日皮会誌:101 (7), 743―746, 1991 (平３）

Polymerase Chain Reaction （ＰＣＲ）法による

　　　　　ツツガムシ病のＤＮＡ診断

　杉田　泰之　　松崎　敏子　　中嶋　英子＊　中嶋　　弘

　　　　　　　　　　要　　旨

　Polymerase chain reaction (ＰＣＲ)法を用いてツツ

ガムシ病の病原体であるRicfeettｓia　tｓＭtｓＭｇｏｗiMｓhiに

特異的なＤＮＡ断片を検出した，この方法を用いてツ

ツガムシ病患者の血液からＲ.　tｓｕtｓｕｇａｍｕｓhi　ｔｏDNA

が検出できることを示し, PCR法によるツツガムシ病

のＤＮＡ診断の可能性を示した．

　　　　　　　　　　緒　　言

　Polymerase chain reaction (ＰＣＲ)法とは，遺伝子

ＤＮＡの特定の領城を増幅して検出する方法1)で，遺伝

性疾患における変異遺伝子の検出2)3)や感染症におい

て病原体に特異的なＤＮＡの検出4)5)などに応用され

ている．

　ツツガムシ病の病原体リケッチアはＲｉｃ.he.ttＲｉａ tＫＵt-

ＳＭｇａｍｉtｓJiiと命名され，血清学的に抗原性が高いとさ

れている58kilodalton (kD)の菌体蛋白は他のリケッ

チア感染症の患者血清との交叉が少く，そのアミノ酸

配列は熱ショック蛋白60との相同性が高いことが知ら

れている6).

　ＰＣＲ法を用いて，ＲパＳＭtＳＭｇＯＷＭｓktの58kD蛋白を

コードする遺伝子の断片を検出し，同じＤＮＡ断片を

ツツガムシ病患者の血液から検出することによって，

従来の血清学的な診断法よりも高感度でより特異性の

高い診断が可能であると思われる．

　　　　　　　　　　材料と方法

　1)材料

　ツツガムシ病の病原体であるＲ，tＳＭtｓＭｇａｗiMｓhiの

Karp, Kato, Gilliam, Kuroki, Kawasaki型各菌株

と，紅斑熱群の病原体であるＲ.　ｒicketti, Ｒ.　ｓihiｒｉｃａを

それぞれ感染させたマウスＬ細胞からＤＮＡを抽出

した．患者材料として，痴皮を伴う刺し口と全身に散

　横浜市立大学医学部皮膚科学教室（主任　中嶋　弘

　教授）

＊神奈川県立足柄上病院皮膚科部長

平成３年３月11日受付，平成３年４月19日掲載決定

別刷請求先:（〒232)横浜市南区浦舟町3 －46　横浜

　市立大学医学部皮膚科学教室　杉田泰之

在する紅斑，発熱，全身倦怠感などのツツガムシ病の

典型的な臨床症状を示した感染後約20日を経たと思わ

れる患者の末梢血を用いた．ツツガムシ病の病原体リ

ケッチアに対する抗体価はGilliam型ではIgMx

160, IgGx80, Karp型ではIgMxlO, IgGx40, Kato

型ではｌｇＭく×10, IgGx 40, Kawasaki型ではIgMx

80, IgG>×320, Kuroki型ではIgMxiO, IgGx40で

あった.

　2)方法

　ＤＮＡの抽出：各菌株の感染したマウスＬ細胞を

lysis buffer (500μg/ml ProteinaseK, 2 %SDS, 10

mMtrisHCl(pH8), 150mM NaCl, lOmM ＥＤＴＡ)

に浮遊させ，37℃で一晩振蕩した後，フェノールとク

ロロホルムを用いて除蛋白し，エタノール沈澱で

ＤＮＡを調整した7).患者の血液0.5mlを２倍濃度の

lysis bufferと混合し，以下同様にしてＤＮＡを調整し

た．

　ＰＣＲ法：Ｒ，tｓＭtｓＭｇａｍｉｉｓhiのKarp型株の58kD蛋

白をコードするＤＮＡ塩基配列6)の中で，①濯

ＧＴＡＣＡＴＧＧＣＧＡＴＣＡＡＴＧＴＣＧＴＡＡ)，②(５'

ＧＴＴＴＣＡＴＣＴＡＡＴＧＧＡＧＡＣＣＧＣＧＡＡ)，③濯

ＣＡＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＴＴＴＴＡＧＡＡＴＣ)の三種類のプ

ライマーを用いることにより，①と③，②と③を用い

たＰＣＲで各々538bpと109bpのＤＮＡ断片が増幅さ

れるように設定した. PCR法の反応条件は, 94°C 1分，

56℃1.5分, 72°C 1分を１サイクルとし，40サイクルの

反応を行い，反応後のＰＣＲ産物の一部を１％アガ

ロースゲルで電気泳動してＤＮＡ断片の増幅を確認し

た．

　塩基配列の決定:ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル

で電気泳動した後，目的ＤＮＡ断片を含むゲルをカッ

ターで切り出し，抽出したＤＮＡを制限酵素Ｓ片峨lで

切断したM13mpl8ファージにサブクｐ－ニングして

dideoχynucleotide chain termination法7膳

基配列を確認した．

　　　　　　　　　　結　　果

　Ｒ.　tｓｕtｓｕｅａｍｕｓhiのKarp,Kato, Gilliam, Kuroki,

744

R. tsu

杉田　泰之ほか

R.r　R. s

Karp Kato Gill. Kuro.Kawa.

MABABABABABAＢ Ａ Ｂ

|七言旭i臨無641頑溜lsl瑠白11贈。m。=;GI∩ﾌｿﾞ

頗評作十

i:tii!:iiifBi‖　　　㎜　㎜　⇔’㎜　㎜　･………:

ﾆ……l

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iJijJjjﾗﾔ才了yj゛7

　jザ’

５３８ －

１０９ －

R. tsu

　Karp (-)

Human

ｉ‖ｌ目接目41日接目卜ｌ川－肝i＼s

　　　　･---|||㎜■･･■■|||　・

１

｡- 345

　　　　　　Fig. 2　negative control of PCR.

R.tsu■.　ＲｉｃｋｅttｓiatｓＭtｓｕｇａｍttｓhi，（－）:no template

DNA, human : human genomic DNA

５３

:LO

８

９

AB

一

一

一

席⇔

　　　　　　　　　　　　　一一

Fig. 3　Specific DNA amplification from patient's

　blood.

に刺されることによって感染し,7～12日の潜伏期の後

40℃前後の発熱が出現する．テトラサイクリン系冲ク

ロラムフェニコール系の抗菌剤が著効を呈するが，抗

菌剤が使用される以前は死亡例も少くなく，以前は東

北地方の一部や伊豆七島に限局する疾患とも考えられ

ていたが最近では全国的に発生しており，早期診断と

適切な抗菌剤による早期治療が重要である．ツツガム

シ病の診断は節足動物の特徴的な刺し口，皮疹や発熱

その他の臨床症状，さらにWeil-Felix反応やＲ.　tｓｕt-

Ｓ昭ａｍｕｓhiに対する血中抗体価の測定によるが，抗体

価の測定は病初期などの抗体価が低い場合には不適切

であり，菌株による抗体の特異性も考慮しなくてはな

Fig. 1　PCR amplified DNA fragments. Agarose

　gel electrophoresis of PCR products shows the

　amplification of 538 bp （Ａ）and 109bp （Ｂ）ＤＮＡ

　fragment in Ｒ.　tｓｕtｓｕｅａｍｉtｓＭ，

　R. tsu-.　Ricfedtｓia iｓｕtｓｕｓａｍＭ＆hi･，ＲＡ　･-　Ricfeeftｓia

　ｒicketii, R.s: Riｒfefittｓia 　ｓibiｒｉｃａ，Ｍ: DNA size

　ｍａｒkeｒS（ψχ174H(ie Ill digest)

Kawasakiの各型菌株を鋳型ＤＮＡとした場合，プラ

イマー①と③，②と③を用いた各々のＰＣＲで, 538bp

(Ａ)と109bp(Ｂ)のＤＮＡ断片が増幅され，Ｒ.　ｒicketti

とＲ，ｓibiｒｉｃａではこれらのＤＮＡ断片は検出されな

かった(図１)．対照として鋳型ＤＮＡを用いずに同じ

プライマーを用いてＰＣＲを行ったがＤＮＡ断片の増

幅はみられず，β■globin遺伝子が増幅できるヒトのゲ

ノムＤＮＡを鋳型ＤＮＡとしてもこれらのＤＮＡ断片

は増幅されなかった(図２)．

　次に臨床的にツツガムシ病と診断された患者の血液

から抽出したＤＮＡを鋳型ＤＮＡとした場合, 538bp

と109bpのＤＮＡ断片が増幅され(図3), 538bpの

ＤＮＡ断片の塩基配列をdideoxynucleotide chain ter-

mination法を用いて確認したところ,文献的に報告さ

れているＲ.　tｓｕtｓｕｓａｍｕｓhiの塩基配列と一致した．

　　　　　　　　　　考　　按

　ＰＣＲ法はＤＮＡポリメラーゼを用いて２個のプラ

イマーオリゴスクレオチド間の標的ＤＮＡを増幅させ

る反応であり，微量のＤＮＡを数十万倍から百万倍に

増幅させることができる8).

　1985年にSaikiら1)によって報告されて以来，医学

を含めた生物学の多くの分野に広く応用されており，

病原体のＤＮＡを検出することによって感染症の診断

にも応用されている．

　ツツガムシ病は病原体リケッチアを有する節足動物

ツツガムシ病のＰＣＲ診断

）ない.

　ＰＣＲ法による感染症の診断は極めて高感度で，理論

りには病原体が一個存在すれば病原体に特異的な

）ＮＡの検出が可能である．今回の実験では，瓦か厨-

昭ａｍ心証の熱ショック蛋白60の一部とみられる58

Dの蛋白をコードする遺伝子の一部をＰＣＲ法にて

l出した．熱ショック蛋白は多くの生物種の間で構造

･;類似しており, PCR法によってＤＮＡを検出する場

ﾔ,他の生物種との交叉性を十分に考慮すべきである．

ダ回ＰＣＲ法のプライマーオリゴヌクレオチドとして

l定した塩基配列は文献的な検討6）によって他の生物

Ｒとの相同性が低い配列を選んであり，患者の血液か

ンヒト由来のＤＮＡを増幅することは考えられない

図２入すなわち患者の血液からＰＣＲ法によって以

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　文

　D Saiki RK, Scharf S， Faloona F, et al:　En-

　　　zymatic　amplification　ｏｆβ■globin　genomic

　　　sequences and restriction site analysis for diag･

　　　nosis of sickle cell anemia, Sc加?7a?, 230 :

　　　1350-1354, 1985.

　2) Kogan sc, Doherty Ｍ， Gitschier J :　An ｉｍ･

　　　proved method for prenatal diagnosis of genetic

　　　diseases　by　analysis　of　amplified　DNA

　　　sequences, A''£昭/フガ'ed. 317 : 985-990, 1987.

　3) Chamberlain JS, Gibbs RA, Ranier JE, Nguyen

　　　PN, Caskey CT :　Deletion screening of the

　　　Duchenne muscular dystrophy locus via multi-

　　　piex DNA amplificaton,ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅs,16 :

　　　11141-11156, 1988.

　4) Ou CY, Kwok S, Mitchell sw, et al:　DNA

　　　amplification for direct detection of HIV-1 in

　　　DNA of peripheral blood mononuclear cells,

　　　Science. 239 : 295-297, 1988.

　5) Duggan DB, Ehrlich GD, Davey FP, et a1:

745

上に述べたＤＮＡ断片が検出されたならば，その患者

はツツガムシ病の病原体リケッチアに感染していると

考えられる．さらにこの方法は従来の血清学的な診断

法に比べて極めて高感度で，血中抗体価の上がらない

病初期でも診断が可能であると思われる.

　ＰＣＲ法による感染症のＤＮＡ診断は,抗体価の低い

場合や抗体の特異性に問題がある場合にも極めて高感

度に行うことができるため，今後も多くの感染症の診

断に応用されていくことであろう．

　稿を終えるにあたり，リケッチア感染細胞を分与してい

ただいた神奈川県立衛生研究所の古田芳哉博士並びに，御

協力いただいた横浜市立大学医学部細菌学教室の奥田研爾

教授に深く感謝いたします．

献

　　HTLV-I-induced lymphoma mimicking Hodg-

　　kin's disease. Diagnosis by polymerase chain

　　reaction　amplification　of　specific　HTLV-I

　　sequences in tumor DNA. Ｂｌｏｏｄ.　1＼１．

　　1027-1032, 1988.

6) Stover CK, Marana DP, Dasch GA, Oaks ＥＶ:

　　Molecular cloning and sequence analysis of the

　　Sta ５８major antigen gene of Ｒｉｃｋｅttｓiats吐

　　ｓｕｓａｍｕｓhi:sequence homology and antigenic

　　comparison of Sta 58 to the 60-kiloda!ton ｆａｍ･

　　ily of stress proteins, /れμｄ Ｉｍｍｕｎ，58 :

　　1360-1368, 1990.

7) Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T :　Molecu-

　　lar cloning ａ laboratory manual, 2n(l Ed, Cold

　　Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Har-

　　bor, NY, 1989.

8）杉田泰之，石井則久，奥田研爾. PCR法の実際と

　　応用，臨床免疫，22 : 283-289, 1990.

746 杉田　泰之ほか

Polymerase Chain Reaction for the Diagnosis of T sutsugamushi Disease

　　Yasuyuki Sugita,Toshiko Matsuzaki, Hideko Nakajima* and Hiroshi Nakajima

　　　　　Departmentof Dermatology,Yokohama CityUniversity,SchoolofMedicine

　　　　　　　　　　　　　　　　　*AshigarakamiHospital

　　　　　　　(ReceivedMarch 11，1991;acceptedforpublicationApril19,1991)

　　A polymerase chain reaction(PCR) using specificoligonucleotideprimers and Taq polymerase was developed

for the detection of 拓ｄ�tsia tsutsu即mushi, the causative agent of tsutsugamuschi disease. Oligonucleotide

primers were synthesized on the basis of DNA sequences encoding ５８kD antigen of 瓦tsutsu即mushi. SpecificDNA

amplification of 358 bp and 109 bp DNA fragments were demonstrated using patient'sblood. This PCR method

would enable to make ａrapid and sensitivediagnosis of tsutsugamushi disease。

　　(Jpn J Dermatol 101: 743～746,1991)

Key words:　polymerase chain reaction,tsutsugamushi disease,diagnosis