Plant Biotechnology - TU Dortmund Bio-Engineering/Stehle... · Verbesserter Pflanzenschutz gegen...

Plant Biotechnology Methoden und pharmazeutische Arzneimittel

Felix Stehle

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© Felix Stehle - 2015

Transgene Pflanzen

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Vorurteile und Ängste

Genfood_2 fotocommunity.de - www.pfalz-express.de - sueddeutsche.de - studierendenwerk-kaiserslautern.de


Transgene Pflanzen

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Was für „Gen“-Pflanzen gibt es hauptsächlich?

Bt-Mais – mit Insekten- und herbizidresistenz wie der „Genmais 1507“

gensuisse.ch


Transgene Pflanzen

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Was ist sonst noch möglich?

Verbesserter Pflanzenschutz gegen Fraßfeinde und Pflanzenerkrankungen Erhöhte Konzentrationen an Naturstoffen in Pflanzen Neuartige Naturstoffe/ -strukturen (Biosimilars) mit veränderter biologischer Aktivität Neue Blüten- und Lebensmittelfarbstoffe Neue Geschmacks- und Parfümstoffe Vermeidung unerwünschter Nebeneffekte (Toxizität, Allergien) Verbesserter kalorischer und ernährungs-physiologischer Wert von Nahrungsmittel


„Versteckter Hunger“

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Vitamin-A-Mangel in Entwicklungsländern 140 Mio Kinder betroffen 500 000 erblinden jedes Jahr 250 000 sterben jedes Jahr

userpage.fu-berlin.de


Golden rice

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Das Vorzeigeprojekt

Erhöhung der Provitamin A Menge um den Faktor 23 Anbau auf den Philippinen ab 2016

allowgoldenricenow.org


Transformationsmethoden

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Wie kommt das „Gen“ in die Pflanze

Infektion mit Agrobakterium

Infektion mit viralen Vektoren

Biolistischer Gentransfer

Transformation von Protoplasten



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A. tumefaciens A. rhizogenes

Wurzelhals-Gallen Hairy roots



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A. tumefaciens und A. rhizogenes Gram-negativ Induktion von Pflanzen-Tumoren nach Verletzung Transfer von Bakterien DNA in Pflanzenzelle Auslöser sind Plasmide

Ti (tumor inducing)-Plasmind Ri (root inducing)-Plasmind



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vir-Gene (Virulenz-)

Tumorentstehung DNA-Transfer Wirtsspezifität

induzierbar durch phenolische Moleküle (z.B. Acetosyringon) und Monosaccharide

Produktion im Wundbereich verletzter Pflanzen



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T-DNA (Transfer-)

LB- , RB-Region Transfer und Einbau in Pflanzengenom

Pathogenitätsgene (onc) Auslösung des Tumor-ähnlichen Wachstums (Gene des Auxin und Cytokinin Stoffwechels) Gene für Synthese von Opinen



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Opin Katabolsimus

Opine = α-Ketosäure + Aminosäure Pflanzenzelle kann diese nicht metabolisierten werden sezerniert

Gene für Opinkatabolismus auf Ti-Plasmid N2-, C-, Energiequelle für A. tumefaciens



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Current Opinion in Biotechnology (2006) 17:147-154



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Agrobacterium erkennt Wirtszelle und docked an Verwundete Pflanzenzelle scheidet penolische Signale aus Weiterleitung der pflanzen-spez. Signale durch VirA–VirG. VirG-vermittelte Signaltransduktion aktiviert vir-Gene Erstellung einer Kopie der T-DNA und Hydrolyse des sense-Stranges durch VirD (T-strand, ssDNA) Bildung des VirB–VirD4 Transport- Komplexes, Transport odes T-strands und der Vir Proteine


Sense-, Antisense-Nukleinsäurestränge

16 www.pharmazeutische-zeitung.de



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Bildung des mature T-Komplexes Import des T-Komplexes in den Nukleus durch die pflanzeneignen Proteine AtKAP α , VIP1, Ran - Intranuklearer Transport des T-Komplexes zu Chromosomen, Einbau der T-DNA in das Genom durch VirD2 und/oder VirE2 und wirtspez. Faktoren



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Infektion mit Agrobakterium Was benötigt man für biotechnologische Nutzung?



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Aufspaltung in 2 Plasmide, binäres Vektorsystem natürliches Ti-Plasmid zu groß



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vir-Gene LB-, RB-Regionen ori für E. coli Resistenz für E. coli Resistenz für Pflanze Transgen mit pflanzenspez. Promotor und Terminator



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Transiente Expression keine dauerhafte Expression (Plasmid oder nicht in Keimzellen vorhanden)

Stabile Expression

dauerhafte Expression (Transgen wird auf Nachkommen übertragen)



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Infektion mit Agrobakterium - transient expression Nicotiana benthamiana - syringe

Nature Protocols 9, 1010–1027 (2014) - bio.tu-darmstadt.de



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Infektion mit Agrobakterium - transient expression Nicotiana benthamiana - vaccum



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Infektion mit Agrobakterium - stabile Expression Arabidopsis thaliana

„floral dip“

Agricultural and Biological Sciences "Transgenic Plants - Advances and Limitations“ - pbrc.org - science.leidenuniv.nl - sites.google.com - Nature Comm. 4, 2875



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Infektion mit Agrobakterium - stabile Expression leaf disc-Transformation

Molecular Biology of the Cell, 4th edition



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Infektion mit Agrobakterium - stabile Expression

agron-www.agron.iastate.edu

leaf disc-Transformation

SI- shoot induction ; RI - root induction


Zellkulturmethoden

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Überblick

scq.ubc.ca

Suspensionkultur (Einzelzellen)


Kallus Kulturen

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Definition

undifferenzierte, totipotente Zellen Wachstum auf Nährboden Induktion durch Phytohormone

dsmz.de

Totipotent: Fähigkeit einen vollständigen bzw. eigenständigen Organismus zu bilden


Kallus Kulturen

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Herstellung Konzentrationsverhältnisse

von Pyhtohormonen entscheidend für Kallus-, Spross- und Wurzelbildung Besonders wichtig:

Auxin und Cytokinine

Oberflächensterilisierung

Überführen von Pflanzenorganen auf Nährstoffagar mit Phytohormonen

Kallusformation (Proliferation)

Überführen des Kallusgewebe auf Nährstoffagar mit Phytohormonen

Kalluskultur

Pflanzenmaterial (Blätter, Wurzel …)


Kallus Kulturen

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Verwendung Produktion von sekundären Pflanzenstoffen

Synthese von Vorläufermolekülen, die chemisch modifiziert werden können Ausgangsmaterial für die vegetative Vermehrung von Pflanzen Stamm-Material für Hochleistungssorten (Erhaltungszucht)

dsmz.de



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gene gun



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geeignet für Pflanzen, Tiere, Mikroben transiente und stabile Expression möglich benötigt nur geringe Mengen an DNA keine carrier-DNA notwendig mehrere Plasmide können gleichzeitig eingebracht werden für sehr große DNA-Fragmente geeignet in situ, in vitro, in vivo und ex vivo Transformation möglich



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DNA-Partikel werden auf Wolfram- oder Gold- Partikel geladen Beim Durchtritt durch Gewebe wird DNA vom Partikel abgestreift Fremd-DNA kann so auch in Mitochondrien oder Chloroplasten eingebracht werden Transformationseffizienz: 1-5 %

Trends Biotechnol. (2007) 25(11):530-4



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Helios (Bio-Rad) gene gun-Prinzip

Trends Biotechnol. (2007) 25(11):530-4 - http://imgarcade.com



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Biolistischer Gentransfer - workflow

learn.genetics.utah.edu

transgenic tomato plant


Biotechnologische Nutzung

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Medizinische Anwendungen

Metabolic engineering

Therapeutische Proteine Enzyme Antikörper

sciencemag.org - northeastern.edu



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Atropa belladonna – Schwarze Tollkirsche

Gentechnik-Biotechnik, Kap. 4, S. 162 - de.honatur.com

Überexpression der H6H aus Hyoscyamus niger

(Bilsenkraut)

H6H - Hyoscyamin-6β-hydroxylase



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Gentechnik-Biotechnik, Kap. 4, S. 162



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Giftstoff, Wahrheitsdroge Vorkommen in Solanaceae-Arten

Grundstoff für Buscopan® Scopoderm® TTS Pflaster

Scopolamin


Therapeutische Proteine

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β-Glucocerebrosidase

Imiglucerase = humane β-Glucocerebrosidase Produktion in CHO Zellen und Glycan-Modelling „Orphan Drug“ bei Morbus Gaucher Therapiekosten: 140.000 € pro Jahr

Gentechnik-Biotechnik, Kap. II.19, S. 801

Orphan Drug: Arzneimittel für seltene Leiden



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Morbus Gaucher

Störung des Fettstoffwechsels verringerte Aktivität der Glucocerebrosidase in Lysosomen aufgrund von Mutationen Glucocerebroside (zuckerhaltige Fettstoffe) werden nicht gespalten Anreicherung in Makrophagen und in Monozyten Freisetzung von Zytokinen entzündliche Zerstörung innerer Organe und Skelett





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Glycan-remodeling Freilegen der Mannose-Reste () Bindung an Mannose-Rezeptor auf Makrophagen Effektivere Aufnahme




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Gentechnik-Biotechnik, Kap. II.19, S. 801 - Nature Biotechnology 30, 472 (2012)

Daucus carota



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Glykanstruktur nach Produktion durch Daucus carota macht Modifikation unnötig

Plant Biotechnology Journal (2007) 5, 579–590



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Erhöhte Aufnahmeraten in die Makrophagen ohne nachträgliche Modifikation

Kinetik Absolute Aufnahme

Plant Biotechnology Journal (2007) 5, 579–590



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seit 2012 von der FDA zugelassen seit 2014 auch für Kinder noch keine Zulassung in Europa erstes plant-made Arzneimittel mit FDA-Zulassung

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