Phänotypische und molekulare Charakterisierung einer ... · Proteine, die durch Endocytose in die...

Universitt Hohenheim

Institut fr Physiologie und Biotechnologie der Pflanzen

Prof. Dr. Andreas Schaller

________________________________________________________

Phnotypische und molekulare

Charakterisierung einer Subtilase loss of

function Mutante in Arabidopsis thaliana ___________________________________________________________________________________________________

Diplomarbeit vorgelegt von:

Mathias Knappenberger

Studiengang Biologie

Fakultt Naturwissenschaften

Stuttgart-Hohenheim, im August 2004

Gewidmet meinen Eltern

II

Zusammenfassung

Das Genom von Arabidopsis thaliana weist 56 Gene fr Subtilasen auf, die einen

eigenen Klan innerhalb der Serinproteasen bilden. Die molekulare

Charakterisierung einiger pflanzlicher Subtilasen zeigt, das sie durch gezielte

Proteolyse wichtige Aufgaben bei Differenzierungsprozessen und

Abwehrreaktionen in der Pflanze bernehmen.

In dieser Arbeit erfolgte eine phnotypische und molekulare Charakterisierung der

Subtilase At4g21630 loss of function Mutante von Arabidopsis thaliana.

Mit Hilfe von Reportergenfusionen wurde die Promotoraktivitt von At4g21630,

ausschlielich in der Postfertilisationsphase der Embryonalentwicklung, in den

Zellen der Integumente, des Embryos und des Suspensors, nachgewiesen.

Phntoypisch zeigen at4g21630 Embryonen bis zum Globular-Stadium, sowie

juvenile und adulte at4g21630 Pflanzen keine sichtbaren morphologischen

Vernderungen, doch reagieren reife at4g21630 Samen der T2-Generation

whrend der Keimung insensitiv bzw. sensitiv auf die Anwesenheit von

exogenem ABA und GA im Vergleich zu wt Samen. Eine Reprimierung oder

Aktivierung der Promotoraktivitt durch die beiden Phytohormone im reifen

Samen war nicht feststellbar.

Der beobachtete Effekt auf die Samenkeimung scheint daher auf

Differenzierungsprozesse, die in der Postfertilisationsphase, im unreifen Samen

ablaufen zurckzufhren zu sein.

Die Ergebnisse der at4g21630 Samen der T2-Generation konnte mit frisch

geernteten Samen der T3-Generation nicht wiederholt werden, was darauf

hindeutet, dass die Nachreife der Samen hier zustzlich noch einen Effekt ausbt.

III

Inhaltsverzeichnis Seite

Zusammenfassung III

Inhaltsverzeichnis IV

Abkrzungsverzeichnis VIII

Abbildungsverzeichnis X

Diagramme XII

1 Einleitung 1 1.1 Einfhrung 1

1.2 Systematische Einteilung der Subtilasen 2

1.3 Biochemische Eigenschaften von Subtilasen 4

1.4 Proteinaufbau 6

1.5 Funktion von Subtilasen 8

1.6 Zielsetzung der Arbeit 9

2 Material und Methoden 11 2.1 Material 11

2.1.1 Verwendete Organismen 11

2.1.1.1 Pflanzen 11

2.1.1.2 Bakterienstmme 11

2.1.2 Vektoren 11

2.1.3 Oligonukleotide 12

2.1.4 Chemikalien, Enzyme und Verbrauchsmaterialien 14

2.1.5 Laborgerte 17

2.1.6 Puffer und Lsungen 18

2.1.6.1 Oberflchensterilisation von Samen 18

2.1.6.2 DNA-Miniprp aus Bakterien 18

IV

2.1.6.3 Gelelektrophorese 18

2.1.6.4 Genomische DNA-Isolierung aus Pflanzen 19

2.1.6.5 RNA-Isolierung 20

2.1.6.5.1 RNA-Isolierung aus Samen 20

2.1.6.5.2 RNA-Isolierung aus Bltenmaterial 20

2.1.6.6 Lsungen fr Dnnschnitte 20

2.1.7 Medien und Sonstiges 21

2.2 Methoden 23

2.2.1 Anzucht der Pflanzen, Behandlung, Ernte 23

2.2.1.1 Anzucht der Pflanzen 23

2.2.1.1.1 Anzucht der Pflanzen im Gewchshaus 23

2.2.1.1.2 Anzucht der Pflanzen auf Agar-Platten 23

2.2.1.3 Keimungsassays 24

2.2.1.4 Genetische Analyse der Segregationspopulation 24

2.2.2 Pflanzentransformation von Arabidopsis thaliana 24

2.2.3 Molekularbiologische Methoden 25

2.2.3.1 Agrobakterien und Escherichia coli 25

2.2.3.1.1 Transformation von Bakterien 25

2.2.3.1.2 Gewinnung von Plasmid-DNA 26

2.2.3.2 DNA-Agarosegelelektrophorese 26

2.2.3.3 Verdau der DNA 27

2.2.3.4 Vektorkonstruktion 28

2.2.3.4.1 Ligation der amplifizierten DNA

Fragmente in den pCR-2.1Topo Vektor 28

2.2.3.4.2 Ligation der DNA-Fragmente in den

Transformationsvektor pGreen0029 28

2.2.3.4.3 Analyse der Ligationsprodukte durch

Restriktionsverdau der Plasmid-DNA 30

2.2.3.5 DNA-Sequenzierung 30

2.2.3.6 Isolierung genomischer DNA aus Pflanzen 30

2.2.3.7 RNA-Isolierung 31

2.2.3.7.1 RNA-Isolierung aus Samen 31

V

2.2.3.7.2 RNA-Isolierung aus Bltenmaterial 32

2.2.3.7.3 RNA-Isolierung mit TRIzolReagent 32

2.2.3.8 Polymerase-Ketten-Reaktion 33

2.2.3.9 Reverse-Transkription 34

2.2.3.10 Histochemischer GUS-Test 34

2.2.3.11 Dnnschnitte 34

2.2.3.12 Samen Frbung 35

2.2.3.12.1 Rutheniumrot Frbung 35

2.2.3.12.2 Vanillin Assay 35

2.2.3.12.3 Tetrazolium Assay 35

3 Resultate 36 3.1 Genomischer Aufbau von At4g21630 36

3.2 Segregationsanalyse 37

3.3 T-DNA-Lokalisation 40

3.4 Transkriptanalyse in den homozygoten T-DNA-Insertionslinien 42

3.5 Phnotypische Analyse 44

3.5.1 Keimungsassay mit ABA 44

3.5.2 Keimungsassay mit GA 48

3.6 Charakterisierung der Samenschale 51

3.7 Expressionsanalyse mit Hilfe der RT-PCR 53

3.7.1 RT-PCR mit RNA aus Samen 53

3.7.2 RT-PCR mit RNA von unterschiedlichen Entwicklungs-

stadien und Geweben 54

3.7.3 Expressionsanalyse von At4g21640 und At4g21650 56

3.8 GUS-GFP-Lokalisation 57

3.8.1 Sequenzierungsergebnisse der Vektorkonstruktion 58

3.8.2 GFP-Lokalisation 59

3.8.3 Identifizierung transformierter Samen 60

3.8.4 GUS-Lokalisation 62

3.8.5 Dnnschnitte GUS gefrbter Schoten und Blten 63

3.9 Morphologie von at4g21630 Embryonen 68

VI

VII

4 Diskussion 70

5 Ausblick 80

6 Literatur 82

7 Zitierte Internetseiten 92

8 Anhang 93

Abkrzungsverzeichnis


2,4-D 2,4-Dichlorphenoxyessigsure

C Grad Celsius

ABA Abscisinsure

Abb Abbildung

Amp Ampicillin

bp Basenpaare

cDNA complementary DNA

CTAB Cetyltrimethylammoniumbromid

CIP alkalische Phosphatase aus Klberdarm

Col Columbia

DEPC Diethylpyrocarbonat

DIC Durchlicht-Differentieller Interferenzkontrast

dNTP Desoxy-Nukleotidtriphosphat

DNA Desoxyribonukleinsure

DNase Desoxyribonuklease

DTT Dithiothreitol

EDTA Ethylendiamintetraessigsure

EGTA Ethylenglykol-bis-(2-aminoethylethyl)-tetra-essigsure

EtOH Ethanol

F Forward

g Erdbeschleunigung

g Gramm

GA Gibberellinsure

GABA -Aminobuttersure

Gent Gentamycin

GFP Green fluorescent Protein

HAF Hours after flowering

IPTG Isopropyl--D-1-thiogalactopyranosid

Kan Kanamycin

kb Kilobasenpaare

VIII


IX

Konz. Konzentration

LB Left Border

M molar (mol/Liter)

min Minute(n)

mRNA Messenger-RNA

PCR Polymerase Kettenreaktion

PPT Phosphinothricin

R Reverse

RB Right Border

Rif Rifampicin

RNA Ribnukleinsure

RNase Ribonuklease

RT Raumtemperatur

RT-PCR Reverse Transkription-PCR

s Sekunden

SDS Natriumdodecylsulfat

TAE Tris/Acetat/EDTA

TSS Transcription start site

TTC 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid

Tween20 Polyoxyethylensorbitanmonolaurat

U Enzymeinheiten

N ber Nacht

verd. verdnnt

Vol. Volumen

wt Wildtyp

X-Gal 5-bromo-4-chloro-Indoxyl--D-galactosid

X-Gluc 5-bromo-4-chloro-3-Indolylglucuronid

Abbildungsverzeichnis


Abb. 1: Schematische Darstellung der Klassifizierung von Serinproteasen

im Klan SB nach der Proteindantenbank MEROPS

Abb. 2: Phylogenetischer Stammbaum der Subtilasen in Arabidopsis auf

Basis abgeleiteter Aminosuresequenz

Abb. 3: Reaktionsmechanismus einer Serinprotease

Abb. 4: Schematischer Aufbau einer pflanzlichen Subtilase

Abb. 5: Vektor pGreen0029 mit dem Fusionsgen GUS-GFP

Abb. 6: Konstruierter Transformationsvektor pGreen0029 mit dem

Promotor von At4g21630, Nos-Terminator und dem Fusionsgen

GUS-GFP

Abb. 7: Genomischer Aufbau von At4g21630

Abb. 8: PCR-Analyseergebnis einer segregierenden T2-Population der Salk

127987-Linie

Abb. 9: PCR-Analyseergebnis einer segregierenden T2-Population der Sail

410_G07-Linie

Abb. 10: T-DNA-Insertion in der Sail 410_G07-Linie

Abb. 11: T-DNA-Insertion in der Salk 127987-Linie

Abb. 12: Anordnung der Primer fr RT-PCR

Abb. 13: Analyse der Expression von At4g21630 in den homozygoten T-

DNA-Insertionslinien

Abb. 14: Frbung der Samen mit Rutheniumrot

Abb. 15: RT-PCR-Analyse mit RNA aus Samen der T2-Generation der Sail

410_G07-Linie

Abb. 16: RT-PCR-Analyse der Expression von At4g21630 in

unterschiedlichen Entwicklungsstadien und in unterschiedlichen

Geweben

Abb. 17: Expressionsanalyse von At4g21640

Abb. 18: Expressionsanalyse von At4g21650

Abb. 19: Sequenz des klonierten Nos-Terminators

X


XI

Abb. 20: Promotorsequenz von At4g21630

Abb. 21: GFP-Lokalisation in Samen der T0-Generation

Abb. 22: Nachweis der T-DNA mit dem Promotor At4g21630 in den

transformierten Pflanzen der T1-Generation

Abb. 23: GUS-Lokalisation

Abb. 24: GUS-Lokalisation in der Schote

Abb. 25: GUS-Lokalisation im Embryo

Abb. 26: GUS-Lokalisation im Embryo

Abb. 27: GUS gefrbte Schote

Abb. 28: Dnnschnitt durch die Samenanlagen von loss of function

Pflanzen der Sail 410_G07 Linie

Abb. 29: Aufbau der Integumente im reifen Embryosack

Diagramme

Diagramme

Diagramm I: Vergleich Keimungsraten zwischen wt Samen und at4g21630

Samen der T2-Generation der Sail 410_G07-Linie auf MS-Medium

mit 5M ABA.

Diagramm II: Vergleich Keimungsraten zwischen wt Samen und at4g21630

Samen der T2-Generation der Sail 410_G07-Linie auf MS-Medium

mit verschiedenen Konzentrationen von ABA.

Diagramm III: Vergleich Keimungsraten zwischen wt Samen und at4g21630

Samen der T2-Generation der Sail 410_G07-Linie auf MS-

Medium ohne Zustze.

Diagramm IV: Vergleich Keimungsraten zwischen wt Samen und at4g21630


Medium mit 1M GA.

Diagramm V: Vergleich Keimungsraten zwischen wt Samen und at4g21630


Medium mit verschiedenen Konzentrationen GA.

Diagramm VI: Vergleich Keimungsraten zwischen wt Samen und at4g21630

Samen der T3-Generation der Sail 410_G07-Linie auf MS

Medium mit 4M ABA.

Diagramm VI: Vergleich Keimungsraten zwischen wt Samen und at4g21630


Medium mit 1M GA.

XII

1. Einleitung Seite 1

1 Einleitung

1.1 Einfhrung

Die Proteolyse von Proteinen durch Endo- und Exoproteasen ist ein vielseitiger Mechanismus

der Zelle, der in gezielter Weise zur nderung von Struktur, Aktivitt, Funktion und

subzellulrer Verteilung von Proteinen eingesetzt wird. Anhand des Katalysemechanismus

differenziert man Serin-, Cystein-, Threonin-, Metall-, und Aspartatproteasen.

Regulatorisch bedeutsam ist vor allem die Reifung von Proteinen und der gezielte

Proteinabbau.

Proteine, die durch Endocytose in die Zelle gelangen, werden im Lysosom abgebaut. Der

lysosomale Abbauweg ist berwiegend unspezifisch, whrend die nicht-lysosomalen

Abbauwege den selektiven Abbau von Proteinen erlauben. Der am besten charakterisierte

nicht-lysosomale Abbauweg ist der Ubiquitin-Proteasom-Weg, in dem Proteine in einem 26S

Proteasom abgebaut werden, nachdem sie mit mehreren Moleklen Ubiquitin konjugiert

wurden.

Viele Proteine werden als inaktive Vorstufen gebildet und durch proteolytische Spaltung in

die aktive Form berfhrt. Beispiele dafr sind die Aktivierung von Verdauungsenzymen und

von Zymogenen der Blutgerinnungskaskade bei Sugern.

In Pflanzen wird das Polypeptid Systemin wahrscheinlich durch das 50-kDa SBP50 Protein

gespalten. SBP50 wird durch Antiserum, das gegen Proproteinkonvertasen (PCs) von

Drosophila gerichtet ist, inhibiert. Diese Daten fhrten zu der Annahme, dass SBP50, wie die

tierischen Proproteinkonvertasen, eine Subtilisin-hnliche Serinprotease ist (Schaller et al.,

1994).

Durch diese Entdeckung, dem Vorkommen von insgesamt 628 Proteasen in Arabidopsis

thaliana und die wenigen Kenntisse ber ihre Funktionen, wurde das Interesse des Institutes

fr Physiologie und Biotechnologie der Pflanzen an der Universitt Hohenheim fr die

pflanzlichen Subtilasen und ihre Substrate geweckt.


1.2 Systematische Einteilung der Subtilasen

Subtilasen sind Serinproteasen, die sowohl in Pro- als auch in Eukaryonten vorkommen. Der

Prototyp der Subtilasen ist Subtilisin Carlsberg, die erste Subtilase von der die Struktur und

Sequenz bekannt war, aus Bacillus licheniformis. Gem der MEROPS-Klassifikation

(http://merops.sanger.ac.uk/) gehren die Subtilasen zum SB-Klan, der wiederum in Familien

und Subfamilien unterteilt wird (Abb.1).

S8-Familie S53-Familie

S8A-Subfamilie S8C-SubfamilieS8B-Subfamilie

Pflanzliche Subtilasen

S1P, SK-1 und NARC-1

SB-Klan

Kexin und PCs

Abb. 1: Schematische Darstellung der Klassifizierung von von Serinproteasen im Kla SB nach der Proteindatenbank MEROPS (http://merops.sanger.ac.uk/)

Im Jahre 1988 konnte die erste eukaryontische Subtilase, die Kex2p-Protease von

Saccharomyces cerevisiae identifiziert werden (Fuller et al., 1988). Sie wird zusammen mit

Furin und sechs weiteren Proproteinkonvertasen (PCs) von Sugern zur S8B-Subfamilie

(Seidah, 2003) zugeordnet. Pflanzliche Subtilasen werden zur Pyrolysin-Gruppe innerhalb der

S8A-Familie zugeordnet (Siezen and Leunissen, 1996). Mitglieder der Familie der Pyrolysine

sind im Vergleich zu Kexin und den PCs nher mit dem prokaryontischen Subtilisin

verwandt. Prokaryontische Subtilasen sind fr die Degradation von Proteine verantwortlich,

whrend Kexin und PCs als Prohormonkonvertasen fungieren. Die Entdeckung des

Subtilisin/Kexin-Isozym 1 (SKI-1) (Seidah et al., 1999) und die Site-1-Protease (S1P)

(Sakai et al., 1998) in Sugern, die ebenfalls zur Gruppe der Pyrolysine zugeordnet werden,

bewies aber, dass auch Mitglieder der Gruppe der Pyrolysine als Proproteinkonvertasen

fungieren knnen.

SKI-1 spaltet das Protein pBDNF (pro-brain-derived neurotophic factor) (Seidah et al., 1999)

und S1P kontrolliert durch die Spaltung der Vorstufe von nSREBP (nuclear sterol regulatory

element binding protein) vermutlich den Lipidmetabolismus in tierischen Zellen (Sakai et al.,

http://merops.sanger.ac.uk/


1998). Im Jahre 1995 konnte durch berexpression der Proteinvorstufe von KP6, ein

Pilztoxin von Ustilago maydis, in Tabakzellen demonstriert werden, dass in pflanzlichen

Systemen Kex2p-hnliche Proteine vorkommen und in der Lage sind wie tierische

Prohormonkonvertasen zu fungieren. Die Vorstufe des KP6-Toxin wird in U. maydis durch

Kex2p zum reifen Protein prozessiert (Kinal et al., 1995). Tabakzellen sind ebenso in Lage,

das reife Protein zu bilden und mssen deshalb Kex2p hnliche Proteine besitzen. Weitere

Forschungen zeigten, dass die Vorstufe von KP6 durch eine Kex2p verwandte Protease im

Golgi-Apparat von Tabakzellen zum reifen Protein prozessiert wird (Jiang and Rogers, 1999).

Das Genom von Arabidopsis thaliana weist die Sequenz von 56 Subtilasen auf, die von den

Arbeitsgruppen um Prof. Dr. Schaller und Prof. Dr. Altmann in sechs Subfamilien eingeteilt

wird (http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de/csbdb/dbcawp/psdb.html).

Abb. 2: Phylogenetischer Stammbaum der Subtilasen in Arabidopsis auf Basis abgeleiteter Aminosure-sequenzen (Rautengarten et al., eingereicht). In der Tomate konnten bisher 15 Subtilasen identifizert werden (Jorda et al., 1999; Jorda and

Vera, 1999), die in fnf Subfamilien gegliedert sind (Meichtry et al., 1999).

http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de/csbdb/dbcawp/psdb.html


1.3 Biochemische Eigenschaften von Subtilasen

Das charakteristische Merkmal der Serinproteasen ist das Vorkommen einer katalytischen

Triade aus rumlich benachbarten Seitenketten der Aminosuren Asparaginsure, Histidin

und Serin.

Die Substratspezifitt wird durch die Eigenschaften spezifischer Aminosure begrenzt, die

sich auf den Seitenketten befinden, die das aktive Zentrum umgeben.

Der Reaktionsmechanismus einer Serinprotease (Abb. 3) ist ein Wechselspiel zwischen der

Hydroxylgruppe des Serylrestes 195 (Chymotrypsin Nummerierung) mit dem benachbarten

Histidin 57. Dadurch wird die Hydroxylgruppe polarisiert und wird dadurch befhigt, die

Carbonylgruppe des Subtrates an der Spaltstelle des Peptids nucleophil anzugreifen. Das

entstehende Oxanion wird durch zwei NH-Gruppen des Peptidrckgrates stabilisiert. In der

nchsten Teilreaktion zerfllt das tetraedrische Zwischenprodukt unter Deprotonierung des N3

des Histidins 63 in das Acyl-Enzym-Zwischenprodukt. Der neue N-Terminus des

Spaltstckes lst sich vom Enzym ab. An seine Stelle tritt Wasser aus dem Lsungsmittel,

welches in der nchsten Reaktion die Esterbindung zwischen Serin 195 und dem neuen C-

Terminus spaltet (Lffler und Petrides, 2003).


Abb. 3: Reaktionsmechanismus einer Serinpeptidase von http://delphi.phys.univ-tours.fr/Prolysis/Images/mecaser.gif

In Subtilasen und im (Chymo)trypsin-Klan der Serinproteasen findet man unabhngig

voneinander ein aktives Zentrum gleicher Struktur, obwohl die Faltung der gesamten

Molekle vllig andersartig ist. Die Subtilasen und (Chymo)trypsine, eine weitere

Serinproteasefamilie, sind damit ein Beispiel fr konvergente Evolution (Dickerson und

Greis, 1971).

Charakteristisch fr pflanzliche Subtilasen ist ein Temperaturoptimum von ber 50C

(Yahmagata et al., 1994; Fontanini et al., 2002; Hamilton et al., 2004), Calcium-Abhngigkeit

(Tornero et al., 1996; Hamilton et al., 2003) und ein ungefhres Molekulargewicht von 70

kDA (Yamagata et al., 1994; Rudenskaya et al., 1998; Janzik et al., 1999; Fontanini et al.,

2002; Hamilton et al., 2004). Das pH-Optimum der meisten bisher charakterisierten

http://delphi.phys.univ-tours.fr/Prolysis/Images/mecaser.gifhttp://delphi.phys.univ-tours.fr/Prolysis/Images/mecaser.gif


Subtilasen liegt im alkalischen Bereich (Yamagata et al., 1994; Rudenskaya et al., 1998;

Bogacheva et al., 1999), was auf eine Lokalisation der Subtilasen im Zellinneren hinweist.

Nur wenige der bisher biochemisch untersuchten Subtilasen weisen ein Optimum der

proteolytischen Aktivitt bei pH 5,0 oder niedriger auf (Janzik et al., 2000; Hamilton et al.,

2003). Dieser niedrige pH-Wert ist ein Indiz fr die Lokalisation der Subtilasen im Apoplast

der Pflanzenzelle, da hier ein niedriger pH-Wert vorliegt.

Kexin und die Pro-Proteinkonvertasen der Subfamilie S8B aus Sugern spalten Proteine, die

ein Erkennungsmotiv (R/K)-(X)n-(K/R) aufweisen, wobei n fr 0, 2, 4, oder 6 und X fr jede

andere Aminosure auer Cys steht (Nakayama et al., 1997).

Pflanzliche Subtilasen zeigen hingegen kein spezielles Erkennungsmotiv. So spaltet die

pflanzliche Subtilase Cucumisin (Kaneda et al., 1975), die Insulin-B-Kette in vitro an acht,

die Subtilase Taraxalisin (Rudenskaya et al., 1998) sogar an neun verschiedenen Positionen.

Diese Daten deuten darauf hin, dass diese Subtilasen nur degenerative Fuktionen erfllen. Die

beiden Pyrolysin-Mitglieder S1P und SKI-1 in Sugern zeigen eine Spezifitt, die sich von

den Mitgliedern der Subfamilie S8B deutlich unterscheidet. Diese Proteasen spalten C-

terminal von Leu-, Thr- oder Asp-Resten (Seidah et al., 1998; Tour et al., 2000).

LeSBT1 spaltet Substrate, die entweder Gln oder Leu in der P1-Positon (Nomenklatur nach

Schechter und Berger, 1967) aufweisen (Janzik et al., 1999). Ara12, eine Subtilase von A.

thaliana, bevorzugt die hydrophoben Aminosuren Phe und Ala und die saure Aminosure

Asp an der P1-Position, whrend an der P1-Position keine spezifische Aminosure erkannt

wird (Hamilton et al., 2003).

Die Substraterkennung von LeSBT1 wird vermutlich nicht allein durch die Aminosure an P1-

Position definiert, sondern noch von anderen Aminosuren, die die Spaltstelle umgeben

(Janzik et al., 1999).

1.4 Proteinaufbau

Subtilasen bestehen aus vier funktionellen Domnen, Pr-, Pro, katalytische- und PA-

Domne.

Abb. 4: Schematischer Aufbau einer pflanzlichen Subtilase.

Signalpetid Prodomne

Katalytische Domne PA-Domme


Subtilasen werden als Prproproteine synthetisiert und durch Proteolyse der Pr- und

Prodomne zur aktiven Protease prozessiert (Beers et al., 2004). Die N-terminale Prdomne

stellt ein Signalpeptid dar, welches fr die Sekretion aus der Zelle via dem

endoplasmatischen Retikulum ntig ist. Die berwiegende Anzahl der untersuchten

Subtilasen in Pro- und Eukaryonten sind extrazellulr lokalisiert, nur wenige Subtilasen

konnten intrazellulr detektiert werden (Siezen and Leunissen, 1996), was bedeutet, dass die

Substrate von Subtilasen ebenso im extrazellulren Raum lokalisiert sein mssen.

Durch die nachfolgende Prodomne werden die Zymogene im inaktivem Zustand gehalten

und erst durch die Abspaltung der Prodomne wird die katalytische Domne aktiviert

(Yamagata et al., 1994). Die Prodomne der Proproteinkonvertasen von Sugern wird durch

eine intra-molekulare Reaktion gespalten und bleibt als kompetetiver Inhibitor nicht-kovalent

mit dem Enzym verbunden. Durch eine zweite Spaltung wird die Prodomne degradiert und

das aktive Enzym freigesetzt (Fugre et al., 2002).

Mglicherweise fungiert die Prodomne darber hinaus als intramolekulares Chaperon fr die

katalytische Domne, wie es fr Subtilisin E und anderen prokaryontischen Subtilasen gezeigt

werden konnte (Shinde et al., 1992).

Die PA-Domne, die eine selbststndige Domne innerhalb der katalytischen Domne

darstellt, findet man bisher nur bei Mitgliedern der pflanzlichen Subtilasen. Sie besteht aus ca.

120 Aminosuren (Luo et al., 2001). Die Proproteinkonvertasen von Sugern weisen keine

PA-Domne auf, sondern besitzen nach der katalytischen Domne eine P-Domne. Deren

Kristallstruktur lsst vermuten, dass sie whrend der Prozessierung des Proteins mit der

Prodomne interagiert (Brenner et al., 2003).

Als einzige Subtilase von A. thaliana besitzt At5g19660 keine PA-Domne, sondern enthlt

eine C-Terminale Transmembrandomne. Die Sequenz von At5g19660 zeigt eine nahe

Verwandtschaft zu S1P/SKI-1 von Sugern und nur eine entfernte bereinstimung mit allen

anderen Subtilasen von A. thaliana (Abb. 2).

Homologe PA-Domnen findet man auch bei funktionell nicht verwandten Proteinen wie

Metallproteinasen, Transferrinrezeptoren TR1 und TR2 von Sugern und auch bei

pflanzlichen Transmembranproteinen (Luo et al., 2001). Die Funktion der PA-Domne ist

noch nicht vollstndig geklrt, sie knnte eine Rolle bei Protein-Protein-Interaktionen oder

bei der Substratselektion spielen (Mahon et al., 2000, Lawrence et al., 1999).


1.5 Funktion von Subtilasen

ber die Funktion, Expression und subzellulre Lokalisation der PCs in Sugern gibt es

bedeutend mehr Informationen als ber pflanzliche Subtilasen. Substrate fr PCs sind

verschiedene Prohormone, Rezeptoren, Wachstumsfaktoren und virale Glykoproteine. Furin,

PC5-B und PC7 konnten im trans-Golgi-Netzwerk lokalisiert werden, whrend PC1, PC2 und

PC5-A in den skretorischen Granula von Zellen detektierbar sind (Seidah and Chrtien,

1997).

In den letzten Jahren wurden zahlreiche Subtilasen von Pflanzen isoliert, u.a. von Avena

sativa (Coffeen et al., 2004), Arabidopsis thaliana (Tanaka et al., 2001), Hordeum vulgare

(Fontanini et al., 2002), Lycopersicon esculentum (Meichtry et al., 1998), Taraxacum

officinale (Bogacheva et al., 1999), Lilie (Taylor et al., 1997) und der Sojabohne (Batchelor et

al., 2000). Die bisherigen Kenntnisse ber die Funktion von pflanzlichen Subtilasen weisen

daraufhin, dass sie wichtige Aufgaben und Funktionen whrend der Differenzierung von

Pflanzenzellen und der Pathogenabwehr bernehmen.

In Tomaten werden Mitglieder der Subtilasefamilie P69 durch Pflanzenpathogene induziert

(Tornero et al., 1996), die mRNA-Expression der Mitglieder P69B und P69C werden bei

Infektionen mit P. syringae verstrkt (Jord et al., 2000).

Die Expression von pflanzlichen Subtilasen kann zell- und entwicklungsspezifsch sein. So

konnte SCS1, eine Subtilase aus der Sojabohne, nur in der Samenschale detektiert werden

(Batchelor et al., 2000). Die Expression fr LIM9, eine extrazellulre Protease aus Lilium

longiflorum, ist am hchsten, wenn das Tetradenstadium bei der Mikrosporogenese erreicht

ist (Tylor et al., 1997) und die mRNA von ag12 wird nur in einem frhen Stadium der

Knllchenbildung bei Alnus glutinosa gebildet (Ribeiro et al., 1995).

In der Modellpflanze Arabidopsis thaliana konnte die zellspezifische Expression einiger

Subtilasen gezeigt und nachgewiesen werden, dass die Expression der Subtilasen At2g19170,

At4g34980 und At5g67360 gewebe- und entwicklungsspezifisch, durch Stressfaktoren

induziert wird (Golldack et al., 2002).

Die Morphologie der Stomataverteilung und Stomatadichte der sdd1-1 (stomatal density and

distribution) Mutante wird durch die Subtilase SDD1 (At1g04110) verursacht. SDD1 reguliert

die Anzahl der protodermalen Zellen, die Anzahl der asymmetrischen Teilungen der

Satellitenmeristemoide, die Bildung von Satellitenmeristemoiden und die Orientierung der

ersten asymmetrischen Teilung der Nebenzellen (Berger and Altmann, 2000).


ALE1 (abnormal leaf shape1; At1g6230) eine weitere Subtilase von A. thaliana wird bentigt

fr die Differenzierung der Epidermis und fr die Ausbildung der Kutikula im entwickelten

Embryo. Loss of function Pflanzen zeigen eine gestrte Morphologie der Epidermiszellen.

Eine durchgehende Ausbildung der Kutikula im entwickelten Embryo und in den Samen fehlt.

Diese morphologischen Strungen fhren zu einem extensiven Wasserverlust in juvenilen

Pflanzen (Tanaka et al., 2001).

Mit Hilfe eines Promotor-GUS-Konstruktes konnte gezeigt werden, dass die mRNA der

Subtilase AIR3 (At2g04160) in Zellen exprimiert wird, die an der Bildung von Seitenwurzeln

beteiligt sind (Neuteboom et al., 1998).

ber die endogenen Substrate, die von pflanzlichen Subtilasen prozessiert werden, ist sehr

wenig bekannt, obwohl in vitro gezeigt werden konnte, dass Pflanzen unspezifische

Substanzen, wie Glucagon oder synthetische Peptide hydrolysieren (Janzik et al., 1999;

Hamilton et al., 2003).

Man vermutet, dass SDD1 und ALE1 von den Zellen in den Apoplast sekretiert werden und

dort Signalmolekle durch proteolytische Spaltung aktivieren, die als Signal fr die

Differenzierung der Zellen bentigt werden. Die extrazellulre aber membran-assoziierte

Lokalisation von SDD1 ist im Einklang mit einer solchen Funktion (von Groll et al., 2002).

In Vertebraten sind verschiedene Peptide BMB4, BMP2 und BMP7 an der Epidermisbildung

beteiligt. In Xenopus Embryos wird BMP4 durch proteolytische Spaltung von

Proproteinconvertasen aktiviert (Tanaka et al., 2001). Bisher konnte aber in Arabidopsis

thaliana noch kein Substrat fr eine Subtilase identifiziert werden.

In Avena sativa wird die Proteolyse-Kaskade des Enzyms Ribulose-1,5-bisphosphat

Carboxylase/Oxygenase durch Serinproteasen katalysiert, die ebenfalls zur pflanzlichen

Subtilasefamilie gehren (Coffeen et al., 2004).

1.6 Zielsetzung der Arbeit

Die bisherigen Befunde deuten darauf hin, dass Subtilasen wichtige Funktionen bei

Abwehrreaktionen und Differenzierungsprozessen in Pflanzen besitzen. Um weitere

Informationen, auch im Rahmen des Arabidopsis thaliana Functional Genomics Project, ber

Subtilasen zu erhalten, beschftigen sich verschiedene Arbeitsgruppen intensiv mit der

Funktion und Substratidentifizierung von Subtilasen.

Im Rahmen dieser Arbeit soll die molekulare Charakterisierung der Subtilase At4g21630

erfolgen.

2. Material und Methoden Seite 10

2 Material und Methoden

2.1 Material

2.1.1 Verwendete Organismen

2.1.1.1 Pflanzen

Wildtyp-Samen ktoyp Col. von Arabidopsis thaliana stammen von Chris

Sommerville (Carnegie Institute, Stanford, USA).

Die Salk-T-DNA-Insertions-Linien, Salk 127987 und Salk 036863, (Alonso et al.,

2003) wurde ber NASC Arabidopsis Stock Center (www.nasc.nott.ac.uk/)

bezogen. Die Sail-T-DNA-Insertion-Linie, Sail 410_G07, (Sessions et al., 2002)

wurde von der Firma Syngenta (www.syngenta.com) bezogen.

2.1.1.2 Escherichia coli und Agrobakterium tumefaciens Stmme

Top10 Escherichia coli-Stamm fr Klonierung

F-mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC) 80lacZlacX74 recA1 araD139

(ara-leu)7697 galU galK rpsL endA1 nupG (Invitrogen One

Shot)

GV3101 Agrobakterium tumefaciens-Stamm fr Pflanzentransformation

(Hellens et al., 2000)

2.1.2 Vektoren

pSoup Tet-r; trfA; oriV; RepA;ColE1 ori (www.pgreen.ac.uk)

Vektor fr Pflanzentransformation via Agrobakterien. Ermglicht

pGreen-Replikation mit Hilfe des Repliaktionsproteins RepA

pMP90 Ti plasmid (Hellens et al., 2000)

pGreen Vektor fr Pflanzentransformation via Agrobakterien

http://nasc.nott.ac.uk/http://www.syngenta.com/


Transformiert wurde mit pGreen0029

pGreenII backbone: ColE1 ori; nptl; pSa-Ori

T-DNA: enthlt nos-kan, multiple cloning site (Hellens et al.,

2000)

In der mutiple cloning site befindet sich zwischen der KpnI- und

XhoI- Schnittstelle das 2544bp lange Funsionskonstrukt GUS-GFP

aus pCambia1303 (http://www.cambia.org/main/r_et_camvec.htm). BglI 1 StuI

pSA-ori GUS-GFP ColEI ori npt

PvuIBspIRBBspHI

nos-KanLB KpnI 1652 XhoISalI 4237ClaI 4247HindIII 4252EcoRV 4260EcoRI 4264

PstI 4274SmaI 4278Bam HI 4282SpeI 4288XbaI 4294NbtI 4301SacI 4322

T-DNA

BglI 1 StuI


PvuIBspIRBBspHI

nos-KanLB KpnI 1652 XhoISalI 4237ClaI 4247HindIII 4252EcoRV 4260EcoRI 4264

PstI 4274SmaI 4278Bam HI 4282SpeI 4288XbaI 4294NbtI 4301SacI 4322

T-DNA

Abb. 5: Vektor pGreen0029 mit dem Fusionsgen GUS-GFP. Die Grenzen der T-DNA sind rot gekennzeichnet. Das Selektionsgen Kanamycin wurde grn untermalt.

2.1 Topo NPT II; Amp; pUC ori; LacZ fragment; f1 origin; M13 forward (-

20) priming site; multiple cloning site; M13 reverse priming

site;T7 promotor/priming site (Invitrogen)

Vektor fr schnelle und effiziente Ligation von PCR-Produkten mit

T/A berhang.

2.1.3 Oligonukleotide

Im Folgenden sind die in dieser Arbeit verwendeten Primer aufgefhrt. Die

Angabe (+) oder (-) gibt an, ob die Strang- oder Gegenstrangsequenz zur

Herstellung des Primer verwendet wurde.


Primer fr die RT-Expression und DNA-Amplifiaktion von At4g21630,

At4g21640 und At4g21650. Primer Sequenz in 5 3-Orientierung Templat Hersteller

33-1362 CTGCAAAAGGTCTACTTCATGAA

ACCAAC

At4g21630(+) Qiagen

33-2587R TACGGTATAGAGTTGTATCGAGC

AAGAAG

At4g21630(-) Qiagen

33-452 AGCTTCTATACCACACAGTCACA

CATGCA

At4g21630(+) Qiagen

33-1424 TATCAACGACGCCGATGATAGCT

TCACTG

At4g21630(-) Qiagen

30-308 TGCTGGAGCCTTAGACAGTGATA

GCAAAG

At4g21650(+) Qiagen

30-1176R GTTGGTGTCATGAAGAAGACCTT

TTACAG

At4g21650(-) Qiagen

31-208 CGACAGAATCACACACACTTCTC

ACTGCA

At4g21640(+) Qiagen

31-1226R ATAGCTTCACTGCCCATGCTGGT

GTTATG

At4g21640(-) Qiagen

Primer fr die berprfung der RT-PCR Primer Sequenz in 5 3-Orientierung Templat Hersteller

EF1 817 CCAGTGGGACGTGTTGAGACTGG

TATGA

Elongationsfaktor

(+)

Qiagen

EF1 1202R GGCTCCTTCTCAATCTCCTTACCA

GAAC

Elongationsfaktor

(-)

Qiagen

Primer fr die Klonierung und Sequenzierung des Promotors von At4g21630. In

Klammern sind die Schnittstellen angegeben, die fr die Klonierung mit den

Primern ber die PCR-Reaktion eingebracht worden sind. Die Sequenz fr die

Schnittstelle wurde unterstrichen. Primer Sequenz in 5 3-Orientierung Verwendungszweck Hersteller

1-33R CCGTCGACTGTCTGAAGTGAGAA

GTGTGTGCATGTGTG

Klonierung (SalI) (-) Qiagen

1390-33 CCGAATTCGATGGTGTTCATGAT

GTTACAATCCCTGT

Klonierung (EcoRI)

(+)

Qiagen


P673F CATAATGTGGCGAATCATGTAAT

G

Sequenzierung (+) Qiagen

P411R CCTTTTGTCTCGATTCGGTTTTAG

TAG

Sequenzierung (-) Qiagen

GUS-GFP

37R

GGTTTCTACAGGACGTAAACT Sequenzierung (-) Qiagen

Primer fr die Klonierung und Sequenzierung des Nos-Terminators. In Klammern

sind die Schnittstellen angegeben, die fr die Klonierung mit den Primern ber die

PCR-Reaktion eingebracht worden sind. Die Sequenz fr die Schnittstelle wurde

unterstrichen. Primer Sequenz in 5 3-Orientierung Verwendungszweck Hersteller

NOSterm-

637R

CCGGTACCGATATCAGCTTGCATG

CCGGT

Klonierung (KpnI) (-) Qiagen

NOSterm-

355

CCGGTACCAGTCAAGCAGATCGTT

CAAAC

Klonierung (KpnI)

(+)

Qiagen

GUS-

GFP2471F

GACCACATGGTCCTTCTTGA Sequenzierung (+) Qiagen

pCambia

2101

CGTGCAGGAGAGGACCATCT Sequenzierung (+) Qiagen

Primer fr die Sequenzierung und Amplifikation der T-DNA Insertionsstelle Primer Sequenz in 5 3-Orientierung Verwendungszweck Hersteller

Sail-LB3 TAGCATCTGAATTTCATAACCAAT

CTCGATACAC

Sequenzierung Qiagen

Sail-LB1 GCCTTTTCAGAAATGGATAAATAG

CCTTGCTTCC

Amplifikation Qiagen

SALK-LBa1 TTCACGTAGTGGGCACATCGCCCT

GATAGA

Sequenzierung Qiagen

SALK-LBb1 AAACCAGCGTGGACCGCTTGCTGC

AACTC

Amplifikation Qiagen


2.1.4 Chemikalien, Enzyme und Verbrauchsmaterialien

()Abscisinsure; Sigma, Deisenhofen

1,4 Dithiothreit; Roth, Karlsruhe

2,4-D; Duchefa, Haarlem

2-Mercaptoethanol; Serva, Heidelberg

2Propanol; Roth, Karlsruhe

Advantage 2 Polymerase Mix; Clontech, Palo Alto

Agarose; Life Technologies, Eggenstein

alkalische Phosphatase aus Klberdarm; MBI-Fermentas, St.Leon-Rot

Ampicillin Natriumsalz; Duchefa, Haarlem

Bacto-Trypton; Difco Laboratories, Detroit

Bromphenolblau; Serva, Heidelberg

Chloroform; Roth, Karlsruhe

CTAB; Roth, Karlsruhe

D(-)-Fructose; Fluka AG, St. Louis

D(-)-Mannit; Roth, Karlsruhe

D(+)-Glucose; Fluka AG, St. Louis

D(+)-Saccharose; Roth, Karlsruhe

Diethylpyrocarbonat; Roth, Karlsruhe

di-Natriumhydrogenphosphat; Merck, Darmstadt

DNase, RNase frei; Stratagene, Cedar Creek

dNTP-Mix; Bioline, London

EDTA; Fluka AG, St. Louis

EGTA; Roth, Karlsruhe

Ethanol; Roth, Karlsruhe

Ethidiumbromid; Roth, Karlsruhe

GA A3; Duchefa, Haarlem GeneRuler1kb DNA Ladder; MBI-Fermentas, St.Leon-Rot

Gentamycin Sulfat; Duchefa, Haarlem

Glufosinatammonium PESTANAL ; Sigma, Deisenhofen

Glycerin; Roth, Karlsruhe


Glycin; Roth, Karlsruhe

IPTG; Duchefa, Haarlem

Iso-Amylalkohol; Merck, Darmstadt

Kaliumacetat; Roth, Karlsruhe

Kaliumchlorid; Roth, Karlsruhe

Kaliumhexacyanoferrat(II)-Trihydrat; Merck, Darmstadt

Kaliumhexacyanoferrat(III); Serva, Heidelberg

Kanamycin A monosulfat; Duchefa, Haarlem

LB Broth Low Salt; Duchefa, Haarlem

Lithiumchlorid; Merck, Darmstadt

Magnesiumchlorid; Fluka AG, St. Louis

Magnesiumsulfat; Merck, Darmstadt

Methyljasmonsure; Serva, Heidelberg

Murashige & Skoog Medium Basal Salt Mixture; Duchefa, Haarlem

Murashige & Skoog Medium including Vitamins; Duchefa, Haarlem

N,N-Dimethylformamid; Roth, Karlsruhe

Natrimhydroxid;

Natriumacetat; Merck, Darmstadt

Natriumchlorid; Merck, Darmstadt

Natriumdihydrogenphosphat; Merck, Darmstadt

Natriumhypochlorid; Roth, Karlsruhe

Natriumlarylsulfat; Roth, Karlsruhe

Pfu Turbo DNA Polymerase; Stratagene, Cedar Creek

Phenol; Roth, Karlsruhe

Plant Agar; Duchefa, Haarlem

Polyoxyethylensorbitanmonolaurat; Roth, Karlsruhe

PPT; Duchefa, Haarlem

Proteinase K; Roth, Karlsruhe

QIAquick Gel Extraction Kit; Qiagen, Hilden

Restriktionsenzyme und Buffer; MBI-Fermentas, St.Leon-Rot

RevertAIDTM M-MuLV Reverse Transcriptase; MBI-Fermentas, St.Leon-Rot

Ribonuclease A; Roth, Karlsruhe


Rutheniumrot; Waldeck GmbH, Mnster

Sarcosine; ICN, Aurorar

Silwet L-77; Lehle Seeds, Round Rock

T4-DNA Ligase; MBI-Fermentas, St.Leon-Rot

T4-DNA Polymerase; MBI-Fermentas, St.Leon-Rot

Technovit 3040; Heraeus Kulzer GmbH, Wehrheim

Technovit 7100; Heraeus Kulzer GmbH, Wehrheim

Thermostabile Taq-DNA-Polymerase; PEQLAB, Erlangen

TopoXL PCR-Cloning Kit; Life Technologies, Eggenstein

Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan; Fluka AG, St. Louis

TRIzolReagent; Life Technologies, Eggenstein

TTC; Fluka AG, St. Louis

Vanillin; Merck, Darmstadt

X-Gal; Duchefa, Haarlem

X-Gluc; Duchefa,Haarlem

Xylene Cyanol; Serva, Heidelberg

Yeast Extract; Difco Laboratories, Detroit

Plastikverbrauchsmaterial wie Pipettenspitzen, Reaktionsgefe und Petrischalen

wurden von der Firma Sarstedt bezogen.

2.1.5 Laborgerte

Binokulare Zeiss SV11

Hund SM33

Computerprogramme SPOT RT Software v3.5

Digitalkamera Nikon, Coolpix995

Digitalkamera fr Mikroskop und Sport RT, Visitron Systems

Binokular

Elektorporator EQUIBIO, Easyjec T

Mikroskop Zeiss Axioskop 2 plus

Mikrotom Lang


Mikrotommesser Heraeus

UV-Vis Photometer Cary100, Varian

PCR-Maschine MyCyclerTM, BioRad

Rotoren Sorvall HB-4

Sorvall HS-4

Zentrifugen Eppendorf 5402

Sorvall MC 12V

Sorvall RC 5B Plus

2.1.6 Puffer und Lsungen

2.1.6.1 Oberflchensterilisation von Samen

Bleech 2-4 Tropfen Tween20 in 50ml

6% wssriger Natriumhypochlorid-Lsung

2.1.6.2 DNA-Miniprp aus Bakterien

Lsung I 25mM Tris/HCl, pH 7,5

50mM Glucose

10mM EDTA

20min autoklaviert

Lsung II 0,2N NaOH

1% SDS

frisch angesetzt aus 0,4N NaOH und 2% SDS

Lsung III 3M Kaliumacetat

Lagerung bei 4C

Lsung IV 3M Natriumacetat pH 5,2

mit Essigsure auf pH 5,2 eingestellt

TE-Puffer 10mM Tris/HCl

1mM EDTA, pH 8,0

20min autoklaviert


RNase, pankreatisch 10mg/ml in TE

10min 85C zur Inaktivierung von DNasen

Proteinkase K 10mg/ml in Wasser

2.1.6.3 Gelelektrophorese

1 x TAE-Puffer 4,84g Tris HCl

1,14ml Essigsure

2ml 0,5M EDTA pH 8,0

mit H2O auf 1l aufgefllt

20min autoklaviert, danach Zugabe von EtBr 14g/l

10 x DNA-Ladepuffer 50% Glycerin

1mM EDTA

1 Spatelspitze Bromphenolblau

20min autoklaviert

10 x RNA-Ladepuffer 50% Glycerin

1mM EDTA

0,25% Bromphenolblau

0,25% Xylen Cyanol

40min autoklaviert

2.1.6.4 Isolierung genomischer DNA aus Pflanzen

DEX 0,14M Sorbitol

0,22M Tris/HCl, pH 8,0

0,222M EDTA

0,8M NaCl

0,8% CTAB

1% Sarcosine

-Mercaptoethanol wird frisch hinzugegeben, je

20l pro ml DEX


2.1.6.5 RNA-Isolierung

2.1.6.5.1 RNA-Isolierung aus Samen

Extraktionspuffer 8M LiCl

2% -Mercaptoethanol

Lsungspuffer 0,5% SDS

100mM NaCl

25mM EDTA

10mM Tris pH 7,6

40min autoklaviert, danach Zugabe von

2% -Mercaptoethanol

2.1.6.5.2 RNA-Isolierung aus Bltenmaterial

Extraktionspuffer 0,2M Na-tetra-Borat

30mM EGTA

danach pH 9,0 mit HCl einstellen

1% SDS

40min autoklaviert, nach dem Abkhlen 5mM

filtersterilisiertes DTT dazugegeben

Fllung 4M LiCl

10mM EDTA

40min autoklaviert

Waschpuffer 2M LiCl

5mM EDTA

40min autoklaviert

2.1.6.6 Lsungen fr Dnnschnitte

Fixierungslsung FAA 50% vergllter EtOH

5% Eisessig


3,7% Formaldehyd

Infiltrationslsung 100ml Basislsung Technovit + 1g Hrter 1

Polymerisationslsung 15ml (Basislsung Technovit + Hrter 1) +1ml

Hrter II

2.1.7 Medien und Sonstiges

MS-Medium 2,2g/l MS-Medium

pH 5,7

1% Saccharose

0,8% Agar

nach dem Autoklavieren (20min) und Abkhlen

je nach Bedarf Zugabe von Antibiotika, Herbiziden

oder Phytohormonen

35mg/l PPT

100mg/l Kan

LB-Medium 20g/l LB Broth

pH 7,0

(1,2% Agar fr Platten)

20min autoklaviert

nach Bedarf Antibiotika:

50mg/l Kan

100mg/l Amp

TYNG 10g/l Bacto-Trypton

5g/l Yeast-Extrakt

5g/l Natriumchlorid

0,2g/l Magnesiumsulfat

(1,2% Agar fr Platten)

pH 7,5

nach dem Autoklavieren (20min) und Abkhlen

je nach Bedarf Zugabe von Antibiotika

50mg/l Kan


50mg/l Gent

SOC-Medium 20g/l Fleischextrakt (Bacto-Tryptone)

5g/l Hefeextrakt

10mM NaCl

2,5mM KCl

pH 7,0 eingestellt mit 5N NaOH

20min autoklaviert

10mM MgCl2

20mM Glucose

Kurz vor der Verwendung wurde dem Medium der

Zucker und MgCl2 aus sterilfiltrierten 1M

Stammlsungen zugesetzt.

Infiltrationsmedium MS Salt

5% Saccharose

0,005% Silwet L-77

X-Gluc-Stammlsung 100mM X-Gluc in Dimethylformamid, Lagerung bei

-20C

X-Gluc-Frbelsung 1mM X-Gluc in 50mM Phosphatpuffer

NaH2PO4/Na2HPO4 pH 7,0

2 mM Kaliumhexacyanoferrat(II)

2 mM Kaliumhexacyanoferrat(II)-Trihydrat

frisch ansetzen

ABA-Stammlsung 4,5mg/ml Methanol, nicht sterilfiltriert, Lagerung

bei 4C - -20C

GA-Stammlsung 20mg/ml 70% Ethanol, sterilfiltriert, Lagerung bei

4C - -20C

Kan-Stammlsung 100mg/ml Wasser, sterilfiltriert, Lagerung bei -20C

Amp-Stammlsung 50mg/ml Wasser, sterilfiltriert, Lagerung bei -20C

X-Gal-Stammlsung 20mg/ml in Dimethylformamid, Lagerung im

Dunkeln bei -20C

IPTG-Stammlsung 200mg/ml in Wasser, filtersterilisiert, Lagerung bei

-20C


2.2 Methoden

2.2.1 Anzucht der Pflanzen, Behandlung, Ernte und

genetische Analyse des verwendeten

Pflanzenmaterials

2.2.1.1 Anzucht der Pflanzen

2.2.1.1.1 Anzucht der Pflanzen im Gewchshaus

Samen der jeweiligen Linie wurden in einem Eppendorf-Gef in 0,1% Agar

suspendiert und fr 48h bei 4C stratifiziert. Danach wurden sie auf frische Erde

ausgelegt und kamen ins Gewchshaus unter einer Plastikabdeckung, bis die

Keimlinge vier Bltter hatten. Anschlieend wurde die Abdeckung entfernt.

2.2.1.1.2 Anzucht der Pflanzen auf Agar-Platten

Samen die auf 0,8% Agar-Platten kamen, wurden zuerst oberflchensterilisiert.

Zur Sterilisierung von Pflanzensamen wurden je 100-500 Samen mit 200l 70%

EtOH fr 5min behandelt und kurz mit 13.000g zentrifugiert. Danach gab man

500l 6% Natriumhypochlorid mit wenigen Tropfen Tween20 hinzu und lie dies

15min lang einwirken. Im Anschluss folgten fnf Waschschritte mit je 500l

sterilem Wasser. Jeder Waschschritt wurde durch einen kurzen

Zentrifugationsschritt (13.000g) unterbrochen und das Wasser mit der Pumpe

unter der Sterilbank abgesaugt. Zum Schluss wurden die Samen in 100-300l

steriler 0,1% Agar-Lsung resuspendiert.

Samen auf Agar-Platten kamen in den Kulturraum mit Wachstumsbedingungen

von 22C und einer Lichtperiode von 16h.


2.2.1.2 Ernte von Pflanzenmaterial fr RNA- bzw. DNA-Isolierung

Die bentigten Gewebe und Organe wurden von Pflanzen aus dem Gewchshaus

oder von Pflanzen, die auf Agar-Platten wuchsen, abgeschnitten in flssigem

Stickstoff eingefroren und bei -80C gelagert.

2.2.1.3 Keimungsassays

Hierfr wurden ca. 100 stratifizierte Samen der T2-Generation der Sail 410_G07-

Linie, der Salk 127987-Linie und der T3-Generation der Sail 410_G07-Linie auf

MS-Platten ausgelegt, die unterschiedliche Konzentrationen von ABA bzw. GA

enthielten, und in den Kulturraum gebracht. Die Messung der Keimungsrate

erfolgte bei ABA jeden Tag, bei GA alle 1-2 Stunden. Samen bei denen die

Radikula zu sehen war, wurden als gekeimt gezhlt. Fr den Keimungstest

wurden Samen von jeweils fnf verschiedenen wt Pflanzen vom kotyp Col. und

Samen von fnf verschiedenen homozygoten At4g21630 Pflanzen der T2- und T3-

Segregationspopulation der Sail 410_G07-Linie verwendet.

2.2.1.4 Genetische Analyse der Segregationspopulation

Die Samen der T2- und T3-Segregationspopulation wurden auf Kan-Medium fr

die Salk 127987-Linie oder auf PPT-Medium fr Sail 410_G07-Linie ausgelegt,

um zu testen ob eine oder mehrere T-DNA-Insertionen im Genom vorliegen.

Mit Hilfe von Gen- und T-DNA spezifischen Primern wurde zustzlich berprft,

ob das DNA-Bandenmuster mit dem Keimungstest auf Kan-Medium oder PPT-

Medium co-segregiert.

2.2.2 Pflanzentransformation von Arabidopsis thaliana

Die Transformation von Arabidopsis thaliana (kotyp Col.) mit Agrobakterien

erfolgte nach der Methode von Bent et al. (1998). Pflanzentransformationen


wurden mit Hilfe des Agrobakterium-vermittelten Gentransfers unter Verwendung

des Agrobakterien-Stammes GV3101 mit dem Helferplasmid pSoup durchgefhrt.

Fr die Transformation wurden die Agrobakterien in 5ml TYNG-Medium +

Antibiotika (Kan und Gent) fr zwei Tage bei 28C inkubiert. Von dieser

Vorkultur wurden 2,5ml entnommen und in 150ml TYNG-Medium + Antibiotika

(Kan und Gent) N bei 28C bis zu einer OD von eins angezogen. Die

gewachsenen Agrobakterien wurden abzentrifugiert (450g, 30min) und in 20ml

Infiltrationsmedium gelst.

Zur Transformation wurden geschlossene sekundre Bltenknospen verwendet.

Der primre Bltenstand wurde eine Woche vorher abgeschnitten, so dass sich

sekundre Bltenstnde entwickeln konnten.

Diese wurden in die Agrobakterien-Suspension gegeben, untergetaucht und fr ca.

20-30s inkubiert. Nach der Transformation wurden die Pflanzen fr zwei Tage mit

einer Plastikschale bedeckt, um eine hohe Luftfeuchtigkeit zu erzeugen. Die hohe

Luftfeuchtigkeit erhht die Transformationsrate. Diese Behandlung wurde nach

sechs Tagen mit den gleichen Pflanzen wiederholt.

2.2.3 Molekularbiologische Methoden

2.2.3.1 Agrobakterien und Escherichia coli

2.2.3.1.1 Transformation von Bakterien

Die bertragung von Plasmid-DNA erfolgte mittels Elektroporation. Hierzu

wurde ein 40l Aliquot der elektrokompetenten Bakterien auf Eis aufgetaut und

1l des zu transformierenden Plasmides zugegeben. Diese Suspension wurde in

eine gekhlte 2mm Elektroporationskvette gegeben und danach wurde sofort die

Elektorporation mit 15F, 2500V durchgefhrt. Nach der Elektroporation wurde

1ml SOC-Medium in die Kvette hinzugegeben und die Suspension in ein 1,5ml

Reaktionsgef berfhrt und fr 60min bei 37C inkubiert. Danach wurden die

Bakterienzellen auf das jeweilige Selektionsmedium berfhrt.


2.2.3.1.2 Gewinnung von Plasmid-DNA (Mini-Prep)

Die Bakterien wurden in 3ml LB + Antibiotika, N bei 37C angezogen. 1,5ml

der N Kultur wurden in 1,5ml Reaktionsgefe berfhrt und abzentrifugiert

(2min, 13.000g). Das Medium wurde verworfen und die Bakterien mit 100l

Lsung I resuspendiert. Danach wurde 150l Lsung II zugegeben, vorsichtig

gemischt und fr 5min auf Eis inkubiert. Dann erfolgte die Zugabe von 150l

Lsung III und es wurden weitere 5min auf Eis inkubiert. Anschlieend wurde

fr 5min bei 15.800g zentrifugiert und der berstand in ein neues Reaktionsgef

berfhrt und durch Zugabe von 400l EtOH gefllt. Das Pellet wurde nach

Zentrifugation (4C, 15min, 15.800g) in 200l TE gelst, 1l RNase

hinzugegeben und fr 30min bei 37C inkubiert. Danach wurden 4l 10% SDS-

Lsung und 2l Proteinase K zugegeben und ebenfalls fr 30min bei 37C

inkubiert. Danach wurde die Plasmid-DNA mittels Phenol-, Chloroform (1:1)-

Extraktionen gereinigt und mit 1/10 Vol. Lsung IV und dem 2,5fachem Volumen

an 99% EtOH fr 30min, bei -20C przipitiert. Nach Zentrifugation (bei 4C,

15min, 15.800g) wurde das Pellet mit 200l eiskaltem, 70% EtOH gewaschen und

nochmals zentrifugiert (4C, 10min, 15.800g). Der berstand dekantiert und das

Pellet im Vakuum getrocknet und anschlieend in 30l TE gelst und bei -20C

aufbewahrt.

2.2.3.2 DNA-Agarosegelelektrophorese

Die Auftrennung von DNA erfolgte auf 0,8%-1,0% TAEAgarosegelen, die mit

0,05M Ethidiumbromid Gelvolumen versetzt wurden. Als Gren-standard

wurden 2g GeneRuler1kb DNA Ladder (MBI-Fermentas) aufgetragen. Nach

der Auftrennung wurde die DNA unter dem UV-Licht betrachtet und die Lage im

Gel durch Fotos dokumentiert.


2.2.3.3 Verdau der DNA

Fr den Kontroll-Verdau von Plasmid-DNA wurde etwa 1g DNA eingesetzt und

in 20l bei 37C fr 1h restringiert. Fr Restrikionsfragmente, die fr die Ligation

dienten, wurden ca. 5g DNA eingesetzt und mit je 25U der bentigten

Restriktionsenzyme und 10l des entsprechenden Puffers in einem Endvolumen

von 100l fr mindestens 3h bei 37C verdaut. Verdaute Plasmid-DNA wurde

ber 0,8% Agarose-Gele aufgetrennt. Das zu isolierende DNA-Fragment wurde

unter UV-Licht mit einer Skalpellklinge aus dem Gel ausgeschnitten und mit

Hilfe des QIAqickGel Extraktion Kit gem Vorschrift von Qiagen isoliert. Der

berstand, der die DNA enthlt, wurde N mit 1/10 Vol. Lsung IV und dem

2,5fachem Volumen an 99% EtOH gefllt. Nach Zentrifugation (bei 4C, 15min,

15.800g) wurde das Pellet mit 200l eiskaltem, 70% EtOH gewaschen und

nochmals zentrifugiert (4C, 10min, 15.800g). Nach dem Trocknen des Pellets

wurde dies in 10l dest. Wasser resuspendiert und zur Mengenabschtzung wurde

1l auf ein 0,8% Agarosegel aufgetragen.

2.2.3.4 Vektorkonstruktion

2.2.3.4.1 Ligation der amplizierten DNA-Fragmente in den pCR2.1-

Topo Vektor

Zur Ligation der beiden DNA-Fragmente, den Promotor von At4g21630 und den

Nos-Terminator, in den pCR2.1-Topo Vektor, wurden diese zuerst mit Hilfe der

PCR amplifiziert. Als Donormaterial fr den Promotor diente wt-DNA vom

kotyp Col.. Der Donor fr den Nos-Terminator stammte aus dem Vektor pGreen

0029.

PCR-Ansatz fr den Nos-Termiantor: 80l ddWasser; 10l 10xCloned Pfu DNA

polymerase reaction buffer; 5U Pfu Turbo DNA Polymerase; 0,4mM Primer

NOSterm-637R; 0,4mM Primer NOSterm-355; 0,4mM dNTPs, 60ng Plasmid-

DNA


PCR-Ansatz fr den Promotor von At4g21630: 80l ddWasser; 10l 10xCloned

Pfu DNA polymerase reaction buffer; 5U Pfu Turbo DNA Polymerase; 0,4mM

Primer 1390-33; 0,4mM Primer1-33R; 0,4mM dNTPs; 6,8g Arabidopsis DNA.

PCR-Programm fr die Amplifikation des Terminators: 1 Zyklus: 95C 120s

25 Zyklen: 50C 40s

95C 20s

72C 40s

PCR-Programm fr die Amplifikation des Promotors: 1 Zyklus: 95C 120s

30 Zyklen: 59C 30s

95C 20s

72C 120s

Durch die PCR-Reaktion wurde am 3`- und am 5Ènde des Nos-Terminators

jeweils eine Erkennungssequenz fr das Restriktionsenzym KpnI eingebaut. Der

Promotor von At4g21630 wurde am 3Ènde mit der Erkennungssequenz fr das

Restriktionsenzym SalI und am 5Ènde mit der Erkennungssequenz fr das

Restriktionsenzym Eco RI flankiert.

Die amplifizierten DNA-Fragmente wurden anschlieend auf ein 0,8%

Agarosegel aufgetragen, aufgetrennt und eluiert. Das isolierte Promotor- und Nos-

Fragment wurde nun in den pCR2.1-Topo Vektor gem der Vorschrift von

Invitrogen eingebaut und in E.coliZellen transformiert.

Es folgte eine blau-wei-Selektion der E.coli Kolonien auf LBKan -Platten mit

Hilfe von 40l IPTG und 40l X-Gal, um die rekombinanten Kolonien zu

identifzieren. Rekombinante Kolonien erscheinen auf der Agarplatte wei.

2.2.3.4.2 Ligation der DNA-Fragmente in den Transformationsvektor

pGreen0029

Aus den identifizierten rekombinanten Kolonien wurde die Plasmid-DNA isoliert

und das inserierte DNA-Fragment (Nos-Termiantor oder Promotor) mit dem

passenden Restriktionsenzym restringiert. Der Nos-Terminator enthlt am 5Ènde


fnf zustzliche Schnittstellen, die aus der Multiple Cloning site des pCR2.1-

Topo Vektors stammen (SacI, BamHI, SpeI, BstXI und Eco RI). Das Einfgen

der Schnittstellen war nicht beabsichtigt, anscheinend wurde die KpnI-

Schnittstelle des Topo-Vektors bevorzugt gespalten.

In den Transformationsvektor pGreen0029, mit dem Fusionsgen GUS-GFP,

wurde deshalb zuerst das Promotorfragment kloniert, um die Entstehung von zwei

Schnittstellen fr Eco RI zu vermeiden, weil dadurch die Ligation des

Promotorfragments nicht mglich wre.

Fr die Ligation des Promotors von At4g21630 wurde der Vektor an der Multiple

Cloning site mit SalI und Eco RI aufgeschnitten und nach der Gel-Elution mit

10U CIP, bei 37C, 60min lang, dephosphoryliert. Nun folgte die Zugabe von

EDTA, sodass eine 5mM EDTA-Konz. entstand. Danach wurde die

dephosphorylierte DNA mittels Phenol-, Chloroform (1:1)-Extraktionen und

anschliessender Ethanol-Przipitation gereinigt, um die alkalische Phosphatase

vollstndig zu inaktivieren

Zur Abschtzung des Konzentrationsverhltnisses von Vektor zu Insert wurden

Aliquots ber ein 0,8% Agarose-Gel aufgetrennt und die DNA-Menge zustzlich

photometrisch bestimmt. Fr die Ligation wurde ein Konzentrationsverhltnis

Vektor zu Insert von 3:1 bevorzugt. Die Ligation wurde mit 5U T4-DNA Ligase,

1l 10xLigase-Puffer und der jeweiligen Konzentration von Promotor und Vektor

in einem gesamt Volumen von 10l fr 3h bei RT durchgefhrt. Anschlieend

folgte bei 65C, fr 10min ein Hitzeschritt um die T4-DNA Ligase zu

inaktivieren.

Dieser Vorgang wurde nach der Klonierung des Promotors mit dem Nos-

Terminator wiederholt. Hierzu wurde der Vektor pGreen0029, mit dem

Fusionsgen GUS-GFP und dem Promotor, an der Multiple Cloning site mit KpnI

aufgeschnitten. Die Ligation wurde mit 5U T4-DNA Ligase, 1l 10xLigase-

Puffer und der jeweiligen Konzentration von Nos-Terminator und Vektor in

einem gesamt Volumen von 10l fr 3h bei RT durchgefhrt.


2.2.3.4.3 Analyse der Ligationsprodukte durch Restriktionsverdau der

Plasmid-DNA

Um zu berprfen, ob der Vektor das gewnschte DNA-Insert enthielt, wurden

ca. 400ng der isolierten Vektor-DNA in einem 20l Ansatz mit 5U des jeweiligen

Restriktionsenzyms 1h bei 37C restringiert. Die Restriktionsprodukte wurden

mittels eines 0,8% Agarosegels aufgetrennt und analysiert.

Um die richtige Orientierung des Nos-Terminators festzustellen wurde zustzlich

eine PCR-Reaktion mit den Primern GUS-GFP 2101 und NOSterm 637R

durchgefhrt.

BspHI


BspIRBnos-Kan

LB

BglIIBglII

StuI

KpnISacIBamHISpeIBstXIEcoRI

XhoI

SalI

PstISmaIBam HI SpeIXbaINbtISacI

KpnIEcoRI

T-DNA

BspHI


BspIRBnos-Kan

LB

BglIIBglII

StuI

KpnISacIBamHISpeIBstXIEcoRI

XhoI

SalI

PstISmaIBam HI SpeIXbaINbtISacI

KpnIEcoRI

T-DNA

nos-term

Promotor At4g21630

nos-term

Promotor At4g21630

PvuI

Abb. 6: Konstruierter Transformationsvektor pGreen0029 mit Promotor von At4g21630 (blau unterlegt), Nos-Terminator (schwarz unterlegt) und dem Fusionsgen GUS-GFP. Die Grenzen der T-DNA sind rot gekennzeichnet. Das Selektionsgen Kanamycin wurde grn untermalt.

2.2.3.5 DNA-Sequenzierung

Die DNA-Sequenzierung wurde von der Firma MWG Biotech AG (Ebersberg)

durchgefhrt.

2.2.3.6 Isolierung genomischer DNA aus Pflanzen

Zur Isolierung von genomischer DNA wurde eine kurze, schnelle Methode

benutzt, um DNA von transgenen Pflanzen fr die PCR-Analyse zu erhalten.

10mg Blattmaterial wurde mit flssigem Stickstoff und mit der Hilfe eines

gekhlten Pistills zu einem feinem Pulver zerstossen. Hierzu wurden 100l DEX-


Puffer gegeben und kurz gevortextet. Nach Zugabe von 200l Chloroform wurde

die Probe 30min lang bei 65C inkubiert und anschlieend zentrifugiert (RT, 5min

13.000g). Der berstand wurde in ein neues Reaktionsgef berfhrt, mit 100l

Isopropanol fr 15min bei RT gefllt und danach zentrifugiert (4C, 15min,

15.800g).

Das Przipitat wurde mit 70% Ethanol gewaschen und nach einem weiteren

Zentrifugationsschritt (4C, 5min, 15.800g) in 30l TE gelst.

Fr die PCR wurde 1,5l template DNA verwendet, der Rest wurde bei -20C

eingefroren.

2.2.3.7 RNA-Isolierung

Um RNase freie Lsungen und Gefe zu erhalten, wurde 0,01% DEPC

hinzupipettiert, N geschttelt und anschlieend fr 45min autoklaviert.

Reaktionsgefe wurden aus neuen Beuteln mit Handschuhen entnommen und

einmal fr 45min autoklaviert. Es wurden nur gestopfte Spitzen verwendet.

2.2.3.7.1 RNA-Isolierung aus Samen

Die RNA-Isolierung aus Samen erfolgte nach der Methode von Vicient und

Delseny (1998). Es wurden ca. 100mg Samenmaterial mit flssigem Stickstoff

zerstoen und anschlieend 2ml Extraktionspuffer hinzugegeben und bei 4C N

inkubiert. Nach Zentrifgation fr 4s wurde der berstand in ein 2ml

Eppendorfgef berfhrt und fr weitere 30min bei 15.800g zentrifugiert. Das

Pellet wurde mit kalten 70% EtOH gewaschen, kurz an der Luft getrocknet und

danach mit Hilfe von 1ml Lsungspuffer gelst. Die Extraktion erfolgte durch die

zweimalige Zugabe von einem Volumen Phenol, eine einmalige Zugabe von

einem Volumen Phenol/Chloroform (25:25) und zweimal durch die Zugabe von

einem Volumen Chloroform. Zwischen jedem Schritt wurde zentrifugiert (4C,

15min, 15.800g) und die wssrige Phase in ein neues 2ml Reaktionsgefe

berfhrt. Die Przipitation erfolgte mit Hilfe von 0,1 Volumen 3M NaAc pH 5,2

und dem 2,5fachem Volumen an 99% EtOH. Nach Zentrifugation (4C, 30min,


15.800g) wurde der berstand verworfen und 0,5ml 3M NaAc pH 5,2

hinzugegeben und nochmals zentrifugiert (4C, 10min, 15.800g). Danach folgte

mit kaltem 70% Ethanol ein Waschschritt bevor das Pellet getrocknet und in

100l DEPC-Wasser gelst wurde.

2.2.3.7.2 RNA-Isolierung von Blten und Schoten

Hierzu wurde bis zu 10g Blattmaterial mit flssigem Stickstoff zerstoen. Zu je

einem g Pflanzenmaterial wurde 2,5ml Extraktionspuffer (auf 50C vorgewrmt)

zugegeben. Dies wurde fr 25min zentrifugiert (4C, 12.000rpm). Der berstand

wurde mit steriler, gestopfter Plastikpipette abgenommen und 2mal mit einem

Volumen Phenol/Chloroform extrahiert und zentrifugiert (4C, 4.000g). Der

Abschluss der Extraktion erfolgte durch die Zugabe von einem Volumen

Chloroform. Nach der Zentrifugation (4C, 10min, 4.000g) wurde die wssrige

Phase mit einem Volumen 4M LiCl, 10mM EDTA, pH 8,0 N bei 4C gefllt

und anschlieend zentrifugiert (4C, 30min, 4.400g). Das RNA-Pellet mit 6-8ml

2M LiCl, 5mM EDTA, pH 8,0 gewaschen und in 400l DEPC-Wasser gelst. Es

folgte eine weitere Fllung mit sterilem 1/50 Volumen 5M NaCl und dem

2,5fachem Volumen an 99% EtOH. Danach wurde das Pellet fr 10min an der

Luft getrocknet und anschlieend in DEPC-Wasser gelst und bei -80C

aufbewahrt.

2.2.3.7.3 RNAIsolierung mit TRIzolReagent

Alternativ wurde die RNA-Isolierung mit TRIzolReagent (Invitrogen), fr die

Isolierung kleiner Mengen (bis zu 100mg) RNA, nach dem Protokoll des

Herstellers durchgefhrt.


2.2.3.8 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)

Die Standard-PCR wurde in einem Volumen von 25l in Gegenwart von 5l

5xPCR-Puffer, 0,5l dNTPs (10mM), jeweils 5U Taq-DNA-Polymerase

(PEQLAB) und je 0,5l 10M Forward- und Reverse Primer verwendet. Fr die

Amplifikation der Klonierungsprodukte wurden 5U der Pfu Turbo DNA

Polymerase benutzt.

Die Menge an Template-DNA variierte je nach Ausgangsmaterial (Plasmid-DNA,

genomische DNA, cDNA).

PCR-Programme:

Fr die Segregationsanalyse:

1 Zyklus: 95C 2min

30 Zyklen: 95C 20s

58C 40s

72C 90s

Fr die Amplifikation des Elongationsfaktor 1:

1 Zyklus: 95C 2min

28 Zyklen: 95C 20s

55C 30s

72C 40s

Fr die Amplifikation der cDNA von Atg421630, Atg421640 und

Atg421650:

1 Zyklus: 95C 2min

35 Zyklen: 95C 20s

61C 40s

72C 90s


2.2.3.9 Reverse-Transkription

Die reverse Transkriptionsreaktion wurde mit der RevertAIDTM M-MuLV

Reverse Transkriptase (MBI-Fermentas) an der gesamten RNA durchgefhrt. Fr

die reverse Transkriptionsreaktion wurde 2g-5g gesamt RNA eingesetzt und

mit DEPC Wasser auf 9,5l aufgefllt. Zu diesem Volumen wurde 5U DNase

(RNase frei) zugegeben und fr 45min bei 37C inkubiert. Zur Inaktiverung der

DNase wurde ein Hitzeschritt 15min, bei 70C durchgefhrt. Fr die reverse

Transkription wurde 0,5g oligo(dT) hinzugegeben und fr 5min, 70C inkubiert,

danach sofort auf Eis. Nun wurde mit 4l 5xReaktion-Puffer, 2l dNTP-Mix

(10mM) und mit 2l DEPCWasser auf 19l aufgefllt und fr 5min, 37C

inkubiert, und wieder auf Eis gestellt. Zum Schluss gab man 200U der Reversen

Transkriptase hinzu und inkubierte bei 42C, 60min. Die Reaktion wurde durch

einen Hitzeschritt 15min, 70C gestoppt. Fr die anschlieende PCR wurde je

1,5l cDNA verwendet, der Rest wurde bei -20C eingefroren.

2.2.3.10 Histochemischer GUS-Test

Das zu untersuchende Blten- und Schotenmaterial wurde, nach dem Abtrennen

sofort in 1-2ml X-Gluc-Frbelsung berfhrt und 3mal im Vakuum fr je 1min

infiltriert. Nach diesem Schritt, wurde das Material N bei 37C inkubiert und

anschliessend mit 70% EtOH entfrbt.

2.2.3.11 Dnnschnitte

Das Pflanzenmaterial wurde in FAA-Lsung fr 1h-2h fixiert und danach mit

ansteigenden Konzentrationen EtOH (50%, 70% und 85%) fr je 1h, in 100%

EtOH N entwssert. Nach dem Ende der Entwsserung folgte die Prinfiltration

mit ansteigenden Konzentrationen Technovit-Lsung 7100 (25% Technovit, 50%

Technovit, 75% Technovit) fr je 2h, in 100% Technovit fr einen Tag. Hierbei

wird das EtOH durch ansteigende Konzentrationen der Technovit-Lsung 7100

ersetzt. Nun folgte die N Infiltration mit Technovit 7100 und Hrter I. Die


Polymerisation mit Hrter II geschah ebenfalls N im Deckel eines 1,5ml

Reaktionsgefes. Mit Techovit 3040 wurde das Polymerisationsprodukt am

Histobloc befestigt.

2.2.3.12 Samen Frbung

2.2.3.12.1 Rutheniumrot Frbung

Gequollene Samen der T2- und T3-Generation der Sail 410_G07-Linie und wt

Samen von kotyp Col. wurden mit wssriger 0,2% (w/v) Rutheniumrot-

Frbelsung bedeckt (Penfield et al., 2001), fr 10min bei RT geschttelt und

danach mit dem Zeiss Axioskop 2 plus untersucht. Pektine werden durch

Rutheniumrot gefrbt (Usadel et al., 20004).

2.2.3.12.2 Vanillin Assay

Samen der T2- und T3-Generation der Sail 410_G07-Linie und wt Samen von

kotyp Col. wurden mit einer 1% Vanillin (w/v) 6N HCl Lsung fr 1h bei RT

inkubiert. Vanillin wird durch die Bindung an Proanthocyanidine rot (Debeaujon

et al., 2000).

2.2.3.12.3 Tetrazolium Assay

Samen der T2- und T3-Generation der Sail 410_G07-Linie und wt Samen von

kotyp Col.wurden mit einer wssrigen 1% (w/v) TTC-Lsung fr zwei Tage bei

30C im Dunkeln inkubiert (Debeaujon et al., 2000). TTC dient zur berprfung

der Keimfhigkeit des Samens. TTC wird durch eine NADH-abhngige

Reduktase zu rotem, wasserunlslichen Formazan reduziert (He, 1975)

3. Resultate Seite 35

3 Resultate

Das Institut fr Physiologie und Biotechnologie der Pflanzen an der Universitt

Hohenheim, beteiligt sich mit anderen Arbeitsgruppen an der Identifizierung der

Funktion von Subtilasen.

Das Ziel dieser Arbeit ist die molekulare Charakterisierung der Subtilase

At4g21630.

In Vorarbeiten, wurden Arabidopsis Linien, in denen verschiedene Subtilasegene,

die durch T-DNA-Insertion mutiert worden waren, unterschiedlichen

Stressfaktoren ausgesetzt und die Reaktion mit wt Pflanzen des kotyps Col.

verglichen. Hierzu gehrten Messungen der Wurzellnge auf cadmium- und

arsenhaltigen Medien (Howden and Cobbett, 1991; Schwger et al., 2000),

Keimungsassays auf hohen Salzkonzentrationen (Saleki et al., 1993), Resistenz

gegenber Aluminium und Kupfer (Larsen et al., 1996; van Vleit et al., 1995) und

Assays auf MS-Medien mit verschiedenen Pflanzenhormonen (Hayashi et al.,

1998; Bleecker et al., 1988; Beemster and Baskin, 2000, Weigel and Glazebrook,

2002).

In diesen Versuchen zeigte die Mutante fr At4g21630 bei Keimungsassays eine

Unempfindlickeit gegenber ABA im Vergleich zu wt Samen (Kapitel 3.5) und

wurde aus diesem Grund fr weitere Untersuchungen im Rahmen der

vorliegenden Arbeit ausgewhlt.

3.1 Genomischer Aufbau von At4g21630

Abb. 7: Genomischer Aufbau von At4g21630 Das Gen besteht aus zehn Exons (als Rechtecke dargestelt), die durch neun Introns voneinander getrennt sind (als Linien dargestellt). Das Gen (ohne Promotor) besteht aus 3253bp. Die Pfeilspitze markiert das 3Ènde.

Die cDNA von At4g21630 besteht aus 2319bp. Die Translation der RNA-

Sequenz in Aminosuren ergibt ein 82,66kDa und aus 772 Aminosuren


bestehendes Protein (hhtp://www.arabdiopsis.org). At4g21630 wird der AtSBT3

Subgruppe innerhalb der Subtilasefamilie zugeordnet (Abb. 2). Phylogenetisch

sind At4g21640 und At4g216350 am nchsten mit At4g21630 verwandt (Abb. 2).

Alle drei Gene sind auf dem Chromosom vier nacheinander angeordnet, was

mglicherweise ein Indiz fr funktionelle Redundanz ist und auf eine Enstehung

durch Genduplikation hindeutet.

3.2 Segregationsanalyse

Durch Segregationsanalysen von Pflanzen der T1-Generation der Sail 410_G07-

und Salk 127987-Linie sollte ermittelt werden, ob nur eine oder mehrere T-DNA-

Insertionen im Genom vorliegen.

Die Vorarbeiten von Dr. Stintzi und Ursula Glck-Behrens belegen, dass die

Pflanzen Sail 410_G07- und Salk 127987-Linie jeweils nur eine T-DNA-Insertion

im Genom enthalten.

Es sollte brprft werden, ob in einer Population von T2-Pflanzen die T-DNA-

Insertion heterozygot oder homozygot vorliegt.

Dazu wurde von den T2-Pflanzen genomische DNA isoliert (s. Material und

Methoden) und mit Hilfe von Gen- und T-DNA spezifischen Primern auf das

Vorhandensein der T-DNA-Insertion untersucht.

Heterozygote Pflanzen enthalten ein Allel mit der T-DNA-Insertion. Somit sind

zwei Banden auf dem Agarosegel erkennbar, eine Bande fr das wt-Allel und eine

weitere Bande fr das Allel mit der T-DNA. Homozygote T-DNA-

Insertionspflanzen und wt Pflanzen zeigen jeweils nur eine DNA-Bande, die

durch ihre Gre von einander zu unterscheiden sind.

Die PCR-Analyse wurde von Ursula Glck-Behrens durchgefhrt.

Es wurden drei unabhngige T-DNA-Insertionslinien, Salk 127987, Salk 036863

und Sail 410_G07, untersucht, um sicher zu stellen, dass ein mglicherweise

beobachteter Phnotyp mit dem Funktionsverlust der Subtilase At4g21630

korreliert. Fr jede dieser Linien wurden 23 bzw. 43 Pflanzen der T2-Generation

untersucht.


A B A B A B A B A B A B A B

Nr. 2 3 4 5 6 7 8Nr. 2 M 5 6 M 7 8

Nr. 11 12 13 M 14 15 16 17 M 18

A B A B A B A B A B A B A B A B

Nr. 20 21 22 M 23 18

A B A B A B A B A B

wt-DNA 972bp

T-DNA 828bp

wt-DNA 972bp

T-DNA 828bp

A B A B A B A B A B A B A B

Nr. 2 3 4 5 6 7 8Nr. 2 M 5 6 M 7 8

Nr. 11 12 13 M 14 15 16 17 M 18


Nr. 2 3 4 5 6 7 8Nr. 2 M 5 6 M 7 8Nr. 2 3 4 5 6 7 8Nr. 2 M 5 6 M 7 8

Nr. 11 12 13 M 14 15 16 17 M 18Nr. 11 12 13 M 14 15 16 17 M 18


Nr. 20 21 22 M 23 18

A B A B A B A B A B

Nr. 20 21 22 M 23 18

A B A B A B A B A B

wt-DNA 972bp

T-DNA 828bp

wt-DNA 972bp

T-DNA 828bp

wt-DNA 972bp T-DNA 828bp

Abb. 8: PCR-Analyseergebnis einer segregierenden T2-Population der Salk 127987-Linie. Fr jede der zu untersuchenden T2-Pflanzen deren Nummer unter dem jeweiligen Gelausschnitt angegeben ist, wurden zwei Primerkombinationen (A und B) eingesetzt. Die Gre der fr das Wildtyp- und mutierte Allel zu erwartende PCR-Produkt ist angegeben. A = Gen spez. Primer 33-452 und Gen spez. Primer 1424R fr die Detektion der wt-Bande. B = T-DNA spez. Primer Salk Left Border und der Gen spez. Primer 33-1424R fr die Detektion der T-DNA-Insertion. M = Grenmarker

Fr die Linie Salk 127987 konnten 16 wt Pflanzen (Nr. 2, 3, 5, 6, 7, 11, 12, 13,

14, 15, 16, 17, 20, 21, 22, 23) und drei homozygote Pflanzen (Nr. 4, 8, 18)

identifziert werden (Abb. 8).

Nr 1 2 3 4 5 M 6 7 8 10 11 12 13 14 M 15 16 17 18

A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B AB A B A B A B

Nr. 19 20 21 22 M 23 24 25 26 28 M 29 30 31 32

A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B

Nr. 33 34 35 36 37 M 38 39 40 41 M 42 43

A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B

wt-DNA 1221bp

T-DNA 640bp

wt-DNA 1221bp

T-DNA 640bp

wt-DNA 1221bp

T-DNA 640bp

Nr 1 2 3 4 5 M 6 7 8 10 11 12 13 14 M 15 16 17 18


Nr 1 2 3 4 5 M 6 7 8 10 11 12 13 14 M 15 16 17 18


Nr. 19 20 21 22 M 23 24 25 26 28 M 29 30 31 32


Nr. 19 20 21 22 M 23 24 25 26 28 M 29 30 31 32


Nr. 33 34 35 36 37 M 38 39 40 41 M 42 43


Nr. 33 34 35 36 37 M 38 39 40 41 M 42 43


wt-DNA 1221bp

T-DNA 640bp

wt-DNA 1221bp

T-DNA 640bp

wt-DNA 1221bp

T-DNA 640bp

Abb. 9: PCR-Analyseergebnis einer segregierenden T2-Population der Sail 410_G07-Linie. Fr jede der zu untersuchenden T2-Pflanzen deren Nummer unter dem jeweiligen Gelausschnitt angegeben ist, wurden zwei Primerkombinationen (A und B) eingesetzt. Die Gre der fr das Wildtyp- und mutierte Allel zu erwartende PCR-Produkt ist angegeben. A = Gen spez. Primer 33-1362 und Primer 2587R fr die Detektion der wt-Bande B = T-DNA spez. Primer Garlic Left Border und der Gen spez. Primer 33-2687R fr die Detektion der T-DNA-Insertion. M = Grenmarker


Fr die Linie Sail 410_G07 wurden 16 wt Pflanzen ( Nr. 1, 2, 11, 12, 13, 14, 15,

19, 20, 24, 25, 33, 36, 39, 40, 42), 23 homozygote Pflanzen ( Nr. 3, 4, 5, 6, 7, 8,

10, 16, 17, 18, 21, 22, 23, 26, 28, 29, 30, 34, 35, 37, 38, 41, 43) und zwei

heterozygote Pflanzen (Nr. 31, 32) identifiziert (Abb. 9).

Die PCR-Analyse der Salk 036863-Linie identifizierte nur eine homozygote

Pflanze, die im Gewchshaus verendete (Daten nicht gezeigt).

Das Ergebnis der PCR wurde berprft, indem zwischen 70-100 T2-Samen auf

Selektionsmedium (PPT fr Linie Sail 410_G07, Kan fr Linie Salk 127987)

ausgest und nach ca. zehn Tagen die ergrnten und die nekrotischen Pflanzen

gezhlt wurden. In homozygoten Mutanten findet in der nchsten Generation

keine Segregation statt, so dass alle Nachkommen auf Kanamycin bzw. PPT

wachsen knnen.

Ist die T-DNA-Insertion nur heterozygot vorhanden, wrde eine Segregation von

3:1 (resistent:sensitiv) stattfinden. Sensitive Pflanzen zeigen einen verkmmerten

Wuchs, bilden keine echte Bltter und besitzen farblose Kotyledonen. Bei wt

Pflanzen erhlt man 100 % sensitive Pflanzen.

Die Analyse besttigte das PCR-Ergebnis weitgehend, lediglich die beiden

heterozygoten Sail 410_G07-Linien 31 und 32 (Abb. 9) wurden anhand dieser

Analyse als wt Pflanzen identifiziert. Eine weitere PCR auf genomische DNA von

Linie 31 und 32 besttigte diesen Befund (Daten nicht gezeigt). Die T-DNA

Bande auf dem Gel (Abb. 9), muss demnach durch eine Kontamination mit DNA

von T-DNA-Insertionspflanzen entstanden sein.

Obwohl es sich bei den Elternpflanzen der T1-Generation um eine heterozygote

Pflanze gehandelt haben muss treten sowohl fr die Sail 410_G07-Linie als auch

fr die Salk 127987-Linie keine heterozygoten Pflanzen in der T2-Generation auf

(Abb. 8 und 9). Anscheinend gehen die heterozygoten Pflanzen whrend der

Segregation verloren.

Die Ursache fr den selektiven Verlust heterozygoter Pflanzen ist unklar.

Eine Beeinflussung der gametophytischen Entwicklung durch die T-DNA-

Insertion kann ausgeschlossen werden (Howden et al., 1998), da gengend

homozygote Pflanzen vorhanden sind und das Phnomen der


Segregationsverzerrung bei unterschiedlichen T-DNA-Insertionslinien auftritt.

Mglicherweise spielen exogene Faktoren, die bisher nicht bekannt sind, bei der

Segregationsverzerrung eine Rolle (Feldmann et al., 1997). Eine andere mgliche

Erklrung fr dieses Phnom ist, dass die Eizelle das unterschiedliche Allel in den

Pollen erkennt und eine Bildung der Zygote nur mglich ist, wenn die Allele der

Einzelle und des Pollens identisch sind.

Die phnotypische Analyse wurde mit T2-Samen aus der Segregationspopulation

der Sail 410_G07- und Salk 127987-Linie durchgefhrt.

3.3 T-DNA-Lokalisation

Zur genauen Lokalisation der T-DNA innerhalb des At4g21630 Gens, wurden die

Insertionsstellen mittels PCR amplifiziert und anschliessend sequenziert. Fr die

Amplifikation der Sail 410_G07-Linie wurde der Gen spez. Primer 33-1362 und

der T-DNA spez. Primer Sail LB1, fr die Salk 127989 Linie der Gen spez.

Primer 33-1424R und der T-DNA spez. Primer Salk LBa1 verwendet. Fr die

Sequenzierung der PCR-Produkte wurde im Falle der Sail-Linie der T-DNA spez.

Primer Sail LB3 und im Falle der Salk-Linie der T-DNA spez. Primer Salk LBb1

benutzt.

CGGTTTCTATGTACAAATATAAGTCCTATATAAC

Abb. 10: T-DNA-Insertion in der Sail 410_G07-Linie Exons werden als Rechtecke dargestellt, Introns als Strich, Pfeilspitze markiert das 3` Ende. Die T-DNA-Insertion befindet sich im Exon sechs. Blau markierte Basen sind genomischen Urspungs, schwarz markierte Basen stammten aus der LB-Region der T-DNA. Die 12 rot markierten Basen konnten mit Hilfe eines Megablast nicht identifizert werden.


TGCGTCAATTTGGCGAGCTGTCGGTCGGGGAGTGGTGATTTGTCAATTTGTCAA TTCACAGCTTC

Abb. 11: T-DNA-Insertion der Salk 127987-Linie- Exons werden als Rechtecke dargestellt, Introns als Strich, Pfeilspitze markiert das 3Ènde. Die T-DNA-Insertion befindet sich im Exon zwei. Blau markierte Basen sind genomischen Urspungs, schwarz markierte Basen stammen aus der LB-Region der T-DNA und rot markierte Basen konnten mit Hilfe eines Megablast nicht identifizert werden. Die 15 grn markierte Basen ergaben eine 100%ige bereinstimmung mit einem 15bp langen DNA-Fragment des Locus At5g24540 und At5g24550. Beide Gene codieren fr eine 6-Phospho-beta-galactosidase aus Arabidopsis thaliana.

Fr die Sail 410_G07-Linie und die Salk 127987-Linie wurde eine Insertion der

T-DNA im Exon sechs bzw. im Exon zwei festgestellt. Die T-DNA kann also

nicht durch den Spleivorgang verloren gehen und fhrt aller Wahrscheinlichkeit

in beiden Fllen zu einem los

Phänotypische und molekulare Charakterisierung einer ... · Proteine, die durch Endocytose in die...

Documents

Transcript of Phänotypische und molekulare Charakterisierung einer ... · Proteine, die durch Endocytose in die...