PCR (polymerase chain reaction) - genome.tugraz.at (VO2).pdf · PCR-History • Erfunden 1983 von...

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Molekulare Diagnostik 1 Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Assoc. Prof. Dr. Juliane Bogner-Strauss PCR (polymerase chain reaction) Ist ein in vitro Verfahren zur selektiven Anreicherung von Nukleinsäure-Bereichen definierter Länge und definierter Sequenz aus einem Gemisch von Nukleinsäure-Molekülen (genomische DNA, cDNA (c…complementary) …..)
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  • Molekulare Diagnostik

    1Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Assoc. Prof. Dr. Juliane Bogner-Strauss

    PCR(polymerase chain reaction)

    Ist ein in vitro Verfahren zur selektiven Anreicherung von Nukleinsäure-Bereichen definierter Länge und definierter Sequenz aus einem Gemisch von Nukleinsäure-Molekülen (genomische DNA, cDNA (c…complementary) …..)

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    2Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Assoc. Prof. Dr. Juliane Bogner-Strauss

    PCR-History• Erfunden 1983 von Dr. Kary Mulles• Er erhielt 10 Jahre später den Nobelpreis für

    Chemie• Seit 1992 tausende Zitate in Publikationen • PCR hat extrem viele Anwendungsgebiete

    (Vaterschaftstest, Gerichtsmedizin, Krankheitsnachweise…..)

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    3Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Assoc. Prof. Dr. Juliane Bogner-Strauss

    Einsatzmöglichkeiten der PCR• Amplifikation von DNA Bereichen• cDNA-Klonierung und cDNA-Genbanken• DNA-Foot- & Fingerprinting• DNA-Sequenzierung• Gen-Diagnostik (genetische Erkrankungen)• Isolierung von DNA-Fragmenten• Markierung von DNA-Fragmenten• Mutagenisierung von DNA-Fragmenten

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    Prinzip PCR• Welche Nukleinsäuresequenz soll

    amplifiziert werden?• Welche DNA wird als Vorlage-Template

    verwendet (Genomische, cDNA…)• Primer setzen und suchen (Kriterien)• Temperaturprogramm wählen• DNA aus PCR Gemisch isolieren• Weiterverwendung der isolierten DNA

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    Primer setzen und suchen

    • Primer im Randbereich der zu amplifizierenden Sequenz setzen (5´- 3´Amplifikation)

    • Komplementär zu je einem Strang• Mit oder ohne Startcodon/Stopcodon• Wie lang sollen die Primer sein

    Schmelztemperatur berücksichtigen Verhältnis G:C zu A:T beachten!!

    • Sollen neue Schnittstellen kreiert werden?

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    PCR-Gemisch

    • Template DNA (100 ng cDNA, 500 ng genomische DNA)

    • Primer (10 µmolar)• DNA-Polymerase Taq (Bakt Thermus aquaticus)• dNTPs (Nukleosidtriphosphate)• PCR-Puffer• dd H2O• MgCl2 / DMSO (optional)

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    7Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Assoc. Prof. Dr. Juliane Bogner-Strauss

    Temperatur- und Zeitprogramm• Denaturieren zum Einzelstrang (94°C, 30 sec)• Anhybridisieren der Primer (Annealing, 30 sec)

    kommt auf die Schmelztemperatur der Primer an umso höher die Temperatur umso spezifischer das PCR-Produkt

    • Amplifizieren mittels DNA-Polymersase (72°C, 2-4 min)kommt auf Größe des Produkts an!!mittels hitzestabiler Taq-Polymerase(proof reading oder nicht?)

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    9Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Assoc. Prof. Dr. Juliane Bogner-Strauss

    Kontrolle und Isolierung der DNA aus PCR Gemisch

    • Wie groß ist das erwartete PCR-Produkt?• Welches Agarosegel verwendet man (meist 0,7-2%)?• Ist nur ein Produkt sichtbar oder mehrere?

    bei vielen Banden muß PCR nochmal und spezifischer gemacht werden

    • Ausschneiden der Spezifischen DNA-Bande aus dem Gel

    • Isolieren der DNA aus dem Gelstückchen (Kit)• Weiterverarbeitung der DNA (NB, Klonierung, etc)

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    Laufrichtung DNA auf Agarosegel

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    Agarosegel zur Auftrennung des PCR-Gemisches

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    Agarosegel zur Auftrennung des PCR-Gemisches

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