Psychopharmaka und Antibiotika beeinflussen die genomische ... · properties; the MAO inhibitor...

Aus der Psychiatrischen und Psychotherapeutischen Klinik am Universitätsklinikum

Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

Direktor: Prof. Dr. med. Johannes Kornhuber

Psychopharmaka und Antibiotika beeinflussen die genomische

DNA-Methylierung von SH-SY5Y Neuroblastomzellen

Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde

der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität

Erlangen-Nürnberg

vorgelegt von Lisa Marie Meintker

aus Nürnberg

Gedruckt mit Erlaubnis der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität

Erlangen-Nürnberg

Dekan: Professor Dr. med. J. Schüttler Referent: Professor Dr. med. S. Bleich Korreferent: PD Dr. med. N. Thürauf Tag der mündlichen Prüfung: 11.11.2009

Inhaltsverzeichnis

1.1 Zusammenfassung 1 1.1.1 Hintergrund und Ziele 1 1.1.2 Material und Methoden 1 1.1.3 Ergebnisse und Beobachtungen 1 1.1.4 Praktische Schlussfolgerungen 2 1.2 Summary 3 1.2.1 Background 3 1.2.2 Material and methods 3 1.2.3 Results 3 1.2.4 Conclusions 4 2 Einleitung 5 2.1 Epigenetische Mechanismen 5 2.2 Molekulare Grundlagen der DNA-Methylierung 5 2.3 Physiologische Bedeutung der DNA-Methylierung 7 2.4 Veränderungen der DNA-Methylierung und Krankheitsentstehung 8 2.5 Ziel der Untersuchungen zum Einfluss von Psychopharmaka und Antibiotika

auf die genomische DNA-Methylierung

11 3 Material und Methoden 13 3.1 Zellkultur 13 3.1.1 Material 13 3.1.2 Kultivierung von SH-SY5Y Zellen 14 3.1.3 Zytotoxizitätstests 15 3.1.4 Stimulation der SH-SY5Y Zellen 16 3.2 Messung der genomischen DNA-Methylierung 16 3.2.1 Material 18 3.2.2 DNA-Isolierung aus SH-SY5Y Zellen 19 3.2.3 Enzymatische Spaltung der DNA mittels Restriktionsendonukleasen 20 3.2.4 Fluoreszenzmarkierung mit Cy5-dCTP 20 3.2.5 Entfernung von überschüssigen Cy5-dCTP Nukleotiden 22 3.2.6 Bestimmung der DNA-Methylierung mittels Laserfluoreszenzmessung 22 3.3 Medikamente und Referenzsubstanzen 24 3.4 Statistische Methoden 25 4 Ergebnisse 26 4.1 Ergebnisse der Zytotoxizitätstests 26 4.2 Ergebnisse der Stimulationsversuche 28 4.2.1 Stimulation mit Referenzsubstanzen 28 4.2.2 Stimulation mit Mood-Stabilizern 30 4.2.3 Stimulation mit Neuroleptika 32 4.2.4 Stimulation mit Antidepressiva 35 4.2.5 Stimulation mit Antibiotika 37 5 Diskussion 39 5.1 Beurteilung der Stimulationen mit Referenzsubstanzen 39 5.2 Veränderung der DNA-Methylierung durch Mood-Stabilizer 40 5.3 Auswirkungen von Neuroleptika auf die genomische DNA-Methylierung 43 5.4 Beeinflussung der DNA-Methylierung durch Antidepressiva 44 5.5 Bewertung der DNA-Hypermethylierung nach Stimulation mit Antibiotika 46

6 Literaturverzeichnis 48 7 Abkürzungsverzeichnis 57 8 Abbildungsverzeichnis 59 9 Danksagung 61 10 Lebenslauf 63

1

1.1 Zusammenfassung

1.1.1 Hintergrund und Ziele

Epigenetische Mechanismen wie DNA-Methylierung spielen bei zahlreichen

physiologischen Prozessen, insbesondere bei der Regulation von Genexpression und

Stabilisierung der Chromatinstruktur, eine wichtige Rolle. Obwohl Veränderungen in den

Methylierungsmustern bei einer Vielzahl psychiatrischer Erkrankungen bekannt sind, ist

der epigenetische Einfluss von Medikamenten speziell von Psychopharmaka bis heute

kaum untersucht.

Ziel dieser Arbeit war es deshalb den Einfluss von Mood-Stabilizern (Carbamazepin, Lithium,

Valproinsäure), Neuroleptika (Haloperidol, Olanzapin, Quetiapin, Risperidon), Antidepressiva

(Amitriptylin, Fluoxetin, Tranylcypromin) und den beiden Antibiotika Cefotiam und

Ciprofloxacin auf die genomische DNA-Methylierung in Zellkultur zu prüfen. Als

Referenzsubstanzen dienten 5-Aza-2’-deoxycytidin, Methotrexat und S-Adenosyl-L-methionin.

1.1.2 Material und Methoden

In Zellkulturexperimenten wurden SH-SY5Y Neuroblastomzellen mit den oben genannten

Substanzen über 6 Stunden, 12 Stunden, 24 Stunden, 2 Tage und 5 Tage stimuliert, um

Methylierungsveränderungen im zeitlichen Verlauf zu erfassen. Geeignete Stimulations-

konzentrationen der einzelnen Substanzen wurden mit Hilfe eines MTT-Zellvitalitätstests

bestimmt.

Die Messung der genomischen Methylierung erfolgte mit einem modifizierten,

fluoreszenzmarkierten Cytosin-Elongationsassay, beruhend auf einem DNA-

Restriktionsverdau und einer anschließenden Fluoreszenzmarkierung mittels einer

Elongationsreaktion.

1.1.3 Ergebnisse und Beobachtungen

Bei den Referenzsubstanzen zeigte sich nach Behandlung mit 5-Aza-2’-deoxycytidin eine

signifikante, nahezu vollständige Demethylierung nach zwei Tagen (p = 0,024) und auch

bei Stimulation mit Methotrexat kam es innerhalb dieser Zeit zu einem signifikanten Abfall

der Methylierung (p = 0,005). Hingegen hatte die Stimulation mit S-Adenosyl-L-methionin

in den durchgeführten Versuchen keinen signifikanten Effekt auf die genomische DNA-

Methylierung (p = 0,140).

2

Die untersuchten Mood-Stabilizer Lithium (p = 0,007) und Valproinsäure (p = 0,030)

bewirkten eine signifikante Hypomethylierung, wobei unter Valproinsäure diese Reaktion

bereits innerhalb der ersten Stunden zu beobachten war, während bei Lithium ein

vergleichbarer Abfall der Methylierung nach 12 Stunden einsetzte. Die mit Carbamazepin

behandelten Zellen zeigten erst nach fünf Tagen eine Tendenz zur Hypomethylierung, die

aber nicht signifikant war (p = 0,084).

Bei den Neuroleptika hatte lediglich Risperidon einen signifikanten Einfluss im Sinne einer

verminderten DNA-Methylierung innerhalb der ersten zwei Tage (p = 0,006). Zwei weitere

getestete, atypische Neuroleptika Olanzapin (p = 0,246) und Quetiapin (p = 0,159) wiesen

ebenfalls die Tendenz zur Demethylierung auf, wenngleich dies keine Signifikanz

erreichte. Haloperidol als typisches Neuroleptikum veränderte während des gesamten

Versuchsverlaufs die genomische Methylierung nicht signifikant (p = 0,437).

Von den untersuchten Antidepressiva hatten sowohl das Trizyklikum Amitriptylin

(p < 0,001) als auch das SSRI Fluoxetin (p < 0,001) eine hoch signifikante,

hypomethylierende Wirkung; der MAO-Inhibitor Tranylcypromin beeinflusste den Grad

der DNA-Methylierung nicht signifikant (p = 0,183).

Die Antibiotika Cefotiam (p = 0,021) und Ciprofloxacin (p = 0,193) führten zu einer DNA-

Hypermethylierung, die allerdings nur bei Cefotiam ein signifikantes Niveau erreichte.

1.1.4 Praktische Schlussfolgerungen

Die Ergebnisse belegen, dass einige Psychopharmaka insbesondere Mood-Stabilizer,

Antidepressiva und in geringerem Ausmaß auch Neuroleptika epigenetische

Veränderungen in Form einer verringerten DNA-Methylierung bewirken können. Im

Hinblick auf mögliche pathologische Methylierungsmuster bei der Entstehung

psychiatrischer Erkrankungen eröffnet dies neue Therapieansätze und sollte daher weiter

untersucht werden. Außerdem sind zusätzliche genspezifische Analysen zum Einfluss von

Psychopharmaka auf die DNA-Methylierung (z.B. Dopamintransporter, serotonerge Gene)

notwendig, um möglicherweise pathophysiologische Zusammenhänge zu detektieren.

3

1.2 Summary

1.2.1 Background

Epigenetic mechanisms like DNA methylation are important for many physiological

processes especially for regulation of gene transcription and stabilization of chromatin

structure. Even though changes in the methylation pattern are known in many psychiatric

diseases the epigenetic influence of medications especially psychotropic drugs has hardly

been tested.

Therefore the aim of this study was to examine the effects of mood stabilizers

(carbamazepine, lithium, valproate), neuroleptics (haloperidol, olanzapin, quetiapine,

risperidone), antidepressants (amitriptyline, fluoxetine, tranylcypromine) as well as the two

antibiotics cefotiam and ciprofloxacin on genomic DNA methylation in cell culture. 5-Aza-

2’-deoxycytidine, methotrexate and S-Adenosyl-L-methionine served as reference

substances.

1.2.2 Material and methods

In cell culture SH-SY5Y neuroblastoma cells were stimulated with the substances

mentioned above for varying durations of 6 hours, 12 hours, 24 hours, 2 days and 5 days to

quantify alterations in genomic methylation. The appropriate substance concentrations for

stimulation were determined using a MTT cell viability assay.

Genomic DNA methylation was measured by a modified, fluorescent Cytosin elongation

assay based on a DNA restriction digestion and subsequent fluorescence labelling using an

elongation reaction.

1.2.3 Results

Treatment with the reference substance 5-Aza-2’-deoxycitidine showed a significant, nearly

complete demethylation after two days (p = 0,024) and likewise stimulation with

methotrexate lead to a significant decline of methylation (p = 0,005) within the same time.

Stimulation with S-Adenosyl-L-methionine had no significant effect on genomic DNA

methylation in the performed tests (p = 0,140).

The investigated mood stabilizers lithium (p = 0,007) and valproate (p = 0,030) caused a

significant hypomethylation. When using valproate hypomethylation set in within the first

hours, whereas when using lithium a comparable decrease of methylation began after

4

12 hours. Cells treated with carbamazepine did not show a tendency towards

hypometylation until the fifth day which was not significant (p = 0,084).

Among the neuroleptics merely risperidone had a significant influence in terms of a

reduced DNA methylation within the first two days (p = 0,006). Two more examined

atypical neurolepics olanzapine (p = 0,246) and quetiapine (p = 0,159) indicated a tendency

towards demethylation although to no significant level. Haloperidol as a conventional

neuroleptic had no significant impact on genomic methylation during the whole experiment

(p = 0,437).

Among the tested antidepressants the tricyclic antidepressant amitriptyline (p < 0,001) as

well as the SSRI fluoxetine (p < 0,001) showed highly significant hypomethylating

properties; the MAO inhibitor tranylcypromine however did not significantly affect the

degree of DNA methylation (p = 0,183).

The antibiotics cefotiam (p = 0,021) and ciprofloxacin (p = 0,193) lead to DNA

hypermethylation, though only cefotiam showed significant effects.

1.2.4 Conclusions

These findings indicate that several psychotropic drugs especially mood stabilizers,

antidepressants and to a lesser extent neuroleptics bring about epigenetic changes in the

form of lowered DNA methylation. With regard to potential pathological methylation

patterns in the development of psychiatric diseases this could disclose new therapeutic

approaches and therefore should be further investigated. Additional gene specific analyses

regarding the impact of psychotropic drugs on DNA methylation e.g. dopamine transporter

and serotonergic genes are necessary to detect possible pathophysiological correlations.

5

2 Einleitung

2.1 Epigenetische Mechanismen

Die Information über den Aufbau unseres gesamten Organismus ist durch die DNA und die

Abfolge ihrer vier Basen Adenin, Cytosin, Guanin und Thymin festgelegt. Dieser so

genannte genetische Code wird allerdings durch die Epigenetik entscheidend erweitert.

Unter Epigenetik versteht man all jene Mechanismen, die durch kovalente Modifikation der

DNA oder ihrer Hüllstrukturen zur einer Regulation der Genexpression beitragen, d.h.

Gene an- oder abschalten (Fuks, 2005). Zu diesen Mechanismen zählen Phosphorylierung

(Hake et al., 2004), Acetylierung (Grunstein, 1997; Struhl, 1998) und Methylierung

(Lachner und Jenuwein, 2002) von Histonen, den Verpackungsproteinen der DNA, sowie

direkte Methylierung der DNA (Doerfler, 1983). Epigenetische Veränderungen entstehen

unter anderem durch Wechselwirkung mit der Umwelt und werden, wie die genetische

Information selbst, an die Tochterzellen weitergegeben (Bird, 2002).

2.2 Molekulare Grundlagen der DNA-Methylierung

Die DNA-Methylierung fungiert als ein wichtiger Steuermechanismus in der

Zelldifferenzierung (Futscher et al., 2002). Nachdem mit Ausnahme der Keimzellen alle

Zellen eines Organismus identische genetische Information besitzen, muss im Rahmen von

Zelldifferenzierungsprozessen festgelegt werden, welche Gene exprimiert werden. Dies

geschieht durch Methylierung von Cytosinresten in CpG-Dinukleotidsequenzen, die als so

genannte CpG-Inseln vermehrt innerhalb von Promotoren und anderen regulatorischen

Einheiten liegen. Im Genom verteilte CpG-Inseln sind üblicherweise zu 70-80 % methyliert

(Ehrlich et al., 1982), wohingegen CpG-Inseln innerhalb der Promotorregionen von Genen

weniger Methylierung aufweisen (Abdolmaleky et al., 2004). Meist ist diese

Promotormethylierung mit einer Geninaktivierung assoziiert (Razin und Cedar, 1991; Kass

et al., 1997), weil hierdurch die Bindung von Transkriptionsfaktoren an die DNA

verhindert (Siegfried et al., 1999; Bird, 2002) und die Histonacetylierung sowie die

Chromatinstruktur verändert wird (Kass et al., 1997; Bestor, 1998). Eine korrekte

Basenpaarung von methyliertem Cytosin mit Guanin wird hingegen durch die

Methylierung nicht beeinflusst (Jones und Laird, 1999).

Für die DNA-Methylierung sind spezifische Enzyme, die DNA-Methyltransferasen

(DNMT), nötig. Dabei unterscheidet man de novo Methyltransferasen, die neue

Methylgruppen in die DNA einfügen, und Methyltransferasen, die bei der Zellteilung das

6

spezifische Methylierungsmuster der Zelle auf die Tochterzelle, d.h. den neu synthetisierten

DNA-Strang, übertragen.

Die de novo Methyltransferasen DNMT-3a und DNMT-3b synthetisieren Methylgruppen

an das C5-Atom des Pyrimidinrings von Cytosinbasen, wodurch 5’-Methylcytosin entsteht

(s. Abb. 2-1) (Okano et al., 1998, 1999; Hsieh 1999). Als Methylgruppendonator dient

dabei S-Adenosyl-L-methionin (Bestor und Verdine, 1994). Diese Form der Methylierung

von CpG-Inseln erfolgt orts- und zeitspezifisch gezielt auf bestimmte äußere Reize hin

(Weaver et al., 2004) und ist abhängig von der DNA-Sequenz, der Anzahl von Repeats und

der Struktur der umliegenden DNA (Bock et al., 2006).

N

NH

NH2

O

N

NH

NH2

O

CH3

CH3

Cytosin 5'-Methylcytosin

Methyltransferase DNMT-1,-3a, -3b

Abb. 2-1: Methylierung von Cytosin zu 5'-Methylcytosin

In der Mitose wird nach der Replikation das spezifische Methylierungsmuster der Zelle mit

Hilfe der Methyltransferase DNMT-1 identisch an die Tochterzellen weitergegeben (Yoder

et al. 1997; Bestor, 2000). Hierzu erkennt die Methyltransferase DNMT-1 zunächst die

hemimethylierten CpG-Sequenzen des neu synthetisierten DNA-Strangs und methyliert

anschließend auf semikonservative Weise die entsprechenden Cytosinreste (Schermelleh et

al., 2007). Die Bedeutung dieses Vorgangs zeigt sich daran, dass DNMT-1 Knockout-

Mäuse infolge der fehlenden Methylierung ihres Genoms sterben (Xu et al., 1999).

Über die Methyltransferase DNMT-2 ist bisher nur wenig bekannt. Sie ist im Gegensatz zu

den Methyltransferasen der Gruppe 1 und 3 nicht im Zellkern, sondern hauptsächlich im

Zytosol lokalisiert und unterscheidet sich außerdem von den oben beschriebenen DNA-

Methyltransferasen, indem sie ausschließlich tRNA methyliert (Goll et al., 2006).

7

2.3 Physiologische Bedeutung der DNA-Methylierung

Wie bereits festgestellt, interferiert DNA-Methylierung mit der Transkription der

assoziierten Gene und reguliert auf diese Weise die Genexpression. Hierfür sind zwei

verschiedene, biologisch relevante Mechanismen bekannt.

Zum einen beeinflussen Methylgruppen direkt die Bindung von Transkriptionsfaktoren an

die DNA. Ein Beispiel ist die Regulation des Insulin-like-Growth-Faktor-2 Gens (IGF-2),

wobei durch Imprinting das paternale Allel des IGF-2 methyliert ist (Li et al., 1993). Diese

Methylierung ermöglicht die Anlagerung des entsprechenden Enhancers, da der Enhancer-

blockierende Isolator CTCF nicht binden kann (Bell et al., 1999). Somit kann das paternale,

methylierte Allel transkribiert werden. Das maternale, unmethylierte Allel hingegen wird

nicht transkribiert, weil die Bindung des notwendigen Enhancers durch CTCF verhindert

wird (Bell und Felsenfeld, 2000; Hark et al., 2000).

Die zweite Möglichkeit der Genregulation durch DNA-Methylierung besteht in der

Anlagerung von methyl-CpG-bindenden Proteinen. Das erste Mitglied dieser

Proteinfamilie, die durch eine gemeinsame methyl-CpG-bindende Domäne (MBD)

gekennzeichnet ist, war MeCP-2 (Lewis et al., 1992). MeCP-2 bindet bereits einzelne

symmetrisch methylierte CpG-Sequenzen und hemmt über eine transkriptions-

unterdrückende Domäne die Expression des betroffenen Gens (Nan et al. 1997). Außerdem

bindet MeCP-2 auch Histondeacetylasen (HDAC), welche eine verminderte

Histonacetylierung und dadurch eine Kondensation des Chromatins bewirken (Nan et al.,

1998). Ein Defekt des MeCP-2 Gens hat eine entscheidende Bedeutung bei der Entstehung

des Rett-Syndroms, bei dem es aufgrund einer Mutation des Gens zur veränderten

Genregulation und vermehrten Expression verschiedener Gene kommt (Amir et al., 1999;

Klose und Bird, 2003).

Inzwischen wurden noch vier weitere Proteine der MBD-Familie mit zum Teil gleicher

Funktion entdeckt: MBD-1, MBD-2, MBD-3 und MDB-4 (Hendrich und Bird, 1998). Zwei

der MBD-Enzyme haben besondere Funktionen, die ebenfalls sehr eng mit der

DNA-Methylierung verknüpft sind. Das methyl-CpG-bindende Protein MBD-2 ist eine

aktive DNA-Demethylase und hat somit direkte Rückwirkungen auf die

DNA-Methylierung und damit auf die Genexpression (Bhattacharya et al., 1999; Cervoni

und Szyf, 2001). MBD-4 ist ein Reparaturenzym, welches Mutagenität von

5’-Methylcytosin beschränkt (Hendrich et al., 1999). Eine Desaminierung von

unmethyliertem Cytosin innerhalb von CpG-Sequenzen führt zu Uracil und einem UpG

Mismatch. Dieses kann durch die Uracil-Glykosylase erkannt und mit Cytosin ersetzt

werden. Die hydrolytische Desaminierung von 5’-Methylcytosin hingegen produziert

Thymin und hat demnach eine fehlerhafte TpG Basenpaarung innerhalb einer

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methyl-CpG x TpG Sequenz zur Folge. Die Ausbesserung dieser fehlerhaften

Basenpaarung kann durch Thymin-Glykosylase und durch MDB-4 erfolgen. Da MBD-4

vorzugsweise an methyl-CpG x TpG Sequenzen bindet, baut es die entsprechende Thymin-

Base sehr effizient aus diesen Abschnitten aus (Hendrich et al., 1999). Dadurch wird eine

höhere Mutagenität von CpG-Sequenzen gemindert (Hendrich et al., 1999).

Obwohl es durch Desaminierung von 5’-Methylcytosin zu Spontanmutationen kommen

kann, sichert die DNA-Methylierung die Integrität des Genoms, indem es Transposons und

Repeats methyliert (Garrick et al., 1998). Dadurch wird deren weitere Verbreitung im

Genom verhindert (Walsh et al., 1998). Außerdem kann sich das Genom durch DNA-

Methylierung vor fremder DNA wie beispielsweise vor Retroviren schützen (Walsh et al.,

1998).

Eine weitere Funktion der DNA-Methylierung ist die Inaktivierung eines der beiden

X-Chromosomen in weiblichen Körperzellen, die so genannte Lyonisierung (Panning und

Jaenisch, 1998). Weibliche Zellen enthalten zwei X-Chromosomen, männliche Zellen

hingegen nur ein X-Chromosom und das kleinere Y-Chromosom. Dadurch würden

X-chromosomale Gene, die keine homologe Entsprechung auf dem Y-Chromosom

besitzen, vermehrt in weiblichen Zellen exprimiert. Dies wird durch eine

Dosiskompensation mittels Methylierung entsprechender X-chromosomaler Gene

verhindert. Dabei erfolgt die Methylierung eines der beiden X-Chromosomen nach Zufall,

so dass in weiblichen Zellen ein X-chromosomales Mosaik mit größerer phänotypischer

Variabilität entsteht (Panning und Jaenisch, 1998).

2.4 Veränderungen der DNA-Methylierung und Krankheitsentstehung

Bisher konzentriert sich die Erforschung menschlicher Erkrankungen auf genetische

Ursachen, aber Störungen des Gleichgewichts epigenetischer Mechanismen können

ebenfalls schwerwiegende Krankheitsbilder zur Folge haben.

Das ICF-Syndrom (Immundefekt, Centromer-Instabilität und faziale Dysmorphien-

Syndrom) beispielsweise wird ausgelöst durch Mutationen im DNMT-3b Gen. DNMT-3b

ist, wie bereits erläutert, notwendig für de novo Methylierung der DNA und die Etablierung

von Methylierungsmustern (Okano et al., 1999). Eine Mutation dieses Gens führt zu einer

veränderten Architektur einiger Chromosomen und einer Instabilität der entsprechenden

Centromere (Ehrlich, 2003). Das klinische Erscheinungsbild des ICF-Syndrom ist

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gekennzeichnet durch eine ausgeprägte Immunschwäche, Anomalien des Gesichtsschädels

und eine gering ausgeprägte, geistige Retardierung (Ehrlich, 2003).

Aber nicht nur Störungen der DNA-Methylierung selbst, sondern auch nachgeschaltete

Schritte, wie eine falsche Interpretation der DNA-Methylierung durch methyl-CpG-

bindende Proteine, können zu epigenetischen Krankheiten führen. So sind

Keimbahnmutationen des MeCP-2 Gens die Ursache für das Rett-Syndrom, eine der

häufigsten Formen von geistiger Behinderung bei Mädchen (Amir et al., 1999). Die

Mutation von MeCP-2 beeinflusst dessen Bindung an methylierte DNA und ist mit einer

verminderten Suppression von Genen verbunden, die normalerweise durch DNA-

Methylierung vermittelt wird (Klose und Bird, 2003). Klinisch fallen die Mädchen nach

einer zunächst normalen Entwicklung bis zum 6.-18. Lebensmonat durch einen

zunehmenden Verlust erworbener sprachlicher und motorischer Fähigkeiten, eine Störung

der Gehirnentwicklung sowie eine sich entwickelnde geistige Behinderung auf (Bienvenu

und Chelly, 2006).

Weitere erbliche Syndrome wie das Angelmann- und Prader-Willi-Syndrom werden durch

fehlerhaftes Imprinting verursacht, welches üblicherweise zu monoallelen Genexpression

führt. Die genannten Erkrankungen entstehen aufgrund der fehlenden Kopie eines

mütterlichen oder väterlichen Gens, das durch Methylierung unterdrückt ist.

Das Angelmann-Syndrom wird durch ein pathologisches, maternales Imprinting der

chromosomalen Region 15q11-13 und einen Verlust der Genexpression des UBE3A Gens,

das die Ubiquitinierung von Proteinen katalysiert und damit eine wichtige Funktion im

Proteasomenkomplex hat, hervorgerufen (Nicholls et al., 1998). Beim Prader-Willi-

Syndrom besteht in der gleichen chromosomalen Region ein fehlerhaftes, paternales

Imprinting, worauf eine Fehlregulation zahlreicher Gene folgt (Nicholls et al., 1998). Beide

Syndrome gehen mit einer variabel ausgeprägten geistigen Behinderung und einer Vielzahl

anderer Symptome einher, die hier nicht näher ausgeführt werden sollen.

Eine entscheidende Rolle spielt die DNA-Methylierung außerdem in der Kanzerogenese.

Sowohl eine Hypomethylierung der Promotorregionen von Onkogenen als auch die

Hypermethylierung von Tumorsuppressorgenen sowie Punktmutationen von 5’-Methyl-

cytosin tragen zur Krebsentstehung bei (Jones und Laird, 1999). Für diese

Hypermethylierung von Tumorsuppressorgenen ist möglicherweise eine erhöhte Aktivität

von DNA-Methyltransferasen in neoplastischen Zellen verantwortlich (Baylin et al., 1998)

und für zahlreiche Krebserkrankungen konnte eine gesteigerte Promotormethylierung an

diesen Genen nachgewiesen werden.

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Beispielsweise ist bei der Mehrzahl der sporadischen Dickdarmkarzinome mit einer

Mikrosatelliteninstabilität der Promotor des Mismatch Reparaturenzyms MLH1

hypermethyliert, welches als Tumorsuppressorgen gilt (Herman et al., 1998). In Zellkultur

solcher Tumoren können die Expression von MLH1 und seine Funktion als

Reparaturenzym durch Demethylierung mit 5-Aza-2’-deoxycytidin wiederhergestellt

werden (Herman et al. 1998). Dies stützt die Hypothese, dass eine CpG-Hypermethylierung

das erste Ereignis in der Inaktivierung von MLH1 ist (Herman et al., 1998).

Auch viele hämatoonkologische Krankheitsbilder zeigen Veränderungen der DNA-

Methylierung. Bei Patienten mit akuter lymphatischer und akuter myeloischer Leukämie

(ALL und AML), sowie beim Myelodysplastischen Syndrom (MDS) und bei akuter

Promyelozyten Leukämie (APL) ist häufig das Tumorsuppressorgen P15INK4b

hypermethyliert, so dass nur eine verminderte Expression von p15 erfolgt (Herman et al.,

1996, 1997; Uchida et al., 1997). Der Tumorsuppressor p15 ist beteiligt an der Regulation

des Zellzyklus und verhindert den Übergang von der G0- in die G1-Phase, indem er an die

Cyclin-abhängige Kinase-4 (Cdk4) bindet und damit deren Interaktion mit Cyclin-D hemmt

(Teofili et al., 1998). Auf diese Weise wird ein unkontrolliertes Zellwachstum, wie das von

Tumorzellen, unterdrückt.

In der Therapie werden diese Erkenntnisse über den Einfluss der DNA-Methylierung bei

der Krebsentstehung zunehmend genutzt.

So wurde im Serum von Patienten mit nicht-kleinzelligem Bronchialkarzinom eine

Hypermethylierung von neoplasiespezifischen Genen gefunden (Esteller et al., 1999).

Dieses Screeningverfahren ist in den letzten Jahren für einige Malignome weiterentwickelt

worden (Kawakami et al., 2000; Grady et al., 2001) und wird in Zukunft die frühzeitige

Diagnostik von Tumoren und Rezidiven erleichtern.

Ebenso kann die DNA-Methylierung von Tumorzellen zur Einschätzung des Ansprechens

eines Malignoms auf eine bestimmte Chemotherapie dienen. So reagieren Gliome mit

einem hypermethyliertem MGMT Gen, das für ein DNA-Reparaturenzym kodiert, besser

auf die Therapie mit akylierenden Substanzen als Hirntumore bei denen dieses

Reparaturgen noch aktiv ist (Esteller et al., 2000).

Die Hypermethylierung von Tumorsuppressorgenen eröffnet außerdem neue, epigenetische

Therapieansätze. Ihr Ziel ist es, Tumorsuppressorgene durch Demethylierung der

entsprechenden Promotoren zu reaktivieren. Zwei Cytidin-Analoga, 5’-Azacytidin

(Vidaza®) und 5-Aza-2’-deoxycytidin (Dacogen®) wurden kürzlich für die Therapie des

Myelodysplastischen Syndroms von der U.S. Food and Drug Administration zugelassen

und verschiedene weitere Substanzen wie Procain, Procainamid und Zebularin werden

derzeit getestet (Ghoshal und Bai, 2007; Schneider-Stock und Ocker, 2007).

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Abschließend soll an dieser Stelle kurz am Beispiel der Alkoholabhängigkeit der Einfluss

von DNA-Methylierung bei psychiatrischen Krankheitsbildern erläutert werden.

Alkoholabhängige Patienten weisen im Vergleich zu gesunden Probanden eine verringerte

mRNA Expression der de novo Methyltransferasen DNMT-3a und DNMT-3b auf, die mit

einer genomischen DNA-Hypermethylierung verknüpft ist (Bönsch et al., 2006). Diese

Veränderungen scheinen nicht auf einer direkten Wirkungen des Alkohol zu beruhen,

sondern könnten vielmehr mit dem gestörten Methylierungsstoffwechsel und erhöhten

Homocystein-Plasmaspiegeln bei Alkoholikern zusammenhängen (Bleich et al., 2000,

2004, 2005; Bönsch et al., 2006).

Daneben wurde bei chronischem Alkoholkonsum auch eine Homocystein assoziierte

Hypermethylierung des HERP-Promotors und eine sich daraus ergebende verminderte

mRNA Expression von HERP beobachtet (Bleich et al., 2006). Das Genprodukt,

Homocystein-induziertes endoplasmatisches Retikulum Protein, wirkt an der Regulation

von Calciumsignalwegen mit und fördert so das Überleben neuronaler Zellen unter

Stressbedingungen (Chan et al., 2004), wie sie unter anderem durch die alkoholbedingte

Hyperhomocysteinämie auftreten (Bleich et al. 2004).

Bei Alkoholikern mit verstärktem Suchtdruck, so genanntem „obsessive craving“, wurde

außerdem eine erhöhte Expression von α-Synuclein auf mRNA- und Proteinebene

gefunden (Bönsch et al., 2004, 2005a). Zudem konnte eine Hypermethylierung im

Promotorbereich des α-Synuclein Gens bei diesen Patienten gezeigt werden (Bönsch et al.,

2005b). α-Synuclein ist auf vielfältige Weise an der dopaminergen Erregungsübertragung

im Gehirn beteiligt (Perez et al., 2002), welche wiederum ein entscheidender Faktor für das

Suchtverlangen ist (Self, 1998).

2.5 Ziel der Untersuchungen zum Einfluss von Psychopharmaka und Antibiotika auf

die genomische DNA-Methylierung

Trotz dieser Erkenntnisse über gestörte DNA-Methylierung bei psychiatrischen

Erkrankungen wurden die epigenetischen Wirkungen von Psychopharmaka bisher nicht

systematisch analysiert. Ziel dieser Arbeit war es deshalb, ein Zellkulturmodell für die

Untersuchung des Einflusses dieser Substanzen auf die genomische DNA-Methylierung in

neuronalen Zellen zu etablieren und die Effekte verschiedener Mood-Stabilizer

(Carbamazepin, Lithium, Valproinsäure), Neuroleptika (Haloperidol, Olanzapin, Quetiapin,

Risperidon) und Antidepressiva (Amitriptylin, Fluoxetin, Tranylcypromin) zu prüfen. Da es

zahlreiche Daten gibt, die zeigen, dass Antibiotika zu psychotischen Störungen führen

können (Jackson und Berkovic, 1992; Hollweg et al., 1997; McDonald et al., 2003),

12

wurden ferner das Cephalosporin Cefotiam und der Gyrasehemmer Ciprofloxacin

untersucht.

Ein besseres Verständnis darüber, welche epigenetischen Modifikationen durch diese

Medikamente hervorgerufen werden, könnte außerdem dazu beitragen, deren

Wirkmechanismus besser zu verstehen und für psychiatrische Erkrankungen ähnlich wie in

der Krebsbehandlung diagnostische Verbesserungen bzw. gezielte epigenetische Therapien

zu entwickeln.

13

3 Material und Methoden

3.1 Zellkultur

3.1.1 Material

Die nachfolgenden Tabellen liefern eine Übersicht der in der Zellkultur verwendeten

Materialien und Geräte. Nicht sterile Materialen und Substanzen wurden vor Gebrauch

autoklaviert oder steril filtriert (Hiclave HV-85).

Tab. 3-1:

Produkt Hersteller D-(+)-Glucose (Bestellnr. G8270)

Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim

Dimethylsulfoxid DMSO C2H6SO, ≥ 99,5% (Bestellnr. A994.1)

Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe

Dulbecco’s Modified Eagle Medium mit 1,0 g/l Glucose, mit L-Glutamin, ohne NaHCO3 (Bestellnr. T041-05)

Biochrom AG, Berlin

Dulbecco’s PBS (Bestellnr. 28374)

Pierce Biotechnology Inc., Rockford, IL

Eppendorfcups Safe Lock 1,5 ml (Bestellnr. 0030120.086) 2,0 ml (Bestellnr. 0030120.094)

Eppendorf AG, Hamburg

Kälberserum (Newborn) (Bestellnr. S 0120)

Biochrom AG, Berlin

Penicillin/Streptomycin 10.000 E/10.000 µg/ml (Bestellnr. A 2212)

Biochrom AG, Berlin

Serologische Pipetten 5 ml (Bestellnr. 94005) 10 ml (Bestellnr. 94010) 25 ml (Bestellnr. 94024)

Techno Plastic Products AG, Trasadingen

SH-SY5Y Cell Line Human Neuroblast from neural tissue Lot # 03C021, 12. Passage (Bestellnr. 94030304)


Spritzenfilter 4,5 cm2 Filterfläche mit PES-Membran, 0,22 µm Porengröße (Bestellnr. 99722)


Thiazolyl blue (MTT) [3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide] (Bestellnr. 15655-1)

Biomol GmbH, Hamburg

(10x) Trypsin/EDTA-Lösung (0,5%/0,2%) in (10x) PBS, ohne Ca2+, Mg2+ (Bestellnr. L 2153)

Biochrom AG, Berlin

14

Produkt Hersteller Zellkulturflaschen 25 cm2, Filterverschluss (Bestellnr. 90026) 75 cm2, Filterverschluss (Bestellnr. 90076) 150 cm2, Filterverschluss (Bestellnr. 90151) (die jeweiligen Filter besitzen eine Membran mit 0,22 µm Porengröße)


Zellkulturtestplatten 96-Well flacher Boden mit 0,31 cm2 Wachstumsfläche (Bestellnr. 92096)


Zellschaber 13 mm (Bestellnr. 99002)


Tab. 3-2:

Geräte Hersteller Accu-Jet pro (Bestellnr. 26300)

Brand GmbH, Wertheim

Eppendorf Centrifuge 5415R (Bestellnr. 5426000.018)


Eppendorf Research Pro Mehrkanalpipette 8-Kanal Pipette, 5-100 µl (Bestellnr. 4860000.534)


Gilson Pipetman P P2 0,2-2 µl (Bestellnr. F144801) P20 2-20 µl (Bestellnr. F123600) P100 10-100 µl (Bestellnr. F123615) P200 20-200 µl (Bestellnr. F123601) P1000 100-1000 µl (Bestellnr. F123603)

Gilson Inc., Middleton, WI

Heraeus HERAsafe Sicherheitswerkbank HSPC 18 (Bestellnr. 50073279)

Kendro Laboratory Products GmbH, Langenselbold

Heraeus Heracell CO2 Inkubator (Bestellnr. 51013569)


Heraeus Biofuge pico (Bestellnr. 75003280)


Hiclave HV-85 Autoclav Hirayama Manufacturing Corproation, Saitama, Japan

Leica DMIL Mikroskop Type 090-135.001 I/02

Leica Microsystems GmbH, Bernsheim

Microplate Reader Benchmark Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA

Schüttler Typ 3006 (Bestellnr. 3006)

Gesellschaft für Labortechnik GmbH, Burgwedel

3.1.2 Kultivierung von SH-SY5Y Zellen

Für alle durchgeführten Experimente wurden Zellen der humanen Neuroblastomzelllinie

SH-SY5Y verwendet. Es handelt sich hierbei um eine dreifach geklonte Subzelllinie

(SK-N-SH � SH-SY � SH-SY5 � SH-SY5Y) der SK-N-SH Neuroblastomzelllinie, die

1970 aus einer Knochenmetastase etabliert wurde (Biedler et al., 1973). Die Zellen

wachsen einschichtig und adhärent, weisen eine epitheliale Morphologie auf und

15

exprimieren entsprechend ihrem neuronal-sympathischen Ursprung Dopamin-β-

Hydroxylase sowie Glutamat-Decarboxylase (Ross et al., 1983).

Die Zellen wurden in einem Nährmedium bestehend aus Dulbecco’s Modified Eagle

Medium versetzt mit 10 % hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum, 1,75 g Glucose,

100 U/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin bei 37 °C in einer Atmosphäre von 5 %

CO2 und 100 % Luftfeuchtigkeit kultiviert.

3.1.3 Zytotoxizitätstests

Die Toxizität der untersuchten Substanzen auf SH-SY5Y Zellen wurde mittels eines MTT-

Vitalitätstest bestimmt (Mosmann, 1983). Dieser basiert auf der Ringspaltung des

wasserlöslichen, schwach gelben Tetrazoliumsalzes Methylthiazolyldiphenyl-

tetrazoliumbromid durch mitochondriale Dehydrogenasen lebender Zellen zum

wasserunlöslichen, dunkelblauen Formazan. Das Formazan wiederum wird durch das

organische Lösungsmittel DMSO in Lösung gebracht und photometrisch bei 570 nm

quantifiziert.

Die Zellen wurden mit einer Dichte von 5,0 × 104 Zellen/cm2 auf 96-Well Platten (Techno

Plastic Products AG) ausgesät und bis zu einer Konfluenz von 70 % kultiviert. Für den

Vitalitätstest wurde das Nährmedium durch ein Inkubationsmedium mit zunehmenden

Konzentrationen der getesteten Substanz ersetzt, und die Zellen für 48 Stunden inkubiert.

Anschließend wurde die Hälfte des Inkubationsmediums durch eine Reaktionslösung

bestehend aus 60 % frischem Nährmedium und 40 % MTT-Lösung (5 mg MTT/ml PBS)

ersetzt, so dass sich eine Endkonzentration von 100 µg MTT pro Well ergab. Nach einer

Inkubationszeit von einer Stunde wurde das gesamte Medium entfernt. Die entstandenen

Kristalle wurden mittels 100 µl DMSO/Well auf einem Schüttler (GFL GmbH) für

5 Minuten bei 300 rpm gelöst und die Lichtabsorption bei einer Wellenlänge 570 nm und

einer Referenzwellenlänge von 630 nm mittels eines Microplate Reader (Benchmark, Bio-

Rad Laboratories Inc.) quantifiziert. Alle Toxizitätstests wurden sechsfach durchgeführt

und bei jedem Test wurden sowohl unbehandelte Kontrollen als auch gegebenenfalls

Kontrollen mit 1 % DMSO als Lösungsmittel der Testsubstanz mitgeführt, um mögliche

Effekte dieses Lösungsmittels auszuschließen. Die Auswertung erfolgte mit der Software

Mircoplate Manager 5.1 und Microsoft Excel 2007.

16

Für die nachfolgende Zellstimulation wurde jeweils die Substanzkonzentration gewählt, bei

der verglichen mit unbehandelten Kontrollen mindestens noch ein Zellwachstum von 80 %

vorhanden war.

3.1.4 Stimulation der SH-SY5Y Zellen

Die Zellen wurden jeweils in einer Dichte von 3,5 x 104 Zellen/cm2 in 75 cm2 Flaschen

gesplittet und über einen Zeitraum von 6 Stunden kultiviert. Zur Stimulation wurde das

gesamte Medium durch ein Inkubationsmedium mit der entsprechenden Konzentration der

jeweiligen Substanz ersetzt (s. Tab. 3-3). Nach der jeweiligen Inkubationszeit (6 Stunden,

12 Stunden, 24 Stunden, 2 Tage, 5 Tage) wurde das Inkubationsmedium abgenommen und

die Zellen wurden zweifach mit 5 ml PBS gewaschen. Die adhärenten Zellen wurden

anschließend mittels eines Zellschabers vom Flaschenboden gelöst, in PBS aufgenommen

und bei 500 g für 5 Minuten zentrifugiert (Heraeus Biofuge pico). Das so erhaltene

Zellpellet wurde im Anschluss unmittelbar bei minus 20 °C eingefroren.

Tab. 3-3:

Substanz Stimulationskonzentration Amitriptylin 10 µM 5-Aza-2’-deoxycytidin 100 µM Carbamazepin 100 µM Cefotiam 100 µM Ciprofloxacin 100 µM Fluoxetin 1 µM Haloperidol 10 µM Lithium 100 µM Methotrexat 20 nM Olanzapin 10 µM Quetiapin 5 µM Risperidon 100 µM S-Adenosyl-L-methionin 100 µM Tranylcypromin 1 µM Valproinsäure 500 µM

3.2 Messung der genomischen DNA-Methylierung

Die Messung der genomischen DNA-Methylierung erfolgte in Anlehnung an Pogribny et

al. (1999) mit einem modifizierten, nicht-radioaktiven Cytosin-Elongationsassay (Bönsch

et al., 2004).

Das Prinzip dieses Assay beruht auf einem DNA-Verdau mit den isoschizomeren

Restriktionsenzymen Hpa II und Msp I. Hierzu wird die zu untersuchende DNA-Probe in

17

zwei jeweils gleich große Proben aufgeteilt, wovon eine mit Hpa II und die andere mit

Msp I weiterbehandelt wird. Diese beiden Enzyme erkennen 5’-CCGG-3’ Sequenzen in der

DNA und können sie an den Phosphosäurediesterbindungen abhängig von der

Methylierung des Cytosin C* hydrolytisch an 5’-CC*GG-3’spalten. Msp I katalysiert

diese Reaktion unabhängig von der Methylierung des Cytosin C*, wohingegen Hpa II

durch die Methylierung gehemmt wird.

Bei diesem Restriktionsverdau entstehen sowohl mit Hpa II als auch mit Msp I

überstehende 5’-CGG-3’ Enden, so genannte sticky ends, die in einer Elongationsreaktion

mit fluoreszierendem Cytosin markiert werden können. Da das fluoreszierende Cytosin

dabei kovalent in die DNA eingebaut wird, können ungebundene Cytosinnukleotide

anschließend abgetrennt werden. Die Fluoreszenz eingebauter Cytosinnukleotide in beiden

Proben wird schließlich mittels eines Laser Imagers gemessen.

Die Bestimmung der genomischen DNA-Methylierung erfolgt über den Vergleich der

Fluoreszenz der mit Hpa II geschnittenen DNA-Probe mit der korrespondierenden mit

Msp I behandelten DNA-Probe über den Quotienten der Messwerte: 1 - (Hpa II / Msp I).

Diese Berechnung beruht darauf, dass Msp I alle 5’-CCGG-3’ Sequenzen schneidet, Hpa II

hingegen nur unmethylierte Sequenzen, so dass sich aus dem Quotienten Hpa II/ Msp I der

Anteil unmethylierter DNA-Abschnitte errechnet.

Die folgende Abbildung 3-1 verdeutlicht das Prinzip des Cytosin-Elongationsassay.

Restriktionsverdau mit Msp I: Restriktionsverdau mit Hpa II:

5'- C C* 5'- C C*

* C C * C C

C C* C C* C C * C

Markierung mit Cy5-dCTP: Markierung mit Cy5-dCTP:

C C C C* C C C* C C C C C C * C

C* : methyliertes CytosinC: Cyanin 5-Cytosin (Fluorochrom)

Abb. 3-1: Prinzip des Cytosin-Elongationsassay

18

3.2.1 Material

Die nachfolgenden Tabellen liefern eine Übersicht der zur Messung der genomischen

Methylierung verwendeten Materialien und Geräte.

Tab. 3-4:

Produkt Hersteller Cy™5-dCTP Konzentration: 500µM (Bestellnr. 27-2692-01)

GE Healthcare, Freiburg

Dulbecco’s PBS (Bestellnr. 28374)

Pierce Biotechnology Inc., Rockford, IL

MultiScreen Filter Plates mit Ultracell-10 Membran (Bestellnr. MAUF 010 02) 10 000 Dalton nominal molecular weight limit

Millipore, Billercia, MA

Multi ’96 Well PCR Tubes (Bestellnr. 81-21970)

PeqLab Biotechnologie GmbH, Erlangen

SupraTherm Polymerase (Bestellnr. GC-022-0100) 5000 U/ml (geliefert in 10mM K-Phosphat, 100mM NaCl, 0,5mM EDTA, 1mM DTT, 0,01% Tween 20, 50% Glycerol) Enzym stammt aus Thermus aquaticus Polymerase Puffer (bestehend aus 160mM (NH4)SO4, 670mM Tris-HCl (pH 8,8), 15mM MgCl2, 0,1% Tween 20)

GeneCraft GmbH, Lüdinghausen

Thin Seal (Bestellnr. STR-THIN-PLT)

Excel Scientific Inc., Wrightwood, CA

QIAamp DNA Blood Mini Kit (Bestellnr. 51304)

Qiagen GmbH, Hilden

Restriktionsendonuklease Hpa II (Bestellnr. R0171L) 10000 U/ml (geliefert in 50mM KCl, 10mM Tris-HCl (pH 7,4), 0,1mM EDTA, 1mM Dithiothreitol, 200µg/ml BSA und 50% Glycerin) Enzym wird durch E. Coli hergestellt, die mit dem HPA II Gen aus Haemophilus parainfluenzae kloniert wurden. NEB Buffer 1 (bestehend aus 10mM Bis-Tris-Propan-HCl, 10mM MgCl2, 10mM Dithiothreitol, pH 7,0 bei 25°C)

New England Biolabs Inc., Ipswich, MA

Restriktionsendonuklease Msp I (Bestellnr. R0106L) 20000 U/ml (geliefert in 50mM KCl, 10mM Tris-HCl (pH 7,4), 0,1mM EDTA, 1mM Dithiothreitol, 200µg/ml BSA und 50% Glycerin) Enzym wird durch E. Coli hergestellt, die mit dem MSP I Gen aus Moraxella kloniert wurden. NEB Buffer 2 (bestehend aus 50mM NaCl, 10mM Tris-HCl, 10mM MgCl2, 1mM Dithiothreitol, pH 7,9 bei 25°C)

New England Biolabs Inc., Ipswich, MA

19

Tab. 3-5:

Geräte Hersteller Eppendorf Research Pro Mehrkanalpipette 8-Kanal Pipette, 5-100 µl (Bestellnr. 4860000.534)


Eppendorf Thermomixer comfort (Bestellnr. 5355000.011)


Eppendorf Zentrifuge 5415R (Bestellnr. 5426000.018)


Gilson Pipetman P P2 0,2-2 µl (Bestellnr. F144801) P20 2-20 µl (Bestellnr. F123600) P100 10-100 µl (Bestellnr. F123615) P200 20-200 µl (Bestellnr. F123601) P1000 100-1000 µl (Bestellnr. F123603)

Gilson Inc., Middleton, WI

Heraeus Inkubator Function Line B12 (Bestellnr. 50042307)


Heraeus Multifuge 3s Kendro Laboratory Products GmbH, Langenselbold

iCycler Thermal Cycler Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA

Laboport Vakuumpumpe KNF Neuberger GmbH, Freiburg Molecular Imager Pharos FX Bio-Rad Laboratories Inc.,

Hercules, CA Schüttler Typ 3006 (Bestellnr. 3006)

Gesellschaft für Labortechnik GmbH, Burgwedel

Vortex Mixer (Bestellnr. 7-2020)

neoLab Migge Laborbedarf-Vertriebs GmbH, Heidelberg

3.2.2 DNA-Isolierung aus SH-SY5Y Zellen

Die Isolierung der DNA aus den SH-SY5Y Zellen erfolgte mittels QIAamp DNA Blood

Mini Kit (Qiagen GmbH) nach dem mitgelieferten Protokoll.

Zunächst wurden die Zellpellets in Eppendorf Cups bei Raumtemperatur aufgetaut und mit

PBS auf ein Gesamtvolumen von 200 µl resuspendiert. Dieser Zellsuspension wurden 20 µl

Poteinase K (Aktivität > 600 µl/ml) und 200 µl Puffer AL (Lysis Buffer) zugegeben und

die Proben 15 Sekunden lang mit einem Vortex gemischt. Anschließend wurden die Proben

zur enzymatischen Zelllyse für 10 Minuten bei 56 °C im Thermomixer (Eppendorf AG)

inkubiert. Nach der Lyse wurden 200 µl Ethanol 96 % zugegeben und die Proben nochmals

15 Sekunden mit dem Vortex gemischt.

Zur Aufreinigung wurden die Proben auf Purifikationssäulen (QIAamp Spin Column)

überführt, für 1 Minute bei 6 000 g zentrifugiert (Eppendorf Zentrifuge 5415R) und der

Durchfluss verworfen. Die verwendeten Säulen besitzen eine Silca-Gel Membran, die in

Anwesenheit von chaotropischen Salzen DNA bindet, Proteine und andere Zellbestandteile

20

hingegen durchfließen lässt. So wird bei dieser ersten Zentrifugation die DNA der Proben

an die Säulen adsorbiert.

In einem ersten Waschschritt wurden 500 µl Puffer AW1 (Washing Buffer 1) auf die

Säulen gegeben und für 1 Minute bei 6 000 g zentrifugiert. Für den zweiten Waschschritt

wurden 500 µl Puffer AW2 (Washing Buffer 2) auf die Säulen gegeben und für 3 Minuten

bei 13 000 g zentrifugiert. Der Durchfluss wurde jeweils verworfen.

Zur Elution der DNA aus den Säulen wurden diese für 1 Minute mit 200 µl Puffer AE

(Elution Buffer) inkubiert. Unter diesen salzarmen Bedingungen wurde die DNA

schließlich durch einminütiges Zentrifugieren bei 6 000 g aus den Säulen ausgewaschen.

Mit dieser Methode konnten ca. 12 µg DNA aus einem Zellpellet entsprechend einer

Konzentration von 60 ng/µl extrahiert werden.

3.2.3 Enzymatische Spaltung der DNA mittels Restriktionsendonukleasen

Der Restriktionsverdau erfolgte mit den Restriktionsenzymen Hpa II und Msp I (New

England Biolabs Inc.) in einer 96 Well PCR-Platte. Da die verwendeten Enzyme

temperaturempfindlich sind, wurden alle Arbeitsschritte auf Eis pipettiert.

Für jede DNA-Probe wurde jeweils ein Reaktionsansatz mit Hpa II und ein weiterer mit

Msp I gemacht. Dazu wurden zunächst je 80 µl DNA pro Reaktionsansatz in einer 96 Well

PCR-Platte vorgelegt und anschließend jeweils als Master-Mix 10 µl NEB Buffer 1 und

5 µl Hpa II (≙ 50 Units) bzw. 10 µl NEB Buffer 2 und 5 µl Msp I (≙ 100 Units) hinzu

pipettiert. Die 96 Well PCR-Platte wurde mit selbstklebender Folie (Excel Scientific Inc.)

verschlossen und für 20 Sekunden bei 2 000 g zentrifugiert (Heraeus Multifuge 3s).

Anschließend wurden die Proben entsprechend dem Aktivitätsmaximum der Enzyme bei

37 °C für 4 Stunden in einem Inkubator (Heraeus Function Line B12) inkubiert. Um einen

vollständigen Verdau der DNA zu sicherzustellen, wurden nach dieser ersten Inkubation

nochmals 5 µl der entsprechenden Enzyme zugegeben und die Proben bei 37 °C über Nacht

inkubiert.

3.2.4 Fluoreszenzmarkierung mit Cy5-dCTP

Die Fluoreszenzmarkierung der durch den Restriktionsverdau entstandenen sticky ends

erfolgte mittels einer Elongationsreaktion unter Einsatz des Fluoreszenzfarbstoffs

21

Cy5-dCTP (GE Healthcare). Der Farbstoff ist ein aktiviertes Cytosinnukleotid, welches das

eigentliche Fluorochrom Cyanin-5 gebunden hat (s. Abb 3-2).

N

SO3-C

H3

CH3

N+

CH3CH3

O3-S

CH3

NH O

NO

O

OH

P

O-

O

O

OH

O-

O

O

P

O

O-

P

N

NH2

NH2

O

Abb. 3-2: Fluoreszenzfarbstoff Cy5-dCTP

Cy5-Fluorochrom

Aktiviertes Cytosinnukleotid

Hallo

Die für die Elongationsreaktion verwendete SupraTherm Polymerase (GeneCraft GmbH)

und der Fluoreszenzfarbstoff sind temperaturempfindlich, folglich wurden wiederum alle

Arbeitsschritte auf Eis durchgeführt.

Um eine Doppelbestimmung der Proben zu ermöglichen, wurden die Reaktionsansätze von

100 µl aus dem DNA-Verdau in zwei Ansätze von je 40 µl aufgeteilt. Dazu wurden die

Proben in eine neue 96 Well PCR-Platte übertragen. Für die Fluoreszenzmarkierung wurde

zu diesen Reaktionsansätzen 6 µl Master-Mix pro Well, bestehend aus je 1 µl 1:50

verdünntem Cy5-dCTP, 0,5 µl (≙ 2,5 Units) Polymerase und 4,5 µl Polymerase Puffer,

hinzu gegeben. Zur Bestimmung eines Hintergrunds bei der Fluoreszenzmessung wurden

zusätzlich zwei Cy5-Kontrollen aus je 40 µl H2O dd und 6µl Master-Mix in die Platte

pipettiert.

Anschließend wurde die PCR-Platte mit einer selbstklebenden Folie (Excel Scientific Inc.)

verschlossen und für 20 Sekunden bei 2 000 g zentrifugiert (Heraeus Multifuge 3s). Die

Elongationsreaktion erfolgte mit Hilfe eines Thermocyclers (Bio-Rad Laboratories Inc.) für

1 Stunde bei 56 °C.

22

3.2.5 Entfernung von überschüssigen Cy5-dCTP Nukleotiden

Überschüssige, ungebundene Cy5-dCTP Nukleotide wurden aus den Proben mit einer

MultiScreen Filterplatte mit Ultracel-10 Membran (Millipore) entfernt. Diese besitzt eine

Zellulose-Membran, deren Porengröße nur eine Passage von Molekülen

< 10 000 Dalton erlaubt. So werden die markierten DNA-Fragmente bei der Filtration

zurückgehalten, während die ungebundenen Cy5-dCTP Nukleotide mit einem

Molekulargewicht von 1145 Dalton und Puffersalze durchfließen.

Für diese 96 Well Plattenaufreinigung wurden je 40 µl der Proben sowie 40 µl der

Hintergrund-Kontrollen auf die Filterplatte übertragen. Zur Überprüfung der ausreichenden

Auswaschung von Cy5-dCTP Nukleotiden wurden außerdem zwei H2O-Kontrollen

gleichen Volumens mitgeführt und die gesamte Platte für 15 Minuten mit einer

Vakuumpumpe (Laboport, KNF Neuberger GmbH) bei 500 mb filtriert. Um eine optimale

Auswaschung der Cy5-dCTP Nukleotide sicherzustellen, wurden die Proben und

Kontrollen anschließend zweimal mit 50 µl H2O dd pro Well für 15 Minuten und einmal

mit 100 µl H2O dd pro Well für 30 Minuten bei 500 mb filtriert.

Zur Lösung der DNA-Fragmente von der Filtermembran wurden 100 µl H2O dd pro Well

zugegeben und die Filterplatte für 10 Minuten bei 300 rpm mit einem Schüttler (GFL

GmbH) geschüttelt.

Wegen der hohen Lichtempfindlichkeit des Fluoreszenzfarbstoffs wurde während aller

Arbeitsschritte die Filterplatte mit Alufolie abgedeckt.

3.2.6 Bestimmung der DNA-Methylierung mittels Laserfluoreszenzmessung

Die Fluoreszenz der Proben und Kontrollen wurde mit einem Molecular Imager Pharos FX

(Bio-Rad) bestimmt. Der Fluoreszenzfarbstoff wurde dazu mit einem externen Laser bei

einer Welllänge von 633 nm angeregt und zeitgleich wurde die Fluoreszenz durch einen

Scanner bei einer Wellenlänge von 680 nm gemessen.

23

100

80

60

40

20

500 600 700 800

Flo

ures

zenz

[%

]

Wellenlänge [nm]

Abb. 3-3: Anregungs- und Emissionswellenlänge von Cy5

Emission

Anregung

XX

XX

Für die Messung wurde die MultiScreen Filterplatte direkt im Imager platziert. Zur

Auswertung wurden Quantity One 4.3.0 (Bio-Rad Laboratories Inc.) und Microsoft Excel

2007 verwendet. Dabei wurden mittels des „Volume Circle Tool“ die Proben innerhalb des

gescannten Bereichs markiert und die Messwerte in Excel exportiert. Die Überprüfung der

ausreichenden Auswaschung von Cy5-dCTP Nukleotiden aus den Proben erfolgte über den

Vergleich der H2O-Kontrollen mit den Cy5-Hintergrund-Kontrollen.

Nach Subtraktion des Leerwerts, der sich aus dem Mittelwert der Cy5-Kontrollen ergab,

wurde die genomische Methylierung der Proben über folgende Formel bestimmt:

Hpa II-Fluoreszenz

1 - x 100 % Msp I-Fluoreszenz

Dabei gibt der Messwert der mit Msp I geschnittenen Probe die absolute Anzahl aller darin

enthaltenen CpG-Inseln wieder, da Msp I sowohl die methylierten wie auch die

unmethylierten Sequenzen schneidet. Der Messwert der mit Hpa II geschnittenen Probe

hingegen zeigt nur die Anzahl der unmethylierten Sequenzen an. Somit ergibt sich aus dem

Verhältnis von Hpa II-Fluoreszenz zu Msp I-Fluoreszenz der Anteil der nicht methylierten

CpG-Abschnitte. Die prozentuale Methylierung der DNA-Probe resultiert dann aus der

Subtraktion dieses Anteils nicht methylierter Sequenzen von 1 und anschließender

Multiplikation mit 100.

24

3.3 Medikamente und Referenzsubstanzen

Die nachfolgende Tabelle liefert eine Übersicht über die verwendeten Medikamente und

Substanzen, sowie die jeweils verwendeten Lösungsmittel. Nach dem Lösen wurden die

Substanzen mit einem Spritzenfilter (Techno Plastic Products AG) steril filtriert.

Tab. 3-5:

Substanz Hersteller Lösungsmittel Amitriptyline hydrochloride CAS # 549-18-2, Lot # 52K1317 (Bestellnr. A8404)


H2O

5-Aza-2’-deoxycytidine CAS # 2353-33-5 (Bestellnr. A3656)


DMSO

Carbamazepine CAS # 298-46-4, Lot # 093K1545 (Bestellnr. C4024)


DMSO

Cefotiam CAS # 61622-34-2

Grünenthal GmbH, Aachen (auf Anfrage bezogen)

H2O

Ciprofloxacin CAS # 85721-33-1 (Bestellnr. 17850-5G-F)


H2O

Fluoxetine hydrochloride CAS # 59333-67-4, Lot # 082K1601 (Bestellnr. F132)


DMSO

Haloperidol CAS # 52-86-8, Lot # 022K1599 (Bestellnr. H1512)


DMSO

Lithium carbonate CAS # 554-13-2, Lot # 15912CA (Bestellnr. 255823)


H2O

Methotrexate CAS # 59-05-2, Lot # 044K07351 (Bestellnr. M9929)


DMSO

Olanzapine CAS # 132539-06-1, Lot # 061735

Eil Lilly, Indianapolis, IN (auf Anfrage bezogen)

DMSO

Quetiapine CAS # 111974-69-7

Astra Zeneca, Cheshire, UK (auf Anfrage bezogen)

DMSO

Risperidone CAS # 106266-06-2, Lot # ZR064766PUA171

Janssen Pharmaceutica, Tilburg, NL (auf Anfrage bezogen)

DMSO

S-(5’-Adenosyl)-L-methionine chloride CAS # 24346-00-7, Lot # 052K7045 (Bestellnr. A7007)


H2O

trans-2-Phenylcylopropylamine hydrochloride Syn.:Tranylcypromine CAS # 1986-47-6, Lot # 072K3677 (Bestellnr. P8511)


H2O

Valproic acid sodium salt CAS # 1069-66-5, Lot # 035K0862 (Bestellnr. P4543)


H2O

25

3.4 Statistische Methoden

Die statistische Analyse der Daten erfolgte mit SPSSTM 14.0 für Windows (SPSS Inc.,

Chicago, IL).

Die Normalverteilung der Messwerte wurde mit einem Kolmogorov-Smirnov-Test geprüft

und quantitative Unterschiede wurden bei vorliegender Normalverteilung anschließend

mittels eines zweiseitigen T-Tests analysiert. Das Signifikanzniveau wurde mit α= 0,05

festgelegt.

26

4 Ergebnisse

4.1 Ergebnisse der Zytotoxizitätstests

Ziel der Zytotoxizitätstests war die Festlegung geeigneter Konzentrationen

unterschiedlicher Substanzen für die Stimulation von SH-SY5Y Zellen. Hierfür wurden die

Substanzkonzentrationen gewählt, bei denen verglichen mit unbehandelten Kontrollen

mindestens noch ein Zellwachstum von ca. 80 % vorhanden war.

Abbildung 4-1 zeigt das Ergebnis der MTT-Tests unter Carbamazepinstimulation, wobei

hier für jede Konzentration der Mittelwert aus jeweils 6 Messungen sowie die

Standardabweichung dargestellt ist. Das Zellüberleben der unbehandelten SH-SY5Y Zellen

(Kontrolle) wurde auf 100 % standardisiert und alle Messwerte entsprechend normiert. Die

1 % DMSO-Kontrolle diente der Überprüfung des toxischen Effekts des Lösungsmittels.

XXXXXXXX

0

20

40

60

80

100

120

1 mM 500 µM 100 µM 10 µM 1 µM 100 nM 10 nM 1 nM 1% DMSO Kontrolle

Lithium

Stimulationskonzentration

Zel

lüb

erle

ben

[%

]

Abb. 4-1: MTT-Test mit Carbamazepin

Der Test zeigt einen eindeutigen Anstieg der Zytotoxizität bei Carbamazepin-

konzentrationen über 100 µM, während bei 100 µM noch ein Zellwachstum von 79 %

besteht. Bei der 1 % DMSO-Kontrolle ist noch ein Zellwachstum von 92 % vorhanden, so

dass der wachstumshemmende Effekt bei der Konzentration von 100 µM Carbamazepin

und einer entsprechenden Konzentration von 0,1 % DMSO auf das Carbamazepin

zurückzuführen ist. Dementsprechend wurde für Carbamazepin eine Stimulations-

konzentration von 100 µM festgelegt.

27

Analog wurden die Ergebnisse der MTT-Tests für alle weiteren Substanzen ausgewertet,

auf deren Abbildung hier verzichtet wird. Zusammenfassend sind die resultierenden

Stimulationskonzentrationen in Tabelle 4-1 dargestellt.

Tab. 4-1:

Substanz Stimulationskonzentration Amitriptylin 10 µM 5-Aza-2’-deoxycytidin 100 µM Carbamazepin 100 µM Cefotiam 100 µM Ciprofloxacin 100 µM Fluoxetin 1 µM Haloperidol 10 µM Lithium 100 µM Methotrexat 20 nM Olanzapin 10 µM Quetiapin 5 µM Risperidon 100 µM S-Adenosyl-L-methionin 100 µM Tranylcypromin 1 µM Valproinsäure 500 µM

28

4.2 Ergebnisse der Stimulationsversuche

Die hier dargestellten Ergebnisse der Stimulationsversuche ergeben sich aus je mindestens

vier unabhängigen Experimenten. Bei den mitgeführten Kontrollen kam es im

Versuchsverlauf zu keinen nennenswerten Schwankungen, so dass auf deren Abbildung

hier verzichtet werden kann.

4.2.1 Stimulation mit Referenzsubstanzen

Die Stimulation der SH-SY5Y Zellen mit den Referenzsubstanzen 5-Aza-2’-deoxycytidin,

Methotrexat und S-Adenosyl-L-methionin diente zur Evaluation des hier angewendeten

Zellkulturmodells für die Untersuchung der Wirkung verschiedener Pharmaka auf die

DNA-Methylierung. Dabei ist bei 5-Aza-2’-deoxycytidin und Methotrexat eine deutliche

Hypomethylierung (Jones und Taylor, 1980) und bei S-Adenosyl-L-methionin eine

Hypermethylierung (Detich et al., 2003b) zu erwarten.

Die Stimulation mit 5-Aza-2’-deoxycytidin führte nach zwei Tagen zu einer signifikanten

(t = 4,210, p = 0,024), fast vollständigen Demethylierung von anfangs 54 % auf schließlich

23 % (s. Abb. 4-2).

Auch unter Stimulation mit Methotrexat kam es zu einer signifikanten Hypomethylierung

(t = 7,222, p = 0,005) innerhalb der ersten zwei Tage, wobei die Methylierung von anfangs

73 % auf 58 % und bis zum fünften Tag weiter auf 48 % sank (s. Abb. 4-3).

Bei der Stimulation mit S-Adenosyl-L-methionin zeigte sich über fünf Tage hinweg kein

signifikanter Effekt auf die DNA-Methylierung (t = 1,992, p = 0,140) (s. Abb. 4-4).

29

XXXXXXXX

0 Stunden 6 Stunden 12 Stunden 24 Stunden 2 Tage

Quetiapin

10

20

30

40

50

60

70

0

80

90

100

Stimulationsdauer

Met

hyl

ieru

ng

[%]

Abb. 4-2: Stimulation mit 5-Aza-2'-deoxycytidin

Quetiapin

6 Stunden 12 Stunden 24 Stunden 2 Tage 5 Tage0 Stunden

10

20

30

40

50

60

70

0

80

90

100

Stimulationsdauer

Met

hyl

ieru

ng

[%]

Abb. 4-3: Stimulation mit Methotrexat

XXXXXXXX

30

Quetiapin


10

20

30

40

50

60

70

0

80

90

100

Stimulationsdauer

Met

hyl

ieru

ng

[%]

Abb. 4-4: Stimulation mit S-Adenosyl-L-methionin

XXXXXXXX

4.2.2 Stimulation mit Mood-Stabilizern

Bei der Behandlung mit den Mood-Stabilizern Carbamazepin, Lithium und Valproinsäure

ergab sich bei Valproinsäure unmittelbar und bei Lithium schon nach 24 Stunden eine

kontinuierliche Hypomethylierung. Unter Carbamazepin zeigte sich nach fünf Tagen eine

vergleichbare Tendenz zu verminderter DNA-Methylierung.

Bei den mit Valproinsäure behandelten Zellen setzte ein hypomethylierender Effekt

innerhalb der ersten Stunden ein, und insgesamt sank die genomische DNA-Methylierung

signifikant (t = 3,916, p = 0,030) um 18 % von anfangs 58 % auf schließlich 40 % nach

fünf Tagen (s. Abb. 4-5).

Auch bei Lithium kam es nach 24 Stunden zu einer vergleichbaren Demethylierung, die

sich bis zum fünften Tag fortsetzte (s. Abb. 4-6). Dieser Abfall um insgesamt 15 % von

77 % nach 6 Stunden auf 62 % nach fünf Tagen war mit p = 0,007 (t = 5,054) signifikant.

Der Vergleich zwischen der Methylierung zu Versuchsbeginn von 77 % und der

Methylierung nach fünf Tagen von 62 % erreichte aufgrund der großen Streuung der

Messwerte bei Versuchsbeginn keine Signifikanz (t = 1,802, p = 0,115).

Die Tendenz zur Hypomethylierung bei Carbamazepin äußerte sich erst nach fünf Tagen

mit einem Abfall der Methylierung von zunächst 71 % auf schließlich 59 % (s. Abb. 4-7),

31

allerdings zeigte diese Entwicklung keine Signifikanz, jedoch nahezu einen signifikanten

Trend (t = 2,016, p = 0,084).

Quetiapin


10

20

30

40

50

60

70

0

80

90

100

Stimulationsdauer

Met

hyl

ieru

ng

[%]

Abb. 4-5: Stimulation mit Valproinsäure

XXXXXXXX

Quetiapin


10

20

30

40

50

60

70

0

80

90

100

Stimulationsdauer

Met

hyl

ieru

ng

[%]

Abb. 4-6: Stimulation mit Lithium

XXXXXXXX

32

Quetiapin


10

20

30

40

50

60

70

0

80

90

100

Stimulationsdauer

Met

hyl

ieru

ng

[%]

Abb. 4-7: Stimulation mit Carbamazepin

XXXXXXXX

4.2.3 Stimulation mit Neuroleptika

Die Stimulationen mit dem typischen Neuroleptikum Haloperidol und den drei atypischen

Neuroleptika Olanzapin, Quetiapin und Risperidon ergaben lediglich für Risperidon

signifikante Ergebnisse.

Unter der Behandlung mit Risperidon verringerte sich die Methylierung von anfangs 68 %

auf 55 % nach zwei Tagen und stieg schließlich wieder auf 61 % am fünften Tag an (s.

Abb. 4-8). Dabei hatte die Hypomethylierung nach zwei Tagen bezogen auf den

Versuchsbeginn eine Signifikanz von p = 0,006 (t = 4,099).

Während der Stimulation mit Haloperidol war die genomische DNA-Methylierung

weitgehend konstant und zeigte innerhalb der fünftägigen Stimulation keine signifikante

Veränderung (t = 0,894, p = 0,437) (s. Abb. 4-9).

Bei der Stimulation mit Olanzapin (s. Abb. 4-10) und Quetiapin (s. Abb. 4-11) ergab sich

eine geringe Tendenz zur Hypomethylierung, die allerdings weder für Olanzapin (t = 1,413,

p = 0,246) noch für Quetiapin (t = 1,607, p = 0,159) signifikant war.

33

Quetiapin


10

20

30

40

50

60

70

0

80

90

100

Stimulationsdauer

Met

hyl

ieru

ng

[%]

Abb. 4-8: Stimulation mit Risperidon

XXXXXXXX

Quetiapin


10

20

30

40

50

60

70

0

80

90

100

Stimulationsdauer

Met

hyl

ieru

ng

[%]

Abb. 4-9: Stimulation mit Haloperidol

XXXXXXXX

34

Quetiapin


10

20

30

40

50

60

70

0

80

90

100

Stimulationsdauer

Met

hyl

ieru

ng

[%]

Abb. 4-10: Stimulation mit Olanzapin

XXXXXXXX

Quetiapin


10

20

30

40

50

60

70

0

80

90

100

Stimulationsdauer

Met

hyl

ieru

ng

[%]

Abb. 4-11: Stimulation mit Quetiapin

XXXXXXXX

35

4.2.4 Stimulation mit Antidepressiva

Die Stimulationen mit den Antidepressiva Amitriptylin, Fluoxetin und Tranylcypromin

ergaben für Amitriptylin und Fluoxetin eine signifikante Verminderung der DNA-

Methylierung, bei Tranylcypromin hingegen kam es zu keiner wesentlichen Veränderung.

Amitriptylin führte trotz Schwankungen im Verlauf zu einer hoch signifikanten

Hypomethylierung (t = 26,981, p < 0,001) um insgesamt 19 % von 58 % zu Versuchs-

beginn auf schließlich 39 % nach fünf Tagen (s. Abb. 4-12). Die Schwankungen der

Methylierung bei Amitriptylin während des Versuchsverlaufs erklären sich durch die

relativ hohe Streuung der einzelnen Messwerte zu den Zeitpunkten 6 Stunden, 12 Stunden

und 24 Stunden.

Bei Fluoxetin kam es während des gesamten Versuchs zu einer kontinuierlichen Abnahme

der DNA-Methylierung um 19 % von anfangs 51 % auf schließlich 32 % (s. Abb. 4-13).

Diese war mit p < 0,001 (t = 20,401) ebenfalls hoch signifikant.

Der MAO-Inhibitor Tranylcypromin hatte im gesamten Verlauf keinen signifikanten

Einfluss auf die genomische DNA-Methylierung (t = 1,725, p = 0,183) (s. Abb. 4-14).

Quetiapin


10

20

30

40

50

60

70

0

80

90

100

Stimulationsdauer

Met

hyl

ieru

ng

[%]

Abb. 4-12: Stimulation mit Amitriptylin

XXXXXXXX

36

Quetiapin


10

20

30

40

50

60

70

0

80

90

100

Stimulationsdauer

Met

hyl

ieru

ng

[%]

Abb. 4-13: Stimulation mit Fluoxetin

XXXXXXXX


Quetiapin

10

20

30

40

50

60

70

0

80

90

100

Stimulationsdauer

Met

hyl

ieru

ng

[%]

Abb. 4-14: Stimulation mit Tranylcypromin

XXXXXXXX

37

4.2.5 Stimulation mit Antibiotika

Die Stimulation mit Antibiotika ergab für Cefotiam eine signifikante Hypermethylierung

(t = -4,457, p = 0,021) um 22 % nach 6 Stunden von zunächst 37 % auf maximal 59 %. Im

weiteren Versuchsverlauf fiel die genomische Methylierung von diesem Höchstwert nach

6 Stunden kontinuierlich bis auf 40 % zu Versuchsende ab (s. Abb. 4-15).

Obwohl bei den Versuchen mit Ciprofloxacin ebenfalls ein Trend zur Hypermethylierung

zu beobachten war (s. Abb. 4-16), ergab sich während des gesamten Versuchsverlaufs

aufgrund der relativ großen Streuung der Messwerte kein signifikanter Zusammenhang

(t = -1,671, p = 0,193).

XXXXXXXX


Quetiapin

10

20

30

40

50

60

70

0

80

90

100

Stimulationsdauer

Met

hyl

ieru

ng

[%]

Abb. 4-15: Stimulation mit Cefotiam

38


Quetiapin

10

20

30

40

50

60

70

0

80

90

100

Stimulationsdauer

Met

hyl

ieru

ng

[%]

Abb. 4-16: Stimulation mit Ciprofloxacin

XXXXXXXX

39

5 Diskussion

5.1 Beurteilung der Stimulationen mit Referenzsubstanzen

Zur Evaluation des hier angewendeten SH-SY5Y-Zellkulturmodells für die Untersuchung

der Wirkung verschiedener Pharmaka auf die genomische DNA-Methylierung wurden die

Zellen zunächst mit den Referenzsubstanzen 5-Aza-2’-deoxycytidin, Methotrexat und

S-Adenosyl-L-methionin stimuliert. Dabei ist bei 5-Aza-2’-deoxycytidin und Methotrexat

eine deutliche Hypomethylierung, bei S-Adenosyl-L-methionin eine Hypermethylierung zu

erwarten: Von dem Cytidin-Analogon 5-Aza-2’-deoxycytidin ist seit längerem bekannt,

dass es in Zellkultur zu DNA-Hypomethylierung, sowie zu gesteigerter Genexpression,

Dekondensation von Chromatin und Veränderungen in der Zelldifferenzierung führt (Jones

und Taylor, 1980). Indem 5-Aza-2’-deoxycytidin eine kovalente Bindung mit der DNA-

Methyltransferase DNMT-1 eingeht, kommt es im Zellkern zu einer Verringerung der

entsprechenden Enzymaktivität und damit zellzyklusabhängig zu einer verminderten DNA-

Methylierung (Santi et al., 1984; Jüttermann et al., 1994).

Auch in dem hier verwendeten Zellkulturmodell hatte 5-Aza-2’-deoxycytidin nach

12 Stunden Stimulation eine deutliche Hypomethylierung zur Folge, die sich bis zum

Versuchsende kontinuierlich fortsetzte. Diese Hypomethylierung ist abhängig von der

Inaktivierung von DNMT-1 durch eine dauerhafte Bindung an 5-Aza-2’-deoxycytidin,

welches in Folge einer DNA-Replikation in einen neu synthetisierten DNA-Strang

eingebaut wird (Jüttermann et al., 1994). Deshalb benötigt es mindestens eine Zellteilung,

bis der Effekt sichtbar wird, was sich ebenfalls bei den hier durchgeführten Stimulationen

bestätigte.

Bei Methotrexat handelt es sich um einen Folsäure-Antagonisten, der kompetitiv das

Enzym Dihydrofolat-Reduktase inhibiert und dadurch die Umwandlung von

Dihydrofolsäure in Tetrahydrofolsäure verhindert (Lambie und Johnson, 1985).

Tetrahydrofolsäure ist ein wichtiger Methylgruppendonator und als Kofaktor an der

Reaktion von S-Adenosyl-L-homocystein zu S-Adenosyl-L-methionin beteiligt. Über die

Verminderung dieses Methylgruppendonators Tetrahydrofolsäure und damit auch von

S-Adenosyl-L-methionin führt Methotrexat schließlich zu einer DNA-Demethylierung

(Varela-Moreiras et al., 1995; Alonso-Aperte und Varela-Moreiras, 1996; Kishi et al.,

2000).

Bei den Stimulationsversuchen mit Methotrexat ließ sich diese DNA-Hypomethylierung

ebenfalls im SH-SY5Y-Zellkulturmodell reproduzieren. Da es sich bei Methotrexat im

Gegensatz zu 5-Aza-2’-deoxycytidin wahrscheinlich nicht um einen zellzyklusabhängigen

40

Prozess handelt, war der kontinuierliche Abfall der Methylierung bereits schon innerhalb

der ersten 6 Stunden zu beobachten.

Der Methylgruppendonator S-Adenosyl-L-methionin induziert über eine Inhibierung der

DNA-Demethylase MBD-2 eine dosisabhängige DNA-Hypermethylierung (Detich et al.,

2003b). Verantwortlich für diese Interaktion ist die Methylgruppe des S-Adenosyl-L-

methionin, die mit dem aktiven Zentrum des Enzyms in Wechselwirkung tritt (Detich et al.,

2003b).

Bei der Stimulation mit S-Adenosyl-L-methionin im hier verwendeten Zellkulturmodell

veränderte sich die genomische DNA-Methylierung über den gesamten Versuchsverlauf

hinweg nicht wesentlich und eine DNA-Hypermethylierung ließ sich nicht reproduzieren.

Die Ursache dafür könnte eine unzureichende Konzentration von S-Adenosyl-L-methionin

in den Zellen sein. S-Adenosyl-L-methionin ist insbesondere bei physiologischen pH-

Werten und Temperaturen nicht stabil (Detich et al., 2003b). Zudem wurde aufgrund der

Toxizität in den hier durchgeführten Stimulationsversuchen mit SH-SY5Y Zellen

S-Adenosyl-L-methionin in einer wesentlich niedrigeren Konzentration (100 µM)

zugegeben, als bei den Experimenten mit humanen, embryonalen Nierenzellen HEK-293

von Detich (8 mM).

Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass das vorliegende SH-SY5Y-

Zellkulturmodell sich für die Untersuchung des Einflusses von Pharmaka auf die

genomische DNA-Methylierung, insbesondere für die Testung von hypomethylierenden

Substanzen, eignet.

5.2 Veränderung der DNA-Methylierung durch Mood-Stabilizer

Mood-Stabilizer werden hauptsächlich in Therapie von affektiven Störungen insbesondere

bei Bipolarer Störung und Borderline Persönlichkeitsstörung eingesetzt. Die meisten

Mood-Stabilizer, mit Ausnahme von Lithium, sind Antikonvulsiva und haben, abgesehen

von Lamotrigin, überwiegend einen Einfluss auf manische Phasen und

Stimmungsumschwünge. Sie wirken über einen Ausgleich exzitatorischer und

inhibitorischer Signaltransduktion im Gehirn (Jope, 1999). Von den im Rahmen dieser

Arbeit verwendeten Substanzen Valproinsäure, Carbamazepin und Lithium ist bekannt,

dass Valproinsäure hauptsächlich zu einer Verstärkung der inhibitorischen, GABAergen

Neurotransmission beiträgt, wohingegen Carbamazepin und Lithium eine Verminderung

der exzitatorischen, glutamatergen Signaltransduktion zur Folge haben (Jope, 1999;

Landmark, 2007). Ferner beeinträchtigt Lithium auch intrazelluläre Signaltransduktions-

41

wege und die neuronale Genexpression unter anderem bei zahlreichen Proteinkinase-C

gesteuerten Genen (Jope, 1999; Lenox und Wang, 2003). Der genaue Wirkmechanismus

dieser Mood-Stabilizer bei Bipolarer Störung ist dennoch gegenwärtig ungeklärt (Harwood

und Agam, 2003).

Deswegen wurde im Rahmen dieser Arbeit untersucht, auf welche Weise die Mood-

Stabilizer Carbamazepin, Lithium und Valproinsäure die genomische DNA-Methylierung

in neuronalen Zellen beeinträchtigen.

Die Ergebnisse zeigen, dass zumindest Lithium und Valproinsäure innerhalb von fünf

Tagen zu einer signifikanten DNA-Hypomethylierung führen, wobei der demethylierende

Effekt von Valproinsäure schon innerhalb der ersten Stunden einsetzt, wohingegen bei

Lithium erst nach 12 Stunden ein vergleichbarer Abfall beginnt. Auch Carbamazepin hatte

eine ähnliche Tendenz zu verminderter DNA-Methylierung nach fünf Tagen.

Damit bestätigen die Stimulationsversuche mit Valproinsäure neuere Studien, die daraufhin

weisen, dass Valproinsäure durch eine vermehrte Histonacetylierung eine DNA-

Hypomethylierung induziert.

Bei Patienten, die unter Schizophrenie oder Bipolarer Störung leiden, konnte gezeigt

werden, dass das Reelin Gen herab reguliert und weniger exprimiert wird (Guidotti et al.,

2000). Dieses Gen ist in neuronalen Vorläuferzellen methyliert und spielt eine

entscheidende Rolle bei der Zelldifferenzierung und Ausbildung von Synapsen (Rice und

Curran, 2001). In Zellkultur mit SH-SY5Y Zellen konnte weiterhin nachgewiesen werden,

dass die Behandlung eines in-vitro methylierten Promotors des Reelin Gens mit

Valproinsäure dessen Genexpression induziert (Chen et al., 2002). Auch eine durch

L-Methionin hervorgerufene Hypermethylierung des Reelin- und GAD67-Promotors, die

im Maus-Modell zu Schizophrenie ähnlichem Verhalten führt, konnte durch eine

Demethylierung mit Valproinsäure rückgängig gemacht werden (Tremolizzo et al., 2002,

2005). Da die gleichzeitige Gabe von Valproinsäure den Wirkungseintritt von Neuroleptika

bei Schizophrenie-Patienten beschleunigen kann (Casey et al., 2003), sollte in diesem

Zusammenhang auch die klinische Anwendung von Valproinsäure bei schizophrenen

Psychosen nachgedacht werden.

Die durch Valproinsäure vermittelte Demethylierung ist ein aktiver Prozess und ist nicht

das Resultat fehlender DNA-Methyltransferase Aktivität nach vorausgegangener DNA-

Replikation (Detich et al., 2003a), sondern wird durch vermehrte Histonacetylierung

hervorgerufen (Cervoni und Szyf, 2001; Cervoni et al., 2002). Dabei wird davon

ausgegangen, dass Valproinsäure durch Inhibition von Histondeacetylasen (HDAC) zu

verstärkter Histonacetylierung führt (Göttlicher et al. 2001; Phiel et al., 2001) und dies die

42

Zugänglichkeit der DNA für Demethylasen erhöht (Detich et al., 2003a). Diese aktive

Demethylierung wird durch das methyl-CpG-bindende Domäne Protein MBD-2 vermittelt,

welches sowohl in-vitro (Bhattacharya et al., 1999) wie auch in Zellkultur (Cervoni und

Szyf, 2001; Detich et al. 2002) aktiv DNA demethyliert.

Neuste Studien an dauerhaft durch DNA-Methylierung supprimierten Genen bestätigen

diesen dynamischen Zusammenhang zwischen Histonhyperacetylierung und DNA-

Demethylierung und belegen, dass Valproinsäure zu stabilen Veränderung zuvor

methylierter Gene führen kann (Milutinovic et al., 2007).

Auch bei Carbamazepin könnte es sich bei der hier beobachteten Hypomethylierung um

einen sekundären Prozess handeln, welcher durch eine vermehrte Histonacetylierung

vermittelt wird. In einem Zellkulturmodell mit HepG2-Zellen resultierte die Inkubation mit

Carbamazepin in der Hyperacetylierung von Histon H4 (Beutler et al., 2005). In-vitro

konnte weiterhin nachgewiesen werden, dass Carbamazepin Klasse I und II HDAC

inhibiert (Beutler et al., 2005). Es ist deshalb plausibel, anzunehmen, dass Carbamazepin

über den gleichen Mechanismus wie Valproinsäure eine aktive DNA-Demethylierung

bewirkt.

Der demethylierende Effekt von Carbamazepin könnte allerdings durch die im Rahmen

dieser Arbeit durchgeführten Stimulationsversuche noch unterbewertet sein. Carbamazepin

scheint nur unzuverlässig in DMSO löslich zu sein und zeigte in Hydroxypropyl-β-

cyclodextin gelöst eine weitaus stärkere Hemmung von HDAC als Valproinsäure (Beutler

et al., 2005).

Auf welche Weise Lithium zu einer DNA-Hypomethylierung führt, ist bislang nicht

bekannt. Lithium beeinflusst über verschiedene Signaltransduktionswege die

Genexpression (Lenox und Wang, 2003). In welchem Umfang hierbei auch epigenetische

Modifikationen wie DNA-Hypomethylierung eine Rolle spielen könnten, muss noch

genauer analysiert werden.

Somit beweisen die hier dargestellten Ergebnisse, dass die Mood-Stabilizer Valproinsäure,

Lithium und Carbamazepin in neuronalen Zellen eine deutliche DNA-Hypomethylierung

bewirken. Vor dem Hintergrund der pathologischen Hypermethylierung verschiedener

Gene bei Bipolarer Störung und Schizophrenie könnte diese Hypomethylierung zur

Wirkung dieser Medikamente bei der Behandlung der genannten Erkrankungen beitragen

und sollte deshalb neben weiteren Experimenten in Zellkultur auch am Tiermodell

ausführlicher untersucht werden.

43

5.3 Auswirkungen von Neuroleptika auf die genomische DNA-Methylierung

Neuroleptika werden in der Behandlung von psychotischen Störungen eingesetzt und

beugen dem erneuten Auftreten akuter psychotischer Phasen vor. Ihre Wirkung beruht auf

einem direkten und indirekten Einfluss auf das dopaminerge System und einer Blockade

von Dopaminrezeptoren im Gehirn (Garver, 2006). Zusätzlich interagieren Neuroleptika

auch mit den Rezeptoren für Noradrenalin, Serotonin, Acetylcholin und Histamin.

Obwohl eine vermehrte Expression von DNMT-1 in neuronalen Zellen (Veldic et al., 2005)

und epigenetische Veränderung wie DNA-Hypermethylierung (Guidotti et al., 2000) bei

Patienten mit Psychosen bekannt sind, wurde der Einfluss von Neuroleptika auf die DNA-

Methylierung bisher nicht systematisch erforscht. Ziel dieser Arbeit war es daher sowohl

das typische Neuroleptikum Haloperidol als auch drei weitere atypische Neuroleptika

Olanzapin, Quetiapin und Risperidon bezüglich ihres Effekts auf die genomische DNA-

Methylierung zu untersuchen.

Die Stimulationen mit Risperidon ergaben eine signifikante Verringerung der DNA-

Methylierung, die nach zwei Tagen am stärksten ausgeprägt war. Auch Olanzapin und

Quetiapin hatten die Tendenz zur Hypomethylierung, die aber keine Signifikanz erreichte.

Haloperidol hatte als einziges der getesteten Neuroleptika keine wesentlichen

Auswirkungen auf die genomische DNA-Methylierung.

Studien zu Chromatinremodeling durch D2-Rezeptorantagonisten haben ergeben, dass

Risperidon eine stabile Zunahme der Histon H3 Phosphoacetylierung und Histon H4

Acetylierung in strialen Neuronen bewirkt (Li et al., 2004). Daraus wiederum resultiert eine

weniger kondensierte Chromatinstruktur (Li et al., 2004), welche ihrerseits, wie bereits

dargestellt, eine aktive DNA-Demethylierung durch MDB-2 ermöglichen könnte.

Da die gesteigerte Histonacetylierung durch Risperidon eine Folge der Blockade von

D2-Rezeptoren ist (Li et al., 2004), scheint es nahe liegend, dass auch Olanzapin und

Quetiapin über diesen Mechanismus zu einer Histonhyperacetylierung und somit

verminderter DNA-Methylierung führen könnten. Gegen diese Annahme spricht allerdings,

dass es während der Stimulation mit Haloperidol, welches ebenfalls eine hohe

neuroleptische Potenz besitzt, zu keiner Veränderung gekommen ist. Um diesen

Widerspruch zu klären, müssen die epigenetischen Effekte der Neuroleptika, speziell von

Risperidon, und deren Zusammenspiel eingehender analysiert werden.

Ferner sollte der direkte Einfluss von Risperidon, Olanzapin und Quetiapin auf die DNA-

Methyltransferasen und auf den Methylstoffwechsel genauer betrachtet werden, um den

Mechanismus, über den es zur Hypomethylierung durch diese Pharmaka kommt, zu

44

entschlüsseln. Hierzu liegen bisher noch keine Daten vor, aber sowohl eine Inhibierung von

DNA-Methyltransferasen als auch eine Störung des Methylstoffwechsels könnten

möglicherweise eine verringerte Methylierung schlüssig begründen.

Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass Risperidon, Olanzapin und Quetiapin eine

DNA-Hypomethylierung in neuronalen Zellen hervorrufen können. Inwieweit dies die

Folge einer D2-Rezeptorblockade und subsequenter Histonhyperacetylierung ist, oder über

einen anderen Mechanismus vermittelt wird, ist Gegenstand weiterer Forschungen. Das

ebenfalls untersuchte Neuroleptikum Haloperidol führte bei den hier durchgeführten

Experimenten zu keinen Veränderungen der DNA-Methylierung.

5.4 Beeinflussung der DNA-Methylierung durch Antidepressiva

Antidepressiva werden seit langem erfolgreich für die Therapie von Depressionen

eingesetzt, wenngleich ihr Wirkmechanismus noch nicht vollständig verstanden ist (Nestler

et al., 2002). Die Sofortwirkung durch Antidepressiva besteht in einer Erhöhung der

Neurotransmitter Serotonin, Noradrenalin und Dopamin im synaptischen Spalt, welche

durch die Hemmung der Rezeptoren für deren Wiederaufnahme oder durch die Hemmung

ihres Abbaus durch Monoaminoxidase vermittelt wird. Die Behandlung mit vielen

Antidepressiva erfordert allerdings eine längerfristige Anwendung bis ein therapeutischer

Effekt eintritt, was darauf hindeutet, dass hierfür neurophysiologische Anpassungsprozesse

notwendig sind (Newton und Duman, 2006). An dieser neuronalen Adaption scheinen

insbesondere epigenetische Mechanismen, die zu einer dauerhaften Regulation der

Genexpression führen, beteiligt zu sein (Newton und Duman, 2006). Diese Annahme wird

weiter unterstützt durch neuere Daten, die darauf hinweisen, dass Antidepressiva über

gesteigerte Genexpression die Konzentration neuronaler Wachstumsfaktoren im Gehirn

erhöhen und so eine bei depressiven Patienten beobachtete Zellatrophie im limbischen

System und im Kortex rückgängig machen (Tanis et al., 2007).

Im Gegensatz zu Histonveränderungen sind die Auswirkungen von Antidepressiva auf

genomische sowie genspezifische DNA-Methylierung bislang nicht erforscht. Im Rahmen

dieser Arbeit wurde deshalb der Effekt des trizyklischen Antidepressivums Amitriptylin,

des SSRI Fluoxetin und des MAO-Inhibitors Tranylcypromin auf die genomische DNA-

Methylierung untersucht.

Die Stimulation mit Amitriptylin und Fluoxetin hatte nach fünf Tagen eine hoch

signifikante (p < 0,001) DNA-Hypomethylierung zur Folge. Über welchen Mechanismus es

zu dieser deutlichen Veränderung der genomischen DNA-Methylierung kommt, ist nicht

45

klar. Möglicherweise könnten dabei ebenfalls Veränderungen der Chromatinstruktur durch

eine vermehrte Histonacetylierung eine Rolle spielen.

In einem Mausmodell für Depression wurden unter anderem Histonmodifikationen und

Veränderungen der Chromatinstruktur in hippokampalen Neuronen unter chronisch-

sozialem Stress und unter Behandlung mit dem Trizyklikum Imipramin untersucht

(Tsankova et al., 2006). Dies Mausmodell basiert auf einer 10 Tage andauernden

Exposition der Test-Mäuse gegenüber einem überlegenen Aggressor, bei dem das

anschließende Interaktions- und Vermeidungsverhalten der Test-Mäuse gegenüber dem

Aggressor als Maß für depressives Verhalten dient (Tsankova et al., 2006). In diesem

Modell zeigte sich, dass die Behandlung mit Imipramin die Auswirkungen des chronisch-

sozialen Stresses auf das Verhalten der Mäuse rückgängig machen kann und zu einer

verminderten Expression von Histondeacetylase-5 mRNA sowie zu Hyperacetylierung von

Histon H3 führt (Tsankova et al., 2006). Die vermehrte Histonacetylierung bewirkte

ihrerseits eine geöffnete Chromatinstruktur und damit eine verstärkte Genexpression des

Brain-Derived Neurotropic Factor (BDNF) (Tsankova et al., 2006). Auf diese Weise

könnte auch das strukturell sehr ähnliche Trizyklikum Amitriptylin eine geöffnete

Chromatinstruktur durch Histonhyperacetylierung hervorrufen und somit aufgrund einer

verbesserten Zugänglichkeit der DNA zu einer aktiven Demethylierung durch MBD-2

führen.

Über die Veränderung der DNA-Methylierung unter der Einwirkung von Fluoxetin wurden

bisher keine Daten publiziert. Dennoch ist bekannt, dass Fluoxetin im Rattenmodell

verschiedene epigenetische Modifikationen wie eine gesteigerte Expression von MeCP-2

und MBD-1, sowie eine Hypoacetylierung von Histon H3 im dorsalem Putamen, frontalen

Kortex und Gyrus dentatus verursacht (Cassel et al., 2006). In einem Mausmodell zeigte

sich allerdings, dass Fluoxetin keinen Einfluss auf die Histonacetylierung an Histon H3 in

anderen Hirnregionen wie dem Hypothalamus hat (Schroeder et al., 2007). Inwiefern diese

epigenetischen Prozesse mit der hier beobachteten DNA-Hypomethylierung

zusammenhängen könnten, muss durch weitere Untersuchungen geklärt werden.

Neben Amitriptylin und Fluoxetin wurde noch ein weiteres Antidepressivum, der MAO-

Inhibitor Tranylcypromin, getestet. Tranylcypromin rief während des gesamten

Versuchsverlaufs keine wesentlichen Veränderungen der Methylierung hervor. Die

Substanz wurde bislang auch nicht auf andere epigenetische Wirkungen hin getestet.

Abschließend lässt sich feststellen, dass sowohl das Trizyklikum Amitriptylin wie auch das

SSRI Fluoxetin zu einer hoch signifikanten DNA-Hypomethylierung führen. Der

Mechanismus hierfür ist nicht aufgeklärt, wenngleich Histonmodifikationen eine Rolle

46

spielen könnten. Der MAO-Inhibitor Tranylcypromin scheint keinen Effekt auf die

genomische DNA-Methylierung zu haben.

5.5 Bewertung der DNA-Hypermethylierung nach Stimulation mit Antibiotika

Obwohl Antibiotika die am zweithäufigsten verschriebenen Medikamente darstellen, sind

mögliche Effekte auf das Zentrale Nervensystem kaum untersucht. Während der

Behandlung mit Antibiotika kann es zu psychopathologischen Erscheinungen wie

Unruhezuständen, Schlafstörungen, delirantem Syndrom, depressiven und manischen

Zuständen, sowie stuporösem Syndrom bei Patienten mit und ohne bekannten

psychiatrischen Vorerkrankungen kommen (Hollweg et al., 1997).

Insbesondere bei der Behandlung mit Gyrasehemmern kommt es mit einer Häufigkeit von

20 auf 1,5 Millionen Anwendungen zu psychiatrischen Symptomen (Hollweg et al., 1997;

Jüngst und Mohr, 1987), die sich rasch nach Absetzten des Medikaments zurückbilden. Die

häufigsten Symptome umfassen Unruhe, Verwirrtheit, Halluzinationen und Krämpfe. Der

Mechanismus, über den es zur Entstehung dieser unerwünschten Arzneimittelwirkungen

kommt, ist bisher nicht aufgeklärt (Abouesh et al., 2002). Es wird aber postuliert, dass

Gyrasehemmer mit Neurotransmittern interagieren und kompetitiv die Bindung von GABA

an seine Rezeptoren verhindern (Tsuji et al., 1988). Vor kurzem wurde außerdem eine

Ketamin ähnliche Wirkweise für Ciprofloxacin vorgeschlagen, die mit erhöhter

glutamaterger Signaltransduktion einhergeht und den Effekt von NMDA-Antagonisten

simuliert (Grimm et al., 2007). Unter der Behandlung mit Cephalosporinen sind ebenfalls

akute Psychosen beschrieben worden, die sich ebenso nach Absetzten des Medikaments

zurückbilden (al-Zahawi et al., 1988; Jackson und Berkovic, 1992; McDonald et al., 2003).

Da die Entstehung von Psychosen mit einer vermehrten DNA-Methylierung in kortikalen

Interneuronen in Verbindung gebracht wird (Veldic et al., 2005), wurde im Rahmen dieser

Arbeit der Einfluss des Cephalosporins Cefotiam und des Gyrasehemmer Ciprofloxacin auf

die genomische DNA-Methylierung untersucht, um zu prüfen, inwiefern auch

epigenetische Veränderungen bei der Entwicklung dieser Symptome eine Rolle spielen

könnten.

Die Ergebnisse der Versuche zeigen für beide Antibiotika eine DNA-Hypermethylierung,

die bei Cefotiam bereits nach 6 Stunden am stärksten ausgeprägt ist und sich im weiteren

Versuchsverlauf bis annähernd auf den Ausgangswert normalisiert. Bei Ciprofloxacin kam

es ebenso zu gesteigerter DNA-Methylierung, wenngleich dieser Effekt nicht signifikant

war. Damit bestätigen diese Ergebnisse frühere Untersuchungen an Nicotiana tabacum

Pflanzen, bei denen die Kultivierung mit Antibiotika, insbesondere Cephalosporinen, zu

einer deutlichen Hypermethylierung führte (Schmitt et al., 1997). Auch wenn der

47

Mechanismus hierfür ist nicht abschließend geklärt ist, wird angenommen, dass Antibiotika

indirekt DNA-Methyltransferasen induzieren und so eine DNA-Hypermethylierung

bewirken (Schmitt et al., 1997).

Insbesondere bei Patienten mit psychiatrischer Vorgeschichte könnte diese deutliche

Zunahme der genomischen DNA-Methylierung zur Entstehung psychotischer Symptome

während einer Antibiotikatherapie beitragen. Dies sollte bei der Wahl des Antibiotikums

für Patienten mit einer entsprechenden Anamnese stets berücksichtigt und die Patienten

während der Therapie engmaschig im Hinblick auf psychiatrische Nebenwirkungen

überwacht werden.

48

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57

7 Abkürzungsverzeichnis

Abb Abbildung

ALL Akute lymphatische Leukämie

AML Akute myeloische Leukämie

APL Akute Promyelozyten Leukämie

BDNF Brain-Derived Neurotropic Factor

C Cytosin

CdK4 Cyclin-dependent Kinase-4

CpG Cytosin-Guanin Dinukleotid

CTCF CCCTC-bindender Faktor; Enhancer-blockierendes Element

Cy5-dCTP Cyanin5-desoxy-Cytosintriphosphat

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Desoxyribonukleinsäure

DNMT DNA-Methyltransferase

G Guanin

GAD-67 Glutamic acid decarboxylase isoform 67

HDAC Histondeacetylase

HEK-293 Human embyonic kidney cells 293

HepG2 Humane hepatozelluläre Zelllinie G2

HERP Homocystein-induziertes endoplasmatisches Retikulum Protein

Hpa II Restriktionsendonuklease Hpa II des HPA Gen von Haemophilus parainfluenzae

ICF Immundefekt, Centromer-Instabilität und faziale Dysmorphien-Syndrom

IGF-2 Insulin-like-Growth-Faktor-2

MAO Monoaminoxidase

MBD Methyl-CpG-bindende Domäne

MeCP-2 Methyl-CpG-bindendes Protein 2

MDS Myelodysplastisches Syndrom

MGMT O(6)-Methylguanin-DNA-Methyltransferase

MLH1 mutL homolog 1, colon cancer, nonpolyposis type 2

mRNA Messenger Ribonukleinsäure

Msp I Restriktionsendonuklease Msp I des MSP Gen von Moraxella

MTT Methylthiazolyldiphenyltetrazoliumbromid

NMDA n-Methyl-D-Aspartat

P15INK4b Cyclin-dependent kinase-4 Inhibitor b

PBS Phosphate Buffered Saline

58

PES Polyethersulfon

rpm Rounds per minute

SH-SY5Y SH-SY5Y Neuroblastomzellen

SSRI Selektiver Serotonin Reuptake Inhibitor

Tab Tabelle

TpG Thymin-Guanin Dinukleotid

tRNA Transfer Ribonukleinsäure

UBE3A Ubiquitin-Protein-Ligase 3A

59

8 Abbildungsverzeichnis

Abbildung Seite

2-1 Methylierung von Cytosin zu 5’-Methylcytosin 6

3-1 Prinzip des Cytosin-Elongationsassay 17

3-2 Fluoreszenzfarbstoff Cy5-dCTP 21

3-3 Anregungs- und Emissionswellenlänge von Cy5 23

4-1 MTT-Test mit Carbamazepin 26

4-2 Stimulation mit 5-Aza-2’-deoxycytidin 29

4-3 Stimulation mit Methotrexat 29

4-4 Stimulation mit S-Adenoysl-L-methionin 30

4-5 Stimulation mit Valproinsäure 31

4-6 Stimulation mit Lithium 31

4-7 Stimulation mit Carbamazepin 32

4-8 Stimulation mit Risperidon 33

4-9 Stimulation mit Haloperidol 33

4-10 Stimulation mit Olanzapin 34

4-11 Stimulation mit Quetiapin 34

4-12 Stimulation mit Amitriptylin 35

4-13 Stimulation mit Fluoxetin 36

4-14 Stimulation mit Tranylcypromin 36

4-15 Stimulation mit Cefotiam 37

4-16 Stimulation mit Ciprofloxacin 38

61

9 Danksagung

Besonders möchte ich mich bei meinem Doktorvater Herrn Professor Dr. med. Stefan

Bleich und bei Herrn Privatdozent Dr. med. Dominikus Bönsch für die stets freundliche

Betreuung, die kontinuierliche Unterstützung und die fürsorgliche Begleitung der Arbeit

bedanken. Gemeinsam haben sie mich mit der Begeisterung für die Forschung angesteckt,

mir in schwierigen Phasen Mut gemacht und mein Durchhaltevermögen gestärkt.

Herrn Professor Dr. med. Johannes Kornhuber danke sehr ich, dass ich die Arbeit an seiner

Klinik durchführen konnte.

Dem Laborteam der Molekularen Neurobiologie und unserer Arbeitsgruppe danke ich für

die Einführung in das gesamte Labor, die Vermittlung grundlegender Methoden sowie für

die Geduld mit meinen umfangreichen Arbeiten in der Zellkultur. Meine Kommilitonen

Herr Bernd Lenz und Frau Sonja Beutler gaben mir stets die Möglichkeit, in einem

umfangreichen Meinungsaustausch Problemstellungen zu diskutieren und somit neue

Lösungen zu finden.

Ein großer Dank gilt meiner Familie, meinen Eltern Anneliese Stein-Meintker und Manfred

Meintker, die mir das Medizinstudium ermöglicht und mich durch alle Höhen und Tiefen

begleitet haben, und meinem Bruder Joseph Stein sowie Jochen Schleu. Sie alle waren mir

auch während meiner Dissertation ein großer Beistand und haben mich auf meinem Weg

immer wieder bestärkt.

63

10 Lebenslauf

Name: Lisa Marie Meintker

Geburtsdatum: 17.05.1984

Geburtsort: Nürnberg

Staatsangehörigkeit: deutsch

Familienstand: ledig

Eltern: Anneliese Stein-Meintker, Ph.D., geborene Sartori am 23.05.1945

Manfred Meintker, Dipl. Ing., geboren am 09.05.1949

Geschwister: Clement Joseph Stein, III, Dipl. Ing., geboren am 30.12.1969

Bildungsgang:

1990-1994 Grundschule Loschgeschule Erlangen

1994-2002 Marie-Therese-Gymnasium Erlangen,

Abschluss mit der Allgemeinen Hochschulreife Juni 2002

Seit Oktober 2002 Studium der Humanmedizin an der Friedrich-Alexander-Universität

Erlangen-Nürnberg

Seit November 2002 Stipendium der Konrad-Adenauer-Stiftung

September 2004 Ärztliche Vorprüfung

2007-2008 Praktisches Jahr in New York, Zürich und Erlangen

Mai 2009 Ärztliche Prüfung

Juni 2009 Approbation als Ärztin

Seit September 2006 Anfertigung der Dissertation an der Psychiatrischen und

Psychotherapeutischen Klinik bei Herrn Prof. Dr. med. Stefanl

Bleich

„Psychopharmaka und Antibiotika beeinflussen die genomische

DNA-Methylierung von SH-SY5Y Neuroblastomzellen“

Psychopharmaka und Antibiotika beeinflussen die genomische ... · properties; the MAO inhibitor...

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