Probleme bei der immunhämatologischen Abklärung · 1 Blutspendezentrale für Wien,...

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Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland

Probleme bei der immunhämatologischen

Abklärung

Fortbildung für Blutdepotbeauftragte 10.Mai und 07.Juni 2016

Elisabeth Schistal, Christof Jungbauer

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Prätransfusionelle Untersuchungen

ABO und RhD (validierte Doppelbestimmung)

Antikörper-Suchtest (im ICT 37°C)

Serologische Verträglichkeitsprobe

- muss vor jeder allogenen Erythrozytentransfusion

durchgeführt werden

- kann vor jeder autologen Transfusion durchgeführt werden

- maximale Gültigkeit KP: 72 Stunden

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ABO-Blutgruppenbestimmung

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Probleme bei der ABO-Bestimmung

Antigenbestimmung

irreguläre Reaktionen der Erythrozyten mit den Testreagenzien Anti-A, Anti-B

Serumgegenprobe

irreguläre Reaktionen des Probandenserums

mit A1-, A2-, B- und O-Testerythrozyten

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Irreguläre Reaktionen der Erythrozyten 1) Partielle, schwache oder fehlende Agglutination Physiologisch (Neugeborene, A-Untergruppen!)

Angeboren

- Seltene A, B und O Varianten

ev. irreguläres Anti-A1 bei A-var, ev. Adsorption-Elution

- Chimärismus

Krankheitsbedingt

- Blutgruppenungleiche (Notfall-, Fehl- bzw. ”kompatible” Transfusion) Mischfeldagglutination

- Knochenmarkstransplantation

- Leukämische Erkrankungen

- Acquiriertes B (bei BG A1)

Fallbeispiel

BG mit MF-Reaktionen und fehlender Isoagglutinine in der SGP

ÖSTERREICHISCHES ROTES KREUZ


Fallbeispiel 3:

BG mit MF-Reaktionen und fehlender Isoagglutinine in der SGP im Rö

RhD Bestimmung im Rö

A B AB A1 A2 B 0 E D CDE Ko

P 132708



• Auflösung Fallbeispiel :

• 1. KMT im Mai 2015 Empfänger A negativ, Spender B positiv ccD.Ee

• 2. KMT im Juli 2015 Empfänger A negativ, Spender B positiv CCD.ee

• während Konditionierung Transfusion mit O negativ

• nach KMT Transfusion mit O positiv CCD.ee

• ab 09.2015 Transfusion mit B positiv CCD.ee, da keine Iso´s vom

Empfänger gegen den Spender mehr vorhanden sind



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Irreguläre Reaktionen der Erythrozyten 2) Irreguläre positive Reaktionen (Agglutination)

Beladung mit Kälte-Wärme-Auto-Antikörpern (DAT positiv)

(eventuell BG-Bestimmung bei 37°C)

Pseudoagglutination

- Geldrollenbildung (Paraproteinämien)

- Unspezifische Aggregation (Dextrane)

- Verunreinigung mit Warthonscher Sulze

VORSICHT falsch positive Reaktionen bei pos. DAT(ctl.pos.)in

der Dia-Med-Gel-Karte !!!

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A RhD positiv ctl. pos, DAT IgG 2+ polyclonal



A RhD positiv ctl. pos, DAT IgG 2+ monoclonal



A RhD positiv ctl. pos, DAT IgG 3+ Röhrchenmethode monoclonal



Irreguläre Reaktionen in der Serumgegenprobe 1) SGP schwach oder negativ physiologisch – angeboren

- Neugeborene

- Alter

- Chimäre (Immuntoleranz)



Irreguläre Reaktionen in der Serumgegenprobe 1) SGP schwach oder negativ krankheitsbedingt

- Hypogammaglobulinämie

- BG-ungleiche Transfusion

- Immunsuppresive Therapie

- Leukämische Erkrankung

- St.p.KMT/SZT (Immuntoleranz)



Verstärkung der Reaktionen der Serumgegenprobe

INKUBATION für ca. 20 Min. bei 4°C

Isoagglutinine primär kältereaktiv (IgM-Ak)

O-Zelle + E-KO mitführen!

Ausschluss kältereaktiver (Auto)antikörper

SGP im IAT 37°C („immune Isoagglutinine“)



Irreguläre Reaktionen in der Serumgegenprobe 2) Irreguläre positive Reaktionen in der SGP

irreguläres Anti-A1 (klinische Relevanz?) A-Variante (A2-Zellen wichtig!)

irreguläres Anti-H

spezifischer, primär kältereaktiver AK

Anti-M, Anti-Le, Anti-P1, Anti-N, Rh-Ak, Kell-Ak

“unspezifische Kälteagglutinine”(meist Anti-I)

Bei BG O als Kontrolle O-Zelle + E-KO mitführen!

BG A RhD negativ ccddee

AK-Screening negativ

BG-Bestimmung und SGP bei RT

Fallbeispiel



Fallbeispiel BG A RhD negativ ccddee, irreguläres Anti-A1

AK-Screening negativ

A1

A2

B

0

E-Ko

SGP im Rö bei 37°C




ABO-Tabelle irreguläres Anti-A1 und Anti-H

A1 mit irreg. Anti-H

A1B mit irreg. Anti-H

A2 mit irreg. Anti-A1

A2B mit irreg. Anti-A1

A1

-

-

1+/-4+

1+/-4+

A2

1+/-4+

1+/-4+

-

-

B

4+

-

4+

-

0

1+/-4+

1+/-4+

-

-

E-KO

-

-

-

-


Serumgegenprobe bei Anti-c

Anti-A neg.

Anti-B 4+

Anti-AB 4+

A1-Zelle 3+

A2-Zelle 2+

B-Zelle 3+

O-Zelle 1+

E-KO neg.

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RhD-RhCE-Bestimmung

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Probleme bei der RhD-RhCE-Bestimmung

Mischfeldagglutination

weakD – partialD

Bestimmung bei positivem DAT

Del (serologisch negativ / genetisch positiv)

Wann ist eine Genotypisierung sinnvoll?

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Serologische Abklärung RhD/RhCE

Doppelbestimmung mit 2 unterschiedlichen – aufeinander abgestimmten Testreagenzien gilt für alle Ag-Bestimmungen

z.B.: monoklonales (das die Kat VI nicht erkennt) und polyklonales Testreagenz ( „DVI+“)

Ein Testreagenz sollte auch im IAT angesetzt werden

„scheinbar“ negative Reaktionen bei RT

RhD-negative mit CDE-positiv Anti-D im IAT

Vorsicht: RT-Milieu negativ, IAT positiv um Testergebnis richtig zu interpretieren, muss DAT negativ sein!

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Serologische Abklärung RhD/RhCE

Mischfeldagglutination:

angeborener Chimärismus

erworbener Chimärismus

- Vortransfusion

(“kompatible” Transfusion, Notfalltransfusion mit O negativ)

- St.p.KMT/SZT

- leukämische Erkrankungen

genetische Abklärung sinnvoll



MF-Agglutination Mischfeld RhD, RhCDE

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MF-Agglutination Mischfeld RhC

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RHD - Varianten RhD var, weakD, partialD Sammelbegriff für serologisch schwach exprimiertes RhD: D var

(historisch: Du, Dweak)

serologisch deskriptive Bezeichnung (ohne nähere Zuordnung)

derzeit können 30 Epitope (mit monoklonalen Ak) auf RhD untersucht werden

Unterscheidung weak-/ partial D praktisch nur genetisch möglich (Hauptproblem sind weak D Typen wegen falsch negativer Reaktionen der Anti-D-Testreagenzien)

weak D Sensibilisierung unwahrscheinlich - (alle Epitope vorhanden)

Polymorphismus intramembranös bzw. zytoplasmatisch

partial D Sensibilisierung möglich - (nicht alle Epitope vorhanden)

Polymorphismus extrazellulär

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Blutspendedienst

Vorgehen bei Patienten mit abgeschwächter D-Expression

D var – Transfusionsempfehlung und Rhesusprophylaxe

Patienten mit weakD-Typ 1,2,3 können wie D-positiv gesehen werden: (sofern eine serologische RhD-Mindestexpression von >= „?/ 1+“ vorliegt)

- Transfusionsempfehlung RhD-positiv

- keine Rhesusprophylaxe in der Schwangerschaft

Patienten mit abgeschwächter D-Expression (Dvar), bei denen

kein weakD-Typ 1,2,3 vorliegt, werden mit RhD-negativem Blut versorgt.

Schwangere erhalten eine Rhesusprophylaxe.

Empfehlungen des BSD SRK. Immunhämatologische und prätransfusionelle Untersuchungen an Patientenproben. 2009

ÖGBT Standards 2015

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RhD-Varianten Was ist der Nutzen der Differenzierung von D var in: weakD bzw. partialD?

ca. 50% der Europäer mit Rh Dvar haben weak D type 1, 2 oder 3

> 95% der europäischen weak D-Typen sind weak D type 1, 2, 3, 4

Einsparung von ca. 3% RhD negativer EK‘s

Schwangere keine Rhesusprophylaxe notwendig

Seltene Phänotypen, z.B. CCddee, ccddEE, pp, Oh, etc…

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Auswertung genetische RHD-Bestimmung 1/2014 bis 10/2015 n= 465

weak D type 1 146

weak D type 2 34

weak D type 3 37

Summe 217 (46%)

anderer weak D-Typ

weakDtype15, weakDtype66

weakDtype5, weakDtype14

9

weak D type 4

17

Summe

26 (5,6%)

RHD positiv serologisch abgeschwächt

„Ceppellini“

Summe

151 (32%)

serologisch positiv

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partial D

D Kat.VII 27

D Kat.VI 10

Sonstige partial D-Typen 34

Summe 71 (15,3%)

wea

k D

D

po

siti

v p

arti

al D

RHD-Genotypisierung Auswertung von 465 Zusendungen (1/2014 bis 10/2015) wegen abgeschwächter D-Expression


RHD-Genotypisierung Auswertung von 465 Zusendungen wegen abgeschwächter D-Expression

46% 32%

15,3% 5,6%

> 2/3 der Patienten können RhD positiv transfundiert werden



Vorsicht RhD-Bestimmung bei pos DAT (IgG+, C3d+, ctl-Karte pos, etc.)

Interpretation der Testergebnisse Ansatz Anti-D RT und IAT

(Blend-Reagenzien: monoclonal IgM / IgG)

RT 1+/2+ IAT 37°C 1+/2+ RH-D var

RT - IAT 37°C - RH-D negativ

RT - IAT 37°C 1+/2+ RH-D derzeit nicht bestimmbar

RT 3+/4+ (falls Milieu-KO negativ ist) RH-D positiv

Serologische Bestimmung von RhD CcEe bei positivem DAT

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BG A RhD negativ, ctl pos. DCT IgG 2+

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Patient mit Del und Anti-D (Titer 1:128) Anti-D serologisch negativ, genetisch alle 10 D-Exons vorhanden, DAT negativ

Adsorption - Elution

KO Überstand letzter Waschschritt

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MF-Agglutination im RhD durch Notfalltransfusion mit RhD negativ

bzw. „kompatibler“ EKs

Krankheitsbedingte Doppelpopulation (leukäm. Erkrankung)

Negride Bevölkerung

Bsp. St. Anna KSp. (DAU; weak D type 14) -diese Var. erscheinen serologisch positiv

RhD negative Patienten mit GB routinemäßig RHD-SSP (als Qualitätskontrolle)

Alle RhD negativen Erstspender mit GB (als Qualitätskontrolle)

Anti-D bei RhD positiv

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RHD Bei welchen Fragestellungen ist eine Genotypisierung sinnvoll


Antigentypisierung

- wenn man einen Phänotyp wissen möchte, aber die Probe ungeeignet ist

- wenn die Molekularbiologie ausführlichere oder bessere Ergebnisse liefert

- wenn die Molekularbiologie effizienter bzw. kosteneffizienter ist als die Serologie

Wann verwendet man die Genetik?

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Antikörper-Screening Ak-Differenzierung Kreuzprobe

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Ak-Screening/-Differenzierung-Reaktionsmilieus

Ak-Differenzierung im Speziellen:

-Ak gegen polymorphe Ag

-Ak gegen HFA

-Ak gegen LFA

-Autoantikörper -Medikamenten-Ak/ DAT

-HTLA-Ak

-Einsatz von Enzym

-Kreuzprobe

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Die in den käuflichen Antikörperscreening – Panels ausgewiesenen Antigene decken die häufigen Antikörperspezifitäten bei Europäern ab

Nach Möglichkeit soll für jedes Ag eine homozygot positive Zelle vorhanden sein



Positiver Ak-Suchtest Ak-Differenzierung Reaktionsmilieus

Indirekter Antihumanglobulintest (IAT)

(AHG-Test, Coombs-Test)klinisch relevante AK vom IgG-Typ

Neutralmilieu RT bzw.4°C (Röhrchen/Gelkarte)

bei V.a. primär kältereaktive Ak vom IgM-Typ

(SGP>, O-Zelle positiv)

(ABO, M/N, P1, Lea/Leb)

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Ak-Differenzierung Reaktionsmilieus

Enzymmilieu

papainresistent: Le, RhD, Jk Ag

papainsensitiv: M/N, Fy, Ch/Rg

weitere Enzyme: Trypsin, DTT, etc…

LISS/Albumin- Röhrchenmethode

RT, LISS/ Albumin 37°C /IAT

Einsatz bei durchgehend positiven Reaktionen in der Gel-Karte

Neutralmilieu Röhrchenmethode RT/ 37°C/ IAT

Einsatz bei kälte-wärmereaktiven Autoantikörpern bzw. bei V.a.

milieuassoziierte Störfaktoren

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Ak-Differenzierung-Ak gegen polymorphe Ag Anti-c

O positiv, CCD.ee



O positiv, CCD.ee



Ak-Differenzierung-Ak gegen hochfrequente Ag


Anti-Dia (Frequenz: 0,01%)

Antikörper gegen LFA



Low Frequency Antigens (LFA)

Frequenz < 1% z.B.: Vw (0,06%), Wra (0,01%), Dia (0,01%)

Mia (0,01%, Asiaten bis 15%) , etc.

Differenzierung nicht unbedingt notwendig, KP ausreichend!

Vorsicht: Frauen im gebärfähigem Alter! HDFN



Antikörperidentifikation bei negativer Autokontrolle

Reaktionsmuster Panelzellen

Interpretation Weitere Vorgehensweise

einzelne Panelzellen positiv ähnliche Reaktionsstärke

spezifischer Allo-Ak, Einzelspezifität Ausschluss weiterer Allo-Ak Bestätigung der Spezifität mittels ausgewählter Testzellen

einzelne oder alle Panelzellen positiv unterschiedliche Reaktionsstärken

mehrere spezifische Allo-Ak bzw. Allo-Ak gegen HFA

Antigenprofil der Patientenzellen Dosierungseffekt? Austestung von Zellen, die dem Phänotyp des Patienten entsprechen, wenn negativ ausgewählte Testzellen,um Allo-Ak zu bestätigen bzw. auszuschließen wenn positiv V.a. Allo-Ak gegen HFA

alle Panelzellen positiv ähnliche Reaktionsstärke

spezifischer Allo-Ak gegen HFA mehrere spezifische Allo-Ak

einzelne Panelzellen sehr schwach reaktiv schwach reaktiver spezifischer Allo-Ak bzw. Antikörper mit Dosierungseffekt

Antigenprofil der Patientenzellen homozygote Testzellen verwenden, deren Antigene beim Patienten negativ sind Techniken zur Verstärkung der Reaktionen verwenden, z.B. Enzyme

nur eine Panelzelle reagiert positiv spezifischer Allo-Ak gegen LFA Testzellen verwenden, die bezüglich LFA positiv sind eventuell ad Referenzlabor zur weiteren Abklärung



Antikörperidentifikation bei positiver Autokontrolle

Reaktionsmuster Panelzellen positiver DAT


alle Panelzellen reagieren negativ mit Serum oder Eluat

eventuell Medikamentenantikörper 1) Antigenprofil des Patienten, allogene

Adsorption (vortransfundiert)

2) Autoadsorption, wenn nicht vortransfundiert

3) Testung (ausgewählter) Panelzellen mit Serum des Patienten

4) Testung von Panelzellen mit Eluat, bei KMT/SCT oder Vortransfusion mit plasmahältigen Präparaten auch mit A und B-Zellen

einzelne Panelzellen sind reaktiv mit Serum und Eluat

Transfusionsreaktion durch Allo-Ak ,falls kürzlich transfundiert spezifischer Auto-Ak (gegen „normalverteiltes“Ag)

alle Panelzellen positiv mit Serum und Eluat nicht vortransfundierter Patient panreaktiver Auto-Ak bei AIHA, Med.-Ak vortransfundierter Patient Transfusionsreaktion durch Allo-Ak gegen HFA, AIHA, Med.-Ak

alle Panelzellen positiv mit Serum , Eluat negativ möglicher Allo-Ak Medikamentenantikörper

alle Panelzellen positiv mit Eluat, mit Serum negativ

Panreaktiver Auto-Ak bei AIHA, kein frei im Serum vorhandener Auto-Ak Frühe Transfusionsreaktion (Allo-Ak gegen HFA)



Antikörperidentifikation bei positiver/negativer Autokontrolle

Reaktionsmuster Panelzellen negativer DAT (positive oder negative Autokontrolle)


alle Panelzellen positiv V.a. Ak gegen Testmedium („Stabilisatorunverträglichkeit“)

Ak-Testung in einem anderen Medium, z.B.Röhrchenmethode Neutralmilieu Elution, wenn klinische Symptome Hämolyse (verkürzte Ery-Überlebensrate) vorhanden sind, z.B. DAT negative AIHA

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HISTORISCHE Antikörper müssen beachtet werden!

z.B. Anti-Jk, Anti-Fy, Anti-E

BOOSTERUNG

verzögerte hämolytische Transfusionsreaktion!

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Wann dürfen Ak-Spezifitäten ausgegeben werden?

- Antikörperspezifitäten dürfen nur bei technisch eindeutiger Differenzierung bei ausreichendem Sicherungsgrad ausgegeben werden.

- Kein „Anzüchten“ von Antikörpern (insbes. bei MDS)

- Vorläufige deskriptive Lösung: „ das Serum des Patienten reagiert mit M-negativen schwächer als mit M-positiven Zellen“.

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Serologische Verträglichkeitsprobe („Kreuzprobe“)

Majortest: Empfänger-Serum + Spenderzellen OBLIGAT

Autoantikörperkontrolle (Eigen-Ko) zu empfehlen, nicht obligat

Reaktionsmilieu: IAT 37°C kein Enzymansatz!!

Teil der prätransfusionellen Untersuchung

Im Rahmen einer Transfusionstherapie KP innerhalb 72h zu wiederholen

Akutsituationen-Minimalanforderungen:

BG+RhD Blutprobe vor Transfusion

KP und Ak-Suchtest mit Beginn der Transfusion

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Österreichisches Rotes Kreuz Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland

Labordiagnostik - Immunhämatologie Wiedner Hauptstrasse 32 1040 Wien Tel.: +43 1 58 900 -260 Fax.: +43 1 58 900 -262 Email: [email protected]

Danke für die Aufmerksamkeit !

Dr. Elisabeth Schistal [email protected], Tel. DW.: -408

Dr. Christof Jungbauer [email protected], Tel. DW.: -402

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