Präzision in der HPLC

Udo Schepers1, Joachim Ermer2,Lutz Preu1, Hermann Wätzig1

1Institut für Pharmazeutische ChemieUniversität Braunschweig

2Aventis, Global Analytical Development

h.waetzig@tu-bs.de

• Akzeptanzkriterien• Abhängigkeit von der Konzentration• Varianzkomponenten

„ ... enthält mindestens 98.5 undhöchstens 101.0 Prozent ..., berechnet aufdie getrocknete Substanz.“

Akzeptanzkriterien des Gehaltes für Wirkstoffe

Miller, J. H. McB., European Directorate for the Quality of Medicines (EDQM),Straßburg; Positionspapier der Fachgruppe Arzneimittelkontrolle/PharmazeutischeAnalytik der Deutschen Pharmazeutischen Gesellschaft

unteres Akzeptanzkriterium:

TSDTSILAL ���� 3%%100

oberes Akzeptanzkriterium:

TSDUAL ��� 3%100

0.3%

%TSI: percental total sum of impurities

0.3%

1%

1%

0.5% = 98.5%

= 101.0%

TSD: target standard deviation

Methoden Substanzbeispiele TSDTitrationen- im wässrigen Milieu mitAlkali, Farbindikator

Salicylsäure 0.2 %

- im wässrigen Milieu mitAlkali, potentiometrischeIndikation

Salicylsäure 0.3 %

- im nicht-wässrigen Milieu mitAlkali, Farbindikator

Ephedrinhydrochlorid,racemisch

0.4 %

- im nicht-wässrigen Milieu mitAlkali, potentiometrischeIndikation

Ephedrinhydrochlorid,racemisch

0.4 %

UV-Spektrometrie Prednisolonacetat, u.a.1) 0.6 % - 1.3 %Flüssigchromatographie(HPLC)

Cloxacillin-Natrium 0.6 %2)

1) Cinnarizin, Dienestrol, Albendazol und Methylprednisolon-hemisuccinate2) ev. teilweise höher, vgl. UV-Spektrometrie

Daas, A. G. J., Miller, J. H. McB., Pharmeuropa 10(1), 137-146 (1998)

0.6%

Analyt Sulfonamide, MW ~ 400Drug product Film tablet 4 mgCommentsConditions 25°C/60%RH

Date of analysis Storage LC Assay 0,2mg/ml 10µl 228nminterval prep 1 prep 2 prep 3

23.01.98 0 3,907 3,914 3,90823.01.98 3 3,954 4,121 4,05121.04.98 6 3,902 3,945 3,96531.07.98 9 3,967 3,987 4,08307.10.98 12 4,02 3,998 3,97326.04.99 18 3,895 3,93 3,89

Berechnungen von Präzisionen ausStabilitätsstudien

Individual Repeatability

0,00%

0,50%

1,00%

1,50%

2,00%

2,50%

3,00%

3,50%

4,00%

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Drug Product / Analyte

RSD

1 Aerosol 5 med. Bad 8 Gel 11-16 Lösungen 18-37 Tabletten 2-4 Wirkstoffe (APIs) 6-7 Cremes 9-10 Lyophilisate 17 Suspensionen

TSD = 0.6% führt also zuvernünftigem Ergebnis:3 * TSD = 1.8%, aufgerundet 2%

Akzeptanzkriterien für die Zulassung

EU: 95 und 105% des deklarierten Gehalts

assay

R

nPLAK �̂23.2%100 �

���

J. Ermer, M. Fischer, B. Renger, H. van Lishaut, H. Wätzig,http://www.tu-bs.de/institute/pharmchem/dphg_pospapier.pdf

� 2.5%

� 2.5%

Reproducibility

0,00%

0,50%

1,00%

1,50%

2,00%

2,50%

3,00%

3,50%

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Drug Product / Analyte

RSD

1 Aerosol 5 med. Bad 9 Gel 12 Salbe 13-19 Lösungen 21-44 Tabletten 2-4 Wirkstoffe (APIs) 6-8 Cremes 10-11 Lyophilisate 20 Suspensionen

Ratio Reproducibility / overall Repeatability

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Drug Product / Analyte

Rat

io

1 Aerosol 5 Bad 9 Gel 12 Salbe 13-19 Lösungen 21-44 Tabletten 2-4 APIs 6-8 Cremes 10-11 Lyophilisate 20 Suspensionen

= 100% ± 5.6%

Vergleichspräzision undAkzeptanzkriterien

assay

R

nPLAK �̂23.2%100 �

��� � 2.5% 1.73

2.4%

Die FG Arzneimittelkontrolle der DPhG schlägt vor, imNormalfall höchstens eine Dreifachbestimmungdurchzuführen.

Obere Grenze der Vergleichspräzision in der HPLC: 2.4%

� 1.9% ± 5.0%

Wiederhol-Standardabweichung

Probenaufbereitung Systempräzision

Einwaage Verdünnung Injektion Integration

Varianzkomponenten in der HPLC

1124

, 2,

2212

10,

2,39

1470

, 3,

06

3057

670,

8,3

6

7075

, 10

,08

5600

, 10

,90

SAMP 400N-Meth 0InhibSens 20

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Retention Time (min)

-0,01

0,00

0,01

0,02

0,03

0,04

Intensity (AU)

Beispiel: HPLC, Glibenclamid +Nebenkomponenten

NH

OS

NH

OO

NH

O

OCH3

Cl

0

0,4

0,8

1,2

1,6

2

0% 20% 40% 60% 80% 100% 120%

Einwaage in Prozent

RSD

+ R

SD-S

YS

Präzision bei 10 - 120% des Nominalgehaltes

Verlauf der Wiederholbarkeit und der Systempräzision:

Die restliche Variation ist durch die Probenaufbereitungbedingt. Ca. 0,63%, da 0,702 = 0,312 + 0,632.

1124

, 2,

2212

10,

2,39

1470

, 3,

06

3057

670,

8,3

6

7075

, 10

,08

5600

, 10

,90

SAMP 400N-Meth 0InhibSens 20

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Retention Time (min)

-0,01

0,00

0,01

0,02

0,03

0,04

Intensity (AU)

02468

10121416

0,0% 0,1% 1,0% 10,0%

Einwaage in Prozent

RSD

Der Anteil der Systempräzision an der Gesamtvariabilitätwird stetig größer.

Präzision unterhalb 10% des Nominalgehaltes

Verlauf der Wiederholbarkeit und der Systempräzision:

Integrationsfehler

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Retention Time (min)

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

Intensity (AU)

100%

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Retention Time (min)

0,000

0,005

0,010

0,015

0,020

0,025

Intensity (AU)

1%

Integrationsfehler

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Retention Time (min)

0,000

0,005

0,010

0,015

0,020

0,025

Intensity (AU)

0,1%

Integrationsfehler

0,1%

0,05%

Integrationsfehler

Konzentrationsabhängigkeit fürweitere Substanzen

0

2

4

6

8

10

12

14

16

0,01% 0,10% 1,00%

Concentration

RSD

%

53146

UV-Spektrum von Glibenclamid

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0,70

0,80

0,90

1,00

200 210 220 230 240 250 260 270 280

Wavelength

Nor

mal

ized

Auswertung bei 210, 228 und 240 nm

Systempräzision bei denverschiedenen Wellenlängen

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

8,00

0,01% 0,10% 1,00% 10,00% 100,00%

Concentration

RSD

%

210 nm 228 nm 240 nm

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0,70

0,80

0,90

1,00

200 210 220 230 240 250 260 270 280

Wavelength

Norm

aliz

ed

Präzision und Integrationssoftware

2.00

1.80

1.60

1.40

1.20

1.00

0.80

0.60

0.40

0.20

0.00

Absorption

0.00 2.00 4.00 6.00 8.00

Time [min]

2.85

6.26

B. Schirm, H. Wätzig, Chromatographia 48, 331-346 (1998)

Präzision und Integrationssoftware 2.00

1.80

1.60

1.40

1.20

1.00

0.80

0.60

0.40

0.20

0.00

Absorption

0.00 2.00 4.00 6.00 8.00

Time [min]

2.85

6.26

Kommerziell erhältliche Software: 2.9 - 3.5% RSD%

KISS-Software: 0.5 - 0.7% RSD%

B. Schirm, H. Wätzig, Chromatographia 48, 331-346 (1998)

Präzision in der HPLC:Schlussfolgerungen

• TSD von 0.6% berücksichtigt den analytischenFehler zufriedenstellend

• Obere Grenze für die Wiederholbarkeit (RSD%):etwa 2%

• Obere Grenze für die Vergleichbarkeit (RSD%):etwa 2.4%

• Weitere Verbesserung der Präzisionwünschenswert (vgl. Akzeptanzkriterien)

• höhere Konzentrationen (� 10% eines deklariertenWertes): Probenvorbereitung dominiertanalytischen Fehler

• geringere Konzentrationen (< 1% einesdeklarierten Wertes): Peakintegration dominiertanalytischen Fehler

Präzision in der HPLC:Schlussfolgerungen

• höhere Konzentrationen(� 10% eines deklariertenWertes): Probenvorbereitungdominiert analytischenFehler

• geringere Konzentrationen(< 1% eines deklariertenWertes): Peakintegrationdominiert analytischenFehler

Präzision in der HPLC:Schlussfolgerungen

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

80,00

90,00

100,00

0,50 1,50 2,50 3,50 4,50

Wiederholbarkeit RSD%

% A

ntei

l an

Ges

amtv

aria

nz

Integration

Probenvorbereitung

Injektion

• Brigitte Babic

• Aventis

• höhere Konzentrationen(� 10% eines deklariertenWertes): Probenvorbereitungdominiert analytischenFehler

• geringere Konzentrationen(< 1% eines deklariertenWertes): Peakintegrationdominiert analytischenFehler

Präzision in der HPLC:Schlussfolgerungen

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

80,00

90,00

100,00

0,50 1,50 2,50 3,50 4,50

Wiederholbarkeit RSD%

% A

ntei

l an

Ges

amtv

aria

nz

Integration

Probenvorbereitung

Injektion