Germeni Germeni Endotoxine Endotoxine Biofilme Biofilme

Hans Träger - Werner GmbH, GermaniaHans Träger - Werner GmbH, Germania Cosmin Costea - Centrul de dializă SibiuCosmin Costea - Centrul de dializă Sibiu

Apa pentru hemodializăApa pentru hemodializă „„Aqua purificata“- norme diferite, alte valori chimice Aqua purificata“- norme diferite, alte valori chimice

permise:permise: Cf. Cf. EuropharmEuropharm: conductivitate : conductivitate < 4,3 μS/cm.< 4,3 μS/cm. Cf. Cf. AAMIAAMI: se permite un conţinut mai ridicat de săruri, de unde : se permite un conţinut mai ridicat de săruri, de unde

rezultă o conductivitate mai mare.rezultă o conductivitate mai mare. Valori critice:Valori critice:

•Endotoxine < 0,25 EU/ml Endotoxine < 0,25 EU/ml (la fel ca „aqua pro injectione“)(la fel ca „aqua pro injectione“)

•Aluminiu < 0,01 ppmAluminiu < 0,01 ppm

A.A.M.I.:A.A.M.I.: AAssociation for the ssociation for the AAdvancement of dvancement of MMedical edical IInstrumentationnstrumentation

De unde vin germenii, De unde vin germenii, endotoxinele şi biofilmele ?endotoxinele şi biofilmele ?

În orice sursă de apă se găsesc multe specii deÎn orice sursă de apă se găsesc multe specii demicroorganisme.microorganisme.

Apa se purifică cu ajutorul radiaţiei UV, Apa se purifică cu ajutorul radiaţiei UV, a membranelor ori a microfiltrelor. a membranelor ori a microfiltrelor.

Germenii inactivaţi cu UV trăiesc în continuare,Germenii inactivaţi cu UV trăiesc în continuare, dar nu se mai pot înmulţi. dar nu se mai pot înmulţi.

Prin osmoză inversă şi microfiltre, germenii sunt Prin osmoză inversă şi microfiltre, germenii sunt reţinuţi 100 %. reţinuţi 100 %.

Tipul Atrăiesc

şi se reproduc

Tipul Btrăiesc,

dar nu se pot reproduce (sunt inactivaţi)

Tipul Cgermeni morţi

Germeni cultivabili şi necultivabili în apăGermeni cultivabili şi necultivabili în apă

Germeni cultivabili

Germeni necultivabili

Numai 1 - 3% dintre toţi germenii formează colonii pe mediu de

cultură

Numai tipul C Numai tipul C eliberează Endotoxineeliberează Endotoxine

Cum se pot număra germenii care nu Cum se pot număra germenii care nu formează colonii (necultivabili)?formează colonii (necultivabili)?

Germenii sunt particule, şi au diametre între 0,2 şi 10 µm. Germenii sunt particule, şi au diametre între 0,2 şi 10 µm. Particulele afectează procesul de fabricare al Particulele afectează procesul de fabricare al

microprocesoarelor.microprocesoarelor. Particulele de praf se pot pune în evidenţă prin metoda Particulele de praf se pot pune în evidenţă prin metoda

dispersiei luminii - nefelometria. dispersiei luminii - nefelometria. Germenii sunt compuşi 99 % din apă şi nu dispersează Germenii sunt compuşi 99 % din apă şi nu dispersează

lumina, de aceea nu pot fi detectaţi prin nefelometrie.lumina, de aceea nu pot fi detectaţi prin nefelometrie. Industria microelectronică a pus la punct încă de acum Industria microelectronică a pus la punct încă de acum 15 15

ani o metodă de măsurare a numărului total de ani o metodă de măsurare a numărului total de germeni. germeni.

Metoda ASTM F 1095-88 (1994)Metoda ASTM F 1095-88 (1994) pentru stabilirea numărului total de germeni pentru stabilirea numărului total de germeni

în industria microelectronică:în industria microelectronică:

Apoi se colorează membrana într-o

soluţie de acridininăGermenii - acum coloraţi -

se pot număra la microscopul cu

fluorescenţă

Printr-o membrană de filtru de 0,2 µm se trec 500 l de apă.

ASTM : American Society for Testing Materials

1,5 %1,5 % din Nr. tot. din Nr. tot. Numărul de colonii pe mediu de cultură săracNumărul de colonii pe mediu de cultură sărac

1 %1 % din Nr. tot. din Nr. tot. Numărul de colonii pe mediu de cultură săracNumărul de colonii pe mediu de cultură sărac

1,15 %1,15 % din Nr. tot. din Nr. tot. Numărul de colonii pe mediu de cultură bogatNumărul de colonii pe mediu de cultură bogat

0,8 %0,8 % din total: din total: Numărul de colonii pe mediu de cultură bogatNumărul de colonii pe mediu de cultură bogat

00 1.0001.000 2.0002.000 3.0003.000 4.0004.000 5.0005.000 6.0006.000 7.0007.000

Total germeni Total germeni

U.F.C. pe Caso (2 z)U.F.C. pe Caso (2 z)

U.F.C. pe Caso (7 z)U.F.C. pe Caso (7 z)

U.F.C. pe R2A (2 z)U.F.C. pe R2A (2 z)

U.F.C. pe R2A (7 z)U.F.C. pe R2A (7 z)

CTC (2 h)CTC (2 h)

CTC (4 h)CTC (4 h)

Acid nalidixic (4 h)Acid nalidixic (4 h)

Rhodamină (2 h)Rhodamină (2 h)

milioane / cm ²milioane / cm ²

Stabilirea numărului de microorganisme vitale din Stabilirea numărului de microorganisme vitale din biofilmele de membrană prin diverse metodebiofilmele de membrană prin diverse metode

Griebe & SchauleGriebe & Schaule

100%:100%: Numărul total de germeni Numărul total de germeni prin epifluorescenţă epifluorescenţă

32 %32 % din Nr. tot. din Nr. tot. Activitate de membrană / microscopietivitate de membrană / microscopie

15 %15 % din Nr. tot. din Nr. tot. Elongaţie (activitate enzimatică) / microscopieElongaţie (activitate enzimatică) / microscopie

41,5 %41,5 % din Nr. tot. din Nr. tot. Dehidrogenază / microscopieDehidrogenază / microscopie

37 %37 % din Nr. tot. din Nr. tot. Dehidrogenază / microscopieDehidrogenază / microscopie

Numărul total de celuleNumărul total de celuleValori cunoscuteValori cunoscute

Un exemplu de apă potabilă din Germania:Un exemplu de apă potabilă din Germania: Germeni tip A - cultivabili Germeni tip A - cultivabili

pe mediu de cultură 20 / ml pe mediu de cultură 20 / ml Germeni tip B - necultivabili 5000 / mlGermeni tip B - necultivabili 5000 / ml Germeni tip C 200000 / mlGermeni tip C 200000 / ml Nivelul de endotoxine 50 EU / mlNivelul de endotoxine 50 EU / ml

Apa potabilă în Basel /CH 10.000 EU / mlApa potabilă în Basel /CH 10.000 EU / ml

Comparaţie între numărul de germeni A+B+C (ASTM), Comparaţie între numărul de germeni A+B+C (ASTM), nivelul de endotoxine şi carbonul organic total (TOC)nivelul de endotoxine şi carbonul organic total (TOC)

în apa pură tratată prin schimbătoare de ioniîn apa pură tratată prin schimbătoare de ioni

A+B+C EU/ml TOC ppmA+B+C EU/ml TOC ppm

Valoare medie 100.000 1,0 1,0Valoare medie 100.000 1,0 1,0

Valoare minimă 60.000 0,5 0,8Valoare minimă 60.000 0,5 0,8

Valoare max. 10.000.000 100 100Valoare max. 10.000.000 100 100

Numărul total de germeni evoluează în paralel cu Numărul total de germeni evoluează în paralel cu nivelul de endotoxine şi cu volumul de carbon organic.nivelul de endotoxine şi cu volumul de carbon organic.

Sursa: Dawson et.al.: Microbes,Endotoxins and Water Pharm. Eng. 9,1988 p 9-12

Comparaţie între mediile de cultură (Agar) R2A şi CASO, şi Comparaţie între mediile de cultură (Agar) R2A şi CASO, şi metoda ChemScan - un analizor care numără toate celulele vii,metoda ChemScan - un analizor care numără toate celulele vii,

adică tipurile A+ B (nu poate număra pe cele de tip C)adică tipurile A+ B (nu poate număra pe cele de tip C)

S-a analizat permeatul după Osmoza inversă:S-a analizat permeatul după Osmoza inversă: ZileZile Medii de culturăMedii de cultură ChemscanChemscanfuncţionarefuncţionare R2A R2A CasoCaso în 1 mlîn 1 ml

00 00 00 00 55 2020 2020 20201515 60.00060.000 60.00060.000 60.00060.0002222 0.80.8 1 1 10103030 11 0,50,5 114040 11 0,50,5 115555 1010 2020 150150

6060 1010 4040 50 50

Sursa: Wallner et al. Hoechst Frankfurt Germany Quality Operations Microbiology

Putem observa că - după osmoza inversă - numărul de germeni de tip A+B Putem observa că - după osmoza inversă - numărul de germeni de tip A+B este la fel de mare ca numărul de germeni de tip A, adică unităţi formatoare este la fel de mare ca numărul de germeni de tip A, adică unităţi formatoare

de colonii. Concluzie: după osmoză nu găsim germeni de tip B de colonii. Concluzie: după osmoză nu găsim germeni de tip B

Profilul endotoxinelor Profilul endotoxinelor într-o staţie de apă pentru dializăîntr-o staţie de apă pentru dializă

Dedurizare Cărbune Filtru Tanc Osmoză Tanc Filtru Aparatul de activ fin inversă 0,1 µm dializă

55

EU/mlEU/ml

00

Sursa: Fresenius, Water in HemodialysisSursa: Fresenius, Water in Hemodialysis

Nivelul de endotoxine într-o staţie de apă Nivelul de endotoxine într-o staţie de apă pentru laborator (exemplu: Frankfurt / D )pentru laborator (exemplu: Frankfurt / D )

Dedurizare Osmoza Schimbător Dedurizare Osmoza Schimbător 2 x Filtru activat cu2 x Filtru activat cu inversă de ioni Tanc inversă de ioni Tanc potenţial zeta potenţial zeta

EU/mlEU/ml

Ca. 70 – 100 EU/ml se elimină în Ca. 70 – 100 EU/ml se elimină în concentratul de la osmoza inversă concentratul de la osmoza inversă

Testele s-au făcut după 6 luni de funcţionare fără dezinfecţie

Notă: Dializoarele sunt şi ele activate cu potenţial zetaNotă: Dializoarele sunt şi ele activate cu potenţial zeta

15-3015-300.003-0.040.003-0.04

0,1-2,00,1-2,00,00060,0006

< 0.0003< 0.0003

Cum se protejează staţia de apă pentru dializă Cum se protejează staţia de apă pentru dializă contra endotoxinelor şi formării de biofilmcontra endotoxinelor şi formării de biofilm

RecirculareRecirculare

Osmoza inversăOsmoza inversăAparat de dializăAparat de dializă

•Când nu este consum de apă, apa din inel trebuie recirculată Când nu este consum de apă, apa din inel trebuie recirculată permanent prin lampa de U.V.permanent prin lampa de U.V.

U.V.U.V.

•Osmoza inversă porneşte automat în fiecare oră câte 5 minute, Osmoza inversă porneşte automat în fiecare oră câte 5 minute, pentru a înlocui apa pentru a înlocui apa “veche” “veche” din inel cu apă proaspătă.din inel cu apă proaspătă.

RegulatorRegulator

Modelele prezentate ne indică următoarele Modelele prezentate ne indică următoarele concluzii:concluzii:

Nu există nici o legătură între Nu există nici o legătură între germenii de tip Agermenii de tip A ce pot fi ce pot fi puşi în evidenţă prin cultivare în mediu de cultură, şi puşi în evidenţă prin cultivare în mediu de cultură, şi

nivelul de endotoxinenivelul de endotoxine.. După osmoza inversă se găsesc doar puţini germeni de După osmoza inversă se găsesc doar puţini germeni de

tip A, şi nici un germen de tip B sau C. tip A, şi nici un germen de tip B sau C. Nu este permisă stagnarea apei în inelul de permeat, fapt Nu este permisă stagnarea apei în inelul de permeat, fapt

care ar duce la dezvoltarea germenilor de tip B+C, care ar duce la dezvoltarea germenilor de tip B+C, responsabili de formarea biofilmelor şi eliberare de responsabili de formarea biofilmelor şi eliberare de

endotoxine. endotoxine. De aceea nu trebuie folosite tancuri de stocare a De aceea nu trebuie folosite tancuri de stocare a

permeatului după osmoza inversă. permeatului după osmoza inversă.

Ce nivel de endotoxine suportă un pacient?Ce nivel de endotoxine suportă un pacient?

Pacienţii suportă un maxim de 5 EU / kg corp.Pacienţii suportă un maxim de 5 EU / kg corp. Astfel, un pacient de 70 kg poate fi încărcat cu circa Astfel, un pacient de 70 kg poate fi încărcat cu circa

350 EU fără a avea reacţii 350 EU fără a avea reacţii febrile.febrile.

Conform normelor în vigoare, 1 ml de apă poate conţine Conform normelor în vigoare, 1 ml de apă poate conţine maxim 0,25 EU, adică 250 EU / litru. Conform acestor maxim 0,25 EU, adică 250 EU / litru. Conform acestor valori, o şedinţă de dializă ar trebui efectuată cu maximum valori, o şedinţă de dializă ar trebui efectuată cu maximum 1,4 litri, peste această valoare endotoxinele 1,4 litri, peste această valoare endotoxinele

provocând reacţii febrile. provocând reacţii febrile. Apa pentru hemodializă are uzual un nivel de endotoxine Apa pentru hemodializă are uzual un nivel de endotoxine

de circa 0,1 EU / ml, pemiţând teoretic efectuarea unei de circa 0,1 EU / ml, pemiţând teoretic efectuarea unei şedinţe de hemodializă cu circa 3,5 litri de apă.şedinţe de hemodializă cu circa 3,5 litri de apă.

Cum se verifica lipsa pirogenilor Cum se verifica lipsa pirogenilor (nivelul de endotoxine) (nivelul de endotoxine)

până acum 15 ani?până acum 15 ani?

Apa care era verificată se injecta într-o anumită doză / kg corp Apa care era verificată se injecta într-o anumită doză / kg corp

la trei iepuri de laborator. Creşterea de temperatură înregistrată la trei iepuri de laborator. Creşterea de temperatură înregistrată

la cele trei animale testate şi însumată nu trebuia să la cele trei animale testate şi însumată nu trebuia să

depăşească 2,1°C în total, altfel proba nu era considerată depăşească 2,1°C în total, altfel proba nu era considerată

apirogenă.apirogenă.

Animalele de laborator aveau nevoie de o perioadă de Animalele de laborator aveau nevoie de o perioadă de

recuperare de mai multe săptămâni pentru un nou test.recuperare de mai multe săptămâni pentru un nou test.

Metoda modernă - testul cu Limulus (LAL) - era cunoscută, dar Metoda modernă - testul cu Limulus (LAL) - era cunoscută, dar

nu a fost acceptată oficial o lungă perioadă de timp.nu a fost acceptată oficial o lungă perioadă de timp.

Cum funcţionează testul cu Limulus?Cum funcţionează testul cu Limulus?

S-a constatat că animalul Limulus, din familia crabilor (animal fosil) moare S-a constatat că animalul Limulus, din familia crabilor (animal fosil) moare subit dacă este contaminat cu endotoxine, chiar în cantităţi mici.subit dacă este contaminat cu endotoxine, chiar în cantităţi mici.

În contact cu endotoxinele, sângele lui Limulus se gelifică, ducând la În contact cu endotoxinele, sângele lui Limulus se gelifică, ducând la colapsul sistemului circulator.colapsul sistemului circulator.

Din sângele albastru (la propriu) al lui Limulus se extrage componenta care Din sângele albastru (la propriu) al lui Limulus se extrage componenta care duce la gelificare, componentă utilizată pentru test.duce la gelificare, componentă utilizată pentru test.

Mai era nevoie de un standard care să reglementeze condiţiile de testare.Mai era nevoie de un standard care să reglementeze condiţiile de testare. Din bacterii Escherichia-Coli s-au extras endotoxine care, folosite în teste Din bacterii Escherichia-Coli s-au extras endotoxine care, folosite în teste

paralele pe iepuri şi Limulus, au dus la conceperea acestui standard.paralele pe iepuri şi Limulus, au dus la conceperea acestui standard. De aceea unitatea de măsură se numeşte Endotoxin Unit (unitate de De aceea unitatea de măsură se numeşte Endotoxin Unit (unitate de

endotoxină)endotoxină)

Cum se realizează testul cu Limulus?Cum se realizează testul cu Limulus?

În eprubeta de test În eprubeta de test în care se află 0,1 în care se află 0,1 ml extract de ml extract de Limulus se Limulus se introduc 0,1 ml introduc 0,1 ml

de apăde apă

Proba de 0,2 ml Proba de 0,2 ml se incubează în se incubează în baie termostatată baie termostatată 30 minute la 35 °C30 minute la 35 °C

Probă gelificată = Probă gelificată = Endotoxin pozitivăEndotoxin pozitivă

Probă fluidă = Probă fluidă = Endotoxin negativăEndotoxin negativă

+ -

Proba incubată se răstoarnă Proba incubată se răstoarnă

cu capul în joscu capul în jos

Cum se stabileşte nivelul de endotoxine Cum se stabileşte nivelul de endotoxine în apa testată?în apa testată?

Există teste de concentraţii diferite:Există teste de concentraţii diferite:

0,03 – 0.06 – 0.125 – 0.25 EU/ml0,03 – 0.06 – 0.125 – 0.25 EU/ml Dacă se face testul cu titrul 0,125, iar rezultatul este negativ, Dacă se face testul cu titrul 0,125, iar rezultatul este negativ,

atunci ştim că nivelul de endotoxine în apa testată este sub atunci ştim că nivelul de endotoxine în apa testată este sub 0,125 EU/ml.0,125 EU/ml.

Dacă se verifică nivele foarte mici de endotoxine, pentru a Dacă se verifică nivele foarte mici de endotoxine, pentru a reduce eroarea de test la valori sub 0,06 EU/ml trebuie testate reduce eroarea de test la valori sub 0,06 EU/ml trebuie testate patru probe în paralel, dintre care minimum trei trebuie să fie patru probe în paralel, dintre care minimum trei trebuie să fie negative ori pozitive pentru ca testul să fie valabil.negative ori pozitive pentru ca testul să fie valabil.

La concentraţii mari (0,125 şi 0,25) este suficientă testarea La concentraţii mari (0,125 şi 0,25) este suficientă testarea unei singure probe.unei singure probe.

Preţul unui test este de circa 1.5 – 3 EUROPreţul unui test este de circa 1.5 – 3 EURO

De ce nu traversează endotoxinele De ce nu traversează endotoxinele membranele de dializă?membranele de dializă?

Membranele de ultrafiltrare au rata de transfer definită Membranele de ultrafiltrare au rata de transfer definită nu în dimensiune metrică ci în greutate moleculară.nu în dimensiune metrică ci în greutate moleculară.

Membranele de dializă sunt asemenea membrane.Membranele de dializă sunt asemenea membrane. Rata lor de transfer este de până la 30.000 Dalton.Rata lor de transfer este de până la 30.000 Dalton. Dalton este sinonim cu greutatea moleculară.Dalton este sinonim cu greutatea moleculară. Endotoxinele au greutăţi moleculare > 100.000 DaltonEndotoxinele au greutăţi moleculare > 100.000 Dalton Exemplu: Acidul acetic CHExemplu: Acidul acetic CH33COOH = 60 Dalton COOH = 60 Dalton

(2xC = 24, 4 x H = 4, 2 x O = 32 total = 60)(2xC = 24, 4 x H = 4, 2 x O = 32 total = 60)

Test de contaminare a filtrului capilar (dializorului) Test de contaminare a filtrului capilar (dializorului) cu cantităţi mari de germeni şi endotoxine cu cantităţi mari de germeni şi endotoxine

(Fresenius 1993)(Fresenius 1993)

DializantDializant 37°C 37°C Pseudomonas 99 Mil. ufc/ml Pseudomonas 99 Mil. ufc/ml Bacteriofage 7 Mil. ufc/ml Bacteriofage 7 Mil. ufc/ml EndotoxineEndotoxine 38.000 EU/ml38.000 EU/ml

Filtrat (sânge) Filtrat (sânge) 37 °C37 °CPt. test: ser fiziologicPt. test: ser fiziologicPseudomonasPseudomonas 0 ufc/ml 0 ufc/ml BacteriofageBacteriofage 0 ufc/ml 0 ufc/ml EndotoxineEndotoxine 0 ufc/ml0 ufc/ml

Durata testului: 5 ore, cu analiza filtratului la fiecare orăDurata testului: 5 ore, cu analiza filtratului la fiecare oră

Vă mulţumim.Vă mulţumim.