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AG Prof. R. Lill, Institut für Zytobiologie

Praktikum Humanbiologie II (5. Semester)

Untersuchungen zur essentiellen Rolle der Cystein-D esulfurase

Nfs1 mit Hilfe der RNA-Interferenz-Technik (RNAi)

Einleitung

Eisen-Schwefel-Zentren (Iron-Sulfur-Cluster, ISC) sind anorganische prosthetische Gruppen,

die für die Funktion einer immer größer werdenden Anzahl von Proteinen notwendig sind. Zu

diesen Proteinen zählen beim Menschen unter anderem die Komplexe I, II und III der

mitochondrialen Atmungskette oder die zytosolischen Proteine IRP1 (iron regulatory

protein 1) und Rli (RNase L inhibitor). In den ISC geht Eisen sowohl mit elementarem

Schwefel als auch mit dem Schwefel von Cystein-Resten der Polypeptidkette koordinative

Bindungen ein (Abbildung 1).

Abbildung 1: Einfache Eisen-Schwefel-Zentren. Das

rhombenförmige [2Fe/2S]- und das kubane [4Fe/4S]-

Zentrum sind die am häufigsten vorkommenden ISC.

Eisen ist in dunkelgrau, Schwefel in hellgrau dar-

gestellt. [J. Balk, R. Lill, ChemBioChem 5 (2004)].

Zurzeit wird die Synthese von ISC im Rahmen der Reifung von Eisen-Schwefel [Fe/S]

Proteinen unter anderem am Modellorganismus der Bäckerhefe (Saccharomyces cerevisiae)

intensiv untersucht. Bislang sind in eukaryontischen Zellen drei Maschinerien bekannt, die für

die Reifung von [Fe/S]-Proteinen notwendig sind: Je eine mitochondriale ISC (Iron-Sulfur-

Cluster Assembly) und eine cytosolische CIA (Cytosolic Iron-Sulfur-Cluster Assembly)

Maschinerie, sowie eine sogenannte ISC Export Maschinerie, die die beiden letzteren

funktionell miteinander verbindet. Die mitochondriale ISC Maschinerie ist von

entscheidender Bedeutung für die Synthese aller [Fe/S]-Proteine einer eukaryotischen Zelle

und besteht aus mindestens 15 Komponenten. Eine davon ist die Cystein-Desulfurase Nfs1,

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die Cystein in Alanin konvertiert und den dabei freiwerdenden Schwefel für die Synthese von

Eisen-Schwefel-Zentren zur Verfügung stellt (Abbildung 2).

Abbildung 2 Modell zur Reifung von [Fe/S] Proteinen in der Hefe. Zweiwertiges Eisen gelangt über einen Transmembrantransporter (Mrs3/4p) in die mitochondriale Matrix und bildet zusammen mit Schwefel, der von Nfs1p durch Konvertierung von Cystein zu Alanin zur Verfügung gestellt wird, auf einem dimeren Trä-gerprotein aus Isu1p / Isu2p einen transienten ISC. An Bildung und Übertragung des ISC auf mitochondriale Proteine sind weitere Kom-ponenten wie Frataxin (Yfh1p) und die Chape-rone Ssq1p, Jac1p sowie Glutaredoxin5 (Grx5p) beteiligt. Daneben ist die mitochondriale ISC Assemblierungsmaschinerie auch essentiell für die Reifung extramitochondrialer [Fe/S] Proteine. Möglicherweise werden ISC-Vorstufen über einen ABC-Transporter (Atm1p) ins Zytosol transportiert, wo sie mit Hilfe einer eigenen Maschinerie (u. a. Cfd1p, Nar1p) an extramitochondriale Proteine geliefert werden. [J. Balk, R. Lill, ChemBioChem 5 (2004)].

Zusätzlich zur zentralen Rolle, die Nfs1 bei der mitochondrialen Biogenese von Eisen-

Schwefel-Zentren spielt, gibt es Hinweise darauf, dass Nfs1 zumindest in geringen Mengen

auch in Zytosol und Nukleus vorkommt. Möglicherweise ist Nfs1 im Nukleus am Splicing

und/oder der postranskriptionalen Modifikation von t-RNAs beteiligt. Bei Saccharomyces

cerevisiae konnte eine essentielle Funktion von nukleärem Nfs1 bereits wahrscheinlich

gemacht werden.

Im Vergleich zur Hefe ist über die Reifung von [Fe/S] Proteinen in Säugerzellen, und hier

insbesondere beim Menschen, nur wenig bekannt. Es gibt jedoch zu allen maßgeblichen

Proteinen der Hefe, die an diesem Prozess beteiligt sind, humane Homologe. Dazu zählt auch

humanes Nfs1. Eine Möglichkeit, um dessen Funktion in menschlichen Zellen zu untersu-

chen, ist seine Depletion und die Analyse der daraus resultierenden zellulären Veränderungen.

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Ein aktueller Ansatz zur Depletion von Proteinen in Säugerzellen ist die RNA-Interferenz-

(RNA interference, RNAi) Technik (Abbildung 3). Sie beruht auf der Beobachtung, dass vor

allem kurze Stränge (19 bis 22 Nukleotide) doppelsträngiger RNA die Degradation komple-

mentärer endogener mRNA hervorrufen können. Der molekulare Mechanismus der RNA-

Interferenz wird zurzeit ebenfalls intensiv untersucht. Im Prinzip wird doppelsträngige RNA

durch eine Nuklease namens Dicer erkannt und in kurze doppelsträngige Fragmente gespalten

(small interfering RNA, siRNA). Die siRNA-Duplices rekrutieren weitere Proteine, sodass

sich ein Ribonukleinpartikel (RNP) bildet, in dem die Duplex-RNA zumindest teilweise

entwunden wird. RNP rekrutiert wiederum andere Proteine, und es entsteht ein Komplex

(RNA induced silencing complex, RISC), der mit Hilfe der einzelsträngigen siRNA an

komplemetäre mRNA binden und sie spalten kann.

Abbildung 3: Depletion von Nfs1 mit Hilfe der RNAi-Technik. Ein 19 Nukleotide langes Stück cDNA der Nfs1

mRNA wird zusammen mit seiner inversen Sequenz und einem kurzen Zwischenstück in den Vektor pSUPER

ligiert und in Säugerzellen exprimiert. Es bildet sich doppelsträngige RNA mit einer Haarnadelschleife, die von

Dicer erkannt und in siRNA gespalten wird. Die siRNA rekrutieren den RISC-Komplex, der seinerseits zur

Degradation der endogenen Nfs1 mRNA führt.

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Aufgabenstellung

Dieser Praktikumsteil gibt Einblicke in den aktuellen Stand der Forschung zur Biogenese von

[Fe/S]-Proteinen und in eine dabei verwendete, vielversprechende Methodik. HeLa-Zellen

(humanes Cervix-Karzinom) werden mit einem Vektor (huNFS1-R3) transfiziert, der eine

kurze cDNA-Sequenz des humanen Nfs1 beinhaltet und zur endogenen Produktion von

siRNAs gegen die mRNA von Nfs1 führt (Abbildung 3). Gleichzeitig werden die Zellen mit

einem weiteren Vektor (pEGFP-N3), der für ein grün fluoreszierendes Protein kodiert,

kotransfiziert. Über mehrere Tage hinweg werden die Zellen beobachtet und dabei ihr

Erscheinungsbild, ihre Zahl, die Proteinmenge, die Aktivität der Succinat Dehydrogenase

(SDH; Teil von Komplex II der Atmungskette, ein [Fe/S] Protein), sowie der Anteil der grün

fluoreszierenden Zellen bestimmt.

Durchführung

Die Untersuchung der zellulären Effekte nach Depletion von Nfs1 in HeLa-Zellen unter-

gliedert sich in zwei Teilexperimente, von denen jedes von jeweils zwei Gruppen

durchgeführt wird. Zwei Gruppen transfizieren unbehandelten HeLa-Zellen, und zwei

Gruppen arbeiten mit bereits transfizierten Zellen und untersuchen die zellulären Effekte nach

einer Re-Transfektion.

Tag 0: Transfektion

� Medien

Zellkulturmedium: - Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) mit - 7,5 % fötalem Kälberserum (FCS) - 1 mM Glutamin - 1 % Penicillin/Streptomycin

Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS, pH ~ 7,4): - 0,8% NaCl - 0,02% KCl - 0,104% Na2HPO4 - 0,02% KH2PO4

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Transfektionspuffer (EP-Puffer, pH = 7,15): - 21 mM Hepes

- 137 mM NaCl - 5 mM KCl - 0,7 mM Na2HPO4 - 6 mM Dextrose (D-Glukose)

� Ernte der Zellen (vgl. auch Kursteil Zellkultur und Fluoreszenzmikroskopie)

1. Kulturmedium aus einer 80 cm2 Flasche mit HeLa-Zellen in ein 50-ml-Röhrchen

überführen und aufheben (konditioniertes Medium)

2. Zellen 1x mit purem DMEM (kein FCS!) vorsichtig abspülen (waschen), Waschmedium

verwerfen

3. 3 ml Trypsin/EDTA zugeben, 5 bis 10 min bei 37°C inkubieren bis sich der Zellrasen vom

Boden löst

4. Abgelöste Zellen in 5 ml frischem Kulturmedium aufnehmen, in 15-ml-Röhrchen

sammeln; Flasche mit 6 ml Kulturmedium nachspülen

5. Abgelöste Zellen (aus 4.) und konditioniertes Medium (aus 1.) zentrifugieren: 250×g,

10 min., RT

6. Pellet der trypsinierten Zellen (aus 4.) trocken saugen, in 1 ml Transfektionspuffer

resuspendieren und auf 10 ml mit Transfektionspuffer auffüllen

7. 200 µl entnehmen für Zellzahlbestimmung (Zellen zuvor gut resuspendieren !!!)

8. Zentrifugation: 250×g, 10 Min., RT

9. Währenddessen:

9a) Bestimmung der Zellzahl in der Zählkammer (vgl. dazu Herstelleranleitung; vor jeder

Probenentnahme Zellen gut resuspendieren !!!)

- Zellsuspension im Verhältnis 1:5 mit PBS verdünnen

- auf jeder Seite der Zählkammer etwa 30 bis 40 µl Zellsuspension einführen

- zwei- bis viermal jeweils 16 Zählfelder auszählen und Mittelwert bilden

- Berechnung der Zellzahl:

Gesamtzellzahl = Mittelwert x Kammerfaktor x Verdünnung x Gesamtvolumen

Konzentration in der verdünnten Probe (pro ml)

Konzentration in der unverdünnten Probe (pro ml)

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9b) Vorbereitung der Aussaat

- frisches und konditioniertes Kulturmedium im Verhältnis 4:1 mischen

- je 30 ml dieser Mischung in zwei 50-ml-Röhrchen überführen

- zweimal vier 25 cm2 Flaschen vorbereiten (je vier für Kontroll- und RNAi-/

Komplementierungsansatz)

10. Pellet der trypsinierten Zellen (aus 4. bzw. 6.) trocken saugen, Zellpellet in 1 ml

Transfektionspuffer resuspendieren

� Elektroporation und Aussaat

1. Zellen mit Transfektionspuffer auf gewünschte Dichte einstellen (hier 11,5 x 106 Zellen/ml)

2. Überführen von je 525 µl (entsprechend ~ 6 x 106 Zellen) in sterile Cups (Zellen gut

resuspendieren !!!)

3. Zugabe der Vektoren, gut mischen (3 x kurz vortexen):

Vektoren Kontrolle RNAi

pSuper 25 µg

huNFS1-R3 25 µg

pEGFP-N3 10 µg 10 µg

4. Überführen der Zellen in die Elektroporationsküvette

5. Elektroporation: 250 V, 1500 µF (EasyJect+)

6. Rasche Zugabe von 550 µl Kulturmedium und überführen der Zellen (Pasteurpipette)

jeweils in 30 ml Kulturmedium, Küvette 2x mit Kulturmedium nachspülen

7. Zellen jeweils auf vier 25 cm2 Flaschen à 7,5 ml verteilen (Zellen gut resuspendieren !!!)

und kultivieren

Tage 1 bis 4: Kontrolle der Zellen und Auswertung

Jeden Tag wird ein Flaschenpaar (Kontroll- und RNAi-Ansatz) untersucht und eine Zeitreihe

erstellt.

� Optische Kontrolle der Zellen

Kontrolle im Umkehr- und im Fluoreszenzmikroskop. Wie sehen die RNAi behandelten

Zellen im Vergleich zu den Kontrollzellen aus?

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� Ernte und Bestimmung der Zellzahl

1. Flaschen schwenken, Überstand abnehmen

2. Zellen 1x mit 3 ml PBS waschen

3. 1,5 ml Trypsin/EDTA auf den Zellrasen geben, 5 bis 10 min bei 37°C inkubieren

4. abgelöste Zellen in ca. 5 ml frischem Kulturmedium aufnehmen, in 15 ml Röhrchen

sammeln; Flasche mit 2,5 ml PBS nachspülen

5. Röhrchen mit PBS auffüllen und zentrifugieren: 250×g, 10 min., RT

6. Zellpellet mit Pipette trocken saugen, in 1 ml PBS resuspendieren und ein Aliquot von

100 µl zur Zellzahlbestimmung entnehmen

7. Aliquots gut resuspendieren und unter Umständen 1:2 (oder mehr) verdünnen

8. Bestimmung der Zellzahl in der Zählkammer wie am Tag zuvor (Punkt 9a)

� Proteinbestimmung

nach Bradford, vgl. auch Kursteil Genetische, biochemische und zellbiologische

Untersuchungen an Mitochondrien aus Saccharomyces cerevisiae

1. Zellen insgesamt 2 x mit PBS waschen

2. Zellen in 900 µl PBS gut resuspendieren; Entnahme von 25, 50, und 100 µl (an späteren

Tagen auch weniger), jeweils auffüllen mit A. bidest. auf 800 µl

3. Zugabe von 200 µl Bradford-Reagenz, vortexen, Bestimmung der OD

4. Proteinbestimmung mit Hilfe einer Eichkurve (die Eichkurve kann, muss aber nicht

täglich erstellt werden); Leerwert nicht vergessen!

Anmerkungen zur Eichkurve:

- der BSA-Standard hat eine Konzentration von 2 mg Protein pro ml

- Zur Erstellung der Eichkurve empfiehlt sich eine 1:10 Verdünnung des Standards

- Für die Eichkurve empfehlen sich sechs bis acht Messpunkte im Bereich zwischen

0,5 µg und 20 µg Protein

� Transfektionseffizienz und Verlauf der Genexpression

Beurteilung anhand der EGFP-Fluoreszenz

1. Aliquots mindestens 1:4 verdünnen (Achten Sie auf die geeignete Verdünnung),

2. Anteil der grün fluoreszierenden Zellen im Gesichtsfeld unter dem Fluoreszenzmikroskop

auszählen;

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� Bestimmung der Enzymaktivität von SDH und Citratsynthase

vgl. auch Kursteil Genetische, biochemische und zellbiologische Untersuchungen an

Mitochondrien aus Saccharomyces cerevisiae.

SDH und Citratsynthase (CS) sind beides Enzyme des Zitronensäurezyklus, wobei SDH als

sogenannter Komplex II gleichzeitig Teil der mitochondrialen Atmungskette ist. Während die

CS über keine ISC verfügt, besteht die SDH aus vier Untereinheiten, von denen eine als

prosthetische Gruppen insgesamt drei Eisen-Schwefel-Zentren trägt. Ein Vergleich der

enzymatischen Aktivitäten von SDH und CS kann daher Hinweise auf eine gestörte ISC-

Biogenese geben.

Während sich eine Succinat-Cytochrom c-Oxidoreductase Aktivität durch Kopplung von

Komplex II und III der Atmungskette in vitro nur an isolierten Mitochondrien verfolgen lässt,

kann eine isolierte SDH-Aktivität auch in Totallysaten von HeLa-Zellen bestimmt werden.

Dabei untersucht man die Übertragung von Elektronen auf einen blauen Indikatorfarbstoff

(Dichlorophenol-Indophenol, DCPIP), der bei Reduktion farblos wird (Abbildung 5):

Succinat Decylubiquinon(ox) DCPIP (farblos)

Malonat | SDH

Fumarat Decylubiquinon(red) DCPIP (blau)

Abbildung 5: Reduktion von DCPIP durch SDH. Die bei der Oxidation von Succinat zu Fumarat freiwerden-

den Elektronen werden auf DCPIP übertragen. Die Farbänderung lässt sich spektrophotometrisch verfolgen.

Die Veränderung der Extinktion von DCPIP (λ = 600 nm, ε = 21 mM-1 * cm-1) wird mit

Hilfe eines Mikrotiterplattenlesegerätes für zahlreiche Proben gleichzeitig ermittelt. Durch

Zugabe von Malonat wird die SDH spezifisch gehemmt, und der Beitrag unspezifischer

DCPIP-Reduktion zur Extinktionsänderung lässt sich als Referenz bestimmen.

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Je zwei Gruppen beladen von Tag (d) zu Tag gemeinsam eine 24-Well-Mikrotiterplatte nach

dem Schema A1 bis A6

Ohne Malonat Mit Malonat

1 2 3 4 5 6

Gruppe a Kontrolle A

d2) 50 µl d3) 40 µl d4) 20 µl

d2) 75 µl d3) 60 µl d4) 30 µl

d2) 100 µl d3) 80 µl d4) 40 µl

d2) 50 µl d3) 40 µl d4) 20 µl

d2) 75 µl d3) 60 µl d4) 30 µl

d2) 100 µl d3) 80 µl d4) 40 µl

Gruppe a RNAi B

Gruppe b Kontrolle C

Gruppe b RNAi D

Unmittelbar vor der Messung wird den Proben A1 bis D3 je 1 ml Succinatpuffer zugesetzt,

den Referenzproben je 1 ml Malonatpuffer:

Reagenz Succinatpuffer Malonatpuffer

50 mM Tris/SO4 (pH 7,4) + + 0,1 % Triton X-100 + +

0,1 mM EDTA + + 1 mM KCN + +

35 µM Decylubiquinon(ox) + + 70 µM DCPIP + +

0,25 % Na-Succinat + + 0,25 % Na-Malonat -- +

Tris/SO4 (Sulfatgepufferte Tris-Lösung), EDTA (Ethylenediamintetraessigsäure), PMSF (Phenyl-Methyl-sulfonylfluorid), KCN (Kaliumcyanid), Na- (Natrium-)

Die SDH-abhängige Extinktionsänderung ergibt sich aus der Differenz der gesamten

Extinktionsänderung (A1 bis D3) und der zugehörigen unspezifischen Extinktionsänderung

(A4 bis D6).

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Auch die CS-Aktivität lässt sich spektrophotometrisch bestimmen. Die Bildung von Citrat aus

Oxalacetat und Acetyl-CoA führt zur Abspaltung von Coenzym-A, das dann mit 5,5’-Dithio-

bis-[2-Nitrobenzoesäure] (DTNB) einen gelben Farbstoff formt.

Oxalacetat Acetyl-CoA DTNB-CoA (gelb)

Citrat Coenzym-A DTNB (farblos)

Abbildung 6: Farbumschlag von DTNB durch Reaktion mit Coenzym-A. Das bei der Bildung von Citrat

freiwerdende Coenzym-A reagiert mit DTNB. Die Farbänderung lässt sich spektrophotometrisch verfolgen.

Die Veränderung der Extinktion von DTNB (λ = 412 nm, ε = 13,3 mM-1 * cm-1) wird auch

hier mit Hilfe eines Mikrotiterplattenlesegerätes für zahlreiche Proben gleichzeitig untersucht.

Als Referenz wird die autokatalytische Bildung von DTNB-CoA im Reaktionspuffer

ermittelt.

Je zwei Gruppen beladen von Tag (d) zu Tag gemeinsam eine 24-Well-Mikrotiterplatte nach

dem Schema A1 bis A6:

1 2 3 4 5 6

Gruppe a Kontrolle A

d2) 20 µl d3) 15 µl d4) 10 µl

d2) 30 µl d3) 25 µl d4) 15 µl

d2) 40 µl d3) 35 µl d4) 20 µl

d2) 20 µl d3) 15 µl d4) 10 µl

d2) 30 µl d3) 25 µl d4) 15 µl

d2) 40 µl d3) 35 µl d4) 20 µl

Gruppe a RNAi B

Gruppe b Kontrolle C

Gruppe b RNAi D

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Unmittelbar vor der Messung wird den Proben A1 bis D3 je 1 ml CS-Puffer zugesetzt, den

Referenzproben je 1 ml CS-Referenzpuffer:

Reagenz CS-Puffer CS-Referenz-

puffer

100 mM NaCl, 50 mM Tris/HCl (pH 8,0) + +

0,5 mM DTNB + +

0,1 % Triton X-100 + +

100 µg/ml Acetyl-CoA + +

200 µg/ml Oxalacetat + --

Die CS-abhängige Extinktionsänderung ergibt sich aus der Differenz der gesamten

Extinktionsänderung (A1 bis D3) und der zugehörigen unspezifischen Extinktionsänderung

(A4 bis D6).

Nach Equilibrierung der Proben ändert sich ihre jeweilige Extinktion linear mit der Zeit. Die

Bodenfläche der Wells beträgt jeweils 2 cm2, und aus dem Volumen in jedem Well lässt sich

somit die Länge d des Lichtweges durch die Probe ermitteln.

Mit Hilfe des Lambert-Beerschen Gesetzes lassen sich damit die Aktivitäten von SDH und

CS, und nach Bestimmung der eingesetzten Proteinmengen auch die spezifischen Aktivitäten

der beiden Enzyme ermitteln.

Für die spektrophotometrische Bestimmung von Enzymaktivitäten gilt nach Lambert-Beer:

E = ε * c * d

bzw.: ∆E/∆t = ε * ∆c/∆t * d

<=> ∆c/∆t = (∆E/∆t) / (ε * d)

Mit: E Extinktion, ε Extinktionskoeffizient, c Stoffkonzentration, d Lichtweg, ∆x/∆t Veränderung pro Zeit

Die Veränderung der Substrat- bzw. Produktkonzentration pro Zeiteinheit (∆c/∆t) gilt als Maß

für die Enzymaktivität. Die Einheit der Aktivität ist Unit (U):

[∆c/∆t] = mM / min

= U / ml

Da die Enzymaktivität in jeder Probe von der eingesetzten Proteinmenge abhängt, wird die

absolute Enzymaktivität darauf bezogen. Daraus ergibt sich die spezifische Aktivität, die

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unabhängig von der Probenmenge und dem Probenvolumen stets konstant ist. Angegeben

wird die spezifische Aktivität in U / mg.

Protokoll

Sie haben in diesem Praktikum die Effekte der Depletion von humanem Nfs1 über einen

Zeitraum von insgesamt zwei Wochen verfolgt. Fassen Sie in Ihrem Protokoll zunächst die

Ergebnisse Ihrer eigenen Gruppe übersichtlich zusammen. Die Form des Protokolls soll der

einer wissenschaftlichen Arbeit (Publikation/Diplomarbeit etc.) entsprechen. Verzichten Sie

allerdings auf die Beschreibung von experimentellen Details und langen Einleitungen (denn

die liegen Ihnen ja mit diesem Skript vor). Kommentieren und interpretieren Sie vielmehr Ihre

eigenen Teilergebnisse. Stellen Sie diese anschließend unbedingt (und durchaus in

angemessener Ausführlichkeit) in Zusammenhang mit den Ergebnissen der anderen drei

Gruppen.