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  • D77

    Protein-Protein- und Protein-Lipid-Wechselwirkungen beeinflussen die Oligomerisierung und Funktion des

    E. coli Aquaglyceroporins GlpF

    Dissertation zur Erlangung des Grades

    "Doktor der Naturwissenschaften"

    im Promotionsfach Chemie

    am Fachbereich Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften

    der Johannes Gutenberg-Universität in Mainz.

    Noreen Klein

    geb. in Wiesbaden

    Mainz, den 05.02.15

  • Dekan:

    1. Berichterstatter:

    2. Berichterstatter:

    3. Berichterstatter:

    Tag der mündlichen Prüfung: 23.04.15

  • Im Rahmen dieser Arbeit sind folgende Veröffentlichungen entstanden: Klein, N., N. Hellmann, and D. Schneider. 2015. Anionic lipids modulate the activity of the aquaglyeroporin GlpF. Biophys J (in Revision). Klein, N., J. Neumann, J. D. O'Neil, and D. Schneider. 2015. Folding and stability of the aquaglyceroporin GlpF: Implications for human aqua(glycero)porin diseases. Biochim Biophys Acta 1848:622-633. Neumann, J., N. Klein, D. E. Otzen, and D. Schneider. 2014. Folding energetics and oligomerization of polytopic alpha-helical transmembrane proteins. Arch. Biochem Biophys. 546:281-296. Neumann, J., N. Klein, and D. Schneider. 2012. Wie falten Membranproteine? — Schritt für Schritt!? Biospektrum 18:146-148. Veerappan, A., F. Cymer, N. Klein, and D. Schneider. 2011. The tetrameric alpha-helical membrane protein GlpF unfolds via a dimeric folding intermediate. Biochemistry 50:10223- 10230. Im Rahmen dieser Arbeit sind folgende Veröffentlichungen in Vorbereitung: Klein, N., J. Franz, H. Li, T. Weidner, V. Sourjik, und D. Schneider. 2015. The local anesthetic 2-phenylethanol modulates the structure and activity of transmembrane proteins by induction of ordered lipid domains.

  • i

    Inhaltsverzeichnis

    Zusammenfassung ................................................................................................... 1

    1. Einleitung ............................................................................................................ 3

    1.1 Biologische Membranen und integrale Membranproteine ........................................ 3

    1.1.1 Aufbau biologischer Membranen ..................................................................................... 3

    1.1.1.1 Lipidkomponenten biologischer Membranen ............................................................... 3

    1.1.1.2 Lipidpolymorphismus und Organisation biologischer Membranen .............................. 5

    1.1.2 Struktur von Membranproteinen ...................................................................................... 9

    1.1.2.1 Faltung von Membranproteinen ................................................................................. 10

    1.1.2.1.1 Helix-Helix-Assoziationen in Lipidmembranen .................................................... 11

    1.1.3 Einfluss der Lipidumgebung auf die Struktur, Stabilität und Aktivität von integralen

    Membranproteinen ........................................................................................................................ 12

    1.1.3.1 Lipidvermittelter Wirkmechanismus von Anästhetika ................................................ 15

    1.2 Aquaporine und Aquaglyceroporine .......................................................................15

    1.2.1 Humane Aquaporine ...................................................................................................... 16

    1.2.2 Aufbau und Struktur der Aquaporine ............................................................................. 18

    1.2.2.1 Tetramerisierung der Aquaporine in biologischen Membranen ................................ 20

    1.2.2.2 Der Aquaporin-Kanal am Beispiel des bakteriellen Aquaglyceroporins GlpF ........... 21

    1.2.2.3 Stereoselektivität des Substratflusses und Inhibition des Protonenflusses .............. 23

    1.2.3 Aquaporine in Lipidmembranen ..................................................................................... 24

    1.3 Motivation und Ziele der Arbeit ...............................................................................25

    2 Material und Methoden .................................................................................... 27

    2.1 Material ..................................................................................................................27

    2.1.1 Chemikalien ................................................................................................................... 27

    2.1.2 Enzyme .......................................................................................................................... 27

    2.1.3 Kits und Größenstandards ............................................................................................. 27

    2.1.4 Verbrauchsmaterialien ................................................................................................... 28

    2.1.5 Geräte ............................................................................................................................ 28

    2.1.6 Puffer und Kulturmedien ................................................................................................ 30

    2.1.7 Bakterienstämme ........................................................................................................... 33

    2.1.8 Antikörper ...................................................................................................................... 34

    2.1.9 Plasmide ........................................................................................................................ 34

    2.1.10 Oligonukleotide .............................................................................................................. 35

    2.1.11 Computerprogramme..................................................................................................... 35

    2.2 Methoden ...............................................................................................................36

    2.2.1 Molekularbiologische Methoden .................................................................................... 36

    2.2.1.1 Isolierung von Plasmid-DNA ...................................................................................... 36

  • ii

    2.2.1.2 Präparativer und analytischer Restriktionsverdau ..................................................... 36

    2.2.1.3 Agarosegelelektrophorese zur Analyse und Isolierung von Nukleinsäuren .............. 36

    2.2.1.4 Isolierung von DNA aus Agarosegelen...................................................................... 37

    2.2.1.5 DNA-Konzentrationsbestimmung .............................................................................. 37

    2.2.1.6 Ligation ...................................................................................................................... 37

    2.2.1.7 DNA-Amplifikation durch die Polymerase-Kettenreaktion ......................................... 37

    2.2.1.8 Klonierungsstrategien ................................................................................................ 38

    2.2.1.8.1 Ortspezifische Mutagenese ................................................................................. 38

    2.2.1.8.2 Klonierung der GlpF-Fusionskonstrukte .............................................................. 39

    2.2.1.8.3 Klonierung von pVenus-GlpF .............................................................................. 41

    2.2.1.9 DNA-Sequenzierung .................................................................................................. 41

    2.2.2 Mikrobiologische Methoden ........................................................................................... 42

    2.2.2.1 Herstellung chemisch kompetenter E. coli-Zellen ..................................................... 42

    2.2.2.2 Transformation kompetenter E. coli-Zellen ............................................................... 42

    2.2.2.3 Kultivierung von E. coli .............................................................................................. 43

    2.2.3 Biochemische Methoden ............................................................................................... 43

    2.2.3.1 SDS-PAGE (Polyacrylamid-Gelelektrophorese)-Analyse ......................................... 43

    2.2.3.2 Coomassie-Färbung .................................................................................................. 44

    2.2.3.3 Western Blot-Analyse und immunochemischer Nachweis ........................................ 44

    2.2.3.4 Bestimmung der Proteinkonzentration ...................................................................... 45

    2.2.3.5 Membranpräparation ................................................................................................. 45

    2.2.3.6 Proteinreinigung mittels immobilisierter Metallionen Affinitäts-Chromatographie ..... 46

    2.2.3.7 Präparative Gelpermeationschromatographie ........................................................... 46

    2.2.3.8 Funktionelle Rekonstitution von GlpF in Proteoliposomen ........................................ 47

    2.2.3.9 SDS-Titration zur Untersuchung der Proteinstabilität ................................................