Prozessvalidierung des Tecan Infinite Luminometers und...

Hochschule für Angewandte Wissenschaften Hamburg

Fakultät Life Sciences

Prozessvalidierung des Tecan Infinite Luminometers und Etablierung

der Messprotokolle für die IBL Steroid Saliva Lumineszenzassays

Bachelorarbeit

im Studiengang Biotechnologie

zur Erlangung des akademischen Grades Bachelor of Science

vorgelegt von

Natalie Scharnweber

Matrikelnummer 2052044

Hamburg am 16.12.2015

1. Gutachter: Prof. Dr. Jörg Andrä (HAW)

2. Gutachter: Dr. Jörg Spangenberg (IBL International)

Die Abschlussarbeit wurde betreut und erstellt in der Abteilung Qualitätskontrolle der Firma

IBL International GmbH in Hamburg.

2

Eidesstattliche Erklärung

Ich versichere hiermit, dass ich die vorliegende Bachelorarbeit ohne fremde Hilfe

selbstständig verfasst und nur die angegebenen Quellen und Hilfsmittel verwendet habe.

Wörtlich oder dem Sinn nach aus anderen Werken entnommene Stellen sind unter

Angabe der Quellen kenntlich gemacht.

Hamburg, 16.12.2015

Natalie Scharnweber

3

Danksagung

Mein Dank an dieser Stelle gilt der Firma IBL International GmbH für die

Ermöglichung dieser Bachelorarbeit.

Besonders bedanken möchte ich mich bei meinen beiden Betreuern Herrn Professor

Jörg Andrä sowie Herrn Dr. Jörg Spangenberg für ihre Unterstützung bei der Planung

und Durchführung dieser Arbeit sowie für ihre Geduld.

Mein herzlichster Dank gilt außerdem meinem Mann für seine unermüdliche

Unterstützung während des gesamten Studiums.

Inhalt

4

Inhalt

I. Abbildungsverzeichnis…………….……..…………………………...……………...7

II. Tabellenverzeichnis…………………………...………………………....…………..8

III. Abkürzungsverzeichnis…………………………………….………………………..9

1. Einleitung und Zielsetzung ......................................................................................... 10

2. Theoretische Grundlagen ............................................................................................ 12

2.1. Lumineszenz ........................................................................................................ 12

2.2. Luminometer ........................................................................................................ 13

2.3. Lumineszenzassays .............................................................................................. 15

2.4. Steroidhormone .................................................................................................... 17

2.5. Immunreaktives Trypsin ...................................................................................... 19

2.6. Prozessvalidierung ............................................................................................... 19

3. Material ....................................................................................................................... 21

3.1. Geräte ................................................................................................................... 21

3.2. Verwendete Testkits ............................................................................................. 22

3.3. Verwendete Software ........................................................................................... 23

3.4. Verbrauchsmaterialien ......................................................................................... 23

4. Methoden .................................................................................................................... 24

4.1. Validierungsplan .................................................................................................. 24

4.2. Design-Qualifizierung (DQ) ................................................................................ 24

4.3. Installations-Qualifizierung (IQ) .......................................................................... 25

4.3.1. Softwareinstallation ....................................................................................... 26

4.3.2. Gerätesensitivität ........................................................................................... 27

4.3.3. Absorbenz Genauigkeit ................................................................................. 28

4.4. Funktions(Operational)-Qualifizierung (OQ) ...................................................... 28

4.4.1. Messwertübertragung .................................................................................... 28

Inhalt

5

4.4.2. Vergleich verschiedener Algorithmen zur Konzentrationsberechnung anhand

der Magellan Software ............................................................................................ 29

4.4.2.1. MikroWin Vier-Parameter-Methode ...................................................... 31

4.4.2.2. MikroWin Lineare Regressions-Methode .............................................. 31

4.4.2.3. Magellan LogitLog Methode .................................................................. 31

4.4.2.4. Magellan Vier-Parameter Methode ........................................................ 32

4.4.2.5. Magellan Vier-Parameter-Marquardt Methode ...................................... 32

4.4.2.6. Magellan Fünf-Parameter-Marquardt Methode ...................................... 32

4.4.2.7. Magellan Cubic Spline Methode ............................................................ 33

4.4.2.8. Magellan Lineare Regression ................................................................. 33

4.4.3. Vergleich der Lumineszenz Messung ........................................................... 34

4.4.3.1. Abarbeitung der Lumineszenzteste ......................................................... 34

4.4.3.2. Lumineszensmessung mit dem Luminometer ........................................ 35

4.4.3.3. Übersprechungsverhalten (Cross-talk) ................................................... 37

4.4.3.4. Intra-Plattenpräzision .............................................................................. 38

4.4.3.5. Richtigkeitsansätze ................................................................................. 38

4.5. Leistungs(Performance)-Qualifizierung (PQ) ...................................................... 39

5. Ergebnisse ................................................................................................................... 41

5.1. Validierungsplan .................................................................................................. 41

5.2. Installations-Qualifizierung (IQ) .......................................................................... 41

5.2.1. Magellan Installationsprüfung ....................................................................... 42

5.2.2. Detektionslimit (Sensitivität) ......................................................................... 42

5.2.3. Absorbance Accuracy (Genauigkeit) ............................................................ 43

5.3. Funktions(Operational)-Qualifizierung (OQ) ...................................................... 44

5.3.1. Datenexport ................................................................................................... 44

5.3.2. Auswertealgorithmen .................................................................................... 44

5.3.3. Messung der Lumineszenz: Cross-talk Testung ............................................ 49

5.3.4. Plattenpräzisionen .......................................................................................... 53

5.3.5. Differenzierung und Konzentrationsermittlungen ......................................... 55

5.4. Leistungs(Performance)-Qualifizierung (PQ) ...................................................... 58

Inhalt

6

6. Diskussion ................................................................................................................... 62

7. Zusammenfassung ...................................................................................................... 70

8. Literaturverzeichnis .................................................................................................... 71

Inhalt

7

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Schematische Darstellung des optischen Systems des Infinite M200 PRO. ......... 14 Abbildung 2: Schematische Darstellung des kompetitiven und nicht-kompetitiven Testprinzipes.

..................................................................................................................................................... 16 Abbildung 3: Typische Standardkurven eines kompetitiven und eines Sandwich-Assay. .......... 17 Abbildung 4: Grundstruktur von Steroidhormonen. ..................................................................... 18 Abbildung 5: Pipettierschema für den Sensitivitätstest. .............................................................. 27 Abbildung 6: Pipettierschema für Cross-talk Testung. ................................................................ 37

Abbildung 7: Pipettierschema für die Lumineszenzassays, beispielhaft für den DHEA Test. .... 39 Abbildung 8: Auszug des Messergebnis- Ausdruckes, Magellan Software. ............................... 44 Abbildung 9: In Excel exportierte Messdaten. ............................................................................. 44 Abbildung 10: Auswertung des Platten-CVs am Beispiel von Estradiol, Std. A, gemessen mit dem Infinite Luminometer, 200ms Integrationszeit und automatischer Filter-abschwächung. ... 53

Inhalt

8

Tabellenverzeichnis Tabelle 1: Herstellerangaben von CentroLIA und Infinite. .......................................................... 41 Tabelle 2: Relativ-light-units (RLU) Ergebnistabelle des ATP Testes für das Infinite M200 Pro Luminometer ohne Filterabschwächung . ................................................................................... 43

Tabelle 3: Relativ-light-units (RLU) Ergebnistabelle des ATP Testes für das Infinite M200 Pro Luminometer mit automatischer Filterabschwächung. ................................................................ 43 Tabelle 4: Relativ-light-units (RLU) Ergebnistabelle des ATP Testes für das Centro LIA Luminometer mit automatischer Filterabschwächung. ................................................................ 43 Tabelle 5: Vergleichende Darstellung der Konzentrationen........................................................ 46

Tabelle 6: Zusammenfassung der Abweichungen der Standardkurvenanalysen zur Referenzmethode in %. ............................................................................................................... 48 Tabelle 7: CentroLIA Messung, 200ms. ...................................................................................... 49 Tabelle 8: Infinite Messung, 200ms, keine Filterabschwächung. ............................................... 50 Tabelle 9: Infinite Messung, 200ms, automatische Filterabschwächung. ................................... 50

Tabelle 10: Infinite Messung, 100ms, automatische Filterabschwächung. ................................. 51 Tabelle 11: Infinite Messung, 400ms, automatische Filterabschwächung. ................................. 51 Tabelle 12: Zusammenstellung der RLUs und Differenzierungen der Standardkurven der verschiedenen Messungen. ........................................................................................................ 52 Tabelle 13: Zusammenstellung der Ergebnisse der Intra-Plattenpräzision ................................ 54

Tabelle 14: Vergleich der RLU-Abweichungen zwischen den Standardkurven am Anfang und am Ende der MTP für Referenz- und Testgerät. ......................................................................... 55 Tabelle 15: Mittelwerte der Abweichungen zum Zielwert der gemessenen Konzentrationswerte für Kitkontrollen und QC-Proben, Standardkurve am Anfang. .................................................... 56 Tabelle 16: Mittelwerte der Abweichungen zum Zielwert der gemessenen Konzentrationswerte

für Kitkontrollen und QC-Proben, Standardkurve am Ende. ....................................................... 56 Tabelle 17: Korrelationsergebnisse für beide Geräte. ................................................................ 57 Tabelle 18: Abweichungen von RLU/RLUmax in Prozent zwischen den beiden Geräten. ........... 57 Tabelle 19: Mittelwerte der Gesamtabweichungen zum Mittelwert für die jeweiligen Bereiche der gemessenen Konzentrationswerte für Kitkontrollen und QC-Proben. ........................................ 59

Tabelle 20: Abweichungen von RLU/RLUmax in Prozent zwischen den beiden Geräten. ........ 60 Tabelle 21: Korrelationsergebnisse für beide Geräte ................................................................. 61 Tabelle 22: statistische Daten. .................................................................................................... 64 Tabelle 23: Sensitivitäten verschiedener Luminometer, unterschieden in flash und glow Lumineszenz. .............................................................................................................................. 68

Inhalt

9

Abkürzungsverzeichnis

µL Mikroliter

µmol Mikromol

amol Attomol

ATP Adenosintriphosphat

C Kohlenstoff

CO2 Kohlenstoffdioxid

CFTR Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance

Regulator

CV Coefficient of Variation

DHEA Dehydroepiandrostendion

DQ Design-Qualifizierung

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

ELISA Enzyme linked immunosorbent assay

FDA Food and Drug Administration

fmol Femtomol

GHTF Global Harmonization Task Force

GMP Good Manufacturing Practice

IMDRF International Medical Device Regulators Forum

IPC In-Prozess-Kontrolle

IQ Installations-Qualifizierung

IRT immunreaktives Trypsin

L Liter

LED light-emmiting diode

LIA Lumineszenzimmunoassay

mL Milliliter

ms Millisekunde

MTP Mikrotiterplatte

nm Nanometer

O2 Sauerstoff

OQ Funktions- (Operational)-Qualifizierung

PMT photomultiplier tube

PQ Performance- (Leistungs)-Performance

QC Qualitätskontrolle

RIA Radioimmunoassay

RLU relative light units

rpm rounds per minute

s Sekunde

1. Einleitung und Zielsetzung

10


Die vorliegende Bachelorarbeit stellt im Folgenden die Prozessvalidierung eines

Messgerätes für Lumineszenz vor. Diese wurde in Zusammenarbeit mit der Firma IBL

International GmbH in Hamburg durchgeführt.

Mit Hilfe eines Luminometers können Mikrotiterplatten gemessen werden, in denen ein

Chemilumineszenz-Immunoassay durchgeführt wird. Diese Arten von Immunoassays

werden genutzt, um zum Beispiel den Gehalt verschiedener Steroidhormone wie

Testosteron, Progesteron, Cortisol u.a. im Saliva zu bestimmen. Dies findet Anwendung

in der Stressbestimmung, bei Befindlichkeitsstörungen und Zyklusbeschwerden der

Frau. Eine weitere Anwendung eines Chemilumineszenz-Immunoassays ist die

Bestimmung von immunreaktivem Trypsin bei Neugeborenen im Screening Verfahren

mit Blutfilterkarten. Anhand der Konzentration des immunreaktiven Trypsins kann

frühzeitig eine Aussage darüber getroffen werden, ob die Krankheit zystische Fibrose,

auch bekannt als Mukoviszidose, vorliegt.

Die Firma IBL International GmbH entwickelt, produziert und vertreibt diverse

Immunoassays für den internationalen Medizinproduktemarkt, u. a. beinhaltet das

Portfolio der Firma 16 verschiedene Chemilumineszenz-Immunoassays.

Im Rahmen dieser Bachelorarbeit soll gezeigt werden, dass das Mikrotiterplatten-

Luminometer Infinite M200 PRO (Tecan GmbH) unter Verwendung der Magellan

Software (Tecan GmbH) für die Messung der IBL-Lumineszenz-Teste geeignet ist. Die

mit dem Infinite Luminometer ermittelten Messdaten werden mit denen des CentroLIA-

Mikrotiterplatten-Luminometers (Berthold Technologies) verglichen, das bisher als

Standardgerät bei der Firma IBL Verwendung findet. Perspektivisch soll das Infinite-

Luminometer das CentroLIA-Gerät ersetzen und für alle IBL-Lumineszenz-Teste

eingesetzt werden, da das Infinite Gerät neben dem Gebrauch als „Stand-Alone Gerät“

auch in automatisierten Systemen der Firma Tecan einsetzbar ist. Weiterhin ist das

Gerät dafür ausgelegt, auch für die Detektion von Fluoreszenz sowie zur

Absorptionsmessung eingesetzt werden zu können. Ebenso besteht die Möglichkeit, das

Gerät mit weiteren Ausstattungsmerkmalen wie Injektor Systemen oder einer

Temperaturkontrolleinrichtung zu versehen.

Im Zuge der Validierung soll zudem untersucht werden, ob Messdateien für die

Lumineszenz-Immunoassays zum Nachweis von Steroidhormonen (Cortisol,

Progesteron, Testosteron, Estradiol, Dehydroepiandrosteron) im Saliva sowie zum


11

Nachweis von neonatalem immunreaktivem Trypsin (IRT) in Vollblut erstellt werden

können. Darüber hinaus wird überprüft, ob für kritische Testparameter vergleichbare

Ergebnisse zu der Referenzauswertung mit der Software Mikrowin (Mikrotek) erzielt

werden.

2. Theoretische Grundlagen

12


2.1. Lumineszenz

Der Begriff Lumineszenz wurde zum ersten Mal im Jahre 1888 durch Eilhard

Wiedemann eingeführt. Er stammt aus dem Lateinischen und bedeutet „kaltes

Leuchten“. (1) Es handelt sich hierbei um die Aussendung von Licht.

Lumineszenz liegt vor, wenn die durch Elektronensprung entstehende Energie als

Strahlung in einer niedrigeren Frequenz abgegeben wird. Dies erfolgt, wenn die

Elektronen von dem angeregten Niveau in ein daruntergelegenes Zwischenniveau

übergehen. (3)

Da bei diesen Vorgängen keine Wärme entsteht, wird auch von kaltem Licht

gesprochen. Je nach Art der Anregung wird differenziert, ob es sich zum Beispiel um

Photolumineszenz handelt, bei welcher die Anregung durch elektromagnetische

Strahlung erfolgt, oder um die durch chemische Reaktionen ausgelöste

Chemilumineszenz.

Die verschiedenen Arten der Lumineszenz lassen sich anhand der Leuchtdauer nach

Ende der Erregung in Fluoreszenz und Phosphoreszenz unterscheiden. Bei Fluoreszenz

klingt das entstandene Licht meist in weniger als einer millionstel Sekunde ab, während

das Licht bei Phosphoreszenz ein Nachleuchten von mindestens einer tausendstel

Sekunde im Anschluss an die Erregung aufweist. (2)

Handelt es sich bei Chemilumineszenz um Vorgänge in biologischen Systemen, wird

diese Art der Lumineszenz Biolumineszenz genannt. Bekannt ist diese unter anderem

als Leuchten von Glühwürmchen. Die Aussendung von Chemilumineszenz kann durch

zwei verschiedene Reaktionen hervorgerufen werden: durch einen einfachen

Elektronentransferprozess, bei dem radikale Ionenpaare entstehen oder durch eine

Energieübertragung durch Singulett-Sauerstoff. Zu den am häufigsten verwendeten

Luminophoren bei Chemilumineszenzreaktionen gehören Derivate von Luminol,

Isoluminol oder Acridin. (4)


13

2.2. Luminometer

Der Begriff „Luminometer“ findet seit 1968 Verwendung (1).

Ein Luminometer ist ein Gerät zur Messung der Lichtausbeute. Hierbei erfolgt die

Integration der Kurve, die sich aus dem Auftragen von Lichtemission aufgrund einer

chemischen Reaktion gegen eine Zeitspanne ergibt. Luminometer beinhalten eine

Probenkammer, die je nach Beschaffenheit des Gerätes für ein Probenröhrchen, eine

Mikrotiterplatte oder ein anderes beliebiges Probengefäß geeignet ist. Weitere

Bestandteile eines Luminometers sind ein Detektor, eine Technik zur Signal-

verarbeitung sowie eine Anzeige für das Ausgangssignal. (2)

Die Messung von Licht beruht bei den meisten Detektoren auf der Überführung von

Photonen in ein elektrisches Signal. Am Gebräuchlichsten sowie am preisgünstigsten

für den Einsatz als Detektor sind Photomultiplier-Röhren (kurz PMT, photomultiplier

tube). Ein Photomultiplier enthält eine Vakuumröhre. In dieser sind eine Photokathode,

ein Elektronenvervielfacher sowie eine Anode enthalten. An der Photokathode findet

der sogenannte photoelektrische Effekt statt. Dabei handelt es sich um die

Elektronenablösung aus einem einzelnen Atom oder einem Atomverband. Die Ursache

für diesen Vorgang begründet sich in der Einwirkung von elektromagnetischer

Strahlung. Die spektrale Empfindlichkeit des Photomultipliers ist abhängig von der

Beschaffenheit der gewählten Photokathode. (3)

Lichtemissionskinetik wird unterschieden in blitzartig („flash“), bei der das Licht

innerhalb weniger Sekunden ausgesendet wird und glühend („glow“), bei der der

Lichtaustritt für eine längere Zeitspanne vorhält. (3)

Die Signalverarbeitung bei Luminometern erfolgt entweder im Photonenzählbetrieb

(„photon-counting“) oder im Strommessmodus („current-measuring“). Beim

Photonenzählbetrieb werden die einzelnen Photonen mit der Photomultiplier-Röhre

gezählt. Im Strommessmodus wird der elektrische Strom gemessen, welcher dadurch

entsteht, dass Photonen auf die Photomultiplier-Röhre treffen. (2)

Die in dieser Arbeit zum Einsatz kommende photon-counting Methode zeichnet sich

durch eine hohe Sensitivität sowie gute Langzeitstabilität aus. Die wichtigsten zu

beachtenden Faktoren bei der Wahl einer Photomultiplier-Röhre sind

Spektralempfindlichkeit, Verstärkung sowie der dynamische Bereich. Die Wahl der

Spektralempfindlichkeit ergibt sich aus dem verwendeten Chemilumineszenz-System.

Die Lichtemission von beispielsweise Acridinium Ester oder Luminol liegt bei einer


14

Wellenlänge von etwa 430 nm (blau), wohingegen Glühwürmchen ein grün-gelbes

Licht von etwa 530 nm aussenden.

Die durch das Luminometer erhaltenen Messdaten werden als „relative light units“

(RLU) dargestellt. Diese Werte sind von Gerät zu Gerät unterschiedlich. Bei Nutzung

der photon-counting Methode können auch Photonen pro Sekunde als Einheit

angegeben werden. (3)

In der vorliegenden Arbeit wird das multifunktionelle Mikrotiterplatten-Lesegerät

„Infinite M200 PRO“ von der Firma Tecan Austria GmbH als Luminometer verwendet.

Dies wird für die Messung von 96-well Mikrotiterplatten validiert. Als Referenzgerät

erfolgt der Einsatz des Luminometers „Centro LIA LB961“ des Herstellers Berthold

Technologies. Die Auswahl erfolgt aufgrund des vergleichbaren Aufbaus der Geräte.

Bei beiden Luminometern wird die Photonenzählmethode angewendet. In Abbildung 1

ist das optische System des Infinite M200 PRO schematisch dargestellt.

Abbildung 1: Schematische Darstellung des optischen Systems des Infinite M200 PRO.

(entnommen aus (4). Das von der Probe emittierte Licht wird von einem Faserbündel zur

Detektionseinheit geleitet. Hierbei durchläuft das Licht ein Filterrad. Mit Hilfe des von der

Gerätesoftware automatisch gesteuerten Z-Transportes erfolgt eine Justierung entsprechend

der gewählten Mikrotiterplattendefinition.


15

2.3. Lumineszenzassays

Unter Verwendung eines Immunoassays kann die Konzentration eines gewünschten

Analyten in einer komplexen biologischen Matrix wie zum Beispiel Serum, Plasma,

Urin oder Saliva bestimmt werden. Verbreitet sind sogenannte Radioimmunoassays

(RIA), Enzyme-linked-immunosorbent-assays (ELISA) und Lumineszenzimmuno-

assays (LIA). (5)

Die ersten Lumineszenzimmunoassays wurden in den späten 1970er Jahren entwickelt

und konnten sich als sichere Alternative zu den seit 1957 bestehenden

Radioimmunoassays etablieren. Beide Verfahren sind durch eine hohe Sensitivität

gegenüber sehr kleinen, schwer nachzuweisenden Analytkonzentrationen

charakterisiert. (6)

Bei Immuntesten wird in kompetitive und in nicht-kompetitive unterschieden. Nicht-

kompetitive werden weiterhin in direkte und indirekte unterteilt. Das Nachweisprinzip

beruht auf Antigen-Antikörper-Reaktionen, durch die eine hohe Selektivität gegenüber

dem zu bestimmenden Parameter gegeben ist.

Der kompetitive Assay beruht auf einer Konkurrenz zwischen markiertem und

unmarkiertem Antigen um eine Antigenbindungsstelle. Wenn die Konzentration der

freien Bindungsstellen, also die Konzentrationen an Antikörper und markiertem

Antigen, sowie das Flüssigkeitsvolumen konstant ist, kann die Menge an vorliegendem

unmarkiertem Antigen in der Lösung bestimmt werden. Je mehr unmarkiertes Antigen

in der Probe vorliegt, umso mehr markiertes Antigen wird von den Bindungsstellen

verdrängt. Eine hohe Konzentration an unmarkiertem Antigen führt zu einem

schwachen Markersignal. Voraussetzung für eine erfolgreiche Anwendung dieses

Prinzips ist eine Limitierung der freien Bindungsstellen.

Bei dem nicht-kompetitiven Assay, auch als Sandwich-Assay bezeichnet, ist das

Antigen von zwei Antikörpern umgeben. Ein sogenannter Fängerantikörper wird an

eine Festphase gekoppelt. Dieser dient dazu, Antigen in der Probe spezifisch zu binden.

In einem Waschschritt werden weitere, ungebundene Substanzen aus der Probe entfernt.

Der Fängerantikörper muss hierzu im Überschuss vorliegen. Als nächster Antikörper

kommt ein mit einem Marker ausgestatteter Detektionsantikörper zum Einsatz, welcher

bevorzugt monoklonal sein sollte und ebenfalls spezifisch für das Antigen ist.

Monoklonale Antikörper werden mittels einer Zelllinie produziert und zeichnen sich

durch Spezifität gegen ein einzelnes Epitop aus. Fänger- und Detektionsantikörper


16

sollten an verschiedene Epitope des Antigens binden. In Abbildung 2 sind die

Testprinzipe kompetititv und nicht-kompetitiv schematisch gezeigt.

Abbildung 2: Schematische Darstellung des kompetitiven und nicht-kompetitiven

Testprinzipes.

(modifiziert nach (7). Bei der kompetitiven Assayvariante ist ein Antikörper an die Oberfläche

einer Mikrotiterplatte immobilisiert. Das Antigen aus der Probe und enzymmarkiertes Antigen

konkurrieren um die Bindungsstellen am Antikörper. Beim Sandwich-Assay wird das Antigen

von einem an der Mikrotiterplatte haftenden Antikörper und einem markierten Fängerantikörper

umschlossen.

Bei dem Markerenzym handelt es sich um eine Peroxidase. Nach Zugabe von

Lumineszenzsubstrat wie Luminol oder Acridinium-Ester wirkt die Peroxidase als

Katalysator für die Chemilumineszenzreakion. (8, 9)

Beim direkten Assay ist der spezifische Antikörper direkt mit Enzym markiert, beim

indirekten Assay wird ein Anti-Antikörper eingesetzt, welcher gegen den spezifischen

Antikörper gerichtet ist. Hierdurch wird eine Signalverstärkung erreicht. Pro

gebundenem primären Antikörper können mehrere markierte Sekundärantikörper

binden.

Die durch die Lumineszenzmessung erhaltenen Rohdaten (RLU) werden gegen die

Konzentration einer mitgeführten Standardreihe bekannter Analytkonzentration

semilogarithmisch aufgetragen. Aus der entstehenden Kalibrierkurve können

unbekannte Konzentrationen entsprechend dem Signalwert abgelesen werden.

Abbildung 3 zeigt typische Standardkurven. (5)


17

Abbildung 3: Typische Standardkurven eines kompetitiven und eines Sandwich-Assay.

(entnommen aus (7). Die linke Kurve zeigt eine typische Standardkurve eines kompetitiven

Testes. Je höher die Antigenkonzentration ist, umso kleiner ist das erhaltene Markersignal. Auf

der rechten Seite ist die charakteristische Standardkurve eines nicht-kompetitiven Assays

gezeigt. Das Messsignal verhält sich direkt proportional zur Antigenkonzentration. Der genaue

Messbereich befindet sich jeweils im linearen Bereich der Kurve.

In der vorliegenden Arbeit erfolgt die Durchführung der Validierung eines

Luminometers. Hierbei werden Lumineszensimmunoassays zum Nachweis einiger

Steroidhormone in humanem Saliva sowie zur Bestimmung von immunreaktivem

Trypsin in Trockenblutproben von Neugeborenen betrachtet.

2.4. Steroidhormone

Im Vergleich zur bewährten Massenspektrometrie sowie unterschiedlichen

Chromatographiemethoden (Gas-, Hochdruckflüssig- und Flüssigchromatographie)

stellen Immunoassays eine kostengünstige, einfache und empfindliche

Nachweisalternative für Steroidhormone in der klinischen Diagnostik dar. Als Nachteil

der Immunoassays gilt eine mögliche Kreuzreaktivität. (10, 11)

Alle Steroidhormone stammen vom Cholesterol ab. Die Synthese dieser

Steroidhormone erfolgt in der Nebennierenrinde, in den Gonaden sowie in der Plazenta.

Die Bildung erfolgt jeweils in den Mitochondrien und dem glatten Endoplasmatischen

Retikulum. Steroidhormone sind lipophil. In Abbildung 4 ist die Grundstruktur der

Steroidhormone gezeigt. (11)


18

Abbildung 4: Grundstruktur von Steroidhormonen.

Entnommen aus (12). Das Steroidhormon-Grundgerüst besteht aus drei C6-Ringen (A–C) und

einem C5-Ring (D) sowie einer Seitenkette. Die Zahlen 1 bis 21 entsprechen der

Nummerierung der Kohlenstoffatome.

Steroidhormone sind in Plasma oder anderen Körperflüssigkeiten nicht löslich. Sie

liegen größtenteils an Transportproteinen gebunden vor. Nur ein kleiner Anteil liegt

ungebunden vor und ist biologisch aktiv. Diese freien Steroidhormone können im Saliva

nachgewiesen werden.

Steroidhormone werden in die Kategorien Mineralcorticoide, Glucocorticoide,

Androgene, Östrogene und Gestagene unterteilt. Mineralcorticoide beeinflussen den

Elektrolythaushalt des Menschen. Das am häufigsten vorkommende Steroidhormon in

der Gruppe der Mineralcorticoide ist Aldosteron. Glucocorticoide sind an der

Energieversorgung des Organismus beteiligt und regulieren unter anderem Stress.

Bekannt aus dieser Gruppe ist das Cortisol. Androgene sind die männlichen

Keimdrüsenhormone mit dem wichtigsten Vertreter Testosteron. Auch das

Dehydroepiandrostendion (DHEA) gehört zu dieser Gruppe. Bei den Östrogenen

handelt es sich um weibliche Geschlechtshormone mit Vertretern wie Estradiol und

Estron. Gestagene sind die Gelbkörperhormone wie das Progesteron. Sie werden auch

Schwangerschaftshormone genannt. (11, 13)

Der Vorteil in der Saliva-Diagnostik von Steroidhormonen liegt in der einfachen und

schmerzfreien Probennahme, die der Patient selbstständig und flexibel durchführen

kann. Für eine Gesamtdiagnostik sollten jeweils auch die Korrelationen der


19

Konzentration des zu bestimmenden Parameters in Serum oder Plasma herangezogen

werden. (13)

In der vorliegenden Arbeit wurden zu diesem Sachverhalt Teste zum Nachweis von

Cortisol, DHEA, 17beta-Estradiol, Progesteron sowie Testosteron im Saliva verwendet,

um die Validierung eines Luminometers durchzuführen.

2.5. Immunreaktives Trypsin

Die Krankheit Zystische Fibrose, besser bekannt unter dem Namen Mukoviszidose, ist

die am meisten verbreitete autosomal rezessive Erkrankung. Als Krankheitsursache gilt

eine Mutation des Gens CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance

Regulator). Immunreaktives Trypsin (IRT) ist eine von der Bauchspeicheldrüse

sezernierte Hydrolase. IRT findet als laborchemischer Marker im Rahmen von

Neonatal-Screening-Programmen Anwendung. Die Bestimmung des immunreaktiven

Trypsins erfolgt meist in Trockenblutproben und wird zur Diagnosestellung der

Krankheit Mukoviszidose verwendet. (21)

In der vorliegenden Arbeit wurde zu diesem Sachverhalt ein Lumineszenztest zum

Nachweis von IRT verwendet, um die Validierung des Luminometers durchzuführen.

2.6. Prozessvalidierung

Ein Qualitätsmanagement-System spezifiziert die Anforderungen an eine

Prozessvalidierung, bezogen auf unternehmensspezifische Anforderungen und

Umgebungsbedingungen. Die Prozessvalidierung wird sowohl gesetzlich gefordert als

auch in Normen und Empfehlungen beschrieben. (14)

Die Notwendigkeit zum Durchführen einer Prozessvalidierung liegt in der Bestätigung,

dass der Prozess konstante Ergebnisse mit den vorher spezifizierten Anforderungen

liefert. Eine Prozessvalidierung kann zum Beispiel von der amerikanischen

Gesundheitsbehörde (Food and Drug Administration, FDA) eingefordert werden, sofern

ein Produkt für den amerikanischen Markt Relevanz hat.

Ebenso ist eine Prozessvalidierung nötig, wenn die Einhaltung der

Qualitätssicherheitsstandards „Gute Herstellpraxis“ (Good Manufacturing Practice,

GMP) gefordert ist.


20

In der FDA Richtlinie 21 CFR Part 820 Section 820.3 (z)(1) wird die

Prozessvalidierung im Englischen definiert als „establishing by objective evidence that

a process consistently produces a result or product meeting its predetermined

specifications” (15). Es handelt sich bei einer Prozessvalidierung also um einen

objektiven Nachweis, dass ein Prozess beständig zu den gleichen Ergebnissen führt

bzw. ein Produkt seine vordefinierten Spezifikationen erfüllt. (16)

Die sinngemäß gleiche Definition für eine Prozessvalidierung erfolgt von der

Europäischen Kommission sowie der Global Harmonisation Task Force (GHTF).

Hierbei handelt es sich um eine bis 2012 agierenden, freiwilligen, internationalen

Vereinigung von Vertretern aus Gesundheitsbehörden und der

Medizinprodukteindustrie. Die GHTF wurde ersetzt durch das International Medical

Device Regulators Forum (IMDRF). (14)

Der Ablauf einer Prozessvalidierung gliedert sich in die nachfolgenden Abschnitte:

1) Erstellung eines Validierungsplanes

2) Durchführen einer Design-Qualifizierung (DQ)

3) Durchführen einer Installations-Qualifizierung (IQ)

4) Durchführen einer Funktions-Qualifizierung (Operational Qualification, OQ)

5) Durchführen einer Leistungs-Qualifizierung (Performance Qualification, PQ)

6) Erstellung eines Abschlussberichtes

Während der Prozessvalidierung sollten ebenso Risikobetrachtungen erfolgen. Risiken,

die bei der Durchführung der Prozessvalidierung erkannt werden, sollten weiter

beurteilt werden. (14, 17)

3. Material

21

3. Material

3.1. Geräte

Bezeichnung Gerätename Hersteller Seriennummer

Luminometer

(Testgerät) Infinite M200 PRO Tecan Austria 1502000870

Luminometer

(Referenzgerät) Centro LIA LB961

Berthold Technologies

2156

Handdispenser Multipette plus Eppendorf 2015857

Mikropipette,

Einsatzbereich

10-100µL

Rotilabo Proline Roth CT62910

Mikropipette,

Einsatzbereich

50-200µL

Rotilabo Proline Roth AS14890

Mikropipette,

Einsatzbereich,

100-1000µL

Eppendorf Research

Eppendorf 469443

Mikrotiterschüttler IKA MTS4 IKA Werke 00.215928

8-Kanal

Mikroplatten

Dispenser

(Waschkamm)

Statmatic 1 TriContinent 70893PL

Kurzzeitmesser Rotilabo Signal-

Timer Roth -

Kalibierplatte

für Infinite MultiCheck-Plus Tecan Austria 605000005

Kalibierplatte

für CentroLIA QC Test Platte

Berthold Technologies

1034

Trockenblutproben-

Stanze für 3mm

Spots

Stanzgerät Sauer-Labtech 11020404

3. Material

22

3.2. Verwendete Testkits

Testname Katalog-

nummer Hersteller

Chargen-

nummer Verfalldatum

Cortisol

Lumineszenztest RE62011

IBL International

LCO280 31.01.2016

LCO283 31.08.2016

Cortisol


IBL International

LCL122 31.08.2016

DHEA


IBL International

LDH133 31.05.2016

LDH134 31.10.2016

Estradiol

Lumineszenztest

RE62049 IBL International

LES153 28.02.2016

RE62041 LES154 31.12.2015

Estradiol

Lumineszenztest


LEL112 31.01.2017

RE62141 LEL113 31.01.2017

Progesteron


IBL International

LPR141 31.03.2016

LPR142 31.10.2016

Testosteron

Lumineszenztest


LTE171 30.04.2015

LTE175 30.06.2016

RE62039 LTE177 31.01.2017

IRT


IBL International

LIT137 30.11.2015

LIT142 31.05.2016

LIT145 31.08.2016

ATP Kit SL 144-041 Bio Thema

AB 191124 28.02.2016

3. Material

23

3.3. Verwendete Software

Bezeichnung Name Hersteller Versionsnummer

Steuerungs- und

Auswertesoftware

Magellan (Standardversion)

Tecan Austria Version 7.2

Steuerungs- und

Auswertesoftware MikroWin2000 Mikrotek Version 4.41

Tabellen-

kalkulationsprogramm Excel 2010 Microsoft 2010

3.4. Verbrauchsmaterialien

Bezeichnung Hersteller Katalognummer Chargen-

nummer

Pipettenspitzen,

2-200 µL Sarstedt 70.760.002 0005/4217001

Pipettenspitzen,

50-1250 µL Sarstedt 70.1186.100 Y23081

10 mL

Glasflaschen

mit Deckel

Nipro Glass Germany

ZVDIN58378-AR10-FL1

142254014

20 mL

Glasflaschen

mit Deckel

Müller + Müller ZVDIN5838-AR20-

FL1 81003003-121-

01

Dispenserspitzen, 2.5 mL

(Combitips advanced) Eppendorf 0030089448 E161401L

Dispenserspitzen, 5 mL

(Combitips advanced) Eppendorf 0030089456 E160864/L

Dispenserspitzen, 10 mL

(Combitips advanced) Eppendorf 0030089464 D1580200

Papierhandtücher Tork OL-1721541 -

4. Methoden

24

4. Methoden

4.1. Validierungsplan

Vor Beginn der Prozessvalidierung wird ein Plan über die durchzuführende

Prozessvalidierung erstellt. Entsprechend den Vorgaben des Qualitätsmanagement-

Systems der Firma IBL erfolgen hierzu die Identifizierung aller verwendeten Geräte und

Geräteparameter sowie erforderlicher Dokumente. Zudem erfolgen die Durchführung

einer Betrachtung von Extremwerten in Form von Prozessgrenzen und Bewertung aller

Prozessschritte sowie die Definition der Akzeptanzkriterien.

Die Erstellung des Plans und die damit verbundene Durchführung der

Prozessvalidierung erfolgt in Anlehnung an die Richtlinien zur Prozessvalidierung von

der Global Harmonization Task Force. (18)

Der Plan muss vor Beginn der Validierung durch Verantwortliche der

Produktentwicklung, Qualitätskontrolle sowie Produktion und vom

Qualitätsmanagement-Beauftragten freigegeben werden. Anhand eines spezifischen

Qualitätsmanagement-Formblattes werden alle Schritte der Prozessvalidierung

dokumentiert.

Das Infinite Luminometer wird im Vergleich zum CentroLIA Luminometer von

Berthold Technologies getestet. Das Infinite Gerät wird mit der Software Magellan von

Tecan verwendet, für das Vergleichsgerät wird die Software MikroWin der Firma

Mikrotek benutzt. Die Validierung erfolgt prospektiv bei der auch retrospektive Daten

verwendet werden und gliedert sich in die Phasen Installations-Qualifizierung (IQ),

Funktions(Operational)-Qualifizierung (OQ) sowie Leistungs(Performance)-

Qualifizierung (PQ).

4.2. Design-Qualifizierung (DQ)

Innerhalb einer Design-Qualifizierung muss überprüft werden, ob das zu validierende

Instrument für den vorgesehenen Verwendungszweck geeignet ist. (28) Für das zu

validierende Gerät ist eine Design-Qualifizierung (DQ) bereits vom Hersteller des

Infinite Luminometers durchgeführt worden, das Gerät wird serienmäßig hergestellt und

es ist laut Gebrauchsanweisung für den bestimmten Zweck vorgesehen. Somit entfällt

im Rahmen dieser Prozessvalidierung die DQ. (5)

4. Methoden

25

4.3. Installations-Qualifizierung (IQ)

Während der Installations-Qualifizierung soll überprüft werden, ob das Gerät den

Herstellerangaben entsprechend funktioniert. Es soll in dieser Phase sichergestellt

werden, dass zum einen alle zugehörigen Komponenten richtig eingerichtet wurden,

sowie dass entsprechende Software richtig installiert wurde. (16, 19)

Außerdem wird unter Betrachtung der Qualitäskontrollempfehlungen aus dem

Betriebshandbuch überprüft, ob geforderte Spezifikationen erfüllt werden. Im Falle der

vorliegenden Validierung handelt es sich hierbei um die Überprüfung der

Gerätesensitivität sowie um Testung der Absorbenz Genauigkeit. (4)

Für die zu vergleichenden Geräte Infinite als Testgerät und CentroLIA als

Referenzgerät werden ähnliche Lager- und Betriebsbedingungen von den jeweiligen

Herstellern angegeben (siehe Tabelle 1: Herstellerangaben). Es bestehen keine

besonderen Raum- und Umgebungsanforderungen. Beide Geräte werden elektrisch mit

Energie versorgt CentroLIA: 220-230V, 50Hz; Infinite: 100-120/220-240V, 50-60Hz

Zu dem InfiniteGerät des Herstellers Tecan gibt es eine Konformitätserklärung, welche

die Übereinstimmung mit folgenden Richtlinien, Normen und Sicherheitsanforderungen

ausweist:

- 2006/95/EG

- 2004/108/EG

- 2006/42/EG

- EN 61010-1:2001

- EN 61010-2-081:2002/A1:2003

- EN 61326-1:2006

- EN ISO 12100:2010

Das Infinite Gerät ist im Labor direkt neben dem CentroLIA Gerät aufgebaut und zur

Steuerung und Auswertung an die Magellan-Software angeschlossen. Das Gerät wird

serienmäßig für die Messung von Lumineszenz-Testen im 96 Well-Format angeboten.

Es wird somit zur Messung der IBL-Lumineszenzassays als geeignet eingestuft. (4)

Die Software Magellan ist ebenso serienmäßig für das Gerät und u.a. für die Erstellung

von Messdateien bzw. zur Auswertung von Absorptions/Lumineszenz-basierten Testen

einsetzbar. (20) Eine Erstellung der entsprechenden Dateien und die Durchführung von

4. Methoden

26

Berechnungen zur Ermittlung von Konzentrationen ist daher mit der Software

durchführbar.

Das Gerät ist serienmäßig mit einem integrierten Filtersystem ausgestattet, um

vorkommende zu hohe Lichtintensität abzuschwächen. Dies findet ggf. Anwendung bei

Assays mit hoher Lichtausbeute. Der Einfluss der Filterfunktion wird im Rahmen eines

„worst-case-Szenarios“ mit Testen hoher Lichtausbeute (Cortisol) und niedriger

Ausbeute (Progesteron oder Estradiol) untersucht und im Rahmen der Überprüfungen

der Lumineszenzmessungen bewertet. (4)

Nach Herstellerangaben werden die Gerätespezifikationen jedes einzelnen Infinite 200

Pro-Readers im Zuge der Produktion bei Tecan Austria überprüft (=100% Kontrolle)

und nur Instrumente, welche die Spezifikationen erfüllen werden ausgeliefert.

Für die Software Magellan wird eine IQ zur Installationsüberprüfung durchgeführt. Das

Infinite Luminometer wird zur Überprüfung der Absorbance Accuracy mit einer vom

Hersteller Tecan zu beziehenden MultiCheck Platte für das Gerät getestet. Die

Sensitivität wird laut Herstellerangaben unter Verwendung des BioThema ATP Kits

überprüft.

4.3.1. Softwareinstallation

Während der Installations-Qualifizierungsphase wird überprüft, ob die Installation der

Magellan Software erfolgreich war. Hierzu wird ein zur Software gehörendes

Installationsprüfprogramm verwendet. Das Programm führt automatisch Testungen zur

Überprüfung des Status aller aktuellen Komponenten durch und gibt diesen

anschließend in Form eines Reports aus. Es wird empfohlen, diese Überprüfung nach

jeder Neuinstallation durchzuführen. (20) Nach Anwählen der Datei

„MagellanIQ.exe“ wird automatisch eine Prüfung der Installation durchgeführt und

anschließend ein Installation Qualifikations- Report generiert.

4. Methoden

27

4.3.2. Gerätesensitivität

Um auch geringe Analytkonzentrationen nachweisen zu können sollte ein Luminometer

eine möglichst geringe Sensitivität/ Detektionslimit aufweisen. Um die Sensitivität des

Infinite Luminometers zu bestimmen wird der ATP Kit SL (BioThema Ab) verwendet.

Die Durchführung erfolgt entsprechend den Vorgaben der Infinite Betriebsanleitung

sowie der Gebrauchsanweisung für den ATP Kit SL.

In Abbildung 5 ist das Pipettierschema, analog zur Mikrotiterplatte, für die Testung

dargestellt.

Abbildung 5: Pipettierschema für den Sensitivitätstest.

Dargestellt ist die Pipettieraufteilung des ATP Tests. Die Abbildung stellt schematisch eine

Mikrotiterplatte dar. In den mit Bx gekennzeichneten wells ist kein Inhalt enthalten. Den mit ATP

1/500 bezeichneten wells wurde der ATP Standard in einer 1:500 Verdünnung mit der

Endkonzentration = 2·10-8 mol ATP zugegeben. Die mit B bezeichneten wells enthalten einen

Mix aus ATP Reagenz und Tris-EDTA Puffer im Verhältnis 1:5.

Zur Bestimmung des Detektionslimit wird eine ATP-Standardflasche mit Diluent C

gelöst. Der Standard mit der Konzentration von 10µmol/L wird 1:100 in Tris-EDTA-

Puffer vorverdünnt indem 10µL ATP-Standard mit 9990 µL Tris-EDTA Puffer in einer

Glasflasche gemischt werden. Der vorverdünnte Standard wird direkt innerhalb der

Vertiefungen der zu verwendenden weißen Greiner 96-well Mikrotiterplatte nochmals

1:5 verdünnt indem 40µL des vorverdünnten Standards mit 160µL ATP-Reagenz

vermischt werden. Diese Mischung ist im Schema mit ATP 1/500 bezeichnet. Die

Vertiefungen mit der Beschriftung Bx (leer) enthalten nichts, in den Wells mit der

Bezeichnung B wurden jeweils 200µL einer 1:5 Verdünnung von ATP Reagenz mit

Tris-EDTA Puffer gegeben. 3mL ATP Reagenz wurden hierfür mit 12mL Tris-EDTA

Puffer in einer Glasflasche vermischt.

Die Lumineszenzmessung wird mit dem Infinite mit einer Integrationszeit von 1s

einmal mit und einmal ohne aktivierte automatische Filterabschwächung durchgeführt.

Zum Vergleich wird die Mikrotiterplatte auch im CentroLIA Luminometer mit einer

Integrationszeit von 1 s gemessen. Das verwendete CentroLIA Gerät ist standardmäßig

mit einem Abschwächungsfilter versehen, welcher bei jeder Messung aktiv ist. Die

Lumineszenzmessung erfolgte zum Vergleich nacheinander von einer einzigen

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

A Bx (leer) ATP 1/500 Bx (leer) B B B B B B B

B Bx (leer) ATP 1/500 Bx (leer) B B B B B B B

C Bx (leer) ATP 1/500 Bx (leer) B B B B B B B

D Bx (leer) ATP 1/500 Bx (leer) B B B B B B B

4. Methoden

28

Mikrotiterplatte. Die Messdaten beider Geräte wurden ausgedruckt und zur weiteren

Verarbeitung in Excel exportiert. (4, 21)

4.3.3. Absorbenz Genauigkeit

Zur Überprüfung der Genauigkeit der Absorbenz des Infinite Luminometers wird nach

dem vom Hersteller vorgeschriebenen Testverfahren vorgegangen. Es handelt sich

hierbei um die Testung mit einer Kalibrierplatte (MultiCheck-Plus Platte) und

dazugehöriger Testsoftware.

Nach Installation der Überprüfungssoftware muss zunächst der sogenannte Normfile der

Platte geladen werden, dies geschieht unter File/update/Normfile. Hierzu ist dann die

Datei mit der Endung .xml auszuwählen. Der Test kann dann durch Drücken der „Play“

Taste gestartet werden. Das Programm fordert den Anwender auf, die MultiCheck Platte

in das Gerät zu setzten und die auf der Platte installierten LEDs durch Drücken eines

Knopfes zu aktivieren. Nach Aktivierung leuchten die LEDs permanent für die Dauer

von 5 Minuten. Die MultiCheck Platte ist mit einer Batterie versehen. Diese wird bei

der jährlich durchzuführenden Kalibrierung der Platte durch den Hersteller getauscht,

die enthaltene Kapazität reicht aus, um mindestens einmal wöchentlich eine Testung

durchzuführen. Nach Abschluss der Testung kann ein Report ausgedruckt werden.

Dieser enthält die Ergebnisse der Überprüfung mit Bewertung. (22)

4.4. Funktions(Operational)-Qualifizierung (OQ)

Die Funktionsqualifizierung dient der Überprüfung, ob das Messgerät den gewünschten

Anforderungen entspricht. In dieser Phase werden kritische Punkte überprüft und eine

Risikobewertung durchgeführt. (17)

4.4.1. Messwertübertragung

Um die Funktion des Datenexport von der Magellan Software in eine Excel-

Tabellenkalkulationsdatei zu verifizieren wird eine Messung eines IBL-

Lumineszenztestes (96 Messwerte) mit dem Infinite Gerät und der Magellan-Software

durchgeführt. Die Daten werden mit der Datenexportfunktion der Software Magellan in

Excel kopiert. Es wird ein Vergleich der Daten durchgeführt. Hierbei wird eine

Messung mit dem Infinite Gerät und der Magellan Software durchgeführt und das

Ergebnis ausgedruckt. Die Datenexportfunktion wird genutzt, die erhaltenen Messdaten

werden in ein leeres Excel-Tabellenblatt exportiert und dieses Blatt wird ausgedruckt.

Bei beiden Ausdrucken werden die Daten durch vergleichende Betrachtung hinsichtlich

4. Methoden

29

einer exakten Übereinstimmung geprüft. Der entsprechende Messwert auf dem

Ausdruck der Magellan Software muss mit dem in Excel exportierten Wert

übereinstimmen, Abweichungen sind nicht zulässig.

4.4.2. Vergleich verschiedener Algorithmen zur Konzentrationsberechnung anhand der Magellan Software

Innerhalb der Validierung sollen für die nachfolgend aufgeführten Teste Messdateien

unter Verwendung der Software Magellan erstellt werden. Die Ergebnisse hieraus

werden hinsichtlich kritischer Testparameter zu der Referenzauswertung mit MikroWin

verglichen. Die in dieser Arbeit verwendeten Lumineszenzassays, wie nachfolgend

aufgelistet, sind mit Luminol- oder Acridin-basierten Substraten ausgestattet.

1.) RE62011/ RE62111_Cortisol Lumineszensassay

2.) RE62021_Progesteron Lumineszensassay

3.) RE62031_Testosteron Lumineszensassay

4.) RE62041/RE62141_Estradiol Lumineszensassay

5.) RE62051_DHEA Lumineszensassay

6.) RE68015-19_IRT neonatal Lumineszensassay

Da das Infinite Luminometer durch die Magellan-Software und das CentroLIA durch

die MikroWin-Software gesteuert wird, muss eine vergleichende Auswertung der

Messergebnisse durchgeführt werden, um einen möglichen Einfluss durch Unterschiede

in der Konzentrationsberechnung berücksichtigen zu können. Hier wird unter

Einbeziehung von retrospektiven Daten zunächst ein Vergleich, bezogen auf

Auswertealgorithmen zwischen der Referenzsoftware von Mikrowin sowie der

Software Magellan, durchgeführt.

Die anschließend durchzuführende prospektive Validierung im Rahmen der

Lumineszenzmessung, siehe unter Punkt 4.4.3., erfolgt mit Hilfe der Neuerstellung von

testspezifischen Messdateien. Hierzu wird der Einfluss auf die Ergebnisfindung

untersucht und bewertet. Außerdem wird durch die Neuerstellung von testspezifischen

Messdateien mittels Magellan überprüft, ob diese Software für die Anforderungen der

Messaufnahme und Messauswertung für diese spezifischen Teste geeignet ist.

4. Methoden

30

Es werden zunächst die spezifischen, den Vorgaben der Mikrowin Software sowie der

testspezifischen Arbeitsanleitung entsprechenden Parameterdateien, mittels Magellan

Software erstellt und überprüft. Die Programmierung der Messdateien mit Magellan

erfolgt unter Berücksichtigung der maßgebenden Kriterien die auch bei der

Referenzauswertung mit MikroWin Anwendung finden.

Hierbei werden die Messdaten aus der Freigabe Messung der Qualitätskontrolle für die

jeweils gültige Testcharge verwendet. Es wird je ein Lauf für die sechs zu

betrachtenden Teste verwendet. Die mit MikroWin generierten Messdaten werden in

Magellan kopiert und mit Hilfe der neu erstellten Methoden unter vergleichender

Anwendung verschiedener Auswertealgorithmen betrachtet. Die zu untersuchenden

Auswertemodalitäten richten sich dabei nach den jeweiligen Vorgaben in den

testspezifischen Arbeitsanweisungen.

Die Konzentrationsberechnung, bei den in dieser Arbeit behandelten Immunoassays,

erfolgt anhand einer Kalibrierkurve. Eine Anzahl an bekannten Analytkonzentrationen

der Standards wird herangezogen um einen Funktionsgraphen zu erstellen. Hierbei

werden die bekannten Konzentrationen gegen die Signalintensität, im vorliegenden Fall

gegen die relative light units (RLU) als Einheit für die Lumineszenzintensität,

aufgetragen. Die Wahl des sogenannten Curve-Fittings, der zur Kurvenerstellung

zugrundeliegenden Formel, hat Einfluss auf die Ergebnisgenauigkeit. (23)

Für die Steroidassays kommen die nachfolgend aufgelisteten Varianten zum Einsatz:

- Vier-Parameter-Methode

- Vier-Parameter-Methode Marquardt

- Fünf-Parameter-Methode

- Fünf-Parameter-Methode Marquardt

- LogitLog

- Cubic Spline

Für den IRT-Assay wird an Stelle der LogitLog-Methode die Methode Lineare

Regression betrachtet.

Es wird für jeden Kurvenanalysentyp die Abweichung der erhaltenen Konzentrationen

zu den Referenzwerten aus der MikroWin Auswertung verglichen.

4. Methoden

31

4.4.2.1. MikroWin Vier-Parameter-Methode

Bei der MikroWin Vier-Parameter-Methode erfolgt eine sigmoidale Kurvenlegung, die

optimal an die vorgegebenen Stützstellen angepasst ist. Die zugrundeliegende

mathematische Gleichung (1.) lautet:

� = � + ��

�� (1.)

mit:

a = erhaltener Wert bei minimaler Konzentration

b = Steigung im Wendepunkt

c = Wendepunkt, analog zur mittleren Konzentration

d = erhaltener Wert bei maximaler Konzentration

(23, 24)

4.4.2.2. MikroWin Lineare Regressions-Methode

Bei der linearen Regressions-Methode unter Nutzung der Referenzsoftware MikroWin

wird der analytische Zusammenhang zwischen den Messwerten und der Konzentration

anhand der folgenden Geradengleichung (2.) ermittelt.

� = �� + � ∙ � (2.)

mit:

a0 = y-Achsenabschnitt

a1 = Steigung

(24)

4.4.2.3. Magellan LogitLog Methode

Bei der LogitLog Berechnung mit der Software Magellan wird eine sigmoidale Kurve

unter Nutzung von mindestens vier Basispunkten erzeugt. Auf der Asymptote wird ein

Minimum und Maximum Limit erreicht. Die LogitLog Methode kann nur dann

angewendet werden, wenn die Standarddaten in Relation zur Konzentration einem

sigmoiden Prozess entsprechen. Außerdem muss die erstellte Kurve in Bezug zum 50%

4. Methoden

32

Abschnitt symmetrisch sein. Zur richtigen Kurvenberechnung sollten ein

Konzentrationswert von null sowie ein maximal hoher Wert an

Standardkonzentrationen vorliegen. Sofern diese Werte nicht vorhanden sind, werden

diese von der Software Magellan entsprechend dem niedrigsten und höchsten

vorliegenden Wert generiert. Die mathematische Formel entspricht der Gleichung (1.).

Hierbei werden die vier Stützstellen a bis d zunächst einer Logit-Transformation

unterzogen. Anschließend erfolgt die Kurvenapproximation. (20, 24)

4.4.2.4. Magellan Vier-Parameter Methode

Die Methodenberechnung Vier-Parameter mittels der Software Magellan basiert auf der

Nelder und Mead Downhill-Simplex Methode. Es gelten die gleichen Voraussetzungen

wie bei der LogitLog Methode. Bei der Vier Parameter Berechnung wird eine

sigmoidale Kurve erzeugt. Für die Berechnung werden mindestens vier Basispunkte

benötigt. Die annähernde Funktion wird durch die Gleichung (1.) beschrieben. Zunächst

wird eine LogitLog Annährerung berechnet, dann werden die Parameter A, B, C und D

mittels des Downhill-Simplex Algorithmus optimiert. Die Berechnung endet

erfolgreich, wenn eine Genauigkeit von 0.001 erreicht wurde oder schlägt fehl, wenn

die maximale Anzahl von 10000 Iterationen erreicht wurde ohne dass die geforderte

Genauigkeit erreicht wurde. (20)

4.4.2.5. Magellan Vier-Parameter-Marquardt Methode

Die Magellan Methode Vier-Parameter- Marquardt benötigt die gleichen Voraussetzung

wie auch die LogitLog Methode. Die erzeugte Kurve wird mittels der Levenberg-

Marquardt Methode erzeugt, die mathematische Formel entspricht Gleichung (1.).

Hierbei erfolgt eine genauere Annäherung, die Prozessierung nimmt mehr Zeit in

Anspruch. Analog zur Vier Parameter Berechnung wird eine sigmoidale Kurve erzeugt

und zunächst eine LogitLog Annäherung durchgeführt. Der Algorithmus wird entweder

bis zu einer Genauigkeit von 10-7 durchgeführt oder abgebrochen, sofern 30000

Iterationen nicht das gewünschte Ergebnis liefern. (20)

4.4.2.6. Magellan Fünf-Parameter-Marquardt Methode

Die Magellan Fünf-Parameter-Marquardt Methode benötigt die gleichen Anforderungen

wie die LogitLog Methode, die sigmoidale Kurve kann nicht-symmetrisch sein. Die zu

erzeugende Kurve wird anhand des Levenberg-Marquardt Algorithmus erstellt.

Mindestens fünf Basis Punkte werden benötigt. Der Algorithmus wird entweder bis zu

4. Methoden

33

einer Genauigkeit von 10-7 durchgeführt oder abgebrochen, sofern 30000 Iterationen

nicht das gewünschte Ergebnis liefern. Die entsprechende mathematische Formel wird

mit Gleichung (3.) angegeben.

� = � + ��

�� (3.)

mit

a bis d: siehe Gleichung (1.)

e: Asymmetrie Faktor

(20)

4.4.2.7. Magellan Cubic Spline Methode

Die für die mit Magellan anwendbare Cubic Spline Berechnung geht auf die Formel (4.)

zurück.

� = � + �� + �� + �� (4.)

Hiermit werden die kubischen Polynome beschrieben, welche die Stützstellen

verbinden. Die Parameterermittlung erfolgt anhand der sogenannten Not-a-Knot

Bedingung. Es werden mindestens drei Basispunkte für diese Berechnung benötigt.

(20, 25)

4.4.2.8. Magellan Lineare Regression

Die mittels der Magellan Software durchgeführte Berechnung mittels Linearer

Regression beruht auf der Summenberechnung der quadratischen Abweichungen der

Stützpunkte. Hierbei sind mindestens zwei Stützpunkte erforderlich. Die annähernde

Funktion wird durch Gleichung Nummer (5.) beschrieben.

� = � ∙ � + � (5.)

Die Parameter A und B werden bestimmt durch Minimieren der Fehlerfunktion (6.).

��, �! = ∑ �#��$! − �$!�&$' (6.)

(20)

4. Methoden

34

4.4.3. Vergleich der Lumineszenz Messung

Für das CentroLIA ist eine Filtervorrichtung im Gerät installiert, welche immer

Anwendung findet. Für das Infinite Luminometer muss im Messprotokoll in der

Magellan Software für jedes Protokoll festgelegt werden, welche Filteroption verwendet

werden soll.

Um die Funktionalität der Lumineszenz Messung zu belegen, wurden Untersuchungen

durchgeführt. Bei den Untersuchungen handelt es sich um Messungen von

Lumineszenzimmunoassays mit dem Referenzluminometer CentroLIA sowie mit dem

Testluminometer Infinite. Zunächst wird die Durchführung der

Lumineszenzimmunoassays beschrieben, diese erfolgt entsprechend der jeweiligen

Arbeitsanleitung für den Test. Im Zuge der Lumineszensmessung wird zunächst das

Übersprechungsverhalten während der Lumineszenzmessung betrachtet, hierzu wird der

Test Estradiol verwendet. Danach werden verschiedene Präzisionstestungen mit den

Testen Cortisol und Estradiol durchgeführt. Anschließend werden die Teste Cortisol,

DHEA, Estradiol, IRT, Progesteron und Testosteron unter Verwendung der enthaltenen

Standardreihe, den Kitkontrollen sowie einem jeweiligen Set Qualitätskontrollproben

durchgeführt. Bei den verwendeten Lumineszenztesten handelt es sich um Glow-

Lumineszenzteste. Bei allen Testungen wird bezüglich der Pipettierung des

Lumineszenzreagenz wie folgt verfahren:

Das Lumineszenzreagenz wird zeilenweise mäanderförmig aufgegeben, da dies der

Messrichtung des Infinite Luminometers entspricht. Die Messrichtung beim CentroLIA

wird soweit wie möglich angeglichen, die CentroLIA Messung erfolgt Zeile für Zeile.

4.4.3.1. Abarbeitung der Lumineszenzteste

Die verwendeten Assays werden entsprechend der jeweiligen Arbeitsanleitung

durchgeführt. Vor Gebrauch werden jeweils alle benötigten Komponenten auf

Raumtemperatur gebracht sowie durchmischt.

Für die Teste DHEA, Estradiol, Progesteron und Testosteron liegt jeweils das gleiche

Abarbeitungsschema vor. Es werden pro entsprechender Kavität der Mikrotiterplatte

50µL (20µL bei Progesteron) der Standards, Kitkontrollen sowie

Qualitätskontrollproben pipettiert. Mit Assaypuffer im Verhältnis 1:101 verdünntes

Enzymkonjugat wird im Volumen von 50µL pro well hinzugegeben, ebenso wie 50µL

gebrauchsfertiges Antiserum je well. Die Mikrotiterplatte wird mit einer Folie

zugeklebt. Auf einem Orbitalschüttler erfolgt eine vierstündige Inkubation bei ca. 500

4. Methoden

35

rpm und Raumtemperatur. Anschließend wird jedes well viermal mit einem zuvor mit

destilliertem Wasser im Verhältnis 1:10 verdünnten Waschpuffer unter Verwendung

eines Mehrkanal-Mikroplatten Dispensers gewaschen und die enthaltene Flüssigkeit

jeweils verworfen. Nach dem Waschen wird die Mikrotiterplatte auf Filterpapier

ausgeklopft. Jedem well werden 50µL (100µL bei DHEA) gebrauchsfertige

Chemilumineszenzreagenzlösung zugegeben. Eine zehnminütige Inkubation wird beim

Zugeben des Substrates in das erste well gestartet. Die Pipettierrichtung entspricht der

Messrichtung des zu beurteilenden Luminometers, zeilenweise mäanderförmig. Nach

Ablauf der zehn Minuten erfolgt die Lumineszenzmessung.

Beim Cortisol werden 50µL (RE62011) bzw. 20µL (RE62111) Standard, Kitkontrolle

und Qualitätskontrollprobe zu jedem well gegeben. Anschließend erfolgt die Zugabe

von 100µL gebrauchsfertigem Enzymkonjugat je well. Nach einer dreistündigen

Inkubation bei Raumtemperatur erfolgen vier Waschzyklen. Pro well werden 50µL

einer im Verhältnis 1:2 gemischten Lösung aus zwei Chemilumineszenzreagentien

pipettiert und wie bei den anderen Testen nach zehnminütiger Inkubation gemessen.

Für den IRT Test werden je Kavität ein entsprechender Trockenblutspot (Durchmesser

3mm) von Standards, Kitkontrollen und Qualitätskontrollproben mit einer Stanze in

jedes well gegeben. Zu jedem well werden 150µL von mit Assaypuffer im Verhältnis

1:321 verdünntes Enzymkonjugat gegeben. Die Mikrotiterplatte wird mit schwarzer

Folie beklebt. Der Test wird für zwei Stunden bei Raumtemperatur auf einem Schüttler

bei ca. 500 rpm inkubiert. Die Mikrotiterplatte wird nach Ablauf der Inkubation mit

einem Mehrkanal-Mikroplatten Dispensers und Verwendung eines zuvor mit

destilliertem Wasser im Verhältnis 1:10 verdünnten Waschpuffer gewaschen. Die

Flüssigkeit wird entsprechend verworfen. Dieser Waschzyklus wird insgesamt fünfmal

durchgeführt. Anschließend wird die Mikrotiterplatte auf Filterpapier trockengeklopft.

Zu jedem well werden 50µL gebrauchsfertiges Chemilumineszenzreagenz

hinzugegeben. Die Platte wird mit einer schwarzen Folie abgedeckt und inkubiert für 45

Minuten bei Raumtemperatur auf einem Schüttler bei ca. 500 rpm. Nach diesem Schritt

erfolgt die Lumineszenzmessung.

4.4.3.2. Lumineszensmessung mit dem Luminometer

Die beiden zu vergleichenden Luminometer werden mindestens 15 Minuten vor Start

der Messung eingeschaltet, dies ist notwendig, damit alle Gerätekomponenten auf

Betriebstemperatur sind. (4)

4. Methoden

36

Für das Referenzgerät CentroLIA wird nach dem im Labor etablierten Verfahren

vorgegangen. Hierbei wird das Gerät mit der Software MikroWin2000 gesteuert und die

Daten ausgewertet. Für die Lumineszenzteste bestehen standardisierte Messprotokolle,

auch Parameterfiles genannt. Es werden bei allen Messungen die voreingestellten

Definitionen für die geometrische Beschaffenheit der Platte verwendet, diese muss

einmalig je Plattentyp konfiguriert werden. Die Lumineszenzmessung erfolgt Spalte für

Spalte jeweils von oben nach unten. Für alle Steroidassays beträgt die Integrationszeit

pro well 200 Millisekunden. Bevor die Messung startet, ist eine Messverzögerung von

30 Sekunden eingestellt. Hierbei inkubiert die zu messende Platte im Dunkeln. Dies soll

dazu dienen, mögliche Störeffekte, auf welche das CentroLIA Luminometer

empfindlich reagiert, zu minimieren. Dies wird nur speziell für das Referenzgerät

durchgeführt. Bei den Konzentrationsermittlungen wird jeweils die Curve-Fitting

Methode Vier Parameter verwendet. Für den IRT Test erfolgt die Lumineszenzmessung

ohne Messverzögerung bei einer Integrierzeit von 100 Millisekunden pro well. Eine

Kurvenberechnung erfolgt anhand der Vier Parameter Methode.

Bei den Messungen wird im Allgemeinen so vorgegangen, dass für die jeweilige

Mikrotiterplatte (96 well Format) eines Lumineszensassays nacheinander auf beiden

Luminometern die Lumineszenzmessung durchgeführt wird. Die beiden Geräte stehen

direkt nebeneinander, sodass die gleichen Umgebungsbedingungen bestehen und

zeitliche Verzögerungen der Messung vernachlässigbar sind. Innerhalb eines

Zeitfensters von maximal zehn Minuten wurde eine Testmikrotiterplatte auf beiden

Messgeräten vermessen. In den Herstellerangaben des verwendeten

Chemilumineszenssubstrates wird eine verlängerte Haltbarkeit des Signals angegeben.

Es ist davon auszugehen, dass das jeweilige Lumineszenszsignal für die Zeitspanne von

bis zu zehn Minuten stabil ist. (26)

Für alle durchgeführten Testungen wurde in der OQ-Phase immer zuerst auf dem

CentroLIA Gerät gemessen und anschließend auf dem Infinite.

Das Testgerät Infinite M200 Pro wird mit der Software Magellan gesteuert und die

Datenauswertung vorgenommen. Die Erstellung der Messprotokolle erfolgt zum einen

in Anlehnung an die etablierten Versionen der Referenzmethode, zum anderen an die

spezifischen Vorgaben der Bedienungsanleitungen für das Infinite Luminometer sowie

für die Magellan Software. Ebenfalls werden gewonnene Erkenntnisse aus den

4. Methoden

37

vorhergehenden Arbeitsschritten aus der Sensitivitätstestung für die Messdurchführung

herangezogen. Die erhaltenen Resultate aus dem Vergleich der Auswertealgorithmen

werden für die Curvefitting Parameter berücksichtigt. Bei der Magellan Software ist

eine einmalige Definition jedes Plattentyps notwendig.

4.4.3.3. Übersprechungsverhalten (Cross-talk)

Bei der Anwendung von Mikrotiterplatten mit Glow-Lumineszenztesten und Messung

im Luminometer kann ein sogenanntes Übersprechungsverhalten (Cross-talk) auftreten.

Hierbei kann durch die Nähe benachbarter wells Licht zwischen den Kavitäten

übertreten und das Ergebnis verfälschen. Die Verwendung von weißen Mikrotiterplatten

minimiert diesen Effekt. (3)

Die Cross-talk Testung soll zeigen, dass zwischen benachbarten wells der

Mikrotiterplatte keine Strahlungsbeeinflussung der RLUs gegenseitig erfolgt. Hierzu

wurde eine Austestung mit dem Estradiol Test durchgeführt, der anhand des in

Abbildung 6 gezeigten Pipettierschemas durchgeführt wurde.

Abbildung 6: Pipettierschema für Cross-talk Testung.

In der Abbildung ist schematisch eine Mikrotiterplatte dargestellt. Eine Standardreihe wurde in

Vierfachbestimmung pipettiert. Die gelb umrahmten Kitkontrollen stellen dar, dass in der Mitte

jeweils Kitkontrollen pipettiert werden und diese von Standard A, welcher ein hohes RLU-

Messsignal liefert, sowie von Standard G, welcher ein niedriges RLU-Messsingnal liefert,

umgeben sind.

Die Lumineszenz-Messung der Mikrotiterplatte erfolgte in der Reihenfolge wie

nachfolgend aufgelistet:

1) Infinite Luminometer, 200ms, keine automatische Filterabschwächung

2) CentroLIA Luminometer, Standardprotokoll

3) Infinite Luminometer, 200ms, automatische Filterabschwächung



1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A Standard G_2

B

C Standard A_2

D

E

F

G

H

Standard E_1

Standard A_1 Kitkontrolle 1_2Standard A_3

Standard B_1 Kitkontrolle 2_2 Kitkontrolle 1_4

Standard C_1

Standard D_1 Kitkontrolle 1_3 Kitkontrolle 2_4

Standard F_1 Kitkontrolle 2_3 Standard D_2 Kit-

kontrolle

2_5

Standard G_1 Standard E_2

Kitkontrolle 2_1 Kitkontrolle 1_1 Standard A_4 Standard F_2

4. Methoden

38

Dabei sollen die ermittelten Konzentrationen der gelb umrahmten Kit-Kontrollen

darüber Aufschluss geben, wie stark sie sich verändern, wenn sie von Standard A und

von Standard G umgeben sind. Die MTP wird pipettiert und in beiden Luminometern,

welche im selben Raum nebeneinander unter gleichen Bedingungen stehen, direkt

nacheinander in einem Zeitfenster von 1-5 Minuten gemessen. Die eventuell möglichen

Einflussfaktoren wie Temperatur, Luftfeuchte können bei der Betrachtung

vernachlässigt werden, da sie keine Auswirkung auf die Vergleichbarkeit der

Luminometer haben. Bei der Magellan Software wird die Lumineszenzmessung mit

einer Integrationszeit von 200 Millisekunden und einer automatischen

Filterabschwächung. Die Konzentrationsberechnung erfolgt unter Verwendung der Vier

Parameter Marquardt Methode.

4.4.3.4. Intra-Plattenpräzision

Zum Vergleich der Intra-Plattenpräzisionen werden jeweils die Standards A (hoher

RLU-Messbereich) und G (niedriger RLU-Messbereich) der Cortisol (50 µL

Probenvolumen) und Estradiolassays (20 und 50 µL Probenvolumen) eingesetzt. Diese

werden in 96-fach Bestimmung auf der ganzen Platte verteilt und die entsprechenden

statistischen Parameter wie Mittelwert, Standardabweichung, Standardfehler,

Variationskoeffizient ermittelt. Diese werden anschließend zwischen den Geräten

verglichen.

Die Messung der Intra-Plattenpräzision erfolgt jeweils zuerst mit dem Infinite Gerät

unter Anwendung von automatischer Filterabschwächung und einer Integrationszeit von

200ms. Danach erfolgt die Messung mit dem CentroLIA nach dem Standardprotokoll

sowie anschließend erneut mit dem Infinite Gerät bei 200ms Integrationszeit ohne

automatische Filterabschwächung.

4.4.3.5. Richtigkeitsansätze

Die Lumineszenzassays für die Bestimmung von Cortisol, DHEA, Estradiol,

Progesteron, Testosteron sowie immunreaktiven Trypsin werden auf beiden Geräten

gemessen. Die jeweiligen Läufe werden durchgeführt und ausgewertet. Bei jedem Lauf

werden die RLU´s absolut und bezogen auf den Nullstandard gegenüber gestellt. Es

werden die absoluten Abweichungen für die RLU´s und die B/Bmax-Werte

ausgerechnet. Es werden für jede Spalte Mittelwerte gebildet. Die Messung der

Lumineszenz darf nur in den RLU´s, nicht aber in der prozentualen Differenzierung

4. Methoden

39

bezogen auf den Nullstandard (B/Bmax) abweichen.

Das Pipettierschema gestaltete sich bei jedem Ansatz folgendermaßen und ist in

Abbildung 7 beispielhaft gezeigt: Zu Beginn eine Standardreihe und Kitkontrollen in

Doppelbestimmung, Qualitätskontrollproben in Doppelbestimmung, Auffüllen der

restlichen freien wells mit Kitkontrollen und Standards und am Ende eine weitere

Standardkurve.

Abbildung 7: Pipettierschema für die Lumineszenzassays, beispielhaft für den DHEA Test. In der Abbildung ist schematisch eine Mikrotiterplatte gezeigt. Es wird jeweils am Anfang und

am Ende eine Standardreihe pipettiert. Zusätzlich werden Kitkontrollen und die für den

jeweiligen Assay verfügbaren Qualitätskontrollproben pipettiert.

Beide Standardkurven wurden hinsichtlich RLUs und Differenzierung betrachtet sowie

die Konzentration der Proben anhand beider Standardkurven berechnet. Die

Lumineszenzmessung erfolgt zunächst mit dem Infinite Luminometer bei Anwendung

von automatischer Filterabschwächung und einer Integrationszeit von 200 ms. Die

Konzentrationsberechung wird mittels der Curvefit Analyse Vier Parameter nach

Marquardt durchgeführt. Anschließend wird die entsprechende Mikrotiterplatte im

CentroLIA Luminometer unter Verwendung der Standardmethode vermessen. Es

werden die absoluten Konzentrationsabweichungen und Abweichungen pro Platte

berechnet, die sich aus den Standards am Anfang und am Ende ergeben. Die Ergebnisse

werden dann für das Referenz- und Testgerät miteinander verglichen.

4.5. Leistungs(Performance)-Qualifizierung (PQ)

Während der Leistungsqualifizierung soll gezeigt werden, dass das Luminometer unter

normalen Nutzungsbedingungen gleichbleibend unter Erfüllung der vorgegebenen

Spezifikationen zur Lumineszenzmessung genutzt werden kann. Die bisher erhaltenen

Ergebnisse müssen reproduzierbar sein. (27)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12A Std. A Std. A K2_2 K2_2 SV6 SV6 K1_3 K1_3 K1_3 K1_3 Std. A Std. AB Std. B Std. B K1_1 K1_1 SV7 SV7 K2_3 K2_3 K2_3 K2_3 Std. B Std. BC Std. C Std. C K1_2 K1_2 SV8 SV8 K1_4 K1_4 K1_4 K1_4 Std. C Std. CD Std. D Std. D SV1 SV1 SV9 SV9 K2_4 K2_4 K2_4 K2_4 Std. D Std. D

E Std. E Std. E SV2 SV2 SV10 SV10 K1 K1 K2 K2 Std. E Std. EF Std. F Std. F SV3 SV3 K1 K1 C C C C Std. F Std. FG Std. G Std. G SV4 SV4 K2 K2 E E E E Std. G Std. GH K2_1 K2_1 SV5 SV5 K1 K1 C C C C K2 K2

4. Methoden

40

Die Leistungsqualifizierung erfolgt durch laufende Routine Ansätze in der

Qualitätskontrollabteilung. Hierbei handelt es sich um Freigabeansätze für

Chargenendkontrollen oder Stabilitätsüberprüfungen. Bei den Ansätzen werden

Kitkontrollen und Qualitätskontrollproben mitgeführt und die erhaltenen Ergebnisse der

Messung auf beiden Luminometern verglichen. Hierbei erfolgt die Messreihenfolge wie

in der OQ-Phase.

5. Ergebnisse

41

5. Ergebnisse

5.1. Validierungsplan

Der Validierungsplan wurde wie in Punkt 4.1. beschrieben durchgeführt.

Die nachfolgend aufgelisteten Kriterien wurden festgelegt:

Für den Vergleich der Auswertealgortihmen werden die maximal zulässigen

Differenzen der Konzentrationsermittlungen auf < 5% für den Durchschnitt festgelegt.

Die Variationskoeffizienten werden festgelegt auf < 6%, die Abweichungen zwischen

den Geräten auf < 6%.

Bei den Richtigkeitsansätzen sollen die B/Bmax-Werte als entscheidendes Kriterium

angesehen werden, es wurde festgelegt, dass diese im Mittel pro Assay und pro Lauf

nicht mehr als 5% voneinander abweichen dürfen.

Die mittels Excel durchzuführende Korrelationen soll in den folgenden Bereichen

liegen:

0.8< m< 1.2 m = Steigung

r > 0.9 r = Korrelationskoeffizient

Die Festlegung dieser Kriterien erfolgte unter Heranbeziehung der

Qualitätskontrollkriterien der IBL sowie in Anlehnung an (28) sowie (29).

5.2. Installations-Qualifizierung (IQ)

Folgende Angaben der Hersteller für Geräteparameter unterscheiden sich bzw. sind

vergleichbar:

Tabelle 1: Herstellerangaben von CentroLIA und Infinite.

Die folgenden Angaben sind den Gerätehandbüchern entnommen. CentroLIA LB961 (Berthold

Technologies GmbH) Infinite M200 PRO (Tecan Austria GmbH)

Betriebstemperaturbereich 15-35°C 15-30°C Feuchtigkeitsbereich 10-85% < 80% Detektor Photomultiplikator, photon

counting technology Photomultiplikator, photon counting technology

Messzeit 0.1-200s 0.1-20s Übersprechung (Crosstalk) < 10-6 < 0.01 % (schwarze Platte) Dynamischer Bereich > 6 Dekaden > 6 Dekaden Software Eigene Software,

MikroWin i-control, Magellan

Betriebssystem notwendig MS Windows95, MS EXCEL MS Windows XP, MS EXCEL Anschluss RS232 USB

5. Ergebnisse

42

Das CentroLIA-Gerät wird im Rahmen monatlicher Wartungen unter Verwendung einer

Lumineszenz-Testplatte LB 9515 (Berthold Technologies) regelmäßig im monatlichen

Intervall zur Überprüfung der Funktionsfähigkeit analysiert. Während des

Validierungszeitraumes durchlief das CentroLIA erfolgreich alle Überprüfungszyklen.

5.2.1. Magellan Installationsprüfung

Die Überprüfung der Magellan Installation wurde wie im dazugehörigen Handbuch

beschrieben durchgeführt. Hierbei ist der Status bei allen durchgeführten Testen als

gelungen gekennzeichnet.

5.2.2. Detektionslimit (Sensitivität)

Mit Hilfe des ATP Kit SL (Biothema Ab) soll die Sensitivität/das Detektionslimit des

Gerätes ermittelt werden. Die Berechnung des Detektionslimits erfolgt anhand von

Formel 7.

(7.) Mit:

2*10-8 = Konzentration ATP Std., mol/L

StdevB = Standardabweichung von blank

mean RLU ATP = RLU Mittelwert ATP Standard

mean RLU B = RLU Mittelwert blank wells

0.0002 = Umwandlung in mol/well

1/1e-15 = Umwandlung in fmol/well

Die nachfolgenden Tabellen 2-4 zeigen die erhaltenen Messergebnisse und die daraus

berechnete Sensitivität (Detektionslimit).

(�)�*)+,-./+0+), #0,/1�// = 2 ∙ 10�5 ∙ 3 ∙ 7)��89

0��-:;< − 0��-9 ∙ 0.0002 ∙ 1

1��>

5. Ergebnisse

43

Die Ergebnisse sind jeweils im Mikrotiterplattenlayout entsprechend dem Pipettierschema

(siehe Abbildung 5) angegeben. Auf der rechten Seite der Tabelle sind die unter Heranziehung

der Formel (6.) berechneten Werte für die Sensitivität (Det.Limit) in fmol pro well angegeben.

Stddev B entspricht der Standardabweichung von blank, mean RLU, ATP gibt den RLU

Mittelwert für den ATP Standard an und mean RLU, B gibt den RLU Mittelwert für die blank

wells an.

Tabelle 2: Relativ-light-units (RLU) Ergebnistabelle des ATP Testes für das Infinite M200 Pro Luminometer ohne Filterabschwächung .

Tabelle 3: Relativ-light-units (RLU) Ergebnistabelle des ATP Testes für das Infinite M200 Pro Luminometer mit automatischer Filterabschwächung.

Tabelle 4: Relativ-light-units (RLU) Ergebnistabelle des ATP Testes für das Centro LIA Luminometer mit automatischer Filterabschwächung.

Es zeigt sich bei der Sensitivitätstestung, dass bei der automatischen Abschwächung mit

Filter beim Infinite Gerät die beste Untergrenze (0.31 fmol/well) für das Detektionslimit

im Vergleich zum CentroLIA (0.47 fmol/well) und zum Infinite ohne automatische

Filterabschwächung erzielt wird (0.76 fmol/well).

5.2.3. Absorbance Accuracy (Genauigkeit)

Zur Überprüfung der Absorbance Accuracy des Infinite Luminometers wird die von

Tecan angebotene MultiCheck Platte verwendet. Die Testung des Luminometers wird

mit Verwendung der MultiCheck Software nach Anleitung durchgeführt. Hierbei

wurden alle Spezifikationen erfüllt.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

A 259 360060 274 166 163 161 137 145 139 144 Stdev B: 22.92

B 213 361190 197 136 131 123 138 129 128 118 mean RLU, ATP: 362770

C 221 363350 180 125 111 98 98 92 102 100 mean RLU, B: 121

D 142 366480 127 116 91 96 91 110 109 92 Det. Limit, fmol/well: 0.76

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

A 98 346090 98 48 51 42 62 39 40 49 Stdev B: 8.89

B 90 342420 71 50 31 53 49 36 46 59 mean RLU, ATP: 345705

C 87 343670 87 63 33 35 36 42 33 47 mean RLU, B: 45


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

A 58 427747 99 50 66 58 58 58 58 83 Stdev B: 16.52

B 91 423244 66 41 33 58 33 33 66 58 mean RLU, ATP: 424731

C 99 419557 107 74 50 25 41 41 50 58 mean RLU, B: 51


5. Ergebnisse

44

9.4564E+05 3.4333E+05 3.3046E+06 6.7547E+051.0580E+06 3.9536E+06 3.2775E+06 2.6568E+057.3649E+06 3.9283E+06 2.1247E+06 2.7858E+057.2739E+06 4.3081E+06 2.1839E+066.1177E+06 4.2892E+06 2.0336E+066.1110E+06 5.6706E+06 1.9539E+065.4321E+06 5.6281E+06 1.2433E+065.6102E+06 4.5952E+06 1.2415E+063.6556E+06 5.1917E+06 6.9190E+053.6968E+06 6.2280E+06 6.7535E+051.6885E+06 6.1861E+06 3.7446E+051.6929E+06 5.6346E+06 3.7440E+059.1307E+05 5.5848E+06 1.0596E+068.7378E+05 3.9888E+06 1.0617E+063.4042E+05 4.5260E+06 1.0978E+063.3681E+05 3.4109E+06 1.1107E+061.0577E+06 3.4022E+06 4.0287E+061.0502E+06 1.5384E+06 3.9322E+067.2313E+06 1.5142E+06 4.0954E+067.2665E+06 2.7989E+06 3.9319E+066.2585E+06 2.8357E+06 7.8159E+066.2085E+06 7.0919E+05 7.5818E+065.4774E+06 7.0559E+05 5.9367E+065.4773E+06 5.6826E+06 6.0142E+063.6245E+06 5.6562E+06 5.2166E+063.7178E+06 4.9065E+06 5.2360E+061.6511E+06 4.9542E+06 3.2288E+061.7060E+06 4.0830E+06 3.3378E+068.8612E+05 4.0174E+06 1.3327E+068.6701E+05 3.7373E+06 1.3924E+063.3225E+05 3.8654E+06 6.3173E+05

Abbildung 8: Auszug des Messergebnis-

Ausdruckes, Magellan Software.

Abbildung 9: In Excel exportierte Messdaten.

5.3. Funktions(Operational)-Qualifizierung (OQ)

5.3.1. Datenexport

Zur Überprüfung der Datenexportfunktion der Software Magellan wurde beispielhaft

ein Testansatz Cortisol Saliva RE62111, Charge LCL121, verwendet. Der Test wurde

durchgeführt und mit dem Infinite Luminometer und Verwendung der Magellan

Software gemessen. Anschließend wurden die Daten mit Hilfe der Export Funktion in

Excel exportiert. Jeder Wert aus Excel wurde mit dem Ausdruck der Magellan-

Auswertung verglichen. Es wurden keine Abweichungen festgestellt. Nachfolgend sind

in Abbildung 8 und 9 ein Auszug des Magellan-Ausdruckes sowie die Excel Werte

gezeigt.

5. Ergebnisse

45

5.3.2. Auswertealgorithmen

Zur Überprüfung der Ergebniskalkulation der Konzentration von Magellan unter

Verwendung verschiedener Standardkurvenanalysen wurden jeweils retrospektiv Daten

der folgenden Testansätze der QC-Abteilung verwendet:

- Cortisol LUM (RE62011): Freigabe-Lauf der Charge LCO282

- Progesteron LUM (RE62021): Freigabe-Lauf der Charge LPR141

- Testosteron LUM (RE62039): Freigabe-Lauf der Charge LTE176

- Estradiol LUM (RE62041): Freigabe-Lauf der Charge LES154

- DHEA LUM (RE62051): Freigabe-Lauf der Charge LDH133

- IRT LUM (RE68019): Freigabe-Lauf der Charge LIT141

Die mit MikroWin und dem CentroLIA gemessenen Daten wurden in die Magellan

Auswertemaske hineinkopiert und mit den in Punkt 4.4.2. aufgelisteten

Berechnungstypen ausgewertet.

Die Magellan Software verfügt über folgende Fehleroptionen:

Wenn ein Wert der berechneten Konzentration außerhalb der

Standardkurvenkonzentration liegt, wird entweder >Max oder <Min ausgegeben. Sofern

eine Berechnung dennoch gewünscht ist, kann optional die Funktion Extrapolation

gewählt werden. Wenn für die Berechnung der Konzentration eines Wertes mehrere

Lösungen existieren, wird MultPt ausgegeben.

Es wurde als Referenz jeweils die etablierte Methode der Auswertung verwendet, die

auch bei allen Routine Messungen wie In Prozess-Kontrollen oder Freigabeansätzen

zum Einsatz kommt. Für Magellan wurden die Methoden getestet, die theoretisch zum

Einsatz kommen könnten um die bestmögliche zu finden.

In der nachfolgenden Tabelle 5 sind die erhaltenen Konzentrationsergebnisse der

verschiedenen Teste und Standardkurventypen für Kontrollen und QC-Proben im

Vergleich zur bisherigen Standardmethode mit MikroWin angegeben.

5. Ergebnisse

46

Tabelle 5: Vergleichende Darstellung der Konzentrationen.

Für die Parameter Cortisol, Progesteron, Testosteron, Estradiol, DHEA und IRT wurde

retrospektiv eine Auswertung mit der Software Magellan unter Anwendung verschiedener

Algorithmen zur Konzentrationsberechnung durchgeführt. Die hieraus erhaltene Konzentration

für ein repräsentatives Probenset, bestehend aus Kitkontrollen und Qualitätskontrollproben,

wird mit der mittels Referenzalgorithmus determinierten Konzentration verglichen. Als

Referenzalgorithmus wurde jeweils die MikroWin 4-Parameter Methode benutzt sowie

zusätzlich als Referenzalgorithmus 2 bei dem Parameter IRT die MikroWin Lineare Regression

Methode. Zwischen der jeweiligen Magellan- und Referenzkonzentration wird unter Benutzung

der Formel (8.):

��1�+�ℎ@-A = �B$CDEF$&GE&HI&JD�J$E&B�KILL�&GE&HI&JD�J$E& � − 1 (8.)

die Abweichung zwischen beiden Konzentrationswerten in Prozent angegeben.

Cortisol Konzentration, µg dL-1

:

Proben-bezeichnung

Referenz-algorithmus

4 Parameter

Methode

Abweichung zur Referenz-methode, %

4 Parameter

Methode

(Marquardt)


5 Parameter

Methode

(Marquardt)


Cubic Spline


LogitLog


K2 1.218 1.562 -22.0 1.233 -1.2 1.183 3.0 MultPt x 1.252 -2.7K1 0.178 0.170 5.0 0.178 -0.2 0.181 -1.7 0.191 -6.9 0.159 12.0

QCSV1 0.117 0.112 4.3 0.116 0.5 0.118 -1.2 0.121 -3.7 0.107 8.9QCSV2 0.163 0.155 5.1 0.163 0.1 0.165 -1.5 0.173 -6.0 0.146 11.6QCSV3 0.123 0.119 3.5 0.124 -0.5 0.126 -2.2 0.129 -4.9 0.113 8.4QCSV4 0.034 0.034 -1.4 0.033 1.5 0.033 2.7 0.032 7.2 0.035 -2.9QCSV5 0.075 0.073 3.0 0.074 1.4 0.075 0.2 0.075 -0.6 0.071 5.2QCSV6 0.219 0.211 4.0 0.222 -1.4 0.224 -2.4 0.238 -8.0 0.195 12.4QCSV7 0.345 0.337 2.5 0.352 -2.0 0.351 -1.8 0.355 -2.8 0.303 13.7QCSV8 1.158 1.463 -20.8 1.182 -2.0 1.134 2.1 MultPt x 1.180 -1.9QCSV9 0.732 0.789 -7.2 0.751 -2.5 0.728 0.6 MultPt x 0.672 9.0QCSV10 2.330 > Max x 2.280 2.2 2.263 3.0 3.967 -41.3 > Max x

Progesteron Konzentration, pg mL-1

:

Proben-bezeichnung


4 Parameter

Methode


4 Parameter

Methode

(Marquardt)


5 Parameter

Methode

(Marquardt)


Cubic Spline


LogitLog


K2 218.66 222.90 -1.9 220.72 -0.9 219.27 -0.3 MultPt x 218.47 0.1K1 50.18 49.83 0.7 50.27 -0.2 50.44 -0.5 50.74 -1.1 46.32 8.3

QCSV1 21.15 20.69 2.2 20.89 1.2 20.88 1.3 21.31 -0.8 20.40 3.7QCSV2 24.35 23.90 1.9 24.14 0.9 24.16 0.8 25.53 -4.6 23.29 4.5QCSV3 45.36 45.01 0.8 45.43 -0.2 45.58 -0.5 46.59 -2.6 42.06 7.9QCSV5 63.20 62.90 0.5 63.38 -0.3 63.57 -0.6 62.18 1.6 57.94 9.1QCSV6 101.62 102.11 -0.5 102.44 -0.8 102.50 -0.9 101.41 0.2 93.60 8.6QCSV7 119.77 120.67 -0.7 120.81 -0.9 120.71 -0.8 119.83 -0.1 111.11 7.8QCSV8 209.33 213.39 -1.9 211.52 -1.0 210.21 -0.4 MultPt x 207.55 0.9QCSV9 556.37 579.50 -4.0 554.40 0.4 550.12 1.1 979.85 -43.2 926.50 -39.9QCSV1 14.81 14.67 0.9 14.80 0.1 14.74 0.4 13.84 7.0 14.91 -0.6QCSV2 17.41 17.03 2.3 17.18 1.3 17.15 1.5 16.59 4.9 17.07 2.0QCSV3 64.85 64.72 0.2 65.20 -0.5 65.39 -0.8 63.81 1.6 59.56 8.9QCSV4 97.97 98.42 -0.5 98.78 -0.8 98.86 -0.9 97.53 0.5 90.17 8.7QCSV5 341.01 351.25 -2.9 343.35 -0.7 340.04 0.3 950.65 -64.1 392.43 -13.1QCSV6 618.49 648.43 -4.6 616.50 0.3 612.83 0.9 984.66 -37.2 > Max x

5. Ergebnisse

47

Testosteron Konzentration, pg mL-1

:

Proben-bezeichnung


4 Parameter

Methode


4 Parameter

Methode

(Marquardt)


5 Parameter

Methode

(Marquardt)


Cubic Spline


LogitLog


K2 172.81 178.09 -3.0 177.02 -2.4 174.19 -0.8 MultPt x 157.16 10.0K1 23.69 22.77 4.0 23.68 0.0 23.92 -0.9 25.25 -6.2 21.55 9.9

QCSV1 3.88 4.15 -6.5 3.68 5.3 3.60 7.8 3.97 -2.3 4.73 -18.0QCSV2 9.86 9.87 -0.1 9.59 2.8 9.60 2.7 8.72 13.1 10.17 -3.1QCSV3 17.51 16.97 3.2 17.29 1.3 17.43 0.5 17.25 1.5 16.52 6.0QCSV4 44.62 42.13 5.9 45.10 -1.1 45.41 -1.7 49.76 -10.3 37.91 17.7QCSV5 65.71 62.43 5.3 67.07 -2.0 67.17 -2.2 70.58 -6.9 54.89 19.7QCSV6 106.42 103.52 2.8 109.14 -2.5 108.32 -1.8 MultPt x 89.76 18.6QCSV7 216.41 232.95 -7.1 220.81 -2.0 216.72 -0.1 MultPt x 211.53 2.3QCSV8 199.27 210.81 -5.5 203.70 -2.2 200.08 -0.4 MultPt x 189.02 5.4QCSV9 374.28 486.45 -23.1 375.63 -0.4 369.52 1.3 744.03 -49.7 547.23 -31.6QCSV10 420.85 580.72 -27.5 419.27 0.4 413.64 1.7 747.79 -43.7 727.08 -42.1QCMS1 13.49 13.29 1.5 13.26 1.7 13.34 1.1 12.26 10.0 13.26 1.7QCMS2 54.69 51.96 5.3 55.82 -2.0 56.06 -2.4 60.33 -9.3 46.14 18.5QCMS3 120.17 118.03 1.8 123.18 -2.4 121.98 -1.5 MultPt x 102.39 17.4

11 36.75 34.83 5.5 37.05 -0.8 37.37 -1.6 41.11 -10.6 31.79 15.612 146.30 146.92 -0.4 149.90 -2.4 147.90 -1.1 MultPt x 128.18 14.113 227.69 248.26 -8.3 232.22 -2.0 227.83 -0.1 MultPt x 227.58 0.0

Estradiol Konzentration, pg mL-1

:

Proben-bezeichnung


4 Parameter

Methode


4 Parameter

Methode

(Marquardt)


5 Parameter

Methode

(Marquardt)


Cubic Spline


LogitLog


K2 13.09 13.75 -4.8 13.59 -3.7 13.45 -2.7 x 13.64 -4.1K1 2.19 2.07 5.8 2.11 4.0 2.11 3.6 x 1.91 14.6

QCSV1 0.72 0.72 0.1 0.70 2.1 0.69 3.8 x 0.71 1.8QCSV2 0.99 0.92 7.1 0.92 7.9 0.91 9.1 x 0.89 11.3QCSV3 3.23 3.09 4.5 3.16 2.1 3.18 1.5 x 2.83 14.0QCSV4 2.10 1.97 6.6 2.00 4.9 2.01 4.6 x 1.82 15.3QCSV5 5.41 5.31 1.9 5.44 -0.5 5.46 -1.0 x 4.89 10.6QCSV6 8.26 8.28 -0.3 8.40 -1.7 8.40 -1.6 x 7.79 6.0QCSV7 20.23 22.28 -9.2 21.01 -3.7 20.61 -1.9 x 24.55 -17.6QCSV8 17.58 19.05 -7.7 18.30 -3.9 17.99 -2.3 x 20.12 -12.6QCSV9 36.54 44.42 -17.7 36.93 -1.0 36.22 0.9 x > Max xQCSV10 55.03 > Max x 52.97 3.9 52.93 4.0 x > Max xQCSV11 0.47 0.47 0.7 0.44 5.7 0.43 8.5 x 0.48 -2.9QCNSV1 1.22 1.14 7.0 1.14 7.0 1.13 7.7 x 1.08 12.9QCNSV2 0.97 0.92 4.9 0.92 5.7 0.91 6.9 x 0.89 9.0QCNSV3 1.66 1.57 5.8 1.59 4.6 1.59 4.7 x 1.46 13.5QCNSV4 1.32 1.24 6.9 1.24 6.5 1.23 7.0 x 1.17 13.3QCNSV5 1.18 1.14 3.5 1.14 3.5 1.13 4.1 x 1.08 9.2

kei

ne A

usw

ert

ung

mög

lich

DHEA Konzentration, pg mL-1

:

Proben-bezeichnung


4 Parameter

Methode


4 Parameter

Methode

(Marquardt)


5 Parameter

Methode

(Marquardt)


Cubic Spline


LogitLog


K2 407.48 342.31 19.0 405.05 0.6 405.04 0.6 594.75 -31.5 335.59 21.4K1 72.97 66.29 10.1 72.71 0.4 72.72 0.4 82.08 -11.1 62.61 16.5

QCSV1 3.82 5.63 -32.2 3.88 -1.6 3.88 -1.5 6.84 -44.2 6.25 -38.9QCSV2 33.53 33.75 -0.7 33.45 0.2 33.45 0.2 27.13 23.6 32.87 2.0QCSV3 63.69 58.92 8.1 63.63 0.1 63.64 0.1 73.60 -13.5 55.88 14.0QCSV4 116.82 101.57 15.0 116.76 0.1 116.77 0.0 113.78 2.7 95.03 22.9QCSV5 117.73 101.57 15.9 116.76 0.8 116.77 0.8 113.78 3.5 95.03 23.9QCSV6 364.48 303.58 20.1 361.20 0.9 361.19 0.9 515.64 -29.3 294.16 23.9QCSV7 474.14 403.94 17.4 472.71 0.3 472.69 0.3 680.69 -30.3 403.90 17.4QCSV8 816.38 756.42 7.9 815.87 0.1 815.77 0.1 908.34 -10.1 857.77 -4.8QCSV9 779.52 712.00 9.5 776.26 0.4 776.17 0.4 890.42 -12.5 794.11 -1.8QCSV10 1381.17 1510.30 -8.5 1374.40 0.5 1374.20 0.5 1076.30 28.3 2314.40 -40.3QCSV11 15.04 17.26 -12.8 15.09 -0.3 15.09 -0.3 14.18 6.1 17.54 -14.3QCSV12 80.66 72.51 11.2 80.42 0.3 80.43 0.3 88.49 -8.8 68.30 18.1QCSV13 272.35 226.80 20.1 271.20 0.4 271.20 0.4 223.59 21.8 215.30 26.5

IRT Konzentration, ng mL-1

:

Proben-bezeichnung

Referenz-algorithmus 1)

4 Parameter

Methode


4 Parameter

Methode

(Marquardt)


5 Parameter

Methode

(Marquardt)


Cubic Spline


Referenz-algorithmus 2)

Regression


K2 237.35 222.37 6.7 238.19 -0.4 238.13 -0.3 257.26 -7.7 240.29 239.63 0.3K1 97.83 110.62 -11.6 96.732 1.1 96.736 1.1 84.04 16.4 97.43 97.43 0.0

QCVB1 26.78 45.62 -41.3 25.902 3.4 25.901 3.4 30.62 -12.5 25.30 25.36 -0.2QCVB2 34.71 53.78 -35.5 33.511 3.6 33.515 3.6 36.09 -3.8 33.22 33.16 0.2QCVB4 55.17 73.53 -25.0 53.787 2.6 53.796 2.6 49.71 11.0 53.88 53.86 0.0QCVB5 78.91 94.59 -16.6 77.574 1.7 77.582 1.7 66.24 19.1 78.06 78.03 0.0QCVB6 103.69 115.45 -10.2 102.63 1.0 102.63 1.0 92.22 12.4 103.43 103.39 0.0QCVB7 120.97 129.54 -6.6 120.13 0.7 120.12 0.7 131.93 -8.3 121.16 121.06 0.1QCVB8 157.21 158.64 -0.9 157.04 0.1 157.02 0.1 185.41 -15.2 158.34 158.23 0.1QCVB9 178.68 175.73 1.7 178.93 -0.1 178.9 -0.1 207.70 -14.0 180.35 180.23 0.1

QCVB10 208.26 199.24 4.5 208.97 -0.3 208.92 -0.3 234.15 -11.1 210.62 210.37 0.1QCVB11 205.20 196.69 4.3 205.73 -0.3 205.68 -0.2 231.45 -11.3 207.49 207.11 0.2QCVB12 253.21 235.42 7.6 254.44 -0.5 254.38 -0.5 269.38 -6.0 256.13 255.89 0.1

291 28.80 47.71 -39.6 27.802 3.6 27.803 3.6 32.02 -10.1 27.31 27.31 0.0292 57.12 75.30 -24.1 55.703 2.5 55.712 2.5 50.98 12.0 55.87 55.81 0.1293 115.58 125.16 -7.7 114.65 0.8 114.64 0.8 118.39 -2.4 115.62 115.53 0.1294 152.44 154.84 -1.5 152.19 0.2 152.17 0.2 179.94 -15.3 153.45 153.36 0.1

5. Ergebnisse

48

Tabelle 6: Zusammenfassung der Abweichungen der Standardkurvenanalysen zur

Referenzmethode in %.

Die Tabelle fasst die ermittelten Abweichungen für die einzelnen Tests und Algorithmen

summarisch zusammen.

Dabei zeigt sich, dass die geringsten Abweichungen für die Steroidhormonassays zur

Referenzmethodik MikroWin mit den Algorithmen Varianten Vier-Parameter-

Marquardt und Fünf-Parameter-Marquardt der Magellan Software erhalten werden. Für

IRT wird zusätzlich mit der Regression die beste Übereinstimmung erzielt.

Bei den Varianten Vier-Parameter-Marquardt, Fünf-Parameter-Marquardt sowie

zusätzlich Regression bei IRT liegen die Differenzen der Konzentrationsermittlungen

im Durchschnitt unter den geforderten 5% und die kritischen Kurvenabschnitte der

Standardkurven weisen keine besonderen Auffälligkeiten auf.

4 Parameter Methode

4 Parameter Methode

(Marquardt)

5 Parameter Methode

(Marquardt) Cubic Spline Logit Log Regression

Cortisol -22 bis 5 -3 bis 2 -2 bis 3 -41 bis 7 -3 bis 14 - Progesteron -5 bis 2 -1 bis 1 -1 bis 2 -64 bis 7 -39 bis 9 - Testosteron -28 bis 6 -2 bis 5 -2 bis 8 -50 bis 13 -42 bis 20 -

Estradiol -18 bis 7 -4 bis 8 -3 bis 9 - -18 bis 15 - DHEA -32 bis 20 -2 bis 1 -2 bis 1 -44 bis 28 -40 bis 24 -

IRT -41 bis 8 -1 bis 5 -1 bis 4 -15 bis 19 - -0.2 bis 0.3

5. Ergebnisse

49

5.3.3. Messung der Lumineszenz: Cross-talk Testung

Die gemessenen RLUs sowie die anhand der am Plattenanfang in Vierfachbestimmung

mitgeführten Standardkurve ausgewerteten Konzentrationen werden im Anhang

aufgeführt. In den nachfolgenden Tabellen 7-12 werden die Ergebnisse der Cross-talk

Testung gezeigt.

Angegeben werden die Mittelwerte der RLU (MV RLU) und Konzentrationen in pg/mL (MV

pg/mL) sowie der RLU Variationskoeffizient (RLU CV) in Prozent und die Differenzierung

(B/B0,%), in Bezug auf Standard A_1 in Prozent angegeben. Für alle Messungen mit dem

Infinite wird eine Abweichung der RLU (RLU dev., %) und Konzentration (conc. dev.,%) zu dem

CentroLIA in Prozent angegeben.

Tabelle 7: CentroLIA Messung, 200ms.

MV RLU MV pg/mL RLU CV, % B/B0, %

Standard A_1 908266 0.01 3 100

Standard B_1 748815 1.22 2 82

Standard C_1 660435 2.12 1 73

Standard D_1 562912 3.36 3 62

Standard E_1 346269 8.20 3 38

Standard F_1 193278 17.40 1 21

Standard G_1 65049 57.80 2 7

Kitkontrolle2_1 246480 12.97 1 27

Kitkontrolle1_1 610409 2.72 0 67

Kitkontrolle1_2 660308 2.12 1 73

Kitkontrolle2_2 271282 11.53 10 30

Standard A_2 876757 0.18 5 97

Kitkontrolle1_3 635631 2.41 0 70

Kitkontrolle2_3 247752 12.88 1 27

Standard A_3 907168 0.22 1 100

Standard A_4 863982 0.22 4 95

Standard G_2 64315 58.84 7 7

Kitkontrolle1_4 640800 2.35 0 71

Kitkontrolle2_4 240292 13.38 1 26

Standard D_2 539302 3.72 5 59

Standard E_2 336192 8.55 3 37

Standard F_2 179449 18.97 2 20

Kitkontrolle2_5 243563 13.16 1 27

5. Ergebnisse

50

Tabelle 8: Infinite Messung, 200ms, keine Filterabschwächung.

Tabelle 9: Infinite Messung, 200ms, automatische Filterabschwächung.

MV RLU MV pg/mL RLU CV, % B/B0, % RLU dev., % conc. dev., %

Standard A_1 329410 0.06 2 100 -64 >

Standard B_1 295243 1.13 1 90 -61 -7

Standard C_1 263955 2.17 1 80 -60 3

Standard D_1 225928 3.56 2 69 -60 6

Standard E_1 142733 8.21 3 43 -59 0

Standard F_1 79350 16.97 1 24 -59 -2

Standard G_1 28490 56.52 4 9 -56 -2

Kitkontrolle2_1 98779 13.17 0 30 -60 2

Kitkontrolle1_1 241330 2.97 0 73 -60 9

Kitkontrolle1_2 249605 2.67 0 76 -62 26

Kitkontrolle2_2 113650 11.17 10 35 -58 -3

Standard A_2 353968 0.01 4 107 -60 >

Kitkontrolle1_3 258815 2.34 0 79 -59 -3

Kitkontrolle2_3 102660 12.58 2 31 -59 -2

Standard A_3 352375 0.00 3 107 -61 >

Standard A_4 347623 0.00 3 106 -60 >

Standard G_2 32524 47.44 12 10 -49 -19

Kitkontrolle1_4 253175 2.54 2 77 -60 8

Kitkontrolle2_4 102915 12.54 0 31 -57 -6

Standard D_2 222790 3.69 4 68 -59 -1

Standard E_2 137923 8.62 3 42 -59 1

Standard F_2 75064 18.07 1 23 -58 -5

Kitkontrolle2_5 100441 12.92 3 30 -59 -2

∑ -59 0


Standard A_1 326418 0.02 2 100 -64 >

Standard B_1 267355 1.14 1 82 -64 -7

Standard C_1 234063 2.06 2 72 -65 -3

Standard D_1 200285 3.29 3 61 -64 -2

Standard E_1 122238 8.50 3 37 -65 4

Standard F_1 68810 18.16 2 21 -64 4

Standard G_1 22928 54.28 2 7 -65 -6

Kitkontrolle2_1 86775 13.68 0 27 -65 6

Kitkontrolle1_1 219715 2.54 2 67 -64 -7

Kitkontrolle1_2 239265 1.90 0 73 -64 -10

Kitkontrolle2_2 96989 11.90 10 30 -64 3

Standard A_2 319639 0.12 4 98 -64 -37

Kitkontrolle1_3 230920 2.16 1 71 -64 -10

Kitkontrolle2_3 89291 13.19 1 27 -64 2

Standard A_3 330583 0.14 1 101 -64 -39

Standard A_4 316508 0.14 3 97 -63 -39

Standard G_2 24911 50.93 11 8 -61 -13

Kitkontrolle1_4 237015 1.97 0 73 -63 -16

Kitkontrolle2_4 87641 13.51 1 27 -64 1

Standard D_2 198570 3.36 4 61 -63 -10

Standard E_2 123647 8.35 3 38 -63 -2

Standard F_2 64607 19.53 1 20 -64 3

Kitkontrolle2_5 87489 13.54 2 27 -64 3

∑ -64 -8

5. Ergebnisse

51




Standard A_1 283005 0.04 3 100 -69 >

Standard B_1 249648 1.13 1 88 -67 -7

Standard C_1 219605 2.25 2 78 -67 6

Standard D_1 193518 3.36 3 68 -66 0

Standard E_1 118830 8.37 2 42 -66 2

Standard F_1 66700 17.21 1 24 -65 -1

Standard G_1 22618 55.66 2 8 -65 -4

Kitkontrolle2_1 85635 12.86 1 30 -65 -1

Kitkontrolle1_1 212605 2.53 0 75 -65 -7

Kitkontrolle1_2 206995 2.76 0 73 -69 30

Kitkontrolle2_2 89083 12.32 9 31 -67 7

Standard A_2 312022 0.00 4 110 -64 >

Kitkontrolle1_3 223565 2.09 1 79 -65 -13

Kitkontrolle2_3 87890 12.47 3 31 -65 -3

Standard A_3 302238 0.00 3 107 -67 >

Standard A_4 311003 0.00 4 110 -64 >

Standard G_2 22301 56.17 4 8 -65 -5

Kitkontrolle1_4 219275 2.26 1 77 -66 -4

Kitkontrolle2_4 84698 13.04 3 30 -65 -3

Standard D_2 196270 3.24 4 69 -64 -13

Standard E_2 123350 7.93 4 44 -63 -7

Standard F_2 64760 17.79 1 23 -64 -6

Kitkontrolle2_5 87737 12.49 2 31 -64 -5

∑ -65 -2


Standard A_1 271223 0.02 2 100 -70 >

Standard B_1 233170 1.15 1 86 -69 -6

Standard C_1 205108 2.19 3 76 -69 3

Standard D_1 179798 3.30 3 66 -68 -2

Standard E_1 110295 8.42 2 41 -68 3

Standard F_1 62316 17.60 1 23 -68 1

Standard G_1 21497 54.92 1 8 -67 -5

Kitkontrolle2_1 80165 12.99 0 30 -67 0

Kitkontrolle1_1 200550 2.37 2 74 -67 -13

Kitkontrolle1_2 199920 2.39 0 74 -70 13

Kitkontrolle2_2 82425 12.62 10 30 -70 9

Standard A_2 290571 0.02 4 107 -67 -91

Kitkontrolle1_3 207070 2.10 1 76 -67 -12

Kitkontrolle2_3 82139 12.60 1 30 -67 -2

Standard A_3 287528 0.00 2 106 -68 >

Standard A_4 292695 0.00 3 108 -66 >

Standard G_2 20479 57.85 4 8 -68 -2

Kitkontrolle1_4 204250 2.22 0 75 -68 -5

Kitkontrolle2_4 77560 13.54 0 29 -68 1

Standard D_2 181433 3.23 4 67 -66 -13

Standard E_2 113923 8.03 4 42 -66 -6

Standard F_2 60483 18.22 2 22 -66 -4

Kitkontrolle2_5 81041 12.82 1 30 -67 -3

∑ -68 -7

5. Ergebnisse

52

Tabelle 12: Zusammenstellung der RLUs und Differenzierungen der Standardkurven der

verschiedenen Messungen.

Hier sind die RLU Mittelwerte für die Standardreihe (RLU) sowie die Differenzierung (B/B0,%)

vergleichend für die verschiedenen Messungen aufgezeigt.

Für jede Messung wurde die Abweichung der gemessenen RLUs mit dem Infinite im

Vergleich zum CentroLIA angegeben. Für einzelne Werte, bei denen die Konzentration

im Bereich von 0.00 bis 0.06 pg/mL liegt, wird die Abweichung nicht berücksichtigt, da

diese mathematisch bedingt für den kleinen Konzentrationsbereich sehr hohe

Abweichungswerte ergibt.

Es zeigt sich, dass bei den Varianten automatische Filterabschwächung: 100ms sowie

keine automatische Abschwächung: 200ms teilweise Konzentrationswerte nicht

berechnet werden können (sie müssten extrapoliert werden) und mit > gekennzeichnet

werden.

Bei der Variante 200ms, keine automatische Abschwächung, ist einmal Kitkontrolle 2

außerhalb des Zielbereiches.

Bei der Variante 200ms, automatische Filterabschwächung, gibt es keine

Auffälligkeiten.

Bei der Betrachtung der Differenzierung zeigt sich, dass alle Varianten außer 200ms,

automatische Filterabschwächung, keine gute Übereinstimmung zu den CentroLIA

Werten zeigen. Es sind bei allen Varianten keine signifikanten Effekte an Überstrahlung

oder Drifteffekten zu bemerken.

RLU B/B0, % RLU B/B0, % RLU B/B0, % RLU B/B0, % RLU B/B0, %

Std A 908266 100 283005 100 326418 100 329410 100 271223 100

Std B 748815 82 249648 88 267355 82 295243 90 233170 86

Std C 660435 73 219605 78 234063 72 263955 80 205108 76

Std D 562912 62 193518 68 200285 61 225928 69 179798 66

Std E 346269 38 118830 42 122238 37 142733 43 110295 41

Std F 193278 21 66700 24 68810 21 79350 24 62316 23

Std G 65049 7 22618 8 22928 7 28490 9 21497 8

Centro LIA (Referenz)

100 ms, auto 200ms, auto 200ms, none 400ms, auto200ms, auto

Infinite (Testgerät)

5. Ergebnisse

53

5.3.4. Plattenpräzisionen

Die Auswertung der Intra-Platten Präzisionstestungen erfolgte anhand des

Qualitätskontroll-Formblattes für Platten-Variationskoeffizient Testung. Beispielhaft ist

in Abbildung 8 die Auswertung von einer durchgeführten Messung gezeigt.

Abbildung 8: Auswertung des Platten-CVs am Beispiel von Estradiol, Std. A, gemessen

mit dem Infinite Luminometer, 200ms Integrationszeit und automatischer Filter-

abschwächung.

Die Abbildung zeigt die erhaltenen Messwerte (RLU) im Mikrotiterplattenformat. Durch

Farbmarkierungen werden der niedrigste und höchste Messwert rot hinterlegt gekennzeichnet.

Der entsprechende Messwert wird im Kasten mit der Bezeichnung RLU-Variation angegeben.

Messwerte, welche sich oberhalb des Mittelwertes befinden, werden blau markiert und

Messwerte, die unterhalb des Mittelwertes liegen, werden gelb markiert. Jeweils pro Spalte und

pro Zeile wird der Mittelwert (MNOPPPPPP) sowie der Variationskoeffizient in Prozent (CV%) angegeben.

Der Gesamtvariationskoeffizient sowie der Gesamtmittelwert der gemessenen RLU werden

angegeben. MNOPPPPPPout bezeichnet den sich aus den Werten des äußeren Rahmens (Zeile A und H

sowie Spalte 1 und 12) ergebenden Mittelwert, der analoge Wert für den inneren Bereich wird

mit MNOPPPPPPin bezeichnet. Die Abweichung zwischen MNOPPPPPPout und MNOPPPPPPin wird unter ∆ angegeben. Von

dem Mittelwert der ersten Spalte und dem Mittelwert von Spalte 2 bis 12 wird eine Abweichung

berechnet.

In Tabelle 13 sind die erhaltenen Ergebnisse für alle durchgeführten Messungen

vergleichend gegenübergestellt.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 RLU CV%

A 331620 321590 333170 332970 324640 334270 335660 339860 340250 344810 343700 356920 336622 2.8%

B 348090 355890 342250 345210 344210 343070 343380 336070 348240 338690 346890 353870 345488 1.6%

C 344430 339660 328770 340390 345960 333580 339270 349220 344700 349890 356780 343920 343048 2.2%

D 331310 324690 328480 332350 329920 332750 330430 329490 337230 327680 338890 335220 331537 1.2%

E 335290 329880 330240 334770 337390 333030 320980 312450 326150 316760 345160 336400 329875 2.8%

F 327840 325930 333310 318780 327070 327400 324980 337410 324800 314640 338110 328100 327364 2.1%

G 319750 323970 326170 318070 319890 322870 302940 302100 317990 338480 336910 330030 321598 3.5%

H 316050 318410 312870 310400 325230 325420 314150 321980 321220 317680 317000 333610 319502 2.0%

MV 331798 330003 329408 329118 331789 331549 326474 328573 332573 331079 340430 339759 331879

CV% 3.3% 3.7% 2.5% 3.7% 2.9% 1.9% 4.2% 4.7% 3.4% 4.1% 3.4% 3.2% 3.5%

RLU - Variation

RLUtotal CVtotal RLUmin RLUmax ∆ RLUout RLUin ∆

331879 3.5% 302100 356920 15.4% 330770 331258 0.1%

RLU MV RLU MV Dev. %

strip 1 strip 2-12 Min / Max

331798 331886 0.0 > mean

< mean

5. Ergebnisse

54

Tabelle 13: Zusammenstellung der Ergebnisse der Intra-Plattenpräzision

Beispielhaft wurden für die Plattenpräzisionstestung die Teste Estradiol und Cortisol betrachtet.

Für den Parameter Estradiol wurde jeweils eine ganze Mikrotiterplatte mit Standard A und

Standard G als Probe befüllt. Für den Parameter Cortisol wurde jeweils für die 20 und 50µL

Testvariante Standard A und Standard G als Probe pipettiert. Von den erhaltenen Messdaten

werden nachfolgend aufgelistete Werte berechnet.

RLU CV, %: Gesamtvariationskoeffizient der RLUs

MW RLU: Gesamtmittelwert der RLUs

RLUmin und RLUmax: niedrigster und höchster RLU Messwert

delta RLU min-max, %: prozentuale Abweichung zwischen niedrigstem und höchstem RLU

Messwert

delta RLU in-out, %: prozentuale Abweichung zwischen dem RLU Mittelwert des äußeren

Bereichs der Mikrotiterplatte (Zeile A und H, Spalte 1 und 12) sowie dem Mittelwert der RLU im

inneren Bereich (Rest) der Mikrotiterplatte

Referenz-

gerät

Infinite

200ms, auto

Abweichung

zum

Referenz-

gerät

Infinite

200ms, none

Abweichung

zum Referenz-

gerät

RLU CV, % 3.3 3.5 6 3.0 -9

MW RLU 876593 331879 -62 313539 -64

RLUmin 794393 302100 -62 287350 -64

RLUmax 948251 356920 -62 333550 -65

delta RLU min-max, % 16.2 15.4 -5 13.9 -14

delta RLU in-out, % -0.5 0.1 -120 1.2 -340

RLU CV, % 8.3 6.3 -24 8.8 6

MW RLU 57253 21449 -63 21359 -63

RLUmin 45543 18357 -60 17621 -61

RLUmax 71099 27127 -62 25914 -64

delta RLU min-max, % 35.9 32.3 -10 32.0 -11

delta RLU in-out, % -1.6 -1.3 -19 -3.8 138

RLU CV, % 2.3 2.5 9 2.7 17

MW RLU 19016474 7522405 -60 7993211 -58

RLUmin 17863296 7130800 -60 7497200 -58

RLUmax 19919047 7929200 -60 8450700 -58

delta RLU min-max, % 10.3 10.1 -2 11.3 10

delta RLU in-out, % 2.1 1.2 -43 0.7 -67

RLU CV, % 2.5 2.7 8 3.0 20

MW RLU 18974856 7443041 -61 7942561 -58

RLUmin 17660744 6909100 -61 7253300 -59

RLUmax 19967285 7912800 -60 8448600 -58

delta RLU min-max, % 11.6 12.7 9 14.1 22

delta RLU in-out, % 2.7 1.6 -41 1.3 -52

RLU CV, % 4.6 4.8 4 4.9 7

MW RLU 928538 336405 -64 339132 -63

RLUmin 792814 276240 -65 279090 -65

RLUmax 982022 373600 -62 375630 -62

delta RLU min-max, % 19.3 26.1 35 25.7 33

delta RLU in-out, % 4.4 1 -77 2.8 -36

RLU CV, % 5.2 5.8 12 5.5 6

MW RLU 401637 151928 -62 148896 -63

RLUmin 344603 126050 -63 124460 -64

RLUmax 473713 184910 -61 178920 -62

delta RLU min-max, % 27.3 31.8 16 30.4 11

delta RLU in-out, % -0.8 -4.5 463 -3.4 325

Cortisol, Standard G, 50µL

Estradiol, Standard A

Estradiol, Standard G

Cortisol, Standard A, 20µL

Cortisol, Standard A, 50µL

Cortisol, Standard G, 20µL

5. Ergebnisse

55

Die erhaltenen RLU-Messsignale verhalten sich wie in den bisherigen Messungen

(Crosstalk), das Infinite Messgerät liefert RLU-Messwerte, die im Bereich von 60–65%

tiefer als beim Referenzgerät liegen, der Faktor zwischen den RLU-Signalen Infinite

und CentroLIA liegt im Bereich von 2.5–2.7.

Anhand der Ergebnisse aus Cross-talk Testung und Plattenpräzisionstestung wird

festgelegt, die Version mit einer Integrationszeit von 200ms sowie Wahl der

automatischen Filterabschwächung als Standardeinstellung für Lumineszenz-

Messungen mit dem Infinite zu setzen.

5.3.5. Differenzierung und Konzentrationsermittlungen

Im Folgenden werden in Tabelle 15 bis 19 die Ergebnisse für die einzelnen Assays und

Messgeräte zusammengefasst.

Tabelle 14: Vergleich der RLU-Abweichungen zwischen den Standardkurven am Anfang

und am Ende der MTP für Referenz- und Testgerät.

Die Differenzen der prozentualen Abweichungen der Standards je nach Position (Anfang vs.

Ende der Platte) und zwischen den Geräten werden für die durchgeführten Assays aufgeführt.

CentroLIA Infinite

Abw. 1 vs. 2, % Abw. 1 vs. 2, %

Cortisol (LCO, 50µL) -0.5 -3.9 3.4Cortisol (LCL) 7.3 1.9 5.4DHEA (LDH) 0.7 1.9 1.2

Estradiol (LES) -1.9 0.6 2.5Testosteron (LTE) 8.8 9.9 1.1Progesteron (LPR) 1.2 2.3 1.1

IRT (LIT) 8.6 4.6 4.0Gesamtmittelwert 3.5 2.5 2.7

AssayDifferenzen

zwischen Geräten, %

5. Ergebnisse

56

Tabelle 15: Mittelwerte der Abweichungen zum Zielwert der gemessenen

Konzentrationswerte für Kitkontrollen und QC-Proben, Standardkurve am Anfang.

Von den jeweils erhaltenen Konzentrationswerten für Kitkontrollen und QC-Proben (ermittelt

über die erste Standardreihe auf der Platte) wird eine Abweichung zum Zielwert bestimmt. Je

Testansatz wird aus diesen Abweichungen ein Mittelwert gebildet, welcher unter den beiden

Luminometern verglichen wird.

Tabelle 16: Mittelwerte der Abweichungen zum Zielwert der gemessenen

Konzentrationswerte für Kitkontrollen und QC-Proben, Standardkurve am Ende.

Von den jeweils erhaltenen Konzentrationswerten für Kitkontrollen und QC-Proben (ermittelt

über die zweite Standardreihe auf der Platte) wird eine Abweichung zum Zielwert bestimmt. Je

Testansatz wird aus diesen Abweichungen ein Mittelwert gebildet, welcher unter den beiden

Luminometern verglichen wird.

CentroLIA Infinite

Abw., % Abw., %

Cortisol (LCO, 50µL) -9.1 -6.0 3.1Cortisol (LCL) -9.1 -10.3 1.2DHEA (LDH) 2.6 7.1 4.5

Estradiol (LES) -22.0 -24.3 2.3Testosteron (LTE) -12.3 -11.5 0.8Progesteron (LPR) 3.5 -3.1 6.6

IRT (LIT) 8.5 5.2 3.3Gesamtmittelwert -5.4 -6.1 3.1

AssayDifferenzen


CentroLIA Infinite

Abw., % Abw., %

Cortisol (LCO, 50µL) -10.1 -10.4 0.3Cortisol (LCL) -7.1 -5.5 1.6DHEA (LDH) -1.2 5.2 6.4

Estradiol (LES) -25.5 -24 1.5Testosteron (LTE) 2.5 5.3 2.8Progesteron (LPR) 6.3 1.7 4.6

IRT (LIT) 1.8 3.2 1.4Gesamtmittelwert -4.8 -3.5 2.7

AssayDifferenzen


5. Ergebnisse

57

Tabelle 17: Korrelationsergebnisse für beide Geräte.

Die mit den Messgeräten CentroLIA sowie Infinite ermittelten Konzentrationen für Kitkontrollen

und QC-Proben wurden anhand einer linearen Regression mit Excel analysiert. Hierzu wurden

die Daten in einem Punktdiagramm aufgetragen (x-Achse: mit CentroLIA ermittelte

Konzentration, y-Achse: mit Infinite ermittelte Konzentration). Mittels Trendlinienoptionen

(linear) werden die nachfolgend gezeigten Korrelationsdaten mx+b sowie R² und R bestimmt.

Hinweis zur Messung des Cortisol (LCL): Zum Zeitpunkt der Messung wurde ein

Defekt beim Referenzmessgerät CentroLIA festgestellt. Dieser Fehler führte zu falschen

Messsignalen in den Wells A1-4 und B1-4, was sich in fehlerhaften Ergebnissen für die

Standardkurve am Anfang auswirkt. Das Referenzgerät wurde daraufhin zur Wartung

an den Hersteller übergeben, eine vergleichende Auswertung erfolgt somit für den LCL

nur anhand der Standardkurve am Ende der Mikrotiterplatte.

Tabelle 18: Abweichungen von RLU/RLUmax in Prozent zwischen den beiden Geräten.

Für die Standardreihen am Anfang und Ende der Mikrotiterplatte wird die Differenzierung

(RLU/RLUmax) in Prozent berechnet und die Abweichung zwischen den beiden Geräten

verglichen.

Assay mx+b R R² mx+b R R²

Cortisol (LCO, 50µL) 1.017x+0.005 0.999 0.999 0.9669x+0.0046 0.999 0.999Cortisol (LCL) - - - 1.0388-0.0041 0.996 0.992DHEA (LDH) 0.9387x+18.349 0.316 0.100 1.0076x+13.088 0.999 0.997

Estradiol (LES) 0.9621x-0.0312 1.000 0.999 0.9974x+0.1346 1.000 0.999Testosteron (LTE) 0.948x+2.4722 0.999 0.999 0.9923x+2.0691 1.000 0.999

Progesteron (LPR) 0.8368x+7.1053 0.996 0.992 0.8794x+6.0246 0.996 0.992IRT (LIT) .9733x-0.0811 0.999 0.998 1.0113x+0.3695 0.999 0.998

Gesamtmittelwert - 0.921 0.848 - 0.998 0.997

2. Standardkurve1. Standardkurve

erste Standard-

kurve

zweite Standard-

kurve

Abw., % Abw., %

Cortisol (LCO, 50µL) -4.1 -2.5 -3.3Cortisol (LCL) x -3.6 -3.6DHEA (LDH) 10.3 3.9 7.1

Estradiol (LES) 7.2 3.9 5.6Testosteron (LTE) 5.0 2.4 3.7Progesteron (LPR) -1.0 0.4 -0.3

IRT (LIT) -0.7 -0.8 -0.8Gesamtmittelwert 2.8 0.5 1.2

Assay Mittelwert, %

5. Ergebnisse

58

5.4. Leistungs(Performance)-Qualifizierung (PQ)

Während der Leistungs-Qualifizierungs Phase wurden je Parameter, in Abhängigkeit

vom Routineaufkommen der Chargenherstellungen, ein bis drei Lumineszensassays

vermessen und ausgewertet. Die Assays wurden auf dem Referenzgerät (CentroLIA)

sowie auf dem Infinite Gerät gemessen. Für jede Testung wurden eine Standardreihe,

Kitkontrollen sowie die jeweils testspezifischen Qualitäts-kontrollproben mitgeführt.

Die erhaltene Messergebnisse (RLUs), die anhand der Standardkurve berechneten

Konzentrationen sowie das jeweilige Differenzierungsverhalten der Standards wurden

zwischen beiden Messgeräten vergleichend analysiert. Hierbei wurden besonders die

jeweiligen Abweichungen der gemessenen RLUs der Standards und ihr

Differenzierungsverhalten (RLU/RLUmax) untersucht sowie auch der Zusammenhang

der jeweilig ermittelten Konzentrationswerte der Proben mittels linearer Regression.

Die Läufe der PQ-Testungen wurden analog zu den OQ-Testungen ausgewertet, mit

Ausnahme, dass nur eine Standardkurve mitgeführt wurde. In den nachfolgenden Tabellen 20-22 werden die Ergebnisse der Untersuchungen

zusammengefasst.

5. Ergebnisse

59

Tabelle 19: Mittelwerte der Gesamtabweichungen zum Mittelwert für die jeweiligen

Bereiche der gemessenen Konzentrationswerte für Kitkontrollen und QC-Proben.

Die mit den Messgeräten CentroLIA sowie Infinite erhaltenen Konzentrationen für die QC-

Proben und Kitkontrollen wurden in Bezug zu der jeweiligen Abweichung zum

Bereichsmittelwert verglichen. Hieraus wurde je Test ein Gesamtmittelwert der Abweichungen

zum Bereichsmittelwert bestimmt, der zwischen beiden Geräten verglichen wird. Die Tabelle

fasst im Überblick die in der PQ-Phase ermittelten Abweichungen zum Mittelwert der jeweiligen

Assays zusammen.

CentroLIA Infinite

Abw., % Abw., %

Cortisol (LCO, 20µL) 1.7 -1.5 3.2Cortisol (LCL) 10.6 6.9 3.7DHEA (LDH)_1 18.0 5.3 12.7DHEA (LDH)_2 8.0 1.0 7.0

Estradiol (LES)_1 -17.1 -19.7 2.6Estradiol (LES)_2 -5.9 -18.7 12.8Estradiol (LEL)_1 -8.6 -16.2 7.6Estradiol (LEL)_2 -8.8 -13.9 5.1

Testosteron (LTE)_1 -7.9 -5.9 2.0Testosteron (LTE)_2 -9.5 -7.3 2.2Testosteron (LTE)_3 -1.9 -4.2 2.3Progesteron (LPR)_1 13.1 13.1 0.0Progesteron (LPR)_2 11.4 5.1 6.3

IRT (LIT)_1 -1.2 -2.5 1.3IRT (LIT)_2 6.9 6.5 0.4

Gesamtmittelwert 0.6 -3.5 4.6

AssayDifferenzen


5. Ergebnisse

60

Die Tabelle 20 gibt einen Überblick über die ermittelten Differenzen im

Differenzierungsverhalten/Standardkurvenverlauf.

Tabelle 20: Abweichungen von RLU/RLUmax in Prozent zwischen den beiden Geräten.

Die mit den Messgeräten CentroLIA sowie Infinite gemessenen RLU und die daraus

berechneten Differenzierungen für die Standards werden für beide Messgeräte verglichen. Es

wird die Gesamtabweichung von RLU zu RLUmax in Prozent je Standardkurve und Assay

angegeben.

Bei den Abweichungen der Differenzierungen der Standardkurve sind keine

signifikanten oder systematischen Unterschiede erkennbar. Die Gesamtabweichung

über alle Assays liegt hier unter 5%.

Assay Abw., %

Cortisol (LCO, 20µL) 6.7Cortisol (LCL) 5.3DHEA (LDH)_1 2.4DHEA (LDH)_2 -3.6

Estradiol (LES)_1 -1.8Estradiol (LES)_2 -1.9Estradiol (LEL)_1 -8.0Estradiol (LEL)_2 -4.8

Testosteron (LTE)_1 -4.2Testosteron (LTE)_2 -7.5Testosteron (LTE)_3 -6.3Progesteron (LPR)_1 -2.4Progesteron (LPR)_2 -7.1

IRT (LIT)_1 0.8IRT (LIT)_2 0.3

Gesamtmittelwert -2.1

5. Ergebnisse

61

Die nachfolgende Tabelle 21 summiert die in der PQ-Phase ermittelten Korrelationen

zwischen den Konzentrationswerten der Proben für beide Geräte.

Tabelle 21: Korrelationsergebnisse für beide Geräte

Die mit den Messgeräten CentroLIA sowie Infinite ermittelten Konzentrationen für Kitkontrollen

und QC-Proben wurden anhand einer linearen Regression mit Excel analysiert. Hierzu wurden

die Daten in einem Punktdiagramm aufgetragen (x-Achse: mit CentroLIA ermittelte

Konzentration, y-Achse: mit Infinite ermittelte Konzentration). Mittels Trendlinienoptionen

(linear) werden die nachfolgend gezeigten Korrelationsdaten mx+b sowie R² und R bestimmt.

Assay

mx+b R R²

Cortisol (LCO, 20µL) 1.021x-0.0087 0.999 0.998Cortisol (LCL) 0.9199x+0.0213 0.998 0.997DHEA (LDH)_1 0.7219x+34.344 0.988 0.976DHEA (LDH)_2 0.7785x+27.298 0.992 0.984

Estradiol (LES)_1 0.9271x+0.0437 0.999 0.997Estradiol (LES)_2 0.6811x+0.9859 0.982 0.964Estradiol (LEL)_1 0.8501x+0.3328 0.998 0.996Estradiol (LEL)_2 0.9571x-0.1258 0.996 0.993

Testosteron (LTE)_1 0.8863x+6.8454 0.998 0.996Testosteron (LTE)_2 0.8719x+6.7449 0.998 0.996Testosteron (LTE)_3 0.8708x+5.0089 0.998 0.996Progesteron (LPR)_1 0.7618x+22.739 0.981 0.963Progesteron (LPR)_2 0.7227x+22.079 0.973 0.948

IRT (LIT)_1 1.0006x-1.4034 0.999 0.999IRT (LIT)_2 0.9913x+0.6036 1.000 0.999

Gesamtmittelwert - 0.993 0.987

Korrelationsdaten

6. Diskussion

62

6. Diskussion

Die vorgesehenen Testungen für die Prozessvalidierung wurden erfolgreich

durchgeführt und die vorgegebenen Kriterien erfüllt. Die Prozessvalidierung ist damit

abgeschlossen und es sind keine weiteren Punkte mehr offen. Das Infinite Luminometer

kann zur Messung der Lumineszenzteste bei IBL verwendet werden.

Während des Validierungszeitraumes durchlief sowohl das CentroLIA Referenzgerät

als auch das Infinite-Luminometer erfolgreich alle Überprüfungszyklen mit den

entsprechenden kalibrierten Testplatten. Die Funktionalität der beiden Geräte war über

den gesamten Validierungszeitraum gewährleistet. Lediglich das CentroLIA befand sich

kurzzeitig in Wartung.

Die optimale Filtereinstellung für das Infinite 200 wurde im Rahmen von

Sensitivitätsanalysen (ATP-Sensitivitätstest) bei der Ermittlung der Sensitivität/ dem

Detektionlimit untersucht. Unter Verwendung verschiedener Möglichkeiten der

Filterwahl zeigte sich das beste Ergebnis für das Infinite Gerät bei Anwendung der

automatischen Filterabschwächung.

Die Auswertungen mit dem CentroLIA Gerät wurden mit der MikroWin 2000 Software

(Mikrotek) durchgeführt. Das Infinite Luminometer weist für diese Software keine

Kompatibilität auf. Deshalb wurde für das Infinite die geräteeigene Magellan Software

(Tecan) benutzt. Die Installation von Magellan wird als erfolgreich bewertet.

Hinsichtlich der unterschiedlichen Software, MikroWin 2000 und Magellan, wurde eine

retrospektive Auswertung bestehender Daten mit verschiedenen Algorithmen zur

Kurvenberechnung für Magellan im Vergleich zur MikroWin Referenz Methode

(4 Parameter Logistik) vorgenommen. Dabei zeigt sich, dass die geringsten

Abweichungen zur Referenzmethodik mit den Algorithmen Varianten Vier-Parameter-

Marquardt (für die Steroidassays Differenzbereich -4 bis +8%) und Fünf-Parameter-

Marquardt (für die Steroidassays Differenzbereich -3 bis +9%) der Magellan Software

erhalten werden. Für IRT wird zusätzlich mit der Regression die beste

Übereinstimmung erzielt (Differenzbereich -0.2 bis 0.3%). Es wurde basierend auf den

Daten entschieden, dass die Methode Vier-Parameter-Marquardt als Standardmethode

für die Auswertung der verschiedenen Assays verwendet wird. Die anderen

ausgetesteten Möglichkeiten der Standardkurvenanalyse werden aufgrund der

schlechteren Übereinstimmung zur Referenzmethode nicht angewandt und müssen,

sofern eine Anwendung doch erfolgen soll, individuell für jeden Parameter betrachtet

6. Diskussion

63

werden. Jedoch ist auch zu beachten, dass sich der Vergleich der Methoden in dieser

Testung immer auf die aktuelle Referenzmethode bezieht. Zudem könnte ein Risiko

dadurch bestehen, dass die QC-Probenbereiche und Kitkontrollbereiche, anhand derer

die Testfreigaben geschehen, mit einer anderen Standardkurvenberechnungsmethode

ermittelt wurde als ein Kunde sie nutzt, was eventuell zu Differenzen bei der

Interpretation der vom Test ermittelten Konzentration führen könnte. Zum Ausschluss

dieses Risikos sind bei entsprechendem Bedarf in den Arbeitsanweisungen der Assays

die zu nutzenden Auswertungsalgorithmen zu definieren.

Die Lumineszenz-Messung mit Luminometern ist für die Durchführung und

Auswertung von Lumineszenz-basierten Assays von entscheidender Bedeutung. Das zu

bewertende Risiko besteht in der bauartbedingten unterschiedlichen Messung von

Lumineszenzwerten (relativen light units = RLU), die zu verschiedenen

Auswertungsresultaten von Lumineszenz-Assays führen können. Die gemessenen

RLU’s müssen nicht zwangsläufig in ihren Absolutwerten übereinstimmen, sollten

jedoch die gleiche Differenzierung von Analyten gewährleisten sowie zu einer

vergleichbaren Sensitivität der Messparameter und Präzision in der Probenmessung

durch das Infinite Gerät im Vergleich zum CentroLIA Gerät führen. Ebenso sollte die

bauartbedingte Übersprechung („Cross-talk“) des Gerätes nicht wesentlich größer sein

als die des CentroLIAs.

Bezüglich der Lumineszenzmessung ist zu beachten, dass das Infinite eine klar

vorgegebene Messrichtung, zeilenweise mäanderförmig, besitzt welche nicht variiert

werden kann. Dies unterscheidet sich zur Referenzmethode. Hier erfolgen die

Pipettierung der Reagenzien und die Messung in Übereinstimmung spaltenweise. Dies

könnte eine Ursache für beobachtbare Unterschiede in der Konzentrationsermittlung

zwischen den beiden Geräten sein. Außerdem ist das CentroLIA im Gegensatz zum

Infinite variabel in der Messrichtung einstellbar.

Es zeigte sich bei der Cross Talk Testung, dass die Variante 200 ms Integrationszeit,

automatische Filterabschwächung, beim Infinite zu einer großen Übereinstimmung mit

den CentroLIA Werten führt und diese Integrationszeit wurde standardmäßig in den

nachfolgenden Messreihen verwendet. Es wurden bei allen getesteten Varianten der

Integrationszeit keine signifikanten Effekte an Überstrahlung oder Drifteffekten

registriert, jedoch war ein Einfluss auf das Differenzierungsverhalten der Standardreihe

zu bemerken, mit der minimalsten Abweichung zu Referenz bei 200 ms

6. Diskussion

64

Integrationszeit.

Bei der Intra-Plattenpräzisionstestung gab es keine Auffälligkeiten, es werden

hinsichtlich der Variationskoeffizienten, Randeffekte sowie der Betrachtung innerer zu

äußerer Bereich der Platte von beiden Geräten ähnliche Ergebnisse erzielt. Alle Assays

mit Ausnahme des Estradiol Assays mit Standard G zeigten einen Intra

Variationskoeffizient von < 6% und liegen damit unterhalb des Schwellenwertes der

Vorgabe aus den Kriterien der Qualitätskontrolle für eine Mikrotiterplatten-In-Prozess-

Kontrolle (IPC). Es wird generell bei den Platten-IPC-Messungen als Probe für die

Präzisionstestung eine Probe gewählt, die im linearen Konzentrationsbereich der

Standardkurve mit einem für den jeweiligen Test mittleren Signal liegt. Bei der hier

vorliegenden Testung wurden bewusst Proben im oberen bzw. unteren Signalbereich

gewählt, um die Prozessgrenzen beurteilen zu können. Außerdem zeigte der Infinite in

dem Estradiol-Assay einen geringeren Platten-CV als das Referenzgerät Centro-LIA.

Insgesamt jedoch lässt sich kein signifikanter Unterschied (Student‘s T-test, t-Statistik: -

0.39, 5 Freiheitsgrade, p= 0.7133) zwischen beiden Geräten hinsichtlich der

gemessenen Plattenpräzision, siehe nachfolgende Tabelle 22, ermitteln.

Tabelle 22: statistische Daten.

N Mittelwert Median Standardfehler (SE)

Standardabweichung (STD)

Centro-LIA (CV%)

6 4.37 3.95 0.915 2.24

Infinite (CV%)

6 4.27 4.15 0.657 1.61

Hinsichtlich der Driftüberprüfung in Bezug auf die Standardkurvenanordnung lassen

sich keine signifikanten Drift- oder positionsbedingten Effekte zwischen den Geräten

feststellen. Die ermittelten Differenzen der prozentualen Abweichungen der

Konzentrationsermittlungen waren für alle Assays, mit Ausnahme des LCL Assays <

5%. Bei dem LCL lag der Variationskoeffizient < 7%. Hierbei ist jedoch zu beachten,

dass der LCL-Assay das geringste Pipettiervolumen für die jeweiligen Proben besitzt

und es damit zu höheren Schwankungen aufgrund von Pipettierungenauigkeiten

kommen kann. Eine Konzentrationsdrift zwischen Beginn und Ende der Mikrotiterplatte

konnte für alle Assays nicht detektiert werden. Die Messgeräte verhalten sich somit

ähnlich und es sind keine Unterschiede zu erkennen, außer dem Unterschied in der

6. Diskussion

65

bauartbedingten absoluten Signalhöhe (Infinite im Vergleich zum CentroLIA konstant

deutlich tiefer (ca. 60-70% für Steroidassays und ca. 40% für IRT).

Bezüglich der Abweichungen zum Zielwert der gemessenen Konzentrationswerte

zeigen die ermittelten Korrelationen, dass zwischen den beiden Geräten kein

signifikanter Unterschied bezüglich der Messniveaus aller untersuchten Assays vorliegt

und sich die Korrelationsparameter alle in den definierten Grenzen bewegen. Die

Korrelationen zeigen, dass zwischen den beiden verglichenen Geräten keine

Verschiebung des Messbereiches vorliegt.

In Bezug auf die Differenzierung von RLU zu RLUmax der Standardkurve wurde bei

allen Testungen, mit Ausnahme für den DHEA- und den Estradiolassay, das Kriterium

von <5% bezüglich der Abweichung voneinander eingehalten. Bei DHEA und beim

Estradiol ist jeweils die Differenzierungsabweichung für die erste Standardreihe nicht

im geforderten Kriterium von <5%. Bezogen auf die Konzentrationsermittlung

verhalten sich beide Teste im Vergleich zwischen den Geräten jedoch ähnlich und

zeigen keine signifikanten Unterschiede gegeneinander. Sind die Abweichungen in den

prozentualen Bindungen zu hoch, kann dies unter Umständen noch über die Einstellung

der Messzeit/Well des Infinite variiert werden. Dieser Sachverhalt muss weiterhin

beobachtet werden und wird als geringe Abweichung zu der festgelegten Grenze

bewertet.

Insgesamt haben wurden die während der OQ Phase erhobenen Resultate innerhalb der

PQ Testungen bestätigt. Der Konzentrationsunterschied über alle Teste hinweg

zwischen den Geräten liegt unter 5%. Beim DHEA und Estradiol Assay war die

jeweilige Abweichung jedoch >5%. Ein Vergleich mit den während der OQ- Phase

erhobenen Daten mit beiden Assays zeigten jedoch, dass hier wahrscheinlich

Unterschiede in der Abarbeitung oder verschiedene Testchargen für die Unterscheide

verantwortlich sind. Hinsichtlich des Messverhaltens der Geräte sind keine

Unterschiede festzustellen. Beim DHEA Assay lagen die mit dem Infinite ermittelten

Ergebnisse sogar näher am Mittelwert des Gesamtprobenbereichs. Da von den

Steroidassays der Parameter Estradiol mit den geringsten Absolutsignalstärken

gemessen wurde, könnte gegebenenfalls durch eine Signalanhebung oder -absenkung

(mittels Enzymkonjugat) oder über eine Anpassung der Standardkurve (Verdünnen oder

Aufkonzentrierung) eine mittigere Messung der jeweiligen Bereiche erreicht werden.

6. Diskussion

66

Die Korrelationsanalysen zur Charakterisierung des Messverhaltens und Messniveaus

der Assays bestätigten ebenso das vergleichbare Verhalten der beiden Geräte. Bei allen

durchgeführten Assays lag der Korrelationskoeffizient deutlich über 0.9.

Die Anforderungen bezüglich der Steigung (0.8 < m < 1.2) wurden mit Ausnahme der

DHEA Assay Ansätze (0.72 und 0.77) und einem Estradiol Ansatz (0.68) eingehalten.

Zudem sind die Korrelationsermittlungen bei Progesteron durch die jeweils

höchstkonzentrierte Qualitätskontroll-Probe und ihrer Varianz in der

Konzentrationsermittlung dominiert. Eine Eliminierung in der Auswertung ergibt für

beide Progesteronansätze der PQ-Phase eine Steigung >0.9 (0.9488x + 5.27; 0.9432x +

1.91). Die ermittelte Steigung von <0.8 für einen der Estradiolansätze ist wahrscheinlich

auch zurückzuführen auf Unterschiede in der Abarbeitung oder der Testchargen. Alle

anderen Estradiolansätze, inklusive der OQ-Phase, ergaben Steigungen von >0.8.

Bei den Testungen während der OQ-Phase wurden jedoch für beide Assays die

jeweiligen Steigungen der Korrelationsanalysen innerhalb der Schwellengrenzen

gefunden. Somit ist davon auszugehen, dass dies auf die oben erwähnten

Ansatzunterschiede zurückzuführen ist.

Die registrierten Abweichungen bezüglich der DHEA und Estradiol Assays sollten

jedoch weiter beobachtet werden um eine eventuelle Systematik zu erkennen. Zum

jetzigen Zeitpunkt sind die Überschreitungen der jeweiligen Schwellenwerte aber nicht

eindeutig auf die jeweils verwendeten Luminometer zurückzuführen.

Da bei allen untersuchten Assays eine weitgehende Übereinstimmung in den ermittelten

Daten und Resultaten zu verzeichnen ist, kann von einer vergleichbaren Funktionalität

für das Infinite zum bisherigen Referenzgerät CentroLIA ausgegangen werden. Damit

ist auch das Infinite M200 Luminometer zur Analyse und Charakterisierung von

Lumineszentesten innerhalb von Inprozess- und Freigabekontrollen einsetzbar.

Sowohl die Konzentrationen der Kontrollen als auch der verwendeten QC-Probenpanels

wurden in großer Übereinstimmung mit beiden Geräten in ihren individuellen,

definierten Bereichen gefunden.

Die Einführung als Referenzgerät sollte es ermöglichen, eine bessere Abstimmung

zwischen Assay und Gerät zu erreichen und damit eine höhere Wahrscheinlichkeit der

Übereinstimmung mit Geräten beim Kunden zu erreichen.

Perspektivisch ist jedoch ein erhöhtes Augenmerk in Bezug auf das tiefere Messsignal

sowie die zu verwendenden Auswertealgorithmen mit Magellan zu legen, da diese zu

6. Diskussion

67

unterschiedlichen Ergebnissen führen können. Eine Erhöhung der Signalstärke für

einzelne Assays bzw. die Festlegung von bestimmten Algorithmen für eine

Auswertesoftware könnte hier noch zu einer weiteren Optimierung führen.

Außerdem ergibt sich eventuell ein erhöhter Schulungsbedarf der Mitarbeiter für die

Verwendung der Magellan-Software für das Infinite M200, da diese sich zur bisher

verwendeten MikroWin Software unterscheidet.

Ein potentieller Vorteil gegenüber dem CentroLIA Gerät ist die Möglichkeit, das

Infinite Luminometer Gerät in Tecan Pipettierstationen zu integrieren um eine

vollautomatisierte Abarbeitung der IBL-Lumineszenzteste zu ermöglichen.

Auf dem Markt ist eine Vielzahl an Luminometern vorhanden. Der Trend geht hin zu

sogenannten Multi-Mode Readern. Hiermit kann mithilfe eines einzigen Gerätes ein

größerer Anwendungsbereich, zum Beispiel die Messung von Lumineszenz,

Absorption, Fluoreszenz u.a. abgedeckt werden. Dies bietet den Nutzern mehrere

Vorteile, so muss nur ein einzelnes Gerät angeschafft werden und nicht mehrere

verschiedene. Außerdem muss so nur ein einzelnes Gerät regelmäßig gewartet werden

anstatt vieler verschiedener. Dies spart Zeit und Personalkosten. Nicht zuletzt ergibt

sich durch Anwendung eines Multi-Mode Readers ein Platzvorteil.

Die Entwicklung von Luminometern ist heutzutage immer mehr darauf ausgerichtet, in

Automatisierungsanlagen eingebunden werden zu können. Ebenso besteht häufig die

Möglichkeit, Luminometer mit Stapeleinheiten (Stacker-Anlagen) zu kombinieren.

In einer Marktübersicht der Zeitschrift Biospektrum von Oktober 2014 für

Mikrotiterplatten Lesegeräte handelt es sich bei 18 von 32 vorgestellten Geräten um

multifunktionale Geräte mit Detektionsfunktion für Lumineszenz. Das in dieser Arbeit

validierte Luminometer Infinite M200 Pro ist in der Marktübersicht ebenso vertreten.

(30)

Die Bestimmung der Sensitivität von Luminometern erfolgt häufig mittels ATP-

Messung. Die Lichtentstehung hierbei geht zurück auf die Reaktionsgleichung:

ATP + D − Luziferin + O� ^_H$`ID�aI,BKbcdeeeeeeeeeeeef �gh + hh+ + i��/@j+#��+- + ki� + N+�ℎ)

mit

ATP = Adenosintriphosphat

AMP = Adenosinmonophosphat

6. Diskussion

68

PPi = anorganisches Pyrophosphat

(21, 31)

Die hohe Sensitivität bei Luminometern wird ermöglicht durch die Verwendung von

ausgewählten Hochleistungs Photomultiplier. Die Anwendung der

Photonenzählmethode zeichnet sich als das stabilste und sensitivste Verfahren der

Lumineszenzmessung aus. (1)

In der durchgeführten Validierung wurde unter Verwendung der optimalsten

Einstellungen eine Sensitivität für glow Lumineszenz für das Infinite M200 Pro von

0.31 fmol/well (entspricht 310 amol/well) erzielt. Im Vergleich mit den

Spezifikationsangaben verschiedener Hersteller für Luminometer ist dieser Wert zwar

von den nachfolgend aufgelisteten am höchsten. Es ist aber dennoch bei einer so

geringen Zahlendimension von a = 10-18 davon auszugehen, dass es sich bei der

erzielten Sensitivität um ein optimales Ergebnis handelt. Die nachfolgende Tabelle 23

zeigt Herstellerangaben für die Sensitivität verschiedener Luminometer.

Tabelle 23: Sensitivitäten verschiedener Luminometer, unterschieden in flash und glow

Lumineszenz.

Gerätename Hersteller

Sensitivität,

amol ATP/well

(flash)

Sensitivität,

amol ATP/well

(glow)

Infinite M200 Pro Tecan Austria

GmbH 12 169

Infinite M1000 Pro Tecan Austria

GmbH 12 225

Luminoskan

Ascent Thermo Scientific 10 -

Spark Tecan Austria

GmbH 10 149

Synergy NEO BioTek 5 -

(31–35)

6. Diskussion

69

Es zeigt sich, dass die Sensitivität für die flash Lumineszenz geringer als für die glow

Lumineszenz ist. Die Abweichung der ermittelten Sensitivität von 310 amol ATP/well

zur Literaturangabe kann sich durch geringe Unterschiede in der Abarbeitung

begründen. So ist zum Beispiel die Testung in einer 96-well statt 384-well Platte

durchgeführt worden. Außerdem könnte die Umgebungstemperatur einen Einfluss auf

die Luziferase Aktivität haben oder die Herstellung der ATP-Stocklösung könnte eine

minimale Abweichung besitzen. Insgesamt sind die erhaltenen Ergebnisse als plausibel

zu bewerten.

7. Zusammenfassung

70

7. Zusammenfassung

Mit Hilfe eines Luminometers können Mikrotiterplatten gemessen werden, in denen ein

Chemilumineszenz-Immunoassay durchgeführt wird. Diese Arten von Immunoassays

werden genutzt, um zum Beispiel den Gehalt verschiedener Steroidhormone wie

Testosteron, Progesteron, Cortisol u.a. im Saliva zu quantifizieren sowie zur

Bestimmung von immunreaktiven Trypsin mit Blutfilterkarten.

Im Rahmen dieser Bachelorarbeit wurde innerhalb der Firma IBL International GmbH

für ein Luminometer eine Prozessvalidierung durchgeführt. Hierbei sollte gezeigt

werden, dass das zu validierende Mikrotiterplatten-Luminometer Infinite M200 PRO

(Tecan GmbH) für die Messung der IBL-Lumineszenz-Teste geeignet ist. Als

Referenzgerät kam das Luminometer CentroLIA (Berthold Technologies) zum Einsatz.

Die für das Infinite Gerät zu verwendende Auswertesoftware Magellan (Tecan GmbH)

wurde ebenso bei der Validierung betrachtet.

Die Prozessvalidierung wurde entsprechend den Vorgaben der FDA Guideline 21 Part

CFR Part 820 Section 820.3 (z)(1) durchgeführt. Hierbei erfolgte eine Einteilung in die

Phasen Designqualifizierung, Installationsqualifizierung, Funktionsqualifizierung und

Leistungsqualifizierung. Es erfolgte die Bestimmung der Sensitivität des Luminometers

mittels eines ATP-Testes. Das Übersprechungsverhalten wurde untersucht. Außerdem

wurden Intra-Plattenpräzisionstestungen durchgeführt. Für die zu betrachtenden

Lumineszensassays wurden Korrelationen der ermittelten Konzentrationswerte für

Qualitätskontrollproben im Vergleich zur Messung mit dem Referenzluminometer

erstellt.

Bei allen durchgeführten Prüfungen ist eine weitestgehende Übereinstimmung in den

ermittelten Daten und Resultaten zu dem Referenzgerät sowie zu den vorher definierten

Kriterien zu verzeichnen. Daher kann von einer vergleichbaren Funktionalität für das

Infinite zum bisherigen Referenzgerät CentroLIA ausgegangen werden. Damit ist das

Infinite M200 Luminometer zur Analyse und Charakterisierung von Lumineszentesten

einsetzbar.

8. Literaturverzeichnis

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