Physikalisch-Chemisches Fortgeschrittenenpraktikum · gung auf das Molekül jedoch durch...

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Physikalisch-Chemisches Fortgeschrittenenpraktikum Charakterisierung von Fluoreszenzfarbstoffen verfasst: Christian Spies, 2011.07 überarbeitet: Tobias Staut, 2013.02

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Physikalisch-ChemischesFortgeschrittenenpraktikum

Charakterisierung vonFluoreszenzfarbstoffen

verfasst: Christian Spies, 2011.07überarbeitet: Tobias Staut, 2013.02

Inhaltsverzeichnis

1 Vorbereitung 3

2 Theoretische Grundlagen 42.1 Licht-Materie-Wechselwirkungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42.2 Übergangsdipolmoment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52.3 Franck-Condon-Faktoren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52.4 Fluoreszenzlebensdauer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62.5 Anregungs- und Emissionsspektren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72.6 Einstein-Koeffizienten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

3 Experimentelle Aufbauten 123.1 Stationäre Spektroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123.2 Zeitaufgelöste Spektroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

4 Versuchsdurchführung 15

5 Auswertung 15

PCF 2013 Charakterisierung von Fluoreszenzfarbstoffen

1 Vorbereitung

Bereiten Sie folgende Themengebiete/Stichworte vor:

• Übergangsdipolmoment und Auswahlregeln

• Born-Oppenheimer-Näherung

• Franck-Condon-Faktoren

• Oszillatorstärke

• Boltzmann-Verteilung

• Jablonski-Diagramm

• Stokes-Verschiebung

• Fluoreszenzlebensdauer

• Einstein-Faktoren

Die Messgeräte sind für jeden Versuch von zentraler Bedeutung. Bereiten Sie daher gründ-lich Aufbau und Funktionsweise der in dieser Anleitung beschriebenen Geräte und Anlagenvor.

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2 Theoretische Grundlagen

2.1 Licht-Materie-Wechselwirkungen

Jeder Energiezustand eines Moleküls kann anhand verschiedener elektronischer, Schwing-ungs- und Rotationsniveaus klassifiziert werden. Die Besetzung dieser Niveaus ist tem-peraturabhängig und wird dabei von der Boltzmann-Verteilung bestimmt. Übergängezwischen diesen Zuständen können durch Zufuhr von Energie induziert werden. Diese En-ergie kann bei kleinen Abständen der Energieniveaus, wie sie bei den Rotationszuständenvorhanden sind, thermischer Natur sein. In der Spektroskopie erfolgt die Energieübertra-gung auf das Molekül jedoch durch Wechselwirkung mit elektromagnetischer Strahlunggeeigneter Wellenlänge. Schwingungsübergänge werden bereits durch niederenergetischeInfrarotstrahlung (IR) ausgelöst, elektronische Übergänge finden durch Absorption von ul-traviolettem und sichtbarem Licht (UV-Vis) statt.Im Folgenden soll nur der elektronische Übergang näher erläutert werden.

Damit ein Molekül mit dem elektrischen Feld der Strahlung wechselwirken kann, müssendrei Bedingungen erfüllt sein:

(i) Das elektrische Feld der Strahlung muss gemäß (2.1) mit der richtigen Frequenzν oszillieren, welche dem Energieunterschied ∆E der beiden beteiligten Zuständeentspricht (h ist das Plancksche Wirkungsquantum):

ν =∆E

h(2.1)

(ii) Die Orientierung des sogenannten Übergangsdipolmomentes µba muss mit derPolarisationsrichtung der Strahlung übereinstimmen. Das Übergangsdipolmoment isteine vektorielle Größe und ein Maß für die Stärke der Licht-Materie-Wechselwirkung.Es kann aus den Molekülorbitalen der beiden Zustände gemäß (2.2) berechnet werden.Dabei bezeichnet e die Elementarladung, Ψa die Wellenfunktion des Grundzustandes,Ψ∗

b die komplex konjugierte Wellenfunktion des angeregten Zustandes und R ist derOrtsvektor, welcher die Bewegung der Elektronen beschreibt.

µba = e

∫dV [Ψ∗

b R Ψa] = e 〈Ψb|R|Ψa〉 (2.2)

(iii) Das Übergangsdipolmoment darf nicht Null sein.

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2.2 Übergangsdipolmoment

Das Quadrat des Übergangsdipolmomentes wird Dipolstärke Dba genannt und ist pro-portional zur Stärke einer Absorptionsbande. Dba lässt sich über das Lambert-BeerscheGesetz direkt messen (über das Integral

∫dν ε(ν)). Die Stärke eines Übergangs wird durch

die Oszillatorstärke fba, einer dimensionslosen Größe, beschrieben. Sie setzt die Stärkeder Absorption in Relation zu der eines klassischen harmonischen Oszillators (vgl. (2.3)).Starke, d.h. nach den Auswahlregeln erlaubte, Übergänge besitzen Oszillatorenstärken . 1.

fba =4meε0c0 ln 10

e2NA

∫dν ε(ν) (2.3)

In (2.3) ist me die Ruhemasse des Elektrons, ε0 die Dielektrizitätskonstante des Vakuums,c0 die Lichtgeschwindigkeit im Vakuum, NA die Avogadrokonstante und ε(ν) der Extink-tionskoeffizient in Abhängigkeit von der Frequenz.Mittels der Oszillatorenstärke lässt sich der Betrag des Übergangsdipolmomentes über(2.4) bestimmen. Somit lässt sich eine quantenmechanische Größe experimentell über dieSpektroskopie berechnen.

Dba = |µba|2 =3e2h

8π2meνfba (2.4)

2.3 Franck-Condon-Faktoren

Durch veränderte Elektronenverteilungen kann das Potentialminimum der Kernschwin-gungen im angeregten Zustand gegenüber dem elektronischen Grundzustand zu anderenKernkoordinaten verschoben sein. Da die Absorption eines Photons wesentlich schneller alsdie Kernbewegungen abläuft (vgl. Abschnitt 2.4), befindet sich das Molekül direkt nachder Anregung noch bei den Kernkoordinaten des Grundzustandes. In der Folge sind nachder Anregung meist höhere Schwingungszustände besetzt.Die unterschiedlichen Zeitskalen von elektronischer Anregung und Kernbewegung ermögli-chen es, für die Gesamtwellenfunktionen Ψ einen Produktansatz zu wählen. Die Funktionenzerfallen in einen elektronischen Term φ(R) und einen Schwingungsterm χ(r):

Ψ = φ(R) · χ(r). (2.5)

r bescheibt dabei die Kernbewegungen. Diese Trennung der Koordinaten wird als Born-Oppenheimer-Näherung bezeichnet. Das Integral in (2.2) wirkt nur auf elektronischeKoordinaten, wodurch sich die Gleichung folgendermaßen umschreiben lässt:

µba = e 〈φbχm|R|φaχn〉 = e 〈χm|χn〉 〈φb|R|φa〉 . (2.6)

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Deswegen besteht ein elektronischer Übergang (und damit das Absorptionsspektrum) nichtaus einer Linie, sondern wird durch die Übergangswahrscheinlichkeit PT zu den einzelnenSchwingungsniveaus moduliert. PT ergibt sich aus dem Überlapp der Wellenfunktionen derSchwingungszustände des angeregten Zustandes χm mit denen des Grundzustandes χn. DieBetragsquadrate der entsprechenden Integrale werden auch Franck-Condon-Faktorengenannt:

PT = |〈χm|χn〉|2 (2.7)

Die Franck-Condon-Faktoren können experimentell mit Hilfe der harmonischen Näherungund des sogenannten Huang-Rhys-Faktors S bestimmt werden ((2.8) und (2.9)). In diesenGleichungen ist vi das Schwingungsniveau, in dem der Übergang endet, k die Kraftkon-stante der Schwingung, ∆q die Verschiebung der Kernkoordinaten in beiden Zuständenund ν̄ die Wellenzahl der Schwingung.

PT =exp(−S)Svi

vi!(2.8)

S =k(∆q)2

2hc0ν̄(2.9)

2.4 Fluoreszenzlebensdauer

Abbildung 1: Jablonski-Termschema: Singulett-Grundzustand S0; die ersten beiden ange-regten Singulettzustände S1 und S2; erster Triplettzustand T1; schwarz: Ab-sorption; grün: Fluoreszenz; rot: Phosphoreszenz; gestrichelt: interne Kon-version; blau: Interkombination; Aus Gründen der Übersichtlichkeit ist derTriplettzustand weiter rechts dargestellt und Rotationsniveaus nicht gezeigt.

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Alle Vorgänge, die nach elektronischer Anregung ablaufen können, werden üblicherweise imsogenannten Jablonski-Termschema zusammengefasst. Ein solches ist in Abb. 1 gezeigt.Der Grundzustand der meisten Moleküle ist ein Singulettzustand (d.h. alle Elektronen-spins sind gepaart) und wird daher als S0 geschrieben. Die Anregung läuft innerhalb vonwenigen Femtosekunden ab (10−15 s). Nach erfolgter Anregung gibt das Molekül durchnichtstrahlende Wechselwirkung mit anderen Molekülen in seiner Umgebung überschüssigeSchwingungsenergie ab und erreicht so den Schwingungsgrundzustand des ersten angereg-ten elektronischen Zustandes (S1 – Zustand). Dieser innerhalb von wenigen Pikosekunden(10−12 s) abgeschlossene Vorgang wird interne Konversion (internal conversion, IC) ge-nannt. Da die Abstände der elektronischen Niveaus groß sind, besteht nur eine geringeÜberlappung der Schwingungswellenfunktionen χn für hohe n des S0-Zustandes mit de-nen des angeregten Zustandes χm (Energielückengesetz). Daher ist die Wahrscheinlichkeitfür IC in diesem niedrigsten Schwingungszustand von S1 sehr gering. Ebenso gering, dadurch das Verbot der Spinumkehr nicht erlaubt, ist die Übergangsrate in den Triplett-Zustand T1, der sogenannte Interkombinationsübergang (intersystem crossing, ISC). Des-wegen kommt es mangels nichtstrahlender Alternativen zur strahlenden Relaxation in denGrundzustand. Erfolgt dieser Übergang im System gleicher Spinmultilizität wird das Phä-nomen als Fluoreszenz bezeichnet. Diese erfolgt üblicherweise auf einer Zeitskala vonNanosekunden (10−9 s). Die Zeitspanne, in der ein Chromophor im angeregten S1-Zustandbis zur Rückkehr in den Grundzustand verbleibt, wird als Fluoreszenzlebensdauer τfbezeichnet. Sie ergibt sich nach (2.10) aus dem Kehrwert der Summe der Ratenkonstantenfür die strahlende (kr) und nichtstrahlende (knr) Rückkehr in den Grundzustand.

τf =1

kr + knr(2.10)

2.5 Anregungs- und Emissionsspektren

Von nun an wird eine Beschränkung auf ein Zwei-Niveau-System und den strahlenden Zer-fall vorgenommen. Des Weiteren wird von harmonischen Potentialen, die in ihren Kern-koordinaten um ∆q verschoben sind, ausgegangen. Die Vereinfachung ist schematisch inAbb. 2 gezeigt.

Da durch interne Konversion Photonen nur aus dem Schwingungsgrundzustand des erstenangeregten elektronischen Zustandes S1 emittiert werden und gemäß den Franck-Condon-Faktoren in höheren Schwingungsniveaus des Grundzustandes enden können, existiert einEnergieunterschied zwischen absorbierter und emittierter Strahlung. Dieser Energieunter-schied wird durch die Solvatationsdynamik des Chromophors noch weiter verstärkt. Die Lö-semittelmoleküle reagieren durch Umorientierung auf die veränderte Elektronenverteilung

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Abbildung 2: Absorptions- und Emissionsvorgang im Zwei-Niveau-System.

und senken dadurch die Energie des angeregten Zustandes noch weiter. Die Entfernung derMaxima von Anregungs- und Emissionsspektren ist die sogenannte Stokes-Verschiebung(vgl. Abb. 3). Diese Verschiebung ist von entscheidender Bedeutung für die Fluoreszenz-spektroskopie, weil somit das Anregungslicht effektiv vom Fluoreszenzlicht spektral ge-trennt werden kann. Aufgrund des Energieverlustes ist die Fluoreszenz immer bathochrom(zu höheren Wellenlängen) verschoben. Häufig ist das Fluoreszenzspektrum spiegelbildlichzum Anregungsspektrum eines Fluoreszenzfarbstoffes (Kasha’s Regel, vgl. Abb. 3), was ausder symmetrischen Modulation der Spektren durch die Franck-Condon-Faktoren resultiert:

If (ν) ∝ |µ|2 PT . (2.11)

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Abbildung 3: Anregungs- und Emissionsspektrum eines Perylen-Farbstoffes.

2.6 Einstein-Koeffizienten

Ein noch viel grundlegenderer Ansatz, die photophysikalischen Prozesse Absorption undEmission miteinander in Einklang zu bringen, stammt von Albert Einstein. Er ging vonder Beobachtung aus, dass durch Lichtwellen sowohl Übergänge vom Grundzustand in denangeregten Zustand, als auch umgekehrt induziert werden können. Diese Prozesse wer-den als Absorption und stimulierte Emission bezeichnet und die Übergangsraten sindabhängig von der Strahlungsdichte der Lichtwellen ρ(ν) und der Besetzung der jeweili-gen Ausgangszustände, N1 und N2. Die entsprechenden Proportionalitätsfaktoren werdenEinsteinkoeffizienten B genannt.

dN1

dt= −B12N1ρ(ν) (2.12)

dN2

dt= −B21N2ρ(ν) (2.13)

Im thermodynamischen Gleichgewicht sind beide Übergangsraten gleich groß, was unterden vorliegenden Gegebenheiten nur mit einer Gleichbesetzung beider Niveaus vereinbarist. Dies ist jedoch nicht der Fall, der angeregte Zustand ist wesentlich weniger stark besetzt

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(Boltzmann-Verteilung). Deswegen muss es noch einen zweiten Zerfallskanal geben, diespontane Emission (Fluoreszenz). Diese ist nicht von der Strahlungsdichte der Lichtwel-len abhängig. Der entsprechende Proportionalitätsfaktor ist der Einsteinkoeffizient für diespontane Emission A21 (vgl. Abb. 4).

Abbildung 4: Definition der Einsteinkoeffizienzen als Proportionalitätsfaktoren für dieÜbergangsraten zwischen zwei Zuständen; ρ(ν) ist die Strahlungsdichte, Ni

die Besetzungszahl des i-ten Zustandes.

Daraus entwickelte Einstein, unter Berücksichtigung der Planckschen Strahlungsdichte ei-nes schwarzen Strahlers, die folgenden Zusammenhänge zwischen den Einsteinkoeffizientenund dem Übergangsdipolmoment:

B21 = B12 =2π2

3ε0h2|µba|2 (2.14)

A21 =16π3ν3

3ε0hc30|µba|2 (2.15)

Bei Vernachlässigung einer Entartung der beteiligten Niveaus gilt folgender Zusammenhangzwischen den Einsteinkoeffizienten der Absorption B12, stimulierten Emission B21 undspontanen Emission:

B21 = B12 =c30

8πhν3A21. (2.16)

Wegen der ν3-Abhängigkeit spielt die stimulierte Emission im sichtbaren Bereich keineRolle und die strahlende Ratenkonstante kr ist gleich A21, A21 = kr.

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Diese Gleichungen können sehr gut angewendet werden, wenn sich die Geometrie der be-teiligten elektronischen Zustände nur wenig unterscheidet. Weiterhin besitzen sie aufgrunddes sehr allgemeinen Ansatzes von Einstein „universelle Gültigkeit“, d.h. sie können beijeder Spektroskopie (NMR, IR, Mößbauer, ...) angewendet werden.

Streng genommen gilt (2.15) nur für Absorption bei genau einer Wellenlänge. Da dies sogarbei Atomen nur näherungsweise der Fall ist – bei Molekülen stimmt diese Näherung nichtmehr – müssen Verbesserungen eingeführt werden. Eine Möglichkeit kr zu berechnen bietetdie Strickler-Berg-Relation:

kr =8π ln(10)n2

NAc20×

∫dν F (ν)∫

dν ν−3F (ν)×∫

dνε

ν(2.17)

Hierbei wird die Ratenkonstante aus dem integrierten Absorptionsspektrum sowie demintegrierten Fluoreszenzspektrum berechnet. F (ν) ist die frequenzabhängige Fluoreszen-zintensität und n der Brechungsindex des Lösemittels.

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3 Experimentelle Aufbauten

3.1 Stationäre Spektroskopie

Zur Aufnahme von Absorptionsspektren steht ein Zweistrahlphotometer (Jasco V-650 ) miteinem Wellenlängenbereich von 190 - 900 nm zur Verfügung.Fluoreszenzanregungs- und Fluoreszenzemissionsspektren können an einem Spektrofluoro-meter (Jasco FP-6500 ) gemessen werden. Ein solches Gerät misst in einer 90 ◦-Geometrie(Warum?). Der stark vereinfachte Aufbau des Gerätes ist in Abb. 5 gezeigt. Zur Aufnahmevon Anregungsspektren wird dabei die Emissionswellenlänge am Monochromator auf derDetektionsseite konstant gehalten, und die Intensität bei verschiedenen Anregungswellen-längen gemessen. Emissionsspektren werden erhalten, indem bei konstanter Anregungswel-lenlänge die Intensität bei verschiedenen Emissionswellenlängen gemessen wird.

Abbildung 5: Schematischer, stark vereinfachter Aufbau eines Fluoreszenzspektrometers.

3.2 Zeitaufgelöste Spektroskopie

Eine experimentelle Methode zur Ermittlung der Fluoreszenzlebensdauer τf ist das zeit-korrelierte Einzelphotonenzählen (time-correlated single photon counting, TCSPC). EinenVergleich der experimentell gemessenen Fluoreszenzlebensdauer τf mit der natürlichen Le-bensdauer τ0 (die Lebensdauer in Abwesenheit nichtstrahlender Prozesse wie IC oder ISC;τ0 = 1/kr) liefert die Fluoreszenzquantenausbeute Φf :

Φf =kr

kr + knr=τfτ0

. (3.1)

Sie ist ein Maß für das Verhältnis von absorbierten zu emittierten Photonen und sollte

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für Anwendungszwecke nahe bei 1 liegen. Die natürliche Lebensdauer ergibt sich aus demKehrwert des Einsteinkoeffizienten für die spontane Emission, A21, der der strahlendenRatenkonstanten kr entspricht.

Fluoreszenzlebensdauern können im Versuch an einer selbst aufgebauten TCSPC-Anlage(Abb. 6) gemessen werden. Zur Anregung stehen zwei gepulste Laserdioden (405 nm und470 nm) zur Verfügung. Beim TCSPC wird nach jedem Laserpuls gemessen, wie lange esdauert, bis das erste Fluoreszenzphoton am Detektor eintrifft (vgl. Abb. 7). Es handeltsich sozusagen um ein Start-Stopp-Experiment, das viele Male durchgeführt wird. Alleerhaltenen Zeiten werden dann in einem Histogramm dargestellt. Es ergibt sich eine Kurve,als würden alle Photonen nach einem Anregungspuls gleichzeitig gemessen (siehe ebenfallsAbb. 7). Die erhaltene Lebensdauerkurve kann (bei einer Lösung mit nur einer Spezies undeiner Zerfallskonstante) durch einen monoexponentiellen Zerfall1 wie in (3.2) beschriebenwerden:

I(t) = I0 exp

(− t

τf

). (3.2)

Demzufolge ergibt sich durch halblogarithmische Auftragung der Signalintensität gegen dieZeit eine Gerade, aus der die Fluoreszenzlebensdauer erhalten werden kann.

Abbildung 6: Aufbau der TCSPC-Anlage. Über ein Spiegelsystem werden beide gepuls-te Anregungslaser übereinandergelegt und auf einen Küvettenhalter gelei-tet. Das emittierte Fluoreszenzlicht wird im rechten Winkel dazu auf eineAvalanche-Photodiode fokussiert.

1Machen Sie sich diesen Sachverhalt klar, indem Sie das Geschwindigkeitsgesetz der „Reaktion“ aufstellen!

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Abbildung 7: Prinzip des TCSPC. Entnommen aus: Wahl, M. (PicoQuant GmbH), Tech-nical Note Time-correlated single photon counting.

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4 Versuchsdurchführung

(i) Stellen Sie eine ca. 1µM Lösung des Ihnen zur Verfügung gestellten Farbstoffes inEthanol her.

(ii) Nehmen Sie ein Absorptionsspektrum auf.

(iii) Nehmen Sie ein Fluoreszenzemissions- und ein Fluoreszenzanregungsspektrum desFarbstoffes auf. (Worauf müssen Sie dabei achten? Was nehmen Sie zuerst auf?)

(iv) Messen Sie ein Fluoreszenzlebensdauerhistogramm ihrer Verbindung. (Worauf müs-sen Sie achten?)

5 Auswertung

(i) Berechnen Sie die Konzentration ihres Farbstoffes.

(ii) Berechnen Sie die Oszillatorstärke des langwelligsten Übergangs aus dem Absorpti-onsspektrum.

(iii) Berechnen Sie das Übergangsdipolmoment (in Debye) des Übergangs aus dem Spek-trum. Vergleichen Sie das Ergebnis mit dem Wert, den Sie erhalten, wenn Sie dievorher berechnete Oszillatorstärke und die Mittelfrequenz des Übergangs einsetzen.

(iv) Berechnen Sie den Einsteinkoeffizienten für die Absorption.

(v) Berechnen Sie die Franck-Condon-Faktoren im Absorptionsspektrum, indem Sie dasSpektrum mit Gaußkurven fitten und vernünftige Näherungen machen. BerechnenSie dann einen Wert für ∆q und diskutieren Sie das Ergebnis kurz.

(vi) Vergleichen Sie Absorptions- und Anregungsspektrum sowie Anregungs- und Emis-sionsspektrum. Entsprechen die Beobachtungen Ihren Erwartungen? Berechnen Siedie Stokes-Verschiebung des Farbstoffes. Was können Sie daraus schließen?

(vii) Berechnen Sie den Einsteinkoeffizienten für die spontane Emission. Verwenden Siedafür eine charakteristische Frequenz ihres Farbstoffes und vergleichen Sie das Ergeb-nis mit dem Wert, den Sie erhalten, wenn sie die Strickler-Berg-Relation verwenden.

(viii) Vergleichen Sie die aus dem Histogramm erhaltene Fluoreszenzlebensdauer mit der-jenigen, die sich aus der Strickler-Berg-Gleichung ergibt. Diskutieren Sie den Unter-schied und berechnen Sie die Quantenausbeute der Fluoreszenz.

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