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Praktisches Arbeiten mit gentechnischen Methoden in der Schule

Comenius - Projekt "come together - work together"

Arno Hirtler

Kollegium Kalksburg

Klasse 8. A

Schuljahr 2003/04

Prof. Mag. Gabriele Premauer Biologie und Umweltkunde

Wien, 21. Jänner 2004

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Inhaltsverzeichnis:

1. Einleitung 4

2. Einführung 5 2.1 Aufbau der Zelle 5

2.1.1 Eukaryonte Zellen 5

2.1.2 Prokaryonte Zellen 6

2.2 Struktur der DNA 7

2.3 Replikation der DNA 11

3. Gentechnik 14 3.1 Isolieren von DNA aus Gewebe 14

3.1.1 Isolieren von DNA aus pflanzlichen Zellen 14

3.1.2 Isolieren von DNA aus Kalbsthymus-Gewebe 15

3.1.3 Isolieren von DNA aus der Mundschleimhaut 19

3.2 Gelelektrophorese 21

3.3 Restriktionsanalyse 24 3.3.1 Theorie 24

3.3.2 Anwendungen 26

3.3.2.1 Modifizieren von DNA 26

3.3.2.2 Vaterschaftstest 27

3.3.2.3 Gerichtsmedizin 27

3.3.3 Praktisches Beispiel 27

3.4 PCR 28 3.4.1 Theorie 29

3.4.1.1 Das Prinzip der PCR 29

3

3.4.1.2 Limitation und Effizienz 32

3.4.1.3 spezielle PCR-Techniken 34

3.4.1.3.1 Nested PCR 34

3.4.1.3.2 Touch down PCR 35

3.4.1.3.3 Inverse PCR 35

3.4.1.3.4 Reverse-Transkriptase-PCR 36

(RT-PCR)

3.4.2 Anwendungen 37

3.4.2.1 Paläontologische Genetik 37

3.4.2.2 Gerichtsmedizin 37

3.4.2.3 Medizinische Diagnostik 37

3.4.3 Praktisches Beispiel 38

4. Zusammenfassung und Ausblick 41

5. Glossar 42

6. Bilderverzeichnis 48

7. Literaturverzeichnis 49

4

1. Einleitung:

Im Herbst 2002 wurde ich gefragt, ob ich zusammen mit Schulkameraden, die als

Wahlpflichtfach ebenfalls Biologie gewählt hatten, an einem Vormittag eine

Polymerase-Kettenreaktion (PCR) machen würde. Damals wusste ich noch nicht, was

PCR war, aber ich sagte zu. An diesem Praktikumstag erfuhr ich auch vom Comenius-

Projekt.

Beim Comenius-Projekt handelt es sich um eine europäische Schulkooperation, an der

Schüler und Lehrer von neun Schulen aus sieben verschiedenen Ländern (Deutschland,

Litauen, Niederlande, Österreich, Slowakei, Tschechien und Ungarn) teilnehmen. Im

Mittelpunkt dieses Projektes stehen Theorie und Praxis zum Thema Gentechnik. Das

Projekt fing im August 2002 an und wird im Juni 2005 enden. Neben den verschiedenen

Techniken sollen auch ethische Probleme der Gentechnik angesprochen werden.

Nach diesem sehr lehrreichen Tag gab es im selben Schuljahr noch einige Exkursionen

in das Vienna Biocenter. In diesem Zeitraum fasste ich den Entschluss, eine

Fachbereichsarbeit über das Thema Gentechnik und besonders über die PCR-Technik

zu schreiben.

Im Frühjahr 2003 wurde gefragt, wer gerne zum nächsten einwöchigen Schüler- und

Lehrertreffen im Rahmen des Comenius-Projekts in Hamburg mitkommen würde. Ich

meldete mich an und konnte schlußendlich mitfahren. In Hamburg lernten wir DNA aus

pflanzlichen und tierischen Zellen zu isolieren und eine Restriktionsanalyse

durchzuführen. Zur Auffrischung machten wir eine PCR.

Ich entschloss mich, alles, was ich dort gelernt hatte, auch in meine Fachbereichsarbeit

einfließen zu lassen. Der Schwerpunkt liegt aber besonders auf der PCR-Technik, weil

ich diese sehr oft durchgeführt habe und mich bei diesem Thema auch am besten

auskenne.

Ich habe die Versuche, die in dieser Fachbereichsarbeit beschrieben werden,

hauptsächlich in Hamburg durchgeführt. Das PCR-Beispiel stammt aus Versuchen im

Vienna Biocenter.

5

2. Allgemein: 2.1 Aufbau der Zelle: Die kleinsten Bausteine eines jeden Lebewesens sind die Zellen. Sie sind von einer

Membran umhüllt und mit einer wässrigen Lösung von chemischen Substanzen gefüllt.

Weil sie sich ohne einen Partner vermehren können, sind einzelne Zellen (= Einzeller,

Protozoen) die einfachsten Lebensformen. Höhere Organismen bestehen aus

Zellgemeinschaften, die aus einer Gründerzelle durch Teilung und Wachstum

entstanden sind. In diesen Gemeinschaften führen Gruppen von Zellen verschiedene

Funktionen durch und können auch miteinander kommunizieren.

Es gibt zwei unterschiedliche Arten von Zellen: Eukaryonten mit Zellkern und

Prokaryonten ohne Kern. Zu den Prokaryonten gehören Bakterien und Blaugrün-Algen.

Alle komplexeren vielzelligen Organismen, wie der Mensch, sind aus eukaryonten

Zellen aufgebaut. Eukaryonten haben auch eine Vielzahl von inneren Organen,

Organellen genannt.

2.1.1 Eukaryonte Zellen: (siehe Abb.)

1

Eukaryonten sind Zellen mit einer Doppelmembran, die das Cytoplasma mit all seinen

Proteinen und Organellen plus einem Zellkern (Nucleus) enthalten. Dieser Zellkern

enthält die Desoxyribonucleinsäure, die DNA, die Erbinformation der Zelle, und ist von

einer doppelten Membran mit Poren umschlossen. Diese Poren sind für den Transport

von Stoffen zwischen Cytosol und Nucleus zuständig.

1 Abb. 1-17 aus dem Lehrbuch der molekularen Zellbiologie, Buch S. 16

6

Im Kerninneren findet die Replikation der DNA und ihre Transkription in RNA

(Ribonucleinsäure) statt. Grundsätzlich wird die RNA in weiterer Folge außerhalb des

Zellkerns als Matrize für die Entstehung von Proteinen verwendet.

Bei der Teilung der Zelle in zwei gleichartige Tochterzellen werden die DNA-Moleküle

kompakter und bilden Chromosomen, wodurch diese leichter erfolgen kann.

Jedes dieser Chomosomen besteht aus einem einzigen, sehr langen DNA-Strang, der mit

Proteinen assoziiert ist, die diesen Strang in eine kompaktere Form bringen. Die

Verbindung von DNA und Protein wird Chromatin genannt.

Die Chromosomen durchlaufen in der Zelle verschiedene Stadien:

In der Interphase befinden sich die Chromosomen in einem ausgebreiteten Zustand, in

dem die Transkription, Translation und Replikation stattfinden.

Wenn sich die Chromosomen auf die Mitose vorbereiten, wird der DNA-Faden immer

mehr aufgerollt und dabei immer kompakter. Das entstandene hochkondensierte

Chromosom nennt man Mitose-Chromosom.

Alle Zellen in Individuen gleichen Geschlechts und gleicher Spezies enthalten immer

einen identischen Chromosomensatz, z.B. der Mensch besitzt 46 Chromosomen.

Natürlich gibt es auch hier Abnormitäten, diese sind aber immer auf Mutationen

zurückzuführen.

2.1.2 Prokaryonte Zellen: (siehe Abb.)

2

Bei den Prokaryonten fehlt der Zellkern, die DNA ist daher nicht im Kern verborgen,

sondern sie treibt als ringförmiges Molekül (Nucleoid) im Plasma herum. Prokaryonte

Zellen haben keine Zellorgane außer Ribosomen.

2 Abb. 3.7 aus der Medizinischen Mikrobiologie, Buch S.159

7

2.2 Struktur der DNA: Als zu Beginn der 20iger Jahre erkannt wurde, dass die Gene, die die Zellteilung

kontrollieren, auf Chromosomen liegen, untersuchte man diese genauer und erkannte,

dass sie aus zwei biologischen Verbindungen aufgebaut sind, und zwar aus Proteinen

und einer bestimmten Nucleinsäure, der Desoxyribonucleinsäure (DNA). Einer dieser

beiden Stoffe musste also das genetische Material sein.

Es war bekannt, dass Proteine Makromoleküle sind und aus 20 Aminosäuren bestehen,

die keine Beschränkung in der Reihenfolge ihrer Verknüpfung haben. So kann es fast

eine unendliche Anzahl verschiedener Proteinarten geben.

Bei der DNA nahm man an, dass es ein kleines unveränderliches Molekül sei. Und da

man dachte, dass die DNA nicht über die nötige Variabilität verfüge, um die gesamte

Erbinformation zu beinhalten, meinte man zuerst, dass die Proteine der Chromosomen

das genetische Material seien.

Für diese Annahme gab es aber keine Beweise und nach genaueren Untersuchungen

wurde allmählich klar, dass die DNA in Wirklichkeit ein sehr langes Polymer mit fast

unendlich vielen Formmöglichkeiten ist.

1928 entdeckte schließlich Frederik Griffith die bakterielle Transformation

(= Aufnahme neuer Gene durch eine Zelle in Form isolierter DNA) (siehe Abb.) und

bewies damit, dass die DNA das genetische Material beinhaltet.

Experimenteller Nachweis, dass DNA das genetische Material ist.3

3 Abb. 6-3 aus dem Lehrbuch der molekularen Zellbiologie, Buch S.199

8

Das Wissen über die Struktur der DNA geht auf die beiden Wissenschaftler J. Watson

und F. Crick zurück.

Alle Zellen enthalten DNA, in der in verschlüsselter Form die "Baupläne" sämtlicher

Proteinmoleküle dieser Zelle gespeichert sind.

DNA, wie auch die RNA, ist ein lineares Heteropolymer, d.h. ein Molekül, das

zahlreiche Einzeleinheiten umfasst, die Monomere, die kettenartig miteinander

verbunden sind.

Dieses Polymer besteht aus vier genetischen Bausteinen, den Nucleotiden, die sich

wiederum aus drei Teilen zusammensetzen: einem Zucker, bei der DNA die

Desoxyribose (siehe Abb.), bei der RNA die Ribose (siehe Abb.), einer

stickstoffhaltigen Base und einer Phosphatgruppe.

Desoxyribose und Ribose 4

Beim Zucker nummeriert man die Kohlenstoffatome immer in der gleichen Weise,

wobei der Kohlenstoff der Carbonylgruppe (– C = O), die sich bei der Kettenstruktur an

einem Ende befinden, die Zahl 1’ erhält. Diese Nummerierung verrät, an welchen

Positionen die anderen Komponenten des Nucleotids mit dem Zucker verbunden sind.

Die vier verschiedenen Stickstoffbasen Adenin, Cytosin, Guanin und Thymin sind die

genetisch informativen Elemente. Adenin und Guanin sind zwei Purine und Cytosin und

Thymin sind Pyrimidine. Die Purine bestehen aus einem Fünferring und einem

Sechserring, die Pyrimidine aber aus nur einem Sechserring (siehe Abb.).

4 Tafel 2-6 aus dem Lehrbuch der molekularen Zellbiologie, Buch S. 68

9

Die zwei Arten von Basen5

An jeder Base ist der Zucker mit seinem 1’-Kohlenstoff durch eine kovalente Bindung

gebunden, d.h., dass diese Bindung nur durch ein Enzym aufgespalten werden kann. An

dem 5’-Kohlenstoff des Zucker ist auch wiederum kovalent das Phosphat gebunden.

Die Verbindung des Zuckers mit einer Base nennt man Nukleosid. Mit der

Phosphatgruppe wird es zum Nucleotid.

Werden mehrere Nucleotide aneinander gehängt, so nennt man dieses entstandene

Polymer Oligonucleotid oder Polynucleotid. Dabei binden sich die Nucleotide

kettenmäßig und kovalent mit Hilfe einer Phosphatbrücke zwischen dem 3’ C-Atom des

Zuckers und dem 5’ C-Atom des Zuckers mit dem folgenden Nucleotid aneinander.

Diese Bindung nennt man 3’-5’-Phosphodiesterbindung (siehe Abb.).

5 Tafel 2-6 aus dem Lehrbuch der molekularen Zellbiologie, Buch S. 68

10

Struktur eines kurzen Polynucleotids6

Durch die Aneinanderknüpfung der Nucleotide entsteht aber nur ein Einzelstrang. Bei

der Doppelhelix der DNA werden jeweils zwei Basen durch Wasserstoffverbindungen,

die durch Hitze leicht aufgetrennt werden können, beieinander gehalten. Zwischen 1945

und 1950 bemerkte dabei Erwin Chargaff, dass die Basenverhältnisse in der DNA

konstant sind. Durch diese Entdeckung erkannten später James Watson und Francis

Crick, dass sich immer ein Purin mit einem Pyrimidin paart. Adenin ist komplementär

zu Thymin und Cytosin ist komplementär zu Guanin. Die Form der Doppelhelix wird

durch die Stapelung der Basen bestimmt. Diese stapeln sich wegen ihres Dipolmoments

um 36° versetzt.

Auszug aus Moderne Genetik, Buch S.:

Die Doppelhelix (siehe Abb.) hat sieben wichtige Eigenschaften:

1. Sie besteht aus zwei Polynucleotiden. [...]

2. Die stickstoffhaltigen Basen sind auf der Innenseite der Helix gestapelt. Die

Zucker-Phosphat-Kette bildet das Rückgrat der DNA. [...]

3. Die Basen der beiden Polynucleotide stehen über Wasserstoffbrücken in

Wechselwirkung. [...]

4. Eine Windung der Helix enthält zehn Basenpaare. [...]

5. Die beiden Stränge der Doppelhelix sind antiparallel. Ein Polynucleotid verläuft

in 5' → 3'-Richtung, das andere in 3' → 5'-Richtung. [...]

6

11

6. Die Doppelhelix hat zwei verschiedene Furchen. Man unterscheidet eine große

und eine kleine Furche . Diese Eigenart ist von Bedeutung, wenn die Doppelhelix

mit Proteinen in Wechselwirkung tritt, die an der DNA-Replikation oder der

Expression der genetischen Information beteiligt sind. [...]

7. Die Doppelhelix ist rechtsgewunden. [...]

Die Doppelhelix7

Der Aufbau und die dreidimensionale Struktur sind bei allen Lebewesen gleich, ob sie

Prokaryonten sind oder Eukaryonten. Doch bei den Eukaryonten, zum Beispiel beim

Menschen, ist die DNA noch weiter organisiert zum Supercoil. In dieser Form ist sie in

Chromosomen aufgeteilt, wo sie einen strukturellen Komplex mit Proteinen bildet.

2.3 Replikation der DNA:

Immer wenn sich eine Zelle teilt, muss sich auch die DNA vervielfältigen

(amplifizieren). Dieser Vorgang wird als identische Duplikation oder Replikation der

DNA bezeichnet.

Die Verdopplung der DNA verläuft semikonservativ, d. h. am Ende der Replikation

sind zwei identische DNA-Doppelstränge entstanden, wobei jeder aus einem

Einzelstrang der ursprünglichen DNA und dem neu dazu synthetisierten Strang besteht

(siehe Abb.).

7 Abb. 6-4 aus dem Lehrbuch der molekularen Zellbiologie, Buch S.200

12

Elternstrang Tochterstränge 8

Dabei wird jeder der beiden Einzelstränge der Doppelhelix als Matrize für den Aufbau

einer neuen komplementären Kette verwendet. Das bedeutet, dass sowohl die

Chromosomenstruktur als auch die Doppelstrangstruktur aufgelöst werden muss.

Während ein DNA repliziert wird, sind immer nur in einem begrenzten Abschnitt die

Basen nicht gepaart. Den Punkt, wo die Unterbrechung der Basenpaare beginnt, nennt

man Replikationsursprung. Von diesem Punkt kann die Sythese entweder in beide

Richtungen oder nur in eine Richtung ablaufen. Der Abschnitt, wo die ursprüngliche

DNA aufgetrennt wird und zugleich neu synthetisiert wird, heißt Replikationsgabel.

Verantwortlich für die Auftrennung der elterlichen Doppelhelix ist die Helicase DnaB.

Dieses Enzym wirkt mit den einzelstrangbindenden Proteinen zusammen. Die Proteine

stabilisieren und linearisieren nach der Auftrennung den Einzelstrang. An dem

Startpunkt der Replikation muss eine Starthilfe in Form eines RNA-Stücks, Primer

genannt, vorhanden sein. Diese Starthilfe wird später wieder durch Enzyme entfernt.

Die DNA-Synthese ist gerichtet. Es gibt nur ein Syntheseenzym, das den

Matrizenstrang aber nur in 3'→5'-Richtung liest und synthetisiert. Daher muss die

Synthese des zweiten neuen Stranges, also des 5'→3' gerichteten, stückweise erfolgen.

So entsteht zuerst ein kontinuierlicher Strang und ein diskontinuierlicher Strang. Die

Stücke des diskontinuierlichen Strangs werden Okazaki-Fragmente genannt, die eine

Größe von 1000 Nucleotiden haben.

8 Abb. 11.2 aus Moderne Genetik, Buch S. 190

13

Abläufe an der Replikationsgabel bei der Verdoppelung der DNA9

Die fehlenden Phosphordiesterbindungen bei den Okazaki-Fragmente werden später

durch ein besonderes Enzym, die DNA-Ligase, hergestellt.

9 Abb. 3-1 aus Gentechnik, Buch S. 67

14

3. Gentechnik Gentechnik ist der Einsatz experimenteller Methoden, um DNA-Moleküle mit neuen

Genen oder neuen Zusammenstellungen von Genen herzustellen.

3.1 Isolieren von DNA aus Gewebe 3.1.1 Isolieren von DNA aus pflanzlichen Zellen:

Es gibt verschiedene Methoden, um (mehr oder weniger reine) DNA zu erhalten, z.B.:

Dichtegradientenzentrifugation, Adsorptionschromatographie, chemisch-enzymatische

Methoden.

Hier wird eine sehr einfache und schnelle Methode zur DNA-Extraktion verwendet. Um

mit dem Molekül dann weiterarbeiten zu können, müsste dieses jedoch noch weitere

Reinigungsschritte durchlaufen.

Benötigtes Material: Benötigte Geräte:

1 ganze Frucht Messer

3 g Salz Schneidbrett

10 ml Spülmittel Filterpapier

100 ml H2O Trichter

100 µl Protease Pipette (100 µl) und gelbe Spitze

20 ml kaltes Ethanol 250 ml Becherglas

Eis 50 ml Becherglas

Wasserbad

Vorgangsweise:

1. Zur Herstellung des Extraktes das

Salz, das Spülmittel und das

Wasser in dem 250 ml Becherglas

mischen. Danach die Frucht klein

(siehe Abb.10) schneiden und in

die Extraktlösung geben.

10 Zerkleinerte Tomate; Foto vom Praktikum in Hamburg

15

2. Um alle Membranen zu zerstören, alles zusammen in einem Wasserbad für ca. 10

Minuten bei 65°C erhitzen.

3. Dann alles in einem Eisbad auf Raumtemperatur herunterkühlen, um die DNA zu

schützen.

4. Die Mischung max. 5 Sekunden

pürieren, wodurch die Zellwände

zerstört werden. (siehe Abb.11)

5. 20 ml des Homogenates in das 50 ml Becherglas filtrieren.

6. Damit die Histone von der DNA gelöst werden, die Protease dazugeben.

7. Vorsichtig das Homogenat mit dem

kaltem Ethanol überschichten.

Dadurch wird die DNA dehydriert

und an der Phasengrenze sichtbar!

(siehe Abb.12)

3.1.2 Isolieren von DNA aus Kalbsthymus-Gewebe:

Säugetiere und Menschen haben eine Thymusdrüse. Sie ist am Aufbau des

Immunsystems, besonders im Säuglingsalter, beteiligt. Die Thymusdrüse enthält von

allen Geweben den höchsten Anteil an Nucleinsäuren. In 10 g Kalbsthymus sind etwa

100 mg DNA enthalten.

Benötigtes Material: Benötigte Geräte:

10 g gefrorenes Kalbsthymus-

Gewebe

Schere

11 Pürieren der Tomate; Foto vom Praktikum in Hamburg 12 Homogenat einer Kiwi mit Ethanol überschichtet; Foto vom Praktikum in Hamburg

16

20 ml 0,9%iger Natriumchlorid-

Lösung

Petrischale

140 ml gekühlter Zellkernpuffer 250 ml Becherglas

50 ml SSC-Puffer (Standard-

Saline-Citrat-Puffer)

Ultra Turrax (Drehzahl: mind. 11 000

U/min.):

Ein Rotor zerreißt durch seine Druckkräfte

alles in kleinste Teile

0,5 ml 10%ige SDS Lösung

(Sodium-Dodecyl-Sulfat)

Glaswolle

15 ml NaCl-Lösung Saugflasche mit Büchner-Trichter

65 ml kaltes vergälltes 96%iges

Ethanol

Filtertuch

Eis zwei 50 ml Zentrifugenbecher

Zentrifuge

Glasstab

250 ml Becherglas mit hoher Form

Rollrandgläschen zum Aufbewahren der

gewonnenen DNA

Isolieren der Zellkerne:

1. Das Kalbsthymus-Gewebe mit der 20

ml Natriumchlorid-Lösung auftauen,

in große Stücke schneiden (siehe

Abb.13) und waschen. Diese

Waschlösung in den Abguss

dekantieren (Flüssigkeit aus dem

Behälter gießen).

13 Zerkleinerung des Kalbsthymus in große Stücke; Foto vom Praktikum in Hamburg

17

2. Mit der Schere das aufgetaute

Gewebe in der Petrischale mit dem 20

ml Zellkernpuffer mischen und in

kleine Stücke schneiden (siehe

Abb.14). Die Stücke sollen so groß

sein wie Linsen. Den Zellkernpuffer

wieder in den Abguss dekantieren und

das Gewebe nochmals mit 20 ml

Zellkernpuffer waschen. Auch diese Waschlösung in den Abguss dekantieren. Die

linsengroße Gewebestücke in das 250 ml Becherglas überführen und mit dem

restlichen Zellkernpuffer das Glas füllen.

3. Das Becherglas in einem Eisbad kühlen. Das

Thymus-Gewebe nun mit dem Ultra-Turrax bei

hoher Drehzahl (11 000 U/min) 45 Sekunden

homogenisieren (siehe Abb.15). Das Gewebe

wird vollständig zerkleinert.

4. Die Kalbsthymus-Suspension über Glaswolle in ein 250 ml Becherglas filtrieren.

Die Glaswolle im Abfallbehälter entsorgen

5. Anschließend die vorgereinigte

Kalbsthymus-Suspension über eine

Saugflasche mit Büchner-Trichter und

Filtertuch absaugen. Das Filtertuch

vorher mit Zellkernpuffer anfeuchten.

(siehe Abb.16)

14 Zerkleinerung in Linsen-große Stücke; Foto vom Praktikum in Hamburg 15 Vollständige Zerkleinerung; Foto vom Praktikum in Hamburg 16 Filtrieren des Homogenats; Foto vom Praktikum in Hamburg

18

6. Die gereinigte Lösung gleichmäßig auf die zwei Zentrifugenbecher verteilen.

7. Es wird 10 Minuten mit 1500 U/min

zentrifugiert (siehe Abb.17). Die

Zellkerne befinden sich anschließend

als fester weißer Pellet (engl.

„Kügelchen“) am Boden der

Zentrifugenbecher.

8. Den fließenden Überstand vollständig dekantieren. Mit der Öffnung nach unten

noch ca. 2 Minuten auf Saugpapier die Zentrifugenbecher zum Abtropfen stehen

lassen.

9. Die Zentrifugenbecher mit den Zellkernen auf Eis stellen.

Mikroskopie der Zellkerne:

Mit dem Glasstab vorsichtig ganz wenig Zellkernsuspension entnehmen. Auf dem

Objektträger die Zellkernsuspension mit einem Tropfen Methylenblau einfärben.

Jetzt ein Deckgläschen auf die Zellkernsuspension legen und die Zellkerne bei

verschiedenen Vergrößerungen unter dem Mikroskop betrachten.

Isolieren der DNA aus Zellkernen des Kalbsthymus

1. Die Zellkerne der beiden Zentrifugenbecher werden in dem SSC-Puffer

resuspendiert:

Von 50 ml SSC-Puffer zweimal kleine Portionen mit ca. 5 ml SSC-Puffer in den

Zentrifugenbecher gießen. Die Zellkerne mit einem Glasstab vorsichtig mit der

Lösung mischen und in das 250 ml Becherglas hoher Form überführen. Mit dem

restlichen SSC-Puffer die Zentrifugenbecher spülen und alles im Becherglas

vereinigen.

2. Die Lyse (Aufschließen) der Zellkerne:

In dem 250 ml Becherglas zu 50 ml Zellkernsuspension tropfenweise unter

Schwenken die SDS-Lösung hinzugeben und 10 Minuten leicht bewegen. Die SDS-

Lösung bildet mit der DNA einen instabilen Komplex. Es darf nicht geschüttelt

17 Hineingeben der Zentrifugenbecher in die Zentrifuge; Foto vom Praktikum in Hamburg

19

werden, da sonst die DNA-Stränge leicht zerbrechen. Die Zeit muss genau

eingehalten werden, da der instabile SDS-DNA-Komplex bei längerer Inkubation

zerfällt.

3. Die hochviskose Lösung mit 15 ml NaCl-Lösung versetzen und 10 Minuten leicht

mit dem Glasstab rühren.

4. Im 250 ml Becherglas die DNA

Lösung vorsichtig am Glasstab mit

dem Ethanol überschichten. Den

Alkohol langsam über einem Glasstab

an der Glaswand entlang in das

Becherglas gießen, so dass sich die

Phasen nicht vermischen. An der

Phasen-Grenzfläche fällt die DNA in

seidigen Fäden aus. (siehe Abb.18)

5. Einen Glasstab durch die Ethanol-Schicht bis

auf den Boden des Becherglases führen und die

DNA durch die Ethanol-Schicht hochziehen.

Die DNA durch Drehen des Glasstabes

aufwickeln, bis die Schichten ganz vermischt

sind.(siehe Abb.19)

6. Die DNA vom Glasstab abstreifen und mit Ethanol in einem Rollrandgläschen

aufbewahren.

18 Ausfallen der DNA; Foto vom Praktikum in Hamburg 19 Aufwickeln der DNA; Foto vom Praktikum in Hamburg

20

3.1.3 Isolieren von DNA aus der Mundschleimhaut:

In diesem Fall wird ein physikalisches-chemisches Verfahren verwendet um DNA zu

isolieren. Am Ende des Isolierungsverfahren kann man jedoch kaum die DNA sehen, da

sie nur in sehr geringer Menge vorhanden ist. Dafür liegt sie vollständig gereinigt vor.

Benötigtes Material: Benötigte Geräte:

50 µl NaOH (Natriumhydroxid) rotes Reaktionsgefäß (Eppi genannt)

2,5 µl TRIS-Puffer (pH 7,5) Pipetten und Spitzen

250 µl PB-Lösung (Bindelösung) Eppi mit Chromatographiesäule

700 µl PE-Lösung (Ethanolische

Lösung)

Zentrifuge

50 µl EB (Elutionbuffer)

Eis 250 ml Becherglas

Vorgangsweise:

1. NaOH in das rote Eppi geben.

2. Mundschleimhaut mit einer Pipetten-

spitze abschaben. (siehe Abb.20)

3. Diese Mundschleimhaut zur NaOH in

das Eppi geben und für 10 Minuten

bei 95°C inkubieren (siehe Abb.21),

dadurch wird das Gewebe zerstört

und die DNA durch Chemikalien und

Wärme aufgespalten.

20 Abschaben der Mundschleimhaut; Foto vom Praktikum in Hamburg 21 Zerstörung der Gewebe; Foto vom Praktikum in Hamburg

21

4. Um die Aufspaltung der DNA zu unterbrechen, für 3 Minuten in ein Eisbad geben.

Gleich danach den TRIS-Puffer dazugeben, wodurch man DNA-Stücke bestimmter

Größe erhält.

5. Da noch Proteine an der DNA haften, die PB-Lösung zum DNA-Extrakt geben, die

diese denaturiert.

6. Jetzt muss die DNA noch gereinigt werden, was mit Hilfe einer

Adsorptionschromatographie geschehen kann. Dazu das DNA-Extrakt auf die

Chromatographiesäule geben. Die DNA befindet sich dann auf der

Silicagelscheibe.

7. Alles bei 13 000 Umdrehungen für 1

Minute zentrifugieren (siehe Abb.22).

Der Durchlauf wird verworfen.

8. Die PE-Lösung hinzugeben, wodurch die DNA gewaschen und auf der

Silicagelscheibe fixiert wird.

9. Wieder alles bei 13 000 Umdrehungen für 1 Minute zentrifugieren und den

Durchlauf verwerfen.

10. Gleich danach die Zentrifugation wiederholen.

11. Die Säule in ein sauberes Reaktionsgefäß ohne Deckel stecken und den

Elutionbuffer in die Mitte tropfen, wodurch die DNA von der

Chromatographiesäule getrennt wird.

12. Nochmals bei 13 000 Umdrehungen für 1 Minute zentrifugieren, dadurch wird das

Eluat in dem Reaktionsgefäß gesammelt

13. Die eluierte DNA wird auf Eis aufbewahrt

Diese DNA kann man zum Beispiel für eine Restriktionsanalyse oder für eine PCR

(Polymerase-chain-reaktion) verwenden.

22 Zentrifugieren der DNA; Foto vom Praktikum in Hamburg

22

3.2 Gelelektrophorese:

Nachdem ein großes DNA-Molekül zum Beispiel mit einer Restriktionsendonuklease in

kleinere Fragmente gespaltet worden ist, müssen diese voneinander getrennt werden.

Dies wird normalerweise mit Hilfe einer Gelelektrophorese durchgeführt, die die DNA-

Fragmente nach ihrer Länge auftrennt. Das Gemisch der DNA-Fragmente wird mit

einem Farbstoff versehen und an einem Ende eines Agarose- oder Polyacrylamid-Gels

aufgetragen, das ein mikroskopisch kleines Netzwerk aus Poren enthält. Der Farbstoff

dient dabei nicht dazu, die DNA anzufärben, sondern mit diesem kontrolliert man, wann

man mit der Elektrophorese aufhören soll, weil der Farbstoff immer kleiner und deshalb

schneller ist als die DNA. Nachdem alle Proben aufgetragen worden sind, wird an das

Gel eine Spannung angelegt. Weil die DNA wegen der Phosphatgruppen negativ

geladen ist, wandern die Fragmente zur positiven Elektrode; die größeren Fragmente

wandern langsamer, da sie von der Agarosematrix stärker behindert werden als die

kleineren. Nach einiger Zeit sind die DNA-Fragmente auf dem ganzen Gel verteilt,

wobei sie eine Leiter aus diskreten „Banden“ bilden, die sich jeweils aus mehreren

DNA-Molekülen von identischer Länge zusammensetzen. Ein bestimmtes DNA-

Fragment kann auf diese Weise auch leicht isoliert werden: Ein schmaler Gelstreifen,

der die gewünschte Bande enthält, wo dieses Fragment ist, wird mit einem Skalpell oder

einer Rasierklinge ausgeschnitten.

DNA-Banden auf Agarose- oder Polyacrylamid-Gelen sind unsichtbar, wenn sie nicht

auf irgendeine Weise markiert oder angefärbt werden. Dabei kann man zum Beispiel

einen Farbstoff an die DNA binden, der unter UV-Licht fluoresziert oder man baut vor

der Elektrophorese ein Radioisotop in die DNA-Moleküle ein.

Erzeugung eines Agarose-Gels:

Benötigtes Material: Benötigte Geräte:

1 g Agarose Flasche (mind. 500 ml)

8 ml TAE-Puffer Erlenmeyerkolben

392 ml reines Wasser (destiliertes

H2O)

Topflappen

Gelelektrophorese-Kammer (enthält 1

Gelbett, 2 Metallkeile)

Gel-Elektrophorese-Kamm (es gibt 2

23

Varianten: mit 8 bzw. 15 Zähnen)

Handschuhe

Mikrowelle, Heizplatte oder

Bunsenbrenner

1. Zuerst den 50fach konzentrierten TAE-Puffer verdünnen. Dazu auf 1 Teil Puffer 49

Teile reines Wasser geben.

2. Die Agarose in den Erlenmeyerkolben geben und 100 ml Laufpuffer dazugießen.

(1%iges Gel)

3. Die Agarose und den Puffer mit der

Mikrowelle, einer Heizplatte oder mit

dem Bunsenbrenner erhitzen (siehe

Abb.23). Sobald kein Agarosepulver

und keine kleinen Bläschen mehr

sichtbar sind, ist die Agarose

vollständig gelöst.

4. Das flüssige Gel etwas abkühlen

lassen. Dies kann man beschleunigen,

indem man außen den Kolben mit

kaltem Wasser abspült. (siehe Abb.24)

5. Bevor das Gel ganz abgekühlt ist,

50 ml davon in die Gelkammer

gießen und ca. 10 – 20 Minuten

erstarren lassen. Die Kammzähne

sollen zu ca. 2/3 in die

Gelflüssigkeit eintauchen. (siehe

Abb.25)

23 Erhitzung der Agarose und des Puffers; Foto vom Praktikum in Hamburg 24 Abspülen des Kolben mit kaltem Wasser; Foto vom Praktikum in Hamburg

24

6. Nach dem Erstarren den Kamm aus dem Gel ziehen und dann ca. 300 ml

Laufpuffer in die Elektrophoresekammer gießen. Das Gel sollte dabei gerade

bedeckt sein.

7. Dieses Gel kann man dann für die

Elektrophorese verwenden. (siehe

Abb.26)

3.3 Restriktionsanalyse: 3.3.1 Theorie:

DNA-Stränge können mit Hilfe von Enzymen hydrolysiert (gespalten) werden. Diese

Enzyme werden als Nukleasen bezeichnet und können entweder ein DNA-Molekül vom

Ende her abbauen (Exonukleasen) oder es zwischen zwei Nucleotiden innerhalb der

Sequenz zerteilen (Endonukleasen).

Eine sehr wichtige Gruppe von Endonukleasen sind die Restriktionsendonukleasen.

Beim Einsatz dieser Enzyme werden bei der Hydrolyse der DNA charakteristische

Enden erzeugt, die durch die Spezifität der verwendeten Restriktionsendonuklease

bestimmt werden. Es können auch durch Restriktionsendonukleasen bestimmte DNA-

Fragmente reproduzierbar isoliert werden.

Es gibt drei Typen von Restriktionsendonukleasen. Gemeinsam ist, dass sie

ausnahmslos doppelsträngige DNA erkennen. Die Typ-1-Restriktionsendonukleasen

benötigen als Co-Substrate ATP (Adenosintriphosphat), S-Adenosylmethionin (SAM)

und Magnesium-Ionen. Die Hydrolyse der DNA geschieht nicht an der

Erkennungsstelle des Enzyms aus der DNA, sondern in einer Entfernung von einigen

hundert Basenpaaren. Aus diesem Grund werden für Klonierungsstrategien Typ-1-

Restriktionsendonukleasen nicht verwendet. Eine Erkennungssequenz ist in der Regel

25 Einfüllen des Geles; Foto vom Praktikum in Hamburg 26 Fertiges Gel; Foto vom Praktikum in Hamburg

25

eine palindromartige Sequenz. Palindrome sind Wörter oder Sätze, die von vorne und

hinten gelesen den gleichen Sinn ergeben, wie zum Beispiel „Otto“ oder „Anna“.

Typ-2-Restriktionsendonukleasen hydrolysieren die DNA innerhalb der

Erkennungssequenz und benötigen meist als Co-Faktor nur Magnesium. Wenn diese

Enzyme doppelsträngige DNA hydrolysieren, können drei unterschiedliche Arten von

Enden erzeugt werden:

- Spalten die Enzyme die Erkennungssequenz symmetrisch, enstehen DNA-Fragmente

mit „glatten Enden“, d.h. die Enden sind gleich lang.

- Spalten die Enzyme die Erkennungssequenz asymmetrisch, entstehen entweder

DNA-Fragmente, bei denen das 5’-Ende über das 3’-Ende hinausragt,

oder

DNA-Fragmente, bei denen das 3’-Ende über das 5’-Ende hinausragt.

Typ-2-Restriktionsendonukleasen27

Die Typ-3-Restriktionsendonukleasen hydrolysieren die DNA in spezifischem Abstand,

normalerweise bis zu 25 Basenpaare von der Erkennungsstelle entfernt. Aus diesem

27 Abb. 2.2.3 aus Gentechnik Biotechnik, Buch S. 27

26

Grund sind die überlappenden Sequenzen, die von Typ-3-Restriktionsendonukleasen

erzeugt werden, nicht miteinander kompatibel.

In der Molekularbiologie werden meistens Enzyme verwendet, die zu den Typ-2-

Restriktionsendonukleasen gehören. Manchmal werden aber auch Typ-3-

Restriktionsendonukleasen eingesetzt.

Damit Restriktionsendonukleasen ihre volle Spezifität entfalten können, müssen die

Reaktionsbedingungen zum Teil relativ genau eingestellt werden, wobei die

Salzkonzentration oft der wichtigste Parameter ist. Oft erkennen sie dann nicht mehr

ihre genaue Erkennungssequenz, sondern hydrolysieren auch Stellen, die nur noch Teile

der Erkennungssequenz repräsentieren.

Je komplexer die Erkennungssequenz ist, um so seltener schneidet die entsprechende

Restriktionsendonuklease eine DNA. Statistisch gesehen wird eine DNA von einem

Enzym, das vier Nucleotide erkennt, jeweils nach 256 Nucleotiden (44) hydrolysiert.

Ein Enzym, das sechs Nucleotide erkennt, spaltet die DNA nach jeweils 4098

Basenpaaren (46).

Die vielen unterschiedlichen Restriktionsendonukleasen können verschieden eingesetzt

werden:

- Die DNA kann mit einem einzelnen Enzym komplett geschnitten werden. Dabei

erhält man DNA-Fragmente, die an beiden Seiten identische Enden besitzen.

- Wird eine Kombination von zwei (oder mehreren) Enzymen verwendet und die

DNA komplett hydrolysiert, so ergeben sich DNA-Fragmente, deren Enden

unterschiedlich sein können.

- Die DNA kann aber auch partiell geschnitten werden. Dazu verwendet man eine

einzelne Restriktionsendonuklease, die relativ häufig schneidet. Für eine partielle

Hydrolyse wird entweder eine sehr geringe Enzymkonzentration eingesetzt oder

die DNA inkubiert nur für eine kurze Zeit mit dem Enzym. Das Ergebnis einer

partiellen Hydrolyse sind relativ große DNA-Fragmente. Grundsätzlich noch

wichtiger ist in diesem Zusammenhang die Tatsache, dass man durch eine

partielle Hydrolyse Fragmente erzeugt, die sich teilweise in ihren Sequenzen

überlappen. Dies ist besonders bedeutsam, wenn man eine genomische Genbank

herstellen will.

27

3.3.2 Anwendungen

3.3.2.1 Modifizieren von DNA:

Wenn man mittels Restriktionsenzymen einen DNA-Strang „geschnitten“ hat, kann man

diesen auch wieder mittels Ligasen miteinander verbinden. Auch diese Enzyme

reagieren nur, wie die Restriktionsendonukleasen, nach einer bestimmten

Basenabfolgen. Durch diese Ligasen können deshalb neue DNA-Stränge erzeugt oder

bestimmte Teile ausgewechselt werden.

3.3.2.2 Vaterschaftstest:

Um Verwandschaftsbeziehungen festzustellen, wird die Satelliten-DNA vom Kind

sowie von dessen Eltern durch Restriktionsenzyme abgespalten. Satelliten-DNA ist

entweder eine leichtere (AT-reiche) oder schwerere (GC-reiche) DNA im Vergleich zur

Haupt-DNA. Nach der Gelelektrophorese kann man feststellen, welche Banden

übereinstimmen. Dabei darf nur eine einzige Bande abweichend sein, sonst kann nur

jemand anderer der Vater sein. Bei einem leiblichen Kind kann es nämlich nur eine

Neumutation geben.

3.3.2.3 Gerichtsmedizin:

In der Gerichtsmedizin werden häufig Restriktionsenzyme zur Herstellung eines

genetischen Fingerprints mittels Restriktionsfragmentlängen-polymorphismus (RFLP)

verwendet. Durch diese Methode kann man einem Täter ein Verbrechen, das er

begangen hat, leichter nachweisen.

Dabei wird mit Hilfe eines Restriktionsenzyms ein genetischer Fingerabdruck mehrerer

DNA-Proben der Verdächtigen hergestellt. Durch die Spaltung zerfällt diese in mehrere

DNA-Fragmente. Da in jeder Probe die Schnittstellen an unterschiedlichen Stellen

liegen, entstehen auch verschieden lange DNA-Stücke. Anhand der DNA-

Fragmentmuster (Banden) auf dem Gel können dann die Fingerprints der Verdächtigen

mit der Probe der am Tatort gefundenen DNA des Täters verglichen und zugeordnet

werden. Der Verdächtige, dessen Probe mit der gefundenen DNA-Probe genau

übereinstimmt, ist der Täter.

28

3.3.3 Praktisches Beispiel:

Wie bereits im vorigen Kapitel Gerichtsmedizin beschrieben, wird hier praktisch ein

Fingerprint von Verdächtigen gemacht und dann mit der gefundenen DNA verglichen.

Benötigtes Material: Benötigte Geräte:

je 5 µl DNA-Proben Pipetten und Spitzen

je 6 µl H2O Wasserbad

je 3 µl Reaktionspuffer Reaktionsgefäße

je 1 µl Restriktionsenzym Gel-Elektrophoreseapparatur

je 3 µl Farbstoff Gel-Dokumentationssystem

1 Agarose-Gel

Vorgangsweise:

1. Zu den DNA-Proben das Wasser, den Reaktionspuffer und die Restriktionsenzyme

dazugeben.

2. Die Reaktionsgefäße bei 37°C im

Wasserbad für ca. 45 Minuten

inkubieren. (siehe Abb.28)

3. Nach dem Ende der Inkubationszeit wird zu den Proben der Farbstoff gegeben.

4. In die Taschen des Gels die Proben hineingeben. Zum Vergleich wird die

gespaltene Probe des „Täters“ mit aufgetragen.

5. Die Elektrophorese starten.

28 Inkubation der Reaktionsgefäße; Foto vom Praktikum in Hamburg

29

6. Nach Beendigung der Elektrophorese

das Gel anfärben (in diesem Fall mit

EtBr, siehe Abb.29) und die

Bandenmuster vergleichen.

Ergebnis:

Bei meiner Gruppe ist bei diesem Praktikum kein Ergebnis zu sehen gewesen, weil

beim Auftragen der Proben auf das Gel unvorsichtig pipetiert worden ist.

Ein mögliches Ergebnis:

Diese Probe eines Verdächtigten stimmt mit allen Banden genau mit der gefundenen

Probe überein. Folglich ist er der Täter.

3.4 PCR:

PCR ist eine der wichtigsten Methoden in der modernen Molekularbiologie. Sie wurde

Mitte der 80er Jahre vom Amerikaner Kary Mullis konzipiert und zur Anwendung

gebracht. Er bekam 1993 dafür den Nobelpreis.

Durch Mullis’ Erfindung konnte zum ersten Mal DNA im Reagenzglas vervielfältigt

werden, was die gesamte Gentechnik revolutionierte.

Die Vervielfältigung der DNA geschieht auf der Basis eines einfachen Prinzips: der

DNA-Synthese. Deshalb braucht man auch alle Komponenten, die für eine DNA-

Synthese nötig sind:

- eine DNA-Matrize

- eine DNA-Polymerase, die die DNA-Synthese katalysiert

29 Färben des Geles; Foto vom Praktikum in Hamburg

30

- eine Initiationsstelle für die DNA-Polymerase

- die vier Desoxynucleotid-Triphosphate: dATP, dCTP, dGTP und dTTP als Substrate

für die DNA-Polymerase.

3.4.1 Theorie

3.4.1.1 Das Prinzip der PCR:

Man kann bei der In-vitro-DNA-Synthese nur Bereiche zwischen bekannten oder aus

der Übersetzung einer Proteinsequenz abgeleiteten Nucleotidsequenzen amplifizieren.

Für diese bekannten Nucleotidsequenzen werden Primer synthetisiert, die sich optimal

an die DNA-Matrize anlagern können. Bei denen beginnt die neue Synthese. Die

Sequenz des amplifizierten DNA-Bereichs muss dabei nicht bekannt sein.

Für die Amplifikation benötigt man zwei PCR-Primer, wobei der erste sich an den

oberen Strang der Ziel-DNA und der zweite in einigem Abstand an den unteren Strang

bindet. Durch diese Anordnung der Primer hat man zwei Startpunkte für die DNA-

Polymerasereaktion definiert. Die Richtung der DNA-Polymerasen ist aber

entgegengesetzt und sie überlappen sich am Ende.

Außer der DNA-Matrize und den beiden Primern benötigt man noch ein Gemisch der

vier Desoxynucleotid-Triphosphate, Magnesium und eine thermostabile DNA-

Polymerase. Da die DNA-Polymerase hohe Temperaturen ohne Inaktivierung

überstehen muss, verwendet man Polymerasen aus thermophilen Bakterien, z.B. aus

Thermus aquaticus (Taq-Polymerase), Pyrococcus furiosus (Pfu-Polymerase) oder

Thermotoga maritima (Tma-Polymerase). Die Mutationshäufigkeit pro Verdopplung

durch die Taq-Polymerase liegt bei 8x10-6. Die anderen Polymerasen sind genauer.

Nach dem Zusammenmischen der Komponenten wird der Ansatz in einen so genannten

Thermocycler gestellt. Mit der Hilfe dieses Thermocyclers wird ein komplexes

Inkubationsprogramm kontrolliert und wiederholt durchlaufen. Dabei wechselt die

Temperatur andauernd (siehe Abb.).

31

Inkubationszeit Inkubations- temperatur

Ergebnis

1 x 5 min. 95 °C Denaturierung der DNA-Matrize 30 sec. ca. 50°C Anlagerung der

Primer ca. 3 min. 72°C Verlängerung der

Primer

ca. 3

0 x

1 min. 95°C Denaturierung der DNA-Matrize

Ein Inkubationsprogramm für eine PCR-Reaktion30

Auszug aus Gentechnik Biotechnik, Buch S.42:

- Zunächst wird die Temperatur für ca. fünf Minuten auf 95°C eingestellt. Unter den

vorgegebenen Pufferbedingungen werden während dieser Zeit alle

doppelsträngigen DNA-Bereiche zu Einzelsträngen denaturiert, so dass zum Ende

dieser Inkubationsperiode nur noch einzelsträngige DNA-Fragmente vorliegen.

- Danach wird die Temperatur auf einen Bereich gesenkt, in dem die Oligonucleotid-

Primer mit den komplementären Bereichen auf der Ziel-DNA doppelsträngige

Hybride ausbilden können. Die beiden Oligonucleotid-Primer liegen im großen

Überschuss zur DNA-Matrize vor. Deshalb bilden sich bevorzugt

Doppelstrangbereiche zwischen den Primern und dem jeweiligen DNA-

Einzelstrang der Ziel-DNA. Renaturierung der beiden denaturierten Einzelstränge

der Ziel-DNA ist hingegen unter diesen Bedingungen nicht favorisiert. Dieser

Renaturierungsprozess ist in der Regel bereits nach 30 Sekunden abgeschlossen.

- Im nächsten Schritt wird die Inkubationstemperatur auf ca. 72°C angehoben. Bei

dieser Temperatur arbeiten die thermostabilen DNA-Poyimerasen optimal. Je nach

Länge des zu amplifizierenden DNA-Bereiches wird die Temperatur ein bis drei

Minuten auf 72°C gehalten. Danach ist der erste Amplifikationszyklus

abgeschlossen.

- Zur Einleitung des zweiten Amplifikationszyklus wird erneut die Temperatur auf

95°C gehoben, allerdings jetzt nur für eine Minute. Es werden dadurch wiederum

sämtliche Doppelstrangbereiche denaturiert.

- Es folgen Renaturierungs- und Polymerisationsphasen wie im ersten Zyklus.

(siehe Abb.)

30 Abb. 2.3.3 aus Gentechnik Biotechnik, Buch S.41

32

Prinzip der Polymerase-Kettenreaktion 31

31 Abb. 12-1: aus Gentechnik, Buch S.294

33

Die Produkte des ersten Amplifikationszyklusses haben keine genau definierte Länge,

weshalb sie „lange Produkte“ genannt werden. Ab der zweiten Amplifikationsrunde

fungieren neben der Originalmatrize auch die „langen Produkte“ als Vorlage. Aus

diesem Grund werden jetzt auch zusätzlich zu den zwei weiteren „langen Produkten“

auch DNA-Fragmente mit einer definierten Länge gebildet. Diese Fragmente sind am

einen Ende durch den Primer und an der anderen Seite durch das Ende der Matrize

begrenzt.

Somit gibt es jetzt zwei komplementäre Stränge der Originalmatrize, vier teilweise

komplementäre Stränge, die „langen Produkte“ und zwei exakt komplementäre

Amplimere (=Bereiche, die durch die beiden PCR-Primer begrenzt werden).

Ausgehend von x Molekülen DNA, die man zur Amplifikation verwendet hat, ist die

Zahl der Ausgangsmatrizen nach n Zyklen konstant geblieben, während die Zahl der

„langen Produkte“ auf x*n gestiegen ist. Die Zahl der Amplimere beträgt x*2n-x-nx.

3.3.1.2 Limitation und Effizienz:

Die Effizienz der PCR kann durch verschiedene Parameter beeinflusst werden. Einer

der Faktoren, der sie verschlechtert, ist die Länge der DNA, die durch die

Oligonucleotide eingeschlossen wird. Im Allgemeinen nimmt die Effizienz mit

steigender Länge des zu amplifizierenden DNA-Bereiches kontinuierlich ab. Die

Effizienz kann aber wieder durch die Inkubationsdauer während eines

Polymerationsschrittes ausgeglichen werden. Durch genauere Einstellung der

Magnesiumkonzentration, die man im Einzelfall experimentell ermitteln muss, kann die

Reaktion für verschiedene DNA-Längen optimiert werden.

Bei der PCR ist weiters zu beachten, dass man keine Primer-Paare verwendet, die

teilweise oder ganz komplementär sind. Diese Primer können, statt sich an die DNA-

Matrizen anzulagern, sehr leicht Primer-Dimere (Primer verbinden sich) bilden.

Dadurch ist es sehr unwahrscheinlich, dass man die gewünschten DNA-Amplimere

bekommt.

Auch nicht jede DNA kann durch PCR vervielfältigt werden. Zum Beispiel wird die

DNA-Amplifikation erheblich gestört, wenn die beiden DNA-Einzelstränge nach der

Denaturierung intramolekulare Sekundärstrukturen ausbilden.

Besonders häufig geschieht dies, wenn die DNA-Einzelstränge hohe Guanin/Cytosin-

Anteile aufweisen, die sich zu stabilen Hypriden anlagern können. Dies kann unter

34

Umständen dadurch umgangen werden, dass man einen kleinen Anteil an 7-Aza-dGTP

dem Ansatz beimischt. Durch diese Nucleotid-Analoge wird teilweise die Ausbildung

von Sekundärstrukturen verhindert, wobei die Matrizenfunktion nicht stark gestört wird.

Diese Funktion kann aber auch Glycerin oder Dimethylsylfoxid (DMSO) übernehmen.

Durch diese Zusätze kann aber unter Umständen die Enzymaktivität abnehmen. Diesem

kann aber beispielsweise durch Rinderserumalbumin (BSA) entgegengewirkt werden.

Dieses BSA schützt die DNA-Polymerase in ihrer Aktivität und vermag Inhibitoren

(Hemmer) zu binden.

Normalerweise kann die theoretische Ausbeute an PCR-Produkten nicht erreicht

werden. Nach ungefähr 20 Zyklen nimmt die Effizienz der PCR kontinuierlich ab.

Dafür gibt es drei Gründe:

1. Die Nucleotide und die Primer werden langsam, aber stetig verbraucht.

2. Wegen der starken Temperaturschwankungen wird das Enzym in seiner

Aktivität gestört.

3. Es lagern sich immer häufiger komplementäre Einzelstränge zu Doppelsträngen

aneinander und dadurch wird verhindert, dass sich Primer anlagern.

DNA-Synthesen, die durch die Taq-Polymerase katalysiert werden, sind ungewöhnlich

fehlerhaft, da sie die „proofreading-Aktivität“ nicht besitzen. Dies kann, muss aber nicht

immer Probleme bereiten.

Besonders deutlich wird dieses Problem, wenn Fehler bereits während der ersten PCR-

Zyklen auftreten und wenn sehr wenig Matrizenmaterial eingesetzt wird. Denn dann

dienen die fehlerhaften Kopien als Hauptmatrize für weitere PCR-Zyklen.

Diese Schwierigkeiten lassen sich allerdings heute teilweise umgehen, da beispielsweise

mit der Vent®-Polymerase aus Thermococcus litoralis eine thermostabile DNA-

Polymerase verfügbar ist, die auch die „proofreading-Aktivität“ besitzt.

Eine der großen Stärken der PCR – nämlich ihre Sensibilität – kann auch zu einem

großen Problem werden. Dies muss besonders beachtet werden, wenn die PCR in der

medizinischen Diagnostik verwendet wird. Kontaminationen der Analysenproben mit

fremdem biologischem Material müssen unbedingt vermieden werden. Sonst besteht die

Gefahr, dass ein falsch-positives Ergebnis herauskommt. Dies ist gerade für solche

Krankheiten eine unakzeptable Komplikation, bei denen heute bevorzugt die PCR-

Analytik als Diagnostikmethode eingesetzt wird: Krebs und AIDS.

Um etwaige Kontaminationen zu vermeiden, muss man in einer extrem sauberen

Umgebung arbeiten. Die unterschiedlichen Arbeitsvorgänge wie die Aufbereitung der

35

Probe, die Amplifikation der DNA und die Analyse des Amplimers werden räumlich

getrennt voneinander vorgenommen.

Wenn die PCR-Methode an ihrem Limit betrieben wird, zum Beispiel mit sehr wenig

DNA-Matrize, sind weitere Schritte nötig, um die ungewollte Amplifikation möglicher

Kontaminationen zu verhindern. Eine Maßnahme kann eine photochemische oder eine

enzymatische Sterilisation sein:

- Bei der photochemischen Sterilisation werden alle Reaktionsansätze vor Zugabe

der Analysenprobe und nach Beendigung der Reaktion vor dem Öffnen der

Gefäße mit kurzwelligem UV-Licht bestrahlt. Wenn sich eine Kontamination

bereits vor Zugabe der Probe im Ansatz befindet oder ein Teil der abgelaufenen

Reaktion den Arbeitsplatz kontaminiert hat, so ist diese Kontamination als

Konsequenz der Bestrahlung nicht mehr amplifizierbar. Wegen der UV-

Bestrahlung wird in den möglichen DNA-Kontaminationen die Ausbildung von

Pyrimidin-Dimeren induziert. Weil durch Pyrimidin-Dimere vernetzte DNA-

Stränge nicht mehr denaturiert werden können, lassen sich die Kontaminationen

auch nicht mehr amplifizieren.

- Bei der enzymatischen Sterilisation wird vor jeder Amplifikation der

Reaktionsansatz mit dem Enzym Uracil-N-Glycosylase behandelt. Bei diesem

Vorgang wird Desoxyuridin-Triphosphat anstelle von Desoxythymidin-

Triphosphat eingesetzt. Das Enzym degradiert die DNA, die Uridin enthält und

daher aus früheren Reaktionen stammen muss. Natürliche DNA oder RNA lässt

das Enzym hingegen unberührt. Im Laufe der ersten Denaturierungsperiode wird

die Uracil-N-Glycosylase durch Hitze inaktiv und es kann das sich im Laufe des

Amplifikationsverfahrens bildende Uridin-haltige Amplimer nicht zerstört

werden.

Diese Sterilisationsmethoden sind in ihrer Effizienz nicht hundertprozentig und ersetzen

deshalb auch nicht die Einhaltung guter Laboratoriumspraktiken und adäquater

Kontrollen.

36

3.4.1.3 Spezielle PCR-Techniken

3.4.1.3.1 Nested PCR:

Es kommt häufig vor, dass die Sequenz eines DNA-Abschnittes, der vervielfältigt

werden soll, nicht bekannt ist. In einem solchen Fall wird die Sequenz der PCR-Primer

von verwandten Genen abgeleitet. Doch oft sind diese nur in einigen Bereichen

identisch. Aus diesem Grund muss damit gerechnet werden, dass sich einer oder sogar

beide Primer nicht nur ausschließlich an die gewünschten Stellen auf der Matrix-DNA

anlagern. In diesen Fällen entstehen oft erhebliche Mengen an Nebenprodukten.

Dieses Problem kann man beseitigen, indem man nach der ersten PCR eine zweiten

PCR mit den Produkten der ersten PCR als DNA-Matrize durchführt (=> „nested

PCR“). Beim zweiten Schritt werden aber andere Primer verwendet, die jeweils 3’ von

der Position der zuerst angewendeten Primer hybridisieren. Die unspezifischen

Nebenprodukte der ersten PCR werden in der Regel dann nicht mehr amplifiziert.

3.4.1.3.2 Touch down PCR:

Im Gegensatz zur „nested PCR“ werden die Amplifikationszyklen bei einer möglichst

hohen Anlagerungstemperatur begonnen. Unter diesen Bedingungen ist es nur perfekten

Primer-DNA-Hybriden möglich, zu initiieren. Wegen der hohen Temperatur ist es sehr

unwahrscheinlich, dass Fehlbildungen stattfinden. Diese Anlagerungstemperatur wird

bei jedem darauf folgenden Zyklus immer weiter gesenkt. Denn bei der ersten

Amplifikationsrunde haben sich so viele zusätzliche Matrizen gebildet, dass eine

eventuelle Fehlpaarung der Primer an falschen DNA-Stellen kaum noch ins Gewicht

fällt.

3.4.1.3.3 Inverse PCR:

Diese Methode ermöglicht die Analyse unbekannter genomischer Sequenzen, die direkt

an schon bekannte Abschnitte grenzen. Dazu wird die gesamte chromosomale DNA mit

einem Restriktionsenzym geschnitten und die entstandenen DNA-Fragmente werden

durch Selbstligation (Verschmelzung) ringförmig geschlossen. In einer daran

anschließenden PCR werden diese ringförmigen DNA-Moleküle als Matrize verwendet,

um die im Ligationsprodukt zwischen den bekannten DNA-Sequenzen liegenden

unbekannten Abschnitte selektiv zu amplifizieren. (siehe Abb.)

37

Inverse PCR32

3.4.1.3.4 Reverse-Transkriptase-PCR (RT-PCR):

Mit Hilfe der RT-PCR können RNA-Sequenzen spezifisch amplifiziert werden. Dazu

wird die RNA in DNA umgeschrieben und dann wird diese DNA amplifiziert.

Besondere Bedeutung kommt dieser Methode zu, wenn seltene Transkripte

nachgewiesen und analysiert werden sollen. Im Vergleich zu RNA-Nachweisverfahren

ist die Sensitivität der RT-PCR erheblich größer.

32 Abb. 12-4 aus Gentechnik, Buch S. 303

38

3.4.2 Anwendungen

3.4.2.1 Paläontologische Genetik:

Fossile DNA ausgestorbener Spezies war bislang für genetische Untersuchungen kaum

zugänglich, da die Mengen an erhaltener DNA sehr gering sind. Nur mit Hilfe der PCR-

Technik konnte fossile DNA amplifiziert und genauer untersucht werden. Die aus

solchen Untersuchungen gewonnenen Daten führten zu einer teilweisen Neuordung von

systematischen Verwandschaftsverhältnissen und ermöglichten darüber hinaus die

phylogenetische Einordnung von unbekannten Spezies. In Zukunft wird es auf diesem

Weg möglich sein, noch weitere offene Fragen zu lösen, die sich mit der Einordnung

fossiler Lebewesen beschäftigen, und einen genaueren Einblick in den zeitlichen

Verlauf evolutionärer Prozesse zu nehmen.

3.4.2.2 Gerichtsmedizin:

In der Gerichtsmedizin wird die PCR-Technik für Fingerprints (siehe 3.3.2.3

Gerichtmedizin, S. 27) besonders dann verwendet, wenn man am Tatort zu wenig DNA

vom Täter gefunden hat, um sie mittels Restriktionsendonukleasen zu spalten. Die

DNA-Proben der Verdächtigen werden mit dem gleichen Primer amplifiziert und

danach werden die Banden der Täter-DNA und den anderen DNA-Proben mittels einer

Gel-Elektophorese verglichen.

3.4.2.3 Medizinische Diagnostik:

Von herausragender Bedeutung ist die medizinische Anwendung der PCR-Technik. Mit

zunehmendem Wissen über spezifische humane Gene und deren Mutationen, die oft die

molekulare Ursache einer genetisch bedingter Krankheiten sind, ist die Analyse von

großer Bedeutung. Auch in der genetischen Beratung und in der Pränataldiagnostik

können Erbkrankheiten einfach und sicher identifiziert werden und man kann

erforderliche Maßnahmen sehr frühzeitig einleiten. Neben der Charakterisierung von

Erbkrankheiten sind mit Hilfe der PCR auch verschiedene Krebserkrankungen auf der

Ebene von Genmutationen untersucht worden.

Eine andere medizinische Anwendung der PCR ist der Nachweis von viralen oder

bakteriellen Infektionen. Durch PCR-Analysen kann der Nachweis einer Infektion

schon vor dem Krankheitsausbruch stattfinden. Bedeutende Anwendungsbeispiele

hierfür sind die klinischen PCR-Diagnosen von Aids- oder Tuberkulose-Infektionen.

39

3.4.3 Praktisches Beispiel:

PCR-Test für Toxoplasmose:

Die angeborene Toxoplasmose ist eine Infektion mit einem Protozoon (Toxoplasma

gondii), die besonders für den wachsenden Fötus im Uterus ein Risiko darstellt. Sie

kann zu Blindheit und geistiger Behinderung führen. Die meisten der infizierten

Neugeborenen haben bei der Geburt keine Symptome.

Im Rahmen der Mutter-Kind-Pass Untersuchungen werden in Österreich alle

Schwangeren mittels Antikörpertests auf eine Erstinfektion untersucht. Der Nachweis

der Infektion des Fötus war bei Erstinfektion der Schwangeren früher schwierig.

In den letzten Jahren wurde ein direkter Nachweis der DNA von Toxoplasma gondii aus

Fruchtwasserproben entwickelt. Bei diesem Test wird eine für Toxoplasma gondii

spezifische DNA Sequenz, das B1 Gen, nachgewiesen. Dieses Gen wird mittels PCR

amplifiziert und das Vorhandensein des spezifischen Amplifikationsproduktes mittels

eines Agarose-Gels analysiert.

Nachweis von Toxoplasma gondii im Fruchtwasser mittels PCR-Analyse:

Benötigtes Material: Benötigte Geräte:

100 mM TRIS-HCl pH 8.4, 250 mM

KCl

Pipette (20 µl)

30 mM MgCl2-Lösung Reaktionsgefäße (500 µl) (oft Eppis

genannt)

2 mM dNTPs (dATP, dCTP, dTTP,

dGTP)

Zentrifuge

sense / antisense primer (Jeder 4

pmol/µl)

Thermocycler

DNA-hältige Proben, aus

Amminoflüssigkeit von Patientinnen

präpariert

Gel-Elektrophoreseapparatur

Taq-DNA-Polymerase Gel-Dokumentationssystem

DNA-Größenstandard (10 µl)

H2O

40

Ladepuffer für Elektrophorese (enthält

Glyzerin und einen blauen Farbstoff:

Bromphenolblau)

Vorgangsweise:

1. Zuerst die Eppis beschriften und, weil die PCR eine sehr empfindliche

Nachweisreaktion ist, Handschuhe anziehen.

2. Die für die jeweilige PCR Reaktion angegebenen Komponenten in ein

Reaktionsgefäß geben. (Jedesmal neue Pipettenspitzen nehmen!)

Komponente Patient 1 Patient 2 Kontrolle Endkonzentration

100 mM TRIS-HCl pH 8.4,

250 mM KCl

10 µl 10 µl 10 µl 20 mM TRIS-HCl,

50 mM KCl

30 mM MgCl2 10 µl 10 µl 10 µl 6 mM

2 mM dNTPs 10 µl 10 µl 10 µl 400 µM

sense / antisense primer 5 µl 5 µl 5 µl 400 nM

DNA-hältige Probe 10 µl 10 µl 10 µl 1-5 ng

Taq DNA Polymerase 1 µl 1 µl 1 µl 1 U

H2O 4 µl 4 µl 4 µl

3. Die Reaktionsgefäße für 5 Sekunden zentrifugieren.

4. Dann die Reaktionsgefäße in den

Thermocycler stellen und das Programm

starten. (siehe Abb.33)

33 Thermocycler; Foto vom Praktikum im Vienna Biocenter

41

Elektrophorese:

1. Nach dem Ende der Reaktion im Thermocycler das Reaktionsgemisch mit dem

Ladepuffer versetzen und durch mehrmaliges Aufziehen der Pipette mischen.

2. 20 µl des Gemisches in die Tasche

des vorbereiteten Agarosegels

pipettieren. (siehe Abb.34)

3. Wenn alle Taschen besetzt sind, startet man die Elektrophorese.

4. Die Elektrophorese soll ungefähr 30 Minuten laufen.

5. Danach das Gel färben und betrachten. Das Ergebnis dokumentieren.

Eigenes Ergebnis:

Auf der Bahn M wurde ein DNA-Größenmarker aufgetrennt, der es erlaubt die Größe

von PCR-Produkten abzuschätzen. In den Bahnen 1 und 2 wurden die PCR-Reaktionen

von zwei Patientenproben aufgetragen. Bahn 3 zeigt eine positive Kontrollreaktion, bei

der Plasmide, die das β-Aktin Gen und das B1 Gen von Toxoplasmen enthalten, der

Reaktion zugesetzt wurden. Ist in der zu analysierenden Probe DNA von Toxoplasmen

vorhanden, so kommt es zur Bildung eines B1-Genfragmentes mit der Größe von 340

bp. Das als Kontrolle amplifizierte β-Aktin Gen liefert ein Produkt mit der Länge von

850 bp. Die beiden Produkte können auf Grund ihrer Größe durch Elektrophorese

getrennt voneinander unterschieden werden. Das Ergebnis dieser Analyse zeigt, dass bei

Patientin 1 Toxoplasma-DNA in der Amminoflüssigkeit vorhanden ist und somit auch

eine Infektion des Fötus vorliegt.

34 Füllen der Geltaschen; Foto vom Praktikum im Vienna Biocenter

42

35

35 Ergebnis der PCR-Reaktion; Bild vom Praktikum im Vienna Biocenter

43

4. Zusammenfassung und Ausblick:

Im ersten Teil der Arbeit wird zuerst kurz über den Zellaufbau gesprochen und es wird

dann gleich auf die Struktur der DNA übergegangen. In diesem Kapitel wird begründet,

weshalb die DNA das Erbmaterial ist. Danach wird die Zusammensetzung der DNA

und die Struktur der Doppelhelix genauer beschrieben. Um genügend Basiswissen zu

vermitteln, wird die Replikation der DNA in einem weiteren Kapitel erklärt.

Der Haupteil ist in drei Teile gegliedert. Im ersten Kapitel sind drei Möglichkeiten zur

Isolierung von DNA praktisch beschrieben, zuerst die Isolierung von pflanzlicher DNA

mit Hilfe einfachster Mittel, danach die Isolierung von tierischer DNA mit Hilfe

anspruchsvollerer Ausrüstung und schlußendlich die Isolierung von DNA aus der

Mundschleimhaut mittels Adsorptionschromatographie.

Im zweiten Teil ist die Restriktionsanalyse zuerst in der Theorie geschildert.

Anschließend werden einige Beispiele der Anwendungsmöglichkeiten dargestellt und

daraufhin wird eine dieser Möglichkeiten praktisch beschrieben.

Im letzten und auch längsten Kapitel wird die PCR-Analyse nach dem gleichen Schema

wie die Restriktionsanalyse erklärt, wobei die Theorie etwas länger ausgefallen ist, da

die PCR-Technik um einiges schwieriger ist und diese auch häufiger Verwendung

findet.

Schon heute ist die Gentechnik sehr wichtig. Es können Krankheiten schon frühzeitig

erkannt werden, es werden Pflanzen gentechnisch verändert, es gab bereits die ersten

Klonversuche und beim Schaf Dolly ist dies auch gelungen. Doch es stellt sich natürlich

die Frage, ob es auch ethisch vertretbar ist, Tiere oder sogar Menschen zu klonen. Man

wird wahrscheinlich sogar einen Embryo so gentechnisch verändern können, dass es

gegen Krankheiten resistenter ist oder man wird Haar - Haut oder Augenfarbe

bestimmen können.

Die Gentechnik hat sowohl ihre guten als auch ihre schlechten Seiten. So würde es

einen großen Fortschritt bedeuten, damit Krankheiten verhindert werden. Aber ob es gut

ist, einen Embryo nach bestimmten Wünschen zu verändern und dies nicht der Natur zu

überlassen, sei dahingestellt.

44

5. Glossar:

A

Amplifikation: (engl.) amplification; Vervielfältigung einer Basensequenz (eines DNA-

Abschnitts)

amplifizieren: = vervielfälltigen

Amplimer:

C

Chromatin: Komplex aus DNA, Histonen (Zellkernproteine) und Nichthiston-Proteinen

im Kern einer Eukaryontenzelle. Das Material, aus dem die Chromosomen bestehen.

Chromatographie: physik.-chem. Verfahren zur Trennung von Stoffgemischen.

Chromatographiesäule: Säule dient zur Trennung von Stoffgemischen (z. B.: Isolieren

von DNA aus Zellen)

Chromosom: Lange fadenartige Struktur bestehend aus DNA und assoziierten

Proteinen, die einen Teil oder die gesamte genetische Information eines Organismus

enthält. In Pflanzen- und Tierzellen besonders auffällig, wenn sich die Zelle der Mitose

oder Meiose unterzieht.

Cytoplasma: Inhalt einer Zelle innerhalb der Plasmamebran, aber, im Fall einer

Eukaryontenzelle, außerhalb des Zellkerns.

Cytosol: Wäßrige Lösung kleiner und großer Moleküle, die das Hauptkompartiment des

Cytoplasmas füllt. Ausgenommen sind membranumschlossene Organellen, wie das

endoplasmatische Retikulum und Mitochondrien.

D

dehydrieren: einer chemischen Verbindung Wasserstoff entziehen.

dekantieren: eine Flüssigkeit vom Bodensatz abgießen.

Denaturierung: Zerstörung der nicht kovalenten Wechselwirkungen, die für die

sekundäre oder höhergradige Struktur von Proteinen und Nucleinsäuren verantwortlich

sind, mit Hilfe chemischer oder physikalischer Mittel.

45

Dimer: eine Struktur, die aus zwei gleichen Untereinheiten besteht. Manchmal wird die

Bezeichnung Heterodimer verwendet, wenn die beiden Untereinheiten nicht identisch

sind.

Dipol: System aus zwei in definiertem Abstand voneinander entfernt stehenden

elektrischen Ladungen, die den gleichen Betrag, jedoch ein entgegengesetztes

Vorzeichen aufweisen; das Produkt aus Ladung Q und Abstand l wird als elektrisches

Dipolmoment p bezeichnet.

DNA: = Desoxyribonucleinsäure(acid); doppelsträngiges Polynucleotid, gebildet aus

zwei separaten Ketten von Desoxyribonucleotideinheiten; dient alsTräger der

genetischen Information.

Doppelhelix: natürliche Form der DNA in der Zelle, bestehend aus zwei

Polynucleotiden, die Basenpaare bilden.

Duplikation: Verdopplung eines Chromosomenabschnitts.

E

Effizienz: Wirksamkeit und Wirtschaftlichkeit.

Eluat: durch Elution gewonnene Lösung.

Elution: Auswaschung; Trennung einer adsorbierten Substanz (an einem anderen Stoff

gebunden) vomAdsorptionsmittel mit Hilfe einer Flüssigkeit.

Enzym: Protein,das eine spezifische chemische Reaktion katalysiert.

Eukaryont: lebender Organismus, der aus einer oder mehreren Zellen mit ausgeprägtem

Zellkern und Cytoplasma besteht. Zu denEukaryontonenzählenPflanzen,Tiere, Pilze und

Protozoen, nicht dagegen Bakterien (Prokaryonten).

F

fluoreszieren: bei Bestralung mit Licht- oder Röntgenstrahlen von selbst leuchtend.

G

Genom: die gesamte genetische Information einer Zelle oder eines Organismus (oder

die DNA-Moleküle, die diese Information tragen).

46

H

Heteropolymer: künstliches Nucleinsäuremolekül aus einem Gemisch unterschiedlicher

Nucleotide.

Homogenat:

homogenisieren: sich nicht mischendeFlüssigkeiten dorch Zerkleinerungder

Bestandteile mischen.

hybridisierung: experimenteller Vorgang, bei dem zwei komplementären

Nucleinsäuresträngen die Gelegenheit gegeben wird, unter selektivenBedingungen

aneinander zu binden; eine hochwirksame Technik, um spezifische Nucleotidsequenzen

aufzuspüren.

Hydrolyse: Spaltung einer kovalenten Bindung bei gleichzeitiger Adition von Wasser: -

H wird an das eine Spaltprodukt, -OH an das andere angehängt.

I

Inhibitoren: Hemmer.

Inkubationszeit: Zeit zwischender Ansteckung (Eindringen des Krankheitserregers in

den Körper) bis zum Auftreten der ersten Krankheitserscheinungen der

Infektionskrankheit.

Interphase: Phase zwischen zwei Zellteilungen, in der sich die Zelle in der

stoffwechselaktiven Arbeitsform befindet.

K

katalysieren: eine chemische Reaktion durch einen Stoff herbeiführen oder beeinflussen,

der selbst unverändert bleibt.

komplementär: bedeutet präzise Basenpaarung von zwei Nucleinsäuresequenzen.

Kontamination: Verschmutzung,Verunreinigung.

L

Ligase: Enzym, das zwei DNA- oder RNA-Segmente Endean Ende verbindet (ligiert).

Ligation: Verschmelzung.

47

Limitation: Beschränkung.

Lyse: Auflösung.

M

Meiose: Sonderform der Zellteilung, durch die Eizellen und Spermien gebildet werden

und bei der eine Reduktion des doppelten Chromosomensatzes auf einen einfachen

Chromosomensatz stattfindet.

Mitose: Teilung des Kerns einer Eukaryontenzelle, einschließlich der Kondensationder

DNA in sichtbare Chromosomen.

Mutation: eine vererbbare Veränderung in der Nucleotidsequenz eines Chromosoms.

N

Nuclease: Enzym, das Nucleinsäuremoleküle abbaut.

Nucleosid: Verbindung eines Zuckers und einer Base.

Nucleotid: Verbindung eines Zuckers, einer Base und einer Phosphatgruppe.

O

Okazaki-Fragment: ein kurzer RNA-gestarteter DNA-Abschnitt, der bei der DNA-

Replikation während der Synthese des Folgstranges entsteht.

oligo-: Präfix für ein Objekt oder ein kurzes Polymer, das aus einer geringen Anzahl

von Untereinheiten besteht. Ein Oligomer kann aus Aminosäuren (Oligopeptid), Zucker

(Oligosaccharid) oder Nucleotiden (Oligonucleotid) bestehen.

Organelle: unabhängige Struktur einer Eukaryontenzelle, die auf eine besondere

Funktion spezialisiert ist.

P

PCR: engl.: Polymerase-chain-reaktion = Polymerase-Kettenreaktion

Pellet: engl.: Kügelchen, Pille

phylogenetisch: betreffend die stammesgeschichtliche Entwicklung der Lebewesen und

die Entstehung der Arten in der Erdgeschichte.

Polymerase: allgemeine Bezeichnung für ein Enzym, das die Addition von

Untereinheiten an ein Polymer katalysiert.

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Polynucleotid: Polymer aus Nucleotideinheiten.

Pränataldiagnostik: Untersuchung des ungeborenen Kindes.

Primer: kurzes Polynucleotid, das sich an ein einzelsträngiges DNA-Molekül anlagert

und so einen Startpunkt für die DNA-Replikation bildet.

Prokaryontenzelle: Typ einer lebenden Zelle charakterisiert durch den fehlenden

Zellkern.

proofreading-Aktivität: (Korrekturlesefunktion) der Vorgang, durch den die DNA-

Polymerase beim „Abschreiten“ der DNA ihre eigenen Fehler korrigiert.

Protease: Enzym das Proteine durch Hydrolyse abbaut.

Protein: vorwiegend aus Aminosäuren aufgebauter Eiweißkörper.

Protozoen: (Protozoon) mikroskopisch kleines, aus einer einzigen Zelle bestehendes

Tierchen.

R

Renaturieren: wieder in einen naturnahen Zustand zurückführen.

Replikation: siehe Duplikaiton

Restriktionsendonuclease: (Restriktionsenzym) Nuclease, die eine spezifische kurze

Nucleotidsequenz auf der DNA erkennt und die DNA spaltet, wo immer diese Sequenz

auftritt.

Ribosom: vor allem aus Ribonukleinsäuren und Protein bestehendes, für den

Eiweißaufbau wichtiches, sehr kleines Körnchen.

S

Satelliten-DNA: ist entweder eine leichtere (AT-reiche) oder schwerere (GC-reiche)

DNA im Vergleich zur Haupt-DNA

semikonservative Replikation: Die Art der DNA-Replikation, bei der jede

Tochterdoppelhelix ein Polynucleotid von der Eltern-DNA und ein neu synthetisiertes

Polynucleotid enthält.

Sequenz: lineare Abfolge von Untereinheiten in einer Polymerkette, beispielsweise von

Aminosäuren in einem Protein oder Nuclioteden in einer DNA.

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Silicagel: Kieselgel

Supercoil: siehe Überspiralisierung

Suspension: feinste Verteilung sehr kleiner Teilchen einesfesten Stoffes in einer

Flüssigkeit, so daß sie darin schweben.

T

Thermocycler: Das Gerät wird für die PCR-Reaktion verwendet. Es ermöglicht einen

schnellen und sehr exakten Temperaturwechsel.

Transformation: Aufnahme neuer Gene durch eine Zelle in Form isolierter DNA.

Transkription: Synthese einer RNA-Kopie eines Genes.

Translation: Synthese eines Proteins, dessen Sequenz nach den Regeln des genetischen

Codes durch die Nucleotidsequenz einer mRNA bestimmt wird.

U

Überspiralisierung: (supercoiling) Konformation, in der eine Doppelhelix stärker oder

schwächer verdrillt ist, do dass eine superhelikale Spiralisierung entsteht.

W

Wasserstoffbrücken: relativ schwache chemische Bindung, die jedoch für die

Stabilisierung der höhergradigen Struktur vieler Biomoleküle von großer Bedeutung ist.

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6. Bilderverzeichnis:

Abb. 1 Abb. 1-17 aus dem Lehrbuch der molekularen Zellbiologie, Buch S. 16

Abb. 2 Abb. 3.7 aus der Medizinischen Mikrobiologie, Buch S.159

Abb. 3 Abb. 6-3 aus dem Lehrbuch der molekularen Zellbiologie, Buch S.199

Abb. 4 Tafel 2-6 aus dem Lehrbuch der molekularen Zellbiologie, Buch S. 68

Abb. 5 Tafel 2-6 aus dem Lehrbuch der molekularen Zellbiologie, Buch S. 68

Abb. 6 Tafel 2-6 aus dem Lehrbuch der molekularen Zellbiologie, Buch S. 69

Abb. 7 Abb. 6-4 aus dem Lehrbuch der molekularen Zellbiologie, Buch S.200

Abb. 8 Abb. 11.2 aus Moderne Genetik, Buch S. 190

Abb. 9 Abb. 3-1 aus Gentechnik, Buch S. 67

Abb. 10 Zerkleinerte Tomate; Foto vom Praktikum in Hamburg

Abb. 11 Pürieren der Tomate; Foto vom Praktikum in Hamburg

Abb. 12 Homogenat einer Kiwi mit Ethanol überschichtet; Foto vom Praktikum in

Hamburg

Abb. 13 Zerkleinerung des Kalbsthymus in große Stücke; Foto vom Praktikum in

Hamburg

Abb. 14 Zerkleinerung in Linsen-große Stücke; Foto vom Praktikum in Hamburg

Abb. 15 Vollständige Zerkleinerung; Foto vom Praktikum in Hamburg

Abb. 16 Filtrieren des Homogenats; Foto vom Praktikum in Hamburg

Abb. 17 Hineingeben der Zentrifugenbecher in die Zentrifuge; Foto vom

Praktikum in Hamburg

Abb. 18 Ausfallen der DNA; Foto vom Praktikum in Hamburg

Abb. 19 Aufwickeln der DNA; Foto vom Praktikum in Hamburg

Abb. 20 Abschaben der Mundschleimhaut; Foto vom Praktikum in Hamburg

Abb. 21 Zerstörung der Gewebe; Foto vom Praktikum in Hamburg

Abb. 22 Zentrifugieren der DNA; Foto vom Praktikum in Hamburg

Abb. 23 Erhitzung der Agerose und des Puffers; Foto vom Praktikum in Hamburg

Abb. 24 Abspülen des Kolben mit kaltem Wasser; Foto vom Praktikum in

Hamburg

Abb. 25 Einfüllen des Geles; Foto vom Praktikum in Hamburg

Abb. 26 Fertiges Gel; Foto vom Praktikum in Hamburg

Abb. 27 Abb. 2.2.3 aus Gentechnik Biotechnik, Buch S. 27

Abb. 28 Inkubation der Reaktionsgefäße; Foto vom Praktikum in Hamburg

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Abb. 29 Färben des Geles; Foto vom Praktikum in Hamburg

Abb. 30 Abb. 2.3.3 aus Gentechnik Biotechnik, Buch S.41

Abb. 31 Abb. 12-1: aus Gentechnik, Buch S.294

Abb. 32 Abb. 12-4 aus Gentechnik, Buch S. 303

Abb. 33 Thermocycler; Foto vom Praktikum im Vienna Biocenter

Abb. 34 Füllen der Geltaschen; Foto vom Praktikum im Vienna Biocenter

Abb. 34 Ergebnis der PCR-Reaktion; Bild vom Praktikum im Vienna Biocenter

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7. Literaturverzeichnis:

Alberts, Bruce; Bray, Dennis; Johnson, Alexander; Lewis, Julian; Raff, Martin; Roberts,

Keith; Walter, Peter: Lehrbuch der Molekularen Zellbiologie (WILEY-VCH Verlag

GmbH

Brown, Terence A.: Moderne Genetik (Spektrum Akademischer Verlag, 1999, 2.

Auflage)

Dingermann, Theodor: Gentechnik Biotechnik (Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft

mbH Stuttgart, 1999)

Gassen, Hans Günter; Minol, Klaus: Gentechnik (Spektrum Akademischer Verlag,

1996, 4. Auflage)

Gelehrter, Thomas D.; Collins, Francis S.; Ginsburg, David: Principles of medical

Genetics (Williams & Wilkins, 1998, 2. Auflage)

Junqueira, Luiz C.; Carneiro, Jose; Kelley, Robert O.: Histologie (Springer-Verlag,

2002, 5. Auflage)

Kayser, Fritz H.; Bienz, Kurt A.; Eckert, Johannes; Zinkernagel, Rolf M.: Medizinische

Mikrobiologie (Georg Thieme Verlag, 2001, 10. Auflage)

Löffler, Georg: Basiswissen Biochemie mit Pathochemie (Springer-Verlag, 2001, 4.

Auflage)

Mandl, Christian; Mandl, Lothar; Reuer, Egon: Organismus und Umwelt 3 (öbv et hpt

VerlagsgmbH & Co. KG, 1998, 3. Auflage)

Passarge, Eberhard: Taschenatlas der Genetik (Georg Thieme Verlag, 1994)

Regenass-Klotz, Mechthild: Grundzüge der Gentechnik (Birkhäuser Verlag, 2000, 2.

Auflage)

Schmid, Rolf D.: Taschenatlas der Biotechnologie und Gentechnik (WILEY-VCH

Verlag GmbH, 2002

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Ich erkläre, dass ich diese Fachbereichsarbeit selbst verfasst habe und dass außer der

angegebenen Literatur keine weitere verwendet wurde.

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Datum Unterschrift