PATHOGENITÄTSVERGLEICH VON SALMONELLA … Kultureller und molekularbiologischer Nachweis von S....

Aus dem

Institut für Tierhygiene und Öffentliches Veterinärwesen

der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig

PATHOGENITÄTSVERGLEICH VON SALMONELLA

TYPHIMURIUM DT104 - WILDTYP UND SALMONELLA

TYPHIMURIUM - DELETIONSMUTANTEN (sseD::aphT &

invC::aphT) IN PERSISTENT INFIZIERTEN SCHWEINEN

Inaugural-Dissertation

zur Erlangung des Grades eines

Doctor medicinae veterinariae (Dr. med. vet.)

durch die Veterinärmedizinische Fakultät

der Universität Leipzig

eingereicht von

Haukur Lindberg Sigmarsson

aus Reykjavík

Leipzig, 2012

Mit Genehmingung der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig Dekan: Prof. Dr. Uwe Truyen Betreuer: Prof. Dr. Dr. Andreas Hensel Gutachter: Prof. Dr. Dr. Andreas Hensel Bundesinstitut für Risikobewertung des Bundesministeriums für Ernährung,

Landwirtschaft und Verbraucherschutz (BMELV), Berlin Gutachter: Prof. Dr. Michael Wendt Klinik für kleine Klauentiere und Forensische Medizin / Ambulatorische Klinik,

Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover Tag der Verteidigung: 10.07.2012

Meiner Familie

Inhaltsverzeichnis

INHALTSVERZEICHNIS

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

TABELLENVERZEICHNIS

ABBILDUNGSVERZEICHNIS

1 EINLEITUNG ....................................................................................................... 1

2 LITERATURÜBERSICHT.................................................................................. 4

2.1 Salmonella ............................................................................................................... 4

2.1.1 Taxonomie ............................................................................................................... 4

2.1.2 Epidemiologie ......................................................................................................... 6

2.1.2.1 Salmonellose Mensch .............................................................................................. 7

2.1.2.2 Salmonellose Schwein ............................................................................................. 9

2.1.3 Pathogenitätsfaktoren ............................................................................................ 12

2.1.3.1 Chromosomal kodierte Pathogenitätsfaktoren ...................................................... 13

2.1.3.2 Plasmid-kodierte Pathogenitätsfaktoren ................................................................ 18

2.1.4 Mutationen ............................................................................................................ 20

2.1.5 Diagnostik von Salmonellosen .............................................................................. 23

2.1.5.1 Kultureller Nachweis ............................................................................................. 23

2.1.5.2 Voranreicherung .................................................................................................... 24

2.1.5.3 Selektivanreicherung ............................................................................................. 25

2.1.5.4 Selektivnährböden ................................................................................................. 26

2.1.5.5 PCR-Nachweis ...................................................................................................... 29

3 MATERIAL UND METHODEN ...................................................................... 32

3.1 Tiere und Aufstallung ............................................................................................ 32

3.2 Versuchsdesign ...................................................................................................... 33

3.2.1 Orale Infektion der Tiere per Schlundsonde ......................................................... 36

3.2.2 Klinische Untersuchung der Versuchstiere ........................................................... 38

3.2.3 Blutentnahme und hämatologische Untersuchung ................................................ 39

3.2.4 Untersuchung auf Salmonellen ............................................................................. 39

3.2.4.1 Kulturelle Diagnostik ............................................................................................ 39

Inhaltsverzeichnis

3.2.4.2 PCR ....................................................................................................................... 40

3.3 Statistische Auswertung ........................................................................................ 42

4 ERGEBNISSE ..................................................................................................... 43

4.1 Ergebnisse der klinischen Untersuchung .............................................................. 43

4.2 Hämatologische Befunde ...................................................................................... 47

4.3 Kultureller und molekularbiologischer Nachweis von S. Typhimurium DT104 .. 56

4.3.1 Ausscheidung mit den Faeces ............................................................................... 56

4.3.2 Besiedlung von Organen und Geweben ................................................................ 57

4.3.3 Qualitative PCR zur Identifizierung und Nachweis von S. Typhimurium DT104 ........................................................................................ 60

5 DISKUSSION ...................................................................................................... 62

5.1 Methodische Überlegungen ................................................................................... 63

5.2 Klinische Symptomatik ......................................................................................... 63

5.3 Weißes Blutbild ..................................................................................................... 64

5.4 Ausscheidung und Organbesiedlung ..................................................................... 67

5.5 Schlussbetrachtung ................................................................................................ 70

6 ZUSAMMENFASSUNG .................................................................................... 71

7 SUMMARY .......................................................................................................... 73

8 LITERATURVERZEICHNIS ........................................................................... 75

9 ANHANG ..................................................................................................... I - XIV

Abkürzungsverzeichnis

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

A Adenin Abb. Abbildung aphT Aminoglykosid 3`-Phosphotransferase BfR Bundesinstitut für Risikobewertung BPL Brilliantgrün-Phenolrot-Lactose BPLS-Medium Brilliantgrün-Phenolrot-Sucrose-Agarmedium ca circa cAMP zyklisches Adenosin-3,5-monophosphat °C Grad Celsius C Cytosin CT Choleratoxin d. h das heißt DM Deletionsmutante DNA Desoxyribonukleinsäure ECDC European Centre for Disease Prevention and Control EDTA Ethylendiamintetraessigsäure bzw. Ethylendiamintetraacetat EFSA European Food Safety Authority ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay E. coli Escherichia coli EHEC Enterohämorrhagische Eschericia coli g Erdbeschleunigung G Guanin GKZ Gesamtkeimzahl ID Infektionsdosis IfSG Infektionsschutzgesetz INFOSAN International Food Safety Authorities Network invC Invasin C i.p. intra peritoneal ISO International Organisation for Standardization, Genf, Schweiz i.v. intravenös kb Kilobasen KBE Kolonie bildende Einheiten kDa Kilodalton kg Kilogramm LB-Boullion Luria-Bertani-Boullion LD Lethaldosis LD50 Lethaldosis, bei der 50 % der Tiere sterben LPS Lipopolysaccharid LT hitzelabile Form MHC Major Histokompatibilitäts-Komplexe Mg Milligramm min Minute ml Milliliter mm3 Kubikmillimeter mRNA messenger Ribonukleinsäure nm Nanometer PBS Phosphate-buffered saline

Abkürzungsverzeichnis

PCR Polymerase-Kettenreaktion RKI Robert Koch-Institut RNA Ribonukleinsäure rpm Rotation per minute RV-Medium Rappaport-Vassiliadis-Medium S. Salmonella S. Tm. Salmonella Typhimurium s Standardabweichung sec Sekunde ser. Serovar SGI Salmonella Genomische Insel sp. Spezies SPI Salmonella Pathogenitätsinsel SPIs Salmonella Patogenitätsinseln Spp. Spezies spv Salmonella plasmid virulence ssa Secretion System Apparatus ssc Secretion System Chaperone sse Secretion System Effector ssr Secretion System Regulator ST hitzestabile Form stn Salmonella enterotoxin Gen subsp. Subspezies s. S. siehe Seite T Thymin Taq Thermus aquatus TBE TRIS-Borat-EDTA TLR Toll-like-Rezeptor TNF Tumor Nekrose Faktor TRIS Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan TTSS Type Three Secretion System U Umdrehungen u.ä. und ähnliches US United States UV-Licht Ultraviolettes Licht V. Vena (v/v) Volumenprozent WHO World Health Organization XLD-Agarmedium Xylose-Lysin-Desoxycholat-Agarmedium z.B. zum Beispiel ZKBS Zentrale Kommission für die Biologische Sicherheit µl Mikroliter

Tabellenverzeichnis

TABELLENVERZEICHNIS

Tabelle 1. Wichtige Anreicherungs- und Differentialnährmedien für Salmonellendiagnostik .................................................................................... 27

Tabelle 2. Übersicht über die in den Infektionsversuchen eingesetzten Bakterienstämme ............................................................................................. 35

Tabelle 3. Gewebeproben zur Untersuchung auf Salmonella Typhimurium DT104-Wildtyp und auf die S. Typhimurium DT104 Deletionsmutanten invC::aphT und sseD::aphT aus persistent infizierten Schweinen ...................................................................................... 36

Tabelle 4. Score für die Beurteilung der Befunde der klinischen Examination im Rahmen der Untersuchung zur Pathogenität von Salmonella Typhimurium DT104 Wildtyp und Salmonella Typhimurium Deletionsmutanten (sseD::aphT & invC::aphT) in persistent infizierten Schweinen. ..................................................................................... 38

Tabelle 5. Primersequenzen zum Nachweis des Wildtyps von S. Typhimurium DT104 und dessen invC::aphT- und sseD::aphT-Deletionsmutanten in Faeces und Gewebeproben von experimentell infizierten Schweinen ............ 42

Tabelle 6. Körpergewichte (Mittelwert ± s) der mit dem Wildtyp DT 104 und mit den Deletionsmutanten invC::aphT bzw. sseD::aphT infizierten Schweine in kg ................................................................................................ 47

Tabelle 7. Mittelwerte der Körpertemperatur (°C) der, mit dem S. Typhimurium DT104-Wildtyp, der Deletionsmutante-invC::aphT, der Deletionsmutante-sseD::aphT infizierten Schweine und die dazugehörige Standardabweichung .................................................................... I

Tabelle 8. Mittelwerte des Körpergewichts der mit dem S. Typhimurium DT104-Wildtyp, der Deletionsmutante-invC::aphT, der Deletionsmutante-sseD::aphT infizierten Schweine mit der dazugehörigen Standardabweichung und Signifikanz ................................................................ I

Tabelle 9. Klinischer Score des Allgemeinbefindens der Infektionsgruppen, S. Typhimurium DT104-Wildtyp, Deletionsmutante invC::aphT und Deletionsmutante sseD::aphT .......................................................................... II

Tabelle 10. Klinischer Score des Durchfallerscheinens der Infektionsgruppen, S. Typhimurium DT104-Wildtyp, Deletionsmutante invC::aphT und Deletionsmutante sseD::aphT ......................................................................... III

Tabelle 11. Die Mittelwerte der Gesamtleukozytenzahl (103/mm3) der Infektionsgruppen, S. Typhimurium DT104-Wildtyp, invC::aphT- und sseD::aphT-Deletionsmutanten ........................................................................ V

Tabelle 12. Die Mittelwerte der relativen Lymphozytenzahlen der Infektionsgruppen, S. Typhimurium DT104-Wildtyp, invC::aphT- und sseD::aphT-Deletionsmutanten in Prozent ...................................................... V

Tabelle 13. Die Mittelwerte der relativen Zahlen der neutrophilen stabkernigen Granulozyten der Infektionsgruppen, S. Typhimurium DT104-Wildtyp, invC::aphT- und sseD::aphT-Deletionsmutanten in Prozent .......... VI

Tabellenverzeichnis

Tabelle 14. Die Mittelwerte der relativen Zahlen der neutrophilen segmentkernigen Granulozyten der Infektionsgruppen, S. Typhimurium DT104-Wildtyp, invC::aphT- und sseD::aphT-Deletionsmutanten in Prozent ......................................................................... VI

Tabelle 15. Die Mittelwerte der relativen Zahlen der eosinophilen Granulozyten der Infektionsgruppen, S. Typhimurium DT104-Wildtyp, invC::aphT- und sseD::aphT-Deletionsmutanten in Prozent ............................................. VII

Tabelle 16. Die Mittelwerte der relativen Monozytenzahlen der Infektionsgruppen, S Typhimurium DT104-Wildtyp, invC::aphT- und sseD::aphT-Deletionsmutanten in Prozent .................................................... VII

Tabelle 17. Qualitativer Nachweis von S. Typhimurium DT104 in Faeces ................... VIII

Tabelle 18. Qualitativer Nachweis von S. Typhimurium DT104 in untersuchten Organ- und Gewebeproben .......................................................................... VIII

Tabelle 19. Quantitativer Nachweis von S. Typhimurium DT104-Infektionsstämme in untersuchten Organ- und Gewebeproben ...................... IX

Tabelle 20. Quantitativer Nachweis der S. Typhimurium DT104-Infektionsstämme in Organ- und Gewebeproben mit der dazugehörigen deskriptiven Statistik und Signifikanzprüfung ........................ X

Tabelle 21. Positiver Nachweis von S. Typhimurium DT104-Wildtyp in untersuchten Organ- und Gewebeproben ....................................................... XII

Tabelle 22. Positiver Nachweis von S. Typhimurium DT104 invC::aphT-Mutante in untersuchten Organ- und Gewebeproben ................................................. XIII

Tabelle 23. Positiver Nachweis von S. Typhimurium DT104 sseD::aphT-Mutante in untersuchten Organ- und Gewebeproben ................................................. XIV

Abbildungsverzeichnis

ABBILDUNGSVERZEICHNIS

Abbildung 1. Schematische Darstellung des Versuchablaufes zur Pathogenität von Salmonella Typhimurium DT104 Wildtyp und Salmonella Typhimurium Deletionsmutanten (sseD::aphT & invC::aphT) in persistent infizierten Schweinen. ...................................................................................................... 34

Abbildung 2. Infektion von Schweinen mit Salmonella-Symposium mittels Magenschlundsonde ........................................................................................ 37

Abbildung 3. Allgemeinbefinden der mit S. Typhimurium DT104 infizierten Schweine .... 43

Abbildung 4. Durchfall der mit S. Typhimurium DT104 infizierten Schweine .................... 44

Abbildung 5. Innere Körpertemperatur (Mittelwert ± s) der mit S. Typhimurium DT104 infizierten Schweine. ....................................................................................... 45

Abbildung 6. Gesamtleukozytenzahl (Mittelwert ± s) der infizierten Schweine. ................. 48

Abbildung 7. Gesamtleukozytenzahl (Mittelwert ± s) der infizierten Schweine. ................. 48

Abbildung 8. Prozentualer Anteil an Lymphozyten (Mittelwert ± s) bei infizierten Schweinen. ...................................................................................................... 49

Abbildung 9. Prozentualer Anteil an Lymphozyten (Mittelwert ± s) bei infizierten Schweinen. ...................................................................................................... 50

Abbildung 10. Prozentualer Anteil neutrophiler stabkerniger Granulozyten (Mittelwert ± s) der infizierten Schweine. ...................................................... 51

Abbildung 11. Prozentualer Anteil neutrophiler segmentkerniger Granulozyten (Mittelwert ± s) der infizierten Schweine. ...................................................... 51

Abbildung 12. Prozentualer Anteil neutrophiler stabkerniger Granulozyten (Mittelwert ± s) der infizierten Schweine. ...................................................... 52

Abbildung 13. Prozentualer Anteil neutrophiler segmentkerniger Granulozyten (Mittelwert ± s) der infizierten Schweine. ...................................................... 53

Abbildung 14. Prozentualer Anteil eosinophiler Granulozyten (Mittelwert ± s) der infizierten Schweine. ....................................................................................... 54

Abbildung 15. Prozentualer Anteil eosinophiler Granulozyten (Mittelwert ± s) der infizierten Schweine. ....................................................................................... 54

Abbildung 16. Prozentualer Anteil an Monozyten (Mittelwert ± s) bei infizierten Schweinen. ...................................................................................................... 55

Abbildung 17. Prozentualer Anteil an Monozyten (Mittelwert ± s) bei infizierten Schweinen. ...................................................................................................... 56

Abbildung 18. Kultureller Nachweis von S. Typhimurium DT104 (in % der infizierten Tiere) in Faeces infizierter Schweine. ............................................................. 57

Abbildung 19. Kultureller Nachweis von S. Typhimurium (in % der infizierten Schweine) in Gewebeproben. ............................................................................................ 59

Abbildung 20. Quantitativer Nachweis des Wildtyps (WT) DT 104, der Deletionsmutante invC::aphT bzw. der Deletionsmutante sseD::aphT in Gewebeproben. ........ 60

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 21. PCR-Produkte zum Nachweis von S. Typhimurium DT104-Wildtyp sowie der invC::aphT- und sseD::aphT-Deletionsmutanten in ausgewählten Gewebeproben experimentell infizierter Schweine. ....................................... 61

Abbildung 22. Nachweis von S. Typhimurium DT104-Wildtyp, Deletionsmutanten in Faeces von ausgewählten Schweinen, die entweder mit der sseD::aphT (I)- oder der invC::aphT-Mutante (II) infiziert wurden. ................................. 61

Einleitung

1

1 EINLEITUNG

Salmonella (S.) Typhimurium ist einer der bedeutendsten Erreger humaner Gastroenteritiden.

In der Europäischen Union (EU) wurden im Jahr 2009 108 614 bestätigte humane

Salmonellose-Fälle gemeldet. Die Anzahl der gemeldeten Salmonellosefälle in der EU zeigt

im Vergleich zum Jahr 2008 einen Rückgang von 17,4 % (EFSA und ECDC2011). Allein im

Jahr 2006 wurden dem Robert Koch-Institut (RKI) 52 575 Salmonellosen bei Menschen in

Deutschland gemeldet (RKI 2007). S. Typhimurium DT 104 wurde als zweithäufigster der

wichtigen Salmonellose-Erreger genannt und hat durch seine chromosomal fixierte

Multiresistenz gegenüber Chemotherapeutika epidemiologisch sehr an Bedeutung gewonnen

(PRAGER et al. 1999; THRELFALL 2000; THRELFALL et al. 2003; HELMS et al. 2005;

ZHAO et al. 2005; MULVEY et al. 2006; ZHAO et al. 2007; LAN et al. 2009). Im Jahr 2009

wurden deutlich weniger Fälle gemeldet (31 408). Mit einem Rückgang von 27 % zum

Vorjahr (42 921) trug S. Typhimurium erstmalig einen signifikanten Beitrag zu sinkenden

Zahlen bei bakteriellen Erkrankungen bei (RKI 2010). Der Trend setzte sich 2010 fort, mit

19 % geringeren Erkrankungszahlen (25 307). Die Salmonellose liegt jedoch an der zweiten

Stelle der durch Bakterien verursachten Erkrankungen in Deutschland (RKI 2011c).

Allein in Sachsen erfasste man 2010 insgesamt 1954 infizierte Menschen (RKI 2011a). Nach

Studien aus anderen Ländern wird jedoch von einer 50-fach höheren Inzidenz der Fälle

ausgegangen. Hieraus ergibt sich für Deutschland eine volkswirtschaftliche und

gesundheitspolitische Bedeutung, die sich in hohen Aufwendungen für Behandlungen und

Kontrollverfahren widerspiegelt.

In Dänemark wurden die Kosten für Salmonellosen bei Menschen im Jahr 2001 auf 15,5

Millionen US-Dollar geschätzt. Die jährlichen Aufwendungen für die Kontrollprogramme für

Menschen, Tiere und Lebensmittel betrugen 14,1 Millionen US-Dollar. Durch die Kontrollen

wurden schätzungsweise 25,5 Millionen US-Dollar öffentlicher Ausgaben eingespart

(WEGENER et al. 2003; KORSGAARD et al. 2005; INFOSAN 2005).

Der Hauptübertragungsweg von S. Typhimurium vom Tier auf den Menschen ist

kontaminiertes Schweinefleisch (RKI 2006; BOYEN et al. 2008; EFSA und ECDC2011).

Somit stellt das Schlachtschwein ein bedeutendes Reservoir für diesen Zoonoseerreger dar.

Eine besondere Rolle nimmt dabei das persistent infizierte Schwein ein. Da Infektionen mit S.

Einleitung

2

Typhimurium beim Schwein überwiegend symptomlos verlaufen, bleibt diese

Infektionsquelle trotz aller Maßnahmen meist unentdeckt.

Die Bekämpfung von Salmonellen in Nutztierbeständen durch eine aktive Immunisierung

gewinnt immer mehr an Bedeutung. Steigende Kosten in Hygiene und Management, sowie

die Zunahme von Resistenzen stellen ein Problem dar. Die bisherigen Maßnahmen, wie

Kontrollen, Einsatz von Antibiotika und Konkurrenzausschluss oder deren Kombinationen,

gelangen zunehmend an ihre Grenzen. Insbesondere der Einsatz von Antibiotika bei

Lebensmittel liefernden Tieren, löst zudem bei immer mehr Menschen Angst vor Resistenzen

aus (ZHANG-BARBER et al. 1999). Bei den heutigen Impfstrategien handelt es sich

vorwiegend um eine Anwendung von Lebendimpfstoff aus vermehrungsfähigen Bakterien

von bestimmten, stabil attenuierten Salmonella-Stämmen. Die Überlegenheit der

Lebendvakzine gegenüber Inaktivat- und Subunitvakzinen konnte in mehreren

tierexperimentellen Untersuchungen bestätigt werden (ROBERTSSON et al. 1983; MARTIN

1992; KARASOVA et al. 2009). Die Wirksamkeit von Salmonella-Lebendimpfstoffen setzt

die Anheftung (Adhäsion), das Eindringen (Invasion) und das Überleben und Vermehren in

der Wirtszelle und lymphoretikulärem Gewebe voraus (MITOV et al. 1992). Dies sind die

drei wichtigen pathogenetischen Schritte von Salmonelleninfektionen. Jedoch ist

entscheidend, dass die in den Impfstoffen enthaltenen Stämme eine verminderte Virulenz

aufweisen und phänotypisch von Salmonella-Feldstämmen zu unterscheiden sind, z.B. durch

Auxotrophien und Resistenzen gegen Antibiotika.

Um Mechanismen der Infektion und der Persistenz des Erregers in den verschiedenen

Geweben des Schweins besser zu verstehen, werden im Rahmen dieser Arbeit die Bedeutung

zweier Virulenzfaktoren mittels des Einsatzes zweier Deletionsmutanten in experimentellen

Infektionensversuchen untersucht. Die hierfür eingesetzten Mutanten wurden durch

Gendeletionen erzeugt, bei denen dadurch von einer verminderten Virulenz auszugehen ist.

Die Mutante I ist durch P22-Transduktion von sseD::aphT aus dem Stamm MvP101

(MEDINA et al. 1999) in den DT104-Stamm erzeugt worden. Das sseD-Gen wird auf der

Salmonella pathogenecity island 2 kodiert, die für die intrazelluläre Überlebensfähigkeit der

Salmonellen in Makrophagen verantwortlich gemacht wird. OCHMAN und Mitarbeiter

(1996) sowie HENSEL und Mitarbeiter (1998) konnten zeigen, dass derartige Mutanten eine

kürzere Überlebenszeit in Makrophagen aufweisen.

Die Mutante II ist durch P22- Transduktion der invC::aphT (Kanamycin-Resistenz)-Kassette

von SB566 (EICHELBERG et al. 1994) in den Wildtyp DT104-Stamm konstruiert worden.

Einleitung

3

Die Deletionsmutanten wurden, wie bereits von EICHELBERG und Mitarbeiter (1994)

beschrieben, konstruiert. Die Deletion des invC-Gens, das sich auf der Salmonella

Patogenicity Island 1 befindet, verursacht in vitro eine verminderte Fähigkeit zur epithelialen

Invasion (GALLOIS et al. 2001).

Ein Wildtyp-Stamm der Salmonella Typhimurium DT104 (MARG et al. 2001; ROESLER et

al. 2004; ARNOLD et al. 2004), vom Schwein isoliert, wurde für den Vergleich zu den vorher

genannten Deletionsmutanten eingesetzt. Dieser in experimentellen Infektionen durchgeführte

Vergleich sollte Erkenntnisse zur unterschiedlichen Organbesiedlung, Veränderungen in

Blutparametern und klinischen Symptomen bringen. Die so erlangten Befunde wiederum

sollten Rückschlüsse auf die Mechanismen der Infektion und durch Persistenz ermöglichen,

um damit die Rolle der Virulenzfaktoren in diesem Infektiongeschehen zu deuten.

Literaturübersicht

4

2 LITERATURÜBERSICHT

2.1 Salmonella

2.1.1 Taxonomie

Die Gattung Salmonella (S.) gehört zur Familie Enterobacteriaceae. Salmonellen sind

gramnegative, fakultativ anaerobe, fast ausnahmslos bewegliche, gerade Stäbchenbakterien

mit einer Größe von 0,7-1,5 x 2,0-5,0 µm (SELBITZ 1992). Die Gattung Salmonella gehört

zu den wichtigsten Vertretern dieser Familie, welche zur Gamma-Untergruppe der

Proteobakterien und somit zu den Eubakterien gezählt werden. Die taxonomischen Einteilung

der einzelnen Salmonella-Isolate basierte über Jahrzehnte auf deren Reaktionen mit Seren

(STACKBRANDT et al. 1988).

So wurden beispielsweise neue epidemiologisch bedeutsame Salmonellen als eigenständige

Spezies definiert. Die übrigen Vertreter sollten hierbei nur als Serovare bezeichnet werden

(DARWIN und MILLER 1999; BRENNER et al. 2000).

KAUFFMANN (1961) beschrieb alle bis dahin bekannten Isolate als eine einzige eigene

Spezies. Später teilte KAUFFMANN (1966) das Genus Salmonella auf der Basis

biochemischer Charakteristika in vier Subgenera ein, wobei jedes Serovar als Spezies

ausgewiesen wurde. Einen entscheidenden Ansatz in der Entwicklung der taxonomischen

Einteilung setzten CROSA et al., (1973) mit dem Beweis der genetischen Verwandtschaft der

Salmonella Subgenera I (enterica), II (salamae) und IV (houtenae) und deren Serovaren,

sowie aller Serovaren von S. arizonae, die einer Spezies zuzuordnen sind (BRENNER et al.

2000).

REEVES et al., (1989) schlugen vor, die Spezies Salmonella anhand von genetischen

Merkmalen, in zwei Subspezies Salmonella enterica und Salmonella bongori einzuteilen.

Gegenwärtig werden die beiden Salmonella-Spezies S. Choleraesuis und S. bongori

anerkannt (POPOFF et al. 1994). Die Spezies S. Choleraesuis beinhaltet die Subspezies: S.

Choleraesuis, S. salamae, S. arizonae, S. diarizonae und S. houtenae (POPOFF et al. 1994).

Der Name „Choleraesuis“ stand gleichzeitig für eine der Spezies als auch für ein Serovar,

was für Verwirrung sorgte. Von LE MINOR und POPOFF (1987) wurde deshalb der

Literaturübersicht

5

präzisierende Vorschlag gemacht, sowohl die Spezies als auch die Subspezies S. Choleraesuis

unter der Speziesbezeichnung Salmonella enterica zusammenzufassen (EUZEBY 1999).

Diese Umbenennung wurde im Jahr 2010 vom „International Commitee of Systematic

Bacteriology“ offiziell anerkannt.

Innerhalb der einzelnen Subspezies der Spezies Salmonella werden verschiedene Serovare mit

diversen Stämmen unterschieden. Ursprünglich wurden fast alle neuen Serovare, welche im

White-Kauffmann-Le Minor-Schema aufgeführt sind, mit Eigennamen belegt. Aus Gründen

der Übersichtlichkeit wurde dieses Prinzip letztlich jedoch nur bei den Eigennamen der zur

Subspezies S. enterica zählenden Serovare beibehalten. Demnach müsste beispielsweise die

korrekte Schreibweise für S. Typhimurium lauten: S. enterica subsp. enterica ser.

Typhimurium. Zur praktischen Vereinfachung der Schreibweise wird von vielen Autoren nun

einfach die Bezeichnung S. typhimurium verwendet. Um den Serovarcharakter deutlich zu

machen, wird der Serovarname trotzdem groß geschrieben, z. B. S. Typhimurium. Die

Vertreter der anderen Subspezies werden durch die Angaben der Antigenformel benannt

(SELBITZ et al. 1995; TINDALL et al. 2005; GRIMONT und WEILL 2007).

Die serologische Typisierung innerhalb der Familie Enterobacteriaceae basiert auf dem

Vorkommen von Antigendeterminanten. Salmonellen haben wie alle Vertreter dieser Familie

Oberflächen- (somatische oder O) und Geißel- (H, Phase I und II) Antigene. Das somatische

„O“-Antigen ist ein hitzestabiles Lipopolysaccharid und ein Bestandteil des in der Zellwand

lokalisierten Lipopolysaccharid-Protein-Komplexes. Die Polysaccharidketten des Antigens

bestimmen die jeweilige serologische Spezifität. Das Geißel- („H“) Antigen ist dagegen ein

hitzelabiles, in den Geißeln sitzendes Protein.

Außerdem können zusätzliche Hüllenantigene (K-Antigene) vorkommen. Heute werden diese

Kapselantigene als „Vi-Antigene“, „Vi“ welches von Virulenz abgeleitet wird, bezeichnet.

Diese sind als Bauelemente der Mikrokapsel der eigentlichen Zellwand aufgelagert und

besitzen Polysaccharidstruktur. Die „Vi-Antigene“ sind nur bei den Serovaren S. Typhi, S.

Paratyphi C und S. Dublin vorhanden.

Die unterschiedliche Zusammensetzung der Antigene ist anhand einer Antigenformel aus dem

White-Kauffmann-Le Minor-Schema, welches bis heute insgesamt 2610 Serovare definiert

(GUIBOURDENCHE et al. 2010), zu entnehmen. Die O-Antigene werden mit arabischen

Ziffern bezeichnet. Stämme mit gemeinsamen Haupt-O-Antigenen werden in O-

Antigengruppen, die mit Buchstaben gekennzeichnet sind, zusammengefasst. Die Serovare

der gleichen Hauptgruppe können mit Hilfe der H-Antigene weiter differenziert werden. Die

Literaturübersicht

6

Isolate, welche identische O- und H-Antigene ausweisen, sollten dem gleichen Serovar

zugeordnet werden.

Eine weitere Methode zur Differenzierung ist die Lysotypie von serologisch definierten

Serovaren. Basierend auf der unterschiedlichen Empfänglichkeit der einzelnen Stämme

innerhalb des selben Serovars gegenüber einem selektierten Set von Bakteriophagen erlauben

Bakteriophagen eine weitere Einteilung der Salmonellen (GRIMONT et al. 2000). Anders als

bei S. Typhi und S. Paratyphi, bei denen Internationale Lysotypiesysteme vorhanden sind,

werden für die Untersuchung von S. Typhimurium verschiedene Phagensätze genutzt. FELIX

und CALLOW (1943) etablierten erstmalig ein derartiges System. Dieses wurde später von

CALLOW (1959) erweitert. ANDERSON et al. (1977) modifizierten es zu der Form, die

heute noch weltweit am häufigsten eingesetzt wird (SCHMIEGER 1999).

Der Phagentyp DT104 hat, begründet durch seine chromosomal fixierte Multiresistenz

gegenüber Chemotherapeutika, seit den neunziger Jahren stark an Bedeutung gewonnen und

wird inzwischen mit am häufigsten isoliert (SCHMIEGER und SCHICKLMAIER 1999;

THRELFALL 2000; RABSCH et al. 2001; THRELFALL et al. 2003; HELMS et al. 2005;

ZHAO et al. 2005; MULVEY et al. 2006; ZHAO et al. 2007; LAN et al. 2009; RKI 2011b).

2.1.2 Epidemiologie

Salmonellen gehören weltweit zu den bedeutendsten bakteriellen Infektionserregern bei

Menschen und Tieren. Nach DINJUS (1998) und für die European Food Safety Authority

(EFSA) stellen sämtliche Salmonellen potentielle Krankheitserreger dar. Dabei stellt sie ihre

Rolle als Zoonoseerreger besonders in den Mittelpunkt des Interesses (EFSA 2006). Das

natürliche Habitat von Salmonellen ist der Darm von Tieren und Menschen. Durch spezielle

Resistenzmechanismen können sie jedoch auch monatelang in einer geeigneten Umwelt

überleben (GUTHIRE 1992).

In den letzten Jahren wurde ein fortlaufend steigender Anteil von Salmonellosen beim

Menschen verzeichnet, die durch kontaminierte Lebensmittel tierischer Herkunft ausgelöst

werden. Hier treten besonders Rohfleischprodukte und Konsumeier als Verursacher der

Infektionen in den Vordergrund. Ihre Kontamination erfolgt entweder primär beim Tier oder

sekundär im Verlauf der Gewinnung, Be- und Verarbeitung sowie bei der Abgabe an den

Verbraucher. Die Gefahr einer primären Kontamination besteht immer dann, wenn das

lebende Tier selbst infiziert ist und zum Ausgangspunkt für den Eintrag von Salmonellen in

Literaturübersicht

7

die Lebensmittelkette werden kann (SELBITZ 1992; STEINBACH und KROELL 1999;

BOTTELDOORN et al. 2003; VAN PARYS et al. 2011).

Die Gefahr für die menschliche Gesundheit erfordert, dass Strategien zur Verhinderung der

Übertragung von Salmonellen durch Lebensmittel entwickelt werden mussten. Diese bestehen

aus einer zielgerechten Kombination von antiinfektiösen, veterinärhygienischen und

produktionsorganisatorischen Maßnahmen (MEYER 1999; MAJOWICZ et al. 2010). Durch

dieses Vorgehen ist eine vollständige Elimination der Kolonisierung zwar nicht möglich,

jedoch eine Verminderung der Gesamtkeimzahlen im Tier (WILCOCK und SCHWARTZ

1992).

Einzelne Serovare weisen dabei ein unterschiedliches epidemiologisches Verhalten auf

(MEYER et al. 1993; SELBITZ 1993), welche auf Unterschieden in ihrer Wirtsanpassung der

einzelnen Vertreter des Genus Salmonella basieren. So existieren Serovare, die ausschließlich

an den Menschen angepasst sind, wie S. Typhi und S. Paratyphi. An bestimmte Tierarten

angepasste Vertreter sind zum Beispiel S. Gallinarum beim Huhn, S. Abortusovis beim Schaf

und S. Choleraesuis beim Schwein. Die Serovare Enteritidis und Typhimurium weisen keine

Wirtsanpassung auf und stellen die Haupterreger von Zoonosen dar (HOLLINGER 2000;

EFSA und ECDC 2011). Die Ursachen, die eine Wirtsspezifität bewirken, sind bisher noch

nicht geklärt (PASCOPELLA et al. 1995). Durch die Unterschiede zwischen adaptierten und

nicht adaptierten Serovaren ergeben sich Konsequenzen hinsichtlich der

Bekämpfungsstrategien und Infektionsvermeidung, da bei adaptierten Salmonellen im

Gegensatz zu nicht adaptierten Salmonellen eine Senkung des Infektionsdrucks im Bestand

möglich ist (SELBITZ 1991). Die Problematik besteht darin, dass diese nicht adaptierten

Serovare nach erfolgter Infizierung, über längeren Zeitraum ohne klinische Symptomatik

persistieren können (WOOD et al. 1989; SCHERER et al. 2008) und somit ohne geeignete

Kontrollmaßnahmen bzw. Bekämpfungsstrategien unerkannt bleiben.

2.1.2.1 Salmonellose Mensch

Die Salmonellose wird als die wichtigste Infektionskrankheit des Gastrointestinaltraktes des

Menschen in Industrieländern beschrieben (WHO 2005; MAJOWICZ et al. 2010). Klinisch

ist sie geprägt von gastroenteritischen Geschehen mit lokalem, sich selbst begrenzenden

Charakter und Durchfall (Enteritis), der das auffälligste Krankheitssymptom darstellt. Auf

Grund dessen wurden die Erreger auch als Enteritissalmonellen bezeichnet. Die

Literaturübersicht

8

Hauptvertreter stammen dabei aus der Subspezies 1 von Salmonella enterica. Jedoch gelten

alle Salmonellen als totipotent für den Menschen und sind als klinisch gleich potent pathogen

anzusehen.

Die durch eine Salmonelleninfektion hervorgerufenen Krankheitsbilder beim Menschen

lassen sich in zwei Gruppen gliedern. Zum einen in die typhöse Form, welche durch

humanadaptierte Serovare ausgelöst wird und zum anderen in die enteritische Form.

Verursacher bei dieser Gruppe sind tieradaptierte und nichtadaptierte Serovare. Demnach

wird die enteritische Salmonellose durch alle Salmonella-Stämme ausgelöst, außer durch S.

Typhi und S. Paratyphi (TSCHÄPE und BOCKEMÜHL 2002; GERLACH und HENSEL

2007; COBURN et al. 2007).

Infektionen werden vorwiegend durch Umweltkontaminationen oder Nahrungsmittel

verursacht (SANDER 1993; MAJOWICZ et al. 2010). Weitere Infektionswege können die

Übertragung von Mensch zu Mensch oder von Tier zu Mensch sein. Bei letzteren handelt es

sich jedoch um Infektketten mit einer sehr geringen Bedeutung (RKI 1997).

Bei Enteritissalmonellen handelt es sich um einen gesundheitspolitisch relevante Erreger, da

das Erkennen einer Erkrankung beim Tier aufgrund des vorwiegend symptomlosen oder

persistenten und subklinischen Verlaufs nicht möglich ist. Beim Menschen jedoch bildet sich

ein deutlich klinisches Bild einer Infektion aus.

Die Infektionsdosis (ID50) für den Menschen wird auf ≥ 105 Keime geschätzt. Die Klinik ist

gekennzeichnet durch Brechdurchfall, kolikartige Bauchschmerzen oder auch Diarrhö, häufig

im Zusammenhang mit hohem Fieber. Diese Symptome können bereits wenigen Stunden

nach Infektion in Erscheinung treten. Die Infektion bleibt meist lokal beschränkt

(Magendarmtrakt) und ist üblicherweise selbstlimitierend. Das heißt, bei milden Verläufen ist

mit einer Heilung nach einer Woche zu rechnen. Eine besondere Gefahr stellt die

Salmonellose für Kleinkinder, Abwehrgeschwächte und alte Menschen dar, da sie hier zu

Organbesiedelung, Septikämie und Arthritis führen kann, dem so genannten typhoiden

Verlauf (HOF et al. 2000; COBURN et al. 2007). Bei dem Serovar S. Typhimurium DT 104

ergeben sich aufgrund seiner breiten Antibiotikamehrfachresistenz, die auf der genomischen

Pathogenitätsinsel SGI 1 kodiert ist (MULVEY et al. 2006) Komplikationen bei der Therapie,

wenn es, wie oben erwähnt, zu einem typhoiden Krankheitsverlauf kommt.

Salmonellosen können epidemisch vorkommen oder sporadisch auftreten. Etwa 85 % aller

Enteritissalmonellen in Deutschland kommen sporadisch vor. Es ist noch nicht geklärt, was

die jeweils dominanten Stämme, welche verstärkt auftreten oder dann aber sogar

Literaturübersicht

9

verschwinden können, befähigt, sogenannte Epidemietypen zu sein. Ein typischer Vertreter

der epidemisch auftretenden Salmonellen ist S. Typhimurium.

Die Epidemiologie von Salmonellosen ist charakerisiert durch die Abhängigkeit von der

Prävalenz in den Tierbeständen, den Überlebens- und Vermehrungsbedingungen im Schlacht-

und Lebensmittelbetrieb, der Virulenz des Erregerklons und dem jeweiligen Immunstatus der

Bevölkerung. Somit ist auch der Anstieg der Erkrankungszahlen in den wärmeren Monaten zu

begründen (KRAUSE 2001).

Seit dem Jahr 2005 sind die Zahlen der Salmonellose-Erkrankungen rückläufig die

wahrscheinlich auf zahlreiche antiepidemische und antiinfektiöse Strategien sowie staatliche

Kontrollmaßnahmen zurückzuführen sind. Bei etwa 65 % davon gelten S. Enteritidis und S.

Typhimurium als Verursacher (EFSA und ECDC 2011). Es besteht die Annahme, dass die

Dunkelziffer bei weitem höher ist. Begründet ist dies mit einem Studienvergleich von anderen

Industrieländern. So vermutet man, dass in Großbritannien und den USA für jede bekannte

Salmonellose 3 bis 50 unerkannt bleiben (WHEELER et al. 1999; VOETSCH et al. 2004).

Im Jahr 2010 wurden dem RKI 25 307 Fälle einer Salmonellose gemeldet, die klinisch-

epidemiologisch und klinisch-labordiagnostisch bestätigt waren (RKI 2011a).

Wie bereits erwähnt, stellt das kontaminierte Lebensmittel die Hauptinfektionsquelle für den

Menschen dar. Aus diesem Grund ist die Verbraucheraufklärung vor allem im Hinblick auf

die Küchenhygiene eine der wichtigsten Präventivmassnahmen (TSCHÄPE und

BOCKEMÜHL 2002). Dies gilt umso mehr, da Salmonellen auf und in Lebensmitteln in

einen Ruhezustand treten oder durch chemische bzw. thermische Noxen subletal geschädigt

werden können, dann nicht mehr kultivierbar und nachweisbar aber immer noch infektiös

sind.

2.1.2.2 Salmonellose Schwein

Die Salmonelleninfektion beim Schwein ist gekennzeichnet durch zwei

Problemschwerpunkte. Zum einen handelt es sich um die im eigentlichen Sinn bezeichnete

Salmonellose, die zur klinischen Erkrankung der Tiere führt. Ausgelöst wird die Erkrankung

durch die an das Schwein adaptierten Serovare S. Choleraesuis und S. Typhisuis. Der zweite

Schwerpunkt ist die fleischhygienische Problematik, welche durch klinisch unauffällige

Ausscheider im Schlachtprozess entsteht und mit einer Kontaminierung der Schlachtprodukte

einhergeht. Verursacher hierfür können eine Vielzahl von Serovaren sein.

Literaturübersicht

10

Die beiden speziesadaptierten Erreger (S. Choleraesuis, S. Typhisuis) sind inzwischen in

Deutschland bedeutungslos. Die durch sie ausgelösten primären Salmonellosen gehen in

Schweinebeständen mit einer hohen Verlustrate einher (STEINBACH und KROELL 1999).

Das in den letzten Jahren von dem Nationalen Referenzlabor für Salmonellen am häufigsten

nachgewiesene Salmonella-Serovar ist S. Typhimurium. Betrachtet man die Jahre 1998 bis

2002 ist eine Zunahme bei diesem Serovar zu verzeichnen. Im Jahr 2002 war der Anteil der S.

Typhimurium Infektionen 88 %. An zweiter Stelle befindet sich S. Derby mit 6 %. Weitere

beim Schwein bedeutsame Serovare sind S. Infantis (0,9 %), S. Livingstone (3,7 %), S.

Enteritidis und S. London (0,9 %). Die in den Schweinebeständen dominierenden Serovare

werden ebenfalls bei Lebensmittelkontaminationen nachgewiesen (DORN et al. 2003).

In den Jahren 2004 – 2008 fiel der Anteil von S. Typhimurium auf 61,1 % zurück

(FRIEDRICH et al. 2010). Im Jahr 2009 wurden 17 % weniger S. Typhimurium-Isolate

(43,8 %) diagnostiziert. Dafür konnte ein Anstieg von 23 % der S. enterica subsp. Enterica

serovar 1,4,[5],12:i:-. (35,6 %) registriert werden. Damit war die monophasische Variante der

S. ser. Typhimurium, die S. enterica subsp. Enterica serovar 1,4,[5],12:i:-. im Jahr 2009 an

zweiter Stelle und die S. ser. Derby (5,7 %) auf Rang drei (FRIEDRICH et al. 2010;

FRIEDRICH et al. 2011).

Bei 61,9 % der S. Typhimurium-Isolate handelte es sich 2001 um den multiresistenten

Lysotyp DT104, der inzwischen gegen bis zu 17 verschiedene Antibiotika Resistenzen

aufweist. Von den im Jahr 2009 eingesandten Proben, in denen S. Typhimurium festgestellt

wurde, konnten 33,9 % als Phagentyp DT 104 identifiziert werden. Generell weisen

Salmonella-Isolate aus Schweinebeständen ein sehr hohes Resistenzniveau auf (POPPE et al.

2002; DORN et al. 2003; PERRON et al. 2007; FRIEDRICH et al. 2010; FRIEDRICH et al.

2011).

Basierend auf Beobachtungen aus dem Feld und intensiver experimenteller Arbeiten am

Tiermodell Schwein kann die Salmonelloseerkrankung des Schweines in verschiedene

Verlaufsformen unterschieden werden, die allerdings fließend ineinander übergehen können:

1. Latente Form

2. Enteritische Form

3. Lokal begrenzte und abszedierende Form

4. Systemische Verlaufsform.

Literaturübersicht

11

Die verschiedenen Formen treten abhängig vom Serovar, der Abwehrlage des Tieres, von

äußeren Stressoren und dem Manifestationsort auf (MARG et al. 2001; SCHERER et al.

2008).

Nach einer Inkubationszeit von zwei Tagen bis mehreren Wochen kann sich je nach den

erwähnten Bedingungen eine akute, subakute oder chronische Salmonellose entwickeln.

Bei der akuten Form steht die Septikämie im Vordergrund. Symptome sind

Lungenerkrankungen, Blauverfärbungen an Ohren, Bauch und Schenkelinnenflächen. Nicht

selten treten Todesfälle auf.

Entwickelt sich eine subakute und chronische Salmonellose, kann man zu Beginn

Verstopfungen beobachten, die in profusen Durchfall übergehen. Überlebende Tiere bleiben

zumeist Kümmerer.

Die latente Form der Salmonellose erscheint symptomlos. Die latent infizierten Schweine sind

jedoch üblicherweise Salmonellenausscheider (GAREIS 1995; BOYEN et al. 2008). Diese

Tiere gelten, als persistente Salmonellenträger, die über Wochen bis Monate Salmonellen

ausscheiden können (WOOD et al. 1989; SCHERER et al. 2008). Eine der häufigsten

Ursachen für eine Infektion ist der fäkal-orale Übertragungsweg durch Einschleppung latent

infizierter Tiere in den Bestand. Diese latent infizierten Ausscheider bleiben aufgrund der

fehlenden klinischen Symptome als eine ständige Infektionsquelle unerkannt (SELBITZ

2002; PERRON et al. 2008; CLOTHIER et al. 2010). Eine ebenso große Rolle spielt die

indirekte Erregerübertragung durch belebte oder unbelebte Vektoren. Die bedeutendsten

belebten Vektoren sind Nager, deren Kot mitunter 105 KBE/g Salmonellen enthalten kann

(HENZLER und OPITZ 1992). Zu den unbelebten Vektoren zählen Abwässer und

Futtermittel. Der Eintrag durch Futter hat in den letzten Jahren aufgrund der vorgeschriebenen

Hitzebehandlung deutlich abgenommen. Im Jahr 2009 waren lediglich 1,8 % der untersuchten

Schweinefutterproben kontaminiert (HARTUNG und KÄSBOHRER 2011). Nicht zu

unterschätzen ist die Möglichkeit der Infektion im Stall selbst, denn durch die hohe Tenazität

der Salmonellen gestaltet sich die Bekämpfung problematisch (BAGGESEN et al. 1997).

Dadurch ergibt sich die höhere Inzidenz in Mastbetrieben (BERENDS et al. 1996). Laut der

2006/2007 durchgeführten EU-Grundlagenstudie zur Erhebung der Prävalenz von

Salmonellen bei Mastschweinen gelten 10,3 % der Mastschweine in der EU als infiziert.

Dagegen betrifft es Zucht- und Ferkelanlagen zu 31,8 %. In Deutschland betrug der Anteil

positiver Mastschweine 12,7 %, während Zucht- und Ferkelerzeugerbetriebe zu 22,4 %

positiv waren (EFSA 2008; BfR 2008; EFSA 2009). Interessant ist, dass die Seroprävalenz

Literaturübersicht

12

bei Mastschweinen in Deutschland mit 32,3 % deutlich höher lag als der Anteil

bakteriologisch positiver Tiere (BfR 2008; EFSA 2009; EFSA und ECDC 2011).

2.1.3 Pathogenitätsfaktoren

Die beiden Salmonellenspezies, S. enterica und S. bongori sind als obligate Pathogene für

Mensch und Tier einzustufen. Im Einzelfall und nach der entsprechenden Prüfung können

Serovare und Stämme als avirulent für betroffene Menschen oder das Tier angesehen werden

(SELBITZ 2002).

Die Salmonella-Pathogenese ist ein komplexes und multifaktorielles Phänomen (WALLIS

und GALYOV 2000; MALIK-KALE et al. 2011). Die Pathogenität von Salmonella sowie die

Interaktionen zwischen Salmonellen und der Wirtszelle auf molekularer Ebene sind bereits

gut untersucht (SANTOS et al. 2003; MCGHIE et al. 2009; SABBAGH et al. 2010;

HALLSTROM und MCCORMICK 2011). Gleichwohl ist die Vielzahl und das

Ineinandergreifen von Virulenzmechanismen der Salmonellen weitgehend unbekannt, was auf

die enormen Unterschiede der Pathogenität in der jeweiligen Zielspezies zurückzuführen ist

(RAHMAN et al. 2004). Nur wenige Isolate wurden auf ihre Pathogenität in der jeweiligen

Zielspezies hin getestet. Die zwei erfolgreichsten Tiermodelle, die bis heute eingesetzt werden

und zur Aufklärung der Virulenzmechanismen von Salmonella dienen, sind Kälber- und

Mäusemodelle. Studien am Schwein sind vergleichsweise selten (FEDORKA-CRAY et al.

2000; SANTOS et al. 2001; NIEWOLD et al. 2007; MEURENS et al. 2009).

Die meisten Erkenntnisse über Virulenzfaktoren der Salmonellen wurden in In vitro-

Versuchen gewonnen. Diese zeigen aber, dass Rückschlüsse auf die medizinische Relevanz

und auf die klinische Bedeutung für den betroffenen Patienten nicht immer möglich sind.

Erschwerend kommt eine geringe Wirtsadaptation und vielfältige klinische Manifestation der

Salmonella-Serovare hinzu, die aus der Kombination des Serovars und dem involvierten Wirt

resultiert (WALLIS und GALYOV 2000; WATSON et al. 2000; SANTOS et al. 2003;

PERRON et al. 2008).

Literaturübersicht

13

2.1.3.1 Chromosomal kodierte Pathogenitätsfaktoren

Die Virulenz der meisten infektiösen Bakterien setzt potente Pathogenitätsfaktoren voraus.

Schätzungsweise werden etwa 4 % des Genoms von Salmonella Typhimurium, welches über

200 Gene kodiert, für eine letale Infektion bei Mäusen benötigt. Ein großer Teil dieser Gene

befindet sich als eine Reihe von Genen, welche eine funktionelle Einheit bilden, in

spezifischen Regionen des Genoms, den so genannten Salmonella Patogenicity Islands (SPIs).

Diese können auch als Pathogenicity Islets vorkommen, die lediglich aus einem oder wenigen

Genen bestehen (MARCUS et al. 2000). Insgesamt sind bereits 21 dieser Pathogenitätsinseln

(SPIs) identifiziert. Einzelne Isolate der verschiedenen Serovare können unterschiedlich viele

Pathogenitätsinseln aufweisen. Die genaue Funktion der einzelnen Pathogenitätsinseln und

ihre Interaktion und Regulation sind jedoch nur teilweise bekannt (SABBAGH et al. 2010;

HALLSTROM und MCCORMICK 2011).

Eines der wichtigsten Pathogenitätsmerkmale der Salmonellen ist die Fähigkeit, im Darm zu

kolonisieren und sowohl M-Zellen als auch Enterozyten zu invadieren. Diese Eigenschaft von

Salmonellen in Wirtszellen einzudringen, wird als „Invasion“ bezeichnet. Untersuchungen

zeigen, dass eine Invasion von Salmonellen in den Wirt nur dann möglich ist, wenn die

Wirtszelle aktiv an diesem Prozess beteiligt ist (GALAN et al. 1993).

Die Salmonella-Pathogenitätsinsel 1 (SPI 1) ist zur Zeit die am besten charakterisierte von

allen und ist in allen Linien der beiden Salmonella-Spezies (S. bongori und S. enterica) zu

finden (MARCUS et al. 2000; LOSTROH und LEE 2001). Die SPI 1 ist 40 kb groß und in

der Centisom-63-Region des Salmonella-Cromosoms lokalisiert. Sie kodiert für insgesamt 33

Proteine. Darunter befinden sich alle Komponenten des Typ III-Sekretionssystems und einige

seiner Regulator- und Effektor-Proteine. Das Typ III-Sekretionssystem wird zusammen von

der Salmonella-Pathogenitätsinsel 1 und der Salmonella-Pathogenitätsinsel 2 kodiert und

transportiert Virulenzfaktoren und Effektor-Proteine in Richtung oder direkt in die

Wirtszellen. Das von der SPI 2 kodierte Typ III-Sekretionssystem ist jedoch strukturell und

funktionell von dem, welches auf der Salmonella-Pathogenitätsinsel 1 kodiert ist,

verschieden. Die auf der SPI 1 kodierten Proteine sind für die Invasion in die nicht

professionell phagozytierenden Zellen erforderlich (GROISMAN und OCHMAN 1993;

MARCUS et al. 2000; HANEDA et al. 2009; AGBOR und MCCORMICK 2011). Die

Invasion in nicht professionell phagozytierende Zellen wird für die Besiedlung innerer

lymphatischer Organe als sehr wichtig angesehen. Die nicht-invasiven Mutanten zeigten in

Literaturübersicht

14

vivo eine verminderte Fähigkeit, die Milz und Leber zu kolonisieren und somit in oral

infizierten Mäusen ein attenuiertes klinisches Erscheinungsbild zu erzeugen. Viele

Beobachtungen haben gezeigt, dass für S. Typhimurium die Invasion als solche nicht immer

erforderlich ist, um gezielt Organe des Wirtsorganismus zu erreichen. So ist z.B. S.

Typhimurium, der die gesamte SPI 1 fehlt, nicht in der Lage, kulturelle Gewebezellen zu

invadieren. Es besitzt jedoch die Fähigkeit, in vivo Organe systemisch zu besiedeln.

Salmonellen haben ausserdem die Möglichkeit einen alternativen Weg zu gehen, um die Milz

zu erreichen. Sie dringen in die CD 18+-Makrophagen ein und benutzen sie als Vehikel. Diese

Erkenntnisse wurden im Rahmen einer intragastrischen Infektion in BALB/c Mäusen erlangt

(LOSTROH und LEE 2001). Eines der auf der Salmonella Pathogenicity Island 1

lokalisierten Gene ist das bereits 1989 entdeckte invC-Gen (GALAN und CURTISS 1989). Es

kodiert für ein 47 kDa-Polypeptid, das in seiner Sequenz homolog zu Vertretern der F0F1-

ATPase-Proteinfamilie verschiedener Mikroorganismen ist. Das Protein weist zudem eine

signifikante ATPase-Aktivität auf (EICHELBERG et al. 1994). Trotz der zentralen Rolle

dieser ATPasen in der Sekretion des Typ III-Sekretionsapparates, ist wenig über deren

Mechanismen bekannt. Bewiesen ist hingegen, dass gereinigtes rekombinantes invC sowohl

in monomerer sowie in multimerer Form vorkommt (wahrscheinlich als Hexamer). Weitere

Untersuchungen lassen vermuten, dass das invC in mindestens drei diskrete Domänen

unterteilt ist. Die erste dieser Domänen ist die Amino-terminale-Domäne, die wahrscheinlich

die Verbindung von invC mit der Membran vermittelt. Die zweite ist die zentrale katalytische

und die dritte eine Carboxyl-terminale Domäne, die möglicherweise an Protein-Protein-

Interaktionen, welche für die Funktion des Typ III-Sekretionssystems wichtig sind, beteiligt

ist (AKEDA und GALAN 2004).

Weitere Pathogenitätsmerkmale der Salmonellen sind das intrazelluläre Überleben und die

Fähigkeit sich intrazellulär zu replizieren. Die dafür verantwortlichen Gene werden von der

Salmonella-Pathogenicity 2 (SPI 2) kodiert (ZURAWSKI und STEIN 2004; GERLACH und

HENSEL 2007).

Die molekularen Funktionen der SPI 2 sind vergleichsweise noch nicht so gut charakterisiert

wie die von der SPI 1. Jedoch konnte in Mäuse-Infektionsversuchen gezeigt werden, dass SPI

2-Mutanten eine erheblich schwächere Virulenz entfalteten und damit die Fähigkeit, in

infizierten Wirtsorganen wie Milz und Leber zu proliferieren, verloren haben. Zwar können

solche Mutanten bei einer oralen Infektion die Peyerschen Platten kolonisieren, jedoch sind

Literaturübersicht

15

sie nicht in der Lage, sich darüber hinaus weiter zu verbreiten. Es konnte auch bereits in In

vitro-Versuchen gezeigt werden, dass SPI 2-Deletionsmutanten eine kürzere Überlebenszeit

und verminderte intrazelluläre Replikation aufwiesen (HANSEN-WESTER und HENSEL

2001).

Die Salmonella-Pathogenitätsinsel 2 bildet eine Insertion im tRNAval-Gen und ist in zwei

Segmente geteilt, die wahrscheinlich durch verschiedene horizontale Gentransfers erworben

wurden. Die 40 kb große SPI 2 liegt bei Centisom 31 und kodiert für mehr als 40 Gene. Die

vier verschiedenen Arten von Genen werden in Operone eingeteilt, welchen verschiedene

Funktionen zuzuordnen sind. Diese werden als Gene für Strukturproteine des

Sekretionsapparates (ssa = secretion system apparatus), Gene für sezernierte Effektor-Proteine

(sse = secretion system effector), Gene die als Regulatoren fungieren (ssr = secretion system

regulator) und Gene die für Chaperone kodieren (ssc = secretion system chaperone), definiert.

Die SPI2 kodiert ein Zweikomponentensystem, das für die Expression aller Gene die für das

Sekretionssystem Typ III der Pathogenitätsinsel 2 notwendig sind. Am Ende der Insel,

beginnend bei Centisom 30, befindet sich ein etwa 26 kb großer Bereich, in dem die Gene für

das Sekretionssystem Typ III lokalisiert sind (MARCUS et al. 2000; WATERMAN und

HOLDEN 2003).

Der von der SPI 2 kodierte Sekretionsapparat dient dem Transfer einer Reihe von Effektor-

Proteinen, die für das intrazelluläre Überleben und die systemische Infektion notwendig sind.

Ein Teil dieses Systems ist eine auf der Bakterienoberfläche lokalisierte Translokatorstruktur,

die aus den drei Proteinen, SseB, SseC und SseD besteht (ZURAWSKI und STEIN 2004). Im

Gegensatz zu den anderen Sekretionsapparaten, die die Proteine durch die Wirtszellmembran

translozieren, erfolgt hier der Transport durch die Vakuolenmembran (HOLDEN 2002). Die

SseCD bilden eine vermeintliche Translokator-Poren-Untereinheit, die in der Membran der

Wirtszelle lokalisiert ist. Bei SseB handelt es sich vermutlich um eine scheidenartige

Untereinheit, deren Funktion darin besteht, den Translokator in der Bakterienmembran mit

der Porenuntereinheit zu verbinden. Zusätzlich wurde eine zentrale Domäne innerhalb des

SseD-Proteins, welches Bindungen beeinflusst, beschrieben (ZURAWSKI und STEIN 2004).

Das von der Salmonella-Pathogenicity-Island kodierte Sekretionssystem ist somit ein

multifunktionelles Virulenzsystem, das nach dem Eintritt in die eukariontische Zelle aktiviert

wird. Auch wenn viele Effektorproteine bereits identifiziert sind, können Effektor-Funktionen

nur wenigen davon zugeschrieben werden. Daher ist vermutlich eine große Anzahl weiterer

Effektoren, die sich an diesem Prozess beteiligen, bisher unentdeckt (WATERMAN und

HOLDEN 2003).

Literaturübersicht

16

Abgesehen von den verschiedenen, eng kontrollierten Pathogenitätsinseln, die in

unterschiedlichen Stadien der Infektion wirksam werden, scheint eine hoch entwickelte

Regulation des Bakterienstoffwechsels zu existieren. Salmonellen verfügen über eine Reihe

von adaptierten Mechanismen, die es ihnen ermöglichen, den verschiedensten

Umgebungseinflüssen entgegen zu wirken. Diese Herausforderungen sind unter anderem

solche wie oxidativer Stress, Nährstoffmangel und Verdauungsenzyme, die in

unterschiedlichen Stadien der Infektion auftreten. Eine Gruppe von Genen, die in der

metabolischen Adaption eine Rolle spielen, sind die so genannten „starvation-stress response

Gene“ (SPECTOR 1998). Diese Gene kodieren spezifische metabolische Funktionen, die für

das Überleben der Salmonellen in bestimmten Stadien der Infektion notwendig sind und

damit als Virulenz-Determinanten betrachtet werden müssen.

Die Fähigkeit der Salmonellen, die Ausscheidung von Darmsekret zu induzieren, wird zum

Teil der Produktion von Enterotoxinen zugeschrieben. Bislang wurde bei einigen Salmonella-

Isolaten ein Choleratoxin-ähnliches Enterotoxin beschrieben, das in der Struktur, Funktion

und Antigenität, dem Choleratoxin- (CT) sowie dem von Escherichia coli hitzelabilen- (LT-

I)-Enterotoxin ähnelt (CHOPRA et al. 1987; PRASAD et al. 1990; 1992). CHOPRA et al.

(1999) konnten zeigen, dass Mutationen des Salmonella enterotoxin-Gens (stn) von S.

Typhimurium im Mäuseinfektionsmodel zu einer signifikanten Verminderung der gesamten

Virulenz führt. Jedoch ist die genaue Funktion dieses Toxins nicht vollständig geklärt.

Weiterhin konnten drei verschiedene Zytotoxine bei Salmonellen beschrieben werden. Zwei

dieser Toxine sind in ihrer Funktion weitestgehend unbekannt. Ein membranassoziiertes

Zytotoxin mit geringem Molekulargewicht wurde von REITMEYER et al. (1986)

beschrieben. Die von ASHKENAZI et al.(1988) untersuchten Isolate produzierten alle ein

hitzelabiles-Zytotoxin und waren empfindlich für eine Trypsinbehandlung, was darauf

hinweist, dass der toxisch aktive Teil ein Protein ist. Ein drittes Toxin ist das so genannte

Salmolysin, ein zellassoziiertes Hämolysin (LIBBY et al. 1990). Das Salmolysin wird von

dem slyA-Gen kodiert und hat keine signifikanten Homologien zu anderen beschriebenen

Genen. Das slyA-Gen kommt dennoch auch bei Shigella und enteroinvasiven E. coli-Isolaten

vor. Salmolysin ist ein essentieller Pathogenitätsfaktor in Salmonella, der für das

intrazelluläre Überleben in Peritoneal-Makrophagen und für die Virulenz im

Mäuseinfektions-Modell verantwortlich ist (LIBBY et al. 1994).

Neuere Untersuchungen zeigen, dass das slyA-Gen eine komplexere Funktion aufweist, als

zuerst vermutet werden konnte. Das SlyA-Protein ist ein Mitglied der MarR-Familie von

Transskriptionsfaktoren, die eine wichtige Rolle bei der bakteriellen Virulenz spielen. Es

Literaturübersicht

17

konnte gezeigt werden, dass SlyA eine selbstregulierende Funktion hat. Hierzu konnte eine

Verbindung zu einem anderen regulierenden Faktor, dem PhoP-PhoQ-

Zweikomponentensystem, nachgewiesen werden. Dieser kontrolliert die

Kapselkomponentenmodifikation der Salmonellen. Dies beruht auf der Mg(II)-

Ionenkonzentration, die im Phagosom niedriger ist als im extrazellulären Raum. Das PhoP-

PhoQ-System erkennt die unterschiedlichen Ionenkonzentrationen von Ca(II) und Mg(II),

wodurch die Lokalisation des Bakteriums bestimmt wird und sich das System den jeweiligen

Oberflächenstrukturen anpassen kann. Das SlyA selbst wird dabei nicht direkt von Mg(II)-

Ionen beeinflusst, sondern über das PhoP-PhoQ-Zweikomponentensystem (NORTE et al.

2003).

Unterschiede in der Lipopolysaccharid- (LPS-) und Flagellen-Struktur der Salmonellen

generieren die antigenetischen Variationen, die sich in den über 2500 Serovaren

widerspiegeln. Desweiteren haben Variationen der Lipopolysaccharide Einfluss auf die

Virulenz des jeweiligen Stammes.

Die Gene der rfb-Region des Salmonellen-Chromosoms kodieren die Enzyme, welche für die

Synthese von Zuckern sowie deren Organisation in den Polysaccharid-Seitenketten des

Lipopolysaccharids verantwortlich sind (LINDQVIST et al. 1994; FITZGERALD et al.

2003). Die zweite weniger variable Komponente des LPS der Salmonellen stellt das Lipid A

dar. Da das Lipid A in den meisten In vivo- und In vitro-Testsystemen die biologisch aktive

Komponente des Lipopolysaccharids ist, wird es als „endotoxic principle“ (Endotoxische

Prinzip) des Endotoxins bezeichnet (SEYDEL et al. 2005). Die rfb-Region ist polymorph und

führt somit zu einem hohen Polymorphismus der Polysaccharidketten (FIERER und GUINEY

2001). Die dritte Komponente des Lipopolysaccharides bildet das Kern-Oligosaccharid (core

oligosaccharide). Diese weitaus weniger variable Kernregion wird in eine äußere und innere

unterteilt und verbindet die O-spezifischen Seitenketten mit dem Lipid A (RIETSCHEL und

BRADE 1992; RIETSCHEL et al. 1993; RYCROFT 2000). Bei den meisten Serotypen bildet

das intakte LPS zum Schutz vor Umwelteinflüssen eine Schicht um das Bakterium und

schützt es somit auch vor Phagozytose durch Makrophagen bzw. vor der

Komplementkaskaden vermittelten Abtötung (SAXEN et al. 1987; ROBBINS et al. 1992).

Hinsichtlich der Koloniemorphologie lassen sich bei den Salmonellen S- (smooth) und R-

(rough) Formen unterscheiden, wobei sich der Begriff auf die Ausbildung der Kolonieränder

bezieht. In der Ultrastruktur erklären sich diese phänotypischen Differenzen mit der

unterschiedlichen Exprimierung des O-Antigens. Ursache hierfür sind Defekte an Genen,

Literaturübersicht

18

welche speziell Phosphoryl- und Glykosyltransferasen kodieren, was eine Synthese

unvollständiger LPS-Moleküle bedingt (KLENA et al. 1992). Zum besseren Verständnis

infektiöser Mechanismen ist anzumerken, dass die S-Formen bei Salmonellen hinsichtlich der

Länge ihrer Polysaccharide stark differieren und neben vollständigen (S) Seitenketten auch

gleichseitig R-Formen exprimiert werden (SEYDEL et al. 1993). Gelangt das

Lipopolysaccharid in den Herzkreislauf des Wirtes führt es zu Immunzellstimulation, aus der

die Freisetzung von Zytokinen wie TNF-α (Tumor Nekrose Faktor α) und Interleukinen

resultiert. Die systemische Produktion dieser Entzündungsmediatoren zeigt sich klinisch

charakteristisch in Symptomen einer Sepsis durch Hypotonie, Fieber, respiratorischer

Dysfunktion, die zu multiplen Organversagen und Tod führen kann (MUELLER et al. 2005).

In geringen Mengen wirken die Lipopolysaccharide stimulierend auf das Immunsystem des

Wirtes, höhere Mengen dagegen führen zu dramatischen pathophysiologischen Reaktionen

(SCHLETTER et al. 1995).

Flagellen der Salmonellen sind auch potente Antigene, welche bei der Serotypisierung anhand

des Kauffmann-White-Schemas Anwendung finden. Die Geißel-Antigene (Flagellen, H-

Antigene) werden in zwei Phasen exprimiert, jedoch exprimiert jedes einzelne Bakterium nur

eine von beiden Phasen. Es wird vermutet, dass dieser Wechsel der Antigene ein Weg für das

Bakterium ist, zeitweise der humoralen Abwehr des Wirtes zu entkommen (FIERER und

GUINEY 2001). Flagellen spielen eine entscheidende Rolle bei der Adhäsion und der

Invasion in verschiedenen kultivierten Zellen. Neuere Untersuchungen zeigen, dass Flagellen

auch bei Entzündungen eine spezifische Rolle übernehmen können. Sie aktivieren die

Sekretion von Entzündungsmediatoren wie NF-κB und Interleukin 8 über den TLR5-Rezeptor

(Toll-Like-Receptor 5) in humanen epithelialen Zellmodellen. Eine verminderte Virulenz von

nicht beweglichen und nicht chemotaktischen Salmonellen-Mutanten kann hauptsächlich von

der weniger effizienten Interaktion mit dem zäkalen Epithelium herrühren (STECHER et al.

2004).

2.1.3.2 Plasmid-kodierte Pathogenitätsfaktoren

Die für die Pathogenität von Enterobakterien verantwortlichen Virulenzfaktoren werden

überwiegend von Plasmiden kodiert. Die Salmonella-Virulenzplasmide (spv) wurden erst in

den 80-iger Jahren entdeckt. Diese Entdeckung bezieht sich auf ein relativ großes, 90 kbp

umfassendes Plasmid, welches bei fast allen S. Typhimurium-Isolaten beobachtet wurde

Literaturübersicht

19

(ROTGER und CASADESUS 1999). Auch einige der Salmonella enterica subspezies

enterica tragen diese sogenannten „Low-Copy“-Plasmide. Insbesondere die wirtsadaptierten

Salmonella-Serovare besitzen vermehrt Virulenzplasmide.

Das Vorhandensein dieser Virulenzplasmide korreliert positiv mit der Virulenz der

betreffenden Stämme, weshalb sie bereits kurz nach ihrer Entdeckung den Namen

„Virulenzplasmide“ erhielten. Es konnte im Rahmen experimenteller Infektionen von Mäusen

gezeigt werden, dass das Vorhandensein dieses Plasmids die LD50 um den Faktor 10 auf 106

in Abhängigkeit von Serovar und Art der Inokulation verringert. Dieser als „spv-Effekt“

bezeichnete Vorgang wurde auch in anderen Tierarten beobachtet (HELMUTH et al. 1985;

TINGE und CURTISS 1990; FIERER et al. 1992; LIBBY et al. 1997; ROTGER und

CASADESUS 1999; MAZURKIEWICZ et al. 2008; GUINEY und FIERER 2011). Die

Größe der Virulenzplasmide kann in Abhängigkeit von Serovar zwischen 50 und 140 kb

variieren. Die Virulenzplasmide der Subspezies I von S. enterica, haben einen Abschnitt, der

stark homolog ist und als „Salmonella plasmid virulence“-Locus (spv-Locus) bezeichnet wird.

Dieser 7,8 kb große spv-Locus besteht aus vier Strukturgenen (spvABCD), die als Operon

organisiert sind und vom spvR-Gen reguliert werden (GUINEY et al. 1994; LESNICK et al.

2001). Das sogenannte SpvR-Protein ist der Hauptregulator dieser Strukturgene. Es bindet an

bestimmte Regionen zweier Promotoren (den eigenen und an spvA) und initiiert die

Transkription. Dafür ist zusätzlich der Sigma-Faktor-RpoS notwenig, der vorwiegend in

Stresssituationen vorliegt. Als Folge dieses Prozesses werden vor allem solche Proteine

gebildet, die Bakterienzellen vor schädigenden Umwelteinflüssen schützen (LESNICK et al.

2001; DONG und SCHELLHORN 2010; GUINEY und FIERER 2011). Genetische Analysen

haben ergeben, dass die spvR- und spvBC-Gene für die Virulenz essentiell sind, während spvA

und spvD dafür irrelevant sind (GUINEY und FIERER 2011).

Literaturübersicht

20

2.1.4 Mutationen

Bakterien weisen eine Genomstabilität auf, die im Normalfall durch Reparaturmechanismen

und Restriktionsenzyme gegen fremde DNA sowie Transferbarrieren gewährleistet wird. Im

Verlauf der evolutionären Anpassung bildeten sich jedoch kontinuierlich Mutationen auf

Grund horizontaler Gentransfers und Umlagerungen genetischer Varianten heraus.

Genrearrangements, also die Neuordnung der sich im Genom befindlichen einzelnen Gene

und Gencluster, sind die Folge von Selektionen.

Spricht man vom horizontalen Gentransfer, handelt es sich um eine Genübertragung durch

Konjugation, Transformation oder Transduktion. Diese drei Transfermechanismen

ermöglichen Bakterien eine erfolgreiche Verteilung und schnelle Resistenzentwicklung.

Bei der Konjugation handelt es sich um einen Plasmid-Transfer. Eine plasmidhaltige Zelle,

der so genannte Donor, gibt über einen Sex-Pilus Kopien von Plasmiden an eine andere Zelle,

den Rezipienten, weiter (KRACZKIEWICZ-DOWJAT et al. 1984). Diesen

extrachromosomalen Informationsaustausch beschrieben bereits Lederberg und Tatum (1946).

Bei der Transduktion erfolgt die Plasmidübertragung durch Bakteriophagen (FALKOW

1975). Da sich diese Vektoren jedoch nur an bestimmte Rezeptoren der Zelloberfläche

anheften können, bleibt der jeweilige Austausch auf eine Bakterienspezies, bzw. gram-

verwandte Spezies, beschränkt (SAUNDERS 1984).

Bei der Transformation werden freie, fremde DNA-Stücke in die Bakterienzelle

aufgenommen und können nun durch homologe Rekombination identischer Sequenzen in das

Genom integriert werden (LEVY 1992). Solch ein Austausch von Genen ist unter

verschiedenen Genera möglich (SAUNDERS 1984). Die Transformation hat jedoch im

Vergleich zur Transduktion und Konjugation kaum Bedeutung, da der Verlust von

Zellwandanteilen des Erregers, als eine Bedingung für die Transformation, diesen

Mikroorganismus empfindlicher gegenüber Umwelteinflüssen macht (WERCKENTHIN und

SCHWARZ 1997).

Eine Mutation führt zu einer Veränderung der DNA-Basen-Sequenz. Dies verschafft der

Mutante gegenüber ihrem Wildtyp oftmals einen entscheidenden Überlebensvorteil. Man

unterscheidet bei Mutationen zwei Formen, die Punkt- und die Rastermutation. Bei einer

Punktmutation werden einzelne Nukleotidbasen ausgetauscht. Sie stellt somit die einfachste

Literaturübersicht

21

Form der Mutation dar. Ihr Vorkommen liegt bei einer Häufigkeit von 1 Mutante pro 106

Keimen. Bei Rastermutationen finden größere Veränderungen im Bereich des Erbgutes statt.

Ursachen dafür sind Insertionen (Hinzufügen von Basenpaaren), Deletionen (Verlust von

Basenpaaren) und Inversionen (Herausschneiden und Einsetzen eines DNA-Moleküls in

umgekehrter Reihenfolge) (HUTCHINSON und DONNELLAN 1996).

Von besonderem Interesse ist die Mutation unter dem Gesichtspunkt der Weitergabe von

Resistenzgenen. Hierbei erfolgt eine Unterteilung in spontane und adaptive Formen der

Mutation (MORRIS et al. 1998). Spontanmutationen unterliegen dem Zufallsprinzip. Sie

finden während der Zellteilung bei 0 bis 5 Mutanten pro 108 Mikroorganismen statt

(LECLERC et al. 1996). Im Gegensatz dazu sind adaptive Mutationen die Folge eines

Selektionsdruckes, sie ereignen sich in Zellen, die sich nicht in der Vermehrungsphase

befinden. Allerdings bleibt diese Veränderung auf eine Spezies beschränkt, führt aber zu

räumlich begrenzten Resistenzen. Bei pathogenen S. enteric- und E. col-Stämmen wurden

vergleichsweise hohe Mutationsraten beschrieben. Die Mutanten dieser Stämme weisen eine

1000-fach höhere Rifampicin-Resistenz im Vergleich zum Wildtyp auf. Auch fanden DNA-

Rekombinationen zwischen verschiedenen Bakteriengenera statt, wodurch es zu einer

rasanten Ausbreitung der Resistenzen kam (LECLERC et al. 1996).

Das Ausschalten bestimmter Virulenzgene in Form von Deletionsmutanten, führt zu einer

Attenuierung, welche genauer untersucht und beurteilt werden kann. So ermöglichen

künstlich herbeigeführte Mutationen einen genauen Einblick in das Zusammenspiel zwischen

Erreger und Organismus.

Bei dem Wildtypstamm von S. Typhimurium DT104 wurde durch eine P22-Transduktion der

invC::aphT-Kassette von SB566 eine SPI-1 Mutante konstruiert (EICHELBERG et al. 1994).

Eine SPI-2 Mutante konnte ebenfalls mit Hilfe der P22-Transduktion von sseD::aphT-

Kassette geschaffen werden. Bei der Bezeichnung aphT handelt es sich um eine Kanamycin-

Resistenz-Kassette, mit deren Hilfe ein Erkennen der S. Typhimurium-Klone, bei welchen

durch homologe Rekombination das intakte Gen gegen das mutierte Gen ausgetauscht wurde,

realisierbar wird. Bei solchen Genkassetten handelt es sich um kleine mobile genetische

Einheiten. Sie enthalten üblicherweise nur ein Resistenzgen und eine spezifische

Rekombinationsstelle (RECCHIA und HALL 1995). Sie sind in ein Integron eingefügt, was

durch ihre Mobilität deutlich wird (PARTRIDGE et al. 2001). Ihre Expression steht in

Abhängigkeit von der Lage des Promotor zum Integron (TENOVER und SCHABERG 1998).

Literaturübersicht

22

Ein essentieller Schritt in der Pathogenese von S. Typhimurium ist das Eindringen des

Erregers in seine Wirtszelle, um von dort tiefere Gewebe zu erreichen. Der genetische Locus

Inv, der sich auf SPI1 befindet, ermöglicht dies nicht nur den Salmonella spp., sondern auch

anderen Enterobakterien. Mutationen in der Inv-Genregion führten zu einer 50 % höheren LD

in einem Infektionsversuch an BALB/c Mäusen nach per oraler Infektion (GALAN und

CURTISS 1989).

InvC gehört zum invABC-Operon. Es kodiert Proteine mit einem Molekulargewicht von 15

bis 47 kDa. Mit Hilfe der Gensequenzierung können deutliche Homologien mit Proteinen

anderer Mikroorganismen aufgezeigt werden, z.B. Spa47 der Shigella spp. (VENKATESAN

et al. 1992) und YscN der Yersinia spp. (WOESTYN et al. 1994). Dies spricht für eine hohe

Übereinstimmung der Gene. Bei einer „nonpolaren Mutation“ von invC konnte an Henle-407-

Zellen ein Anheften des Erregers an kultivierte Zellen nachgewiesen werden, ein Eindringen

in die Zellen fand jedoch nicht statt. Die Ursache hierfür liegt in der Unfähigkeit des Erregers,

die typischen und auch notwendigen Zytoskelettveränderungen in der Wirtszelle

herbeizuführen, was als Indikator für das Unvermögen der Bakterien angesehen wird, Signale

an die zu infizierende Zelle zu übermitteln (GINOCCHIO et al. 1994). InvC weist eine hohe

ATPase-Aktivität auf. Die Hydrolyse von ATP dient Salmonellen zur Energiegewinnung für

den Proteintransport in die Wirtszelle, wodurch erst das Eindringen in diese nicht

phagozytierenden Zellen ermöglicht wird. Die SPI-1 TTSS-assoziierte ATPase invC ist aus

drei funktionellen Domänen zusammengesetzt, welche jeweils mit verschiedenen essentiellen

Aktivitäten des Proteins verbunden sind. Das als Domäne 1 bezeichnete Polypeptid besteht

aus ca. 120 Aminosäuren, die den Kontakt mit der Bakterienmembran vermittelt. Domäne 2

stellt den zentral gelegenen katalytischen Teil dar. Domäne 3 bezeichnet den Bestandteil des

Proteins, der unabdingbar für die Funktion des TTSS-Apparates ist. Dieser vermittelt die

Protein- Protein- Interaktionen.

InvC existiert als Monomer oder Hexamer mit einem Molekulargewicht von 47 kDa (AKEDA

und GALAN 2004).

Ein weiteres Kennzeichen der Salmonella-Pathogenese ist die Fähigkeit, intrazellulär zu

überleben und sich zu vermehren. Ermöglicht wird dieser Phänotyp durch die Virulenzgene

auf der SPI 2. Bei SseD handelt es sich um ein Effektorprotein, dessen Aufgabe darin besteht,

die Zellphysiologie zum Vorteil des Bakteriums zu modulieren. Auch werden durch sie

verschiedene Immunitätsmechanismen des Wirtes beeinflusst (WATERMAN und HOLDEN

2003).

Literaturübersicht

23

SseD zeigt eine deutliche Sequenzähnlichkeit zu Sekretionsapparat-Proteinen EspB und EspD

von E. coli und YopB und YopD von Yersinien. In In vitro-Versuchen konnte gezeigt

werden, dass dieses Translokatorprotein im sauren Medium sezerniert wird und dann mit

SseB, ebenfalls einem Effektorprotein der SPI 2, auf der Bakterienoberfläche eine komplexe

Struktur bildet (KLEIN und JONES 2001).

Es besteht ein obligates Zusammenspiel der drei Translokatorproteine SseA, B und D.

Aufgrund der Sequenzhomologien bereits entschlüsselter Enterobakterien wird vermutet, dass

SseD zusammen mit SseC eine Translokator-Poren-Untereinheit in der Vakuole der

Wirtszelle ausbildet. SseB dient zur Verbindung zwischen Translokator der

Bakterienmembran und der Pore. Sie sind damit für den Transport verschiedener Proteine aus

der Bakterienzelle in die Wirtszelle unabdingbar (ZURAWSKI und STEIN 2004).

2.1.5 Diagnostik von Salmonellosen

2.1.5.1 Kultureller Nachweis

Salmonellen stellen keine hohen Ansprüche an Nährmedien, jedoch sollte man beachten, dass

ihre Isolierung abhängig vom physiologischen Zustand der Salmonellen im Probenmaterial,

ihrer Anzahl in der Probe und der Begleitflora ist. Generell gestaltet sich der Nachweis aus

klinischen Proben (Fäzesproben, Organproben u.ä.) leichter als aus Umwelt-, Lebensmittel-

oder Futtermittelproben.

Bei der Entnahme klinischer Proben müssen ebenfalls erhebliche Einflussfaktoren

berücksichtigt werden. Handelt es sich bei dem Probanden beispielsweise um einen latenten

Keimträger, so liegen die Salmonellen in einer weitaus geringeren Anzahl als bei einer akuten

Salmonellose vor. Somit besteht die Notwendigkeit einer Erreger-Anreicherung, die einer

kontinuierlichen Weiterentwicklung im Bezug zur Lebensmittelsicherheit unterliegt. Bis

heute sind zahlreiche unterschiedliche Verfahren beschrieben, die jedoch erhebliche

Abweichungen bezüglich ihrer maximalen Nachweisrate aufweisen. Nicht nur aus diesem

Grund ist der amtliche Nachweis von Salmonellen im Lebensmittel Gegenstand des

Lebensmittel- und Futtermittelgesetzbuches (LFGB, § 64) geworden, welches sich dabei eng

an die Norm 6579:2002 der International Organization for Standardization (ISO) anlehnt

(ANONYMUS 2007).

Literaturübersicht

24

Der Direktausstrich als Nachweisverfahren eignet sich nur für den Fall einer akuten

Salmonellose.

Bei anderen Formen der Erkrankung ist das Verhältnis von Salmonellen zur Darmflora zu

gering, was eine vorangehende Anreicherung nötig macht (WALTMAN 2000).

Es konnte durch verschiedene Untersuchungen belegt werden, dass eine Voranreicherung der

Salmonellen einen positiven Effekt auf die Salmonellen-Isolierungsrate hat (SCHLUNDT und

MUNCH 1993).

Der Salmonellennachweis in Umgebungsproben oder Futter- und Lebensmitteln ist deshalb

schwieriger, weil hier die Begleitflora zahlenmäßig deutlich überlegen ist. Es sollte bevorzugt

mit selektiven Medien gearbeitet werden. Da jedoch die Salmonellen durch verschiedene

Herstellungsverfahren oder Umgebungseinflüsse subletal geschädigt vorliegen können, kann

es zu deren Abtötung durch die Selektivmedien kommen (EIGNER et al. 2001).

Zu berücksichtigen ist die enge Verwandtschaft innerhalb der Enterobacteriaceae, sodass

durch Kreuzreaktionen mit ähnlichen Spezies falsch positive Ergebnisse auftreten können.

Aus diesem Grund wurden zahlreiche Selektivnährmedien erprobt, die genau auf die

physiologischen Eigenschaften der Salmonellen zugeschnitten sind, und die andere

Mikroorganismen, die im natürlichen Milieu der Enterobakterien vorkommen, in ihrem

Wachstum hemmen (WALTMAN 2000).

Daraus ergibt sich für den kulturellen Nachweis der Salmonellen eine festgelegte Reihenfolge

bestimmter Schritte: 1. nicht-selektive Voranreicherung, 2. selektive Anreicherung,

3. Ausstrich auf Selektivnährböden.

Insgesamt werden für den kulturellen Nachweis von Salmonellen vier Tage benötigt, da nach

jedem Schritt eine Inkubationszeit von 18 bis 24 Stunden notwendig ist (ANONYMUS 2007).

2.1.5.2 Voranreicherung

Bei der Voranreicherung erfolgt die Stabilisierung und Aktivierung subletal geschädigter

Salmonellen durch die Gewährleistung optimaler Nährstoffbedingungen.

Die Voranreicherung schützt die Organismen vor den toxischen Zusätzen, die sich in den

selektiven Anreicherungsmedien befinden. Daraus ergibt sich der Vorteil, dass man eine

größere Menge Probenmaterial und auch getrocknete oder tiefgefrorene Proben untersucht

werden können (MAYR und ROLLE 1993; KÜHN und TSCHÄPE 1995).

Literaturübersicht

25

Es existieren verschiedene, international anerkannte Voranreicherungsmedien, die

beispielsweise eine Ringerlösung mit Brilliantgrün, die Laktose- oder die Tryptikase-

Bouillon nützen (D´AOUST 1981). In der ISO 6579, die amtliche Verfahren zur

Untersuchung auf Salmonellen in Deutschland regelt, wird gepuffertes Pepton-Wasser zur

Anreicherung gefordert. Bei Pepton-Wasser handelt es sich um eine nährstoffreiche und

hemmstofffreie Bouillon, die ein intensives Wachstum und eine hohe Wiederbelebungsrate

von subletal geschädigten Salmonellen ermöglicht. Gleichzeitig werden die sich ungünstig

auswirkenden pH-Wert-Schwankungen durch den Phosphat-Puffer ausgeglichen (PIETZSCH

1981).

Von DAVIES und WRAY (1997) wurde eine Methode zur erhöhten Salmonellen-Ausbeute

über eine Voranreicherung entwickelt, bei welcher mit Antikörpern beschichtete

Zelluloseschwämme, in gepuffertem Pepton-Wasser zum Einsatz kommen. Bei 670

Umgebungs- und Schweinekotproben stieg die Anzahl der positiven Isolate um 40 % im

Vergleich zur Standard-Kulturmethode.

Kein einziges eingesetztes Anreicherungsmedium führt allerdings zu einer Verkürzung der

Inkubationszeit, ihre Dauer ist von größerer Bedeutung als die des verwendeten Mediums

(D´AOUST 1981).

2.1.5.3 Selektivanreicherung

Der Schritt der Selektivanreicherung dient der Hemmung der Begleitflora, was durch

verschiedene Zusätze, z.B. Antibiotika, Gallensalze oder Farbstoffe gewährleistet wird.

Bei gramnegativen Begleitkeimen gestaltet sich dies schwieriger, da eine zeitgleiche

Hemmung des Salmonellenwachstums vermieden werden soll. Daher wählt man für eine

zusätzliche Hemmung der Begleitflora und Unterdrückung des Proteus-Schwärmens eine

Bebrütungstemperatur von 42 °C (MAYR und ROLLE 1993).

Das Rappaport-Vassiliadis-Medium (RV-Medium) eignet sich gut zur Anreicherung von

Salmonellen. Dieses Medium weist durch den Zusatz von Malachitgrün eine hohe Selektivität

für Salmonellen auf, da Salmonellen gegen diesen Stoff resistent sind (BAGER und

PETERSEN 1991). Außerdem wird die Fähigkeit der Salmonellen sich bei hohem

osmotischem Druck und niedrigem pH-Wert vermehren zu können, genutzt. Um den Vorteil

der hohen Selektivität und Spezifität dieses Mediums nicht herabzusetzen, kann man

Literaturübersicht

26

allerdings nur geringe Volumina inokulieren. Dieses Verhältnis sollte idealerweise 1:100

betragen.

Die Erstbeschreiber dieses Selektivmediums sind RAPPAPORT et al. (1956). Eine

Modifizierung erfolgte durch VASSILIADIS und Mitarbeiter, indem der Anteil des

Malachitgrün gesenkt und eine Bebrütungstemperatur von 42 °C eingeführt wurde

(VASSILIADIS et al. 1976). Die Nutzung des RV-Mediums setzt eine vorangegangene

Anreicherung voraus.

2.1.5.4 Selektivnährböden

Durch die selektive Voranreicherung erfolgt eine Erhöhung der Keimzahl an Salmonellen in

der Probe wodurch dann eine Kultivierung auf festen Selektivnährböden möglich wird.

Deren Funktionen gleichen denen der selektiven Anreicherungsmedien, wie Hemmung der

Begleitflora und Schaffung einer optimalen Grundlage für das Salmonellenwachstum.

Aufgrund von Farbumschlägen durch Indikatoren oder einer Schwärzung durch

Sulfidausfällungen in den Nährmedien kann man auf das Vorhandensein von Salmonellen

schließen (DEDIE K et al. 1993). Die Funktionsweise der Indikatoren beruht auf

verschiedenen biochemischen Eigenschaften der isolierten Keime. So verstoffwechseln

Bakterien Saccharose (Salmonella nicht), Xylose, Laktose (S. Arizonae und S. Diarizonae)

und andere Substrate, was zu pH-Wert-Änderungen und somit zu einen Farbumschlag führt.

Jedoch wird mittels dieser Methoden eine serologische und biochemische Untersuchung nicht

ersetzt, da auch andere Keime vergleichbare Farbreaktionen auslösen können.

Eine reichhaltige Auswahl solcher Selektivnährböden ist kommerziell erhältlich. Ein kurzer

Überblick wird durch die Tabelle 1 gegeben (SELBITZ 1992).

Literaturübersicht

27

Tabelle 1. Wichtige Anreicherungs- und Differentialnährmedien für Salmonellendiagnostik

Anreicherungsmedien Differentialnährmedien

Voranreicherungen

Tetrathionat-Medien

• Kaliumtetrathionat-Kristallviolett-

Anreicherung nach Preuss

Selenit-Medien

• Natriumselenit-Lactose-Bouillon

nach Leifson

• Selenit-Brilliantgrün-Mannit-

Anreicherungsbouillon

nach Osborne und Stokes

Magnesiumchlorid-Malachitgrün-Medium

nach Rappaport

Lactosespaltung

• Wasserblau-Metachromgelb-Agar nach

Gassner

• Brilliantgrün-Phenolrot-Agar nach

Kauffmann

• MacConkey-Agar

• Fuchsin-Lactose-Agar nach Endo

• Lackmus-Lactose-Agar nach Drigalski

und Conradi

• Salmonella-Shigella-Agar

• Desoxycholat-Citrat-Agar nach Leifson

• Eosin-Methylenblau-Agar nach Levine

• Hektoen-Agar

• Salmonella-Agar nach Önoz

Sulfidbildung

• Xylose-Lysin-Desoxycholat-Agar

• Wismut-Sulfit-Agar

Weitere Medien

• Galle-Chryosidin-Glycerol-Nährboden

nach Ziesché

Durch die ISO-Norm 6579:2002 wird der Ausstrich auf XLD-Agar und einem weiteren

selektiven Nährboden gefordert (ANONYMUS 2007).

Die verschiedenen Nährmedien werden nach ihrem Selektivitätsgrad (gering, mäßig, hoch)

eingeordnet. Das BPLS-Agar gilt nach der Einordnung als hoch selektiv und das XLD-Agar

als mäßig selektiv (LIEBESWAR und ALLERBERGER 2001).

Literaturübersicht

28

Der von Taylor (1965) entwickelte Xylose-Lysine–Deoxycholate-Agar-(XLD-Agar) dient der

Isolierung und Differenzierung pathogener Enterobacteriaceae, insbesondere der Spezies

Salmonella und Shigella.

Nach geeigneter Anreicherung ist seine Überlegenheit gegenüber anderen Selektivnährböden

durch eine weit höhere kultivierbare Anzahl an Salmonellen gekennzeichnet (DUNN und

MARTIN 1971; BHAT und RAJAN 1975). Bei dem verwendeten Indikator handelt es sich

um Phenolrot, welches nach Gelb umschlägt, wenn Laktose, Xylose und Saccharose

verstoffwechselt werden, was jeweils mit einer Säurebildung einhergeht. Die Inhaltsstoffe

Thiosulfat und Eisen(III)-salz dienen zum Nachweis der Schwefelwasserstoffbildung, die man

an einer Schwarzverfärbung der Kolonien infolge der Ausfällung von Eisensulfid erkennt. Die

Hemmwirkung dieses Agarmediums ist allerding relativ schwach. Er nutzt dazu

Natriumdesoxycholat gegen coliforme Keime.

Der Selektivnährboden Brilliant-Grün-Phenol-Rot-Laktose-Agarmedium (BPL-Agar) ist zur

Isolierung aller Salmonellen geeignet, mit Ausnahme von S. Typhi aus Kot, Urin,

pathologischem Material oder Lebensmitteln. Dieser im Jahr 1925 von KRISTENSEN et al.

hergestellte BPL-Agar wurde von KAUFFMANN modifiziert (1935).

Der Nährboden enthält ebenfalls den Indikator Phenolrot, der bei Wachstum unter

Säurebildung zu einem gelben Farbumschlag führt. Das Prinzip ist das gleiche, wie das des

XLD-Agarmediums.

Bei Salmonella erfolgt kein Abbau von Laktose und Saccharose. Dadurch entwickelt sich ein

basisches Milieu und die Kolonien stellen sich in diesem Medium rosarot mit einem roten Hof

dar. Durch den Zusatz von Brilliantgrün wird das Wachstum grampositiver Keime, Shigellen

und Salmonella Typhi gehemmt.

Der Unterschied zwischen dem 1935 entwickelten BPL-Agar und dem in dieser Arbeit

verwendeten BPLS-Agar (Brilliant-Grün-Phenol-Rot-Laktose-Sucrose-Agarmedium) liegt in

der Gewährleistung einer optimierten Nährstoffgrundlage, die zu einem besseren Wachstum

von Salmonellen führt. Gleichzeitig wurde zur Hemmung der Begleitflora der Gehalt an

Brilliantgrün erhöht. Durch die enthaltene Saccharose wird eine zusätzliche Differenzierung

zwischen den Laktose- und Saccharose-negativen Mikroorganismen (Salmonella) und allen

Laktose-negativen oder Saccharose-positiven Keimen erreicht.

Literaturübersicht

29

2.1.5.5 PCR-Nachweis

Um auch geringste Mengen DNA nachzuweisen zu können, wurde eine spezifische Technik

zur Vervielfältigung von DNA entwickelt (MULLIS und FALOONA 1987). Diese Technik

der Polymerase-Ketten-Reaktion (polymerase chain reaction) wurde seitdem intensiv

weiterentwickelt und stellt heute ein unverzichtbares Verfahren mit Anwendungen auf sehr

zahlreichen Gebieten der Mikrobiologie dar. Charakteristisch für diese Methode der DNA-

Analytik sind ihre Schnelligkeit in der Durchführung und ihre hohe Sensitivität.

Das Prinzip beruht auf einem sich ständig wiederholenden DNA-Vermehrungszyklus, wobei

als direkte Replikationsmatrize genomische oder rekombinante DNA, auch Template genannt,

verwendet wird.

Es werden zunächst die Doppelstränge der DNA durch Erhitzen aufgetrennt. Dadurch können

sich kurze, einzelsträngige DNA-Sequenzen, die sogenannten Primer, an die jeweils

komplementären Regionen der DNA anheften. Die Primer stellen den Startbereich für eine

hitzestabile Polymerase dar, die so den einzelnen DNA-Strang komplementär nachbilden

kann. Auf diese Weise werden nur gesuchte DNA-Abschnitte vermehrt, da die vorgelegten

Primer in ihrer Sequenz definiert und synthetisiert sind. Durch sie werden die Sensitivität,

Spezifität und Reproduzierbarkeit dieser Methode geprägt (RYCHLIK 1995).

Theoretisch findet bei jedem Zyklus eine Verdopplung der gesuchten Sequenzen statt, es

handelt sich um ein exponentielles Geschehen, das mit der Formel N=N02n beschrieben

werden kann. Dabei ist N die Anzahl der vervielfältigten Abschnitte, N0 die

Ausgangsmolekülanzahl und n die Anzahl der Zyklen. Unter idealen Bedingungen könnte

man also von einem exponentiellen Zuwachs der Ziel-DNA ausgehen, praktisch jedoch ist die

Effektivität der PCR niemals 100 %. Es gilt die Formel N= N0(1+E) n. Dies ergibt sich durch

den sich ausbildenden Plateaueffekt, der sich an die exponentielle Phase anschließt.

Ursachen dafür können eine Akkumulation des Produktes, ein Verbrauch der

Reaktionskomponenten oder das Absinken des Polymerase- Template- Verhältnis sein.

Für das Amplifikat stehen verschiedene Nachweissysteme zur Verfügung, z. B. der Southern-

Blot oder die Agarose- Gel- Elektrophorese. Jeder dieser Nachweise ist mit einem relativ

hohen Zeitaufwand verbunden.

Mit der PCR-Methode kann lediglich eine qualitative Aussage getroffen werden.

Im Jahr 1991 wurde die wohl bedeutendste PCR-Methode zum Salmonellennachweis

veröffentlicht (WIDJOJOATMODJO et al. 1991). Dabei werden Abschnitte des

Replikationsgens oriC amplifiziert. Im nachfolgenden Jahr entwickelten die gleichen Autoren

Literaturübersicht

30

ein Verfahren zur Extraktion von Salmonellen-DNA aus klinischen Proben, bei der

spezifische Antikörper mit magnetischen Partikeln beladen werden (WIDJOJOATMODJO et

al. 1992). In Kombination mit ihrer 1991 entwickelten PCR nannten sie dieses Verfahren

„Magnetic Immuno-Polymerase-Chain-Reaction“-(MIPA). Mit Hilfe dieses Verfahrens waren

(WIDJOJOATMODJO et al. 1992) und später andere Autoren (WIDJOJOATMODJO et al.

1992; FLUIT et al. 1995; FAVRIN et al. 2003) in der Lage, Salmonellen sowohl aus Stuhl-

als auch Lebensmittelproben mit hoher Detektionsrate zu isolieren (105 KBE/g Stuhl bzw. 1 -

3 KBE/25 g bzw. ml Lebensmittel).

Eine von RAHN und Mitarbeiter (1992) entwickelte Salmonellen-PCR detektiert das von

GALAN und CURTISS entdeckte invA-Gen (GALAN und CURTISS 1989; GALAN und

CURTISS 1991; GALAN et al. 1992). Bei dieser PCR wurde eine Sensivität von 99,4 % und

eine Spezifität von 100 % erzielt. Das Rahn’sche Verfahren wurde später von ARNOLD et al.

(2004) modifiziert und damit optimiert. Dadurch gelang es, sowohl Sensivität als auch

Spezifität zu erhöhen, da keine Kreuzreaktionen mit Genomabschnitten zeitgleich präsenter E.

coli mehr auftraten.

Neben oben genannten eigenen sich andere Genabschnitte zum Nachweis von Salmonellen.

So verwendeten BRUMME (2006) und RÖSLER (2007) Abschnitte des invC- sowie sseD-

Gens, um Mutanten vom Wildtyp von S. Typhimurium nachzuweisen.

Im Jahr 1991 gelang es OLSEN et al., einen 2,3 kb großen DNA-Bereich zu identifizieren,

der bei 20 verschiedener Salmonella-Serovaren identisch war und sich zum Nachweis von

Salmonellen mittels PCR eignete. Diesen Bereich nutzen auch AABO und Mitarbeiter (1993)

die zeigen konnten, dass sich ein 429 bp großes Fragment dieses Bereiches noch besser zum

Nachweis von Salmonellen eignet, da es offensichtlich einen stark konservierten

Genomabschnitt repräsentiert und für mindestens 213 Serovare spezifisch ist. Die zum

Nachweis dieses 429 bp großes Fragments notwendigen Oligonukleotidprimer sind in der

DIN 10135 (ANONYMUS 1999) als solche gelistet, die sich zum Nachweis von Salmonellen

mittels PCR eignen. Diese DIN einhält auch die Primer, die RAHN et al. (1992) nutzte. Diese

DIN sagt jedoch auch, dass auch andere Oligonukleotide zum Nachweis von Salmonellen

eingesetzt werden können, wenn deren Eignung fachlich geprüft wurde.

Neben klassischen PCR Protokollen sind solche erwähnenswert, die auf der sogenannten

nested PCR basieren. Gängige nested PCR sind in den unlängst erschienenen Artikeln von

WAAGE et al. (1999) und RATHNAYAKA (2011) resümiert. Dabei werden in der Regel

folgende Genabschnitte zur Amplifikation genutzt: das bereits oben beschriebene 2,3 kb

Literaturübersicht

31

große Salmonella-DNA-Fragment (AABO et al. 1993; WAAGE et al. 1999) bzw. das fliC-

Gen (TOURON et al. 2005; RATHNAYAKA 2011).

Bei einer nested PCR erfolgt ein initialer PCR-Schritt (externe PCR), dem ein zweiter folgt.

Bei Letzterem werden Abschnitte des initial amplifizierten Genomabschnittes nochmals

vermehrt. Derartige Verfahren sind generell sensitiver als konventionelle PCR. Nachteil ist,

dass die Gefahr von Kontaminationen wesentlich höher ist. Jüngere Verfahren basieren auf

der Real-time PCR. Dabei werden Zielgene bzw. Genomabschnitte amplifiziert, an die sich

spezifische Farbstoffe binden. Das Ausmass der Farbstoffbindung wird gemessen; je mehr

Farbstoff gebunden ist, desto höher ist die Konzentration des Amplifikates und damit des zu

testenden Agens wie Salmonellen in der Testsubstanz. Durch eine Real-time PCR ist neben

dem schlichten Nachweis („Ja/Nein“) auch eine Quantifizierung möglich (KUBISTA et al.

2006).

Material und Methoden

32

3 MATERIAL UND METHODEN

3.1 Tiere und Aufstallung

Insgesamt wurden 25 männliche Hybrid-Schweine (Landrasse x Edelschwein) in die

Untersuchungen einbezogen. Das Tierversuchsvorhaben wurde vom Regierungspräsidium

Leipzig genehmigt (Tierversuchsvorhaben Nr. 02/03). Die Tiere entstammen aus einem

Herdbuch-Zuchtbetrieb einer Erzeugergemeinschaft aus Niedersachsen, der in der

Vergangenheit stets negative serologische und bakteriologische Salmonellenbefunde zu

verzeichnen hatte. Die Tiere waren zu Versuchsbeginn 6 Wochen alt, frei von klinischen

Symptomen und durchschnittlich 10,3 kg (s +- 1,2) schwer. Die Schweine, die vor

Versuchsbeginn serologisch mittels eines kommerziellen ELISA-Tests (Salmotype LPS-

ELISA; LDL, Leipzig, Deutschland) und mikrobiologisch mittels einer Kotprobe (in

Anlehnung an ISO 6579 zur Untersuchung auf Salmonellen) auf Salmonellen untersucht und

als frei befundet worden waren, wurden in die Versuche aufgenommen. Die Muttertiere

wurden auf gleiche Weise getestet und waren ebenso frei von Salmonellen befundet.

Dieselben Schweine fanden in der Dissertation von BRUMME (2006) und in der Habilitation

von RÖSLER (2007) Verwendung. In genannten Arbeiten wurde sich unter anderem

serologischen und immunologischen Aspekten der Infektion gewidmet.

Sämtliche Versuche fanden im voll klimatisierten Versuchstierstall des Institutes für

Tierhygiene und Öffentliches Veterinärwesen an der Veterinärmedizinischen Fakultät der

Universität Leipzig statt. Die Tiere wurden paarweise auf Vollspaltenboden gehalten und

erhielten Ferkelaufzuchtsfutter (FZ I; Agrargenossenschaft Laas e.G.) und Wasser ad libitum.

Das Futter wurde den Tieren 20 Stunden vor Versuchsbeginn (Infektion) entzogen.


33

3.2 Versuchsdesign

Das Versuchsdesign ist in Abbildung 1 schematisch dargestellt. Innerhalb der ersten Woche

nach Einstallung wurden die Schweine an die neue Umgebung adaptiert. Danach erfolgte die

Infektion mit entsprechenden Salmonellen (Tabelle 2) mittels Magensonde (Fa. Rüsch,

Kernen, Deutschland; Abbildung 2). Bei acht Tieren erfolgte die Infektion mit einem

Wildtyp-Stamm von S. Typhimurium DT104, der aus dem Schwein isoliert und bereits in

einem vorangegangenen Infektionsversuch eingesetzt worden war (MARG et al. 2001;

ROESLER et al. 2004; ARNOLD et al. 2004). Weitere neun Tiere wurden mit der

invC::aphT-Deletionsmutante infiziert, während bei den verbleibenden acht Tieren die

Deletionsmutante sseD::aphT Verwendung fand (Tabelle 2). Die in den Infektionsversuchen

eingesetzten Deletionsmutanten wurden von der Arbeitsgruppe um Herrn Professor Wolf-

Dietrich Hardt (Institut für Mikrobiologie der Eidgenössischen Technischen Hochschule

Zurich), aus dem S. Typhimurium DT104-Wildstamm konstruiert und freundlicherweise zur

Verfügung gestellt.


34

Abbildung 1. Schematische Darstellung des Versuchablaufes zur Pathogenität von Salmonella Typhimurium DT104 Wildtyp und Salmonella Typhimurium Deletionsmutanten (sseD::aphT & invC::aphT) in persistent infizierten Schweinen.

Schweine n = 25

≈ 1 Woche Adaptionszeit

Orale Infektion per Magenschlundsonde

1 x 1011 KBE

S. Typhimurium DT104 Wildtyp

n = 8

Mutante II invC::aphT

n = 9

Mutante I sseD::aphT

n = 8

Beobachtungszeitraum 20 Tage

Täglich: Klinische Untersuchung

Tag 1. bis 7. p.i. Kotprobenentnahme zur Bestätigung der Persistenz

2 x pro Woche: Gewichtskontrolle,

Blutentnahme, Kotprobenentnahme zur

Bestätigung der Persistenz

Tötung am 21. Tag nach

Infektion

Organentnahmen

Aufarbeitung der Organproben für weiterführende Untersuchungen


35

Tabelle 2. Übersicht über die in den Infektionsversuchen eingesetzten Bakterienstämme

Bezeichnung Herkunft Spezies/Charakteristika

Wildtyp S. Typhimurium

Stammsammlung des Instituts für Bakteriologie und Mykologie der Veterinärmedizinischen Fakultät

der Universität Leipzig

S. Typhimurium DT104

(Isolat vom Schwein) (SCHOLZ et al. 2001;

MARG et al. 2001; ARNOLD et al. 2004)

SPI-2 Mutante M809

(Mutante I)

Institut für Mikrobiologie der Eidgenössischen Technischen

Hochschule Zurich Prof. Wolf-Dietrich Hardt

Die Mutante ist durch P22-

Transduktion von sseD::aphT aus dem Stamm MvP101

(MEDINA et al. 1999) in den DT104-Stamm erzeugt

worden.

SPI-1 Mutante M810

(Mutante II)

Institut für Mikrobiologie der Eidgenössischen Technischen

Hochschule Zurich Prof. Wolf-Dietrich Hardt

Die Mutante ist durch P22-

Transduktion der invC::aphT (Km-resistenz)-Kassette von SB566 (EICHELBERG et al. 1994) in den Wildtyp DT104-

Stamm konstruiert worden .

Der Infektion schloß sich eine Beobachtungsphase von 20 Tagen an. Während dieser Zeit

wurden die Tiere täglich klinisch untersucht, zweimal pro Woche gewogen (digitale Waage

der Fa. Soehnle, Backnang, Deutschland) und dabei Blut für die hämatologische

Untersuchung gewonnen. Der kulturelle Nachweis von Salmonellen erfolgte im Kot. Dazu

wurde Rektalkot täglich in der ersten Woche post inocculationem und dann an den

Wiegeterminen entnommen. Somit sollten die persistent infizierten Tiere identifiziert und die

Ausscheidung von Salmonellen über den Versuchszeitraum, auch in Abwesenheit klinischer

Symptome, festgehalten werden. Am 21. Tag nach der Infektion wurden die Tiere unter

(Ketamin-Xylazin)-Anästhesie durch Bolzenschuss und Blutentzug getötet und die in Tabelle

3 gelisteten Organe bzw. Organteile für den Nachweis von Salmonellen gewonnen.


36

Tabelle 3. Gewebeproben zur Untersuchung auf Salmonella Typhimurium DT104-Wildtyp und auf die S. Typhimurium DT104 Deletionsmutanten invC::aphT und sseD::aphT aus persistent infizierten Schweinen

Organ- und Gewebeproben Abkürzung

Tonsille To

Mandibularlympknoten MaLy

Lunge (Mittellappen) Lu

Lungenlymphknoten LuLy

Leber Le

Milz Mi

Jejunum (kaudaler Abschnitt) Je

Ileum (distaler Abschnitt) Il

Colon + Inhalt Co

Caecum + Inhalt Ca

Jejunal-Lymphknoten Jely

Ileocaecal-Lymphknoten Icly

Colon-Lymphknoten Coly

Muskel Mu

Gallenflüssigkeit Gf

3.2.1 Orale Infektion der Tiere per Schlundsonde

Die Schweine wurden über eine Magensonde (Fa. Rüsch, Kernen, Deutschland; Abbildung 2)

mit den entsprechenden Salmonellen (Tabelle 2) infiziert (MARG et al. 2001; ROESLER et

al. 2004; ARNOLD et al. 2004). Von jedem der genutzten Salmonellenstämme wurden

insgesamt 1 x 1011 KBE in 50 ml PBS aufgenommen und je Tier verabreicht. Die Tiere

wurden vor der Verabreichung des jeweiligen Salmonella Stammes mit 0,4 mg/kg Azaperon

(Stresnil) sediert.


37

Abbildung 2. Infektion von Schweinen mit Salmonella-Symposium mittels Magenschlundsonde (MARG et al. 2001; ROESLER et al. 2004; ARNOLD et al. 2004).

Zur Herstellung der Infektionsdosen wurden Übernachtkulturen in einem 50 ml-Kolben mit

Luria-Bertani-Boullion (LB)-Bouillon im Schüttelinkubator aerob bei 37 °C angesetzt. Am

darauffolgenden Tag wurden davon jeweils 2,5 ml entnommen. Damit wurden 12 ml frische

LB-Boullion, die sich in einem 300 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben befanden, überimpft.

Insgesamt wurden 16 dieser Kolben angesetzt, im Schüttelinkubator bis zur mittleren

logarithmischen Phase inkubiert und anschließend bei 2000 x g für 10 min zentrifugiert. Der

Überstand wurde verworfen und das erhaltene Pellet einmal in PBS (Phosphat Buffered

Saline; pH 7,2) resuspendiert und nochmals zentrifugiert.

Vor Bestimmung der Gesamtkeimzahl pro Milliliter Infektionskultur wurde jeder Ansatz

1:100 mit PBS verdünnt. Die Bestimmung erfolgte in einer Thoma-Zählkammer

(Kammervolumen 0,00025 mm3). Diese verfügt über 16 Großquadrate, die jeweils 16

Kleinquadrate aufweisen. In dieser Studie wurden insgesamt fünf Großquadrate gewählt und

in diesen jeweils vier Kleinquadrate ausgezählt. Aus den Ergebnissen der Auszählung der

fünf Großquadrate wurde der Mittelwert ermittelt und mit 4 x 106 multipliziert, um die

Gesamtkeimzahl in der Verdünnung zu erhalten. Durch erneute Multiplikation mit 100 wurde

die Gesamtkeimzahl in der Ausgangskultur bestimmt und diese dann mit PBS verdünnt, um


38

die gewünschte Keimzahl von 1011 GKZ/ml für die anschließende Infektion der Schweine zu

erreichen (MARG et al. 2001; ROESLER et al. 2004; ARNOLD et al. 2004).

3.2.2 Klinische Untersuchung der Versuchstiere

Die Tiere wurden während des 20-tägigen Beobachtungszeitraums täglich einer klinischen

Untersuchung unterzogen (Abbildung 1). Dabei wurden Allgemeinbefinden, Atmung, Husten,

Futteraufnahme, Erbrechen sowie Diarrhö beurteilt und mittels eines Scores eingeteilt

(Tabelle 4). Die jeweils physiologischen Befunde erhielten den Wert 0, während

Abweichungen davon mit Werten zwischen 1 (geringgradig abweichend) bis 3 (hochgradig

abweichend) beurteilt wurden. Der Gesamtscore ergab sich aus der Addition der ermittelten

Werte.

Tabelle 4. Score für die Beurteilung der Befunde der klinischen Examination im Rahmen der Untersuchung zur Pathogenität von Salmonella Typhimurium DT104 Wildtyp und Salmonella Typhimurium Deletionsmutanten (sseD::aphT & invC::aphT) in persistent infizierten Schweinen.

Score Parameter 0 1 2 3 Allgemein-befinden lebhaft und

munter, stehfähig

aufmerksam und stehfähig, aber weniger lebhaft

als „0“

deutlich ruhigeres Verhalten und verminderte

Aufmerksamkeit, vermehrtes Liegen

apatisch, deutlich verminderte

Aufmerksamkeit und vorwiegend

liegend Atmung gleichmäßig,

≤ 18 Atemzüge/min

gleichmäßig, ≥ 18

Atemzüge/min

ungleichmäßig oder gleichmäßig,

26 - 35 Atemzüge/min

hechelnde Maulatmung,

>35 Atemzüge/min

Husten Ohne ≤ 2 mal / 30 min 3 bis 5 mal / 30 min >5 mal / 30 min

Appetit unvermindert, ausgiebige

Zeit der Futteraufnahme

verkürzte Zeit der Futteraufnahme

deutlich verkürzte Zeit der

Futteraufnahme

keine Futteraufnahme

Erbrechen

Ohne

einmaliges Erbrechen frisch aufgenommenen

Futters

gehäuftes Auftreten von Erbrechen

immer wiederkehrendes Erbrechen von Magensaft und

Galle Durchfall Ohne breiiger Kot dünnflüssiger Kot wässriger,

profuser Kot


39

3.2.3 Blutentnahme und hämatologische Untersuchung

Die Entnahme von Blut erfolgte aus der V. cava cranialis. Hierfür wurde das Entnahmesystem

Vacuette® als Probegefäße und Holdex® (Fa. Greiner bio-one, Essen) als Adapter für die

Einmalkanülen (Ø 0,90 x 40 mm, Sterican® B. Braun Melsungen AG, Melsungen)

verwendet. Das Entnahmesystem nutzt EDTA als Antikoagulanz. Das Blut wurde noch am

selben Tag gekühlt an das Labor Fa. Invitro (Wien, Österreich) geschickt. Am

darauffolgenden Tag erfolgte dort die Bestimmung des weißen Blutbildes.

3.2.4 Untersuchung auf Salmonellen

3.2.4.1 Kulturelle Diagnostik

Zur Untersuchung auf Salmonella wurden Medien verwendet, wie sie vor der Modifikation

im Jahre 2008 laut ISO 6579 vorgeschrieben waren. Dabei handelte es sich um gepufferte

Pepton-Bouillon (Fa. Merck, Darmstadt) zur nicht selektiven Voranreicherung und

Rappaport-Vassiliadis (RV)-Medium (Fa. Merck) zur Selektivanreicherung.

Als Selektivnährboden kam Xylose-Lysine-Desoxycholat (XLD)-Agarmedium (Fa. Merck),

XLD-Agarmedium mit 100 µl/ml Kanamycinsulfat (Fa. AppliChem, Darmstadt) und

Brilliantgrün-Phenolrot-Saccharose (BPLS)-Agarmedium (Fa. Merck) zur Anwendung.

Die bakteriologische Untersuchung der Proben erfolgte im Labor in Anlehnung an die ISO

6579. Steril entnommenes Organmaterial wurde in Spiritus getaucht, äußerlich über einem

Bunsenbrenner abgeflammt und jeweils 5 g in 45 ml Pepton-Bouillon eingewogen. Das

Gewebe-Pepton-Bouillon-Gemisch wurde in einen Stomacherbeutel (Fa. Seward, London,

UK) gegeben und anschließend bei höchster Stufe im Stomacher 400 (Fa. Seward) für 1 min

homogenisiert. Die Stomacherbeutel wurden entnommen und anschließend bei 37 °C für 24

Stunden aerob bebrütet. Für die Untersuchungen des Kots wurde jeweils 1 g in 9 ml Pepton-

Boullion gelöst, durch einen Exzenterschüttler gemischt und wie oben für die

Stomacherbeutel beschrieben inkubiert. Aus allen Pepton-Bouillon-Voranreicherungen

wurden zweimal 100 µl entnommen und in jeweils ein neues Reagenzröhrchen überführt, das


40

9,9 ml Rappaport-Vassiliadis (RV)–Medium enthielt. Die Reagenzröhrchen wurden für 24

Stunden bei 42 °C inkubiert. Die Inhalte der zwei Reagenzröhrchen einer Voranreicherung

wurden anschließend parallel jeweils auf XLD-Agarmedium und auf BPLS-Agarmedium mit

Hilfe eines Glasstabes ausgestrichen und bei 37 °C für 24 Stunden aerob inkubiert.

Anschließend wurden die Agarmedien ausgewertet und verdächtig erscheinende Kolonien

einer Objektträgerschnellagglutination unterzogen (es wurden spezifische Agglutinationsseren

der Firma Sifin, Berlin, verwendet). XLD-Agarmedium (mit 100 µl/ml Kanamycinsulfat; Fa.

AppliChem, Darmstadt) wurde genutzt, um Salmonella-Mutanten vom Wildstamm zu

unterscheiden.

Eine Quantifizierung von Salmonellen erfolgte nur bei den Organproben. Dazu wurde dem

Stomacherbeutel Homogenisat nach der 1-minütigen Behandlung im Stomacher entnommen

und logarithmische Verdünnungsreihen (bis 10-9) hergestellt. Von der erhaltenen Suspension

wurden 25 µl im Dreifachansatz auf XLD-Agarmedium ausgetropft. Weitere 25 µl wurden im

Mikrotitiersystem in 10er-Schritten verdünnt und ebenfalls auf XLD-Agarmedium

ausgetropft. Die XLD-Agarmedien wurden für 24 Stunden aerob bebrütet und anschließend

ausgezählt, um die Keimzahlen zu bestimmen.

3.2.4.2 PCR

Alle durch Objektträgerschnellagglutination als Salmonella-positiv bewerteten Kolonien aus

Gewebe- und Kotproben wurden mittels PCR untersucht, um die beiden Mutanten von

einander und vom Wildstamm zu unterscheiden.

Vor der DNA-Extraktion wurden die Kolonien auf Nähragarmedium (Fa. Merck)

ausgestrichen und für 24 Stunden bei 37 °C aerob inkubiert, vorsichtig mehrere Kolonien mit

einem Glasstab abgehoben, in 500 µl Lysis-Puffer mit Proteinase K gesetzt und mit einem

Exzenterschüttler vermischt. Danach erfolgte eine einstündige Inkubation bei 56 °C.

Anschließend wurden die Proben für 10 Min in ein 94 °C heißes Wasserbad platziert, um die

Proteinase zu inaktivieren. Als letzter Schritt im Rahmen der Extraktion erfolgte eine

Zentrifugation bei 13.000 rpm (Biofuge Fa Heraeus Instruments, Osterode) für 5 min. Der

Überstand wurde gewonnen und die darin enthaltende DNA als Templete für die PCR

verwendet. Die PCR erfolgte wie bei BRUMME (2006) und RÖSLER (2007) beschrieben.


41

Der PCR-Ansatz betrug 50 µl. Fünf µl des Überstandes wurden zu 43 µl Readymix (Fa.

Peqlab, Biotechnologie GmbH, Erlangen) gegeben und durch 1 µl des jeweiligen Forward-

und Reverse-Primers (1:10) ergänzt. Als Primer fanden die in Tabelle 5 dokumentierten

Oligonukleotide (Fa. VBC-Genomics GmbH Wien, Österreich) Verwendung. Dabei handelte

es sich um Primer, die entweder an die invC- oder sseD-Region des Genoms von

S. Typhimurium binden. Beide Primerpaare binden sowohl beim Wildstamm als auch bei

beiden in dieser Arbeit verwendeten Mutanten. Allerdings unterscheiden sich die PCR-

Produkte in ihrer Größe. Werden inv-C Primer verwendet, ist das PCR-Produkt bei der

invC::aphT-Mutante größer als das des Wildtyps und der sseD::aphT-Mutante; jedoch sind

die PCR-Produkte von Wildtyp und sseD::aphT-Mutante dann gleichgroß (2.5 kb versus

jeweils 1.5 kb). Ähnlich verhält es sich, wenn die sseD::aphT-Mutante nachzuweisen ist und

entsprechende Primer genutzt werden. Dann ist das PCR-Produkt der sseD::aphT-Mutante

größer als das des Wildtyps und der invC::aphT-Mutante, die beide gleichgroß sind (1.8 kb

versus jeweils 1.0 kb). Jede Probe wurde im Doppelansatz mit beiden Primerpaaren

untersucht. Das sollte eine klare Differenzierung des Salmonellentyps ermöglichen und dabei

helfen, Kontaminationen auszuschließen. Die PCR wurde wie folgt durchgeführt: Nach einer

initialen Denaturierung bei 95 °C und finalen Elongation bei 72 °C für jeweils 5 min wurden

insgesamt 30 Zyklen durchgeführt. Sie bestanden jeweils aus einer Denaturierung bei 94 °C

für 40 sec, einem Annealing bei 60 °C für 30 sec und einer Elongation bei 72 °C für 70 sec.

Als Thermocycler diente ein Gerät vom Typ „Tpersonal“ (Biometra-biomedizinische

Analytik GmbH, Göttingen).

Die PCR-Produkte wurden anschließend durch Gelelektrophorese aufgetrennt. Dazu wurden

zweiprozentige (v/v) Agarosegele (Agarose der Firma Fa. Peqlab, Biotechnologie GmbH

Erlangen; gelöst in TRIS-Borat-EDTA-(TBE)-Puffer), eine horizontale

Gelelektrophoresekammer (Fa. Biorad, München) und TBE als Laufpuffer verwendet. In jede

Geltasche wurden 10 µl des Produkts sowie eine Positiv- und eine Negativkontrolle

aufgetragen. Zur Größenbestimmung wurden 4 µl eines Längenmarkers (peqGOLD Leiter-

Mix, Fa. Peqlab, Biotechnologie GmbH, Erlangen) mitgeführt. Die Auftrennung der Produkte

erfolgte bei 140 Volt über 30 min. Zur Anfärbung der Produkte wurde das Gel 20 min in

Ethidiumbromid (Fa. Amresco, Solon, Ohio, USA) inkubiert und kurz in Aquabidest

gewaschen. Die Detektion und die fotographische Dokumentation der PCR-Produkte erfolgte

mit dem Geldokumentationssystem Gel DocTM 2000 (Fa. Biorad, München) unter UV-Licht

der Wellenlänge von 254 nm.


42

Tabelle 5. Primersequenzen zum Nachweis des Wildtyps von S. Typhimurium DT104 und dessen invC::aphT- und sseD::aphT-Deletionsmutanten in Faeces und Gewebeproben von experimentell infizierten Schweinen S. Typhimurium-

Stamm Primer* Oligonukleotid-Sequenz

invC::aphT-Mutante II

invC-f invC-r

5´-GCC GGC GAA CAA TAG ACT GCT T-3´ 5´-TCT CAT CTG CCT TGA ATG GGT TTT-3´

sseD::aphT-Mutante I

sseD-f sseD-r

5´-CAA CCG AGG GCG CCA GTC AGA-3´ 5´-TAT CCC GCG TAA AAG TCC CAG T-3´

*Fa. VBC-Genomics GmbH Wien, Österreich; (BRUMME 2006; ROESLER 2007)

3.3 Statistische Auswertung

Die statistische Auswertung wurde mit dem Statistikprogramm SPSS® Version 18 (Software

GmbH München) durchgeführt. Die Daten wurden mit dem Shapiro-Wilks-Test auf

Normalverteilung überprüft. Die Scores für die klinischen Parameter sowie für die Werte der

quantitativen bakteriologischen Untersuchungen waren nicht normalverteilt. Für die Scores

wurden Mittelwert und Standardabweichung angegeben. Die Daten wurden mit Hilfe der

ANOVA mit dem Bonferroni-Test ausgewertet. Waren die Varianzen inhomogen, wurde mit

dem Dunett-T3-Test gearbeitet. Veränderungen im Beobachtungszeitraum wurden mit der

Varianzanalyse für Messwiederholung, dem gepaarten t-Test und einer Bonferroni-

Adjustierung durchgeführt. Bei Unterschieden in den Ergebnissen wurde anschließend mit

dem Levene-Test auf Homogenität der Varianzen überprüft.

Bei den nicht normalverteilten Scores für die klinischen Parameter sowie für die Werte der

quantitativen bakteriologischen Untersuchungen erfolgte die statistische Auswertung mit dem

Kruskal-Wallis-Test und dem U-Test nach Mann und Whitney. Häufigkeitsvergleiche

qualitativer Merkmale wurden mit dem mit Chi²- und dem Exaktem Test nach Fisher

überprüft. Unterschiede zwischen Ergebnissen mit P≤0,05 wurden als signifikant angesehen.

Ergebnisse

43

4 ERGEBNISSE

4.1 Ergebnisse der klinischen Untersuchung

Alle acht mit Salmonella Typhimurium DT104-Wildtyp infizierten Schweine wurden krank,

d.h. sie wiesen bei einem oder mehren der beurteilten Parameter von der Norm abweichende

Befunde auf. Generell ist festzustellen, dass Tiere, die mit einer der Mutanten infiziert

wurden, wesentlich seltener krank und selten schwerwiegend krank waren.

Das Allgemeinbefinden war unabhängig vom Infektionsstamm generell nur geringgradig

gestört (drei Tiere in der mit dem Wildstamm infizierten Gruppe und ein Tier in der Gruppe

der mit Mutante I infizierten Schweine; kein Tier in der Gruppe der mit Mutante II infizierten

Tiere; Abbildung 3).

Abbildung 3. Allgemeinbefinden der mit S. Typhimurium DT104 infizierten Schweine (durchschnittlicher Score; 0 – 3 für nicht bis hochgradig gestört). Tag 0 = Tag der Infektion mit dem Wildtyp (WT) DT104 , der Deletionsmutante invC::aphT bzw. der Deletionsmutante sseD::aphT. * = Signifikanter Unterschied zwischen Tieren, die mit dem Wildtyp bzw. der invC::aphT-Mutante infiziert wurden (P≤0,05).

Ergebnisse

44

Alle der mit dem Wildstamm infizierten Tiere entwickelten Durchfall (Abbildung 4). Am

ersten Tag nach der Infektion hatten 37,5 % (n = 3) der Schweine dünnflüssigen bis wässrigen

Durchfall, 87,5 % (n = 7) am zweiten und alle 8 Schweine am dritten Tag. Dabei variierte die

Dauer des Durchfalls. Vier (50 %) der Schweine hatten über sieben Tage durchgehend

Durchfall. Ein (12,5 %) Schwein litt 14 Tage unter profusem Durchfall (Abbildung 4). Die

verbleibenden drei wiesen nur 1 bis 2 Tage mittelgradigen Durchfall auf.

Eine Diarrhö trat wesentlich seltener auf, wenn Tiere mit Mutanten infiziert wurden

(Abbildung 4). In der Gruppe der mit der invC::aphT-Mutante infizierten Schweine zeigten

nur drei der Tiere eine geringgradig verminderte Kotkonsistenz (Score1), die auch nur bis 3

Tage anhielt. In der Gruppe der mit sseD::aphT-Mutante infizierten Tiere war nur ein

Schwein für 1 Tag an Diarrhö erkrankt. Dessen Kot war von breiiger Konsistenz.

Abbildung 4. Durchfall der mit S. Typhimurium DT104 infizierten Schweine (durchschnittlicher Score; 0 – 3 für kein bis wässriger/profuser Kot). Tag 0 = Tag der Infektion mit dem Wildtyp (WT) DT104, der Deletionsmutante invC::aphT bzw. der Deletionsmutante sseD::aphT. * = Signifikante Unterschiede (P≤0,05) zwischen Tieren der Wildtypgruppe und der beiden Mutantengruppen.

Ergebnisse

45

In allen drei Gruppen wurden Tiere beobachtet, die eine Körpertemperatur ≥ 40 °C aufwiesen

(Abbildung 5). Dies betraf drei (37,5 %) der mit dem Wildstamm infizierten und fünf

(55,6 %) der mit der invC::aphT-Mutante infizierten Tiere, während 4 der Tiere, die mit

Mutante sseD::aphT infiziert wurden, eine derartige Körpertemperatur entwickelten. Bei

Tieren, die mit dem Wildstamm oder der Mutante sseD::aphT infiziert wurden, stieg die

Körpertemperatur ab Tag 2 post infectionem, bei Tieren, die mit der invC::aphT-Mutante

infiziert wurden einen Tag später. Während sich die Körpertemperatur Wildstamm-infizierter

Tiere sukzessive bis Tag 5 auf durchschnittlich 39 °C normalisierte, wiesen einzelne Tiere,

die mit Mutanten infiziert wurden, intermittierend auch zu späteren Zeitpunkten (z.B. Tage 8,

12 oder 14) erhöhte Körpertemperaturen bis zu 40,5 °C auf. Nicht immer traten zeitgleich

zum Temperaturanstieg andere klinische Symptome wie verminderte Fresslust oder Diarrhö

auf. Bei 3 Tieren der invC::aphT-Mutantengruppe und 4 Tieren der sseD::aphT-

Mutantengruppe war lediglich erhöhte Körpertemperatur zu beobachten.

Abbildung 5. Innere Körpertemperatur (Mittelwert ± s) der mit S. Typhimurium DT104 infizierten Schweine. Tag.0 = Tag der Infektion mit dem Wildtyp (WT) DT104, der Deletionsmutante invC::aphT bzw. der Deletionsmutante sseD::aphT.

Ergebnisse

46

Ein Schwein, das mit dem Wildstamm infiziert wurde, fraß weniger als vor der Infektion. Die

Verminderung der Futteraufnahme begann am Tag 2 und hielt 2 Tage an. Erbrechen wurde

bei einem Schwein zwischen den Tagen 2 und 3 beobachtet. Es war ein gehäuftes Erbrechen

(Score 2) in diesem Zeitraum zu beobachten. Tiere der zwei Mutanten-Infektionsgruppen

zeigten weder eine Verminderung der Nahrungsaufnahme noch Erbrechen.

Bei allen drei Infektionsgruppen war die Atmung während des Beobachtungszeitraums

unbeeinträchtigt.

Detailierte Daten der klinischen Untersuchung sind den Tabellen 9 und 10 im Anhang zu

entnehmen.

Aus technischen Gründen konnten die Schweine der Gruppe „sseD::aphT“ am dritten Tag

und die der Gruppen „sseD::aphT“ sowie „invC::aphT“ am 21 Tag nach der Infektion nicht

gewogen werden, so dass entsprechende Körpergewichte fehlen. So wird das Körpergewicht

vom Tag 17 nach der Infektion als Endgewicht genutzt, um eine Vergleichbarkeit zu

gewährleisten (Tabelle 6).

Das durchschnittliche Körpergewicht der Tiere der drei Versuchsgruppen unterschied sich am

Tag der Infektion nicht signifikant. Alle Tiere nahmen bis zum Tag 16 post infectionem zu.

Die Gewichtzunahme variierte jedoch im Vergleich zwischen den Gruppen. Sie war bei mit

der Mutante invC::aphT infizierten Tieren größer als bei Tieren, die mit dem Wildstamm

infiziert wurden, und zwar durchschnittlich 9 kg versus 6 kg; (P≤0,05). sseD::aphT infizierte

Tiere nahmen ca. 7 kg zu (nicht signifikant im Vergleich aller Gruppen).

Ergebnisse

47

Tabelle 6. Körpergewichte (Mittelwert ± s) der mit dem Wildtyp DT 104 und mit den Deletionsmutanten invC::aphT bzw. sseD::aphT infizierten Schweine in kg

Tag p.i. WT DT 104 n = 8

DM-invC::aphT n = 9

DM-sseD::aphT n = 8

0 8,9 ± 1,3d 10,3 ± 1,2d 9,9 ± 1,1d

3 9,0 ± 1,2B,d 11,6 ± 1,5A,c,d nicht verfügbar1 7 9,6 ± 1,4B,d 13,6 ± 1,8A,b,c 10,9 ± 1,0B,c,d

10 11,2 ± 1,5B,c,d 14,7 ± 1,5A,b 12,5 ± 1,9B,b,c 14 13,0 ± 1,9B,b,c 17,7 ± 1,8A,a 14,0 ± 2,6B,b 17 14,8 ± 2,1B,a,b 19,2 ± 2,6A,a 16,5 ± 1,8A,B,a 21 16,8 ± 2,5a nicht verfügbar1 nicht verfügbar1

1 Tiere konnten aus technischen Gründen nicht gewogen werden. p.i. = post infectionem. WT DT104 = Wildtyp, DM = Deletionsmutante

(A, B) Werte unterscheiden sich signifikant in Zeilen (P≤0,05). (a–d) Werte unterscheiden sich signifikant in Spalten (P≤0,05).

4.2 Hämatologische Befunde

Tiere aller drei Gruppen wiesen ein weißes Blutbild auf, welches sich im Anschluss an die

Infektion veränderte. Dabei unterschieden sich die Gruppen in der Qualität der

Veränderungen.

Nach Infektion mit dem Wildtyp stieg bei allen Schweinen die Gesamtleukozytenzahl bis zum

Tag 10, um dann langsam bis zum Tag 21 wieder abzufallen, ohne das die Ausgangswerte

erreicht werden konnten (P≤0,05; Abbildung 6). Auch bei Tieren, die mit der Mutante

sseD::aphT infiziert wurden, kam es zu einem Anstieg der Gesamtleukozytenzahl. Dieser war

allerdings kurz und nur auf den Tag 3 post infectionem beschränkt. Die

Gesamtleukozytenzahl der Schweine, welche die Mutante invC::aphT erhielten, fluktuierte

und wies am Tag 14 nach der Infektion maximale Werte auf, ohne das die Unterschiede

statistisch signifikant waren.

Die Gesamtleukozytenzahl ist in Abbildung 8 zusätzlich grafisch als Boxplots dargestellt, um

den Vergleich zwischen den Gruppen an den jeweiligen Beprobungstagen zu erleichtern. Die

Gruppen unterschieden sich an einem oder mehreren der Beobachtungstage signifikant

Ergebnisse

48

voneinander (P≤0,05), ohne das ein klares, dem Infektionsstamm zuzuordnendes Muster zu

erkennen war.

Abbildung 6. Gesamtleukozytenzahl (Mittelwert ± s) der infizierten Schweine. Tag 0 = Tag der Infektion mit dem Wildtyp (WT) DT104, der Deletionsmutante invC::aphT bzw. der Deletionsmutante sseD::aphT. (a–c) Werte unterscheiden sich signifikant zwischen den Tagen für eine und dieselbe Infektionsgruppe (P≤0,05).

Abbildung 7. Gesamtleukozytenzahl (Mittelwert ± s) der infizierten Schweine. Tag 0 = Tag der Infektion mit dem Wildtyp (WT) DT104, der Deletionsmutante bzw. der Deletionsmutante sseD::aphT, (A–C) Werte unterscheiden sich signifikant zwischen den Infektionsgruppen für ein und denselben Tag (P≤0,05).

Ergebnisse

49

Ähnlich zu Veränderungen in der Gesamtleukozytenzahl veränderten sich einzelne

Zellpopulationen des Differentialblutbildes. Nach der Infektion sank der prozentuale Anteil

der Lymphozyten bei den Tieren, die mit dem Wildtyp bzw. der Mutante invC::aphT infiziert

wurden (Abbildung 8). Während sich invC::aphT infizierte Tiere davon schon am Tag 7

erholt hatten bzw. höhere Werte als zum Zeitpunkt vor der Infektion aufwiesen, fiel der Anteil

der Lymphozyten der mit dem Wildstamm infizierten Tiere nochmals (wenn auch nicht

signifikant), um auf diesem Level bis zum Ende des Beobachtungszeitraums zu verbleiben.

Im Vergleich dazu blieb der prozentuale Anteil der Lymphozyten bei Tieren, die mit der

Mutante sseD::aphT infiziert wurden, relativ konstant (Abbildung 8).

Abbildung 8. Prozentualer Anteil an Lymphozyten (Mittelwert ± s) bei infizierten Schweinen. Tag 0 = Tag der Infektion mit dem Wildtyp (WT) DT104, der Deletionsmutante invC::aphT bzw. der Deletionsmutante sseD::aphT. (a–c) Werte unterscheiden sich signifikant zwischen den Tagen für eine und dieselbe Infektionsgruppe (P≤0,05).

Zwischen den drei Gruppen gab es zum Teil erhebliche Unterschiede (Abbildung 9). So

wiesen Tiere der mit dem Wildstamm infizierten Gruppe am Tag 0 (d.h. vor der Infektion)

mehr Lymphozyten als Tiere auf, die Mutante sseD::aphT erhielten, während Letztere an den

Tagen 17 und 21 post infectionem den höchsten Anteil hatten (P≤0,05). Tiere, die Mutante

invC::aphT erhielten, dominierten dahingehend am Tag 7 nach der Infektion (P≤0,05).

Ergebnisse

50

Abbildung 9. Prozentualer Anteil an Lymphozyten (Mittelwert ± s) bei infizierten Schweinen. Tag 0 = Tag der Infektion mit dem Wildtyp (WT) DT104, der Deletionsmutante invC::aphT bzw. der Deletionsmutante sseD::aphT, (A,B) Werte unterscheiden sich signifikant zwischen den Infektionsgruppen für ein und denselben Tag (P≤0,05).

Während die Tiere, die den Wildtyp erhielten, nach der Infektion mit einem deutlichen

Anstieg des prozentualen Anteils mit neutrophilen Granulozyten (nachfolgend „Neutrophile“

genannt) reagierten, blieb eine derartige Reaktion bei mit Mutanten infizierten Tieren

weitestgehend aus (ohne Abbildung).

Der Anstieg des Anteils neutrophiler Granulozyten mit dem Wildstamm infizierter Tiere war

auf eine Zunahme des Anteils sowohl stab- wie auch segmentkernige Granulozyten

zurückzuführen (Abbildungen 10 und 11). Bei Tieren, welche die invC::aphT-Mutante

erhielten, blieb dieser Anteil jeweils relativ konstant. Im Vergleich dazu sank der Anteil an

stab- wie auch segmentkernige Granulozyten sseD::aphT-Mutante infizierter Tiere sukzessive

während des Beobachtungszeitraums (P≤0,05).

Ergebnisse

51

Abbildung 10. Prozentualer Anteil neutrophiler stabkerniger Granulozyten (Mittelwert ± s) der infizierten Schweine. Tag 0 = Tag der Infektion mit dem Wildtyp (WT) DT104, der Deletionsmutante invC::aphT bzw. der Deletionsmutante sseD::aphT, (a,b) Werte unterscheiden sich signifikant zwischen den Tagen für eine und dieselbe Infektionsgruppe (P≤0,05).

Abbildung 11. Prozentualer Anteil neutrophiler segmentkerniger Granulozyten (Mittelwert ± s) der infizierten Schweine. Tag 0 = Tag der Infektion mit dem Wildtyp (WT) DT104, der Deletionsmutante invC::aphT bzw. der Deletionsmutante sseD::aphT, (a,b) Werte unterscheiden sich signifikant zwischen den Tagen für eine und dieselbe Infektionsgruppe (P≤0,05).

Ergebnisse

52

Im Gruppenvergleich für die jeweiligen Untersuchungstage fluktuieren die segmentkernigen

wesentlich stärker als die stabkernigen Neutrophilen. Die Stabkernigen unterschieden sich

lediglich am Tag 3 nach der Infektion; mit dem Wildstamm infizierte Tiere wiesen einen

höheren Prozentsatz dieser Zellen auf als Tiere, die mit der Mutante sseD::aphT infiziert

wurden (P≤0,05; Abbildung 12). Die Anzahl Segmentkerniger war mal bei der einen, mal bei

der anderen Gruppe höher bzw. niedriger (P≤0,05; Abbildung 13). Ein klares Muster war

nicht zu erkennen.

Abbildung 12. Prozentualer Anteil neutrophiler stabkerniger Granulozyten (Mittelwert ± s) der infizierten Schweine. Tag 0 = Tag der Infektion mit dem Wildtyp (WT) DT104, der Deletionsmutante invC::aphT bzw. der Deletionsmutante sseD::aphT, (A,B) Werte unterscheiden sich signifikant zwischen zwischen den Infektionsgruppen für ein und denselben Tag (P≤0,05).

Ergebnisse

53

Abbildung 13. Prozentualer Anteil neutrophiler segmentkerniger Granulozyten (Mittelwert ± s) der infizierten Schweine. Tag 0 = Tag der Infektion mit dem Wildtyp (WT) DT104, der Deletionsmutante invC::aphT bzw. der Deletionsmutante sseD::aphT, (A,B) Werte unterscheiden sich signifikant zwischen zwischen den Infektionsgruppen für ein und denselben Tag (P≤0,05).

Die relative Anzahl der eosinophilen Granulozyten zeigte bei allen Gruppen geringe

Schwankungen. Die Gruppe der mit dem Wildstamm infizierten Tiere zeigte dabei die

stärksten Fluktuationen, die scheinbar einer gewissen Regelmäßigkeit unterlagen (niedrig-

hoch-niedrig; Abbildung 14). Unterschiede zwischen den Gruppen gab es an den Tagen 7, 14

und 17 nach der Infektion. Mit dem Wildstamm infizierte Tiere wiesen an diesen Tagen

relativ mehr eosinophile Granulozyten als Tiere der Vergleichsgruppen auf (Abbildung 15).

Ergebnisse

54

Abbildung 14. Prozentualer Anteil eosinophiler Granulozyten (Mittelwert ± s) der infizierten Schweine. Tag 0 = Tag der Infektion mit dem Wildtyp (WT) DT104, der Deletionsmutante invC::aphT bzw. der Deletionsmutante sseD::aphT. (a,b) Werte unterscheiden sich zwischen den Tagen für eine und dieselbe Infektionsgruppe (P≤0,05).

Abbildung 15. Prozentualer Anteil eosinophiler Granulozyten (Mittelwert ± s) der infizierten Schweine. Tag 0 = Tag der Infektion mit dem Wildtyp (WT) DT104, der Deletionsmutante invC::aphT bzw. der Deletionsmutante sseD::aphT, (A,B) Werte unterscheiden sich zwischen den Infektionsgruppen für ein und denselben Tag (P≤0,05).

Ergebnisse

55

Ähnlich wie die eosinophilen Granoluzyten verhielt sich auch der relative Gehalt an

Monozyten relativ stabil (konstant in der Gruppe der mit dem Wildtyp infizierten Tiere;

geringe Veränderungen in beiden Mutantengruppen; Abbildung 16). Im Vergleich der

Gruppen waren Unterschiede an den Tagen 10, 17 und 21 deutlich; auch hier hatten Wildtyp-

infizierte Tiere relativ mehr Monozyten (Abbildung 17).

Abbildung 16. Prozentualer Anteil an Monozyten (Mittelwert ± s) bei infizierten Schweinen. Tag 0 = Tag der Infektion mit dem Wildtyp (WT) DT104, der Deletionsmutante invC::aphT bzw. der Deletionsmutante sseD::aphT, (a,b) Werte unterscheiden sich zwischen den Tagen für eine und dieselbe Infektionsgruppe (P≤0,05).

Ergebnisse

56

Abbildung 17. Prozentualer Anteil an Monozyten (Mittelwert ± s) bei infizierten Schweinen. Tag 0 = Tag der Infektion mit dem Wildtyp(WT) DT104, der Deletionsmutante invC::aphT bzw. der Deletionsmutante sseD::aphT, (A,B) Werte unterscheiden sich zwischen den Infektionsgruppen für ein und denselben Tag (P≤0,05).

4.3 Kultureller und molekularbiologischer Nachweis von S. Typhimurium DT104

4.3.1 Ausscheidung mit den Faeces

Die Untersuchung der Faeces auf S. Typhimurium DT104 erfolgte in Anlehnung an die

ISO 6579. Vor der Infektion waren alle Schweine frei vom Stamm Salmonella Typhimurium.

Unabhängig vom Infektionsstamm (d.h. Wildtyp oder Mutante) schieden 100 % der

infizierten Schweine bis Tag 5 nach der Infektion den jeweiligen Stamm mit den Faeces aus

(Abbildung 18).

An nachfolgenden Untersuchungstagen war dieser Prozentsatz variabel, ohne dass sich die

Gruppen im Prozentsatz positiv befundeter Tiere unterschieden (Abbildung 18). Er vaiierte

zwischen 62,5 bis 100 % bei Tieren, die den Wildtyp erhielten, betrug 55,6 % bis 100 % bei

Ergebnisse

57

Tieren, die mit der invC::aphT-Mutante infiziert wurden und 75 % bis 100 % bei Schweinen,

welche die sseD::aphT-Mutante bekamen.

Abbildung 18. Kultureller Nachweis von S. Typhimurium DT104 (in % der infizierten Tiere) in Faeces infizierter Schweine. Tag 0 = Tag der Infektion mit dem Wildtyp (WT) DT104, der Deletionsmutante invC::aphT bzw. der Deletionsmutante sseD::aphT.

4.3.2 Besiedlung von Organen und Geweben

Insgesamt wurden 375 Gewebeproben kulturell auf S. Typhimurium DT104 untersucht.

Jeweils 120 stammten von Tieren, die mit dem S. Typhimurium DT104-Wildtypstamm bzw.

der sseD::aphT-Mutante infiziert wurden, während 135 Proben von Schweinen zur

Untersuchung gelangten, welche die invC::aphT-Mutante erhielten. Die Untersuchung

erfolgte in Anlehnung an die ISO 6579.

Von den untersuchten Gewebeproben waren insgesamt 218 (58,1 %) positiv. Davon entfielen

79 (65,8 %) auf Gewebeproben der mit der sseD::aphT-Mutante infizierten Schweine, 77

(64,2 %) auf Tiere, die den S. Typhimurium DT104-Wildtypstamm erhielten, während nur 62

Ergebnisse

58

(45,9 %) Proben der mit der der invC::aphT-Deletionsmutante infizierten Schweine positiv

waren (P≤0.05).

Insgesamt stammten 120 Gewebeproben von Schweinen (n = 8), welche mit dem Wildstamm

von S. Typhimurium DT104 infiziert wurden. Alle Tiere dieser Gruppe waren positiv in den

nachfolgend genannten Organen: Tonsille, Ileum, Caecum Colon, Mandibularlymphknoten

und Ileo-Caecal-Lymphknoten (Abbildung 19). Bei fünf Tieren konnte S. Typhimurium

DT104 im Lungengewebe und bei 4 Tieren im Lungenlymphknoten nachgewiesen werden.

Bei zwei Tieren gelang der Nachweis in der Leber und Muskulatur. Alle Tiere waren negativ

in Milz und Galle.

Von den Tieren (n = 9), die mit der invC::aphT-Mutante infiziert wurden, entstammten 135

Gewebeproben. Alle Tiere waren in Mandibularlymphknoten und im Colon positiv

(Abbildung 19). Häufig wurde die invC::aphT-Mutante auch aus Proben des Caecums, den

Ileo-Cecal- sowie Colon- und Jejunal-Lymphknoten isoliert. Jejunum, Lunge und

dazugehörige Lymphknoten waren jeweils nur bei einem Tier positiv, während Leber, Milz

und Gallenflüssigkeit negativ blieben.

Die 120 Gewebeproben der Tiere (n = 8), die mit der sseD::aphT-Mutante infiziert wurden,

waren wie folgt für genannte Mutante positiv (Abbildung 19): bei allen Tieren Tonsille,

Ileum, Caecum, Colon, Mandibular-, Ileo-Cecal-, und Colon-Lymphknoten; bei sieben Tieren

Jejunallympknoten; bei sechs Tieren Jejunum; bei vier Tieren Lunge und

Lungenlymphknoten; bei zwei Tieren Leber; bei jeweils einem Tier Milz und Muskel. Die

Gallenflüssigkeit war bei allen Probanden negativ.

Ergebnisse

59

Abbildung 19. Kultureller Nachweis von S. Typhimurium (in % der infizierten Schweine) in Gewebeproben. Tag 0 = Tag der Infektion mit dem Wildtyp (WT) DT104, der Deletionsmutante invC::aphT bzw. der Deletionsmutante sseD::aphT, (A–B) Werte unterscheiden sich signifikant für ein und dasselbe Gewebe (P≤0,05). # = kein Nachweis. To = Tonsille; Maly = Mandibular-Lymphknoten; Lu = Lunge; LuLy = Lungen-Lymphknoten; Le = Leber; Mi = Milz; Je = Jejunum; Jely = Jejunal-Lymphknoten; Il = Ileum; Icly = Ileocaecal-Lymphknoten; Ca = Caecum; Co = Colon; Coly = Colon-Lymphknoten; Mu = Muskel; Gf = Gallenflüssigkeit.

Die Tonsillen waren gruppenunabhängig am stärksten besiedelt (Abbildung 20). Im Vergleich

der Gruppen war die Deletionsmutante-sseD::aphT dabei offensichtlich effektiver als die

Deletionsmutante-invC::aphT. Auch bei anderen Organen gab es Unterschiede. Wie bei den

Tonsillen wurde die Deletionsmutante-sseD::aphT auch häufiger in mandibularen, jejunalen

Lymphknoten und Ileo-Caecal-Lymphknoten gefunden (Abbildung 20). In anderen Organen

wie z.B. Illeum, Caecum und Jejunum gab es dagegen keine Unterschiede zwischen den

Stämmen.

Ergebnisse

60

Abbildung 20. Quantitativer Nachweis des Wildtyps (WT) DT 104, der Deletionsmutante invC::aphT bzw. der Deletionsmutante sseD::aphT in Gewebeproben. Die y-Achse zeichnet die Werte als Exponent zur Basis 10. To = Tonsille; Maly = Mandibular-Lymphknoten; Je = Jejunum; Il = Ileum; Co = Colon; Jely = Jejunal-Lymphknoten; Icly = Ileocaecal-Lymphknoten; Coly = Colon-Lymphknoten. (A,B) Werte unterscheiden sich signifikant zwischen den Gruppen für ein und denselben Tag (P≤0,05).

4.3.3 Qualitative PCR zur Identifizierung und Nachweis von S. Typhimurium DT104

Insgesamt wurden 252 positive Kotproben und alle 218 kulturell positiven Gewebeproben mit

Hilfe der PCR untersucht. Alle Proben waren S. Typhimurium positiv. Es wurde

ausschließlich der jeweils zur Infektion verwendete Stamm gefunden. Die Ergebnisse der

PCR sind in den Abbildungen 21 und 22 veranschaulicht.

Ergebnisse

61

Abbildung 21. PCR-Produkte zum Nachweis von S. Typhimurium DT104-Wildtyp sowie der invC::aphT- und sseD::aphT-Deletionsmutanten in ausgewählten Gewebeproben experimentell infizierter Schweine. M = Längenmarker; a = Positivkontrolle invC::aphT-Mutante; b = Positivkontrolle sseD::aphT-Mutante; c = Positivkontrolle DT104 Wildtyp mit invC-Primer; d = Positivkontrolle DT104 Wildtyp mit sseD::aphT-Primer, ÷ = Negativkontrolle, To = Tonsille; Maly = Mandibular-Lymphknoten; Icly = Ileocaecal-Lymphknoten.

Abbildung 22. Nachweis von S. Typhimurium DT104-Wildtyp, Deletionsmutanten in Faeces von ausgewählten Schweinen, die entweder mit der sseD::aphT (I)- oder der invC::aphT-Mutante (II) infiziert wurden. M = Marker, a = invC::aphT-Mutante-Positivkontrolle, ÷ = Negativkontrolle, I = Kotproben der sseD::aphT-Mutantengruppe, II = Kotproben der invC::aphT-Mutantengruppe, b = sseD::aphT-Mutante Positivkontrolle.

Diskussion

62

5 DISKUSSION

Ziel dieser Arbeit war der Pathogenitätsvergleich des Wildstamms von Salmonella

Typhimurium DT104 zu seinen Deletionsmutanten sseD::aphT und invC::aphT. Dieses

Serovar ist ubiquitär und weist keine Wirtsspezifität auf. Alle landwirtschaftlichen Nutztiere

können sich infizieren und mit zum Teil schwerwiegender klinischer Symptomatik erkranken.

Gleiches gilt für den Menschen, der sich durch Umgang mit infizierten Tieren und von Tieren

stammenden Produkten anstecken kann. Dem Schwein, vor allem aber

Schweinefleischprodukten, kommt dabei herausragende Bedeutung zu. Wenn auch dies nicht

der öffentlichen Wahrnehmung entspricht, wo eher die unlängst in 2011 aufgetretene

Epidemie mit EHEC (Enterohämorrhagische Escherichia coli) in Deutschland diskutiert wird,

ist die Situation bezüglich S. Typhimurium DT104 nicht weniger dramatisch, da sich jährlich

immer noch viele Tausend Menschen mit S. Typhimurium DT104 infizieren und erkranken.

Ähnlich wie bei EHEC ist besonders brisant, dass S. Typhimurium DT104 über eine

Multiresistenz gegenüber Antibiotika verfügt und somit Erkrankungen schwer therapierbar

sind. Insofern ist das hier beschriebene Forschungsvorhaben von großer Relevanz, da es dazu

beiträgt, die Pathogenitätsmechanismen von S. Typhimurium DT104 besser zu verstehen,

wirksam zu bekämpfen bzw. Infektionen mit diesem Bakterium zu verhindern.

Wie schon vormals bei Hühnern und Mäusen gezeigt (PORTER et al. 1993; MAHAN et al.

1993; FINLAY 1994; HENSEL et al. 1995) demonstrierten die in dieser Arbeit generierten

Ergebnisse eindrucksvoll, dass Infektionen mit dem Wildtyp von S. Typhimurium zu einer

schweren Erkrankung beim Schwein führen können. Es wurde ferner gezeigt, dass beide in

dieser Arbeit verwendeten Mutanten weniger krankmachend sind. Basierend auf den

Ergebnissen dieser Arbeit ist davon auszugehen, dass die Deletionen in den sseD::aphT bzw.

invC-Bereichen tatsächlich zu Veränderungen bestimmter Eigenschaften geführt haben, die

Teil der Pathogenitätsmechanismen für das Schwein sind. Es ist zu vermuten, dass invC in die

Steuerung des Invasionsvermögens eingebunden ist.

Diskussion

63

5.1 Methodische Überlegungen

In dieser Arbeit wurden zur Untersuchung auf Salmonella Medien verwendet, wie sie vor der

Modifikation im Jahre 2008 laut ISO 6579 vorgeschrieben waren. Grund dafür ist, dass die

hier beschriebenen Untersuchungen vor oben genannter Modifikation stattfanden. Die

Modifikation betrifft die Selektivanreicherung mittels Rappaport-Vassiliadis (RV)-Medium.

Während vor der Modifikation flüssiges Medium verwendet wurde, schreibt die modifizierte

ISO 6579 im Anhang D vor, halbfestes Rappaport-Vassiliadis-Medium (MRSV-Medium)

zum Nachweis von Salmonellen in Kot- und Umweltproben zu nutzen. Dadurch sollten

sowohl Sensitivität und Spezifität der Salmonellen-Diagnostik erhöht als auch Arbeits- und

Material-Aufwand reduziert werden (ANONYMUS 2005; ANONYMUS 2007). Ob einzelne

Salmonellen-positive Proben deshalb in dieser Arbeit unerkannt blieben, bleibt offen. Wenn

dieser Fehler tatsächlich systematisch bestand, war er gruppenübergreifend ohne

Konsequenzen für den Gruppenvergleich. Kulturell als positiv befundete Proben waren

hingegen tatsächlich positiv, da sie alle mittels PCR untersucht und bestätigt wurden.

5.2 Klinische Symptomatik

Die unterschiedliche Virulenz der in dieser Arbeit verwendeten S. Typhimurium DT104

Stämme konnte eindeutig demonstriert werden. Je nach Stamm variierte die klinische

Symptomatik zum Teil erheblich. Schwere klinischeVerläufe wurden nach Infektion mit dem

Wildtyp von S. Typhimurium DT104 beobachtet, während nach Infektion mit den Mutanten

vergleichsweise milde klinische Erscheinungen auftraten. Das betraf sowohl Morbidität,

Krankheitsintensität als auch die Dauer der Erkrankung. Während alle mit dem Wildtyp

infizierten Tiere mit unterschiedlichen Symptomatiken klinisch krank waren, wurden bei

Verwendung der Mutanten nur einzelne Tiere krank. Fast alle der in dieser Studie beurteilten

klinischen Parameter waren bei einem oder mehreren mit dem Wildtyp infizierten Tieren zum

Teil zeitgleich verändert, während bei Verwendung der Mutanten mal der eine, mal der

andere Paramter verändert war und äußerst selten dieselben Tiere betraf oder Veränderungen

zeitglich zu beobachten waren. Traten klinische Veränderungen auf, waren die Symptome

stark ausgeprägt, wenn mit dem Wildtyp infiziert wurde. Mutanten verursachten dagegen nur

milde klinische Veränderungen. Waren Schweine mit dem Wildtyp infiziert und erst einmal

Diskussion

64

krank, hielt die Erkrankung über meherer Tage an. Nach Verwendung der Mutanten waren

Krankheitssymptome eher sporadischer Natur und verschwanden schon am darauffolgenden

Tag. Es ist sicher berechtigt zu konstatieren, dass sich nach Infektion mit dem Wildtyp von S.

Typhimurium DT104 eine Erkrankung per definitionem (WIESNER und RIBBECK 1991)

entwickelte, während die Deletionsmutanten wohl eher untypisch milde klinische

Verlaufsformen auslösten. Das zeigt auch die Gewichtsentwicklung, die bei den mit dem

Wildtyp infizierten Tieren geringer als bei den jenigen Schweinen war, die mit Mutanten oral

inokkuliert wurden. Bekanntlich fressen kranke Tiere weniger und nehmen während der Zeit

der Erkrankung weniger zu (BALAJI et al. 2000). So ist allein anhand der klinischen

Symptomatik zu vermuten, dass Deletionen im sseD-Gen oder invC-Gen die

Pathogenitätsseigenschaften der Salmonellen abschwächen. Das gilt wie in dieser Arbeit

gezeigt offensichtlich für das Schwein genauso wie dies für die Maus gezeigt werden konnte

(HEESEMANN und HENSEL 2000) und das Huhn (PORTER et al. 1993). Die in dieser

Arbeit beobachtete klinische Symptomatik nach Infektion mit dem Wildtyp ist bekannt und

wurde wiederholt beschrieben (WOOD et al. 1989; WOOD und ROSE 1992; FEDORKA-

CRAY et al. 1994; NIELSEN et al. 1995; SCHERER et al. 2008). Die Beobachtung milderer

Verläufe durch die in dieser Arbeit verwendeten Deletionsmutanten ist neu. Da sich die

Mutanten nicht wesentlich in den durch sie hervorgerufenen klinischen Erscheinungen

unterschieden, ist davon auszugehen, dass die durch die Deletion hervorgerufenen

Funktionsänderungen oder gar –verluste in den deletierten Genomsabschnitten ähnlich

effektiv in der Abmilderung klinisch relevanter Pathogenitätsmechanismen waren. Wie

eingangs erwähnt, steuert sseD das Überleben der Salmonellen, während invC für die

Invasivität verantwortlich ist. Die vorhandenen klinischen Symptomatiken lassen darauf

schließen, dass invC-deletierte Mutanten im Unterschied zum Wildtyp vergleichsweise selten

in den Organismus gelangten, während Mutanten mit Deletion im sseD-Bereich zwar in den

Organismus gelangten, jedoch effektiver als der Wildtyp und die invC::aphT-Mutante aus

dem Organismus des Schweins eleminiert wurden.

5.3 Weißes Blutbild

Anhand der Beschreibung des weißen Blutbildes sollte geprüft werden, ob und wie effektiv

sich die einzelnen Salmonellenstämme der Immunabwehr des Wirtsorganismus widersetzen

Diskussion

65

können. Wie schon vormals beschrieben (COE et al. 1992; VAN DIEMEN et al. 2002), stieg

die Gesamtleukozytenzahl nach Infektion mit dem Wildtyp bis zum Tag 10 nach der Infektion

an, um danach langsam bis zum Versuchsende abzufallen. Diese offensichtlich für das

Schwein typische Reaktion (COE et al. 1992; VAN DIEMEN et al. 2002) blieb aber bei

denjenigen Tieren, die mit den Deletionsmutanten infiziert wurden, aus. SseD::aphT-

Infektionen führten zwar zu einem Anstieg in der Anzahl der Leukozyten am Tag nach der

Infektion. Dieser Anstieg war jedoch transient und schon am darauffolgenden Tag wieder

abgeklungen. Klassisch und wie von Schilling (zitiert aus KRAFT und DÜRR 2005)

beschrieben, verhielten sich die Lymphozyten, wenn mit dem Wildstamm infiziert wurde.

Nach einem initialen protrahierten und moderaten Abfall bis zum Tag 7 nach der Infektion,

erfolgte eine ebenso protrahierte Erholung. Der initiale Abfall in der Anzahl an Lymphozyten

war möglicherweise das Resultat eines eingangs gestiegenen Verbrauchs vermutlich vor allem

zytotoxischer T-Lymphozyten, die bei der inaten d.h. sofortigen Immunantwort auf die

Infektion beteiligt waren. Dieses klassische Muster fehlte nach Infektion mit den

Deletionsmutanten. Lymphozyten sind Bestandteil der humoralen Immunabwehr.

Offensichtlich wurde dieses durch den Wildstamm effektiver stimuliert als nach den

Infektionen mit den Mutanten. Dieser postulierte Effekt kann schwerlich allein nummerisch

begründet sein, da nach o.g. Theorie sseD::aphT-Mutanten in gleicher Anzahl wie der

Wildtyp in den Organismus gelangt sein müssten. Die Lymphozytenkurve des Wildtyps

unterschied sich jedoch von beiden Mutanten in gleicher Weise. Möglicherweise besitzen

solchermaßen spezifisch deletierte Salmonellen und solche des Wildtypes unterschiedliche

immunogene Eigenschaften. Da es lediglich die Deletion ist, die Mutanten vom Wildtyp

unterscheiden, ist logisch anzunehmen, dass ein Zusammenhang zur Deletion besteht.

Wodurch auch immer letztlich verursacht, empfehlen sich beide Deletionsmutanten aufgrund

der verminderten Immunantwort nicht als Kandidaten für Impfstoffe. Auch wenn, wie

gewünscht, kaum klinische Symptome auftraten, ist mit einer eher schwachen humoralen

Immunantwort zu rechnen. Unterschiede in der Immunantwort im Vergleich von Wildtyp und

Mutanten sind auch im Vergleich der neutrophilen Granulozyten ersichtlich. Wie zu erwarten,

verursachte der Wildtyp eine eindeutige Reaktion (Anstieg) im Anschluss an die Infektion.

Dieses Phänomen wurde schon vormals beschrieben (VAN DIEMEN et al. 2002) und

bestätigt, dass neutrophile Granulozyten bei einer Infektion mit Salmonellen wie auch bei

anderen bakteriellen Infektionen Teil der unspezifischen Immunabwehr sind. Dieser Effekt

blieb nach den Infektionen mit den Deletionsmutanten weitestgehend aus.

Diskussion

66

Offensichtlich unterscheiden sich Wildtyp und Mutante auch in Eigenschaften, welche die

zelluläre Immunantwort des Wirtsorganismus beeinflussen. In diesem Zusammenhang sind

nochmals Überlegungen zur Klinik angebracht. Von vielen anderen bakteriellen Infektionen

beim Schwein einschließlich des vor allem durch coliforme Bakterien verursachte MMA-

Syndroms ist bekannt, dass klinische Verlaufsformen (inklusive Fieber, Inappetenz und

Erbrechen) durch chemotaktische Substanzen wie Interleukine und Zerfallsprodukte der

Bakterien (Endotoxine) verursacht werden (REINER et al. 2007). Bakterielle

Zerfallsprodukte entstehen auch als Resultat der zellulären Abwehr. Neutrophile Granulozten

sind zur Phagozytose befähigt (WIESNER und RIBBECK 1991). Wo Abwehrmechanismen

mit neutrophilen Granulozyten versagen oder nur vermindert funktionieren, wie in dieser

Studie bei der Infektion mit den Deletionsmutanten möglicherweise erfolgt, werden auch

wenige chemotaktische Substanzen vorhanden sein und bakterielle Zerfallsprodukte entstehen

und deshalb möglicherweise auch weniger/keine klinische Symptome auftreten. Die hier

skizzierten „pathways“ finden durch die Ergebnisse der Arbeit von Brumme Bestätigung

(BRUMME 2006; BRUMME et al. 2007). In diesen Arbeiten wurden dieselben Schweine

und gleiches Versuchsdesign genutzt, sich jedoch vornehmlich auf die Untersuchung von

Entzündungsmediatoren (Interleukin 2 und 4 sowie Interferon γ) und Antikörpern (IgA, G und

M) konzentriert. Die Expression aller drei Entzündungsmediatoren war bei den jenigen

Schweinen, die mit dem Wildtyp infiziert wurden, höher als bei den Tieren, welche die

Deletionsmutante erhielten. Ähnliches war bei den untersuchten spezifischen Antikörpern

festzustellen. Es wurde unter anderem geschlussfolgert, dass sowohl die zelluläre wie auch

die humorale Immunantwort bei mit dem Wildstamm infizierten Tieren ausgeprägter als bei

Schweinen ist, die mit einer der beiden Deletionsmutanten infiziert wurden. Interssant ist

auch, dass sich beide Mutanten in der Immunantwort unterschieden. Die durch sseD::aphT-

ausgelöste Reaktion (gemessen an der Expression von Interleukin 4 und Interferon γ) war

heftiger als bei Verwendung der invC::aphT- Deletionsmutante (BRUMME 2006; BRUMME

et al. 2007). Ähnliches wurde in der vorliegenden Arbeit bei der klinischen und

labordiagnostischen Beurteilung sowie bei der Bewertung der Invasivität beobachtet.

Die Ergebnisse der Bestimmung eosinophiler Granulozyten und von Monozyten waren

indifferent und erlauben keine substantielle Diskussion im Hinblick auf die Pathogenität des

jeweiligen Infektionsstammes. Eosinohile Granulozyten sind mononukleäre Zellen, die

Diskussion

67

vermehrt bei Allergien auftreten und bei der Abwehr von Parasitosen und an der

Rekonvaleszenz des gestörten Organs/Gewebes beteiligt sind (EDFORS-LILJA et al. 1994;

KRAFT und DÜRR 2005). Monozyten sind phagozytierende Zellen und wesentlicher

Bestandteil der unspezifischen zellulären Abwehr (EDER 1987). Die Anzahl von Monozyten

im Blut unterliegt generell großen Schwankungen (EDER 1987). Folgt man der klassischen

Infektiologie, wäre zu erwarten gewesen, dass die eosinophilen Granulozyten in der Phase der

Rekonvaleszenz einige Zeit nach der vorangegangenen Infektion mit S. Typhimurium

ansteigen (KRAFT und DÜRR 2005). Dieses klare Muster war, wie oben angedeutet, bei

keinem der verwendeten Infektionsstämme zu beobachten.

5.4 Ausscheidung und Organbesiedlung

Die Untersuchungen der Kotproben zum kulturellen Nachweis von S. Typhimurium DT104-

Wildtyp und Deletionsmutanten erfolgten wie in der ISO 6579 vorgeschrieben. Altrock

(2000) empfahl, diese Untersuchungen kontinuierlich und in engen Intervallen durchzuführen,

um eine sichere Aussage über die Dauer der Ausscheidung treffen zu können. Dies wurde

befolgt und der Beprobungsplan analog engmaschig konzipiert. Prinzipiell lassen die

Ergebnisse der Kultur folgende Schlussfolgerungen zu: Nach oraler Infektion von

Salmonellen werden die Schweine Ausscheider. In diesem Verhalten unterschieden sich

Wildtyp nicht von Mutanten. Die Salmonellen werden gleichwohl intermittierend

ausgeschieden. Auch in dieser generellen Eigenschaft verhielten sich die in dieser Arbeit

verwendeten Stämme gleich. Zwar wurden in der Anzahl „Ausscheider je Untersuchungstag“

vereinzelt Unterschiede beobachtet, jedoch weitab von jeglicher Signifikanz. Das Schweine S.

Typhimurium intermittierend ausscheiden können, ist bekannt (WOOD et al. 1989; WOOD

und ROSE 1992; FEDORKA-CRAY et al. 1994; NIELSEN et al. 1995; SCHERER et al.

2008). Es wird vermutet, dass latent infizierte Tiere dann ausscheiden, wenn sie gestresst

werden oder andere die Ausscheidung begünstigende Konstellationen eintreten (ISAACSON

et al. 1999; LARSEN et al. 2003; LOYNACHAN et al. 2004; BOUGHTON et al. 2007;

WILLIAMS et al. 2008). Es konnte zudem beobachtet werden, dass Salmonellen

ausgeschieden werden, ohne dass die Tiere zwangsläufig klinisch erkranken. Obwohl dies

schon seit langem bekannt ist (WOOD et al. 1989; FEDORKA-CRAY et al. 2000; BOYEN et

al. 2008; SCHERER et al. 2008; VAN PARYS et al. 2011), zeigen auch diese Versuche, dass

Diskussion

68

latente Infektionen typisch sind. Latente Träger wurden vor allem in der Gruppe der mit den

Deletionmutanten infizierten Tiere beobachtet. Unsere Befunde bestätigen, dass die Fähigkeit

zur Persistenz offensichtlich nicht an die Virulenz gekoppelt ist (WALES et al. 2011). Der

Fakt, dass einzelne Tiere (vor allem die mit Deltionsmutanten infizierten) viele Tage nach der

vorangegangenen Infektion, wenn auch nur milde Krankheitsymtome aufwiesen, mag als

zusätzliches Indiz einer faktoriellen Genese der Salmonellose des Schweines gelten.

Möglicherweise erfuhren diese Schweine eine für sie unbeherrschbare Belastung (zum

Beispiel als Folge der Versuchsdurchführung), die zu kurzzeitigen milden klinischen

Verlaufsformen führten.

Zum Nachweis der Invasiviät der verwendeten Salmonellenstämme wurden verschiedenste

Gewebe- und Organproben sowohl kulturell als auch mittels PCR auf Salmonellen untersucht.

Alle in der Kultur positiven Ergebnisse konnten in der PCR bestätigt werden. Die kulturellen

Anzucht- Ergebnisse dieser Arbeit sind damit zuverlässig validiert. Generell ist festzuhalten:

Alle Stämme, d.h. sowohl Wildtyp als auch die Mutanten sind invasiv, da sie sich prinzipell

in fast allen der beprobten Organe nachweisen ließen. Damit bestätigt sich, dass sich

Salmonella Typhimurium über das lymphatische und blutführende System in Organismen

ausbreiten kann und verschiedene Zelltypen invadiert (SANTOS et al. 2003; HAPFELMEIER

et al. 2005; HARAGA et al. 2008). Makrophagen dienen dabei als Vehikel. S. Typhimurium

kann in ihnen überleben und sich dort sogar vermehren (ALTHOUSE et al. 2003). Allerdings

gab es nicht unerhebliche Unterschiede zwischen den in dieser Arbeit verwendeten Stämmen,

vor allem im Hinblick auf das Muster der Organbesiedlung, aber auch mit Blick auf die

Häufigkeit des Befalls einzelner Organe. Interessant war, dass sich die sseD::aphT-Mutante

als gleichermaßen invasiv wie der Wildtyp herausstellte. Obwohl die Invasivität des Wildtyps

bekannt ist (MEYERHOLZ et al. 2002; NIEWOLD et al. 2007), erstaunt dieses Ergebnis

deshalb, da bisher angenommen wurde, dass die sseD::aphT-Mutante über eine verminderte

Überlebensfähigkeit in Makrophagen verfügt und darum recht effektiv durch den Organismus

eliminiert wird. Basierend auf den Ergebnissen dieser Arbeit – vor allem unter

Berücksichtigung der ausbleibenden zellulären Immunantwort – kann vermutet werden, dass

sich diese Mutante womöglich (auch) recht effektiv vor der zellulären Immunabwehr des

Wirtsorganismus maskieren konnte. Etwaige dafür zugrunde liegende Mechanismen müssen

noch untersucht werden. Fakt ist, dass sich die pathogenen Eigenschaften von sseD-Gen beim

Schwein vor allem im Hinblick auf dessen Fähigkeit zur Invasion deutlich von denen bei der

Diskussion

69

Maus unterscheiden, bei der sich sseD-Gen von Salmonella als wenig invasiv herausstellte

(HENSEL 2000; HEESEMANN und HENSEL 2000; GALLOIS et al. 2001; HOLZER und

HENSEL 2010). Dieses Ergebnis verdeutlicht auch, wie wichtig vergleichende

Untersuchungen an bzw. mit der jeweiligen Zielspezies sind.

Im Gegensatz zu sseD bewies invC eine geringere Invasivität bzw. Fähigkeit, sich im

Wirtsorganismus zu verbreiten und Organe zu kolonisieren. Dieses Ergebnis ist nicht

unerwartet, da invC, wie schon mehrfach erwähnt, über ein deletiertes und damit in seiner

Funktion verändertes invC Gen verfügt. Sämtliche Schweine waren unabhängig vom

verwendeten Infektionsstamm in Tonsillen, Mandibularlymphknoten und im Colon mit

Salmonellen besiedelt. Diese Besiedlungsorte sind typisch und gehören zu denjenigen, in

denen Salmonellen bevorzugt persistieren (WOOD et al. 1989; WOOD und ROSE 1992;

HURD et al. 2001; MARG et al. 2001; ROESLER et al. 2004; SCHERER et al. 2008;

SZABO et al. 2008; VAN PARYS et al. 2011). Andere Organe, wie Leber, Muskulatur und

Milz waren wesentlich seltener besiedelt oder kulturell negativ. Dieses Ergebnis ist fleisch-

und lebensmittelhygienisch von Bedeutung, da es sich bei Leber und Muskulatur um vom

Schwein stammende Vorprodukte handelt, die verarbeitet oder unverarbeitet in die

menschliche Nahrungskette gelangen.

Die Ergebnisse dieser Arbeit in ihrer Gesamtheit zeigen, dass der Wildtyp von S.

Typhimurum erwartungsgemäß pathogener ist als die beiden Deletionsmutanten sseD::aphT

und invC::aphT. Diese Interpretation bezieht sich vor allem auf die klinische Symptomatik

und auf Veränderungen der Blutbilder, die sich vor allem beim Wildtyp manifestierten. In der

Fähigkeit zur Ausscheidung (auch intermittierend) bestanden bei den Versuchsschweinen

keine Unterschiede. Anders in der Invasivität (d.h. Fähigkeit der Verbreitung im Organsimus

und Besiedlung von Organen); invC::aphT invadierte seltener als sseD::aphT, die ein ähnlich

starkes Invasionsvermögen wie der Wildtyp aufwies. Damit korrespondieren die Ergebnisse

dieser Arbeit gut mit denen von BRUMME et al. (2007) und BRUMME (2006), die, wie oben

erwähnt, vornehmlich basierend auf immunologischen Parametern ebenso fand, dass die

sseD::aphT-Deletionsmutante pathogener als die invC::aphT-Mutante ist.

Diskussion

70

5.5 Schlussbetrachtung

Angesichts des zoonotischen Potentials von S. Typhimurium und vor allem auch durch die

Gesetzgebung legitimierten Anstrengungen zur Elimination dieses Bakteriums aus der

menschlichen Nahrungskette durch stringente Monitoring- und Eradikationsprogramme sowie

durch die Einhaltung einwandfreier Hygienestandards mag sich die Bedeutung der

Salmonellen eher durch ihre Fähigkeit zur Invasivität, Persistenz und dauerhaften

Ausscheidung als denn allein durch die klinischen Symptome beim Wirt definieren. Wird

dieses als Bewertungsgrundlage genutzt, ist zumindest die Infektion mit der sseD::aphT-

Deletionsmutante nicht weniger klinisch auffällig (und in diesem Sinne „gefährlich“) als die

Infektion mit dem Wildtyp von S. Typhimurium. Ohne erkennbare klinische Erscheinungen

bei den Versuchsschweinen auszulösen, invadierte dieser Stamm den Wirtsorganismus in

einer Weise, wie sie nur vom Wildtyp bekannt ist. Da für die Verbreitung der Salmonellen im

Organismus Makrophagen als Vehikel dienen, muss zukünftig die Frage beantwortet werden,

ob seeD prinzipiell für die Überlebensfähigkeit von S. Typhimurium in Makrophagen kodiert,

oder ob es nicht auch eine spezies-spezifische Komponente gibt. Anders hingegen

invC::aphT, die sich bei Betrachtung aller genannten Kriterien wie klinische Symptomatik

und Invasivität als weniger pathogen erwies. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass die

Deletion im invC-Locus des Bakteriengenoms tatsächlich zu einer Veränderung in dessen

Funktion führte, die dann im Infektionsgeschehen beim Schwein mit einer Beinträchtigung

der Invasivität der invC::aphT-Mutante einherging.

Zusammenfassung

71

6 ZUSAMMENFASSUNG


PATHOGENITÄTSVERGLEICH VON SALMONELLA

TYPHIMURIUM DT104 WILDTYP UND SALMONELLA

TYPHIMURIUM DELETIONSMUTANTEN (sseD::aphT & invC::aphT) IN PERSISTENT INFIZIERTEN SCHWEINEN Institut für Tierhygiene und Öffentliches Veterinärwesen der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig Eingereicht im Februar 2012 74 Seiten, 22 Abbildungen, 23 Tabellen, 241 Literaturstellen, 14 Seiten Anhang Schlüsselworte: Salmonella Typhimurium DT104, Deletionsmutante, invC-Gen, sseD-Gen, Schwein, experimentelle Infektion

Salmonella (S.) Typhimurium DT104 ist ein gram-negatives Bakterium. Es weist keine Wirtsspezifität auf und gilt als Zoonoseerreger. Jährlich erkranken daran allein in Deutschland mehrere Tausend Menschen unter dem Bild einer schwerwiegenden Diarrhö mit zum Teil tödlichem Ausgang. Das Schwein gilt als eines der Reservoire für S. Typhimurium DT104 des Menschen. S. Typhimurium DT104 gelangt über vom Schwein stammende Produkte in den menschlichen Verzehr. Die Kontrolle von S. Typhimurium DT104 einschließlich effektiver Eradikationsmassnahmen in unseren Schweinebeständen ist deshalb von entscheidender Bedeutung, um den Eintrag dieses Bakteriums in die menschliche Nahrungskette wenn möglich zu eliminieren. Dafür ist das Verständnis über S. Typhimurium DT104 einschließlich der Kenntnis seine Pathogenitätseigenschaften notwendig. Ziel dieser Arbeit waren Untersuchungen zur Pathogenität von S. Typhimurium DT104. Dabei wurden der Wildstamm mit zwei seiner Deletionsmutanten (sseD::aphT und invC::aphT) verglichen.

Die Untersuchungen erfolgten im Infektionsversuch an insgesamt 25 sechs Wochen alten männlichen Schweinen, die in einem vollklimatisierten Versuchsstall gehalten wurden. Den Tieren wurde im Anschluss an eine einwöchige Akklimatisierungsphase eines der nachfolgenden Stämme von S. Typhimurium DT104 oral in einer Konzentration von 1 x 1011 KBE verabreicht: Wildtyp (n = 8 Schweine), Deletionsmutante seeD::aphT (n = 8) und Deletionsmutante invC::aphT (n = 9). Bei den Mutanten handelt es sich um Varianten von S. Typhimurium DT104, die an den entsprechenden Abschnitten des Bakteriumgenoms (d.h.

Zusammenfassung

72

sseD-Gen bzw. invC-Gen) deletiert wurden. SseD regelt die Überlebensfähigkeit von S. Typhimurium in Makrophagen, invC dessen Invasionsvermögen. Im Mäusemodel war die Pathogenität beider Mutanten deutlich vermindert. Nach der Infektion schloss sich ein 20 tägiger Beobachtungszeitraum an, während dessen nachfolgend genannte Parameter erfasst bzw. Proben genommen wurden: klinische Symptome (Allgemeinbefinden, Erbrechen, Durchfall, Futteraufnahme, Atmung, Temperatur); Blutentnahme für Erstellung des weißen Blutbildes; Kotentnahme zum Nachweis der Ausscheidung von S. Typhimurium. Einen Tag nach Ende der Beobachtung wurden die Tiere getötet und Proben von insgesamt 15 Organen (unter anderem Tonsille; Colon und Caecum sowie dazugehörige Lymphknoten; Leber; Milz; Muskulatur) genommen. Kot sowie Gewebeproben wurden kulturell und, wenn positiv, auch mittels PCR untersucht.

Alle mit dem Wildtyp infizierten Schweine wurden mehr oder weniger stark krank. Häufig zeigten erkrankte Schweine zeitgleich mehrere Krankheitssymptome (z. B. Erbrechen und Durchfall). Die Erkrankung hielt über mehrere Tage an. Im Vergleich dazu waren die Krankheitssymptome der Tiere, die mit Mutanten infiziert wurden, mild. Nur wenige Tiere erkrankten und dann auch nur kurzzeitig. Gewöhnlich war nur einer der erfassten Parameter verändert. Typische Veränderungen im weißen Blutbild waren nur bei Wildtyp-infizierten Tieren zu beobachten, während Tiere beider Mutanten kaum auf die Infektion reagierten. Alle 25 infizierten Tiere schieden S. Typhimurium mit dem Kot während der ersten 5 Tage post inocculationem aus. Danach wurden in allen drei Gruppen etwa gleichviel intermittierende Ausscheider beobachtet. Zwischen 65 und 67 % der Gewebeproben der mit dem Wildtyp und mit der sseD::aphT-Mutante infizierten Tiere waren sowohl in der Kultur als auch mittels PCR S. Typhimurium positiv, während dieser Anteil nach Infektion mit invC::aphT nur 49 % betrug. Alle Tiere waren in Mandibularlymphknoten und im Colon positiv, während S. Typhimurium nur selten in Muskulatur und Leber nachzuweisen war.

Die Ergebnisse dieser Arbeit bestätigen, dass Infektionen mit dem Wildtyp von S. Typhimurium zu einer schweren Erkrankung führen können. Gleichzeitig konnte gezeigt werden, dass beide in dieser Arbeit verwendeten Mutanten weniger krankmachend sind. Es muss davon ausgegangen werden, dass die Deletionen in den sseD- bzw. invC-Bereichen tatsächlich zu Veränderungen bestimmter Eigenschaften geführt haben, die Teil der Pathogenitätsmechanismen für das Schwein sind. Im Unterschied zur Maus war sseD beim Schwein allerdings invasiv. Es kann vermutet werden, dass die durch sseD kodierten Pathogenitätseigenschaften von S. Typhimurium bei der Maus anders als beim Schwein wirken und somit unterschiedliche Bedeutung haben. Da die invC::aphT-Mutante jedoch, und wie erwartet, wesentlich schwächer als Wildtyp und sseD::aphT invadierte, ist davon auszugehen, dass die Deletion im invC Bereich das Invasionsvermögen der Mutante beim Schwein ähnlich wie bei der Maus verringerte.

Summary

73

7 SUMMARY


COMPARISON OF THE PATHOGENICITY OF SALMONELLA

TYPHIMURIUM DT104 WILD TYPE AND SALMONELLA

TYPHIMURIUM DELETIONSMUTANTS (sseD::aphT &

invC::aphT) IN PERSISTENT INFECTED PIGS

Institute of Animal Hygiene and Veterinary Public Health Faculty of Veterinary Medicine, University of Leipzig Submitted February 2012 74 pages, 22 figures, 23 tables, 241 references, 14 pages appendices Keywords: Salmonella Typhimurium DT104, deletion mutant, invC gene, sseD gene, swine,

experimental infection

Salmonella (S.) Typhimurium DT104 is a gram-negative bacteria. It does not have a strong host specifity and is considered a zoonotic pathogen. In Germany, several thousand people get sick annually with the clinical picture of a severe diarrhea which occasionally can also lead to death. The pig is considered a reservoir for infections of humans. S. Typhimurium DT104 is transmitted to human through pig products that are offered for food consumption. The control of S. Typhimurium DT104 including effective measures for eradication in our pig industry is therefore crucial in the attempt to eliminate the entry of this bacteria into the human food chain. To achieve this goal it is necessary to understand S. Typhimurium DT104 including the mechanisms that regulates its pathogenicity. The aim of the present study was to investigate into pathogenic properties of S. Typhimurium DT104. For this reason the wild type was compared to two of its mutants (i.e. sseD::aphT und invC::aphT). In this investigation, a total of 25 six weeks old male pigs were used for an infection trail. Animals were confined in a fully climatized pig barn. After being moved into the barn the pig were allowed to acclimatize for one week, and were then infected with S. Typhimurium DT104 orally in a concentration of 1 x 1011 cfu as follows: wild type (n = 8 pigs), mutant seeD::aphT (n = 8) as well as mutant invC::aphT (n = 9). The mutants are variants of

Summary

74

S. Typhimurium DT104 that have been modified at the respective loci of the bacterial genome (i.e. at the sseD-gene and invC-gene, respectively). While sseD is involved in regulating of the survival ability of S. Typhimurium in macrophages, invC regulates its ability to invade. Using the mouse model a reduced patogenicity has been demonstrated for both mutants. The day after infection a 20-days observation period commenced and the following parameters were determined, or samples taken during that period: clinical symptoms (general health, vomiting, diarrhea, feed consumption, breathing, body temperature); white blood cell count; collection of feaces for the detection of S. Typhimurium. One day after the last day of the observation period all animals were sacrificed and specimens taken from a total of 15 organs that includes tonsils; colon and caecum as well as lymph nodes, respectively; liver; spleen; muscle). All faecal samples and tissue specimens were subjected to cultural analysis as well as PCR. All animals that received the wild type of S. Typhimurium got more or less sick. Sick animals often had more than one clinical symptom at the same time (e.g. vomiting and diarrhea). The disease often lasted over several days. In comparison, animals that received either of the mutants were only slightly sick. Moreover, only a few animals were sick and the sickness then disappeared quickly. There was also usually only one clinical parameter that was affected. Typical changes of the white blood count was only observed in animals that were infected with the wild type, while animals that received either of the mutants did not show much as the result of infection. All 25 infected animals shed S. Typhimurium via feaces within the first week of infection. After this time animals of all three groups started to shed intermittently. Between 65 and 67 % of the animals that were infected with either the wild type of S. Typhimurium or the sseD::aphT-mutant were found positive for S. Typhimurium with both culture and PCR. In comparison, the percentage of specimens that were positive after infection with invC::aphT was 49 %. In all pigs S. Typhimurium was found in lymph nodes of the mandibular gland and in colon, while it was rarely observed in liver and muscle. The results of this study confirm that, infections with the wild type of S. Typhimurium can lead to severe sickness. At the same time it could be demonstrated that, the mutants that were used in this study are less “sick-making”. It is assumes that, the modifications that occurred to the sseD and invC regions resulted in changes of certain properties that are part of the mechanisms that regulate the pathogenicity if the bacteria in pigs. In contrast to mice sseD has been shown to be invasive in the pig. It is assumed that, sseD codes for pathogenicity properties that act in a different manner in pigs than in mice and thus may have a different significance for the pig. However, the fact that the invC::aphT mutant did invade to a much slighter extend than sseD::aphT suggest that the modification that occurred at the invC region did reduce the invasion capability of that mutant.

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Anhang

I

9 ANHANG

Tabelle 7. Mittelwerte der Körpertemperatur (°C) der, mit dem S. Typhimurium DT104-Wildtyp, der Deletionsmutante-invC::aphT, der Deletionsmutante-sseD::aphT infizierten Schweine und die dazugehörige Standardabweichung

Mittelwerte der Körpertemperatur der infizierten Versuchsschweine in °C

Tag nach der Infektion

DM-invC::aphT DM-sseD::aphT Wildtyp DT104

Mittelwert Standard-

abweichung Mittelwert Standard-

abweichung Mittelwert Standard-

abweichung 0 39,7 0,5 39,4 0,2 38,8 0,3 1 38,9 0,3 39,4 0,4 39,2 0,5 2 39,1 0,4 39,8 0,4 40 0,5 3 39,6 0,3 39,6 0,4 39,3 0,3 4 39,6 0,4 39,3 0,4 39,4 0,6 5 39,4 0,3 39,7 0,2 39,1 0,6 6 39,2 0,3 39,5 0,2 39,2 0,6 7 39,8 0,3 39,4 0,2 39,2 0,4 8 39,9 0,3 39,4 0,2 39,2 0,6 9 39,5 0,3 39,4 0,3 39,2 0,4

10 39,4 0,2 39,5 0,1 39,3 0,3 DM = Deletionsmutante

Tabelle 8. Mittelwerte des Körpergewichts der mit dem S. Typhimurium DT104-Wildtyp, der Deletionsmutante-invC::aphT, der Deletionsmutante-sseD::aphT infizierten Schweine mit der dazugehörigen Standardabweichung und Signifikanz

Mittelwerte für das Körpergewicht der infizierten Schweine in kg

Tag WT DT 104

n = 8 Mittelwert ± s

DM-invC::aphT n = 9

Mittelwert ± s

DM-sseD::aphT n = 8

Mittelwert ± s

0 8,9 ± 1,3d 10,3 ± 1,2d 9,9 ± 1,1d

3 9,0 ± 1,2B,d 11,6 ± 1,5A,c,d nicht gemessen 7 9,6 ± 1,4B,d 13,6 ± 1,8A,b,c 10,9 ± 1,0B,c,d

10 11,2 ± 1,5B,c,d 14,7 ± 1,5A,b 12,5 ± 1,9B,b,c 14 13,0 ± 1,9B,b,c 17,7 ± 1,8A,a 14,0 ± 2,6B,b 17 14,8 ± 2,1B,a,b 19,2 ± 2,6A,a 16,5 ± 1,8A,B,a 21 16,8 ± 2,5a nicht gemessen nicht gemessen

Am Tag 3 konnten die Gruppe DM-sseD::aphT und am Tag 21. die Gruppen DM-sseD::aphT und DM-invC::aphT aus technischen Gründen nicht gemessen werden.

WT DT104 = Wildtyp, DM = Deletionsmutante A – B = Werte unterscheiden sich signifikant (P≤0,05) in Zeilen. a – d = Werte unterscheiden sich signifikant (P≤0,05) in Spalten.

Anhang

II

Tabelle 9. Klinischer Score des Allgemeinbefindens der Infektionsgruppen, S. Typhimurium DT104-Wildtyp, Deletionsmutante invC::aphT und Deletionsmutante sseD::aphT

Klinischer Score für das Allgemeinbefinden


Deskriptive Statistik

WT DT104 (A)

DM-invC::aphT

(B)

DM-sseD::aphT

(C)

Signifikanzprüfung zwischen den Gruppen

0

n 8 9 8 A:B p= 1,0 Mittelwert (±

SD) 0a 0a 0a

Standardabw. 0 0 0 A:C p=1,0 min 0 0 0 max 0 0 0 B:C p= 1,0

1

n 8 9 8 A:B p= 1,0 Mittelwert 0 0 0,125

Standardabw. 0 0 0,354 A:C p= 0,317 min 0 0 0 max 0 0 1 B:C p= 0,289

2

n 8 9 8 A:B p= 0,289 Mittelwert 0,250 0 0

Standardabw. 0,707 0 0 A:C p= , 317 min 0 0 0 max 2 0 0 B:C p= 1,0

3

n 8 9 8 A:B p= 0,289 Mittelwert 0,125 0 0

Standardabw. 0,354 0 0 A:C p= 0,317 min 0 0 0 max 1 0 0 B:C p= 1,0

4

n 8 9 8 A:B p= 1,0 Mittelwert 0 0 0

Standardabw. 0 0 0 A:C p= 1,0 min 0 0 0 max 0 0 0 B:C p= 1,0

5

n 8 9 8 A:B p= 0,05 Mittelwert 0,250a 0b 0b


6

n 8 9 8 A:B p= 0,121 Mittelwert 0,125 0 0

Standardabw. 0,232 0 0 A:C p= 0,143 min 0 0 0 max 0,5 0 0 B:C p= 1,0

7

n 8 9 8 A:B p= 0,289 Mittelwert 0,063 0 0


8 - 21



WT DT104 = Wildtyp, DM = Deletionsmutante

Anhang

III

Tabelle 10. Klinischer Score des Durchfallerscheinens der Infektionsgruppen, S. Typhimurium DT104-Wildtyp, Deletionsmutante invC::aphT und Deletionsmutante sseD::aphT

Klinischer Score für das Durchfallgeschehen Tag nach der

Infektion Deskriptive

Statistik WT DT104

(A) DM-

invC::aphT (B) DM-

sseD::aphT (C) Signifikanzprüfung

zwischen den Gruppen

0


Standardabw. 0 0 0 A:C p=1,0 min 0 0 0 max 0 0 0 B:C p= 1,0

1

n 8 9 8 A:B p= 0,155 Mittelwert 0,875 0,111 0

Standardabw. 1,246 0,333 0 A:C p= 0,064 min 0 0 0 max 3 1 1 B:C p= 0,346

2

n 8 9 8 A:B p= 0,001 Mittelwert 1,375 0 0


3

n 8 9 8 A:B p= 0,174 Mittelwert 0,750 0 0,111

Standardabw. 1,165 0 0,333 A:C p= 0,064 min 0 0 0 max 3 0 1 B:C p= 0,346

4

n 8 9 8 A:B p= 0,024 Mittelwert 1,250 0,111 0,125

Standardabw. 1,280 0,333 0,354 A:C p= 0,034 min 0 0 0 max 3 1 1 B:C p= 0,931

5

n 8 9 8 A:B p= 0,016 Mittelwert 1,875 0,111 0


6

n 8 9 8 A:B p= 0,018 Mittelwert 1,375 0,056 0

Standardabw. 1,302 0,167 0 A:C p= 0,010 min 0 0 0 max 3,0 0,5 0 B:C p= 0,346

7

n 8 9 8 A:B p= 0,020 Mittelwert 1,250 0,111 0

Standardabw. 1,165 0,333 0 A:C p= 0,010 min 0 0 0 max 3,0 1 0 B:C p= 0,346

8

n 8 9 8 A:B p= 0,289 Mittelwert 0,250 0 0


WT DT104 = Wildtyp, DM = Deletionsmutante Fortsetzung nächste Seite

Anhang

IV

Tag nach der

Infektion Deskriptive Statistik WT DT104 (A)

DM-invC::aphT

(B)

DM-sseD::aphT

(C)


9

n 8 9 8 A:B p= 0,289 Mittelwert 0,125 0 0


10

n 8 9 8 A:B p= 0,289 Mittelwert 0,125 0 0,188

Standardabw. 0,354 0 0,530 A:C p= 0,927 min 0 0 0 max 1 0 1,5 B:C p= 0,289

11

n 8 9 8 A:B p= 0,289 Mittelwert 0,125 0 0


12

n 8 9 8 A:B p= 0,289 Mittelwert 0,063 0 0


13

n 8 9 8 A:B p= 0,289 Mittelwert 0,063 0 0


14

n 8 9 8 A:B p= 0,271 Mittelwert 0,250 0,111 0


15

n 8 9 8 A:B p= 0,346 Mittelwert 0 0,222 0

Standardabw. 0 0,667 0 A:C p= 1,0 min 0 0 0 max 0 2 0 B:C p= 0,346

16 - 21




Anhang

V

Tabelle 11. Die Mittelwerte der Gesamtleukozytenzahl (103/mm3) der Infektionsgruppen, S. Typhimurium DT104-Wildtyp, invC::aphT- und sseD::aphT-Deletionsmutanten

Tabelle 12. Die Mittelwerte der relativen Lymphozytenzahlen der Infektionsgruppen, S. Typhimurium DT104-Wildtyp, invC::aphT- und sseD::aphT-Deletionsmutanten in Prozent

Tag nach der

Infektion

WT DT 104 n

Mittelwert ± s

DM-invC::aphT n

Mittelwert ± s

DM-sseD::aphT n

Mittelwert ± s

0 8 66,8 ± 15,7A,a

9 47,4 ± 15,3A,B,a,b

8 43,0 ± 14,5B,b

3 8 47,3 ± 14,7b

8 36,9 ± 12,7b

8 45,4 ± 12,2b

7 8 35,0 ± 8,9B,b

9 60,8 ± 16,6A,a

8 42,6 ± 10,4B,b

10 8 36,8 ± 10,1b

9 54,0 ± 14,1a,b

8 48,1 ± 17,5b

14 8 37,8 ± 8,0b

9 50,1 ± 19,0b

8 48,4 ± 17,8a,b

17 8 47,5 ± 9,0B,b

9 56,1 ± 11,9B,a,b

8 71,9 ± 7,5A,a

21 8 48,4 ± 5,7B,b

6 46,2 ± 15,3B,a,b

7 71,7 ± 13,5A,a

A –C = Werte unterscheiden sich signifikant (P≤0,05) in Zeilen a – c = Werte unterscheiden sich Signifikant (P≤0,05) in Spalten


Tag nach der

Infektion

WT DT 104 n

Mittelwert ± s

DM-invC::aphT n

Mittelwert ± s

DM-sseD::aphT n

Mittelwert ± s

0 8

8,0 ± 2,1C,c 9

16,1 ± 3,1A 8

13,9 ± 2,7A,B,a,b,c

3 8

15,3 ± 3,5a,b 8

19,7 ± 5,8 8

19,5 ± 4,0a

7

8 18,1 ±4,0a,b

9 20,7 ± 5,5

8 15,2 ± 3,9a,b

10

8 20,1 ± 5,1a

9 20,3 ± 7,4

8 15,3 ± 2,8a,b

14

8 17,6 ± 3,9A,B,a,b

9 25,6 ± 10,4A

8 12,0 ± 2,3C,b,c

17

8 15,7 ± 0,8A,B,a,b

9 22,8 ± 8,2A

8 12,9 ± 3,0B,b,c

21

8 14,6 ± 1,3b

6 14,4 ± 7,4A,B

7 9,9 ± 2,6B,c

A –C = Werte unterscheiden sich signifikant (P≤0,05) in Zeilen a – c = Werte unterscheiden sich Signifikant (P≤0,05) in Spalten


Anhang

VI

Tabelle 13. Die Mittelwerte der relativen Zahlen der neutrophilen stabkernigen Granulozyten der Infektionsgruppen, S. Typhimurium DT104-Wildtyp, invC::aphT- und sseD::aphT-Deletionsmutanten in Prozent

Tag nach der

Infektion

WT DT 104 n

Mittelwert ± s

DM-invC::aphT n

Mittelwert ± s

DM-sseD::aphT n

Mittelwert ± s

0 8 0,9 ± 1,4b

9 1,8 ± 1,3

8 1,8 ± 1,3a

3 8 4,6 ± 3,0A,a

8 1,9 ± 1,9A,B,

8 1,0 ± 0,9B,a,b

7 8 1,1 ± 0,6b

9 1,7 ± 2,5

8 0,5 ± 0,8a,b

10 8 1,1 ± 0,6b

9 2,2 ± 2,7

8 0,5 ± 1,1a,b

14 8 1,5 ± 1,3b

9 0,8 ± 0,8

8 1,3 ± 1,1a,b

17 8 1,5 ± 1,2b

9 1,8 ± 1,8

8 1,0 ± 0,9a,b

21 8 2,3 ± 2,1a,b

6 1,2 ± 1,2

7 0,1 ± 0,4b

A – C = Werte unterscheiden sich Signifikant (P≤0,05) in Zeilen a – c = Werte unterscheiden sich Signifikant (P≤0,05) in Spalten


Tabelle 14. Die Mittelwerte der relativen Zahlen der neutrophilen segmentkernigen Granulozyten der Infektionsgruppen, S. Typhimurium DT104-Wildtyp, invC::aphT- und sseD::aphT-Deletionsmutanten in Prozent

Tag nach der

Infektion

WT DT 104 n

Mittelwert ± s

DM-invC::aphT n

Mittelwert ± s

DM-sseD::aphT n

Mittelwert ± s

0 8 22,6 ± 13,8B,b

9 45,0 ± 15,3A,

8 46,4 ± 12,5A,a

3 8 40,5 ± 16,9a,b

8 55,5 ± 9,7

8 49,1 ± 11,5a

7 8 54,9 ± 11,7A,a

9 33,8 ± 16,3B

8 52,1 ± 8,8A,a

10 8 54,0 ± 10,1a

9 37,1 ± 15,5

8 46,8 ± 17,1a

14 8 53,4 ± 7,8a

9 45,4 ± 17,9

8 41,0 ± 14,2a,b

17 8 41,4 ± 8,7A,a

9 34,2 ± 11,4A,B

8 23,6 ± 7,4B,b

21 8 39,3 ± 7,0A,B,a,b

6 47,7 ± 14,7A

7 24,1 ± 12,4B,b



Anhang

VII

Tabelle 15. Die Mittelwerte der relativen Zahlen der eosinophilen Granulozyten der Infektionsgruppen, S. Typhimurium DT104-Wildtyp, invC::aphT- und sseD::aphT-Deletionsmutanten in Prozent

Tag nach der

Infektion

WT DT 104 n

Mittelwert ± s

DM-invC::aphT n

Mittelwert ± s

DM-sseD::aphT n

Mittelwert ± s

0 8

2,8 ± 2,3a,b 9

1,2 ± 1,4 8

1,1 ± 1,0 3 8

0,75 ± 0,7b 8

2,3 ± 1,5 8

1,3 ± 1,3

7 8

2,9 ± 2,0A,a,b 9

0,6 ± 0,7B 8

1,4 ± 1,1A,B

10 8

1,6 ± 1,6a,b 9

1,0 ± 0,9 8

1,5 ± 1,3

14 8

3,5 ± 1,4A,a 9

0,9 ± 0,9B 8

1,0 ± 1,2B

17

8 2,3 ± 1,7A,a,b

9 0,9 ± 1,6A,B

8 0,4 ± 0,5B

21

8 2,8 ± 1,8a,b

6 2,3 ± 2,1

7 1,1 ± 1,4



Tabelle 16. Die Mittelwerte der relativen Monozytenzahlen der Infektionsgruppen, S Typhimurium DT104-Wildtyp, invC::aphT- und sseD::aphT-Deletionsmutanten in Prozent

Tag nach der

Infektion

WT DT 104 n

Mittelwert ± s

DM-invC::aphT n

Mittelwert ± s

DM-sseD::aphT n

Mittelwert ± s

0 8 6,75 ± 4,1

9 4,6 ± 1,3a,b

8 7,5 ± 3,2a

3 8 6,8 ± 3,6

8 3,5 ± 1,3b

8 3,3 ± 1,4b

7 8 6,0 ± 3,0

9 3,2 ± 1,8b

8 3,4 ± 1,6b

10 8 6,5 ± 3,2A

9 5,4 ± 2,5A,B,a,b

8 3,1 ± 1,5B,b

14 8 3,5 ± 1,9

9 2,8 ± 1,9b

8 5,3 ± 2,9a,b

17 8 6,5 ± 3,6A,B

9 6,9 ± 1,5A,a

8 3,1 ± 1,5B,b

21 8 6,75 ± 3,4A

6 2,7 ± 2,7B,b

7 2,7 ± 1,6B,b



Anhang

VIII

Tabelle 17. Qualitativer Nachweis von S. Typhimurium DT104 in Faeces

Qualitativer Nachweis von S. Typhimurium DT104 in Faeces


Wildtyp DT104 n = 8 n (%)

DM-invC::aphT n = 9 n (%)

DM-sseD::aphT n = 8 n (%)

0 0 0 0 3 8 (100) 9 (100) 8 (100) 7 5 (63) 8 (89) 8 (100)

10 8 (100) 8 (89) 8 (100) 14 5 (63) 9 (100) 7 (88) 17 8 (100) 6 (67) 6 (75) 21 8 (100) 5 (56) 7 (88)


Tabelle 18. Qualitativer Nachweis von S. Typhimurium DT104 in untersuchten Organ- und Gewebeproben

Qualitativer Nachweis von S. Typhimurium DT104 in Organ- und Gewebeproben

WT DT104

n = 8 n (%)

DM-invC::aphT

n = 9 n (%)

DM-sseD::aphT

n = 8 n (%)

Tonsille 8 (100) 8 (89) 8 (100) Mandibular-Lnn. 8 (100) 9 (100) 8 (100)

Lungengwebe 5 (63)A 1 (11)B 3 (38)A,B

Lungen-Lnn. 4 (50) 1 (11) 4 (50) Lebergewebe 2 (25) 0 2 (25) Milzgewebe 0 0 1 (13)

Jejunalgewebe 5 (63)A 1 (11)B 6 (75)A

Ilealgewebe 8 (100) 5 (56) 8 (100) Colongewebe 8 (100) 9 (100) 8 (100)

Caecumgewebe 8 (100) 8 (89) 7 (88) Jejunal-Lnn. 4 (50) 5 (56) 7 (88)

Ileocaecal-Lnn. 8 (100) 7 (78) 8 (100) Colon-Lnn. 7 (88) 6 (67) 8 (100)

Muskelgewebe 2 (25) 2 (22) 1 (13) Gallenflüssigkeit 0 0 0

A – B = Werte unterscheiden sich signifikant (P≤0,05) in Zeilen. Lnn. = Lymphknoten, WT DT104 = Wildtyp, DM = Deletionsmutante

Anhang

IX

Tabelle 19. Quantitativer Nachweis von S. Typhimurium DT104-Infektionsstämme in untersuchten Organ- und Gewebeproben

Nachweisrate von S. Typhimurium im Gewebe [KbE/g]

Gewebe WT DT104

n = 8 Mittelwert ± s

DM-invC::aphT n = 9

Mittelwert ± s

DM-sseD::aphT n = 8

Mittelwert ± s To 5,07E+05 ± 8,70E+05A 5,53E+04 ± 7,04E+04B 1,53E+06 ± 2,88E+06A MaLy 0A 0B 1,00E+02 ± 1,00E+02A

Je 0 0 3,33E+01 ± 6,17E+01 IL 1,78E+03 ± 4,68E+03 0 1,02E+04 ± 2,88E+04 Co 2,33E+02 ± 4,82E+02 1,48E+02 ± 4,44E+02 3,33E+01 ± 9,43E+01 Ca 2,33E+02 ± 4,82E+02 3,87E+02 ± 7,66E+02 8,41E+02 ± 2,11E+03 JeLy 0B 0B 5,12E+02 ± 8,13E+02A

IcLy 1,67E+01 ± 4,71E+01B 1,78E+02 ± 5,33E+02B 8,15E+02 ± 6,18E+02A

CoLy 0 1,48E+01 ± 4,44E+01 5,00E+01 ± 6,90E+01 A –B = Werte Unterscheiden sich signifikant (P≤0,05) in Zeilen To = Tonsille; MaLy = Mandibularlymphknoten; Je = Jejunalgewebe; IL = Ilealgewebe; Co = Kolongewebe; Ca = Zäkumgewebe; JeLy = Jejunallymphknoten; IcLy = Ileozäkallymphknoten; CoLy = Kolonlymphknoten, WT DT104 = Wildtyp, DM = Deletionsmutante Bei den nicht aufgeführten Gewebeproben aus dem Probespektrum konnte kein Nachweis erfolgen.

Anhang

X

Tabelle 20. Quantitativer Nachweis der S. Typhimurium DT104-Infektionsstämme in Organ- und Gewebeproben mit der dazugehörigen deskriptiven Statistik und Signifikanzprüfung

Nachweisrate von S. Typhimurium im Gewebe [KbE/g]

Gewebe Deskriptive Statistik WT DT104 (A)

DM-invC::aphT

(B)

DM-sseD::aphT

(C)

Signifikanzprüfung zwischen den

Gruppen

To

n 8 9 8 A:B p= 0,136 Mittelwert 5,07E+05 5,53E+04 1,53E+06

Median 1,86E+05 2,79E+04 3,81E+05 Standardabw. 8,70E+05 7,04E+04 2,88E+06

A:C p= 0,529 min 0 0 3,64E+02 max 2,56E+06 1,81E+05 8,48E+06

25 1,65E+04 2,00E+02 4,48E+04 B:C p= 0,034 Perzentile 50 1,86E+05 2,79E+04 3,81E+05

75 6,77E+05 1,12E+05 1,51E+06

MaLy

n 8 9 8 A:B p= 1,0 Mittelwert 0 0 1,00E+02

Median 0 0 0 Standardabw. 0 0 1,85E+02

A:C p= 0,064 min 0 0 5,33E+02 max 0 0 0

25 0 0 0 B:C p= 0,050 Perzentile 50 0 0 0

75 0 0 1,33E+02

Je


Median 0 0 0 Standardabw. 0 0 6,17E+01

A:C p= 0,143 min 0 0 0 max 0 0 1,33E+02

25 0 0 0 B:C p= 0,121 Perzentile 50 0 0 0

75 0 0 1,00E+02

IL

n 8 9 8 A:B p= 0,122 Mittelwert 1,78E+03 0 1,02E+04

Median 0 0 0 Standardabw. 4,68E+03 0 2,88E+04

A:C p= 0,644 min 0 0 0 max 1,33E+04 0 8,13E+04

25 0 0 0 B:C p= 0,289 Perzentile 50 0 0 0

75 7,00E+02 0 0

Co


Median 0 0 0 Standardabw. 4,82E+02 4,44E+02 9,43E+01

A:C p= 0,441 min 0 0 0 max 1,33E+03 1,33E+03 2,67E+02

25 0 0 0 B:C p= 1,0 Perzentile 50 0 0 0

75 4,00E+02 0 0 Fortsezung nächste Seite

Anhang

XI

Gewebe Deskriptive Statistik

WT DT104 (A)

DM-invC::aphT (B)

DM-sseD::aphT

(C)


Ca


Median 0 0 0 Standardabw. 4,82E+02 7,66E+02 2,11E+03

A:C p= 0,469 min 0 0 0 max 1,33E+03 2,13E+03 6,06E+03

25 0 0 0 B:C p= 0,589 Perzentile 50 0 0 6,67E+01

75 4,00E+02 6,73E+02 3,33E+02

JeLy


Median 0 0 6,67E+01 Standardabw. 0 0 8,13E+02

A:C p= 0,027 min 0 0 0 max 0 0 2,30E+03

25 0 0 0 B:C p= 0,020 Perzentile 50 0 0 6,67E+01

75 0 0 8,82E+02

IcLy


Median 0,00 0 5,64E+02 Standardabw. 4,71E+01 5,33E+02 6,81E+02

A:C p= 0,001 min 0 0 1,33E+02 max 1,33E+02 1,60E+03 1,94E+03

25 0 0 2,67E+02 B:C p= 0,003 Perzentile 50 0 0 5,64E+02

75 0 0 1,48E+03

CoLy

n 8 9 8 A:B p= 0,346 Mittelwert 0 1,48E+01 5,00E+01

Median 0 0 0 Standardabw. 0 4,44E+01 6,90E+01

A:C p= 0,063 min 0 0 0 max 0 1,33E+02 1,33E+02

25 0 0 0 B:C p= 1,0 Perzentile 50 0 0 0

75 0 0 1,33E+02 To = Tonsille; MaLy = Mandibularlymphknoten; Je = Jejunalgewebe; IL = Ilealgewebe; Co = Kolongewebe; Ca = Zäkumgewebe; JeLy = Jejunallymphknoten; IcLy = Ileozäkallymphknoten; CoLy = Kolonlymphknoten, WT DT104 = Wildtyp, DM = Deletionsmutante

Anhang

XII

Tabelle 21. Positiver Nachweis von S. Typhimurium DT104-Wildtyp in untersuchten Organ- und Gewebeproben

Nachweis von S. Typhimurium DT104-Wildtyp in Organ- und Gewebeproben

Kulturelle Untersuchungen PCR-Untersuchungen

n (%) n (%)

Tonsille 8 (100) 8 (100) Mandibular-Lnn. 8 (100) 8 (100)

Lungengwebe 5 (63) 5 (63) Lungen-Lnn. 4 (50) 4 (50) Lebergewebe 2 (25) 2 (25) Milzgewebe 0 0

Jejunalgewebe 5 (63) 5 (63) Ilealgewebe 8 (100) 8 (100)

Colongewebe 8 (100) 8 (100) Caecumgewebe 8 (100) 8 (100)

Jejunal-Lnn. 4 (50) 4 (50) Ileocaecal-Lnn. 8 (100) 8 (100)

Colon-Lnn. 7 (88) 7 (88) Muskelgewebe 2 (25) 2 (25)

Gallenflüssigkeit 0 0 Positiver Befund für jeweiliges Verfahren. Lnn. = Lymphknoten

Anhang

XIII

Tabelle 22. Positiver Nachweis von S. Typhimurium DT104 invC::aphT-Mutante in untersuchten Organ- und Gewebeproben

Nachweis von S. Typhimurium DT104 invC::aphT-Mutante inOrgan- und Gewebeproben

Kulturelle Untersuchung PCR-Untersuchung

n (%) n (%)


Lungengwebe 1 (11) 1 (11) Lungen-Lnn. 1 (11) 1 (11) Lebergewebe 0 0 Milzgewebe 0 0






Anhang

XIV

Tabelle 23. Positiver Nachweis von S. Typhimurium DT104 sseD::aphT-Mutante in untersuchten Organ- und Gewebeproben

Nachweis von S. Typhimurium DT104 sseD::aphT-Mutante in Organ- und Gewebeproben

Kulturelle Untersuchung PCR-Untersuchung

n (%) n (%)


Lungengwebe 3 (38) 3 (38) Lungen-Lnn. 4 (50) 4 (50) Lebergewebe 2 (25) 2 (25) Milzgewebe 1 (13) 1 (13)






Danksagung

10 DANKSAGUNG Im Anschluss an meine Arbeit möchte ich all jenen, die mit Worten und Taten zum gelingen dieser Arbeit beigetragen haben, ganz herzlich danken. Insbesondere danke ich:

• Herrn Prof. Dr. Dr. A. Hensel für die Überlassung dieses sehr interessanten Themas, für seine Betreuung und für die fachliche Unterstützung bei der Anfertigung dieser Arbeit.

• Herrn. Prof. Dr. U. Rösler möchte ich mich ebenfalls für die Unterstützung bei der

Durchführung der Versuche und für die fachliche Hilfe jeglicher kritischer Phasen der Laborarbeit bzw. Auswertung, sowie für die freundliche Begleitung der Arbeit bedanken.

• Weiterhin danke ich Herrn Prof. Dr. U. Truyen für die Unterstützung während meiner

Zeit am Institut.

• Herrn Prof. Dr. A. Sobiraj für die Unterstützung und für das entgegengebrachte Vertrauen.

• Dr. T. Arnold für die Beantwortung aller offenen Fragen rund um die PCR und die

stets gewährte freundschaftliche Unterstützung.

• Dr. T. Herold für die stets aufmunternde Worte und die ständige Unterstützung in allen Bereichen.

• Allen an den Infektionsversuchen beteiligten Doktoranden des Instituts für

Tierhygiene und Öffentliches Veterinärwesen, bestehend aus: Peter Burger, Steffi Brumme, Eugénie Zeeuw, Steffi Mauer, Melanie Hassel und Katharina Monig.

• Evelin Brumme und Nadja Leinecker für die tatkräftige und stets gewährte Hilfe im

Labor.

• Allen Angehörigen des Instituts für Tierhygiene und Öffentliches Veterinärwesen für die Ständige Unterstützung jeglicher Art.

• Familie Kauffold für die Freundschaft, die großartige Unterstützung, das

entgegengebrachte Vertrauen und die stets gewährte Hilfe.

• Reinhard Willig und Lydia Hildebrandt für die Freundschaft und die Unterstützung jeglicher Art.

• Meinen Eltern und meiner Freundin Almut Prkno für ihre unermüdliche Geduld und

allseits gewährte Unterstützung.

• Allen anderen ungenannten Personen, die mit Worten und Taten zum gelingen dieser Arbeit geholfen haben.

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