PCR basierte- Detektionstechniken Mi21 Martina Jahn 08.02.20162.

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PCR basierte-Detektionstechniken

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Anwendung

Anwendung

• 1. Forensische Analysen DNA- Abstammungsanalysen (Vaterschaftstests, Kriminalistik)

• 2. Mikrobielle Gemeinschaften: Biofilme, medizinische Mikrobiologie

• 3. Gentechnisch hergestellte Lebensmittel

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Anwendung

• minimale Mengen an DNA ausreichend

• zeitsparend

• schneller Überblick

• kulturunabhängig

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• Strangtrennung durch kurzzeitiges Erhitzen der DNA auf 95°C

• Hybridisierung der Primer bei spezifischer Annealingtemperatur

• DNA-Synthese bei 72°C durch eine hitzeresistente DNA-Polymerase

Kary B. MullisNobelpreis 1993

PCR- Methode (http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/pcr.html)

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Sequenzierung von PCR-Fragmenten nach Sanger

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Frederic SangerNobelpreis für Chemie1980

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1. Humane Anwendungen

• DNA-Abstammungsanalysen

• Forensische Analysen

• Ahnenforschung

• (Analyse fossiler DNA)

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„Fingerprinting“ bei Menschen

WS 10/11

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• Tandem-Repeat-Polymorphismen durch repetitive Cluster charakterisiert

• in nicht-kodierenden Bereichen der DNA (Introns, Pseudogene).

• co-dominante Vererbung

• Short Tandem Repeats (STR) • Variable Number of Tandem Repeats (VNTR)• Fragmentlängen-Analyse

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Forensic

46 Chromosomen (Mensch)

Genorte (Stand 2011): D3S1358, TH01, D21S11, D18S51, Penta E, D5S818, D13S317, D7S820, D16S539, CSF1PO, Penta D, Amelogenin, vWA, D8S1179, TPOX und FGA

DNA-Abschnitte: Mikrosatelliten

1985-1989: meist VNTRsseit 1998: STRs

Wahrscheinlichkeit.2 Individuen = gleiche Anzahl von wiederholten Repeats: 1 zu mehreren Milliarden!!!

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DNA Abstammungsanalysen

Mikrosatelliten sind kurze Abschnitte der DNA, die in verschieden häufigen Wiederholungen vorliegen (Fragmentlängen-Analyse). Die Anzahl der Wiederholungen unterscheiden sich von Mensch zu Mensch, die Kombination des Musters dieser Wiederholungen sind einzigartig. Sie werden aber - zusammen mit dem gesamten Erbgut - von den Eltern an Ihre Kinder vererbt. Die Vererbung und die Vielfältigkeit (Polymorphie) der Mikrosatelliten machen Sie zu idealen Markern für eine genetische Abstammungsanalyse.

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Vaterschaftstest M Kindsmutter

K Kind

PV Putativvater

A B

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Eineiigige Zwillinge

??????????????• Fingerabdruck• Anatomisch• Genetisch• Krankheiten

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Eineiige Zwillinge

WS 14/15

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Unterscheiden sich eineiige Zwillinge?

• Anatomisch? Leberflecke (u.a.), Muttermale

• genetisch? Nein; epigenetisch verändertes Methylierungsmuster an DNA &Histon-AcetylierungenV(D)J-Regionen der T- & B-Lymphozytendes Immunsystems (adaptiveImmunsystem)

• Krankheiten/Allergien? Nicht zwingend

Nussallergie 65% (7% bei 2-eiigen)Asthma 20%

• Fingerabdruck: Papillarleisten ? Nein; (umweltfaktorische Ausnahmen)

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2. Mikrobiologische Anwendungen

• Identifizierung von Mikroorganismen in unterschiedlichen Habitaten

• Erregernachweis bei Infektionskrankheiten

• Phylogenetische Analysen

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Phylogentische Marker

• Ribosomale RNA (5S, 16S, 23S)

• Spezifische Gene (z.B. rpoN)

• Phospholipide, Fettsäuren

• Internal Transcribed Spacer Regions (ITS)

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16S rRNA

DNA Protein

• Strukturelle und katalytische Komponente der Ribosomen

• Hohe Kopienzahl

• Ca. 1.500 Basenpaare

Ribosom

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16S rRNA

23S und 5S rRNA

16S rRNA

Bakterielles 70S Ribosom

E. Coli 15.000

Thomas SteitzNobelpreis 2009X-stal structure ribosom

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16S rRNA

• Mutationen oft letal

• Konstanter Selektionsdruck

• Sekundärstruktur an vielen Stellen hochkonserviert

• Vergleich analoger variabler Bereiche

• Datenbanken

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Fingerprinting „Bakteriengemeinschaften“

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Analytik• Single-Strand Conformation Polymorphism (SSCP)*

• Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)*

• Temperature Gradient Gel Electrophoresis (TGGE)*

• Amplified rDNA Restriction Analysis (ARDRA)*

• Terminal Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismus (tRFLP)

* = gelbasierende Auftrennung der PCR-Amplifikate

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z. Bsp.: SSCP

• Unterscheidung von DNA-Molekülen derselben Länge aber unterschiedlicher Sequenz

• Auftrennung nach Sekundärstruktur der einzelsträngigen PCR Produkte

• DNA - Konformation ändert Laufverhalten

• Trennung in nicht-denaturierendem Polyacrylamidgel

• 5`- Primer trägt Phosphatrest

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Prinzip SCCP-Gel

G

C

G

G

+

-

A

T

T

T

+

-

Bakterium A Bakterium B

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Analytik SSCP Gel

Densiometrische Ableitung

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Datenanalyse - Profilvergleich

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3. Gentechnisch hergestellte Lebensmittel

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Vorraussetzungen zur Generierung einer gentechnisch veränderten

Pflanze

1. Kultivierung einer individuellen Pflanzenzelle (Protoplast oder Zellkultur)

2. Regenerierung zur vollständigen Pflanzenzelle aus Protoplasten oder Zellkultur

3. Änderung des Nucleus der Pflanzenzelle durch Insertion neuen genetischen Materials (DNAs)

- Plasmid mit Fremdgen über/in Agrobacterium- mechanisch, durch „gene gun“ Methode

Infizierte Maispflanze

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Insertion neuenGenetischen MaterialsÜberAgrobacterium

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Gene Gun

Alternative Methode der Gen Insertion – “Gene Gun”

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4.Screen nach transformierten Pflanzen– Antibiotika Resistenz:

Problem: Wie kann man von 1 bis 1000 Pflanzen die gentechnisch

veränderte erkennen?

Lösung: man koppelt die Antibiotika –Resistenz mit dem Gen, welches

genetisch entfernt wird

1. Kultivierung einer individuellen Pflanzenzelle (Protoplast oder Zellkultur)

2. Regenerierung zur vollständigen Pflanzenzelle aus Protoplasten oder Zellkultur

3. Änderung des Nucleus der Pflanzenzelle durch Insertion neuen genetischen Materials (DNAs)

- Plasmid mit Fremdgen über/in Agrobacterium- mechanisch, durch „gene gun“ Methode

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Gentechnisch veränderter Mais

Bt – Bacillus thuringiensis – ubiquitär vorkommendes Bakterium

Produziert Proteine (“crystal proteins”, Cry [>60]) welche selektiv bestimmte Gruppen von Insekten tötet- Magen toxins, müssen von Insekten gefressen werden um tödlich zu wirken- Proteine binden an Darmrezeptoren Insekt stoppt Nahrungsaufnahme/verhungert- seit 30 Jahren werden Bt Toxine als Pestizide in Mio to/Jahr auf Feldern versprüht

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„Corn Borer Impact“U.S. + Canada: > $1 Mrd per annum, Schaden und Kontrollkosten

D > 250.000 Euro

Maiszünsler (Ostrinia nubilalis), westliche Maiswurzelbohrer (Diabrotica virgifera)

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Gefahren durch Genmais?1. Potentielles Risiko für Menschen auf allergische Reaktionen?

- Toxizität der Cry Proteine für Menschen ≤ Null

- Cry1 – wird über Magensäure unschädlich für Menschen

degradiert

- Cry9 – moment. im Tier (Maus) Modell untersucht (bisher keine Tox.)

2. Tötlich für andere Insektenarten? (select. für Lepidopterane):

- Monarch Schmetterlinslarve

ja: Bt Toxin, aber Schmetterling

geht nicht auf Maispflanze

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Transgener Reis

Anbau + H2O Ist – H2O

Gewünscht – H2ORaipur Indien 2005

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Transgener Golden Reis

Gentechnisch verändert:Enthält ß Carotin, welches sich in Vitamin A umwandelt

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Gentomate

„ Anti-Matschtomate“1994 Flavr Savr Tomate: entwickelt in USA; von Monsanto auf dem Markt1997 mangels Nachfrage eingestellt

2010: indische Forscher: Tomaten haltbarer durch α-Mannosidase und ß-D-N-Acethylhexosaminidase die das WeichwerdenDer Tomaten inhibieren (für zusätzliche 30 Tage)

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Transgene Baumwolle

Ein oder mehrere Gene des Bodenbakteriums B. thuringiensis werden in die chromosomale DNA der Baumwollpflanze integriert → produzieren Toxine gegen Schädlinge (Käfer, Schmetterlinge, Zweiflügler, Baumwolleule

Transgene Baumwolle wurde 2009 in 12 Ländern angebaut: Argentinien (95%), Australien (95%), Brasilien (18%), Burkina Faso (29%), China (60%), Indien (89%), Kolumbien (31%, 2007), Mexiko (56,5%), Südafrika

(98%), USA (88%), Indonesien, und Costa Rica.

Baumwollkapselbohrer

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Warum die öffentliche Angst über Biotech Lebensmittel?

• Unwissenheit über die Technologie

• Fehlen verlässlicher Informationen

• Unwissenheit über genetisch eingebaute „Safeguards“

• Negative Medienpräsens und –meinung

• Opposition durch Aktivistengruppen

• Misstrauen der Industrie

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