Prof. Dr. Thomas Brück

Dr. Norbert Mehlmer

Technische Universität München

Fakultät für Chemie/ Fachgebiet Industrielle Biokatalyse

(IBK)

Ressourceneffiziente

Produktionsverfahren für PHB-

Biokunststoffe

Projektpräsentation

Projektverbund

Ressourcenschonende Biotechnologie

in Bayern

Einleitung

2

PHB: Poly-(R)-3-Polyhydroxybutyrat

Biologisch recycelbar

Ziele

3

Kleie

Genetisch optimierter

E. coli stamm zur

Produktion von

Designer PHB

E. coli Wachstumsmedium

Kleie-Hydrolysat

Produktion eines neuen, auf Polyhydroxybutyrat (PHB) basierenden

Kunststoffs

Aus erneuerbaren Ressourcen (Kleie-Hydrolysat)

Nicht auf Erdöl-Basis

Verbesserte Produkteigenschaften

Kostengünstige Produktion

Vorgehensweise

4

Nachhaltige Fermentationsgrundlage

Kleie (Weizen)

Enzymatische Hydrolyse:

Cellulasen

Pectinasen

Hemi-Cellulasen

Zuckerzusammensetzung des

Hydrolysats

Zusammensetzung:

Glucose (Hexose)

Xylose (Pentose)

…

Problem:

Gleichzeitige Fermentation

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Parallele Fermentation von Hexosen und Pentosen

ptsG Knockout Gleichzeitige Verwertung von Glukose und Xylose

Wachstum (OD=optische Dichte, schwarz) von E. coli in einem

Wachstumsmedium das drei Zucker beinhaltet: Xylose (blau), Arabinose (lila),

und Glukose (grün). Links: wild-typ E. coli. Rechts: ptsG Knockout.

Xia et. al, 2012

Vorgehensweise

6

Verstärkter Xylose Metabolismus zur gesteigerten 3HB Produktion

Pentose-Phosphate Weg Dahm Weg

Üblicher Weg Abkürzung

Xylose

Xylonate

2-keto-3-deoxy-

Xylonate

Gylcolaldeyd

Pyruvat

D-Xylose

Dehydrogenase

Xylonate

Dehydratase

Aldolase

Acetyl-CoA

Pyruvate Dehydratase Komplex

Xylulose

Xylulose-5-Phosphate

Eingang zur Glycolyse

D-Xylulokinase

Transketolase

Transaldolase

Glyceraldehyde-3-Phosphat

+Fructose-6-Phosphat

Glycolyse

Pyruvat

Xylose

D-Xylose Isomerase

Acetyl-CoA

Pyruvat Dehydratase

Komplex

Vorgehensweise

7

Metabolic Stoffwechselweg zu PHB

phbA: β-ketoacy-CoA Thiolase

phbB: acetoacetyl-CoA Dehydrogenase

phbC: PHB Polymerase

Endogene Synthese von PHB (taktisch)

Synthese des Designer PHB

Neue Synthesestrategie Ataktisches

PHB

thioesterase II

3HB

+ CoASH

Vorgehensweise

8

Neue synthetische Strategie

Ziel: Ataktisches PHB

Lactonisierung

Vorgehensweise

Übersicht:

Ring-Öffnungspolymerisation

9

Biokatalytische Lactonisierung von 3-HB

PL CD6

Natives

Substrate

Substrat

(Funktionelle

Gruppe)

Ziel-

substrate

PL HS6

Vorgehensweise

10

Strukturbasierte Mutagenese von PlaO1

Doppelsträngige ß-Helix Konserviertes Eisen-Bindemotiv

Vorgehensweise

C-Terminale Region

Substratspezifische

Bindung

Hauptansatzpunkt

zur gezielten

Mutagenese

11

Lipase-basierende Ringöffnungs Polymerization

ß- Lactone

Lipase AP6

Lipase

Designer PHB

Vorgehensweise

Optimierung der Produktausbeute

Wie lässt sich die Ausbeute von 3HB steigern ?

Vorgehensweise

13

Metabolische Flussanalyse und Optimierung der Produktivität

13C

12C

Markierte Substrate

Feed

Zellkultur

0

50

M1 M2 M3 M4 M5

Ab

un

da

nce

Messung

Analyse Metabolische Markierung

Vorgehensweise

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Zusammenfassung

PHB ist ein natürliches Biopolymer, das sich fermentativ einfach

herstellen lässt

Etablierung einer nachhaltigen Fermentationsgrundlage

basierend auf Kleiehydrolysat

Produktion von ataktischem PHB durch eine neue

Synthesestrategie durch

Biokatalytische Lactonisierung von 3HB

Lipase-katalysierte Ringöffnungspolymerisation des Lactons

Metabolische Optimierung der Produktausbeute

Projektfortschritt

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Plasmid zur Expression des

PlaO1 Gens (WP4)

Plasmid zur Expression der

phbA und phbB Gene (WP2)

ptsG Knockout E. coli Stamm (WP2).

Etablierung der 3HB Produktion in E. coli

Etablierung der 3HB

Nachweismethode (Kit)

Danksagung

Dr. Daniel Garbe

Dr. Monika Fuchs

Dr. Farah Qoura

Dania Awad

Felix Bracharz

Gülnaz Celik

Matthias Glemser

Martina Haack

Elias Kassab

Jan Lorenzen

Mahmoud Masri

Wolfgang Mischko

Veronika Redai

Johannes Schmidt

Wojciech Jurkowski

Samer Younes

Prof. Dr. Thomas Brück Technische Universität München

Fakultät für Chemie

Bayerisches Staatsministerium für

Umwelt und Verbraucherschutz