Phänotyp / Genotyp – Analyse bei Patienten mit fokalen ... · Entwicklung von kortikalen...

Aus der Neurochirurgischen UniversitätsklinikAus der Neurochirurgischen UniversitätsklinikSektion Sektion prächirurgischeprächirurgische EpilepsiediagnostikEpilepsiediagnostik

(Ärztlicher Leiter: Prof. Dr. med. A. Schulze(Ärztlicher Leiter: Prof. Dr. med. A. Schulze--Bonhage)Bonhage)der Albertder Albert--LudwigsLudwigs--Universität Freiburg i. Br.Universität Freiburg i. Br.

Phänotyp / Genotyp Phänotyp / Genotyp –– Analyse bei Patienten mit Analyse bei Patienten mit fokalen kortikalen Dysplasien (FCD) fokalen kortikalen Dysplasien (FCD) -- TSC2TSC2--GenGen

Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Medizinischen Doktorgradesder Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Br.

Constantin Bernhard Rohsbach

PopulationPopulation

99 %99 % 1 % Epilepsie1 % Epilepsie

45 % andere Formen45 % andere Formen 55 % fokale Epilepsien55 % fokale Epilepsien

77 % andere Formen77 % andere Formen 23 % FCD23 % FCD

24% 24% pharmakosensibelpharmakosensibel 76 % pharmakorefraktär76 % pharmakorefraktär

EinleitungEinleitung DiskussionDiskussionErgebnisseErgebnisseMethodenMethoden

[Elger, C.E. (2002) [Elger, C.E. (2002) BrainBrain PatholPathol 12: 19312: 193--198]198]

[Freitag, C.M. et al. (2001) [Freitag, C.M. et al. (2001) EpilepsiaEpilepsia 42:97942:979--985] 985]

[Kuzniecky et al. (1993) [Kuzniecky et al. (1993) NeurologyNeurology 43: 68143: 681--687]687]

EpilepsieEpilepsie

[Semah et al. (1998) [Semah et al. (1998) NeurologyNeurology 51: 125651: 1256--1262]1262]


Patientin aus dieser StudiePatientin aus dieser Studie

ElektrodenlageElektrodenlage1

2

3

4

5

6

7

8

E

D

C

B

A

AnfallsbeginnPropagationhäufige Spikesseltene Spikeslafa



InvasiveInvasive EEGEEG--Messung:Messung:

Mittels Mittels subduralsubdural einliegender einliegender intrakraniellerintrakranieller ElektrodeElektrode

LäsionsbefundLäsionsbefund::

UnifokaleUnifokale Dysplasie links Dysplasie links frontal mit verwaschener Markfrontal mit verwaschener Mark--RindengrenzeRindengrenze

Erweiterte Erweiterte LäsionektomieLäsionektomie

MRT bei fokalen kortikalen Dysplasien

Mit der modernen MRT-Bildgebung (inklusive Postprocessing-Verfahren von 3D-Datensätzen) werden fokale kortikale Dysplasien bei ca. 20-25% aller Patienten mit fokalen Epilepsien gefunden [Kuzniecky et al., 1993; Huppertz et al. 2005, Schulze-Bonage et al. 2002]


FLAIRFLAIR--WichtungWichtung

PostprocessingPostprocessing featurefeature mapsmaps::

abnormen KortexdickeAbnorme Mark-Rinden-Differenzierung

Entwicklung von kortikalen Dysplasien

Störung der OrganisationReichen möglicherweise bis in die Neugeborenenperiode (z.B. FCD Typ 1)[Lombroso et al. (2000) Epilepsia 41:245-253]


Störung der Migration12.bis 24. Schwangerschaftswoche[Gressens P (2000) Pedriatr Res 48:725-7309]

Störung der Proliferation6. bis 12. Schwangerschaftswoche p. m. (z.B. FCD Typ 2)[Redecker et al. (2000) Nervenarzt 71:238-248]

Klinische Diagnosekriterien der TSCKlinische Diagnosekriterien der TSC


Hauptkriterien:Faciale Angiofibrome, unguale Fibrome, hypomelanotische Flecken, retinaleHamartome, kortikale Tubera, subependymale Knötchen, Riesenzellastrozytome, kardiale Rhabdomyome, renale Angiomyolipome und Lymphangioleiomyomatose

Nebenkriterien:Enamelveränderungen, rektale Polypen, Knochenzysten, Gingivafibrome, retinaleachromatische Flecken und multiple renale Zysten

definitive TSC: 2 Hauptkriterien oder 1 Hauptkriterium + 2 Nebenkriterienwahrscheinliche: 1 Hauptkriterium + 1 Nebenkriterium mögliche : 1 Hauptkriterium oder 3 Nebenkriterien

Roach ES, Gomez MR, Northrup H; J Child Neurol 1998; 13 (12): 624-628

Fragestellung dieser DissertationFragestellung dieser Dissertation1.1. Können bei Patienten mit Können bei Patienten mit unifokalerunifokaler oder multifokaler FCD weitereoder multifokaler FCD weitere

Stigmata der Stigmata der tuberösentuberösen Hirnsklerose nachgewiesen werden?Hirnsklerose nachgewiesen werden?

2.2. Liegt eine Keimbahnmutation vor oder lassen sich nur VeränderungLiegt eine Keimbahnmutation vor oder lassen sich nur Veränderungen en in der DNA des dysplastischen Hirngewebes nachweisen, was einer in der DNA des dysplastischen Hirngewebes nachweisen, was einer somatischen Mutation entspräche?somatischen Mutation entspräche?

3.3. Gibt es diesbezüglich Häufungen in der Patientengruppe oder im Gibt es diesbezüglich Häufungen in der Patientengruppe oder im Vergleichskollektiv?Vergleichskollektiv?

4.4. Gibt es tatsächlich wenige Gibt es tatsächlich wenige SequenzveränderungenSequenzveränderungen im TSC2 Gen, im TSC2 Gen, wie sie von Becker et al. 2002 beschrieben worden sind? wie sie von Becker et al. 2002 beschrieben worden sind? [Becker, A.J. (2002) Ann [Becker, A.J. (2002) Ann NeurolNeurol 52: 2952: 29--37]37]


Phänotypische UntersuchungenPhänotypische UntersuchungenEinleitungEinleitung DiskussionDiskussionErgebnisseErgebnisseMethodenMethoden

PringlePringle JJ (1890) A JJ (1890) A casecase of of congenitalcongenital adenomaadenoma sebaceumsebaceumBritish Journal of British Journal of DermatologyDermatology, 1890, vol. 2, pp. 1, 1890, vol. 2, pp. 1--1414KotheKothe, R (1903) Zur Lehre der Talgdrüsengeschwülste, R (1903) Zur Lehre der TalgdrüsengeschwülsteArchArch DermatolDermatol SyphSyph 6868: 273: 273--278 (Bild)278 (Bild)

HautinspektionHautinspektion

NierensonoNierensono

HerzechoHerzecho

AugenspiegelungAugenspiegelung

Genotypische Untersuchungen Genotypische Untersuchungen


DNA Isolierung aus Blut und HirngewebsschnittenDNA Isolierung aus Blut und Hirngewebsschnitten

PCRPCR

erneute PCRerneute PCR

SequenzierungSequenzierung

AgaroseAgarose--GelGel

SSCP GelSSCP Gel

Auswertung der Auswertung der SequenzierungSequenzierung


mRNA-Auswertung:Stelle 5215 accgatatc

T D IT D IEs handelt sich um einen heterozygoten PolymorphismusEs handelt sich um einen heterozygoten Polymorphismusan Stelle c.5220 mit der Veränderung Tan Stelle c.5220 mit der Veränderung T��C.C.

NCBINCBI--HomepageHomepage: BLAST: BLAST

Welche Auswirkung hat das?Welche Auswirkung hat das?EinleitungEinleitung DiskussionDiskussionErgebnisseErgebnisseMethodenMethoden

[Modifiziert nach [Modifiziert nach Wikipedia.orgWikipedia.org]]

-- Das Das TripletTriplet GAT sowie das GAT sowie das TriplettTriplett GAC kodieren beide GAC kodieren beide für für AsparaginsäureAsparaginsäure..

Mutationstypen:Mutationstypen:

-- SilentSilent, , missensemissense, , nonsensenonsense-- frameshiftframeshift, , inin--frameframe-- an der Spleißstellean der Spleißstelle

SilentSilent MutationMutation

Genstruktur

Primärtranskript

polyAAUG Stop

N C Protein

Enhancer

polyAIntron

Exon1 Exon2

ATG Stop

Spleißstellen

gt ag

TATA-Box

3´́́́UTR5´́́́UTR

AUG Stop

mRNA AAAAAA

Translationsstart

Translationsende

Spleißen

Entfernen des Introns

Spleißstelle (gt > at, ag > aa)

Konsensussequenz gt - ag


ErgebnisseErgebnisse


Blut:Blut:

Gewebe:Gewebe:

Exon

Anz

ahl d

er P

olym

orph

ism

en

0

2

4

6

8

3 10 14 3230 37 40413426

coiled-coilDomäne

coiled-coilDomäne

GAP-relatedDomäne

38

ErgebnisseErgebnisse

Es kam zu keiner signifikanten Häufung der Es kam zu keiner signifikanten Häufung der SequenzveränderungenSequenzveränderungen in einem speziellen Exon.in einem speziellen Exon.


�� Sieben Proteindomänen des TSC2Sieben Proteindomänen des TSC2--Gens:Gens:

1.1. LeucineLeucine zipperzipper Domäne (LZD), Exon 3Domäne (LZD), Exon 32.2. CoiledCoiled--coilcoil Domäne 1 (CCD1), Exon 10 Domäne 1 (CCD1), Exon 10 3.3. CoiledCoiled--coilcoil Domäne 2 (CCD2), Exon 26Domäne 2 (CCD2), Exon 264.4. TranscriptionTranscription activationactivation Domäne 1 (TAD1) Exon 29Domäne 1 (TAD1) Exon 29--30305.5. GTPaseGTPase activatingactivating proteinprotein (GAP) Exon 34(GAP) Exon 34--38386.6. TranscriptionTranscription activationactivation Domäne 2 (TAD2) Exon 39Domäne 2 (TAD2) Exon 39--40407.7. CalmodulinCalmodulin--bindingbinding Domäne (Domäne (CaMDCaMD) Exon 40) Exon 40--4141

Alle Polymorphismen, die in diesen Domänen gefunden Alle Polymorphismen, die in diesen Domänen gefunden werden konnten, waren heterozygot, häufig werden konnten, waren heterozygot, häufig silentsilent und und konnten ebenfalls im Vergleichskollektiv gefunden werden.konnten ebenfalls im Vergleichskollektiv gefunden werden.

ProteindomänenProteindomänen

[[KrymskayaKrymskaya et al. 2003]et al. 2003]


Zusammenfassung der Zusammenfassung der ErgebnissseErgebnissse

�� del A5.1%1,49%del A5.1%1,49%

1,49%5.1%IVS 41+65 del Ahomozygot14,3841

20,9%5.1%IVS 41+65 del Aheterozygot19, 2341

3,3 %5.1 %c5415 g� a, Serinhomozygot14, 3841

18,3 %7.7%c5415 g� a, Serinheterozygot13,19,2341

22,4 %10.3%IVS 40-49, c � theterozygot8,10,14,3840

1,49%2.7%c5220, t � c, Asp.sre.homozygot1440

23,1 %18.0%c5220, t � c, Asp.sre.heterozygot5,8,10,19,23,28,3840

1,49 %7.7%IVS 39-10, a � chomozygot5, 14, 3839

46,3 %7.7%IVS 39-10, a � cheterozygot8,10,2339

1,49 %2.6%IVS 31-56, c � ghomozygot1931

16,42 %7,7%IVS 31-56, c � gheterozygot14, 23,2831

2,99 %10.26%IVS 31+78, g � aheterozygot0,8,1131

25,00 %18.0%IVS 14-39 c � theterozygot5,8,10,11,28,29,3814

5,77 %2.6%IVS 14-14, c� thomozygot1414

21,15 %15.4%IVS 14-14, c� theterozygot5,19,22,27,31,3814

2,99 %2.6%c1596 c � t, Serinhomozygot1414

11,94 %12.8%c1596 c � t, Serinheterozygot5,19,22,31,3814

<5%2.6%c1128 a � g, Glutaminheterozygot3510

4,48 %10.3%c1118 g � a, Arg �Gluheterozygot21,26,30,3610

5 %7.7%IVS 4-3, c � theterozygot10,28,294

VergleichKollektivMutationhomo-/ heterozygotPatient(en)Exon / Intron


Diskussion der MethodenDiskussion der Methoden

�� Die Die SSCPSSCP--MethodeMethode eignet sich hervorragend, um ein Gen auf einen eignet sich hervorragend, um ein Gen auf einen bekannten Polymorphismus zu bekannten Polymorphismus zu screenenscreenen. .

�� In dieser Studie wurden bessere Ergebnisse mit dem Zusatz von 5%In dieser Studie wurden bessere Ergebnisse mit dem Zusatz von 5%GlycerolGlycerol zu den zu den SSCPSSCP--GelenGelen beobachtet.beobachtet.

�� Die Die SequenzierungSequenzierung ist der Goldstandard zum Auffinden von ist der Goldstandard zum Auffinden von (unbekannten) Veränderungen auf (unbekannten) Veränderungen auf NukleotidebeneNukleotidebene..

�� Die Ergebnisse der Die Ergebnisse der SequenzierungSequenzierung hängen in hohem Maße von der hängen in hohem Maße von der Qualität der DNA und der sorgfältigen Verarbeitung der Proben abQualität der DNA und der sorgfältigen Verarbeitung der Proben ab..


VergleichVergleich

[Becker et al. 2002][Becker et al. 2002]


SchlussfolgerungSchlussfolgerung�� Alle Alle SequenzveränderungenSequenzveränderungen sind sowohl im Blut als auch im sind sowohl im Blut als auch im

dysplastischen Hirngewebe nachweisbar.dysplastischen Hirngewebe nachweisbar.

�� Bis auf eine Sequenzveränderung in Intron 39 gibt es bei den Bis auf eine Sequenzveränderung in Intron 39 gibt es bei den gefundenen gefundenen SequenzveränderungenSequenzveränderungen keine signifikante Häufung.keine signifikante Häufung.

�� Bei FCDBei FCD--Patienten sind keine Mutationen gefunden worden, die bei Patienten sind keine Mutationen gefunden worden, die bei TSCTSC--Patienten als krankheitsverursachend eingestuften wurden.Patienten als krankheitsverursachend eingestuften wurden.

�� Die im TSC2Die im TSC2--Gen gefundenen Gen gefundenen SequenzveränderungenSequenzveränderungen ergeben keinen ergeben keinen Anhalt für die Genese einer FCD, insbesondere der FCD Typ 2B.Anhalt für die Genese einer FCD, insbesondere der FCD Typ 2B.

�� Bei der FCD handelt sich höchstwahrscheinlich nicht um eine „forBei der FCD handelt sich höchstwahrscheinlich nicht um eine „forme me frustefruste“ der TSC.“ der TSC.


Fragen, bitte!Fragen, bitte!

Herzlichen Dank Herzlichen Dank Ganz herzlich bedanken möchte ich mich bei…Ganz herzlich bedanken möchte ich mich bei…

�� Den Patienten und den Freiwilligen der KontrollgruppeDen Patienten und den Freiwilligen der Kontrollgruppe�� Herrn Prof. Dr. SchulzeHerrn Prof. Dr. Schulze--BonhageBonhage�� Herrn Prof. Dr. KorinthenbergHerrn Prof. Dr. Korinthenberg�� Frau Dr. Susanne FauserFrau Dr. Susanne Fauser�� Monika Monika HäffnerHäffner, Dr. Karsten , Dr. Karsten HäffnerHäffner�� Christoph Christoph GumbingerGumbinger�� PD Dr. Jansen und Dr. PD Dr. Jansen und Dr. SutterSutter (Humangenetik Heidelberg) (Humangenetik Heidelberg) �� Herrn Prof. Dr. Volk und den Mitarbeitern der Abteilung für Herrn Prof. Dr. Volk und den Mitarbeitern der Abteilung für

Neuropathologie, insbesondere Dr. Neuropathologie, insbesondere Dr. PantazisPantazis�� Den Laborteams von Frau Prof. Dr. Haas und Herrn Prof. Den Laborteams von Frau Prof. Dr. Haas und Herrn Prof.

Dr. Dr. NikkahNikkah�� Herrn Dr. Herrn Dr. AipleAiple und Herrn Wintermantelund Herrn Wintermantel�� Station Wartenberg und den MTA des Station Wartenberg und den MTA des EEGEEG--MonitoringsMonitorings�� Mein ganz spezieller Dank gilt Mein ganz spezieller Dank gilt meinermeiner Freundin, Freundin, FamilieFamilie

und Freunden.und Freunden.

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