Les classes 1 et 3 ont donc globalement la même réponse pour les deux

zones d’endémie.

3.1.2) Corrélation entre l’ADPm et la parasitémie circulante

Si l’on évalue l’impact de la présence du portage asymptomatique sur la réponse en

chimiluminescence, on observe dans les deux villages une baisse de réponse en ADPm pour

les personnes parasitées (cf figure 45). Cependant cette baisse est non significative à Ndiop -

P = 0,9 - où 22% de la population d’étude est parasitée. Cette diminution est à l’inverse

hautement significative à Dielmo - P < 0,0001 - où 53% de la population était parasitée au

moment du prélèvement.

Figure 45 : Impact de la parasitémie circulante dans les deux zones d’étude

A Dielmo, la relation entre l’ADPm et la parasitémie est analysée en dichotomisant cette

dernière variable en faiblement parasitées - F1 et F2 - et fortement parasitées - F3 à F5 - (cf

figure 46). On observe une diminution significative de l’ADPm entre les non et faiblement

parasitées - P = 0,0009 -. Elle est en revanche non significative entre les faiblement et les

fortement parasitées - P = 0,2 -.

L’ADPm a donc une relation avec la présence de parasites mais le lien avec la charge

parasitaire mesurée dans le sang est moins évident.

Parasités

Dielmo Ndiop

ADPm

Parasités

Dielmo Ndiop

ADPm

115

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

Moy

. des

cel

lule

s po

ur A

DP

m

D, 0 D, 1-2 D, 3-5

Diag. en bâtonsVariable(s) de groupe : Nd/D, stratParaBarres d’erreurs : ± 1 Erreur(s) standard(s)Critère d’inclusion : Dielmo de double transversale .xls (importé)

ADPm

0 F1+F2 F3+F4+F5

*

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

Moy

. des

cel

lule

s po

ur A

DP

m

D, 0 D, 1-2 D, 3-5

Diag. en bâtonsVariable(s) de groupe : Nd/D, stratParaBarres d’erreurs : ± 1 Erreur(s) standard(s)Critère d’inclusion : Dielmo de double transversale .xls (importé)

ADPm

0 F1+F2 F3+F4+F5

*

Figure 46 : Stratification de la réponse en ADPm par rapport à l’intensité de la parasitémie

à Dielmo

Cette corrélation entre l’ADPm et le fait d’être ou non parasité laisse supposer que ce sont les

mêmes Ac qui jouent un rôle important dans la phagocytose immune par les PNN et le

« contrôle » de la parasitémie circulante.

3.1.3) Corrélation entre l’ADPm et l’hémoglobine AS

Pour les deux zones d’étude, aucune relation n’a été trouvée entre la réponse en

chimiluminescence et le fait d’être ou non drépanocytaire AS - P = 0,3 à Ndiop et 0,9 à

Dielmo -. Les Ac fonctionnels dans ce test n’ont pas de relation avec le type d’hémoglobine.

Ce résultat était prévisible, ce test étant basé sur les formes libres du parasite et non pas sur le

GR.

3.1.4) Corrélation entre l’ADPm et la protection clinique

Nous avons également réalisé des études prospectives de corrélation entre la protection

clinique et le taux d’ADPm grâce à la disponibilité d’un nombre suffisant de résultats

fonctionnels et de données cliniques précises. La variable individuelle d’ADPm a été testée en

continu ou avec différents seuils. Les critères d’Akaïké (AIC) ont permis de définir les

modèles les plus représentatifs.

A Ndiop, deux modèles de régression de Poisson ont été testés : l’un avec l’ADPm en variable

continue, l’autre en variable dichotomisée avec un seuil à 250 - valeur proche de la moyenne

observée dans le village -. Une corrélation a été trouvée en tenant compte de l’âge entre une

116

baisse du taux d’ADPm et l’augmentation du risque clinique (cf tableau XVII). Le meilleur de

ces deux modèles, du point de vue du critère d’AIC, est celui avec la dichotomie à 250. Une

personne dont l’ADPm a été trouvé en dessous de ce seuil aura une probabilité de faire 1,8

fois plus d’accès qu’un individu du même âge dont l’ADPm a été trouvé supérieur ou égal à

250. Autrement dit, si ce dernier individu fait 3 accès dans les 6 mois suivant le prélèvement,

celui du même âge n’ayant pas atteint ce seuil de réponse au test de phagocytose en fera 5 ou

6 pendant la même période.

Tableau XVII : Régressions de Poisson pour l’étude du risque d’accès palustres en fonction

de l’ADPm à Ndiop (l’ADPm en continu est sous sa forme dégressive)

RR 95%CI P RR 95%CI P

ADPm

Continu 1,002 1,001-1,003 0,049

Dichotomisé

≥250 1

<250 1,789 1,038-3,077 0,036

Age (ans) <0,001 <0,001

≥30 1 1

15-29 3,298 1,220-8,915 0,019 3,203 1,182-8,681 0,022

2-14 12,239 4,868-30,773 <0.001 12,627 5,036-31,660 <0,001

Deviance 118,6 118,4

AIC 120,6 120,4

Modèle 1 Modèle 2

Si l’on teste également la morbidité observée à Dielmo, nous obtenons des résultats similaires.

En effet, trois modèles de « variable ADPm » ont été retenus, un avec l’ADPm en continu et

deux avec l’ADPm dichotomisé avec un seuil à 300 - proche de la moyenne des réponses

observées pour le village - ou à 250 - seuil trouvé pour l’étude à Ndiop -. Ces trois modèles

fournissent une corrélation significative entre une baisse de la chimiluminescence et

l’augmentation du risque clinique (cf tableau XVIII).

Le meilleur modèle trouvé selon l’AIC est celui avec la même dichotomie qu’à Ndiop. Aussi,

à Dielmo, une personne dont l’ADPm a été trouvée en dessous du seuil à 250 aura une

probabilité de faire 17,5 fois plus d’accès qu’un individu du même âge dont l’ADPm a été

trouvée supérieure ou égale à 250. Soit, si ce dernier individu fait 1 accès dans les 6 mois

suivant le prélèvement, celui du même âge n’ayant pas atteint ce seuil de réponse au test de

phagocytose en ferait 17 ou 18 pendant la même période.

117

RR 95%CI P RR 95%CI P RR 95%CI P

ADPm

Continu 1,005 1,001-1,008 0,006

Dichotomisé

≥300 1

<300 12,150 1,653-89,302 0,014

≥250 1

<250 17,509 2,275-134,744 0,006

Age (ans) <0,001 <0,001 <0,001

≥15 1 1 1

7-14 4,233 1,133-15,823 0,032 3,827 1,027-14,256 0,046 2,876 0,759-10,904 0,120

2-6 31,944 9,189-111,052 <0,001 41,130 12,590-134,371 <0,001 17,637 5,042-61,690 <0,001

Hb

AA n'apporte rien au modèle n'apporte rien au modèle 1

AS 0,790 0,291-2,141 0,643

scoretest Hb NS NS 0,035

Deviance 111,8 106,6 86,7

AIC 113,8 108,6 90,7

Modèle 3Modèle 1 Modèle 2

Tableau XVIII : Régressions de Poisson pour l’étude du risque d’accès palustre en fonction de

l’ADPm à Dielmo (l’ADPm en continu est sous sa forme dégressive)

Cependant, ce résultat, confirmant fortement celui trouvé à Ndiop, est à interpréter avec

précaution du point de vue des valeurs absolues. En effet, bien qu’étant significatif - P =

0,006 -, l’intervalle de confiance trouvé pour le risque relatif est large - de 2,3 à 134,7 -.

Celui-ci peut se justifier par la faible quantité et la distribution particulière des individus

faisant des accès palustres dans cette zone d’étude, rendant les analyses de morbidité et donc

protection clinique difficiles à réaliser avec précision (cf Partie IIIA §2).

4) Etude fonctionnelle des candidats vaccins

Après avoir étudier la fiabilité et l’importance de ce test comme outil de détection du degré

d’immunité acquise, nous l’avons ensuite évalué pour un deuxième axe important

d’utilisation : tester la fonctionnalité des Ac liés aux candidats vaccins.

Dans cette partie de l’étude, nous avons utilisé le test de chimiluminescence comme un outil

potentiel de « sélection » des candidats vaccins du point de vue de ce type de réponse

immunitaire. Cependant, les candidats ne répondant pas de façon positive au test ne sont pas à

proscrire, celui-ci ne modélisant in vitro qu’une forme de réponse immune. En revanche, pour

118

les candidats vaccins y répondant positivement, il peut fournir un argument supplémentaire en

faveur de leur développement et de leur suivi en essais cliniques.

4.1) Etude à partir des sérums déplétés

Tester en parallèle les sérums sous leur forme intacte et déplétée permet de juger par

comparaison l’impact éventuel des candidats vaccins dont les Ac ont été déplétés. Cette

solution est la plus adaptée pour deux raisons :

� la déplétion est efficace, facile et rapide à réaliser ;

� des essais à partir d’IgG spécifiques purifiées peuvent être réalisés.

Pour les IgG anti-MSP4p20 purifiées, aucune poussée respiratoire significative n’a pu être

observée. Cependant la déplétion en Ac anti-MSP4p20 a un impact mesurable en

chimiluminescence. Il est possible pour les IgG purifiées qu’un seul type d’Ac ne suffise pas à

créer une poussée respiratoire suffisamment conséquente. Une addition de plusieurs types

d’Ac semble donc nécessaire. Ainsi, l’utilisation d’Ac spécifiques purifiés peut sembler peu

concluante par rapport aux sérums déplétés.

Les différents résultats obtenus avec les sérums déplétés, détaillés ci-après, sont représentés

sur la figure 47.

21 sérums forts répondeurs contre MSP1p19 et en ADPm ont été testés, sous leur forme

native et déplétée par ce candidat vaccin. Une diminution du tiers de la réponse en

chimiluminescence a été observée pour les sérums déplétés, la moyenne des réponses

d’ADPm diminuant d’une valeur de 548 à 388. Cette diminution est significative - P = 0,002,

rangs de Wilcoxon -. Sur ces 21 sérums, seuls trois ne permettent pas d’observer une

diminution avec leur correspondant déplété.

Concernant l’étude de MSP4p20, 23 sérums forts répondeurs en ELISA et

chimiluminescence ont été déplétés. Une diminution de près de 50% de la réponse en

chimiluminescence en absence d’Ac anti-MSP4p20 a été observée - P < 0,0001 -. La

moyenne des réponses ADPm a diminué de 522 à 239. La déplétion en Ac anti-MSP4p20 fait

chuter la moyenne d’ADPm sous la barre des 250, seuil défini par les études de morbidité

119

pour l’augmentation significative du risque clinique. Sur les 23 sérums testés, seules deux

déplétions n’ont pas engendré de baisse de la chimiluminescence.

Figure 47 : Impact des déplétions des anticorps de différents candidats vaccins

sur la réponse en ADPm (I : sérums intacts, D: sérums déplétés ou saturés)

Concernant MSP5, les huit premiers sérums testés n’ayant pas fourni de résultats concluants,

la cohorte d’étude n’a pas été élargie. En effet, la très légère diminution globale observée -

l’ADPm moyen diminue de 302 à 277 - n’est pas significative - P = 0,78 -. Seuls 3 des 8

sérums testés sont responsables de cette diminution.

Nous avons également souhaité avoir, pour valider l’étude, un contrôle négatif. Pour cela,

nous avons testé les sérums saturés en R45. En effet, étant un Ag du GRp, il ne doit pas ou

peu agir dans la réponse contre le mérozoïte. Nous avons alors obtenu des résultats similaires

à ceux de MSP5, voire même avec un impact supérieur. Sur les dix sérums testés, six ont été

responsables d’une légère baisse de la réponse moyenne en ADPm - de 308 à 267 -, mais

celle-ci est non significative - P = 0,14 -.

Pour finir, il nous fallait également étudier l’impact des déplétions multiples. Nous avons

donc testé 11 sérums à la fois forts répondeurs en Ac anti -MSP1p19 et -MSP4p20 afin de

Etude MSP1p19 Etude MSP4p20 Etude MSP5

EtudeMSP1p19 + MSP4p20Etude R45

* *

*

I D I D I D

I D I D

Etude MSP1p19 Etude MSP4p20 Etude MSP5Etude MSP1p19 Etude MSP4p20 Etude MSP5



* *

*

I D I D I D

I D I D

120

déterminer l’effet conjugué des deux. Une perte de la réponse en ADPm de l’ordre des 2/3 est

alors observable, la moyenne diminuant de 652 à 198 - P = 0,005 -. Cette dernière valeur est

encore une fois inférieure au seuil défini par rapport à la clinique de 250.

Cependant, bien que cette méthode d’étude par déplétion des Ac liés aux candidats vaccins

soit correcte, les procédures avec des déplétions multiples le sont nettement moins, voire

impossibles pour trois déplétions ou plus. En effet, une déplétion excessive en Ac contre des

cibles différentes fait que nous n’observons plus aucune réponse en chimiluminescence.

4.2) Etude en chimiluminescence des mérozoïtes transgéniques D10-PcMEGF

Pour tester l’impact des Ac anti-MSP1p19, les mérozoïtes issus de la souche transgénique

D10-PcMEGF ont également été utilisés. Ces parasites, comme nous l’avons vu

précédemment (cf Partie I § 5.1.1), ont la particularité de ne pas être affectés par les Ac anti-

PfMSP1p19. Leur emploi nous permet donc, en les comparant avec la souche contrôle - D10-

PfM3’ -, de déterminer l’impact de ces Ac sur la chimiluminescence. Nous réalisons donc

ainsi une approche parallèle de l’expérience précédente utilisant les sérums déplétés. Sans

avoir à extraire les Ac du sérum, c’est l’Ag PfMSP1p19 qui est masqué.

22 sérums ayant une réponse en ELISA supérieure à 100 unités arbitraires du point de vue de

la réponse anti-MSP1p19 ont alors été étudiés. Ils ont quasiment tous induit une baisse

significative de leur réponse, comme nous pouvons le visualiser à la figure 48.

Globalement, cette diminution hautement significative de la poussée respiratoire - P < 0,0001

- correspond à une perte de 32% de la réponse. Nous retrouvons donc une réponse similaire à

celle des sérums déplétés. De plus, le contrôle négatif testé est quant à lui resté inchangé, bien

que n’étant pas noyé dans le bruit de fond.

121

Figure 48 : Comparaison des valeurs d’ADPm obtenues avec des sérums possédant un taux

important d’anticorps anti-MSP1p19 pour deux souches transgéniques de mérozoïtes,

exprimant (D10-PfM3’) ou non (D10-PcMEGF) l’antigène PfMSP1p19.

4.3) Effet de la surcharge des sérums en Ac anti-MSP4p20

Les IgG anti-MSP4p20 purifiées ne fournissant pas de réponse directe en chimiluminescence

mais étant impliquées significativement dans ce phénomène, nous avons testé l’effet de leur

addition dans divers types de sérums calibrés. Nous avons sélectionné des sérums d’individus

avec différents profils: i) ADPm nulle et pas d’Ac anti-MSP4p20, ii) ADPm moyenne mais

toujours sans Ac anti-MSP4p20, iii) ADPm nulle avec cette fois des Ac anti-MSP4p20 et iv)

ADPm bonne avec peu d’Ac anti-MSP4p20 - 2 individus différents pour chaque cas -.

Nous avons préalablement vérifié avec des sérums forts répondeurs que la quantité de sérum

pouvait être diminuée à 5 µL sans modification notable de la valeur d’ADPm.

Nous avons donc ensuite pu tester les sérums sélectionnés dans les conditions : i) contrôle : 5

µL de sérum + 5 µL de PBS 1x, ii) « vaccination » : 5 µL de sérum + 5 µL d’Ac spécifiques

anti-MSP4p20 issus d’habitants de Dielmo. Point important, ces Ac ont toujours été conservés

à +4°C afin de ne pas risquer une dénaturation possible des IgG en cas de décongélation au vu

de leur relativement faible concentration.

Cependant, cette supplémentation en Ac n’a eu aucun impact sur le taux d’ADPm dans les

différentes configurations.

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

AD

Pm

1

D10-PfM3'

D10-PcMEGF

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

AD

Pm

1

D10-PfM3'

D10-PcMEGF

122

TOUS 2-14 ans 15-29 ans ≥ 30 ans TOUS 2-6 ans 7-14 ans ≥ 15 ans

MSP1p19 vs ADPmrho=0,68 P <0,0001

rho=0,53 P =0,0003

rho=0,67 P =0,0002

rho=0,62 P =0,0004

rho=0,71 P <0,0001

NSrho=0,57 P =0,002

rho=0,67 P <0,0001

MSP4p20 vs ADPmrho=0,53 P <0,0001

rho=0,39 P =0,007

rho=0,73 P <0,0001

NSrho=0,40 P <0,0001

rho=0,73 P =0,002

NSrho=0,42 P =0,0005

MSP5 vs ADPmrho=0,40 P <0,0001

NS NS NSrho=0,33 P =0,0003

NS NSrho=0,34 P =0,006

R23 vs ADPmrho=0,50 P <0,0001

rho=0,37 P =0,0112

NSrho=0,52 P =0,003

rho=0,30 P =0,0013

NS NS NS

NDIOP DIELMO

4.4) Corrélations entre les réponses obtenues en ELISA et celles en chimiluminescence

Nous avons, en dernière analyse, étudié les corrélations entre les résultats ELISA concernant

les réponses Ac contre les différents candidats vaccins - exprimés en ratio de densité optique -

et les réponses obtenues en chimiluminescence - analysées en ADPm -. En tenant compte des

corrections de Bonferroni pour cette étude, le seuil de signification est abaissé à 0,0125. Les

résultats obtenus, par village et par classe d’âge, sont présentés dans le tableau XIX.

Tableau XIX : corrélations de Spearman entre les réponses anticorps visant les candidats

vaccins et l’ADPm, en prenant compte des corrections de Bonferroni.

Si, dans un premier temps, nous ne tenons pas compte des groupes d’âge et observons la

relation globale, nous notons que tous les candidats vaccins étudiés, qu’ils soient ou non liés

au mérozoïtes, engendrent une réponse Ac reliée à la réponse en ADPm. Ces corrélations sont

toutes hautement significatives - P ≤ 0,0013 -.

Excepté pour les Ac anti-MSP1p19 qui sont reliés plus fortement avec l’ADPm à Dielmo -

71% contre 68% à Ndiop -, les trois autres constructions vaccinales induisent des Ac mieux

reliés à la chimiluminescence à Ndiop qu’à Dielmo, avec respectivement : 53% et 40% pour

les Ac anti-MSP4p20, 40% et 33% pour les anti-MSP5, 50% et 30% pour les anti-R23.

Notons que :

� la réponse anti-MSP1p19 apparaît comme mieux reliée à l’ADPm que la réponse anti-

MSP4p20, résultat allant en sens inverse de celui obtenu à partir de l’étude avec les sérums

déplétés ;

� la réponse anti-R23 apparaît de façon globale comme mieux associée au résultat

d’ADPm que MSP5, qui est pourtant un Ag du mérozoïte. Ce résultat tend à confirmer la non

123

dépendance de la chimiluminescence aux Ac anti-MSP5, résultat trouvé avec l’analyse des

sérums déplétés.

Afin de s’affranchir de l’impact de l’âge sur le statut immun et donc sur l’importance de la

poussée respiratoire, les corrélations sont analysées par groupe d’âge. Nous obtenons alors

des corrélations avec des significations généralement plus faibles, voire même inexistantes.

Les absences de relation liées à MSP4p20 dans les deux villages ou à MSP5 à Ndiop le sont

en prenant compte des corrections de Bonferroni - 0,04 ≤ P ≤ 0,0127. Il pourrait donc suffire

de peu d’individus supplémentaires pour éventuellement observer des relations significatives.

Ces résultats sont donc à interpréter avec prudence. Cependant, concernant la relation non

significative observée pour la classe d’âge 1 à Dielmo avec les Ac anti-MSP1p19 ou celles

liées à MSP5 à Dielmo ou à R23 dans les deux villages, celles-ci sont relativement plus fortes,

donc plus fiables.

124


C/ ANALYSE DE L’INHIBITION DE

CULTURE DEPENDANTE DES ANTICORPS

Nous souhaitions comparer les résultats obtenus pour deux types de fonctionnalités différentes

des Ac : avec coopération ou directe. Il fallait donc étudier un autre test en plus de celui de

chimiluminescence précédemment développé.

Dans le test d’inhibition de culture, qui est devenu une référence internationale en terme

d’étude de fonctionnalité des Ac, ceux-ci jouent un rôle direct bloquant. Nous avons donc

souhaité approfondir l’étude de ce test également.

Des analyses précédentes réalisées au laboratoire avaient défini l’hématocrite et le

pourcentage de sérum à utiliser pour la réalisation de ce type de test en macro méthode

(Diouf, 2002). Des études en cytofluorométrie avaient déjà été initiées dans ces conditions

(Diatta, 2004). Nous les avons donc reprises afin de pouvoir les adapter en micro méthode

automatisable.

1) Lecture par cytométrie en flux

La cytofluorométrie en flux est une technique permettant d’analyser, en moins d’une minute,

plusieurs milliers de GR - généralement entre 50 000 et 100 000 -. Une bonne estimation de la

parasitémie est ainsi obtenue, en un temps très court. De plus, l’Institut Pasteur de Dakar

possède un FACScalibur équipé d’un système HTS, permettant une analyse automatisée en

micro méthode. La cytométrie en flux nous a donc semblé la technique la plus adaptée à la

lecture des tests d’inhibition de culture. Aussi, nous avons repris les études d’inhibition

précédemment réalisées. L’hématocrite et le pourcentage de sérum prédéfinis ont été

conservés tout en étant ramenés au volume adéquat pour une étude en plaque de 96 puits - 2

µL de GRp et 20 µL de sérum suffisent -.

125

A B

1.1) Le choix du marqueur de fluorescence : HE à la place de TO

Les études réalisées en cytofluorométrie au laboratoire l’étaient jusqu’à présent avec détection

par thiazole orange (TO). Or, ce fluorochrome présente l’inconvénient de ne pas distinguer les

formes parasitaires jeunes des GR sains. Seules les formes âgées sont clairement identifiées,

comme le montrent les analyses de la figure 49 (M2 et R2).

Figure 49 : Détection par thiazole orange avec analyse en histogramme (A) et dot plot (B).

M1 et R1 correspondent à des érythrocytes parasités par des formes trophozoïtes,

M2 et R2 par des formes schizontes.

Cette figure représente deux des différents types d’analyse possibles : l’analyse par

histogramme (49A) et celle par dot plot (49B). Ce sont les deux types d’analyse les plus

fréquemment utilisés.

Le dot plot permet de distinguer les GR en quantité moindre, moins aisément détectables avec

un histogramme. De plus la qualité du réglage - voltages utilisés et compensations réalisées -

est plus aisée à vérifier par dot plot que par histogramme, car nous avons des « taches » de

réponses et non pas des pics plus ou moins larges.

Dans un premier temps, pour résoudre le problème de détection partielle, nous avons souhaité

tester un autre fluorochrome. L’utilisation de l’hydroéthidine (HE) en lieu et place du TO a

alors été étudiée. Ce marqueur est décrit comme permettant la détection de toutes les formes

parasitaires, quel que soit leur âge (Jouin, 2004). De plus, c’est un marqueur de viabilité :

seuls les parasites toujours vivants sont détectés. La figure 50 représente exactement la même

population parasitaire que la figure 49, mais avec une détection par HE. Nous notons alors

que, même sous la forme histogramme, les formes trophozoïtes peuvent clairement être

observées. La résolution est donc augmentée et la parasitémie a été trouvée grandement

126

B A

diminuée, de 10% à 7% environ, ce qui s’explique en grande partie par la meilleure séparation

d’avec les GR non parasités.

Figure 50 : Détection par hydroéthidine. M1 et R1 correspondent à des érythrocytes parasités

par des formes trophozoïtes, M2 et R2 par des formes schizontes.

Souhaitant également tester l’impact de l’HE sur les formes parasitaires jeunes, nous avons

marqué une autre culture composée au moment de l’étude de formes anneaux et trophozoïtes.

Bien que ces deux populations ne soient pas distinguables des formes saines en TO (figure

51A), elles sont bien distinctes en HE (figure 51B).

Figure 51 : Détection d’une culture parasitaire composée d’anneaux et trophozoïtes

par TO (A) ou HE (B).

Enfin, si nous comparons le bruit de fond inhérent à chaque type de marquage, l’usage de

l’HE apparaît encore comme préférable. Le bruit de fond obtenu avec ce dernier marqueur

correspondant aux faux positifs obtenus, c’est-à-dire à un pourcentage de parasitémie pour

une étude de GR sains, est de 0,13% alors qu’avec le TO nous obtenons 0,4%. Le bruit de

fond est donc diminué de plus de moitié en utilisant l’HE. C’est un résultat non négligeable,

d’autant plus qu’il n’est pas déductible des pourcentages obtenus, la règle de base en

cytofluorométrie étant de ne jamais rien soustraire.

B A

127

Il est ainsi plus intéressant d’utiliser l’HE au détriment du TO. L’HE permet d’identifier

clairement les différentes populations parasitaires, de les isoler en fonction de leur âge et donc

d’obtenir une meilleure précision de lecture.

1.2) Des problèmes de reproductibilité

Nous n’avons pas pu continuer l’étude en testant l’inhibition due à nos différents sérums

immuns à cause de nombreux problèmes lors des réglages et lectures automatisées des

plaques par HTS.

1.2.1) Des doubles marquages impossibles

La première incohérence notée a été le décalage des populations saines d’un marqueur à

l’autre. Normalement, les populations saines doivent être positionnées par réglages des

voltages afin d’être comprises dans le carré de fluorescence négative - valeurs inférieures à

101 dans les différents canaux -. Une fois ce réglage défini, il ne doit plus être modifié selon

les marqueurs, et seules des compensations de fluorescence doivent être réalisées. Ainsi, des

marquages multiples peuvent être effectués afin de mieux définir la population étudiée. Ceci

a pu être réalisé sur le FACScalibur de l’Institut Pasteur de Paris. Or, réaliser des doubles

marquages TO/HE s’est révélé impossible sur l’appareil de l’Institut Pasteur de Dakar, les

populations saines étant complètement décalées lorsque le marqueur est modifié. Si les

réglages du négatif sont définis à partir du TO (figure 52A), lors du passage à un marquage à

l’HE, les formes saines se retrouvent en lieu et place des formes parasitées (figure 52B). Si

l’on effectue à l’inverse le réglage du négatif à partir d’un marquage des formes saines à l’HE

(figure 52C), lorsque l’on se trouve en présence d’un marquage par TO, les formes saines

« disparaissent » (figure 52D).

128

Figure 52 : Visualisation de globules rouges sains marqués par TO (A-D) et HE (B-C), en

fonction que les réglages aient été réalisés à partir de la solution contenant TO (A) ou HE (C).

Ces déplacements de populations neutres en fonction des marquages ne devraient pas exister

et nous ont amené à nous poser les premières questions sur le FACScalibur utilisé. Des billes

CaliBRITE et le logiciel FACScomp ont donc été utilisés afin de recalibrer l’appareil si

besoin. Mais bien qu’ayant eu un rapport FACScomp tout a fait normal, le problème a

subsisté. L’alignement des lasers a également été vérifié et celui-ci s’est également révélé

normal. Nous avons donc repris nos études en considérant que tout double marquage se

révélait impossible pour une raison inconnue et avons fixé nos réglages à partir de l’HE pour

une analyse par HE.

1.2.2) Une autofluorescence qui n’en est pas une

Nous avons commencé des tests de reproductibilité de lecture avec l’HE par le système HTS.

La lecture par HTS repose sur des réglages préalables de l’appareil. Ceux-ci sont

obligatoirement réalisés en tube et sauvegardés avant d’être paramétrés dans le programme

Plate Manager qui gère la lecture par HTS. Par la suite, la lecture se fait donc de façon

entièrement automatisée et aucune ingérence de l’expérimentateur n’est tolérée par l’appareil.

Nous avons alors constaté un deuxième problème ressemblant à un phénomène

d’ « autofluorescence », à savoir une fluorescence non compensable n’ayant pas de raison

d’être. Celui-ci est visible à l’intersection des canaux FL1-FL2 et FL2-FL3. Une véritable

autofluorescence devant être visible sur tous les canaux, nous avons testé le canal FL4 dans

lequel nous n’avons observé aucune fluorescence. Cette hypothèse s’est par conséquent

révélée infondée.

Ce phénomène aurait pu être dû à une « fuite » du marqueur sur plusieurs canaux, phénomène

observable avec certains fluorochromes comme l’iodure de propidium qui fluoresce en FL2 et

A B

C D

129

FL3. Cette supposition était confortée par le fait que les compensations sont inutiles. Mais

dans ce cas comment expliquer qu’elle n’apparaisse pas systématiquement et ne soit pas

visible lors des tests en tubes réalisés sur l’appareil de l’Institut Pasteur de Paris ?

Pour un même sérum testé dans différents puits, ce phénomène est plus ou moins marqué

comme le montre la figure 53.

Figure 53 : « Fuite » de fluorescence plus ou moins importante sur la diagonale visualisée

pour une expérience en triplicata (sérum de personne immunisée)

Dans le cas représenté ici, nous notons clairement trois profils différents alors qu’il s’agit d’un

triplicata, et cela à cause de cette « fuite » le long de la diagonale. Si nous considérons comme

pourcentage de parasitémie tout ce qui fluoresce (R1), nous avons alors des pourcentages très

variés - 0,09%, 0,30% et 0,17% dans le cas présent -. Néanmoins, en faisant abstraction des

populations sur la diagonale (R2), nous obtenons une meilleure reproductibilité - 0,03%,

0,04% et 0,09 % -. Cependant l’apparition aléatoire de ce phénomène n’est pas « normale » et

ne devrait pas être observée.

1.2.3) Un écrasement qui ne correspond pourtant pas à une mort cellulaire

Nous avons également rencontré un troisième problème : la survenue d’un écrasement de la

réponse. Celui-ci se produit également de façon aléatoire, et non pas dans les derniers puits

d’étude. Dans l’exemple choisi à la figure 54, il a été observé au puits D09 alors qu’en E09

nous avons retrouvé un profil des cellules neutres relativement correct. Il ne s’agit donc pas

130

d’un phénomène de mort cellulaire car la composition des puits étant identique, il devrait

s’intensifier au fur et à mesure de l’étude, les puits étant lus ligne par ligne.

Figure 54 : Tassement de la réponse en FL2 (sérum humain passé en triplicata)

Le gros problème de ce phénomène est que les populations neutres « disparaissant »

partiellement du cadre de lecture, les populations parasitées se retrouvent en grande partie en

lieu et place des populations saines. Elles ne sont donc plus comptabilisées comme parasitées.

Ceci entraîne un gros problème du point de vue de la reproductibilité. L’étude étant

entièrement automatisée, ce phénomène n’est absolument pas contrôlable.

1.2.4) Remarques générales sur ces difficultés

Ces différentes difficultés ont été rencontrées essentiellement lors de l’utilisation du passeur

de plaque. Elles sont parfois observables lors de l’analyse en tube mais de façon généralement

atténuée et uniquement en travaillant sur le même appareil. Il semblerait que ces phénomènes

soient dus à des problèmes de pression. Ceux-ci sont bien entendu amplifiés lorsque les

quantités prélevées sont moindres.

Des microfuites et microfissures observables sur le système de pompage du FACScalibur

pourraient être à l’origine de ces problèmes.

L’appareil n’ayant pas été réparé sur ce point durant la période de cette thèse et l’Institut

Pasteur de Paris n’étant pas équipé d’un système HTS, nous n’avons pas pu continuer à

explorer cette voie, pourtant prometteuse.

131

0

,05

,1

,15

,2

,25

,3

Moy

. des

cel

lule

s

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san

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'0,5

% s

ans

blan

c

Col

onne

4

Plaq F

Maxisorp

Culture

Diag. en bâtonsEclaté par : plaqueBarres d’erreurs : ± 1 Erreur(s) standard(s)Critère d’inclusion : Concentré de GIA plaque.xls ( importé)

0

,05

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ans

blan

c

Plaq F

Maxisorp

Culture

Diag. en bâtonsEclaté par : plaqueBarres d’erreurs : ± 1 Erreur(s) standard(s)Critère d’inclusion : dilué de GIA plaque 060609.xl s (importé).svd

**

*

2% 1% 0,5% 0,25% 2% 1% 0,5% 0,25%Dépôt des GRp concentré Dépôt des GRp dilué

*Plaque culture

Plaque Maxisorp

Plaque ELISA F

0,3

0,2

0,1

0

0,3

0,2

0,1

00

,05

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Moy

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cel

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s

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% s

ans

blan

c

Col

onne

4

Plaq F

Maxisorp

Culture

Diag. en bâtonsEclaté par : plaqueBarres d’erreurs : ± 1 Erreur(s) standard(s)Critère d’inclusion : Concentré de GIA plaque.xls ( importé)

0

,05

,1

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Moy

. des

cel

lule

s

'2%

san

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san

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ans

blan

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blan

c

Plaq F

Maxisorp

Culture

Diag. en bâtonsEclaté par : plaqueBarres d’erreurs : ± 1 Erreur(s) standard(s)Critère d’inclusion : dilué de GIA plaque 060609.xl s (importé).svd

**

*

2% 1% 0,5% 0,25% 2% 1% 0,5% 0,25%Dépôt des GRp concentré Dépôt des GRp dilué

*Plaque culture

Plaque Maxisorp

Plaque ELISA F

0,3

0,2

0,1

0

0,3

0,2

0,1

0

0,3

0,2

0,1

0

0,3

0,2

0,1

0

2) Lecture par absorbance : détection de la pLDH

En raison des dysfonctionnements réitérés du cytofluoromètre, nous avons continué l’étude

avec une autre technique pour tenter d’obtenir des résultats plus reproductibles. Nous avons

alors testé les conditions standardisées par le NIH reposant sur une détection de la pLDH

(Zhou, 2005).

2.1) Domaine de définition du test et conditions de réalisation

En étudiant le protocole SOP décrivant cette méthode, nous nous sommes rendus compte

qu’elle avait été standardisée dans des conditions de travail et avec du matériel différent des

nôtres. Les cultures parasitaires sont réalisées dans des conditions gazées avec un milieu

composé de sérum humain, et la lecture du test est réalisée sur plaques Polysorp - plaques

particulières fixant les résidus hydrophobiques -. A l’Institut Pasteur de Dakar, nous utilisons

des plaques Immulon 4HBX, qui sont un équivalent des Polysorp. Cependant, cette étude a

été commencée à l’Institut Pasteur de Paris où nous n’avions que trois types de plaques à

notre disposition : des plaques de culture cellulaire, des plaques ELISA Nunc F - dont nous ne

connaissons pas le caractère hydrophile/hydrophobe - et des plaques Maxisorp qui fixent les

domaines hydrophobes et hydrophiles. Nous avons donc, dans un premier temps, souhaité

mesurer l’impact que pouvait avoir la plaque sur la révélation. Nous avons alors constaté que

selon le type de dépôt des GRp - en condition concentrée ou diluée -, l’utilisation d’une

plaque fixant ou non les résidus hydrophobiques pouvait avoir une influence.

� En condition de dépôt dilué, le type de plaque ne semble jouer qu’un rôle très mineur

� En condition de dépôt concentré, son rôle est beaucoup plus significatif et une plaque

Maxisorp semble souhaitable pour obtenir une plus grande échelle de réponse (cf figure 55).

Figure 55 : Impact du type de plaque et de dépôt sur les résultats du dosage de la pLDH

132

Nous avons donc par la suite préféré utiliser des plaques Maxisorp ou Immulon 4HBX, selon

nos possibilités.

Dans la standardisation des résultats, une limite supérieure de parasitémie de 4% est stipulée

pour la validité du test. Mais aucune limite inférieure n’est mentionnée. Or si l’on étudie les

ratios de parasitémie observés pour les plaques Maxisorp, on se rend compte qu’ils sont

globalement valables pour la dilution de 2% à 1% - 0,6 en dépôt concentré, 0,4 en dépôt dilué

- et entre 1% et 0,5% - 0,5 et 0,4 respectivement -. Cependant, le ratio n’est plus du tout

correct si l’on diminue à moins de 0,5% de parasitémie - entre 0,5% et 0,25%, ratios de 0,08

et 0,7 -.

Cette impossibilité de détecter de manière fiable des parasitémies de moins de 0,5% a été

retrouvée une fois à Dakar avec l’étude sur plaque Immulon 4HBX. L’étude a cette fois pris

en compte des parasitémies de 3%, 1,5%, 0,75% et 0,375%. En utilisant une quantité de GRp

de 1 µL comme définie dans les conditions standardisées et avec un dépôt en solution, nous

avons trouvé des ratios de dilution respectifs de 0,5 , 0,4 et seulement 0,2 pour la dernière

dilution. En revanche, si nous utilisons 2 µL de GRp, comme nous le faisions précédemment

pour le test en cytofluorométrie, nous obtenons un ratio correct pour les trois dilutions - 0,4,

0,5 et 0,4 respectivement -. Augmenter la quantité de GRp pourrait donc éventuellement

permettre une augmentation de la résolution du test.

2.2) Impact du Complément

Ayant développé précédemment un test ne dépendant pas du Complément, nous avons

également étudié l’impact de celui-ci sur ce test d’inhibition. Ce dernier est connu comme

nécessitant des sérums sans Complément.

Les sérums étudiés ont été décomplémentés par chauffage à 56°C et les inhibitions obtenues

avec ou sans la présence du Complément ont été comparées. Nous avons alors observé un rôle

majeur pour ce dernier, tous les sérums testés perdant globalement leur effet inhibiteur en

absence de Complément (cf figure 56).

133

-400

-350

-300

-250

-200

-150

-100

-50

0

50

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'346

63

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'346

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'346

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pl.

'346

59

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59 d

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pl.

Diag. en bâtonsBarres d’erreurs : ± 1 Erreur(s) standard(s)

C D C D C D C D C D

Sérums 1 2 3 4 5

-400

-350

-300

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pl.

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59

'346

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Diag. en bâtonsBarres d’erreurs : ± 1 Erreur(s) standard(s)

C D C D C D C D C D

Sérums 1 2 3 4 5

C D C D C D C D C D

Sérums 1 2 3 4 5

Figure 56 : pourcentages d’inhibition de culture parasitaire suivant que

les sérums soient intactes (C) ou décomplémentés (D)

Cependant, nous n’avons pas obtenu de reproductibilité dans les pourcentages d’inhibitions

d’une ligne à l’autre des plaques d’étude. Nous avons en effet observé cette diminution de

l’effet inhibiteur de façon systématique mais avec une variation de valeur très importante.

Pour exemple, le sérum 1 a varié de 24% à 109% d’inhibition en présence du Complément, et

de 16% à -46% en absence de ce dernier. Ces résultats sont donc à prendre avec précaution,

n’ayant pas pu observer de reproductibilité suffisante.

2.3) Des conditions standardisées non applicables dans nos conditions de croissance

parasitaire

L’origine du problème que nous avons rencontré avec ce test est due en grande partie aux

conditions de croissance parasitaire différentes entre la standardisation et la réalisation. En

effet, avec 1 µL de GRp à 0,3%, après un cycle et dans les conditions utilisées pour la

standardisation, la parasitémie finale obtenue est de 2-3%. En albumax et candle-jar, la

parasitémie augmente bien plus lentement quand les GR sont en faible quantité. Nous

n’atteignons généralement qu’une parasitémie de l’ordre de 0,5% après un cycle, or nous

avons vu que ce résultat est trop faible pour la détection par pLDH.

De plus, tous les puits d’étude ne sont pas réenvahis au même moment, un décalage a en effet

pu être visible par microscopie selon les sérums. Certains puits contenaient des parasites sous

forme anneaux exclusivement alors que pour d’autres, les parasites étaient toujours en

rosaces. Nous avions donc des puits ayant subi deux invasions alors que les autres n’en

avaient eu qu’une seule et cela pour une même durée de test. Cela rend l’étude très difficile,

134

voir impossible. Cette différence a été visible pour un test lancé 27H après la synchronisation

et un temps de GIA de 40H - analyse de 3D7 -. Il semblerait qu’un temps intermédiaire de

24H soit souhaitable, la durée standardisée de 23H ayant été à l’inverse trouvée trop courte.

La croissance parasitaire étant variable, la présence de formes trophozoïtes âgés est préférable

à une nouvelle réinvasion.

Le problème majeur dont nous n’avons pas pu nous affranchir est l’observation, dans nos

conditions, d’effets de croissance pour les sérums immuns supérieurs aux contrôles négatifs.

Cela s’explique par la richesse des sérums qui l’emporte sur l’action des Ac, la quantité des

parasites étant trop faible. Cela a été vérifié pour deux souches parasitaires : PA FCR3 et 3D7.

La méthode GIA, bien que standardisée, est valable pour des conditions de culture qui ne sont

pas les nôtres et la standardisation réalisée n’est pas utilisable dans notre cas. D’autres mises

au point sont nécessaires.

135

PARTIE IV : DISCUSSION

La problématique de base de ce travail était axée sur la validation d’un test fonctionnel. Celui-

ci devait être un reflet, éventuellement plus révélateur que d’autres, de l’immunité. Il devait

pouvoir servir de référence dans l’analyse des candidats vaccins. Le test de

chimiluminescence a répondu à ces exigences.

Cependant, nous ne pouvions étudier les candidats vaccins dans un test fonctionnel sans les

avoir au préalable analysés selon des méthodes plus « classiques » : réponses immunologiques

associées - tests ELISA - et relations avec différents facteurs épidémiologiques tels que l’âge

ou la protection clinique.

Il est important de souligner que le terme « protection » recouvre en réalité différents critères

d’étude. Les études de relation à la protection analysent généralement de façon prospective le

taux d’Ac vis-à-vis de la survenue d’évènements ultérieurs sur une durée plus ou moins

longue. Ces évènements étudiés peuvent être une protection contre la mort, contre les cas

graves, contre la survenue d’accès cliniques, contre l’apparition d’une parasitémie

circulante,… Aussi, lorsque différentes études de protection clinique sont comparées, il est

important de savoir si elles correspondent à l’analyse des mêmes facteurs sur une même

durée. Dans ce travail, nous avons étudié la survenue d’accès cliniques pendant 5,5 mois

suivant les prélèvements sanguins.

Le même type de question se pose lors de l’analyse des corrélations avec l’âge. Les cohortes

étudiées correspondent-elles à un même éventail d’âge et donc étudie-t-on réellement la

même chose? Nous avons travaillé sur une population dont l’âge est distribué entre 3 et 80

ans, en est-il de même pour les autres analyses de corrélation à l’âge avec lesquels nous

pourrions comparer nos résultats ?

Les divers points de cette étude sont discutés dans la suite de ce document : i) les réponses

immuno-épidémiologiques associés aux candidats vaccins étudiés à savoir MSP1p19,

MSP4p20, MSP5 et R23, ii) les tests fonctionnels et l’importance du test de

chimiluminescence développé, et iii) l’impact des Ac liés à certains candidats vaccins dans le

test de chimiluminescence.

136

1) Les taux d’anticorps contre certains candidats vaccins et leur corrélation avec la

protection

1.1) MSP1p19 : confirmation de son caractère majeur

Concernant la construction vaccinale MSP1p19 exprimée par le Baculovirus dans les cellules

d’insectes (BvMSP1p19), une réponse Ac supérieure à un ratio de DO de 7 est apparue

comme extrêmement importante d’un point de vue clinique. En effet, nous avons observé

dans les deux zones d’endémie étudiées, une protection clinique significativement plus élevée

chez les individus ayant atteint ou dépassé ce taux et ce, quelque soit l’âge. Nous avons

également remarqué que ce seuil de 7 est difficilement atteint chez les jeunes enfants. Le

challenge vaccinal pourrait donc être de permettre, dès le plus jeune âge, l’acquisition d’une

réponse Ac contre MSP1p19 suffisamment forte pour permettre une bonne protection

clinique.

Cette valeur de seuil est remarquablement constante. Elle a déjà été trouvé à plusieurs reprises

dans des études menées de manière totalement indépendantes, sur des séries de prélèvements

différents et par des manipulateurs distincts.

� A Ndiop, pour la saison de transmission de l’année 2000, un rDO inférieur à 7

entraînait un risque relatif de faire un accès clinique de 1,30 - P = 0,047, régression de

Poisson -. L’étude avait été réalisée à partir de sérums prélevés en juillet 2000 sur 205

volontaires de tout âge suivis cliniquement pendant cinq mois. Une moyenne de réponse Ac

de 8,1 rDO avait été obtenue (Perraut, 2005 A), résultat inférieur mais globalement similaire

à celui de notre étude pour le même village (9,3).

� En 1997, une étude de repositivation menée à Ndiop sur 110 volontaires a également

mis en relief ce seuil à 7 - moyenne de rDO de 8 -. Une relation significative a pu être établie

avec la durée comprise entre le traitement curatif par antipaludéen et la réapparition d’une

parasitémie - P < 0,01 -. Cependant, cette relation disparaissait quand l’âge était pris en

compte dans le modèle (Perraut, 2003). Ce phénomène peut être expliqué par un effectif

réduit de villageois analysés, fournissant moins de puissance aux tests statistiques.

L’association d’une réponse Ac anti-MSP1p19 supérieure ou égale à 7 rDO avec la

protection clinique est donc particulièrement pertinente, car ayant été retrouvée sur plusieurs

années et pour deux zones d’endémie différentes.

137

La qualité de cette réponse protectrice a pu être montrée par des tests immunologiques

(Garraud, 2002). BvMSP1p19 conduit in vitro, en présence de PBMC, à la production

essentiellement d’IgG1, accompagnées ou non d’IgG3. Ces deux sous-classes cytophiles sont

connues pour leurs effets protecteurs dans le cas du paludisme (Garraud, 2003). A l’inverse,

les IgG non cytophiles, IgG2 et IgG4, sont neutres ou bloquantes et donc potentiellement

impliquées dans les cas de paludisme aggravé (Soe, 2004). Or celles-ci ne sont jamais

retrouvées contre BvMSP1p19 in vivo dans les plasmas. In vitro, l’étude a montré la

production dans quelques rares cas d’IgG2 mais jamais d’IgG4.

Il est cependant important de bien considérer tous ces résultats dans le contexte de la

construction particulière de BvMSP1p19, à savoir l’expression de la construction vaccinale

par le Baculovirus dans les cellules d’insectes. En effet, l’analyse des résultats immuno-

épidémiologiques obtenus à partir de la construction MSP1p19 exprimée dans E. coli

(EcMSP1p19) donne des résultats différents.

� Lors d’une étude menée au Kenya, avant la saison des pluies 2004, sur 72 volontaires,

aucune relation entre l’âge et le niveau de réponse Ac anti-MSP1p19 n’a pu être établie

(Dorfman, 2005).

� De même, une étude menée sur 112 individus au Vietnam, prélevés en juin 1994 et

suivis cliniquement pendant six mois n’a pas permis d’établir une relation entre la protection

clinique ou le délai avant repositivation et la réponse Ac anti-EcMSP1p19 chez les 47

personnes de l’étude considérées comme non prémunies (Wang, 2001).

Plusieurs facteurs semblent pouvoir expliquer ces différences.

� Le premier porte sur l’effectif des sujets participant à ces études. Dans les deux cas

précédents, les cohortes sont plus réduites en nombre d’individus que celles impliquées dans

les études avec la construction BvMSP1p19. Elles sont donc moins significatives du point de

vue de la validité des conclusions.

� Le deuxième facteur porte sur les différences d’étude de corrélation à l’âge ou à la

protection clinique, dont nous avons commencé à discuter dans l’introduction de cette partie.

* Concernant l’étude menée par Dorfman et al., la relation entre le taux d’Ac et l’âge est

biaisée : sur les 72 volontaires, 57 ont entre 5 et 9 ans. La population étudiée est donc très

spécifique d’une classe d’âge pour laquelle l’immunité est en cours d’acquisition. Elle n’est

donc pas le reflet de toute une population comme a pu l’être notre étude. De plus, ils précisent

que néanmoins, ils ont observé une différence significative pour la reconnaissance de

138

EcMSP1p19 : 54% des adultes testés, contre 23% des enfants de la cohorte, sont positifs

contre EcMSP1p19 - P = 0,036 - (Dorfman, 2005). Si la population d’étude avait une

distribution en âge mieux répartie, une relation entre le taux d’Ac anti-EcMSP1p19 et l’âge

serait donc envisageable.

* De même, pour l’étude menée par Wang et al., les 112 personnes ont un âge compris entre 9

et 55 ans. Il n’y a donc pas de jeunes enfants naïfs. De plus, une sélection est réalisée et

l’étude de protection n’est menée en réalité que sur 47 personnes susceptibles de faire un

accès palustre (Wang, 2001). Ils ne spécifient pas la distribution en âge de cette sous cohorte

mais il s’agit à priori d’une sous population plus jeune. Ils cherchent donc à montrer une

éventuelle corrélation avec la protection clinique chez une population qui a été sélectionnée

pour son absence de prémunition. Il ne s’agit donc pas du même type d’étude que la nôtre qui

prenait en compte toute une population, quelque soit son statut immun.

� Le troisième facteur concerne la construction vaccinale en elle-même. Il a été montré

que les structures secondaire et tertiaire de l’Ag sont essentielles pour le caractère protecteur

vis-à-vis de l’infection. Or, le repliement et la formation des ponts disulfures sont plus

délicats à réaliser avec un vecteur tel qu’E. coli (Planson, 2003), comparativement à un

vecteur de type Baculovirus (Pizarro, 2003). Ces résultats pourraient donc suggérer que la

construction BvMSP1p19 présente une meilleure antigénicité qu’EcMSP1p19, car mieux

conformée par rapport à l’Ag natif.

* Cette dernière suggestion est appuyée par une étude comparative multicentrique menée par

l’OMS - programme EuroMalVac - utilisant des lapins vaccinés avec différentes constructions

MSP1 candidat vaccin pour le terrain. Les sérums de lapins ont été testés en aveugle en GIA,

en ELISA, et avec les parasites transgéniques D10-PcMEGF. Les résultats obtenus à partir

d’une vaccination avec BvMSP1p19 ont été meilleurs que ceux dus à EcMSP1p19. Cela a été

vérifié pour les différentes études réalisées (article en préparation). Le caractère plus

immunogène de BvMSP1p19 semblerait donc être plus qu’une supposition.

1.2) MSP4p20 : des études à approfondir

Concernant MSP4p20, les résultats sont moins tranchés et nécessitent d’autres études

complémentaires.

Nous n’avons pas obtenu dans cette étude de relation entre la réponse Ac anti-MSP4p20 et la

protection clinique, et cela aussi bien en zone de méso- que d’holo-endémie. Cependant, une

139

corrélation entre la réponse anti-MSP4p20 et la protection clinique avait été trouvée lors du

suivi clinique sur cinq mois des 205 individus de tout âge prélevés en juillet 2000 à Ndiop.

Pour cette étude, une médiane de ratio de DO de 17,3 avait été obtenue. Une dichotomie basée

sur cette valeur entraînait un risque relatif de 1,33 pour les personnes ayant une réponse en

ELISA inférieure, et cela indépendamment de l’âge - P = 0,018, régression de Poisson -

(Perraut, 2004). Ce seuil n’a pas pu être testé dans nos études, les rDO maximales obtenues

contre BvMSP4p20 pour juillet 2002 étant de 14,7 et 15, respectivement pour Ndiop et

Dielmo. Comment expliquer de telles variations d’amplitude ? Correspondent-elles à des

titres similaires ou bien sont-elles le reflet d’une véritable différence de réponses entre ces

deux années ? Ce type de résultats permet de souligner l’intérêt de l’étude des candidats

vaccins en ELISA par la méthode du Dr Remarque qui permet de définir un « titre ».

Cependant cette méthode est lourde car elle nécessite de tester au moins 3 dilutions de chaque

sérum et d’inclure une gamme complète de titration du standard positif par plaque. Nous

aurions dû multiplier par 4 à 6 le nombre de plaques ELISA dans nos études.

Une autre étude basée sur le suivi clinique pendant six mois de 112 Vietnamiens prélevés en

juin 1994 et menée sur EcMSP4 ou ScMSP4 (MSP4 exprimé par Saccharomyces cerevisiae)

n’a pas donné de résultat concluant. Aucune relation avec l’âge ou la protection clinique n’a

pu être observée, et cela quelque soit le vecteur d’expression utilisé et pour les 47 personnes

considérées « à risque » (Wang, 2001).

Cependant, bien qu’étudiant dans cette étude et dans notre travail les réponses liées à l’Ag

MSP4 d’un point de vue immuno-épidémiologique, de nombreuses restrictions sont à faire

concernant la comparaison de ces deux travaux.

� Comme nous l’avons vu précédemment (cf §1.1), cette étude n’a été réalisée que sur

une sous population sélectionnée pour son risque de faire un accès palustre. Il ne s’agit donc

pas du même type de relation à l’âge ou à la protection clinique que dans notre étude. De plus

l’échantillon est nettement plus réduit, aussi bien en nombre qu’en différence de statut

immun, limitant la puissance des analyses statistiques.

� Outre le fait que MSP4 soit exprimé dans des vecteurs différents, l’étude implique la

protéine entière et non uniquement son fragment terminal MSP4p20.

� Enfin, comme pour MSP1p19, la protéine comporte des ponts disulfures. Des

structures secondaires et tertiaires similaires à celles de la protéine native semblent

indispensables à une fonctionnalité (Wang, 1999). Les constructions issues de différents

vecteurs peuvent donc également présenter des différences d’antigénicité.

140

Il semble donc important de pouvoir de nouveau analyser les réponses Ac anti-PfMSP4 de

cette transversale 2002, en particulier en y incluant les divers fragments de MSP4, pour

exploiter l’ensemble des données

1.3) MSP5 : un « nouveau » candidat vaccin prometteur

Concernant la construction vaccinale BvMSP5, nous avons trouvé une corrélation entre la

réponse Ac qui lui est liée et la protection clinique pour les deux zones d’endémie testées. Ces

résultats positifs viennent conforter un précédent résultat, obtenu à partir de la cohorte de

Ndiop de juillet 2000 et étudiée de façon similaire. Les études ELISA avaient fait ressortir

une médiane de réponses de 2,4 rDO. Celle-ci, prise comme seuil pour la dichotomie des

réponses Ac, engendrait une relation avec la protection clinique. Le risque relatif de faire un

accès palustre pour les individus ayant une réponse ELISA moindre, et ce quelque soit l’âge, a

été trouvé égal à 1,45 - P = 0,003, régression de Poisson - (Polson, 2005 A). Ce seuil est

similaire à celui trouvé par l’analyse menée à Dielmo pour l’année 2002. Concernant

l’analyse menée à Ndiop en 2002, aucun seuil n’avait été défini, les rDO devant être étudiés

en continu. Trois analyses, portant sur des années et des villages différents, ont donc permis

d’établir pour ce candidat vaccin une relation avec la protection clinique (article en

préparation). Ces résultats soulignent l’intérêt de cette construction pour un développement

vaccinale ultérieur, d’autant qu’elle ne présente pas de variabilité en fonction des souches

parasitaires (Polson, 2005 A) (Polson, 2005 B).

La construction BvMSP5 présente une particularité atypique : elle est doublement myristilée,

par la présence de deux acides gras à 14 carbones sur la construction vaccinale. Cette

particularité a été mise en évidence suite à une analyse par spectrométrie de masse puis

confirmée via l’injection dans les cultures d’acide myristilé marqué au tritium (Longacre et

al., données non publiées).

Une étude complémentaire substantielle devra être menée afin de déterminer le rôle éventuel

des acides gras comme cofacteur d’expression de MSP5, et cela à différents niveaux.

� Validité des mesures des réponses Ac obtenues en ELISA ?

� In vivo, quel est le rôle des groupements myristiles dans la protection clinique ?

� Possibilité de produire le candidat vaccin avec les groupements myristiles ?

141

Ces questions sont importantes dans la mesure où nos connaissances actuelles sur l’Ag natif

ne nous permettent pas de savoir si il est ou non myristilé à un moment ou un autre du

processus d’invasion.

La présence de ces groupements myristiles apporte un doute sur la validité des réponses

ELISA obtenues avec cette construction.

� Les analyses contrôlant l’efficacité des déplétions pourraient laisser supposer

qu’environ 25% de la réponse Ac détectée contre BvMSP5 seraient non spécifiques. En effet,

pourquoi ces déplétions seraient-elles quasi-totales pour BvMSP1p19 et BvMSP4p20 et de

seulement 74% pour BvMSP5 ? Une reconnaissance Ac des groupements myristiles pourrait

être à l’origine du phénomène.

� Inversement, on pourrait émettre l’hypothèse que les groupements myristiles masquent

partiellement MSP5. La conséquence en serait une moins bonne reconnaissance de la

construction vaccinale par les Ac. Cela expliquerait le pourcentage plus faible de répondeurs

obtenu par rapport aux autres MSP testées.

Concernant l’effet éventuel des groupements myristiles dans la protection clinique, nous

pouvons citer une étude menée par Kumaratilake et al. (Kumaratilake, 1997). Elle a montré

qu’in vitro les acides gras influencent l’activité des PNN - qu’en est il in vivo ? -. Suivant le

nombre de carbones (C) constituant les acides gras utilisés, on observe une augmentation (de

20 à 22 C), une diminution (> 28 C) ou un effet neutre (18 C) par rapport à l’activité

antiparasitaire des PNN. Nous n’avons pas trouvé d’étude portant sur l’impact des acides gras

à 14 C. Toutes les hypothèses doivent donc être envisageables.

Les groupements myristiles présents sur MSP5 représentent-ils pour le candidat vaccin une

force, un désavantage, ou bien n’ont-ils aucun impact ?

1.4) R23 : des variabilités importantes

Concernant les études immuno-épidémiologiques de R23, nous avons, comme pour

BvMSP4p20, des résultats différents d’une année à l’autre.

� Dans notre étude, concernant les deux zones d’endémie, nous n’avons trouvé aucune

corrélation entre la réponse Ac anti-R23 et la protection clinique.

142

� Pour l’étude de repositivation de 1997 menée sur 110 habitants de Ndiop, une telle

corrélation ajustée sur l’âge avait pu être déterminée. Le facteur risque trouvé était de 1,25

pour les individus n’étant pas répondeurs en Ac anti-R23 - P = 0,04, régression de Poisson -.

Cependant, lors de cette même étude, il n’y avait pas de relation entre les réponses Ac anti-

R23 et la durée de repositivation, le temps de portage asymptomatique ou le moment

d’apparition du 1er épisode clinique (Perraut, 2003). Aucune relation avec ces trois facteurs

n’ayant été obtenue, comment expliquer le lien avec le nombre d’accès palustres? Quel est le

rôle de ces Ac ?

� Lors d’une étude menée à Ndiop et Dielmo en mars et décembre 1996, aucune relation

entre les Ac anti-R23 et la protection clinique n’a pu être détectée. Néanmoins, des niveaux

d’Ac significativement plus faibles ont été relevés en décembre, soit en fin de saison de

transmission intense (Perraut, 2000). Ce dernier résultat suggère que, lors des accès palustres,

ces Ac ont été consommés et que cette consommation n’a pas été compensée par une

production suffisante.

Afin de mieux comprendre la réponse Ac liée à R23, une étude visant à déterminer la qualité

de la réponse protectrice a été menée (Garraud, 2002). In vitro, la construction vaccinale R23,

en présence de PBMC, induit la formation des quatre sous-classes d’IgG possibles. Les sous-

classes d’IgG les plus fréquemment retrouvées ont été les IgG1 et IgG2. Des IgG2 et IgG4 ont

parfois été décelées comme seuls Ac spécifiques formés, réponses allant habituellement à

l’encontre d’une protection anti-palustre (Schreiber, 2006). Cette non spécificité de réponse

pourrait être à l’origine des différences de protection retrouvées selon les études. Elles

pourraient dépendre de la sous-classe d’IgG majoritairement présente au moment de l’étude.

Mais comment expliquer une telle différence de réponse Ac selon les individus ou les

périodes ? Quel(s) facteur(s) influence (nt) le type d’isotype des Ac se liant à R23 ?

R23 induit une réponse majoritairement IgG1 et IgG2, deux types d’Immunoglobulines

généralement considérées comme très différentes, l’une étant cytophile et l’autre non.

Néanmoins, une étude a montré que dans certains cas de polymorphisme, les IgG2 pouvaient

être considérées par les récepteurs Fc comme des IgG1 cytophiles (Chappel, 1993). Ce

polymorphisme spécifique serait-il plus fréquemment présent pour les IgG2 visant R23 et

cette caractéristique expliquerait-elle alors les résultats trouvés par Garraut et al. ?

Cela n’est pas la seule interrogation que suscite cette construction vaccinale. Des analyses par

microscopie de fluorescence ont montré que l’Ag natif correspondant à R23 n’est pas toujours

143

présenté à la surface du GRp. Ce phénomène de présentation ou non de l’Ag a été étudié par

Mercereau-Puijalon et al.. Ils ont montré que l’Ag est systématiquement surestimé en

condition de stress (O. Mercereau-Puijalon - communication personnelle).

Cette présentation non systématique de l’Ag pourrait intervenir dans l’intensité des réponses

Ac détectées et les différences de corrélation observées entre les réponses Ac et la protection

clinique. Il serait intéressant d’étudier ce phénomène en le rapprochant des résultats issus de

ce travail pour les personnes à profil drépanocytaire hétérozygote AS. Leurs réponses Ac sont

significativement plus élevées en ELISA vis à vis de la construction R23. Cela est-il

simplement dû à la forme des GR de type AS, qui permettrait une meilleure présentation de

l’Ag ? Ou bien à une présentation plus systématique de celui-ci à la surface du GR qui serait

due au « stress » des parasites lié à un manque d’oxygène dans les GR de type AS ou bien à

un métabolisme intracellulaire légèrement différent à l’intérieur de ceux-ci ?

2) Les tests fonctionnels : des références à définir

La plupart des études immuno-épidémiologiques ont été menées à partir de résultats ELISA.

Or, ce test quantifie tous les Ac sans lien avec leur fonctionnalité réelle dans la protection.

C’est la raison pour laquelle des tests fonctionnels de référence doivent également être définis

et normalisés (Miller, 1997).

2.1) Le test d’inhibition de culture : un test de référence difficile à adapter

Parmi les tests fonctionnels existants, un a déjà acquis ce statut de test de référence. Il s’agit

de l’inhibition de culture, réalisé avec une lecture par dosage de la pLDH. Un protocole de

type « Standard Operating Procedure » a été validé par une commission de standardisation des

bio-essais de l’OMS (Zhou, 2005).

Plusieurs articles sont parus à ce sujet au cours de ces deux dernières années. Ils avaient

comme objectif une optimisation des tests d’inhibition de culture et la définition du meilleur

protocole de lecture (Persson, 2006) (Bergmann-Leitner, 2006) (Miura, 2007).

Les deux méthodes qui apparaissent comme les plus fiables sont les lectures par dosage de la

pLDH ou par cytofluorométrie. Persson et al. arrivent à la conclusion que la cytofluorométrie

est la méthode la plus précise, résultat qui nous semble probant dans le cadre de nos essais

144

partiels. En effet, si le fluorochrome est bien choisi et l’appareil en parfait état, toutes les

formes parasitaires peuvent être détectées et quantifiées. Le dosage de la pLDH quant à lui

nécessite des trophozoïtes âgés ou des schizontes. Ceci peut engendrer une moins bonne

précision. Pourtant Bergmann-Leitner et al. ont jugé cette méthode comme la plus

satisfaisante.

Bien que standardisé, ce test nous a posé de nombreuses difficultés. Nos conditions de travail

ne nous ont pas permis d’obtenir les résultats escomptés. Des difficultés dues à des problèmes

d’appareillage ou à des conditions induisant une croissance parasitaire insuffisante nous ont

finalement bloqués.

Les tests d’inhibition de culture avaient pu être réalisés à l’Institut Pasteur de Dakar avec des

cultures en albumax de la souche FUP via une lecture par hypoxanthine tritiée, après de

nombreuses mises au point (Diouf, 2002). Ces mises au point ne sont plus applicables dès

qu’un facteur est modifié, de même que les conditions standardisées réalisées aux Etats-Unis

ne sont pas directement applicables pour un laboratoire du Sud, les conditions étant

différentes. Toute technique doit donc être validée et restandardisée au Sud avant de pouvoir y

être utilisée.

2.2) L’ADCI : un test difficile à reproduire ne pouvant pas encore devenir une référence

L’ADCI est un autre test fonctionnel basé sur la réponse Ac. Il a été très utilisé par l’équipe de

P. Druilhe et très largement décrit (Bouharoun-Tayoun, 1990) (Bouharoun-Tayoun, 1995)

(Druilhe, 1997) (Jafarshad, 2007). Ce test a permis l’identification d’un nouveau candidat

vaccin prometteur, l’Ag MSP3 (Oeuvray, 1994).

Cependant, bien que présentant un réel intérêt, ce test fonctionnel a été très peu utilisé par des

laboratoires extérieurs. Peu d’équipes ont publié sur ce sujet (Shi, 1999) (Tebo, 2001) ou sur

l’utilisation de ce test (Zhou, 2006). L’explication tient dans la difficulté qu’il représente en

terme de variables à maîtriser et de reproductibilité. Un travail fait état de l’impossibilité de

reproduire les résultats précédemment établis, malgré tous les efforts fournis pour y arriver.

Sur 17 sérums de personnes vivant en zone d’hyperendémie, aucune ADCI n’a pu être

détectée (Rzepczyk, 1988).

145

Il est clair que les tests fonctionnels de destruction parasitaire par des cellules et dépendant

des Ac sont complexes car impliquant un système multifactoriel variable avec les cellules

« naturelles » humaines. Dans le cadre de l’ADCI, cette difficulté a été décrite dans le détail et

de manière quantitative récemment (Zhou, 2006). L’ADCI y permet une évaluation de

l’efficacité d’un candidat vaccin, le FALVAC-1A. Pour cela, des IgG de lapins vaccinés ont

été testés avec des monocytes humains. Les résultats sont présentés comme positifs : des

résultats similaires auraient été obtenus avec les sérums de lapins vaccinés et les personnes

immunisées. Cependant, si l’on analyse plus précisément les données rapportées, on note des

problèmes de reproductibilité majeurs. En effet, toutes les expériences réalisées ne sont pas

prises en compte dans les résultats finaux. Plus de 30% des essais n’ont pas été retenus dans

l’analyse, les contrôles positifs donnant des résultats inférieurs à 10% d’inhibition. Si on

examine la figure résumant les données des expériences retenues, on note que pour un même

sérum les pourcentages d’inhibitions oscillent de plus de 50% entre les différentes

expériences - lapin R3123 oscillant de 0 à 53% d’ADCI, contrôle positif humain oscillant de

12% à 68% d’ADCI, pour ne citer que deux exemples -. Le problème de reproductibilité a été

contourné dans l’étude en travaillant non pas directement sur les résultats mais sur les

moyennes des réponses valides obtenues. Cela n’est pas acceptable pour un test standardisé de

référence. C’est donc la raison pour laquelle, à l’heure actuelle, il nous semble difficile de

classer ce test comme un test de référence pour l’évaluation des candidats vaccins.

2.3) La phagocytose des mérozoïtes en chimiluminescence : une variante simplifiée de

l’ADCI ?

L’ADCI est donc difficile à mettre en œuvre de façon réellement reproductible. De plus, son

mécanisme n’est à l’heure actuelle toujours pas élucidé. L’intermédiaire fonctionnel dans la

destruction parasitaire n’a pas été clairement identifié (Druilhe, 1997). Cependant, comme

nous l’avons décrit de façon approfondie dans la discussion de l’article portant sur le

développement du test de chimiluminescence (cf annexe), nous faisons l’hypothèse que les

deux tests reposent sur le même processus. En effet, les expériences réalisées par l’équipe de

P. Druilhe pour invalider le rôle des ROS (Lunel, 1989) (Bouharoun-Tayoun, 1995) ne

semblent pas totalement concluantes. La durée de vie des PNN ne permet pas d’étudier leur

action pendant 24h et leur technique de purification est très agressive et longue - ficoll,

sédimentation, lyse et lavages -. De même, le choix de l’utilisation de la superoxyde

dismutase et de la catalase comme seuls inhibiteurs de ROS est discutable et n’est pas

146

exhaustif pour tester l’hypothèse d’action des ROS car elles n’ont pas d’effet sur le singulet

de l’oxygène. Quant au TNFα, médiateur associé à l’ADCI, il est connu pour être un

activateur de la poussée respiratoire.

A ces arguments développés dans l’article (cf annexe), nous pouvons en ajouter d’autres

portant sur des similitudes observées. Concernant les Ac, il a été montré qu’en ADCI un fort

taux d’IgG1 ne suffit pas. Il est nécessaire qu’il y ait un équilibre entre les taux d’IgG1 et

d’IgG3 comportant un excès d’IgG1 (Shi, 1999). Ce résultat a également été trouvé pour

l’analyse de la chimiluminescence. De plus, cette même étude a montré que le récepteur des

IgG des monocytes important pour ce test est FcγRIIA - comme pour la chimiluminescence -,

et que les mérozoïtes jouent un rôle crucial dans le déclenchement de la coopération

monocyte/Ac. Enfin, il a également été montré que les IgG non cytophiles gênaient le

phénomène d’ADCI et impliquaient une baisse de réponse (Druilhe, 1997) (Bouharoun-

Tayoun, 1995), phénomène également vrai pour la phagocytose immune (Groux, 1990).

Concernant la chimiluminescence, des résultats similaires ont été obtenus lors d’une étude

portant sur les personnes atteintes de neuropaludisme. Lorsque la gravité de la maladie

augmente, le taux d’IgG4 augmente - P < 0,001 -. Or, les personnes décédant des suites de la

maladie ont présenté des réponses en chimiluminescence significativement plus faibles que

les personnes ayant eu une issue favorable - P = 0,003 - (Mbengue, 2007).

Beaucoup de similitudes peuvent donc être notées entre ces deux tests. Reposent-ils en réalité

sur le même phénomène de poussée respiratoire ? Dans ce cas, notre test présenterait des

avantages majeurs sur l’ADCI. Il est reproductible et moins long dans sa réalisation car ne

s’intéressant qu’à l’étape du test impliquant les mérozoïtes. Il est également plus facilement

maîtrisable, le nombre de paramètres et variables étant réduits.

Le test de chimiluminescence nous semble être un test pouvant servir de référence afin de

compléter les tests d’inhibition de culture pour évaluer l’antigénicité des candidats vaccins.

Nous allons maintenant discuter du test en lui-même et des avantages qu’il présente.

147

3) La chimiluminescence, un test fonctionnel reflet de l’immunité naturelle

3.1) Un test ne dépendant pas exclusivement de la quantité d’anticorps

Le test de phagocytose via détection de la poussée respiratoire par chimiluminescence est un

test dépendant des Ac, ou plus exactement de leur capacité fonctionnelle. En effet, ce n’est

pas la seule présence des Ac qui permet de détecter une réponse positive en ADPm. Il

semblerait qu’un certain équilibre IgG1/IgG3 doive être respecté à l’avantage des IgG1. Mais

il ne permet pas à lui seul d’expliquer la totalité de la réponse.

De plus, il est important de noter que le taux d’IgG totales dirigées contre les Ag du mérozoïte

n’est pas lié à la protection clinique si l’on tient compte de l’âge - cohorte Ndiop Non Parasité

-. Ce résultat avait déjà été trouvé avec l’étude sur 5 mois des sérums prélevés en 2000 à

Ndiop - P = 0,97 - (Perraut, 2005 A).

Aussi, le test de chimiluminescence étant quant à lui associé à la protection clinique, il ne peut

pas être expliqué par une action due à la seule quantité d’IgG anti-mérozoïtes. Leur spécificité

et leur cytophilie sont cruciales.

Nous pouvons également souligner que la présence ou non du Complément n’est pas critique.

Ce résultat avait déjà été montré (Kumaratilake, 1992).

3.2) Amélioration de la méthode par utilisation de cytokines ?

Le test de suivi de la poussée respiratoire par chimiluminescence a été étudié dans ce travail

de façon la plus exhaustive possible. Cependant, il manque à cette étude l’analyse de

l’utilisation des cytokines comme facteur d’activation. Leur usage est une perspective qui

permettrait éventuellement d’améliorer la méthode.

L’activation préalable des PNN par des cytokines issues de cellules Th1, comme le TNF,

l’IFN γ, etc., permet d’augmenter la capacité de poussée respiratoire des PNN (Kumaratilake,

1994) et donc d’intensifier le signal de chimiluminescence observé (Kumaratilake, 1992).

Nous pouvons supposer qu’une réponse trop faible des PNN pour être analysable pourrait être

contournée par l’activation préalable. Si cette hypothèse venait à être confirmée, cela

résoudrait une des deux difficultés liées à cette méthode, la deuxième étant l’absence de

lignée cellulaire cultivable in vitro.

148

Cependant, les études de corrélation de l’ADPm avec la protection clinique seraient à

reprendre intégralement. Cette activation a été montrée comme variable selon les individus et

comme faisant perdre de la spécificité dans la réponse dépendante des Ac (Ferrante, 1988)

(Kumaratilake, 1994). Il faudra étudier si cette perte de spécificité est similaire pour chaque

sérum, n’entraînant qu’une hausse du bruit de fond compensée par une augmentation plus

importante de la réponse spécifique. Ou inversement, si cette activation venait à entraîner une

perte complète du caractère spécifique de ce test.

Cette activation, en plus de rendre le test beaucoup plus onéreux, permettrait-elle réellement

d’améliorer la méthode ou au contraire lui ferait-elle perdre toute spécificité ? La corrélation

obtenue de l’ADPm avec la protection clinique serait elle toujours vérifiée? La question reste

largement ouverte.

3.3) Un test fonctionnel associé à la protection clinique

De nombreux rapports et articles font état de l’absence de tests fonctionnels standardisés

permettant d’appuyer les tests précliniques et cliniques. Ceux-ci sont vivement attendus par la

communauté scientifique car ils permettraient de réduire les coûts des essais cliniques et

d’augmenter l’efficacité de leur pouvoir prédictif (OMS, 1997) (Giersing, 2006). Jusqu'à

présent, aucun test n’avait permis d’avoir une corrélation satisfaisante entre ses résultats et la

protection clinique (Snounou, 2007).

La problématique de ce travail était d’atteindre cet objectif : définir un ou plusieurs tests de

référence pour l’évaluation des candidats vaccins. La chimiluminescence est apparue comme

remplissant les critères requis.

Ce test présente plusieurs avantages par rapport au test d’inhibition de culture. En effet, bien

qu’étant un test de référence, les pourcentages d’inhibition de culture observés ne sont pas liés

à l’âge et aucune différence de réponse n’est observée lors des accès cliniques (Perraut, 2005

B), à la différence de la chimiluminescence. De plus, les résultats du test d’inhibition de

culture n’ont jamais pu être associés à la protection clinique (Mahanty, 2003), y compris lors

d’une étude menée dans le village de Ndiop (Perraut, 2005 A). Cependant, ce test fonctionnel

est déjà utilisé pour le suivi d’essai clinique d’AMA-1. (Malkin, 2005). Des études

précliniques menées chez la souris, le lapin et le singe ont montré que le taux d’Ac était lié à

149

l’inhibition de la croissance parasitaire. Partant de ces conclusions, il a été supposé que ce test

permettait de juger l’impact de la vaccination in vivo. Cependant, il peut conduire à des

conclusions qui se révéleraient par la suite infondées. L’utilisation d’un test, dont la réponse

est statistiquement associée à la protection chez l’homme comme l’est la chimiluminescence,

représente un atout supplémentaire pour une meilleure analyse des effets des candidats

vaccins.

En effet, la chimiluminescence est associée à la protection clinique comme le montre cette

étude. Cela a été vérifié pour les deux zones d’endémie testées malgré des conditions

totalement différentes en terme de population immunes et d’effectifs à risque d’épisodes

fébriles. On obtient une même dichotomie à une valeur d’ADPm de 250 pour l’étude du

nombre d’accès palustres, et cela malgré des réponses statistiquement différentes dans les

deux villages. En zone d’holoendémie, sa réponse prise en analyse continue a également été

trouvée comme étant reliée à la protection clinique. Ces résultats fournissent un argument

important pour la validité et l’originalité de ce test.

Cette relation avec la prémunition avait déjà été soupçonnée par l’équipe de P. Druilhe dans

les années 1990. Son équipe étudiait la chimiluminescence obtenue avec des mérozoïtes

purifiés par simple centrifugation. Ils avaient observé que les réponses étaient statistiquement

plus élevées pour les sérums immuns que non immuns. De même, en zone d’endémie, les

adultes répondaient mieux que les enfants. Ils avaient donc suggéré que le test était prédictif

du statut de protection des individus (Lunel, 1990).

Il est important de noter que les relations avec la protection clinique sont généralement

étudiées sur des animaux, dans des conditions expérimentales ne reflétant pas la réalité. Les

différences avec les réponses in vivo sont dues à l’utilisation de souches adaptées, à la

purification d’IgG dénaturant leurs effets, à la complexité des tests entraînant des sources de

variabilité, ou encore à la non considération de la cascade complexe d’évènements

physiologiques qui provoquent la destruction parasitaire chez l’homme. Les résultats ainsi

obtenus n’ont qu’une fiabilité relative pour juger une éventuelle représentativité chez

l’homme (Mahanty, 2003) (Perraut, 2005 B). Or la relation observée dans notre étude repose

sur une analyse statistique basée sur un suivi clinique objectif et précis des populations. La

corrélation obtenue entre l’ADPm et la protection observée in vivo chez l’homme est donc

particulièrement intéressante. Elle est très différente des études positives ou négatives menées

150

chez les modèles animaux - y compris les primates - car potentiellement bien plus

représentative.

4) Application directe de la chimiluminescence pour la sélection de candidats vaccins

Une application directe de la chimiluminescence en vaccinologie a pu être réalisée grâce à

l’étude des mérozoïtes transgéniques ou des sérums déplétés. Ces deux méthodes nous ont

permis de réaliser des études portant spécifiquement sur le déclenchement de la poussée

respiratoire. Nous avons noté un impact important des Ac réagissant avec BvMSP1p19 et

BvMSP4p20 dans ce phénomène. Leur implication dans le test ayant été mise en évidence,

nous savons qu’au moins une de leur fonctionnalité réside dans l’activation de ce phénomène.

Enfin, concernant les Ac anti-MSP1p19, l’étude à partir des mérozoïtes transgéniques D10-

PcMEGF a mis en relief la diversité de leur fonctionnalité. Nous avons vu qu’ils étaient

impliqués dans une coopération avec les effecteurs cellulaires. Environ 30% de la réponse en

ADPm peut leur être attribuée - 32% de diminution obtenue avec D10-PcMEGF, 29% avec

les sérums déplétés -. De plus, ils ont également une action directe. En inhibition de culture,

25% de l’inhibition est perdue lors de l’utilisation des parasites transgéniques (O'Donnell,

2001). Ces résultats issus de tests fonctionnels confirment ainsi l’importance de ce candidat

vaccin. Les Ac qui lui sont associés semblent agir de diverses façons du point de vue du

système immunitaire.

151

CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES

Dans ce travail de thèse, nous avons eu l’occasion d’évaluer in vitro l’efficacité de différents

candidats vaccins via des analyses immuno-épidémiologiques ou via le test fonctionnel de

chimiluminescence. Nous avons également étudié le test fonctionnel d’inhibition de culture,

avec différents modes de lecture. Ces résultats, assortis de la confrontation avec les données

de la littérature, nous ont permis de répondre à notre problématique. Celle-ci revenait à

déterminer et standardiser un test fonctionnel reflet de l’immunité.

Nous avons pu aboutir à la conclusion que le test de chimiluminescence est un test

reproductible qui est surtout associé à la protection clinique en zone d’endémie. Nous avons

donc, après de nombreuses mises au point, abouti à la standardisation d’un test fonctionnel,

reflet d’un type de l’immunité palustre. Cette dernière étant multiple, un seul test ne peut pas

en être un reflet complet.

Concernant les candidats vaccins testés, nos conclusions et perspectives sont multiples.

� Concernant BvMSP1p19, nos résultats ont tous conforté l’impact majeur de ce

candidat vaccin dans la protection clinique. Nous l’avons de nouveau retrouvé relié à la

protection clinique, et cela pour les deux villages étudiés et avec le même seuil à 7 rDO. Les

Ac qui lui sont associés sont donc protecteurs, mais un taux élevé est nécessaire pour ce faire.

Ils sont de plus très efficaces d’un point de vu fonctionnel comme cela avait été montré en

inhibition de culture et comme nous l’avons observé dans le test de phagocytose. Il semblerait

donc que ce candidat vaccin ait sa place en essais cliniques. � Concernant BvMSP4p20, les résultats sont controversés. Les Ac qui lui sont associés

n’ont pas été trouvés comme reliés à la protection clinique. Cependant, ils sont fonctionnels

dans le test de phagocytose. Il est donc nécessaire d’approfondir les études sur ce candidat

vaccin, sachant que dans le passé, son caractère protecteur avait été montré. � S’agissant de BvMSP5, bien que non fonctionnel en chimiluminescence, les Ac qui lui

sont liés ont été retrouvés pour la deuxième fois comme associés à la protection clinique. Sa

fonctionnalité ne serait pas reliée au déclenchement de la poussée respiratoire comme

MSP1p19 ou MSP4p20 mais serait bien réelle. Il faudrait l’étudier dans un autre type de test,

comme par exemple les inhibitions de culture, afin de déterminer quel type de fonctionnalité

lui est associé. Il est également primordial d’étudier l’effet des deux groupements myristiles

qui lui sont liés, afin de connaître leur éventuel impact sur la protection - positif ou négatif -.

152

� EcR23 n’a pas fourni de résultats concluants dans cette étude. Seul son impact chez les

personnes drépanocytaires hétérozygotes AS pourrait ouvrir de nouveaux champs

d’investigation afin de mieux comprendre son mode de présentation et donc son rôle.

Concernant les tests fonctionnels, nous n’avons pas pu, pour diverses raisons, réaliser le test

d’inhibition de culture. Il nécessiterait un travail plus approfondi que nous n’avons pas pu

réaliser dans cette étude.

Cependant, le test de chimiluminescence a pu être développé, optimisé et standardisé. Son

mode de fonctionnement nous a semblé élucider des incompréhensions sur celui de l’ADCI :

les ROS seraient des effecteurs majeurs dans les deux tests. Nous avons également pu, via le

calcul d’ADPm, permettre la standardisation des résultats et leur conférer une bonne

reproductibilité. Les résultats obtenus nous ont permis de montrer l’impact des Ac anti-

MSP4p20 et anti-MSP1p19 dans le déclenchement de la poussée respiratoire, via l’utilisation

de sérums déplétés et/ou de mérozoïtes transgéniques. Cependant cela n’a pas pu être obtenu

pour MSP5, montrant ainsi la spécificité du test dans la validation de candidats vaccins. Des

corrélations entre l’ADPm et la protection clinique en zone de méso- et d’holo-endémie ont

également pu être définies, avec le même seuil de réponses dans les deux cas. Il semble donc

important, au vu de tous ces résultats concluants, que ce test soit repris par d’autres équipes.

Si, en utilisant la méthodologie développée dans ce travail, des résultats similaires sont

retrouvés, alors ce test pourrait devenir un test de référence. Il pourrait être utilisé non

seulement pour les tests précliniques, mais également pour les essais cliniques en phase I, but

ultime de ce travail.

153

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PARTIE III : RESULTATS A/ ETUDE DES REPONSES ANTICORPS...

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